CN103898185A - 一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于玉米蛋白综合利用开发抗氧化活性肽的技术领域，公开了一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，重点解决了以玉米蛋白粉为原料，以水解度作为酶解效果的衡量指标，以DPPH清除率为抗氧化活性的衡量指标，借助单因素和响应面实验设计方法，设计了一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，能够实现在酶解的3h内，水解度可由水解度由42.13%提高至48.23%以上，玉米抗氧化肽粉的DPPH清除率由70.16%提高至78.65%以上。本发明旨为促进玉米蛋白粉的综合利用开展抗氧化活性肽系列化产品与其产业化示范研究提供一定的前期技术基础。
Description
技术领域
本发明属于玉米蛋白综合利用开发抗氧化活性肽的技术领域，涉及一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，能够实现在酶解的3h内，水解度可由水解度由42.13%提高至48.23%以上，玉米抗氧化肽粉的DPPH清除率由70.16%提高至78.65%以上。
背景技术
目前，玉米蛋白活性肽是当今食源性活性肽研究的热点问题之一。玉米蛋白粉为玉米精深加工主要副产物，其组成复杂、口感粗糙、水溶性差、具有特殊的臭味和色泽，因而目前常被作为玉米蛋白饲料或者当废弃物排掉，在食品工业中的应用较少。但是作为优质蛋白资源，如何能够最大限度的实现酶解获取活性显著的目标肽是国内外诸多研究学者的关注焦点问题。因而，本专利拟解决的一种借助辐照辅助酶解技术，实现了提高玉米蛋白水解度的同时，也提高了酶解物玉米抗氧化肽粉的DPPH清除率，为后期玉米蛋白抗氧化活性肽的产品研发与其产业转化提供了一种技术途径。
快中子电子束辐照技术本被广泛应用于食品的杀菌保藏，而应用于提高蛋白粉的水解度以及提高活性肽的抗氧化性实属国内首例。经过快中子电子束照射后，玉米蛋白粉内部结构发生改变，从而使得蛋白质之间的链接得以更容易的被切断，从而提高玉米蛋白粉的水解度，释放出更多的活性肽分子，进一步提高肽液的抗氧化性。玉米蛋白粉的原料特性符合此项技术对原料的基本要求，所以快中子电子束处理玉米蛋白粉是可行的。本专利是在大量试验研究的基础上，优化获得利用快中子电子书辐照技术提高玉米蛋白粉酶解效果以及提高玉米肽抗氧化活性的最佳工艺参数，从而获得科学度高、可行性强的工艺流程。因而，本发明是借助快中子电子束辐照处理玉米蛋白粉辅助酶解以提高抗氧化性实属首例。
本发明选用水解度作为玉米肽的酶解效果的衡量指标，选择DPPH清除率作为玉米肽抗氧化活性的衡量指标，测试方法方便实用，结果可信度较高。目前pH-stat法是使用最为广泛的蛋白质水解度测定方法，其计算公式如下所示：
式中，B为酶解过程中消耗NaOH的体积（mL）；Nb为NaOH的浓度（mol/L）；α为平均氨基解离度，该专利试验条件下取值为1；Mp为底物蛋白的总质量（g）；htot表示蛋白质中肽键的质量摩尔浓度（mol/g）；对玉米蛋白而言，取值为7.35mmol/g。
DPPH清除率是使用96孔板测定法：向96-孔板中每孔加入100μL肽液，100μL甲醇和100μL0.6mM的DPPH溶液，充分混合后，于37℃水浴中放置1.5h。使用酶标仪于517nm处测定吸光度值（AS），空白（AB）使用甲醇代替DPPH溶液和样品，DPPH清除率公式如下所示：
DPPH清除率（%）=(AB-AS)/AB×100
式中，AS为100μL肽液++100μL0.6mM的DPPH溶液吸光度；AB为300μL甲醇吸光度。
特别强调——本专利是在单因素和响应面实验设计的研究基础上，优选出辐照和酶解的最佳工艺条件，攻克了玉米蛋白粉酶解效果不佳的技术难题，其优势在于：①改变了玉米蛋白粉的内部分子结构；②有效的提高了水解度；③提高了其酶解物的DPPH清除率。
发明内容
本专利需要解决的技术问题：
