CN103896251B - 一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法。该方法是将1,4加成聚合物加入到有机溶剂中，200～450℃碳化反应30min～24h，得到荧光碳量子点。制备100份重量份数的荧光碳量子点，所用的各物质的量为：1,4加成聚合物5～100份，有机溶剂0～95份。本发明制备的碳量子点生物显影剂产率高、尺寸分散均一，具有低细胞毒性，易溶于水或有机溶剂，可用于细胞成像、或活体成像等领域，在不同pH条件下发光稳定。
Description
技术领域
本发明属于生物显影剂材料技术领域，涉及一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法。
背景技术
2006年美国克莱蒙森大学的孙亚平首次发现碳量子点，是继碳纳米管、纳米金刚石、富勒烯和石墨烯之后出现的一类新颖的纳米碳材料。碳量子点具有优异的光学和电学性能，跟传统的半导体量子点相比，具有细胞毒性低、合成成本低、光稳定性好等优点，因此在生物显影成像、传感和探针等领域有着广泛的应用前景。
现有碳量子点量子效率低，文献报道的碳量子点量子效率一般不超过10﹪。另一方面，碳量子点吸收长波长激发光而发射出短波长（可见光）的向上逆转能力也较弱。由于长波长光源能够穿过较厚的组织，在人体组织中显影具有较强的实用性，因此，需要发展一种能够吸收近红外光线具有较强向上逆转能力的碳量子点。
Wei Li等人（Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,1–6）报道一种蚕丝经水热法制备的荧光量子纳米微球。由于蛋白质中氮元素的存在使得碳量子点荧光的量子效率大为提高，这提供了一种通过在碳量子点中引入氮掺杂来提高其光学性能的方法。然而由于这种纳米微球的尺寸太大（大约90纳米），可能会引起细胞行为的变化，因此在细胞中作为显影剂应用受到限制。
Yan-Qing Zhang等人（J.Mater.Chem.,2012,22,16714–16718）报道四氯化碳（CCL4）和氨基钠（NaNH2）反应生成碳量子点，氮掺杂使碳量子点具有将近红外激发光（700-900nm）向上逆转发出波峰在500纳米可见荧光的能力。然而由于四氯化碳和氨基钠反应而在碳量子点中引入氮的摩尔比例很难调控，因此需要发展一种可以精确调控氮含量的办法来优化其光学性能。
1,4加成反应能够精确调节聚合物中各单体结构的含量，以此作为碳源能够控制碳量子点中的氮元素含量。本发明公布一种由1，4加成聚合物经高温碳化而形成的碳量子点，由于氮元素含量的控制，该碳量子点具有较强的荧光效率和向上逆转能力，同时具有在不同pH条件下发光稳定性，在生物显影方面具有广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提出一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法，该方法利用1,4加成聚合物来制备碳量子点，通过调节聚合物中各单体结构的含量，来调控碳量子点的光学性能。此方法无毒环保，制备简单，原材料价格低廉，收率较高，一步直接获得碳量子点，得到的碳量子点水溶性好，且具有优异的光致发光特性。
为解决上述技术问题，本发明方法为高温碳化制备方法，具体是：
将1,4加成聚合物加入到有机溶剂中，200～450℃碳化反应30min～24h，得到荧光碳量子点；
制备100份重量份数的荧光碳量子点，所用的各物质的量为：1,4加成聚合物5～100份，有机溶剂0～95份；
所述的有机溶剂为甘油、乙二醇的一种或两种混合液；
所述的1,4加成聚合物的制备方法是：
将单体A、单体B在20～95℃下聚合2～48h，得到1,4加成聚合物；单体A与单体B的摩尔比为1：1；
作为优选，聚合温度为20～60℃；
所述的单体A为含有双官能团的丙烯酸酯类单体、含有双官能团的丙烯酰胺类单体的一种或两种；
所述的含有双官能团的丙烯酰胺类单体结构式A1如下：
所述的含有双官能团的丙烯酸酯类单体结构式A2如下：
所述的单体B为含有氨基或巯基的双官能团单体，其结构式为式B1、式B2、式B3的一种或多种，如下所示：
式B1；
式B2；
式B3；
若单体A中含有含双官能团的丙烯酰胺类单体A1，在1,4加成聚合物的制备过程中必须加入蒸馏水，即将单体A、单体B先溶于蒸馏水中，得到混合溶液，然后混合溶液20～95℃下聚合2～48h，得到1,4加成聚合物；其中混合溶液中蒸馏水的质量含量为40～95﹪；
作为优选，混合溶液中蒸馏水的质量含量为70﹪。
本发明制备得到的碳量子点生物显影剂相关结构和性能表征：
