CN103816532A

CN103816532A - 重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用

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Publication number: CN103816532A
Application number: CN201410098980.3A
Authority: CN
Inventors: 孙非; 梁重阳; 张喜田
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-03-18
Filing date: 2014-03-18
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-03-18
Also published as: WO2015139532A1; CN103816532B

Abstract

本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用。本发明采用由阿霉素（ADR）腹腔注射建立大鼠心力衰竭模型研究rLZ-8对慢性心力衰竭的治疗作用，实验研究结果表明，rLZ-8可明显改善大鼠慢性心力衰竭模型的心功能，降低心肌细胞凋亡率，并减少心肌细胞中相关凋亡蛋白（caspase3、caspase9）的表达，以及增加慢性心衰大鼠的存活率。

Description

重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用

技术领域

本发明涉及重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用，具体涉及大鼠慢性心力衰竭模型的建立，治疗程序的设计以及治疗结果的统计分析，涉及大鼠心肌细胞以及相关蛋白的检测，重点涉及重组灵芝免疫调节蛋白在治疗大鼠慢性心力衰竭模型中的应用。

背景技术

慢性心力衰竭（CHF）是心力衰竭中最常见的形式，是冠心病、心肌病、高血压病、心脏瓣膜病等多种心血管疾病发展的终末阶段，也是最主要的死亡原因。随着人口老龄化，以及急性心肌梗死诊治系统的完善使许多病人从急性期存活下来，CHF发病率逐渐升高，已成为常见公共卫生问题。2010 年美国心脏学会报道，美国的心衰患者人数已经超过580万，并且仍以67万/年的速度不断增加，心衰死亡率为28万/年。我国慢性心衰的患病率为0.9%～1.6%，女性高于男性，随年龄增加心衰的患病率增加。

2005年美国慢性心力衰竭指南的最大特点之一是将心衰分期从心衰的危险因素、易患人群到难治性心衰，分为A、B、C、D 4个阶段，全面涵盖了从防到治的全新概念，强调了对心衰早期干预，与既往NYHA

、、、

分级概念有所不同。

A 期：指具有明确发生心衰危险因素的易患人群，如高血压、冠心病、糖尿病、代谢综合征等患者，但尚无左心功能受损和心脏器质性改变，更无心衰症状，即属于心衰前期。

B 期：指患者已有心脏结构性改变，但无心衰症状和(或) 体征，相当于无症状心衰或NYHA I级。

C 期：指现在或过去曾有过心衰症状且有器质性心脏病者，相当于NYHAII、III和部分IV级患者。

D期：指需要特殊干预的顽固性心衰，相当于NYHA IV级中最严重的阶段。70% 患者1年内死亡。患者反复住院，常需长期静脉输注或滴注血管扩张药和正性肌力药，需釆用心脏机械性辅助装置、心脏同步起搏、心脏移植等治疗。

慢性心力衰竭的药物治疗在西药方面主要有以下几种：1）血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI），适用于所有左心室射血分数减少(小于0.40) 的心衰患者，以改善患者的生存质量、症状及心脏功能，并减少住院时间。ACE I治疗CHF现存在不同类型血管紧张素抑制剂的差异、目标剂量与常用剂量差距、经济承受能力、不良反应、发生率较高等问题。 2）利尿药，利尿剂通过利尿作用减轻心衰病人的液体储留、改善心功能、症状和运动耐量，单一利尿剂是不够的。联合应用ACE I、β受体阻滞剂、洋地黄类药物可减少临床失代偿的危险。利尿药可出现低血钠、酸碱平衡紊乱、高尿酸血症，低血镁等不良反应，噻嗪类可出现低血钾、低血镁、低血钠、高酸尿血症、糖耐量异常、酸碱平衡紊乱等不良反应，因此患者需经常检测血清肌酐和电解质水平。3）β受体阻断药，β受体阻滞剂治疗CHF病理生理基础——降低心肌耗氧量，改善心脏功能：但是，对于心衰病人不同的β受体阻断药可能出现不同的临床效应。受体阻断药不适用于急性心力衰竭，只能在稳定状态下使用。 4）血管紧张素II受体阻断药，对不能耐受ACE I的症状性心衰患者，血管紧张素II受体阻断药可替代ACE I使用，以减少病死率和并发症。血管紧张素II受体阻断药和ACE I对于慢性心衰的病死率和发病率降低似乎具有类似的效果。血管紧张素受体阻断药亦能引起低血压、高血钾及肾功能恶化，应用时应注意血压、血电解质及肾功能。4）醛固酮抑制剂，醛固酮有独立于血管紧张素II对心脏结构和功能的不良作用，促进心肌纤维化，易导致室性心律失常及碎死。目前FDA批准依普利酮仅用于急性心梗后心衰患者的治疗，醛固酮抑制剂应用过程中应检测患者血钾和血清肌酐水平。