以玉米蛋白粉为原料，以水解度作为酶解效果的衡量指标，以DPPH清除率为抗氧化活性的衡量指标，借助单因素和响应面实验设计方法，设计了一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，能够实现在酶解的3h内，水解度可由水解度由42.13%提高至48.23%以上，玉米抗氧化肽粉的DPPH清除率由70.16%提高至78.65%以上。
本专利的技术方案：
1.一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，其特征在于，以蛋白质含量45～60%、颗粒细度150～200目的玉米蛋白粉为原料，经快中子电子束辐照、碱性蛋白酶可控酶解、灭酶和离心、超滤、喷雾干燥过程，使被辐照处理后的玉米蛋白粉在适宜的蛋白酶作用下酶解3h，水解度由42.13%提高至48.23%以上，玉米抗氧化肽粉的DPPH清除率由70.16%提高至78.65%以上；
1）所述的快中子电子束辐照过程，是以蛋白质含量45～60%、颗粒细度150～200目的玉米蛋白粉为原料，按照每袋100～500g的重量分装保存于自封袋中，置于速度为2～20m/h的输送带上，输送进入快中子电子束辐照室循环照射，使物料吸收的辐照剂量为5K～140K，获得玉米蛋白辐照粉；
2）所述的碱性蛋白酶可控酶解过程，是以蛋白质含量45%～60%的玉米蛋白辐照粉为底物，按照重量比用20～50℃水配制底物浓度为2～7%的蛋白溶液体系；再用磁力搅拌器处理蛋白溶液体系，搅拌温度控制在50～65℃，搅拌时间为5～10min；而后再置于85～95℃的水浴锅中加热变性10～35min，冷却后至胃蛋白酶的适宜酶解温度为45～65℃，调节pH值为7.5～10.5，按[E]/[S]为6～12%加入胃蛋白酶，用1M的NaOH控制肽液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，收集酶解液置于85～95℃的水浴锅中加热灭酶5～15min后计算酶解过程的水解度为48.23%以上；
3）所述的灭酶和离心过程，是将酶解液进行离心处理，离心温度为2～10℃、转速为6000～12000×g，离心时间为5～30min，收集上清液并将pH值调节至7后4℃冷藏备用；
4）所述的超滤过程，是将4℃保藏的上清液升温至10～25℃后进行超滤处理，采用清洁的超滤膜的分子量截留值为3k～10k Da，超滤流速为6～15mL/min、超滤压力为0.1～0.2MPa，收集超滤膜下液，冷藏备用；
5）所述的喷雾干燥过程，是调节进风温度为150～200℃，超滤膜下液的进样速度为30～60mL/min，离心雾化器转速为15000～25000r/min，获得玉米抗氧化肽粉，测定其DPPH清除率为78.65%以上。
2.根据权利要求1所述的一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，其特征在于，碱性蛋白酶可控酶解过程中所需用水选择纯净水、去离子水、渗透水和蒸馏水中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的分子量截留值为3k～10k Da超滤膜，使用之前需要经35～50℃热水冲洗1～2次，再经35～50℃的0.05～0.1mol/L的NaOH溶液冲洗1～2次，最后再用10～25℃的水进行冲洗1～2次。
申请发明技术效果：
（1）本发明实现了以蛋白质含量45～60%、颗粒细度150～200目的玉米蛋白粉为原料，经快中子电子束辐照、碱性蛋白酶可控酶解、灭酶和离心、超滤、喷雾干燥过程，使被辐照处理后的玉米蛋白粉在适宜的蛋白酶作用下酶解3h，水解度由42.13%提高至48.23%以上，玉米抗氧化肽粉的DPPH清除率由70.16%提高至78.65%以上；
（2）本发明前期处理便捷，生产工艺流程较为简单，可大幅提高玉米蛋白粉的综合利用价值。
具体实施方法
实施例1：