1.为表明本发明碳量子点生物显影剂的尺寸和分布状态，对本发明制得的碳量子点做了透射电镜扫描，结果显示碳量子点的粒径呈较窄的分布状态，尺寸为4.7nm左右。
2.为表明本发明碳量子点生物显影剂的荧光性质，本发明检测了320nm～460nm不同波长激发下获得的碳量子点的荧光发射光谱。
3.为表明本发明碳量子点生物显影剂的向上逆转荧光性能，本发明检测了650nm～900nm不同波长激发下获得的碳量子点的荧光发射光谱。结果显示，其具有很好的逆转发光能力。
4.为表明本发明碳量子点生物显影剂的荧光稳定性，检测了pH=4～9范围内4碳量子点的荧光强度变化。结果显示，该碳量子点具有很好的光稳定性。
5.为表明本发明碳量子点生物显影剂的细胞显影作用，采用HELA细胞，加入0.1﹪质量浓度的碳量子点，培养4小时后，用荧光显微镜表征。
本发明的优点是：
1.本发明制备的碳量子点生物显影剂产率高、尺寸分散均一；
2.本发明制备的碳量子点生物显影剂具有低细胞毒性，易溶于水或有机溶剂，可用于细胞成像、或活体成像等领域；
3.所得到的碳量子点具有在不同pH条件下发光稳定的特点。
4.所得到的碳量子点能够进入细胞，不同激发波长下可以激发出不同颜色的荧光，可以作为生物显影剂使用。
附图说明
图1为实施例1-1制备得到的碳量子点的透射电镜照片；
图2为实施例1-1制备得到的碳量子点的荧光光谱；
图3为实施例1-1制备得到的碳量子点在近红外区域的荧光光谱；
图4为实施例1-1～1-5制备得到的碳量子点在不同pH下所荧光强度（480nm）；
图5为HELA细胞在实施例1-1制备得到碳量子点不同浓度条件下的存活率。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
首先制备1,4加成聚合物的实施例，如下：
实施例1-1.
0.43g(5mmol)哌嗪，1.54g（10mmol）亚甲基双丙烯酰胺,0.77g(5mmol)N,N-双(2-羟乙基)乙二胺溶于5mL水，加入10mL试管，经氮气置换30min后，加热至50℃反应12小时。产物经冷冻干燥，得到2.56g1,4加成聚合物（P1）。
实施例1-2.
1.51g(5mmol)四乙二醇丙烯酸酯，0.77g（5mmol）二硫苏糖醇,加入10mL试管，经氮气置换30min后，加热至50℃反应2小时,得到2.18g1,4加成聚合物（P2）。
实施例1-3.
1.51g(5mmol)四乙二醇丙烯酸酯，0.43g（5mmol）哌嗪,加入10mL试管，经氮气置换30min后，加热至50℃反应24小时，得到1.86g1,4加成聚合物（P3）。
实施例1-4.
1.54g（10mmol）二硫苏糖醇，1.54g（10mmol）亚甲基双丙烯酰胺溶于5mL水，加入10mL试管，经氮气置换30min后，加热至50℃反应24小时。产物经冷冻干燥，得到2.62g1,4加成聚合物（P3）。
实施例1-5.
0.86g(5mmol)哌嗪，1.54g（10mmol）亚甲基双丙烯酰胺溶于5mL水，加入10mL试管，经氮气置换30min后，加热至50℃反应12小时。产物经冷冻干燥，得到2.09g1,4加成聚合物（P5）。
表1实施例1-1～1-5产物经GPC表征得到的结构特征
实施例1-6.
0.85g（5mmol）乙二醇二丙烯酸酯，0.86g(5mmol)N,N-双(2-羟乙基)乙二胺加入10mL试管，经氮气置换30min后，加热至20℃反应48小时。产物经冷冻干燥，得到2.09g1,4加成聚合物。
实施例1-7.
3.21g（15mmol）二乙二醇二丙烯酸酯、1.54g（10mmol）二硫苏糖醇、0.43g(5mmol)哌嗪加入20mL试管，经氮气置换30min后，加热至95℃反应2小时。产物经冷冻干燥，得到2.09g1,4加成聚合物。
实施例1-8.
3.87G（15mmol）三乙二醇二丙烯酸酯、1.54g（10mmol）二硫苏糖醇、0.86g(5mmol)N,N-双(2-羟乙基)乙二胺加入10mL试管，经氮气置换30min后，加热至60℃反应20小时。产物经冷冻干燥，得到2.09g1,4加成聚合物。
实施例1-9.
1.54g（10mmol）亚甲基双丙烯酰胺、2.58g（10mmol）三乙二醇二丙烯酸酯、0.43g(5mmol)哌嗪、1.54g（10mmol）二硫苏糖醇、0.86g(5mmol)N,N-双(2-羟乙基)乙二胺加入10mL试管，经氮气置换30min后，加热至60℃反应25小时。产物经冷冻干燥，得到2.09g1,4加成聚合物。
然后利用上述实施例1-1～1-9制备得到的1,4加成聚合物制备碳量子点，具体实施例如下：
实施例2-1.
