CN103897180B - 重金属离子完全抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种重金属离子完全抗原的制备方法，包括如下步骤：在室温条件下，按照重金属离子与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸的摩尔比为1:1，将0.1mol/L的重金属离子硝酸盐溶液与所述异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸于pH为7.2~7.4的条件下混合，搅拌进行螯合反应，得到重金属‑异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原；及在室温条件下，按照质量比为1:1，将所述重金属‑异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原与多聚赖氨酸于pH为9.0的条件下混合，搅拌进行偶联反应，得到重金属‑异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸‑多聚赖氨酸完全抗原溶液。上述重金属离子完全抗原的制备方法制备的重金属离子完全抗原制备的抗重金属离子抗体具有较高的效价。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，特别涉及一种重金属离子完全抗原的制备方法。
背景技术
重金属是一类有毒的、持久的环境污染物，其中最著名的是的镉、铅、铬、汞、砷。而矿冶、机械制造、化工、电子、仪表等工业的许多生产过程中都会产生含重金属离子（镉、铬、铜、汞、镍等）的废水，其排放造成了水环境污染。含有重金属离子的水被人类饮用，会造成人类各种疾病的发生，有的甚至会致癌。因此，对环境中的重金属离子含量进行检测和监控是非常必要的。为了减少环境污染，保证人类健康生存和保持经济社会的可持续发展，做到早检测、早治理，降低污染治理的成本，将重金属离子污染对人类的危害控制在最低程度，必须要做到快速、实时检测环境中的毒性金属离子。
常用的重金属离子检测方法是仪器分析法，如原子吸收光谱法，电感耦合等离子体质谱法，电感耦合等离子体发射光谱法。仪器分析法的特点是检测准确灵敏，可靠性高，但也是存在着成本高，耗时，前处理复杂，其他离子干扰严重、处理通量小等缺点。此外，免疫学技术也已广泛用于重金属离子的检测中。重金属免疫学检测技术具有检测速度快、费用低廉、灵敏度高和选择性强等优点。该技术以重金属螯合物特异性单克隆抗体为基础，而成功制备重金属免疫原是制备单克隆抗体的关键。重金属离子由于分子量小，且免疫原性弱而不能直接诱导动物产生抗体，因此，需要将重金属离子以一定的方式与蛋白质连接形成重金属离子完全抗原，然后再利用制备出的全抗原诱导免疫动物产生针对重金属离子的抗体。目前，国内外相关研究机构在重金属离子半抗原的制备上多采用螯合剂来连接重金属离子。这样做的原因在于：（1）重金属离子分子量小，只有与相关的载体连接后才能引发动物体内的免疫反应产生出特异性的抗体。（2）螯合剂易于与重金属离子络合形成复合物。常用的螯合剂有乙二胺四乙酸，二乙烯三胺五乙酸，乙二醇二乙醚二胺四乙酸或其类似的衍生物。传统方法制备出的重金属离子半抗原能与普通载体蛋白相连制成重金属离子完全抗原，例如匙孔血蓝蛋白（KLH）或牛血清白蛋白（BSA），但是由于普通蛋白本身具有过强的免疫原性，当选用它们作为重金属离子的载体时，会减弱抗重金属离子抗体的产生，使得抗重金属离子的抗体的效价较低。
发明内容
鉴于此，有必要提供一种能够制备出具有较高效价的抗重金属离子抗体的重金属离子完全抗原的制备方法。
一种重金属离子完全抗原的制备方法，包括如下步骤：
在室温条件下，按照重金属离子与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸的摩尔比为1:1，将0.1mol/L的重金属离子硝酸盐溶液与所述异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸于pH为7.2~7.4的条件下混合，搅拌进行螯合反应，得到重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原；及
在室温条件下，按照质量比为1:1，将所述重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原与多聚赖氨酸于pH为9.0的条件下混合，搅拌进行偶联反应，得到重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液。
在其中一个实施例中，还包括对所述重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的分离纯化步骤：采用超滤离心管对所述重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液进行分离纯化。
在其中一个实施例中，对所述重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的分离纯化之前还包括对所述超滤离心管的预处理步骤：用四乙酸二氨基乙烯对所述超滤离心管清洗，并用pH为7.2~7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节所述超滤离心管的pH。
在其中一个实施例中，对所述重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的分离纯化之后还包括将分离纯化后的产物于-80℃冷冻之后，进行真空干燥。
在其中一个实施例中，所述超滤离心管为美国Milipore公司的30超滤离心管。
在其中一个实施例中，所述重金属离子为铜离子、铅离子、锌离子、锡离子、镍离子、钴离子、锑离子、汞离子、镉离子或铋离子。
在其中一个实施例中，搅拌进行所述螯合反应的步骤为：使用转速为100转/分钟的摇床搅拌24小时。
在其中一个实施例中，搅拌进行所述偶联反应的步骤为：使用转速为100转/分钟的摇床搅拌22小时。
上述重金属离子完全抗原的制备方法，先通过采用重金属离子硝酸盐溶液与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）螯合形成重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原，再通过采用重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原与多聚赖氨酸（PLL）偶联形成重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液，由于多聚赖氨酸（PLL）基本不具有免疫原性，而上述重金属离子完全抗原的制备方法采用多聚赖氨酸（PLL）作为重金属离子的载体，可以避免因普通蛋白质免疫原性过强而减弱抗重金属离子抗体的产生，使得上述重金属离子完全抗原的制备方法制备的重金属离子完全抗原制备的抗重金属离子抗体具有较高的效价。