以蛋白质含量45%、颗粒细度160目的玉米蛋白粉为原料，按照每袋100g的重量分装保存于自封袋中，置于速度为5m/h的输送带上，输送进入快中子电子束辐照室循环照射，使物料吸收的辐照剂量为5K，获得玉米蛋白辐照粉；以蛋白质含量45%的玉米蛋白辐照粉为底物，按照重量比用20℃纯净水配制底物浓度为4%的蛋白溶液体系；再用磁力搅拌器处理蛋白溶液体系，搅拌温度控制在60℃，搅拌时间为10min；而后再置于90℃的水浴锅中加热变性20min，冷却后至碱性蛋白酶的适宜酶解温度为50℃，调节pH值为9，按[E]/[S]为10%加入碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制肽液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，收集酶解液置于90℃的水浴锅中加热灭酶10min后计算酶解过程的水解度为48.23%以上；将酶解液进行离心处理，离心温度为4℃、转速为10000×g，离心时间为10min，收集上清液并将pH值调节至7后4℃冷藏备用；采用清洁的超滤膜的分子量截留值为10k Da，预先经35℃热水冲洗2次，再经40℃的0.1mol/L的NaOH溶液冲洗1次，最后再用23℃的水进行冲洗2次；而后将4℃保藏的上清液升温至20℃后进行超滤处理，超滤流速为12mL/min、超滤压力为0.1MPa，收集超滤膜下液，冷藏备用；调节进风温度为150℃，超滤膜下液的进样速度为40mL/min，离心雾化器转速为16000r/min，获得玉米抗氧化肽粉，测定其DPPH清除率为78.65%以上。
实施例2：
以蛋白质含量48%、颗粒细度150目的玉米蛋白粉为原料，按照每袋200g的重量分装保存于自封袋中，置于速度为2m/h的输送带上，输送进入快中子电子束辐照室循环照射，使物料吸收的辐照剂量为36.8K，获得玉米蛋白辐照粉；以蛋白质含量48%的玉米蛋白辐照粉为底物，按照重量比用25℃去离子水配制底物浓度为2%的蛋白溶液体系；再用磁力搅拌器处理蛋白溶液体系，搅拌温度控制在55℃，搅拌时间为15min；而后再置于92℃的水浴锅中加热变性15min，冷却后至碱性蛋白酶的适宜酶解温度为45℃，调节pH值为10，按[E]/[S]为6%加入碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制肽液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，收集酶解液置于95℃的水浴锅中加热灭酶5min后计算酶解过程的水解度为48.23%以上；将酶解液进行离心处理，离心温度为6℃、转速为6000×g，离心时间为30min，收集上清液并将pH值调节至7后4℃冷藏备用；采用清洁的超滤膜的分子量截留值为5k Da，预先经40℃热水冲洗2次，再经35℃的0.08mol/L的NaOH溶液冲洗2次，最后再用15℃的水进行冲洗2次；而后将4℃保藏的上清液升温至10℃后进行超滤处理，超滤流速为8mL/min、超滤压力为0.2MPa，收集超滤膜下液，冷藏备用；调节进风温度为160℃，超滤膜下液的进样速度为60mL/min，离心雾化器转速为17000r/min，获得玉米抗氧化肽粉，测定其DPPH清除率为78.65%以上。
实施例3：
以蛋白质含量50%、颗粒细度170目的玉米蛋白粉为原料，按照每袋300g的重量分装保存于自封袋中，置于速度为10m/h的输送带上，输送进入快中子电子束辐照室循环照射，使物料吸收的辐照剂量为65K，获得玉米蛋白辐照粉；以蛋白质含量50%的玉米蛋白辐照粉为底物，按照重量比用30℃蒸馏水配制底物浓度为3%的蛋白溶液体系；再用磁力搅拌器处理蛋白溶液体系，搅拌温度控制在50℃，搅拌时间为25min；而后再置于88℃的水浴锅中加热变性30min，冷却后至碱性蛋白酶的适宜酶解温度为50℃，调节pH值为10.5，按[E]/[S]为7%加入碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制肽液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，收集酶解液置于85℃的水浴锅中加热灭酶7min后计算酶解过程的水解度为48.23%以上；将酶解液进行离心处理，离心温度为8℃、转速为8000×g，离心时间为15min，收集上清液并将pH值调节至7后4℃冷藏备用；采用清洁的超滤膜的分子量截留值为3k Da，预先经45℃热水冲洗1次，再经45℃的0.07mol/L的NaOH溶液冲洗1次，最后再用20℃的水进行冲洗1次；而后将4℃保藏的上清液升温至25℃后进行超滤处理，超滤流速为10mL/min、超滤压力为0.1MPa，收集超滤膜下液，冷藏备用；调节进风温度为170℃，超滤膜下液的进样速度为50mL/min，离心雾化器转速为25000r/min，获得玉米抗氧化肽粉，测定其DPPH清除率为78.65%以上。
