CN103898191B - 沙门氏菌检测方法及检测用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种沙门氏菌检测方法，采用毛细管法进行检测，毛细管内填装有MSTT培养基，其组成为：每1L培养基中，含有以下组分：5.0～10.0g蛋白胨，0～5.0g牛肉膏，0～3.0g氯化钠，1.0～5.0g胆盐，30.0～50.0g硫代硫酸钠，9～10mg煌绿，4.0～5.0g碘，5.0～6.0g碘化钾，2.5～3.0g琼脂，0或20～40mg新生霉素，余量为水。本发明利用毛细管培养法及MSTT培养基检测沙门氏菌，将沙门氏菌预增菌和增菌步骤合并，节约了大量时间，至少缩短检测时间24h；而且用毛细管培养法对样本进行了初筛，节约了大量的后续分离鉴定过程。

Description

沙门氏菌检测方法及检测用培养基

技术领域

本发明涉及一种沙门氏菌检测方法及检测用培养基，属于微生物检验领域。

背景技术

目前，美国FDA、AOAC、ISO和中国国标等的食品中的沙门氏菌检测基准方法都是以预增菌、增菌、分离和鉴定为基本程序，但在各种培养基上略有区别。但这些基准方法都比较耗费时间、人力和物力。为了节约人力和时间，科研人员研发了很多快速检测方法，原理基本上都是以PCR和抗原抗体反应为基础，在一些领域发挥了重要作用，但是在某些方面不可替代分离培养方法，原因为：1、无论PCR和抗原抗体，只能针对有限的目标基因或抗原，其在沙门氏菌2000多种血清型的覆盖度上与分离培养法无法比拟，即敏感性方面逊于分离培养法，因此无法撼动分离培养法作为沙门氏菌检测金标准的地位；2、某些重要项目上，取得活菌是确凿证据；3、需要活菌进行进一步分析的时候。

关于以分离培养为基础的方法，AOAC也验证了一些新的方法，如MSRV(改良半固体Rappaport-Vassiladis)培养基培养法，以沙门氏菌选择性增菌剂Rappaport-Vassiladis(RV)肉汤为基础改进而成，该方法应用于可可制品和奶制品中的沙门氏菌分离。MSRV方法主要步骤是将样本经缓冲蛋白胨水(BPW)预增菌及四磺酸钠煌绿肉汤(TTB)和RV肉汤增菌后，分别吸取数滴接种于MSRV半固体平板，待沙门氏菌运动生长产生晕圈后挑取该培养物继续进行鉴定和分离。

专利ZL201210006404.2(公开号102517375A)公开了一种利用毛细管培养法检测微生物的方法，建立了毛细管培养检测微生物的基本程序和方法。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种沙门氏菌检测方法，及检测用培养基，其可用于检测或筛选多种样本中的沙门氏菌，具有快速、高效、省时省力、特异性好、敏感性强等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种沙门氏菌检测方法——毛细管培养法，步骤如下：

(一)填装毛细管：以内径为0.5～5mm、长度3～10cm的直管毛细管(优选内径1mm、长度5cm的直管毛细管)为容器，装载MSTT培养基(该培养基为本发明独创的培养基，具体组成及制备方法见下述)或改良半固体Rappaport-Vassiladis(MSRV)培养基(该培养基为现有技术中已有的常规培养基)；

所述毛细管的材质为玻璃、透明塑料或透明合成树脂中的任一种；

(二)检测：进行以下两种操作之一，或以下两种操作都进行：

(1)将上述填装培养基后的毛细管的一端接入待检样本(液态样本)、待检样本的稀释液、含有待检样本的预增菌液或含有待检样本的增菌液中，另一端密封或接入培养基(该培养基与毛细管内填装的培养基相同)中；若毛细管中接入的培养基为MSTT培养基，则培养16<t≤48h后，进行观察；若毛细管中接入的培养基为MSRV培养基，则培养30<t≤72h后，进行观察；

