CN103864642B - 大黄酸衍生物及其合成方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及大黄酸类衍生物及其合成方法和用途。具体地说本发明公开要求保护通式(I)化合物

Description

大黄酸衍生物及其合成方法和用途

技术领域

本发明属于制药领域，涉及大黄酸氨基酸衍生物及其合成方法和用途。

背景技术

近年来的研究表明，大黄酸可通过促进细胞凋亡、细胞周期抑制、阻止DNA损伤修复、抑制血管生成等作用发挥一定的抗癌活性，对乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、舌癌、鼻咽癌、肝癌细胞均有一定的抑制增殖作用。由于癌细胞快速增殖，所以需要更多的氨基酸，如尝试将大黄酸与各种氨基酸分子连接，组成新的化合物，则有可能更易将目标化合物靶向作用于癌细胞。

基于上述思路，我们以大黄酸作为母体，设计合成了一系列的大黄酸氨基酸衍生物，并进行了抗肿瘤活性和放射增敏活性测试。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤作用且具有放射增敏作用的大黄酸衍生物。

本发明的第二个目的是提供大黄酸衍生物的合成方法。

本发明的第三个目的是提供大黄酸衍生物的用途。

1.一种式I的化合物

R为L-氨基酸残基和2-氨基丁酸

所述氨基酸为L-丙氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-谷氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺、L-丝氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-甘氨酸、L-脯氨酸和2-氨基丁酸。

2.式I化合物的合成方法，包括如下步骤：

将1-2g氨基酸加入甲醇中，-30℃-0℃环境下逐滴加入1-3ml二氯亚砜，始终保持溶液温度在0℃以下，室温搅拌过夜，减压蒸馏得氨基酸盐酸盐固体或粘稠物。取40mg大黄酸和相应换算量的氨基酸盐酸盐或粘稠物二氯甲烷溶液，再将35-65mgEDC·HCl和15-35mgHOBt一起倒入含有二氯甲烷的圆底烧瓶中，混匀，加入10-20滴三乙胺，室温搅拌4-5h，点薄层板对比。过硅胶柱，收集第二个条带，旋转干得大黄酰氨基酸酯。向所得酯中加入1MNaOH溶液，搅拌一段时间后逐滴加入盐酸，至析出淡黄色固体，并且溶液搅拌后不再变紫。过滤，产物用水和乙醇各冲洗一遍，干燥，得黄色大黄酰氨基酸固体。

3.含有上述大黄酸衍生物和其药学上可接受的盐的药物组合物，是用所述大黄酸衍生物和其药学上可接受的盐为活性成分与药学上可接受的辅料制成的注射剂、口服剂、喷剂或霜剂。

4.上述大黄酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物和放射增敏药物中的应用，所述肿瘤优先为肺癌。

5.上述大黄酸衍生物及其药学上可接受的盐的药物组合物在制备抗肿瘤药物和放射增敏药物中的应用，所述肿瘤优先为肺癌。

实验证明，本发明的大黄酸衍生物对肺癌H460细胞有明显的细胞毒作用；初步放射增敏实验说明了本发明的衍生物有一定的放射增敏作用，表明本发明的衍生物在作为抗肿瘤药物和放射增敏药物方面的前景。

具体实施方法

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不作为对本发明的任何限制。

实施例1

大黄酰亮氨酸的制备

加50ml甲醇于100ml圆底烧瓶中，置于冷阱中15-30min，温度计测定烧瓶内甲醇温度保持在-10℃以下。称取1.5gL-亮氨酸，加入圆底烧瓶中。沿瓶壁，缓慢多次地加入1.5-2个当量的二氯亚砜液体，期间随时监测瓶内温度，保持在0℃以下。然后冷阱中搅拌至氨基酸溶解后，继续搅拌1-2h，再转移至室温，搅拌过夜。发现析出少量白色晶体，减压抽干，加入二氯甲烷，反复抽干两次，得到亮氨酸甲酯盐酸盐。在50ml圆底烧瓶中加入30mg大黄酸，40mgEDC·HCl，20mgHOBt，1.5-2个当量的亮氨酸甲酯盐酸盐，然后加入25ml二氯甲烷，再加入4-5个当量的三乙胺，搅拌，溶解，变紫红色澄清液体。室温搅拌4-6h，TCL(氯仿作展开剂)监测反应。过硅胶柱，氯仿洗脱，收集第二条带，旋干得大黄酰氨基酸酯。向上述大黄酰氨基酸甲酯中，加入1MNaOH溶液，45℃搅拌1-2h后，逐滴加入10％盐酸，紫色溶液变浅，至析出淡黄色固体，再加两滴，至溶液搅拌不再变紫。过滤，再用水冲洗两遍，乙醇冲洗一遍，干燥，得黄色大黄酰亮氨酸固体。TCL(甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7.5∶2∶0.5)得只有一个比原料大黄酸极性大的黄点。产率64.3％。mp.201-205℃(分解)；¹HNMR(300MHz；DMSO-d6/TMS；25℃)δ(ppm)：12.69(s，1H，4’-COOH)，11.89(s，2H，1and8-OH)，9.10-9.07(d，1H，2’-H)，8.17-8.16(s，1H，4-H)，7.85-7.73(m，3H，5，6，7-H)，7.42-7.39(d，1H，2-H)，4.49-4.42(m，1H，3’-H)，1.84-1.58(m，3H，5’-H6’-H)，0.95-0.88(dd，6H，7’-H8’-H)，