实施例4：
以蛋白质含量53%、颗粒细度180目的玉米蛋白粉为原料，按照每袋400g的重量分装保存于自封袋中，置于速度为15m/h的输送带上，输送进入快中子电子束辐照室循环照射，使物料吸收的辐照剂量为108.7K，获得玉米蛋白辐照粉；以蛋白质含量53%的玉米蛋白辐照粉为底物，按照重量比用35℃渗透水配制底物浓度为5%的蛋白溶液体系；再用磁力搅拌器处理蛋白溶液体系，搅拌温度控制在65℃，搅拌时间为20min；而后再置于95℃的水浴锅中加热变性10min，冷却后至碱性蛋白酶的适宜酶解温度为65℃，调节pH值为7.5，按[E]/[S]为8%加入碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制肽液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，收集酶解液置于88℃的水浴锅中加热灭酶15min后计算酶解过程的水解度为48.23%以上；将酶解液进行离心处理，离心温度为2℃、转速为7000×g，离心时间为20min，收集上清液并将pH值调节至7后4℃冷藏备用；采用清洁的超滤膜的分子量截留值为7k Da，预先经50℃热水冲洗1次，再经50℃的0.05mol/L的NaOH溶液冲洗1次，最后再用25℃的水进行冲洗1次；而后将4℃保藏的上清液升温至22℃后进行超滤处理，超滤流速为15mL/min、超滤压力为0.2MPa，收集超滤膜下液，冷藏备用；调节进风温度为180℃，超滤膜下液的进样速度为30mL/min，离心雾化器转速为28000r/min，获得玉米抗氧化肽粉，测定其DPPH清除率为78.65%以上。
实施例5：
以蛋白质含量58%、颗粒细度190目的玉米蛋白粉为原料，按照每袋500g的重量分装保存于自封袋中，置于速度为20m/h的输送带上，输送进入快中子电子束辐照室循环照射，使物料吸收的辐照剂量为135K，获得玉米蛋白辐照粉；以蛋白质含量58%的玉米蛋白辐照粉为底物，按照重量比用40℃蒸馏水配制底物浓度为6%的蛋白溶液体系；再用磁力搅拌器处理蛋白溶液体系，搅拌温度控制在58℃，搅拌时间为15min；而后再置于85℃的水浴锅中加热变性35min，冷却后至碱性蛋白酶的适宜酶解温度为55℃，调节pH值为8，按[E]/[S]为9%加入碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制肽液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，收集酶解液置于93℃的水浴锅中加热灭酶12min后计算酶解过程的水解度为48.23%以上；将酶解液进行离心处理，离心温度为10℃、转速为12000×g，离心时间为25min，收集上清液并将pH值调节至7后4℃冷藏备用；采用清洁的超滤膜的分子量截留值为4k Da，预先经47℃热水冲洗1次，再经47℃的0.06mol/L的NaOH溶液冲洗2次，最后再用10℃的水进行冲1次；而后将4℃保藏的上清液升温至10℃后进行超滤处理，超滤流速为15mL/min、超滤压力为0.2MPa，收集超滤膜下液，冷藏备用；调节进风温度为190℃，超滤膜下液的进样速度为35mL/min，离心雾化器转速为23000r/min，获得玉米抗氧化肽粉，测定其DPPH清除率为78.65%以上。
实施例6：
