CN103869040B - 一种特立齐酮中d‑环丝氨酸含量的测定分析方法 - Google Patents
一种特立齐酮中d‑环丝氨酸含量的测定分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种特立齐酮中D‑环丝氨酸含量的测定分析方法，该方法用2，4‑二硝基氟苯（DNFB）作为衍生试剂与特立齐酮中D‑环丝氨酸形成衍生物，然后用高效液相色谱法测定衍生物的含量，从而得出特立齐酮中D‑环丝氨酸的含量。该分析方法与现有技术相比具有专一性好,灵敏度高，重现性好等特点。
Description
技术领域
本发明涉及用2，4-二硝基氟苯(DNFB)衍生D-环丝氨酸，用高效液相色谱法测定衍生物的含量，从而计算出特立齐酮中D-环丝氨酸的含量。此方法能较好的控制原料药中D-环丝氨酸含量，为患者的健康用药提供保障，属于医药技术领域。
技术背景
特立齐酮，化学名
4，4′-[1，4-Phenylenebis(methylidynenitrilo)]bis(isoxazolidin-3-one)
为一种抗结核、麻风分支杆菌类药物。结构如下：
特立齐酮中含有反应残留或者降解产生的D-环丝氨酸，结构如下：
准确定量地测定特立齐酮中的D-环丝氨酸含量极具挑战性。D-环丝氨酸极性很大，不具备敏感的紫外吸收基团，并且在酸碱条件下不够稳定。更为复杂的是特立齐酮本身在水存在的条件下，会生成D-环丝氨酸。其生成含量取决于系统中水的含量高低。其水解平衡如下：
因此，很难采用气相、液相色谱和其他分析手段对其进行直接测定。此外，由于分析测定系统中存在有不确定量的水而产生不确定量的D-环丝氨酸使得分析结果的准确性变得很不确定，常使分析结果偏高，并且无法控制结果的精密度。
目前，测定特立齐酮中D-环丝氨酸含量的方法采用经典的比色法，其专一性、灵敏度、方法精密度和重复性都存在很大的缺陷，不能提供可靠的分析结果。为了克服原方法的缺陷，本发明采用2，4-二硝基氟苯(DNFB)作为衍生试剂与D-环丝氨酸形成稳定的衍生物。形成的衍生物具备优异的液相色谱分离和紫外检测等特征。该分析方法具有专一性好、灵敏高、重现性好等特点。
发明内容
如上所述，直接定量测定D-环丝氨酸存在各种缺陷。然而，利用D-环丝氨酸带有伯胺基团这一特征，可改造其特性使之转化为适合定量分析的分子结构。利用2，4-二硝基氟苯能快速定量地同胺基基团发生化学反应的性质，而衍生试剂与D-环丝氨酸形成的衍生物具有稳定性强和非常适合反相液相色谱分离的低极性特征。除此之外，该衍生物在长波长紫外区(348nm)有强烈吸收这一特征使本方法的灵敏度和专一性大大提高。衍生化学反应式如下：
通过试验发现特立齐酮在二甲亚砜(DMSO)中有非常好的溶解性。本发明将用二甲亚砜(DMSO)作为稀释剂。该分析方法的关键点是对分析系统中水份进行严格控制。由于分析系统中含有不确定量的水，这些水将使特立齐酮水解产生不确定量的D-环丝氨酸，从而使测定结果偏高、重现性较差。为了确保系统中水份含量恒定，并低于可接受的实验误差，本发明在干燥的二甲亚砜(DMSO)反应溶剂加入过量強脱水试剂N，N’-二环己基碳亚胺(DCC)。DCC的脱水机理如下：(本发明提到的DMSO即为二甲亚砜，DCC为N，N’-二环己基碳亚胺)
在无水DMSO溶剂中进行衍生反应能准确的定量特立齐酮中游离状态的D-环丝氨酸，后继色谱分离过程中，特立齐酮遇水产生的D-环丝氨酸不会干扰特立齐酮中原来存在的D-环丝氨酸的测定。
本发明采用的技术方案如下：
样品前处理：
稀释液，采用干燥DMSO加1％DCC(W/V)，密封于40C放置12h以上备用。衍生液，用稀释液配制成约2mg/ml的DNFB溶液。标准D-环丝氨酸溶液，用稀释液精密配制约60ug/ml的标准D-环丝氨酸溶液。标准品衍生：精密加入500ul的标准D-环丝氨酸溶液于2ml的HPLC进样瓶中，然后精密加入500ul衍生液，放入恒温烘箱中，40℃放置20min，迅速进样。样品衍生：精密称取约2mg样品于2ml的HPLC进样瓶中，然后精密加入500ul稀释液，再精密加入500ul衍生液，放入恒温烘箱中，40℃放置20min，迅速进样。
本发明使用色谱柱为：Agilent Zorbax XDB-C182.1mm*50mm3.5um色谱柱。流速1.0ml/min。柱温40℃。流动相，A：水，B：乙腈，梯度如下：
| A | B | |
| 0min | 70％ | 30％ |
| 7min | 20％ | 80％ |
| 7.1min | 70％ | 30％ |
| 10min | 70％ | 30％ |
紫外检测波长：348nm
附图说明：
附图1：根据本发明实施例1得到的DNP-衍生物紫外吸收图；
附图2：根据本发明实施例1得到的D-环丝氨酸标准品衍生图谱；
附图3：根据本发明实施例2得到的特立齐酮样品衍生图谱；
附图4：根据本发明实施例3得到的特立齐酮样品加样回收率图谱。
具体实施例
