CN103860658A - 红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用。粉碎自然风干的红茂草，过筛，得红茂草粉末；室温下、用乙醇溶液密闭浸泡红茂草粉末，然后加热、超声波振荡、回流提取，将提取液减压蒸馏至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物。将红茂草乙醇浓缩提取物用于制备治疗动物外伤及传染性化脓性皮肤炎的药物中，为红茂草提取物在中兽医医药方面的开发和利用提供一定理论参考。

Description

红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用

技术领域

本发明属于兽医医药技术领域，涉及一种中药提取物的新用途，具体涉及一种红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用，为该提取物在中兽医医药方面的开发和利用提供一定理论参考。 

背景技术

红茂草[Dicranostigma leptopodum(Maxim.)Fedde]又名秃疮花、秃子花、勒马回，系罂粟科(Pa-paveraceae)红茂草属植物。主要分布在我国甘肃、陕西、河南、山西、青海、四川、云南、西藏等省区的低山丘陵地带。春、夏两季均可采挖带根全草，阴干或鲜用。全草有毒，味苦、涩，性凉。红茂草在民间全草入药，有清热解毒、消肿止痛、杀虫等功效。主治扁桃体炎、牙痛、咽喉痛、淋巴结核，外用于秃疮、疮疖疥癣、痈疽等症。红茂草能有效抑制由扑热息痛、卡介苗合并脂多糖、CCl₄引起的小鼠肝损伤，并可抑制由H₂O₂和乙酰苯肼引发的红细胞氧化性溶血，还具有增强小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能及抗肿瘤作用。红茂草注射液可抑制细菌的生长和Orf病毒的繁殖，使脾脏T细胞增殖与活化，诱导IL-2分泌，对移植性S₁₈₀肉瘤的抑制率达50%以上，对CCl₄造成的急性肝损伤有明显的保护作用，对各类结核的总有效率为98.44%，对淋巴结核、骨结核及窦道溃疡患者等有效。近年来的研究发现，红茂草可显著促进荷瘤小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞的增殖，增强外周血NK细胞杀伤靶细胞K₅₆₂的活性。

为了更好的利用红茂草，专利《红茂草乙醇浓缩提取物在制备抗黑色素瘤转移药物中的应用》）专利号ZL201110299601.3，公告号CN102357123B，公告日2013.06.05）提供了一种红茂草乙醇浓缩提取物在抗肿瘤药物中的新用途，该醇提取物具有抗肿瘤转移作用，可以将红茂草乙醇浓缩提取物应用于抗黑色素瘤转移药物中。 

发明内容

本发明的目的是提供一种红茂草提取物在制备外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用。

所述红茂草提取物采用如下方法制备而成：粉碎自然风干的红茂草，过筛，得红茂草粉末；室温下、用乙醇溶液密闭浸泡红茂草粉末，然后加热、超声波振荡、回流提取，将提取液减压蒸馏至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物。

进一步的，所述的红茂草提取物采用如下方法制备而成：粉碎自然风干的红茂草，过60～80目筛；室温下、用浓度70～75%乙醇溶液密闭浸泡15.0g红茂草粉末48～72小时，然后加热至35～40℃，超声波振荡25～30分钟，回流提取1.2～1.5小时，在30～35℃温度下减压蒸馏提取液至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物。

本发明提供的红茂草乙醇浓缩提取物的新用途，用于制备治疗动物外伤及传染性化脓性皮肤炎的药物中，为红茂草提取物在中兽医医药方面的开发和利用提供一定理论参考。西北野生药用植物红茂草乙醇浓缩提取物，肌肉注射BALB/c小鼠，注射后在不同时间采集小鼠心、肝、脾、肺、肾和注射部位肌肉组织，通过制作切片，用HE染色法进行染色后镜检，未发现典型性病理变化。说明红茂草乙醇浓缩提取物注射小鼠后并未引起各种脏器的病理变化，从而明确了红茂草药物的毒性大小，进而为红茂草临床用药安全提供了实验依据。将提取物作用于动物外伤及传染性化脓性皮肤炎的治疗，发现其对动物外伤、疥癣和瘘管及传染性化脓性皮肤炎的治疗效果，在中兽医医药方面的开发和利用提供一定理论参考。