(2)将待检样本(液态样本)、待检样本的稀释液、含有待检样本的预增菌液或含有待检样本的增菌液接种到四硫磺酸钠煌绿肉汤(TTB)、Muller-Kauffmann四硫磺酸钠新生霉素(MKTTn)肉汤、Rappaport-Vassiladis胰蛋白胨(RVS)肉汤、Rappaport-Vassiladis(RV)肉汤或亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液中，得接种液；然后将上述填装培养基后的毛细管的一端接入接种液中，另一端密封或接入培养基(该培养基与毛细管内填装的培养基相同)中；若毛细管中接入的培养基为MSTT培养基，则培养16<t≤48h后，进行观察；若毛细管中接入的培养基为MSRV培养基，则培养30<t≤72h后，进行观察；

所述观察是指：观察毛细管内、毛细管密封端、毛细管接入培养基的一端或毛细管所接入的培养基，观察是否有晕环，有晕环者为疑似阳性结果，表明待检样本中可能含有沙门氏菌；无晕环者为阴性结果，表明待检样本中不含有沙门氏菌；

所述密封是指用气密性橡胶或气密性硅胶帽直接密封；

所述培养基(指接入毛细管的培养基)盛放在1～10mL容量的管制瓶或1～10mL容量的透明塑料瓶中(优选1mL玻璃管制瓶)，管制瓶或透明塑料瓶用气密性橡胶塞或气密性硅胶塞密封，毛细管穿过该硅胶塞或橡胶塞，以保证气密性。

进一步地，还包括以下步骤：

(三)鉴定：对上述检测结果为疑似阳性结果的待检样本进行鉴定，以进一步确定待检样本中是否含有沙门氏菌；具体方法为：将显示晕环的毛细管内、毛细管密封端、毛细管接入培养基的一端或毛细管所接入的培养基中的培养物接种到XLD平板上，36℃培养24h后，接种生化套管，进行鉴定(按照国家标准或相关试剂厂家说明书进行结果判定)。所述XLD平板、生化套管均为现有技术中用于检测沙门氏菌的常规产品。

所述预增菌液选自缓冲蛋白胨水(BPW)、乳糖肉汤(LB)、胰酪胨大豆肉汤(TSB)、营养肉汤或通用预增菌肉汤(UPB)。所述增菌液选自TTB、MKTTn肉汤、RVS肉汤、RV肉汤或SC增菌液。均为现有技术中已有的常规产品。

所述四硫磺酸钠煌绿肉汤(TTB)、Muller-Kauffmann四硫磺酸钠新生霉素(MKTTn)肉汤、Rappaport-Vassiladis胰蛋白胨(RVS)肉汤、Rappaport-Vassiladis(RV)肉汤、亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液，均为现有技术中已有的常规产品。

一种用于上述沙门氏菌检测的培养基——改良半固体四硫磺酸钠煌绿(MSTT)培养基，每1L培养基中，含有以下组分：5.0～10.0g蛋白胨，0～5.0g牛肉膏，0～3.0g氯化钠，1.0～5.0g胆盐，30.0～50.0g硫代硫酸钠，9～10mg煌绿，4.0～5.0g碘，5.0～6.0g碘化钾，2.5～3.0g琼脂，0或20～40mg新生霉素，余量为水(优选蒸馏水)。所涉及的各组分均为现有技术中已存在的常规培养基的原料/组分。

优选的，每1L培养基中，含有以下组分：10.0g蛋白胨，5.0g牛肉膏，3.0g氯化钠，5.0g胆盐，50.0g硫代硫酸钠，10mg煌绿，5.0g碘，6.0g碘化钾，2.7g琼脂，40mg新生霉素，余量为蒸馏水。

上述MSTT培养基的制备方法为：将碘和碘化钾溶解于蒸馏水，得碘-碘化钾溶液，备用；将新生霉素溶解于蒸馏水，得新生霉素溶液，备用；将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、胆盐、硫代硫酸钠和煌绿溶解于蒸馏水中，加热溶解至沸腾，冷却至46～50℃，加入前述配制的碘-碘化钾溶液，以及新生霉素溶液，定容至1000mL，即得MSTT培养基。