用原料L-异亮氨酸，L-色氨酸，2-氨基丁酸替代实施例1中的L-亮氨酸，其它同实施例1，制备出化合物大黄酰异亮氨酸和大黄酰色氨酸。

大黄酰异亮氨酸的波谱数据：黄色粉末状固体；产率60.2％，mp.210-212℃(分解)；¹HNMR(300MHz；DMSO-d6/TMS；25℃)δ(ppm)：12.73(s，1H，4’-COOH)，11.91(s，2H，1and8-OH)，9.00-8.97(d，1H，2’-H)，8.12(s，1H，4-H)，7.85-7.72(m，3H，5，6，7-H)，7.42-7.39(d，1H，2-H)，4.36-4.31(t，1H，3’-H)，1.97(s，1H，5’-H)，1.34-1.22(m，2H，7’-H)，0.96-0.86(m，6H，6’-H8’-H)。

大黄酰色氨酸的波谱数据：棕色粉末状固体；产率27.8％，mp.140-142℃(分解)；¹HNMR(300MHz；DMSO-d6/TMS；25℃)δ(ppm)：12.699(s，1H，4’-COOH)，11.827(s，2H，1and8-OH)，10.776(s，1H，8’-H)，9.120(s，1H，2’-H)，8.082(s，1H，4-H)，7.791-7.701(m，3H，5，6，7-H)，7.598-7.572(d，1H，2-H)，7.359-7.284(m，2H，11’and14’-H)，7.188(s，1H，7’-H)，7.057-6.940(m，2H，12’and13’-H)，4.691(s，1H，3’-H)，3.353-3.194(m，2H，5’-H)。

大黄酰正丁酸的波谱数据：产率72.4％，mp.260-266℃(分解)；¹HNMR(300MHz；DMSO-d6/TMS；25℃)δ(ppm)：12.759(s，1H，4’-COOH)，11.891(s，1H，1or8-OH)，9.077(s，1H，2’-H)，8.164(s，1H，4-H)，7.813-7.680(m，3H，5，6，7-H)，7.406-7.314(d，1H，2-H)，4.303(s，1H，3’-H)，1.849-1.643(m，2H，5’-H)，1.026-0.969(m，3H，6’-H)。

实施例2

大黄酰天冬氨酸的制备：

加50ml甲醇于100ml圆底烧瓶中，置于冷阱中15min，温度计测定烧瓶内甲醇温度保持在-10℃以下。称取1.5gL-天冬氨酸，加入圆底烧瓶中。沿瓶壁，缓慢多次地加入1.5eq的二氯亚砜液体，期间随时监测瓶内温度，保持在0℃以下。然后冷阱中搅拌至天冬氨酸溶解后，继续搅拌1h，再转移至室温，搅拌过夜。减压抽干，得黄色粘稠状液体。加入定量二氯甲烷，得到定量溶液。在50ml圆底烧瓶中加入40mg大黄酸，38.4mgEDC·HCl，20mgHOBt，适量天冬氨酸甲酯溶液，然后加入适量二氯甲烷，再加入4-5个eq的三乙胺，搅拌，溶解，变紫红色澄清液体。室温搅拌5h，TCL(氯仿作展开剂)监测反应。过柱，氯仿洗脱，收集第二条带，旋干得大黄酰天冬氨酸甲酯。向上述大黄酰天冬氨酸甲酯中，加入1MNaOH溶液，45℃搅拌1h后，逐滴加入10％盐酸，紫色溶液变浅，至析出淡黄色固体，再加两滴，至溶液搅拌不再变紫。过滤，再用水冲洗两遍，乙醇冲洗一遍，干燥，得黄色大黄酰天冬氨酸固体。TCL(甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝7.5∶2∶0.5)得只有一个比原料大黄酸极性大的黄点。产率28.9％，mp.214-218℃(分解)；¹HNMR(300MHz；DMSO-d6/TMS；25℃)δ(ppm)：12.719(s，2H，4’and6’-COOH)，11.873(s，2H，1and8-OH)，9.225-9.201(d，1H，2’-H)，8.127(s，1H，4-H)，7.839-7.717(m，3H，5，6，7-H)，7.405-7.328(t，1H，2-H)，4.793-4.724(q，1H，3’-H)，2.911-2.699(m，2H，5’-H)。

用原料L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-脯氨酸替代实施例2中的L-天冬氨酸，其它同实施例2，制备出化合物大黄酰谷氨酸、大黄酰蛋氨酸和大黄酰脯氨酸。

