CN103880944A - 一种野生型rhNGF的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种野生型β-hNGF的制备方法，步骤为：hNGF片段获取；酶切后与载体连接，诱导表达，亲和层析纯化；Factor Xa或肠激酶或Genenase I切除MBP标签蛋白，获得野生型β-hNGF。此方法能够产业化方法，纯化得率高，纯度高。

Description

一种野生型rhNGF的制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及野生型rhNGF的制备方法。
背景技术
自上世纪70年代以来，大肠杆菌原核表达系统一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。作为外源基因表达的宿主，大肠杆菌遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞，并且近年来出现了很多新型的真核表达系统，但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来，有关蛋白结构以及功能研究的开展，对基因表达的要求更高，这时原核表达往往是表达的第一选择。
众所周知，原核表达存在两个缺点：第一，容易形成包涵体；第二，大多数的重组表达方案都会在重组蛋白的上游的引入多余的氨基酸残基。无法获得可溶性的、天然无多余氨基酸残留的野生型目的蛋白。目前需要一种解决以上问题的蛋白制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够产业化生产野生型hNGF的方法。
为实现上述目的，本发明提供一种野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
1）hNGF片段获取：
PCR扩增：上游引物5’端引入XmnI酶切识别位点序列GAAGGAGTTC，下游引物引入多克隆位点上其他任意酶切识别位点，同时下游引物的反义链3’端必须带有终止密码子；利用该对引物扩增β-hNGF成熟肽编码序列；或
通过人工合成或在上游引物中引入Ile-Glu-Gly-Arg或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr的编码碱基进行扩增；
2）酶切：分别双酶切PCR产物和载体并回收；所述载体带有类似XmnI酶切识别位点或表达产物可被Factor Xa的内切酶酶切的载体；
3）连接：T4连接酶连接载体和双酶切后的PCR产物，转化大肠杆菌表达菌株并进行鉴定；
4）诱导表达：IPTG诱导表达；
5）亲和层析纯化：麦芽糖蛋白亲和层析纯化获得MBP-NGF重组蛋白；
6）获得野生型β-hNGF：Factor Xa或肠激酶或Genenase I切除MBP标签蛋白，获得野生型β-hNGF。
所述1）步骤中的PCR扩增，上游引物序列为SEQ ID NO:1，下游引物序列为SEQ ID NO:2，下游引物带HindIII酶切位点。
所述2）酶切中，所述载体为pMAL-c2X，pMAL-p2X，pMAL-c2E,pMAL-p2E,pMAL-c2G,pMAL-p2G,pGEX-4T-1或pGEX-4T-2。
所述5）亲和层析纯化为：
（1）低温离心收集目的蛋白表达菌体；
（2）用Resuspending Buffer重悬菌体，在冰水浴中进行超声波破碎，所述Resuspending Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;1mM DTT；pH6.5；
（3）低温离心，缓慢吸取上清液，滤膜过滤后移至新离心管中，置冰上待纯化；
（4）不溶物再用Resuspending Buffer重悬，重复以上步骤进行超声处理；离心获取上清液，沉淀可再进行超声破碎或进行再次重复；
（5）重力柱纯化或者
Figure BDA0000458940050000021
蛋白纯化：
所用的填料为Dextrin Sepharose HP，
轻柔、充分翻转摇匀填料悬浊液，用宽嘴枪头吸取树脂浆，待树脂完全沉降，打开层析柱下方旋钮，当储存缓冲液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下时，用5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，然后再用5倍树脂体积Binding Buffer平衡树脂；
待Binding Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液;将流速控制在每小时10倍柱体积;重复吸附一次，收集穿过组分并置于冰上；
用5倍树脂体积Binding Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上；
用8倍树脂体积Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱组分置于冰上；
所述收集穿过组分即为纯化后的MBP-NGF重组蛋白；