附图说明

图1是肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第3天的肝脏切片显微镜图。

图2是肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第3天的心脏切片显微镜图。

图3是肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第3天的脾脏切片显微镜图。

图4是肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第3天的肺脏切片显微镜图。

图5肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第3天的肾脏切片显微镜图。

图6肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第3天的肌肉组织切片显微镜图。

图7肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第21天的心脏切片显微镜图。

图8肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第21天的肝脏切片显微镜图。

图9肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第21天的脾脏切片显微镜图。

图10肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第21天的肺脏切片显微镜图。

图11肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第21天的肾脏切片显微镜图。

图12肌肉注射浓度为8mg/mL红茂草乙醇浓缩提取物的实验组小鼠注射第21天的肌肉组织切片显微镜图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

为了更好地理解本发明，下面以红茂草乙醇浓缩提取物的药理试验及实验结果来说明其在兽药制药领域中的新用途。以下是红茂草乙醇浓缩提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用研究，实验方法及结果如下：

一、红茂草乙醇浓缩提取物的制备：

红茂草自然风干，粉碎，过60～80目筛，得红茂草粉末；称取15.0g该红茂草粉末，用浓度70～75%乙醇溶液密闭浸泡红茂草粉末，室温下密闭浸泡48～72小时，然后加热至35～40℃，超声波振荡25～30分钟，在索氏提取器中回流提取1.2～1.5小时，提取液装入锥形瓶，置于旋转蒸发仪中、在30～35℃温度下减压蒸馏至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物（生物碱含量为20±2mg/mL），封口、静置、备用。

二、红茂草乙醇浓缩提取物对小鼠的毒性实验

材料与方法

、材料

药品与试剂

生物碱含量为20mg/mL的红茂草乙醇浓缩提取物。其余试剂均为国产或进口分析纯。

主要仪器

电热恒温培养箱（上海精密实验设备公司）、循环水浴锅（Grant，英国）、电热恒温水浴锅（北京长风仪器仪表公司）、高速离心机（Eppendorf，德国）、YB-6LF包埋机（MICROM，德国）、烤片台（北京市医疗设备厂）、切片机（MICROM，德国）、包埋盒（北京市医疗设备厂）等。

溶液配制

4%甲醛溶液：10mL甲醛溶液（AR），加90mL蒸馏水。

卡诺氏固定液：用纯酒精3重量份和冰醋酸1重量份配制而成；或者用纯酒精6重量份、氯仿3重量份和冰醋酸1重量份配制而成。

埃利希苏木精染液：分别取苏木精1g、纯酒精50mL、冰醋酸5mL、甘油50mL、硫酸铝钾约5g（饱和量）和蒸馏水50mL；将苏木精加入约15mL纯酒精中，再加入冰醋酸，搅拌至苏木精完全溶解后，加入甘油，并摇动容器，同时加入剩余的纯酒精，形成混合液；将硫酸铝钾在研钵中研碎并加热，然后加入蒸馏水中，形成硫酸铝钾溶液；将温热的硫酸铝钾溶液逐滴加入配制的混合液中，持续搅动，溶液混合完毕后，形成混合溶液。此时可采用下述两种方式中的一种使该混合溶液成熟：1）用棉塞封闭容器口，置避光通风处，并经常摇动以促进其成熟，成熟时间约为3～4周，制得埃利希苏木精染液。2）加入0.2g碘酸钠，混合溶液立即成熟，制得埃利希苏木精染液。埃利希苏木精染液很稳定，不会发生沉淀，可长期贮备，该染液也可分别与伊红等进行二重染色。

1%伊红酒精溶液：伊红1g溶于100ml体积百分比浓度为95%的酒精溶液中。

1%盐酸乙醇溶液：浓度为36%的浓盐酸1体积份和体积浓度为70%的酒精100体积份配制而成。

甘油蛋白贴片剂：分别取蛋清50mL、甘油50mL和水杨酸钠（防腐剂）1g；用玻璃棒将蛋清打成雪花状泡沫，双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，滤出透明蛋白液；此时在量筒中再加入与透明蛋白液等量的甘油，稍稍振摇使两者混合，最后加入水杨酸钠防腐，可保存几个月。