大黄酰谷氨酸的波谱数据：产率28.9％，mp.221-225℃(分解)；¹HNMR(300MHz；DMSO-d6/TMS；25℃)δ(ppm)：12.416(s，2H，4’and7’-COOH)，11.833-11.814(d，2H，1and8-OH)，9.050-9.028(d，1H，2’-H)，8.117(s，1H，4-H)，7.804-7.679(m，3H，5，6，7-H)，7.364-7.388(d，1H，2-H)，4.436(s，1H，3’-H)，2.404-2.358(t，2H，6’-H)，2.138-1.948(m，2H，5’-H)。

大黄酰蛋氨酸的波谱数据：产率33.6％，mp.237-240℃(分解)；¹HNMR(300MHz；DMSO-d6/TMS；25℃)δ(ppm)：12.765(s，1H，4’-COOH)，11.840(s，2H，1and8-OH)，9.083-9.060(d，1H，2’-H)，8.118(s，1H，4-H)，7.774-7.682(m，3H，5，6，7-H)，7.368-7.342(d，1H，2-H)，4.548-4.526(d，1H，3’-H)，2.593-2.564(d，2H，5’-H)，2.061(s，5H，6’and8’-H)。

大黄酰脯氨酸的波谱数据：产率21.5％，mp.114-117℃(分解)；¹HNMR(300MHz，DMSO-d6/TMS；25℃)δ(ppm)：12.666(s，1H，7’-COOH)，11.880(s，2H，1and8-OH)，8.063(s，1H，4-H)，7.800-7.514(m，3H，5，6，7-H)，7.394-7.12(m，1H，2-H)，4.429-4.337(m，1H，3’-H)，3.609-3.490(m，2H，6’-H)，2.304-2.286(d，2H，4’-H)，1.895(s，2H，5’-H)。

实施例3

用原料L-苏氨酸丙酯盐酸盐、L-缬氨酸乙酯盐酸盐、L-甲硫氨酸乙酯盐酸盐、L-谷氨酰胺乙酯盐酸盐、L-天门冬酰胺乙酯盐酸盐、L-丝氨酸乙酯盐酸盐、L-半胱氨酸乙酯盐酸盐、L-精氨酸乙酯盐酸盐、L-组氨酸乙酯盐酸盐、L-酪氨酸乙酯盐酸盐替代实施例1中制得的氨基酸甲酯盐酸盐，其它同实施例1，经检测得到了相应的大黄酰氨基酸产物。

实施例4

本发明采用体外细胞毒实验，通过检测离体培养癌细胞加入待测样品(样品用二甲亚砜进行连续梯度稀释)后的存活率，来确定样品的活性程度。选取的肿瘤细胞株为H460肺癌细胞。采用MTT法测定各化合物对每种癌细胞的死亡率(或存活率)为50％时的抑制浓度(IC₅₀，48h和24h)。由于大黄酰氨基酸水溶性很差，所以将实施例1-2得到的大黄酸衍生物碱化得其钠盐，再进行实验，结果见表1。

表1.各化合物对H460的细胞毒作用(IC₅₀/48h、IC₅₀/24h)

“-”：低浓度有明显地促进增殖作用，未测出数值。

实施例5

初步放射增敏实验：

由MTT结果，选取大黄酰亮氨酸钠和大黄酰异亮氨酸钠做初步放射增敏实验，大黄酸钠作原料对比，表柔比星作为阳性对照。选取化合物的48hIC₂₀值作放射增敏测试浓度。按2×10⁴个/mL细胞液，200μL/孔接种于96孔培养板中，37℃、5％CO₂的培养箱培养24h使细胞贴壁生长。加药，培养24h后照射。分五个剂量组，0、1、2、4、6Gy，照射后继续培养24h，加入15μLMTT(5mg·mL^-1)试液，培养4h，吸出培养液，加入DMSO150μL/孔，振摇5min，酶标仪492nm处测定吸收值。比较单纯照射组和照射合并给药组，初步判断是否有放射增敏作用。结果见表2。

表2所选取化合物合并照射所得OD₄₉₂吸收值(n＝6，)

注：与单纯对照组相比，^#P＜0.01；^*P＜0.05

初步放射增敏实验说明了本专利所涉及的衍生物具有一定的放射增敏作用，即与射线共同作用于肿瘤细胞时，能够提高射线杀伤细胞的能力；这表明了本专利所涉及的衍生物在抗肿瘤方面的前景。

经实验证明，对实施例中肺癌细胞，大黄酰亮氨酸钠、大黄酰异亮氨酸钠、大黄酰蛋氨酸钠、大黄酰脯氨酸钠和大黄酸正丁酸钠的细胞毒作用(IC₅₀/24h)都较相应的前体化合物大黄酸钠强。在放射增敏实验中：大黄酰异亮氨酸钠的放射增敏作用较相应的大黄酸钠强。

Claims (4)

1.如式(I)所示的大黄酸衍生物或其药学上可接受的盐类，

式(I)中R为L-异亮氨酸残基。

2.权利要求1所述的大黄酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备肺癌放射治疗增敏药物中的应用。

3.一种药物组合物，包括权利要求1所述的大黄酸衍生物或其药学上可接受的盐为活性成分，以及一种或几种药学上可接受的赋形剂或载体。

4.权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物可以是注射剂、口服剂、喷剂或霜剂。