所述Binding Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;pH6.5、ElutionBuffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;10mM Maltose；pH6.5；均用ddH2O配置Binding Buffer、Elution Buffer，0.22μm过滤器过滤除菌。
所述5）亲和层析纯化为：
（1）低温离心收集目的蛋白表达菌体；
（2）用10mL Resuspending Buffer重悬200ml LB培养的沥干菌体，在冰水浴中进行超声波破碎，超声破碎条件：25%脉冲，功率200w，10min，开1s关2s；所述ResuspendingBuffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;1mM DTT；pH6.5；
（3）4℃，12000rpm离心20min沉淀不溶物；缓慢吸取上清液，0.45μm滤膜过滤后移至新离心管中，置冰上待纯化；
（4）不溶物再用Resuspending Buffer重悬，重复以上步骤进行超声处理；离心获取上清液，沉淀可再进行超声破碎或进行再次重复；
（5）重力柱纯化或者
Figure BDA0000458940050000031
蛋白纯化：
所用的填料为Dextrin Sepharose HP，
轻柔、充分翻转摇匀填料悬浊液，用宽嘴枪头吸取树脂浆，待树脂完全沉降，打开层析柱下方旋钮，当储存缓冲液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下时，用5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，然后再用5倍树脂体积Binding Buffer平衡树脂；
待Binding Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液;将流速控制在每小时10倍柱体积;重复吸附一次，收集穿过组分并置于冰上；
用5倍树脂体积Binding Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上；
用8倍树脂体积Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱组分置于冰上；
所述收集的穿过组分和洗脱组分即为纯化后的MBP-NGF重组蛋白；
所述Binding Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;pH6.5、ElutionBuffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;10mM Maltose；pH6.5；均用ddH2O配置Binding Buffer、Elution Buffer，0.22μm过滤器过滤除菌。
最后还包括用5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，3倍树脂体积的0.5M NaOH洗树脂，5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，5倍树脂体积的20%乙醇洗树脂，最后注入等体积20%乙醇，树脂即可长期保存于4℃。
所述6）获得野生型β-hNGF为利用Factor Xa Protease或肠激酶或Genenase I切割MBP-NGF，再用Xa Removal Resin吸附去除残留的Factor Xa；切割下来的MBP标签和未切割的MBP-NGF融合蛋白利用Dextrin Sepharose HP吸附。
采用本发明的制备方法制备得到的目的蛋白表达量高、易于纯化，基因表达产物经切割和二次纯化后获得完全不带额外氨基酸残基的纯天然野生型的目的蛋白，克服了传统方法（基因插入多克隆位点，表达产物经限制性酶酶切后，获得带有至少1个额外的氨基酸残基的目的蛋白）表达所获得的目的蛋白不是野生型的难题。
本发明提供一种通过对目的蛋白N端密码子修饰或在基因N端添加蛋白特异性内切酶识别序列的编码碱基，连接高效可溶表达载体，表达产物经特异性酶切割去除标签获得野生型目的蛋白的方法。
方式1：对目的蛋白N端密码子修饰
上游引物5’端引入XmnI酶切识别位点序列GAA GGNN TTC（XmnI识别位点GAA NNNN TTC，N表示任何碱基），下游引物5’端引入多克隆位点上其他任意酶切识别位点，同时下游引物的反义链3’端必须带有终止密码子。
插入pMAL-c2X或pMAL-p2X（或类似的，具备类似XmnI酶切识别位点（GGA GGNN TTC，N表示任何碱基,下同）和表达产物可被类似Factor Xa这样的识别特异性位点的内切酶酶切的载体）。
克隆成功后的目的基因表达载体序列含有如下信息：
malE…ATC GAG GGA AGG NNT TC…(目的基因序列)TGA…lacZα
该载体的表达产物带有ATC-GAG-GGA-AGG的编码的Ile-Glu-Gly-Arg氨基酸残基，可被Factor Xa识别并切割，从而获得以NNTTC为开头的基因编码的天然野生型目的蛋白。
必须同时符合以下条件的蛋白，适合利用该方法中的该方式（引入XmnI酶切识别位点和插入pMAL-c2X或pMAL-p2X载体）制备野生型的重组蛋白：
第一，目的蛋白编码基因内部没有XmnI酶切识别位点；