附图说明
图1为一实施方式的重金属离子完全抗原的制备方法流程图。
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对重金属离子完全抗原的制备方法作进一步详细的说明。
如图1所示，一实施方式的重金属离子完全抗原的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110：在室温条件下，按照重金属离子与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸的摩尔比为1:1，将0.1mol/L的重金属离子硝酸盐溶液与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）于pH为7.2~7.4的条件下混合，搅拌进行螯合反应，得到重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原。
其中，重金属离子为铜离子、铅离子、锌离子、锡离子、镍离子、钴离子、锑离子、汞离子、镉离子和铋离子等。
其中，步骤S110中，搅拌进行螯合反应的步骤为：使用转速为100转/分钟的摇床搅拌24小时。
步骤S120：在室温条件下，按照质量比为1:1，将重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原与多聚赖氨酸（PLL）于pH为9.0的条件下混合，搅拌进行偶联反应，得到重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液。
其中，搅拌进行偶联反应的步骤为：使用转速为100转/分钟的摇床搅拌22小时。
其中，步骤S120之后，还包括对重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的分离纯化步骤：采用超滤离心管对重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液进行分离纯化。
其中，超滤离心管可以为本领域常用的超滤离心管，优选为美国Milipore公司的30超滤离心管。
其中，对重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的分离纯化之前还包括对超滤离心管的预处理步骤：用四乙酸二氨基乙烯（EDTA）对超滤离心管清洗，并用pH为7.2~7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）调节超滤离心管的pH。
其中，pH为7.2~7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）可通过自行配置制备得到。
其中，对所述重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的分离纯化之后还包括将分离纯化后的产物于-80℃冷冻之后，进行真空干燥。其中，真空干燥之后得到的重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的粉末于-20℃冷藏备用。
上述重金属离子完全抗原的制备方法，先通过采用重金属离子硝酸盐溶液与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）螯合形成重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原，再通过采用重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原与多聚赖氨酸（PLL）偶联形成重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液，由于多聚赖氨酸（PLL）基本不具有免疫原性，而上述重金属离子完全抗原的制备方法采用多聚赖氨酸（PLL）作为重金属离子的载体，可以避免因普通蛋白质免疫原性过强而减弱抗重金属离子抗体的产生，使得上述重金属离子完全抗原的制备方法制备的重金属-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原制备的抗重金属离子抗体具有较高的效价。
以下为具体实施例部分：
实施例1
本实施例的重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的制备如下：
（1）重金属镉离子硝酸盐溶液的配置：将Cd(NO3)2·4H2O和蒸馏水混合配制成镉离子的浓度为0.1mol/L的硝酸镉溶液。
（2）在室温条件下，按照重金属镉离子与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）的摩尔比为1∶1，将0.1mol/L的硝酸镉溶液与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）于pH为7.4的条件下混合，使用转速为100转/分钟的摇床搅拌24小时，进行螯合反应，得到重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原。
（3）在室温条件下，按照质量比为1:1，将重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原与多聚赖氨酸（PLL）于pH为9.0的条件下混合，使用转速为100转/分钟的摇床搅拌22小时，进行偶联反应，得到重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液。用四乙酸二氨基乙烯（EDTA）对美国Milipore公司的30超滤离心管清洗，并用pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）调节超滤离心管的pH，采用美国Milipore公司的30超滤离心管对重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液进行分离纯化。将分离纯化后的产物于-80℃冷冻之后，进行真空干燥，并置于冰箱中-20℃冷藏备用。其中，pH为7.4的10毫摩4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）的配制为：先配置其100×HEPES贮存液，具体配制方法为：取23.8克的HEPES溶于90毫升的双蒸水中，用lN NaOH调pH至7.4，然后用水定容至100ml，过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，4℃或-20℃保存。