本发明的改良半固体四硫磺酸钠煌绿(MSTT)培养基，可以用于辅助检测沙门氏菌，具体应用时，可应用于毛细管培养法，见上述，也可直接应用于平皿中，倾倒一定量MSTT于平皿中，待凝固后接种菌悬液，培养24～48h后观察是否有晕环。

本发明的改良半固体四硫磺酸钠煌绿(MSTT)培养基，是以TTB为基础，添加了适量的琼脂，并去掉了碳酸钙改良而成。添加适量的琼脂的目的是形成合适的半固体环境，适宜于沙门氏菌运动。去掉碳酸钙的目的是为了沙门氏菌在生长运动过程中产生的酸不会被碳酸钙所中和，该类酸会使MSTT培养基中的胆盐形成胆酸，从而形成沉淀环，在外观上形成明显的晕环，易于判断结果；此外该类酸能够抑制沙门氏菌之外的杂菌的生长，从而极大的提高了该培养基对沙门氏菌的分离效果；而且能够避免酸与碳酸钙反应产生的气泡撑裂半固体培养基。

本发明利用毛细管培养法检测沙门氏菌的原理为：在培养过程中，待检样本中的细菌(包括沙门氏菌，以及其它杂菌)会在毛细管中向前生长或/和运动，由于采用了特定的培养基，沙门氏菌能够保持正常或超常的向前生长或/和运动，而杂菌则会受到反复的抑制性选择，如此，类似化学成分在色谱中不断进行再分配的过程，最后沙门氏菌会被释放到毛细管另一端或毛细管另一端接入的培养基中，从而实现目标菌的快速高效分离。

本发明利用毛细管培养法及MSTT培养基检测沙门氏菌，将沙门氏菌预增菌和增菌步骤合并，节约了大量时间，至少缩短检测时间24h；而且用毛细管培养法对样本进行了初筛，节约了大量的后续分离鉴定过程，且毛细管填装培养基较少，可以节约大量的人力物力和成本。在毛细管培养法检测后，可进一步地进行鉴定，两种方法结合，判断结果更为准确、可靠。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1MSTT平皿法检测沙门氏菌

步骤如下：

1、MSTT培养基的制备

配方为：每1L培养基中，含有以下组分：10.0g蛋白胨，5.0g牛肉膏，3.0g氯化钠，5.0g胆盐，50.0g硫代硫酸钠，10mg煌绿，5.0g碘，6.0g碘化钾，2.7g琼脂，40mg新生霉素，余量为蒸馏水。

制备方法为：将碘和碘化钾溶解于蒸馏水，得碘-碘化钾溶液，备用；将新生霉素溶解于蒸馏水，得新生霉素溶液，备用；将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、胆盐、硫代硫酸钠和煌绿溶解于蒸馏水中，加热溶解至沸腾，冷却至46～50℃，加入前述配制的碘-碘化钾溶液，以及新生霉素溶液，定容至1000mL，即得MSTT培养基。

2、菌悬液的制备：将沙门氏菌标准菌株鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028制成103CFU/mL的菌悬液。

3、接种与培养：吸取一滴约50微升菌悬液滴加到MSTT平皿中培养基的表面，共取6滴滴于不同位置，36℃，培养24h，观察结果。6滴菌悬液周围均有菌呈扩散生长，形成晕环。

实施例2使用MSTT培养基的毛细管培养法检测沙门氏菌及与使用含有碳酸钙的MSTT培养基毛细管培养法的比较

步骤如下：

1、MSTT培养基的制备

配方及制备方法同实施例1，制备得到MSTT培养基后，分装到1mL管制瓶中，马上填装毛细管。

2、含有碳酸钙的MSTT培养基的制备

配方及制备方法同实施例1，不同之处在于：每1L培养基中，还添加有45.0g碳酸钙，制备时，碳酸钙随同氯化钠、胆盐等一起加入。制备得到MSTT培养基后，分装到1mL管制瓶中，马上填装毛细管。

3、毛细管的填装：将内径1mm，长度5cm的无菌毛细管(已穿入对应于1mL管制瓶的橡胶塞)插入上述步骤1和2制备的融化状态培养基，观察毛细管虹吸上缘，使毛细管整管填充后，室温静置至凝固。