若有识别位点（GAA NNNN TTC），则可在不改变氨基酸的基础上突变GAATTC这六个碱基中的一个或一个以上，继续使用该方法。
第二，目的蛋白的N端前两个氨基酸是NNT TCN的编码产物。
符合这个条件的目的蛋白的前两个氨基酸可以是PheSer(编码碱基TTTTCN，下同)，SerSer(TCTTCN，AGTTCN)，TyrSer(TATTCN)，CysSer(TGTTCN)，LeuSer(CTTTCN)，ProSer(CCTTCN)，HisSer(CATTCN)，ArgSer(CGTTCN)，IleSer(ATTTCN)，ThrSer(ACTTCN)，AsnSer(AATTCN)，ValSer(GTTTCN)，AlaSer(GCTTCN)，AspSer(GATTCN)，GlySer(GGTTCN)。
上述的是将目的基因连接pMAL-c2X或pMAL-p2X，重组表达后直接获得可溶性野生型目的蛋白的方式之一。
同样的，可以利用以下方式获得可溶性野生型目的蛋白：
1）N端前两个氨基酸是ValPro（编码碱基GTNCCN）的目的蛋白插入pMAL-c2E或pMAL-p2E，表达后的高度可溶的MBP融合蛋白经肠激酶切除MBP标签后，获得野生型目的蛋白。
2）N端第一个氨基酸是Val（编码碱基GTN）的目的蛋白插入pMAL-c2G或pMAL-p2G，表达后的高度可溶的MBP融合蛋白经Genenase I切除MBP标签后，获得野生型目的蛋白。
3）N端前两个氨基酸是GlySer（编码碱基GGNTCN，GGNAGT，GGNAGC）的目的蛋白插入pGEX-4T-1或pGEX-4T-2，表达后的高度可溶的GST融合蛋白经凝血酶切除GST标签后，获得野生型目的蛋白。
pMAL-c2X,pMAL-p2X,pMAL-c2E,pMAL-p2E,pMAL-c2G,pMAL-p2G,pGEX-4T-1,pGEX-4T-2的多克隆位点序列见图1和图2。
方式2：在基因N端添加蛋白特异性内切酶识别序列的编码碱基
1）通过人工合成或在上游引物中引入Ile-Glu-Gly-Arg的编码碱基，插入pMAL-c2X,pMAL-p2X,pMAL-c2E,pMAL-p2E,pMAL-c2G,pMAL-p2G,pGEX-4T-1,pGEX-4T-2任意一个载体的多克隆位点，表达产物用Factor Xa切割获得野生型目的蛋白。
2）通过人工合成或在上游引物中引入Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的编码碱基，插入上述任意一个载体，表达产物用肠激酶切割获得野生型目的蛋白。
3）通过人工合成或在上游引物中引入Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr的编码碱基，插入上述任意一个载体，表达产物用Genenase I切割获得野生型目的蛋白。
【附图说明】
图1为载体pMAL-c2X,pMAL-p2X、pMAL-c2E,pMAL-p2E,pMAL-c2G,pMAL-p2G的多克隆位点图。
图2为载体pGEX-4T-1,pGEX-4T-2的多克隆位点图。
图3为制备野生型hNGF的技术流程图。
图4为hNGF-F/R扩增NGF基因凝胶电泳检测图。
图5为表达载体和hNGF双酶切凝胶检测图。
图6为菌液PCR检测阳性克隆电泳图。
图7为SDS-PAGE检测NGF的表达、纯化、MBP的切除图。
图8为SDS-PAGE检测hNGF单体图。
图9为鸡胚背根神经节培养鉴定hNGF的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
以下引物合成、序列合成和序列测序均为Invitrogen公司。
实施例1：可溶性高效原核表达野生型β-hNGF
技术流程如下：
上游引物5’端引入XmnI酶切识别位点序列GAAGGAGTTC，下游引物引入HindIII酶切位点，利用该对引物扩增β-hNGF成熟肽编码序列；双酶切PCR产物和pMAL-c2X载体并回收；T4连接酶连接载体和NGF序列，转化大肠杆菌表达菌株并进行鉴定；IPTG诱导表达，麦芽糖蛋白亲和层析纯化获得MBP-NGF重组蛋白；Factor Xa切除MBP标签蛋白，获得野生型β-hNGF。整个技术流程图见图3。
1.NGF基因的扩增
采用TRIzol法从人胎盘组织中（厦门市妇幼保健院）提取总RNA，RT-PCR反应生成cDNA。利用hNGF-F和hNGF-R上下游引物扩增NGF成熟肽编码基因。hNGF-F和hNGF-R上下游引物序列如下：
hNGF-F：AGGGAAGGAGTTCATCCCATCCCATCTTCCAC（单下划线为XmnI酶切位点）（SEQ IDNO:1）
hNGF-R：CCAAGCTT
Figure BDA0000458940050000061
TCTCACAGCCTTCCTGCTGAG（单下划线为
Figure BDA0000458940050000062
酶切位点，双下划线的TCA反义链为TGA终止密码子）（SEQ ID NO:2）
反应条件为：95℃2min
(94℃,30s;51℃,30s;72℃,1min)32个循环
72℃10min
hNGF-F/R扩增NGF基因序列的电泳结果见图4。其中泳道1、2、3、4为4个重复，从图中可以看出，其片段大小符合预期。
2.pMAL-c2X-hNGF表达载体和表达工程菌的构建