以蛋白质含量60%、颗粒细度200目的玉米蛋白粉为原料，按照每袋250g的重量分装保存于自封袋中，置于速度为18m/h的输送带上，输送进入快中子电子束辐照室循环照射，使物料吸收的辐照剂量为138.7K，获得玉米蛋白辐照粉；以蛋白质含量60%的玉米蛋白辐照粉为底物，按照重量比用50℃去离子水配制底物浓度为7%的蛋白溶液体系；再用磁力搅拌器处理蛋白溶液体系，搅拌温度控制在62℃，搅拌时间为20min；而后再置于87℃的水浴锅中加热变性25min，冷却后至碱性蛋白酶的适宜酶解温度为57℃，调节pH值为8.5，按[E]/[S]为12%加入碱性蛋白酶，用1M的NaOH控制肽液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，收集酶解液置于90℃的水浴锅中加热灭酶5min后计算酶解过程的水解度为48.23%以上；将酶解液进行离心处理，离心温度为8℃、转速为9000×g，离心时间为5min，收集上清液并将pH值调节至7后4℃冷藏备用；采用清洁的超滤膜的分子量截留值为8k Da，预先经37℃热水冲洗2次，再经37℃的0.09mol/L的NaOH溶液冲洗2次，最后再用13℃的水进行冲洗2次；而后将4℃保藏的上清液升温至15℃后进行超滤处理，超滤流速为6mL/min、超滤压力为0.1MPa，收集超滤膜下液，冷藏备用；调节进风温度为200℃，超滤膜下液的进样速度为45mL/min，离心雾化器转速为20000r/min，获得玉米抗氧化肽粉，测定其DPPH清除率为78.65%以上。
Claims (3)
1.一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，其特征在于，以蛋白质含量45%～60%、颗粒细度150～200目的玉米蛋白粉为原料，经快中子电子束辐照、碱性蛋白酶可控酶解、灭酶和离心、超滤、喷雾干燥过程，使被辐照处理后的玉米蛋白粉在适宜的蛋白酶作用下酶解3h，水解度由42.13%提高至48.23%以上，玉米抗氧化肽粉的DPPH清除率由70.16%提高至78.65%以上；
1）所述的快中子电子束辐照过程，是以蛋白质含量45%～60%、颗粒细度150～200目的玉米蛋白粉为原料，按照每袋100～500g的重量分装保存于自封袋中，置于速度为2～20m/h的输送带上，输送进入快中子电子束辐照室循环照射，使物料吸收的辐照剂量为5K～140K，获得玉米蛋白辐照粉；
2）所述的碱性蛋白酶可控酶解过程，是以蛋白质含量45%～60%的玉米蛋白辐照粉为底物，按照重量比用20～50℃水配制底物浓度为2%～7%的蛋白溶液体系；再用磁力搅拌器处理蛋白溶液体系，搅拌温度控制在50～65℃，搅拌时间为5～10min；而后再置于85～95℃的水浴锅中加热变性10～35min，冷却后至胃蛋白酶的适宜酶解温度为45～65℃，调节pH值为7.5～10.5，按[E]/[S]为6%～12%加入胃蛋白酶，用1M的NaOH控制肽液的pH值变化在±0.04内，控制酶解时间为3h，收集酶解液置于85～95℃的水浴锅中加热灭酶5～15min后计算酶解过程的水解度为48.23%以上；
3）所述的灭酶和离心过程，是将酶解液进行离心处理，离心温度为2～10℃、转速为6000～12000×g，离心时间为5～30min，收集上清液并将pH值调节至7后4℃冷藏备用；
4）所述的超滤过程，是将4℃保藏的上清液升温至10～25℃后进行超滤处理，采用清洁的超滤膜的分子量截留值为3k～10kDa，超滤流速为6～15mL/min、超滤压力为0.1～0.2MPa，收集超滤膜下液，冷藏备用；
5）所述的喷雾干燥过程，是调节进风温度为150～200℃，超滤膜下液的进样速度为30～60mL/min，离心雾化器转速为15000～25000r/min，获得玉米抗氧化肽粉，测定其DPPH清除率为78.65%以上。
2.根据权利要求1所述的一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，其特征在于，碱性蛋白酶可控酶解过程中所需用水选择纯净水、去离子水、渗透水和蒸馏水中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的一种借助辐照辅助酶解技术提高玉米肽抗氧化活性的方法，其特征在于，所述的分子量截留值为3k～10k Da超滤膜，使用之前需要经35～50℃热水冲洗1～2次，再经35～50℃的0.05～0.1mol/L的NaOH溶液冲洗1～2次，最后再用10～25℃的水进行冲洗1～2次。
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