实验测试：采用本实施例的重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原制备抗体：取8-10周龄的Balb/C小白鼠为实验动物。实验中基础免疫剂量为0.25-2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5-2.0mg/kg。
(a)基础免疫：用体积比为1:1的PBS/甘油稀释本实施例中得到的重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原，无菌过滤器过滤后加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散。将乳化好的完全抗原采用腹腔及背部皮下多点注射动物，注射剂量为0.1mg抗原/只。
(b)基础免疫3-4周后，进行加强免疫；用体积比为1∶1的PBS/甘油稀释得到的重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原，无菌过滤器过滤，加入等体积不完全弗氏佐剂，充分乳化，直到滴入水中不扩散；腹腔与背部轮换注射，注射剂量为0.1mg抗原/只。
（c）每隔3-4周，按照步骤(b)中方法进行加强免疫；从第三次免疫开始，每次免疫后第8-10天，从小鼠眼眶采血，测效价，为大于1∶10000。
通过上述实验结果表明：本实施例制备得到的重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原刺激小白鼠的免疫系统产生效价大于1:10000的抗镉离子抗体，获得的抗体稳定性好，可用于环境中镉离子的监测。
实施例2
本实施例的重金属铅-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原的制备如下：
（1）重金属铅离子硝酸盐溶液的配置：将重金属铅和稀硝酸混合经高温反应配制成铅离子浓度为0.1mol/L的硝酸铅溶液。
（2）在室温条件下，按照重金属铅离子与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）的摩尔比为1:1，将0.1mol/L的硝酸铅溶液与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸（ITCBE）于pH为7.2的条件下混合，使用转速为100转/分钟的摇床搅拌24小时，进行螯合反应，得到重金属铅-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原。
（3）在室温条件下，按照质量比为1:1，将重金属铅-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原与多聚赖氨酸（PLL）于pH为9.0的条件下混合，使用转速为100转/分钟的摇床搅拌22小时，进行偶联反应，得到重金属铅-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液。用四乙酸二氨基乙烯（EDTA）对美国Milipore公司的30超滤离心管清洗，并用pH为7.2的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）调节超滤离心管的pH，采用美国Milipore公司的30超滤离心管对重金属铅-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液进行分离纯化。将分离纯化后的产物于-80℃冷冻之后，进行真空干燥，并置于冰箱中-20℃冷藏备用。其中，pH为7.2的10毫摩4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）的配制为：配置其100×HEPES贮存液，具体配制方法为：取23.8g克的HEPES溶于90毫升双蒸水中，用lN NaOH调pH至7.2，然后用水定容至100毫升，过滤除菌，分装小瓶(2ml/瓶)，4℃或-20℃保存。
实验测试：按照实施例1中采用重金属铅-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原制备抗体的方法，采用重金属铅-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原制备抗体，此处不再赘述。通过实验结果表明：本实施例制备得到的重金属铅-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原刺激小白鼠的免疫系统产生效价大于1:8000的抗铅离子抗体，获得的抗体稳定性好，可用于环境中铅离子的监测。
其它重金属离子完全抗原的制备方法与实施例1的方法相同，此处不再赘述。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (1)
1.一种重金属离子完全抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)重金属镉离子硝酸盐溶液的配置：将Cd(NO3)2·4H2O和蒸馏水混合配制成镉离子的浓度为0.1mol/L的硝酸镉溶液；
(2)在室温条件下，按照重金属镉离子与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸的摩尔比为1:1，将0.1mol/L的硝酸镉溶液与异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸于pH为7.4的条件下混合，使用转速为100转/分钟的摇床搅拌24小时，进行螯合反应，得到重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原；
(3)在室温条件下，按照质量比为1:1，将重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸半抗原与多聚赖氨酸于pH为9.0的条件下混合，使用转速为100转/分钟的摇床搅拌22小时，进行偶联反应，得到重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液；用四乙酸二氨基乙烯对美国Milipore公司的30超滤离心管清洗，并用pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸调节超滤离心管的pH，采用美国Milipore公司的30超滤离心管对重金属镉-异硫氰酸苄基乙二胺四乙酸-多聚赖氨酸完全抗原溶液进行分离纯化；将分离纯化后的产物于-80℃冷冻之后，进行真空干燥，并置于冰箱中-20℃冷藏备用；其中，pH为7.4的4-羟乙基哌嗪乙磺酸的配制为：取23.8克的4-羟乙基哌嗪乙磺酸溶于90毫升的双蒸水中，用1mol/L的NaOH调pH至7.4，然后用水定容至100mL，过滤除菌，分装小瓶，4℃或-20℃保存。
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