二甲苯、中性树胶和不同浓度的酒精（30%、50%、70%、80%、95%、100%）等。

实验动物 

40日龄的BALB/c实验小鼠（18～20g）90只（购自卫生部兰州生物制品所，雌雄各半）。

、方法

实验分组与免疫

将90只BALB/c小鼠随机分为5组，其中4组（A、B、C、D）为实验组，每组20只；E为对照组，对照组10只，雌雄各半。四个实验组分别用不同浓度（2mg/kg、4mg/kg、6mg/kg、8mg/kg）的红茂草乙醇浓缩提取物进行肌肉注射，每只注射200μl。对照组每只小鼠采用相同的方法、相同的剂量注射生理盐水。

样品采集

注射后第1d、3d、7d、10d、15d、21d、28d分别取每个实验组的小鼠剖杀，采集心、肝、脾、肺、肾及免疫部位肌肉组织置于10%的甲醛溶液中固定备用。

制作病理切片

（1）取材：将保存于10%甲醛溶液中的小鼠组织脏器取出后，切取约5mm×5mm×2mm大小，放置于包埋盒中。

（2）固定：将包埋合置于固定液中固定30～50min。

（3）洗涤：将包埋合中的组织材料进行充分洗涤（除含酒精外）。

（4）脱水：洗涤后，将每个切片置于30%、50%、80%、90%的各级酒精中分别浸泡40min，再放入95%和100%的酒精分别浸泡2～3次，每次20min（更换高一级脱水剂时，应吸干包埋合中的液体）。

（5）透明：在纯酒精、二甲苯等量混合液中透明15min，二甲苯30min，再换一次二甲苯重复透明实验。如果在透明过程中材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未脱尽，应退回纯酒精中重新脱水，然后再进行透明。

（6）透蜡：将透明后的样品放入二甲苯和石蜡各半的混合液透蜡15min，再放入石蜡中分别透蜡20～30min，使石蜡渗透到样品组织内部达到饱和程度以便包埋（透蜡在55～60℃温箱中进行）。

（7）包埋：在包埋机上进行包埋。

（8）切片：在切片机上切片，一般切片厚度为4～10μm。

（9）贴片：在洁净的载玻片上均匀的涂上蛋白甘油，以便牢固的粘贴切片，然后贴片。

（10）脱蜡复水：石蜡切片经二甲苯脱蜡5～10min，然后依次放入浓度为100%、95%、90%、80%、70%、50%的酒精溶液中分别浸泡1～2min，再放入蒸馏水中浸泡3min。

（11）染色：脱蜡复水切片放入苏木精中染色约10min。

（12）水洗：用自来水冲洗约10min，冲洗过程中切片颜色变蓝。

（13）分化：将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒钟。这一步是HE染色的关键。（就是将细胞质的着色褪去，使细胞核着色明显）

（14）脱水：切片依次放入浓度为50%、70%、80%和90%乙醇溶液中分别浸泡2～3min。

（15）复染：用0.5%伊红乙醇（0.5g伊红溶于100毫升95%乙醇）对比染色2～5min。

（16）脱水：放入体积浓度为95%的乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中浸泡3～5min，最后用吸水纸吸干多余的乙醇。