4、菌悬液的制备：将沙门氏菌标准菌株鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028制成100CFU/mL的菌悬液。

5、接种与培养：吸取1mL菌悬液加入到10mLBPW中，将上述制备的载有培养基的毛细管另一端插入到BPW中，BPW管用带中孔的发泡硅胶塞封口，毛细管穿过硅胶塞中孔。36℃，培养16～24h，观察结果。载有MSTT培养基的毛细管中16h后出现明显的晕环，到24h晕环直至管制瓶中。含有碳酸钙的MSTT培养基16h毛细管中未见晕环，24h后管制瓶中见晕环，毛细管内见气泡，部分培养基破裂。

实施例3毛细管培养法检验肉鸡胴体样本中的沙门氏菌

步骤如下：

1、MSTT培养基的制备

配方及制备方法同实施例1，制备得到MSTT培养基后，分装到1mL管制瓶中，马上填装毛细管。

2、毛细管的填装：将内径1mm，长度5cm的无菌毛细管(已穿入对应于1mL管制瓶的橡胶塞)插入上述步骤1制备的融化状态培养基，观察毛细管虹吸上缘，使毛细管整管填充后，室温静置至凝固。

4、样本的处理：将五份肉鸡胴体样本分别称取25g加入到225mLBPW中均质，装入300mL无菌锥形瓶中，用带有中孔的发泡硅胶塞塞住瓶口。

5、预增菌接种与培养：将上述制备的载有培养基的毛细管另一端穿过锥形瓶上硅胶塞的中孔插入到BPW中。36℃，培养16～48h，观察结果。48h后，有两份样本中毛细管及管制瓶中均有晕环存在，其中一份样本16h毛细管中出现晕环，24h时明显晕环至管制瓶中。

6、增菌接种与培养：提前制备10mLTTB和10mLRV肉汤，分装于试管中，分别加入0.1mL步骤5培养后的BPW，用带有中孔的发泡硅胶塞塞住试管口。将上述制备的载有培养基的毛细管另一端穿过试管上硅胶塞的中孔插入到TTB或RV肉汤中。36℃，培养16～48h，观察结果。48h后，有两份样本中TTB和RV肉汤所接的毛细管及管制瓶中均有晕环存在，阳性样本与步骤5一致。

7、分离鉴定，将两份阳性样本接种到XLD平板上，36℃，培养24h后，接种生化套管，结果均鉴定为沙门氏菌。

实施例4毛细管培养法检验粪便中的沙门氏菌

步骤如下：

1、MSTT培养基的制备

配方及制备方法同实施例1，制备得到MSTT培养基后，分装到1mL管制瓶中，马上填装毛细管。

2、毛细管的填装：将内径1mm，长度5cm的无菌毛细管(已穿入对应于1mL管制瓶的橡胶塞)插入上述步骤1制备的融化状态培养基，观察毛细管虹吸上缘，使毛细管整管填充后，室温静置至凝固。

4、样本的处理：将30份粪便样本，每份分别称取1g加入到10mLTTB和10mLSC增菌液中混匀，TTB和SC增菌液分别装于试管中，用带有中孔的发泡硅胶塞塞住试管口。

5、接种与培养：将上述制备的载有培养基的毛细管另一端穿过试管上硅胶塞的中孔插入到TTB或SC增菌液中。36℃，培养16～48h，观察结果。48h后，有一份样本中TTB和SC增菌液所接的毛细管及管制瓶中均有晕环存在。

6、分离鉴定，将一份阳性样本接种到XLD平板上，36℃，培养24h后，接种生化套管，结果鉴定为沙门氏菌。

实施例5毛细管培养法检验医疗污水中的沙门氏菌

步骤如下：

1、MSTT培养基的制备

配方及制备方法同实施例1，制备得到MSTT培养基后，分装到1mL管制瓶中，马上填装毛细管。

2、MSRV培养基的制备

MSRV培养基使用脱水干粉MSRV培养基按照厂家说明书配制，加热溶解煮沸后，冷却至46～50℃，混匀后分装到1mL管制瓶中，马上填装毛细管。

3、毛细管的填装：将内径1mm，长度5cm的无菌毛细管(已穿入对应于1mL管制瓶的橡胶塞)插入上述步骤1和2制备的融化状态培养基，观察毛细管虹吸上缘，使毛细管整管填充后，室温静置至凝固。