2.1构建pMAL-c2X-hNGF表达载体
利用XmnI和HindIII（两种酶购于Fermentas）双酶切上述的PCR产物和pMAL-c2X载体（购于NEB）并胶回收；T4连接酶连接酶切后的载体和PCR产物，转化大肠杆菌DH5α菌株（购于Novagen）并进行菌液PCR鉴定正确后，测序验证其序列正确性，正确的为重组载体pMAL-c2X-hNGF。表达载体和NGF双酶切结果见图5，菌液PCR检测结果见图6。其中图5的泳道1为hNGF酶切前（对照），泳道2为hNGF酶切后样品，泳道3为pMAL-c2X-hNGF酶切前（对照），泳道4为pMAL-c2X-hNGF酶切后样品；图6的泳道1、2、3、4为4个重复，大小符合预期；
经测序鉴定正确的β-hNGF成熟肽编码序列为SEQ ID NO:3及对应的氨基酸序列为SEQ IDNO:4。人为改变了第一个氨基酸编码碱基（TCA→AGT），但不改变其氨基酸。均为丝氨酸（Ser）。
2.2阳性重组质粒转化表达菌株
提取鉴定正确的重组载体pMAL-c2X-hNGF的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)（或BL21(DE3)pLysS）表达菌株中。具体方法如下：
（1）取100μL冰浴上融化的感受态细胞，加入0.5μL重组质粒，轻轻混合，在冰浴中放置30min；
（2）42℃水浴中热激60s，然后迅速将管转移到冰浴中2-3min；
（3）向管中加入500μL无菌的不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃，200rpm条件下振荡培养1h，使细菌复苏；
（4）取150μL涂布在含有Amp的LB固体平板上，在37℃恒温箱中倒置培养过夜。2.3表达工程菌保存
（1）挑取单菌落接种于250mL培养瓶带有50mL液体LB培养基（含50μg/mL Amp）中；
（2）37℃，250rpm条件下振荡培养至OD600=0.6-0.8（同时对多个菌落进行培养，选择生长速度最快的保存甘油菌）；
（3）取920μL移至冷冻管，加入80μL甘油；
（4）充分混匀，于液氮中快速冷冻，保存于-80℃。
3.NGF的可溶性重组表达和亲和层析纯化
3.1诱导表达目的蛋白
（1）用灭菌接菌环刮取-80℃冻存的甘油菌，划线于琼脂板上，在37℃恒温箱中倒置培养过夜，活化菌株；
（2）挑取单菌落接种于20mL液体LB培养基（含50μg/mL Amp）中，37℃，300rpm条件下振荡培养约10-12h；
（3）按1:50的比例转接于新鲜的液体LB培养基中，37℃，300rpm条件下振荡培养至OD600≈0.8（约2.0-2.5hr）；
（4）立即加入IPTG至终浓度为0.1mM，在另一恒温培养箱内，25℃，180rpm（提前设置好）条件下振荡培养10h-12h诱导表达，得到MBP-hNGF融合蛋白。
3.2MBP-hNGF融合蛋白纯化
（1）4℃，3000rpm离心10min，收集目的蛋白表达菌体；
（2）分别用10mL Resuspending Buffer（20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;1mM DTT；pH6.5）重悬200ml LB培养的沥干菌体，在冰水浴中进行超声波破碎，超声破碎条件：25%脉冲（功率200w）10min，开1s关2s；
（3）4℃，12000rpm离心20min沉淀不溶物；缓慢吸取上清液，0.45μm滤膜过滤后移至新离心管中，置冰上待纯化。纯化步骤参照PROTOCOL进行。重力柱纯化步骤见3.3；
（4）不溶物再用Resuspending Buffer重悬，重复以上步骤进行超声处理。离心获取上清液，沉淀可再进行超声破碎或进行包涵体相关步骤的处理；
（5）SDS-PAGE分析超声破碎后的上清和沉淀样品。
3.3重力柱纯化步骤
纯化MBP重组蛋白所用的填料为Dextrin Sepharose HP（GE,货号：28-9355-97），大量处理样品时采用蛋白纯化系统操作。利用重力柱可以小量快速纯化所需的样品，具体步骤如下：
（1）用ddH2O配置Binding Buffer（20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;pH6.5）、Elution Buffer（20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;10mM Maltose；pH6.5），0.22μm过滤器过滤除菌；
（2）轻柔、充分翻转摇匀Dextrin Sepharose HP填料悬浊液，用宽嘴枪头吸取树脂浆。为了避免出现气泡，往柱子中添加树脂时将吸头尖端始终置于柱子液面以下；
（3）待树脂完全沉降，打开层析柱下方旋钮，当储存缓冲液（20%乙醇）液面降到柱床上沿以下时，用5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，然后再用5倍树脂体积Binding Buffer平衡树脂；
（4）待Binding Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液。将流速控制在每小时10倍柱体积为宜。如果流速过快，洗脱的目的蛋白中会混入较多的杂质。重复吸附一次，收集穿过组分并置于冰上；