慢性心力衰竭的药物治疗在中药方面主要有以下几种：1）单味药研究，常用的治疗心衰的药物有茯苓、车前子、黄芪、人参皂苷、丹参、附子、葛根、葶苈子等，现代药理研究和动物实验证明中药在治疗心衰方面确有治疗依据。黄芪是一种非洋地黄正性肌力药物，可增加心脏收缩力和搏出量，对中毒或疲劳衰竭心脏更为明显，还有显著抗心肌缺血作用，能显著降低急性坏死心肌的血清肌酸激酶，对坏死的心肌细胞有十分明显的保护作用；人参皂苷可以清除氧自由基，减轻缺血对心肌的损害，改善微循环，还能抑制心肌细胞膜Na⁺-K⁺-ATP酶，提高心肌细胞内Ca²⁺浓度，提高心肌收缩力；葶苈子有强心作用，能使心肌收缩力增强，心率减慢，对衰弱的心脏可增加心搏出量，降低静脉压；附子能降低心衰模型大鼠血清脑利钠肽(BNP)及白介素-6水平，减轻心肌细胞损伤，从而改善心功能、减轻心衰症状、降低死亡率，附子与干姜配伍可以加快心衰大鼠的心率、升高左心室内压、提高左心室内压最大上升和下降速率，改善心衰大鼠血流动力学的变化；丹参对冠状动脉具有明显的扩张作用，并且具有抗凝作用，改善血液的高凝状态，丹参中的丹参酮成分能够抑制心肌细胞的钙超载，发挥对心肌细胞的保护作用，同时能减少心肌组织缺氧时的氧化损伤及炎症反应引起的损伤；茯苓、车前子通过其利水作用减轻心脏前负荷，且利尿作用时间长，较少引起电解质紊乱；葛根能扩张血管，降低外周阻力、扩张冠状动脉，增加冠脉流量，改善微循环，并能抑制血小板聚集，增加内源性纤溶系统活性，降低血液粘度，增加红细胞变形能力，减轻血管平滑肌增殖和迁移，减少氧自由基对心肌的损伤。2）复方制剂研究，生脉注射液源自古方“生脉散”，主要成分为人参和麦冬，五味子。中医认为具有益气固脱养阴生津的作用，药理研究显示其具有强壮抗疲劳、抗放射、促进造血功能、保护心肌细胞抗休克以及增加机体免疫功能、抗肿瘤等作用。临床主要用于治疗冠心病，心肌梗死，心功能衰竭，各种休克及肿瘤患者化疗的辅助治疗。研究显示参附注射液、参麦注射液、丹参注射液、丹红注射液、丹参酮注射液、黄芪注射液等对慢性心衰均有较好疗效。

阿霉素(ADR)是一种高效的广谱抗肿瘤抗生素，临床上广泛用于治疗多种恶性肿瘤。ADR 在机体内易产生大量自由基，引起细胞损伤氧化反应，并且它还能通过线粒体途径、Fas 蛋白／Fas 配体信号系统、神经酰胺信号系统等诱导细胞凋亡，出现剂量依赖的不可逆转的 CHF。ADR诱导的大鼠 CHF 模型与人的心肌病 CHF 相似，适合研究衰竭心脏心肌超微结构改变、神经内分泌异常及血流动力学变化。所以，本发明采用ADR腹腔注射建立大鼠心力衰竭模型，探讨重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）对大鼠慢性心力衰竭的治疗作用。