为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合本发明的具体实施例作进一步说明，但其不限制于本发明。
实施例一
仪器与条件：
高效液相色谱仪：Agilent1260infinity，DAD检测器。
色谱柱：Agilent Zorbax XDB-C182.1mm*50mm3.5um
流动相：A：水 B：乙腈。
梯度如下：0～7min，有机相比例从30％～80％。7min～7.1min，有机相比例
从80％～30％。7.1min～10min，有机相比例保持30％。
柱温：40℃。
进样体积：3ul。
实验步骤：
(1)稀释液A：250ml容量瓶中加200ml干燥DMSO，加2.0g DCC，摇匀，密封，40C放置过夜。
(2)衍生液B：50mg DNFB于25ml容量瓶中，加入A定容。
(3)标准溶液C：精密称取约60mg D-环丝氨酸于10ml容量瓶中，加A定容，摇匀，精密吸取100ul于另一10ml容量瓶中，加A定容，即得C(标准溶液浓度约60ug/ml)。
(4)标准品溶液：分别精密取500ul C和500ul B于2mlHPLC进样瓶中，盖好盖子，40°烘箱中放置20min，迅速进样。记录色谱图，见典型图谱2。抽取衍生物峰的UV图谱，见典型图谱1。
实施例二
仪器与条件：
高效液相色谱仪：Agilent1260infinity，DAD检测器。
色谱柱：Agilent Zorbax XDB-C182.1mm*50mm3.5um
流动相：A：水B：乙腈。
梯度如下：0～7min，有机相比例从30％～80％。7min～7.1min，有机相比例
从80％～30％。7.1min～10min，有机相比例保持30％。
柱温：40℃。
进样体积：3ul。
实验步骤：
(1)稀释液A：250ml容量瓶中加200ml干燥DMSO，加2.0g DCC，摇匀，密封，40C放置过夜。
(2)衍生液B：50mg DNFB于25ml容量瓶中，加入A定容。
(3)样品溶液D：精密称取约2.0mg特立齐酮样品，分别精密取500ul A和500ul B于2mlHPLC进样瓶中，盖好盖子，40°烘箱中放置20min，迅速进样。记录色谱图，见典型图谱3。
实施例三
仪器与条件：
高效液相色谱仪：Agilent1260infinity，DAD检测器。
色谱柱：Agilent Zorbax XDB-C182.1mm*50mm3.5um
流动相：A：水B：乙腈。
梯度如下：0～7min，有机相比例从30％～80％。7min～7.1min，有机相比例
从80％～30％。7.1min～10min，有机相比例保持30％。
柱温：40℃。
进样体积：3ul。
实验步骤：
(1)稀释液A：250ml容量瓶中加200ml干燥DMSO，加2.0g DCC，摇匀，密封，40C放置过夜。
(2)衍生液B：50mg DNFB于25ml容量瓶中，加入A定容。
(3)标准溶液C：精密称取约60mgD-环丝氨酸于10ml容量瓶中，加A定容，摇匀，精密吸取100ul于另一10ml容量瓶中，加A定容，即得C约60ug/ml。
(4)样品溶液E：精密称取约2.0mg特立齐酮样品，分别精密取500ul C和500ul B于2mlHPLC进样瓶中，盖好盖子，40°烘箱中放置20min，迅速进样。记录色谱图，见典型图谱4。
Claims (2)
1.一种特立齐酮中D-环丝氨酸含量的测定分析方法，其特征在于用2，4-二硝基氟苯(DNFB)作为衍生试剂与特立齐酮中D-环丝氨酸形成衍生物，然后用高效液相色谱法测定衍生物的含量，从而得出特立齐酮中D-环丝氨酸的含量；所述2，4-二硝基氟苯(DNFB)与D-环丝氨酸衍生的反应中用二甲亚砜(DMSO)作为稀释剂和衍生反应溶液；稀释剂二甲亚砜溶剂中加入强脱水试剂N,N’-二环己基碳亚胺；所述高效液相色谱法的测定条件为：色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18，2.1mm*50mm，3.5μm色谱柱；流速1.0ml/min；柱温40℃±0.8℃之间；流动相为水和乙腈进行梯度洗脱，梯度如下：0～7min，有机相比例从30％～80％；7min～7.1min，有机相比例从80％～30％；7.1min～10min，有机相比例保持30％。
2.根据权利要求1所述的一种特立齐酮中D-环丝氨酸含量的测定分析方法，其特征在于该方法包括以下几个步骤：
(1)取特立齐酮原料或制剂粉末，以含有N,N’-二环己基碳亚胺的二甲亚砜作为稀释剂，2，4-二硝基氟苯作为衍生剂制备得到样品衍生溶液；
(2)采用Agilent Zorbax XDB-C18，2.1mm*50mm，3.5μm的色谱柱，流动相为水和乙腈进行梯度洗脱；
(3)柱温控制在40℃±0.8℃之间，取(1)的样品衍生溶液进样，记录色谱图。
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