（5）用5倍树脂体积Binding Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上；
（6）用8倍树脂体积Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱组分置于冰上待后续分析；将纯化产物保存于-80℃；
（7）用5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，3倍树脂体积的0.5M NaOH洗树脂，5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，5倍树脂体积的20%乙醇洗树脂，最后注入等体积20%乙醇，树脂即可长期保存于4℃；
（8）SDS-PAGE分析各组分，结果见图7。其中泳道1为恩经复原液，泳道2为菌体超声破碎后的上清，泳道3为菌体超声破碎后的沉淀，泳道4为上清液过完重力柱的流穿液，泳道5为缓冲液冲洗柱的样品，泳道6为洗脱的目的融合蛋白，泳道7为利用Factor Xa酶切MBP-NGF后的样品；MBP标签大小约43KDa，hNGF大小约为13KDa，MBP-hNGF融合蛋白大小约为56KDa，图中所示结果与之相符合。
4.MBP亲和标签的去除
利用Factor Xa Protease（QIAGEN，货号：33223）切割MBP-NGF，按protocol进行操作。切割效果见图7泳道7；利用Xa Removal Resin（QIAGEN，货号：33213）吸附去除残留的Factor Xa；切割下来的MBP标签和未切割的MBP-NGF融合蛋白利用DextrinSepharose HP（GE,货号：28-9355-97）吸附；以上操作后可获得高纯度的β-rhNGF。SDS-PAGE检测去除标签效果，结果见图8。从图8中可以看出，纯化效果特别好，没有杂质。
纯化获得rhNGF的得率约为50%，纯度可达99%。
5.β-rhNGF生物学活性检测
细胞培养板用无菌L-多聚赖氨酸包被，取9d龄鸡胚（白壳蛋鸡），显微解剖镜下，剥离背根神经节，分散接种在无血清的DMEM培养基中，实验组中加入纯化的β-hNGF，37℃培养48h，倒置显微镜下观察突起生长。检测结果见图9，以7ng的恩经复（mNGF）原液为对照（厦门北大之路生物工程有限公司上市产品）；hNGF为7ng纯化的β-hNGF。从图7可以看出：添加纯化的β-hNGF的处理的背根神经节四周长出了放射状的神经纤维，生长状况与mNGF相当，表明利用本方案表达、纯化获得的β-hNGF与恩经复具有相当的生物活性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Figure IDA0000458940110000011
Figure IDA0000458940110000021
Figure IDA0000458940110000031

Claims (7)

1.一种野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，包括如下步骤，
1）hNGF片段获取：
PCR扩增：上游引物5’端引入XmnI酶切识别位点序列GAAGGAGTTC，下游引物引入多克隆位点上其他任意酶切识别位点，同时下游引物的反义链3’端必须带有终止密码子；利用该对引物扩增β-hNGF成熟肽编码序列；或
通过人工合成或在上游引物中引入Ile-Glu-Gly-Arg或Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr的编码碱基进行扩增；
2）酶切：分别双酶切PCR产物和载体并回收；所述载体带有类似XmnI酶切识别位点或表达产物可被Factor Xa的内切酶酶切的载体；
3）连接：T4连接酶连接载体和双酶切后的PCR产物，转化大肠杆菌表达菌株并进行鉴定；
4）诱导表达：IPTG诱导表达；
5）亲和层析纯化：麦芽糖蛋白亲和层析纯化获得MBP-NGF重组蛋白；
6）获得野生型β-hNGF：Factor Xa或肠激酶或Genenase I切除MBP标签蛋白，获得野生型β-hNGF。
2.权利要求1所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，所述1）步骤中的PCR扩增，上游引物序列为SEQ ID NO:1，下游引物序列为SEQ ID NO:2，下游引物带HindIII酶切位点。
3.权利要求1所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，所述2）酶切中，所述载体为pMAL-c2X，pMAL-p2X，pMAL-c2E,pMAL-p2E,pMAL-c2G,pMAL-p2G,pGEX-4T-1或pGEX-4T-2。
4.权利要求1所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，所述5）亲和层析纯化为：
（1）低温离心收集目的蛋白表达菌体；
（2）用Resuspending Buffer重悬菌体，在冰水浴中进行超声波破碎，所述Resuspending Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;1mM DTT；pH6.5；