灵芝免疫调节蛋白（Fungal Immunomodulatory Protein of Ganoderma lucidium，LZ-8）是1989年Kino等从灵芝菌丝体提取物中分离到第一个真菌免疫调节蛋白。本发明采用重组技术手段，以毕赤酵母作为表达载体，经过高密度深层次发酵得到与天然灵芝免疫调节蛋白（LZ-8）具有相同的氨基酸序列和空间结构重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8），活性实验表明两者具有一致的生物学活性。研究表明，rLZ-8具有抑制小鼠系统性过敏反应，刺激人类外周血淋巴细胞增殖和IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子产生的免疫学活性。

发明内容

本发明目的是提供重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用，重点考察了大鼠慢性心力衰竭模型在不同给药剂量条件下对治疗效果的影响，采用数学统计软件对数据进行检验处理，得出rLZ-8在治疗心力衰竭过程中具有显著疗效。具体发明内容如下：

心力衰竭模型建立：选用健康灵活Wistar 大鼠，雌性，体重200～240g ，SPF级，参照Teraoka的方法，除空白组之外其余各组大鼠给予盐酸阿霉素（用生理盐水稀释）腹腔注射，注射剂量为2mg/kg，前7次每3天注射一次，后3次则每2天注射一次，共注射3周，累计注射用量20mg/kg。

实验分组与给药方法：Wistar大鼠80只，按照体重随机分为6组，其中模型组（A组）20只，空白组（K组）、阳性药组（Y组）、rLZ-8（B组）小、中（C组）、大剂量组（D）各12只。模型组与空白对照组均给予溶剂（生理盐水）；rLZ-8大、中、小剂量组剂量分别为50μg/kg/天、10μg/kg/天、5μg/kg/天；阳性药物选用生脉注射液（4ml/kg）。各组均在第4周开始腹腔注射给药，连续注射4周。

检测内容与方法：本发明主要从血流动力学、生化指标、形态学、心脏组织细胞凋亡、凋亡调控基因等方面进行检测，全面的检测了大鼠心力衰竭治疗过程的各项指标，具体的检测方法如下：

1）血流动力学：大鼠麻醉后于右颈总动脉插管，连接Pc-lab生物医学信号采集处理系统记录心率(HR)、外周收缩压(SBP)和外周舒张压(DBP)；将插管逆行进入左心室后记录左心室收缩末压(LVSP)、左心室舒张末压(LVDEP)、左心室内压上升最大速率（+dp/dt_max）和左心室内压下降最大速率（-dp/dt_max）。

2）生化指标检测：大鼠腹主动脉采血，分离血清，-20℃保存，用于检测血清中BNP、MDA、AngⅡ、Ca²⁺浓度，评价rLZ-8对慢性心力衰竭的治疗作用。

3）形态学检测：切取心尖部分心肌组织，投入2.5%戊二醛中固定，标本送吉林大学基础医学院电镜室进行超微结构的观察，分析各组心肌细胞的损伤程度；另取心肌组织置于10%甲醛中固定，标本送吉林大学基础医学院病理教研室进行包埋切片，经HE染色后，比较各组形态学差异。

4）心脏组织细胞凋亡：采用TUNEL法检测细胞凋亡，具体方法详见实施例2：

5）凋亡调控基因的检测：采用 SABC法进行免疫组化染色，检测心脏组织中心肌细胞中Caspase 3、Caspase 9、Fas等凋亡相关蛋白的表达。具体方法详见实施例2。

实验结果部分：本发明实验数据采用SPSS10.0统计软件处理，以均值±标准差（

±s）表示，采用组间差异比较t检验进行统计分析。具体实验结果如下：

1）大鼠生长情况：K组大鼠均生长良好，饮食正常，精神状态好。A组存活的大鼠均存在饮食减少，精神萎靡的表现。死亡率33%，尸检发现心脏明显扩大，肝脏淤血并有大量腹水形成，考虑死亡原因为心率失常或严重心衰。B组存活9只（死亡率25%），C组存活7只（死亡率41%），D组存活5只（死亡率58%），Y组存活7只（死亡率41%）。