在密闭高压反应瓶中加入0.1g实施例1-1制备得到的1,4加成聚合物P1和1mL甘油（1.26g），经氮气置换30min后，然后在250℃中磁力搅拌下反应4h，自然冷却至常温，得到荧光碳量子点溶液，产物经过离心分离，超滤提纯后得到碳量子点（CD-P1）。
实施例2-2.
将实施例2-1中的聚合物P1替换成实施例1-2制备得到的1,4加成聚合物P2，其他实验条件与实施例2-1一致，得到碳量子点（CD-P2）。
实施例2-3.
将实施例2-1中的聚合物P1替换成实施例1-3制备得到的1,4加成聚合物P3，其他实验条件与实施例2-1一致，得到碳量子点（CD-P3）。
实施例2-4.
将实施例2-1中的聚合物P1替换成实施例1-4制备得到的1,4加成聚合物P4，其他实验条件与实施例2-1一致，得到碳量子点（CD-P4）。
实施例2-5.
将实施例2-1中的聚合物P1替换成实施例1-5制备得到的1,4加成聚合物P5，其他实验条件与实施例2-1一致，得到碳量子点（CD-P5）。
表2实施例2-1～2-5制备得到的碳量子点元素成分和量子效率
将实施例2-1～2-5制备得到的碳量子点在365nm紫外灯下照射下溶液发出蓝色荧光。CD-P1的量子效率最高，为25.9﹪。
如图1所示，为CD-P1碳量子点的TEM照片，量子点形状规整圆形。
如图2所示，为CD-P1碳量子点溶液（0.1m/v）在不同波长（320～460nm）激发光照射下的荧光谱图。CD-P1碳量子点能够进入细胞，不同激发波长下可以激发出不同颜色的荧光，可以作为生物显影剂使用。
如图3所示，为CD-P1碳量子点溶液（0.1m/v）在近红外区域不同波长（650～900nm）激发光照射下的荧光谱图。
如图4所示，为CD-P1～CD-P5碳量子点溶液在不同pH条件下的荧光强度（波长为480nm），在不同pH条件下发光稳定。
如图5所示，为HELA细胞在CD-P1碳量子点不同浓度条件下的存活率，显示基本无毒。
实施例2-6.
在密闭高压反应瓶中加入0.5g1,4加成聚合物和7.54mL甘油（9.5g），经氮气置换30min后，然后在200℃中磁力搅拌下反应24h，自然冷却至常温，得到荧光碳量子点溶液，产物经过离心分离，超滤提纯后得到碳量子点。
实施例2-7.
在密闭高压反应瓶中加入5g1,4加成聚合物和5g乙二醇，经氮气置换30min后，然后在450℃中磁力搅拌下反应30min，自然冷却至常温，得到荧光碳量子点溶液，产物经过离心分离，超滤提纯后得到碳量子点。
实施例2-8.
在密闭高压反应瓶中加入5g1,4加成聚合物、5g乙二醇、5g甘油，经氮气置换30min后，然后在300℃中磁力搅拌下反应10h，自然冷却至常温，得到荧光碳量子点溶液，产物经过离心分离，超滤提纯后得到碳量子点。实施例2-9.
在密闭高压反应瓶中加入5g1,4加成聚合物，经氮气置换30min后，然后在400℃中磁力搅拌下反应5h，自然冷却至常温，得到荧光碳量子点溶液，产物经过离心分离，超滤提纯后得到碳量子点。
上述实施例所用的乙二醇二丙烯酸酯结构式为
二乙二醇二丙烯酸酯结构式为
三乙二醇二丙烯酸酯结构式为
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法，其特征在于该方法是将1,4加成聚合物加入到有机溶剂中，200～450℃碳化反应30min～24h，得到荧光碳量子点；
制备100份重量份数的荧光碳量子点，所用的各物质的量为：1,4加成聚合物5～100份，有机溶剂0～95份；
所述的1,4加成聚合物的制备方法是：
将单体A、单体B在20～95℃下聚合2～48h，得到1,4加成聚合物；单体A与单体B的摩尔比为1：1；
所述的单体A为含有双官能团的丙烯酸酯类单体、含有双官能团的丙烯酰胺类单体的一种或两种；
所述的含有双官能团的丙烯酰胺类单体结构式A1如下：
所述的含有双官能团的丙烯酸酯类单体结构式A2如下：
；
所述的单体B为含有氨基或巯基的双官能团单体，其结构式为式B1、式B2、式B3的一种或多种，如下所示：
2.如权利要求1所述的一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法，其特征在于有机溶剂为甘油、乙二醇的一种或两种混合液。
3.如权利要求1所述的一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法，其特征在于聚合温度为20～60℃。
4.如权利要求1所述的一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法，其特征在于若单体A中含有含双官能团的丙烯酰胺类单体A1，在1,4加成聚合物的制备过程中加入蒸馏水；最后制备得到1,4加成聚合物中蒸馏水的质量含量为40～95﹪。
5.如权利要求4所述的一种水溶性碳量子点生物显影剂的制备方法，其特征在于1,4加成聚合物中蒸馏水的质量含量为70﹪。
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