（3）低温离心，缓慢吸取上清液，滤膜过滤后移至新离心管中，置冰上待纯化；
（4）不溶物再用Resuspending Buffer重悬，重复以上步骤进行超声处理；离心获取上清液，沉淀可再进行超声破碎或进行再次重复；
（5）重力柱纯化或者
Figure FDA0000458940040000021
蛋白纯化：
所用的填料为Dextrin Sepharose HP，
轻柔、充分翻转摇匀填料悬浊液，用宽嘴枪头吸取树脂浆，待树脂完全沉降，打开层析柱下方旋钮，当储存缓冲液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下时，用5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，然后再用5倍树脂体积Binding Buffer平衡树脂；
待Binding Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液;将流速控制在每小时10倍柱体积;重复吸附一次，收集穿过组分并置于冰上；
用5倍树脂体积Binding Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上；
用8倍树脂体积Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱组分置于冰上；
所述收集穿过组分即为纯化后的MBP-NGF重组蛋白；
所述Binding Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;pH6.5、ElutionBuffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;10mM Maltose；pH6.5；均用ddH2O配置Binding Buffer、Elution Buffer，0.22μm过滤器过滤除菌。
5.权利要求1所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，所述5）亲和层析纯化为：
（1）低温离心收集目的蛋白表达菌体；
（2）用10mL Resuspending Buffer重悬200ml LB培养的沥干菌体，在冰水浴中进行超声波破碎，超声破碎条件：25%脉冲，功率200w，10min，开1s关2s；所述ResuspendingBuffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;1mM DTT；pH6.5；
（3）4℃，12000rpm离心20min沉淀不溶物；缓慢吸取上清液，0.45μm滤膜过滤后移至新离心管中，置冰上待纯化；
（4）不溶物再用Resuspending Buffer重悬，重复以上步骤进行超声处理；离心获取上清液，沉淀可再进行超声破碎或进行再次重复；
（5）重力柱纯化或者
Figure FDA0000458940040000022
蛋白纯化：
所用的填料为Dextrin Sepharose HP，
轻柔、充分翻转摇匀填料悬浊液，用宽嘴枪头吸取树脂浆，待树脂完全沉降，打开层析柱下方旋钮，当储存缓冲液即20%乙醇液面降到柱床上沿以下时，用5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，然后再用5倍树脂体积Binding Buffer平衡树脂；
待Binding Buffer流到柱床上沿以下，加入制备好的蛋白抽提液;将流速控制在每小时10倍柱体积;重复吸附一次，收集穿过组分并置于冰上；
用5倍树脂体积Binding Buffer洗柱，收集穿过组分并置于冰上；
用8倍树脂体积Elution Buffer洗脱目的蛋白，收集洗脱组分置于冰上；
所述收集的穿过组分和洗脱组分即为纯化后的MBP-NGF重组蛋白；
所述Binding Buffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;pH6.5、ElutionBuffer为20mM Tris-HCl;50mM NaCl;1mM CaCl2;10mM Maltose；pH6.5；均用ddH2O配置Binding Buffer、Elution Buffer，0.22μm过滤器过滤除菌。
6.权利要求4或5所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，最后还包括用5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，3倍树脂体积的0.5M NaOH洗树脂，5倍树脂体积的ddH2O洗树脂，5倍树脂体积的20%乙醇洗树脂，最后注入等体积20%乙醇，树脂即可长期保存于4℃。
7.权利要求1所述野生型β-hNGF的制备方法，其特征在于，所述6）获得野生型β-hNGF为利用Factor Xa Protease或肠激酶或Genenase I切割MBP-NGF，再用Xa Removal Resin吸附去除残留的Factor Xa；切割下来的MBP标签和未切割的MBP-NGF融合蛋白利用DextrinSepharose HP吸附。
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