2）血流动力学方面：与K组相比，A组的LVEDP明显增加（P<0.05），HR，SBP，DBP，LVSP，+dp/dt_max及-dp/dt_max均明显降低（P<0.05~P<0.01），表明慢性心力衰竭大鼠心肌收缩和舒张功能受损；与A组相比，rLZ-8各组能明显升高SBP、DBP、HR及-dp/dt_max（P<0.05~P<0.01），rLZ-8组降低LVDEP（P<0.05）同时能升高LVSP、+dp/dt_max，（P<0.05）。

3）生化指标方面：大鼠腹主动脉插管取血，收集血清，ELISA 法测定血清脑利钠肽（BNP）、血管紧张素II(AngⅡ)、丙二醛(MDA)含量，微板法测定血清Ca²⁺浓度。与K组相比，A组的血清BNP 、AngⅡ、MDA、Ca²⁺含量量明显增加（P<0.05～P<0.001），表明慢性心力衰竭大鼠存在心肌过氧化损伤、钙超载等问题；与A组相比，rLZ-8各组能明显降低血清BNP 、AngⅡ、MDA、Ca²⁺含量（P<0.05～P<0.01）。

4）形态学方面：HE染色后各组组织学分析结果如下： K组：心肌细胞排列整齐有序，心肌纤维间隙甚小，无炎细胞渗出及间质水肿改变；A组：心肌细胞排列紊乱，扭曲变形粗细不均，部分心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙明显增宽，间质水肿，心肌细胞间充满大量红细胞，少量淋巴细胞浸润；B组：心肌细胞排列略整齐，个别心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙无明显增宽，少量淋巴细胞浸润；C组：心肌细胞排列略整齐，部分心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙略增宽，少量淋巴细胞浸润；D组：心肌细胞排列紊乱，部分心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙略增宽，部分心肌纤维变性坏死，少量淋巴细胞浸润；Y组：心肌细胞排列略整齐，部分心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙略增宽，间质水肿及少量淋巴细胞浸润。电镜下微观结构观察结果如下： K组：心肌结构无明显病理改变，肌丝形态完好，排列整齐，Z线清晰，肌节结构完好，闰盘完整；肌丝间线粒体如隔板样排列整齐，其形态正常，界膜完整，嵴清晰；细胞核形态规则，核膜完整，核仁清晰可见；胞质内糖原丰富；间质胶原纤维含量正常。A组：心肌细胞肌节结构排列紊乱，肌节上肌丝减少；闰盘紊乱、分离；肌丝溶解消失，排列松散，肌结构消失；肌丝间线粒体明显增生、肿胀、出现髓样小体、嵴断裂，呈空泡化改变；细胞核形态不规则，核基质致密，染色质固缩；胞质内偶可见脂褐素颗粒。B组肌丝轻微收缩，局部紊乱，肌丝轻度溶解、断裂；线粒体肿胀及嵴断裂减少，仍存在线粒体增生，嵴轻度致密；细胞核染色质固缩情况减轻，核膜完整，形态较规则。C组肌丝轻度溶解、断裂；线粒体增生、肿胀；闰盘分离、紊乱；细胞核空化。D组肌节结构模糊，肌丝轻度收缩、肌丝溶解；线粒体代偿性增生、肿胀，闰盘分离或横位；细胞核形态不规则。

5）心肌细胞凋亡率方面：TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡率，结果显示，A组心肌细胞凋亡率显著高于K组（P<0.001），经不同剂量rLZ-8治疗后，治疗组心肌细胞凋亡率显著下降（P<0.01~P<0.001）。

6）凋亡调控基因方面：采用 SABC法进行免疫组化染色，检测心脏组织中心肌细胞中Caspase 3、Caspase 9、Fas等凋亡相关蛋白的表达，免疫组化染色结果采用Motic Images Advanced 3.2图像分析软件测灰度值，灰度值越大阳性表达越低，灰度值越小阳性表达越高。结果显示，A组心肌细胞Caspase 3、Caspase 9、Fas表达量显著低于K组（P<0.001），经不同剂量rLZ-8后，治疗组心肌细胞Caspase 3、Caspase 9、Fas表达量显著下降（P<0.01~P<0.001）。