（17）透明：切片放入二甲苯和乙醇的等量混合液约5min，然后放入二甲苯中分别浸泡3～5min。

（18）封藏、中性树胶封存：在切片上涂上少量的中性树胶，盖上盖玻片，贴上标签以备镜检。

、结果与分析

组织切片观察

实验共采集标本175份，共作病理切片60张，经对每张切片进行仔细观察，发现心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和注射部位肌肉组织均无明显的病理变化。以8mg/kg剂量注射组小鼠注射后第3天和第21天各个组织器官的病理切片为例。图1～图6分别是该组小鼠注射后第3天的肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织的切片显微镜图；图7～图12分别是该组小鼠注射后第21天的肝脏、心脏、脾脏、肺脏、肾脏和肌肉组织的切片显微镜图。由组织切片镜检可以看出，在第3d或者第21d各组织脏器中均未发现明显的病理变化。虽然在第21d肝脏中，有些细胞变淡，有小空泡，这与个体差异有关；第3d在有些肌肉组织中，肌纤维变淡、均质化，血管周围有少量的淋巴细胞，单核细胞浸润，有少量的炎症变化。这是由于免疫接种后，肌肉组织中少量炎症尚未消退；在肺脏组织中，虽然能够看到有少量的淤血现象，这是由于在剖杀过程中，小鼠剧烈的挣扎而使血液逆行入肺所致，而未发现明显的炎症；在脾脏中，淋巴结、淋巴细胞、红、白髓都比较正常；在心肌中个别血管扩张，心窦中充有血液，但未发现有炎症现象和异常病变。

小鼠，在不同时间采集脏器组织和接种部位的皮肤（肌肉）组织，经HE染色镜检；除在接种后第3d接种部位肌肉组织中发现有明显的肌肉外膜纤维结缔组织急性炎症反应，有的结缔组织呈弥漫性炎症外，各种组织中未发现有明显的病理变化。虽然在肺脏中发现有些淤血和少量炎症，这是由于在剖杀小鼠时，小鼠剧烈的挣扎而使血液经气器官逆行入肺所致。在第7d，各种脏器组织中未发现明显的病理变化，而在肌肉组织中肌束膜、结缔组织中有些慢性炎症，但随着时间的推移，接种部位皮肤组织中的炎症逐渐消失，趋于正常。在第21d，各种组织HE染色镜检未见明显的病理变化。在整个实验过程中对照组中除在第3d接种部位肌肉中有少量的炎症外，其余脏器中均未发现明显的病理变化。说明红茂草乙醇浓缩提取物注射小鼠后并未引起各种脏器的病理变化，因而红茂草乙醇浓缩提取物对小鼠作用应该是安全的，为红茂草临床用药提供了实验依据。

三、红茂草乙醇浓缩提取物对动物外伤及传染性化脓性皮肤炎的治疗

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

患病羊只及其它动物，均由甘肃农业大学动物医学院提供。

1.2红茂草制剂

红茂草乙醇浓缩提取物溶液共计三个批次（批号：0911101、0911102、0911103），由天水师范学院生物工程实验室提供。

1.2方法

1.2.1动物外科创伤治疗实验

对动物因各种机械原因引起的新伤和旧伤，先用无菌干药棉沾生理盐水冲洗后，再用无菌干药棉蘸生理盐水搽洗伤口，然后用无菌干药棉沾本发明制得的红茂草乙醇浓缩提取物搽洗伤口，最后用红茂草外用敷剂（将红茂草干草粉末用水熬制而成）涂于伤口面上，并根据情况用沙布和胶布固定，每天一次，重复3～5次。对已患疥癣的动物患病部位，先用60℃左右的温水热敷10min后清除表面皮层，然后用无菌干药棉沾红茂草乙醇浓缩提取物搽洗伤口，最后用红茂草外用敷剂涂于伤口面上，并根据情况用沙布和胶布固定，每天一次，重复5～7次。对因感染而形成的瘘管，先用无菌干药棉沾红茂草乙醇浓缩提取物搽洗，彻底冲洗瘘管内部，然后用无菌干药棉将红茂草外用敷剂塞入瘘管内部，最后用沙布和胶布固定瘘管口，三天一次，重复3～5次。

1.2.2羊只传染性化脓性皮肤炎治疗实验

已患羊口疮的绵羊和山羊，用红茂草乙醇浓缩提取物进行治疗。对羊口疮引起的丘疹、水疱、脓疱、溃烂和疣状痂皮，需先划破丘疹、水疱、脓疱、溃烂和清除痂皮，用生理盐水冲洗后再用无菌干药棉蘸干，将红茂草乙醇浓缩提取物加热到40～50℃，待凉到37℃涂抹于水疱、脓疱、溃烂和疣状痂皮清除部，每天1～2次。病羊在5d内恢复正常为治愈。