4、样本的处理：将十份医疗污水样本分别取200mL经微孔滤膜过滤后，冲洗到加入到275mLTTB中，分别装入300mL无菌锥形瓶中，用带有两个中孔的发泡硅胶塞塞住瓶口。

5、接种与培养：将上述制备的两种载有培养基的毛细管另一端分别穿过锥形瓶上硅胶塞的两个中孔插入到TTB中。36℃，培养16～72h，观察结果。24h后，MSTT毛细管培养单元中有两份样本中毛细管及管制瓶中均有晕环存在，48h后，MSRV毛细管培养单元中有两份管制瓶中有晕环存在，两者结果一致。

6、分离鉴定，将两份阳性样本接种到XLD平板上，36℃，培养24h后，接种生化套管，结果均鉴定为沙门氏菌。

Claims (6)

1.一种非诊断或治疗目的的沙门氏菌检测方法，其特征在于：步骤如下：

(一)填装毛细管：以内径为0.5～5mm、长度3～10cm的直管毛细管为容器，装载MSTT培养基；所述MSTT培养基的组成为：每1L培养基中，含有以下组分：10.0g蛋白胨，5.0g牛肉膏，3.0g氯化钠，5.0g胆盐，50.0g硫代硫酸钠，10mg煌绿，5.0g碘，6.0g碘化钾，2.7g琼脂，40mg新生霉素，余量为蒸馏水；

(二)检测：进行以下两种操作之一，或以下两种操作都进行：

(1)将上述填装培养基后的毛细管的一端接入液态待检样本、待检样本的稀释液、含有待检样本的预增菌液或含有待检样本的增菌液中，另一端密封或接入培养基中，该培养基与毛细管内填装的培养基相同；培养16<t≤48h后，进行观察；

(2)将液态待检样本、待检样本的稀释液、含有待检样本的预增菌液或含有待检样本的增菌液接种到四硫磺酸钠煌绿肉汤、Muller-Kauffmann四硫磺酸钠新生霉素肉汤、Rappaport-Vassiladis胰蛋白胨肉汤、Rappaport-Vassiladis肉汤或亚硒酸盐胱氨酸增菌液中，得接种液；然后将上述填装培养基后的毛细管的一端接入接种液中，另一端密封或接入培养基中，该培养基与毛细管内填装的培养基相同；培养16<t≤48h后，进行观察；所述观察是指：观察毛细管内、毛细管密封端、毛细管接入培养基的一端或毛细管所接入的培养基，观察是否有晕环，有晕环者为疑似阳性结果，表明待检样本中可能含有沙门氏菌；无晕环者为阴性结果，表明待检样本中不含有沙门氏菌。

2.根据权利要求1所述的沙门氏菌检测方法，其特征在于：还包括以下步骤：(三)鉴定：对上述检测结果为疑似阳性结果的待检样本进行鉴定，以进一步确定待检样本中是否含有沙门氏菌。

3.根据权利要求1所述的沙门氏菌检测方法，其特征在于：所述毛细管选择内径1mm、长度5cm的直管毛细管。

4.根据权利要求1所述的沙门氏菌检测方法，其特征在于：所述毛细管的材质为玻璃、透明塑料或透明合成树脂中的任一种。

5.根据权利要求1所述的沙门氏菌检测方法，其特征在于：所述密封是指用气密性橡胶或气密性硅胶帽直接密封。

6.根据权利要求1所述的沙门氏菌检测方法，其特征在于：所述接入毛细管的培养基盛放在1～10mL容量的管制瓶或1～10mL容量的透明塑料瓶中，管制瓶或透明塑料瓶用气密性橡胶塞或气密性硅胶塞密封，毛细管穿过该硅胶塞或橡胶塞。