附图说明：

图1HE染色后各组组织学分析图；

图2rLZ-8对大鼠心力衰竭模型心脏组织细胞线粒体和肌丝的修复作用；

注：K为空白组、A为模型组、B为rLZ-8低剂量组、C为rLZ-8中剂量组、D为rLZ-8高剂量组。

图3 rLZ-8对大鼠心力衰竭模型心脏组织细胞闰盘的影响；

图4 rLZ-8对大鼠心力衰竭模型心脏组织细胞细胞核的保护作用；

具体实施方式

实施例1：心力衰竭动物模型的建立

1.1实验方法：

1.1.1实验材料与试剂

rLZ-8、盐酸阿霉素、生理盐水、一次性1mL注射器、生脉注射液、大鼠饲料、垫料。

1.1.2 仪器设备

白炽灯、大鼠饲养笼、电子天平、4℃冰箱、双人超净工作台、普光学倒置显微镜。

1.1.3 实验动物

Wistar 大鼠，雌性，体重200～240g，吉林大学实验动物中心提供（合格证号：医动字第10-5112）。

1.2大鼠心力衰竭模型的建立

选用健康灵活Wistar 大鼠，雌性，体重200～240g ，SPF级，参照Teraoka的方法，除空白组之外其余各组大鼠给予盐酸阿霉素（用生理盐水稀释）腹腔注射，注射剂量为2mg/kg，前7次每3天注射一次，后3次则每2天注射一次，共注射3周，累计注射用量20mg/kg。

实施例2：rLZ-8对大鼠慢性心力衰竭模型的治疗作用

实验分组：Wistar大鼠80只，按照体重随机分为6组，其中模型组（A组）20只，空白组（K组）、阳性药组（Y组）、rLZ-8（B组）小、中（C组）、大剂量组（D）各12只。

治疗程序：模型组与空白对照组均给予溶剂（生理盐水）；rLZ-8大、中、小剂量组剂量分别为50μg/kg/天、10μg/kg/天、5μg/kg/天；阳性药物选用生脉注射液（4ml/kg）。各组均在第4周开始腹腔注射给药，连续注射4周。

实验结果：为了真实反映出rLZ-8对大鼠慢性心力衰竭模型的治疗作用，本发明主要从血流动力学、生化指标、形态学、心脏组织细胞凋亡、凋亡调控基因等方面进行检测，全面的检测了大鼠心力衰竭治疗过程的各项指标，具体的检测方法与结果如下：

2）血流动力学方面：

实验方法：大鼠麻醉后于右颈总动脉插管，连接Pc-lab生物医学信号采集处理系统记录心率(HR)、外周收缩压(SBP)和外周舒张压(DBP)；将插管逆行进入左心室后记录左心室收缩末压(LVSP)、左心室舒张末压(LVDEP)、左心室内压上升最大速率（+dp/dt_max）和左心室内压下降最大速率（-dp/dt_max）。

实验结果：实验结果表明（见表1），与K组相比，A组的LVEDP明显增加（P<0.05），HR，SBP，DBP，LVSP，+dp/dt_max及-dp/dt_max均明显降低（P<0.05~P<0.01），表明慢性心力衰竭大鼠心肌收缩和舒张功能受损；与A组相比，rLZ-8各组能明显升高SBP、DBP、HR及-dp/dt_max（P<0.05~P<0.01），rLZ-8组降低LVDEP（P<0.05）同时能升高LVSP、+dp/dt_max，（P<0.05）。

表1 rLZ- 8对慢性心力衰竭大鼠血流动力学方面的影响（x±s）

注：* P<0.05，** P<0.01 与K组比较； ^▲ P<0.05， ^▲▲ P<0.01 与A组比较。

3）生化指标方面：

实验方法：大鼠腹主动脉采血，分离血清，-20℃保存，用于检测血清中BNP、MDA、AngⅡ、Ca²⁺浓度，采用美国RD公司生产检测上述指标的试剂盒，按照试剂盒说明书介绍的检测办法进行上述指标的检测，以评价rLZ-8对慢性心力衰竭的治疗作用。

实验结果：大鼠腹主动脉插管取血，收集血清，ELISA 法测定血清脑利钠肽（BNP）、血管紧张素II(AngⅡ)、丙二醛(MDA)含量，微板法测定血清Ca²⁺浓度。与K组相比，A组的血清BNP 、AngⅡ、MDA、Ca²⁺含量明显增加（P<0.05～P<0.001），表明慢性心力衰竭大鼠存在心肌过氧化损伤、钙超载等问题；与A组相比，rLZ-8能明显降低血清BNP 、AngⅡ、MDA、Ca²⁺含量（P<0.05～P<0.01）。见表2。