2、结果与分析

2.1红茂草制剂对动物外科创伤治疗的结果与分析

红茂草乙醇浓缩提取物对动物外科创伤、疥癣和瘘管的治疗实验，其结果见表1。

表.1   动物外科创伤、疥癣和瘘管的治疗效果

由表1可知，红茂草乙醇浓缩提取物对动物外科创伤、疥癣和瘘管的治愈率分别为96.00%、86.67%和95.00%。治疗过程中发现红茂草乙醇浓缩提取物不仅对病原微生物有杀灭作用而且对外科创伤、疥癣和瘘管的愈合和组织的修复有促进作用。

2.2红茂草制剂对羊只传染性化脓性皮肤炎治疗的结果与分析

红茂草乙醇浓缩提取物对羊只传染性化脓性皮肤炎的治疗实验，其结果见表2。

表.2   红茂草乙醇浓缩提取物对羊只传染性化脓性皮肤炎治疗效果

由表2可知，三个批次的红茂草乙醇浓缩提取物对羔羊传染性化脓性皮肤炎的治愈率分别为86.9%、94.1%和95.7%；该三个批次的红茂草乙醇浓缩提取物对成年羊传染性化脓性皮肤炎的治愈率分别为91.5%、96.4%和98.2%。

从红茂草乙醇浓缩提取物对动物外科创伤、疥癣和瘘管的治疗实验结果可知，红茂草乙醇浓缩提取物对动物外科创伤、疥癣和瘘管有非常好的治疗效果，而且在治疗过程中发现红茂草乙醇浓缩提取物不仅对病原微生物有杀灭作用而且对外科创伤、疥癣和瘘管的愈合和组织的修复有促进作用。从红茂草乙醇浓缩提取物对传染性化脓性皮肤炎治疗结果看，三个批次的红茂草乙醇浓缩提取物对羔羊和成年羊的传染性化脓性皮肤炎均有良好的治疗效果，批号0911102的红茂草乙醇浓缩提取物对传染性化脓性皮肤炎治疗效果最佳。

实施例1

粉碎自然风干的红茂草，过60目筛，得红茂草粉末；将15.0g红茂草粉末加入浓度70%乙醇溶液中，室温下密闭浸泡72小时，然后加热至35℃，超声波振荡30分钟，在索氏提取器中回流提取1.5小时，提取液装入锥形瓶，置于旋转蒸发仪中、在30℃温度下减压蒸馏至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物（生物碱含量为20mg/mL），封口、静置、备用。

实施例2

粉碎自然风干的红茂草，过80目筛，得红茂草粉末；将15.0g红茂草粉末加入浓度75%乙醇溶液中，室温下密闭浸泡48小时，然后加热至40℃，超声波振荡25分钟，在索氏提取器中回流提取1.2小时，提取液装入锥形瓶，置于旋转蒸发仪中、在30℃温度下减压蒸馏至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物（生物碱含量为22mg/mL），封口、静置、备用。

实施例3

粉碎自然风干的红茂草，过70目筛，得红茂草粉末；将15.0g红茂草粉末加入浓度72%乙醇溶液中，室温下密闭浸泡60小时，然后加热至38℃，超声波振荡28分钟，在索氏提取器中回流提取1.35小时，提取液装入锥形瓶，置于旋转蒸发仪中、在33℃温度下减压蒸馏至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物（生物碱含量为18mg/mL），封口、静置、备用。 

Claims (4)

1. 一种红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用。

2. 根据权利要求1所述红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用，其特征在于，所述的红茂草提取物采用如下方法制备而成：粉碎自然风干的红茂草，过筛，得红茂草粉末；室温下、用乙醇溶液密闭浸泡红茂草粉末，然后加热、超声波振荡、回流提取，将提取液减压蒸馏至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物。

3. 根据权利要求2所述红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用，其特征在于，所述的红茂草提取物采用如下方法制备而成：粉碎自然风干的红茂草，过60～80目筛；室温下、用浓度70～75%乙醇溶液密闭浸泡15.0g红茂草粉末48～72小时，然后加热至35～40℃，超声波振荡25～30分钟，回流提取1.2～1.5小时，在30～35℃温度下减压蒸馏提取液至无醇味，制得红茂草乙醇浓缩提取物。

4. 根据权利要求3所述红茂草提取物在外伤及传染性化脓性皮肤炎药物中的应用，其特征在于，制得的红茂草乙醇浓缩提取物中生物碱含量为20±2mg/mL。

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