表2 rLZ- 8对慢性心力衰竭大鼠BNP及ANG-II的影响（x±s）

4）形态学方面：

实验方法：切取心尖部分心肌组织，投入2.5%戊二醛中固定，标本送吉林大学基础医学院电镜室进行超微结构的观察，分析各组心肌细胞的损伤程度；另取心肌组织置于10%甲醛中固定，标本送吉林大学基础医学院病理教研室进行包埋切片，经HE染色后，比较各组形态学差异。

实验结果： HE染色后各组组织学分析结果如下见图1：K组：心肌细胞排列整齐有序，心肌纤维间隙甚小，无炎细胞渗出及间质水肿改变；A组：心肌细胞排列紊乱，扭曲变形粗细不均，部分心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙明显增宽，间质水肿，心肌细胞间充满大量红细胞，少量淋巴细胞浸润；B组：心肌细胞排列略整齐，个别心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙无明显增宽，少量淋巴细胞浸润；C组：心肌细胞排列略整齐，部分心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙略增宽，少量淋巴细胞浸润；D组：心肌细胞排列紊乱，部分心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙略增宽，部分心肌纤维变性坏死，少量淋巴细胞浸润；Y组：心肌细胞排列略整齐，部分心肌细胞胞质深染，心肌细胞核固缩深染，心肌纤维间隙略增宽，间质水肿及少量淋巴细胞浸润。电镜下微观结构观察结果如下：具体见图2、图3、图4，其中K组：心肌结构无明显病理改变，肌丝形态完好，排列整齐，Z线清晰，肌节结构完好，闰盘完整；肌丝间线粒体如隔板样排列整齐，其形态正常，界膜完整，嵴清晰；细胞核形态规则，核膜完整，核仁清晰可见；胞质内糖原丰富；间质胶原纤维含量正常。A组：心肌细胞肌节结构排列紊乱，肌节上肌丝减少；闰盘紊乱、分离；肌丝溶解消失，排列松散，肌结构消失；肌丝间线粒体明显增生、肿胀、出现髓样小体、嵴断裂，呈空泡化改变；细胞核形态不规则，核基质致密，染色质固缩；胞质内偶可见脂褐素颗粒。B组肌丝轻微收缩，局部紊乱，肌丝轻度溶解、断裂；线粒体肿胀及嵴断裂减少，仍存在线粒体增生，嵴轻度致密；细胞核染色质固缩情况减轻，核膜完整，形态较规则。C组肌丝轻度溶解、断裂；线粒体增生、肿胀；闰盘分离、紊乱；细胞核空化。D组肌节结构模糊，肌丝轻度收缩、肌丝溶解；线粒体代偿性增生、肿胀，闰盘分离或横位；细胞核形态不规则。

5）心肌细胞凋亡率方面：

实验方法：本发明采用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒，进行心肌细胞凋亡率的检测，按照该试剂盒的说明步骤，具体方法如下：

组织学切片常规脱蜡入水。

滴加新鲜配制3%H₂O₂，室温处理10min。蒸馏水洗涤2min×3 次。

③ 标本片加0.01M TBS 1:200新鲜稀释Proteinase K 37℃消化15min，0.01M TBS 洗2 min×3次。

④ 标本片加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20μl/片，以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-d-UTP 各1μl，加入18μl标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μl/片。置样品于湿盒中，37℃标记2h。

⑤ 0.01M TBS 洗2min×3 次。

⑥加封闭液50μl/片，室温30min，甩掉封闭液，不洗。

⑦用抗体稀释液1：100稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀后50μl/片加至标本片上。置样品于湿盒中，37℃反应30 min。0.01M TBS洗2min×3 次。

⑧用抗体稀释液1：100稀释SABC，混匀后50μl/片加至切片。37℃反应30 min。0.01M TBS 洗5 min×4 次。

⑨ DAB 显色：取1ml 蒸馏水，分别加入DAB 试剂盒中A，B，C 试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显色20min左右。水洗。

⑩ 苏木素轻度复染，0.01M TBS 洗，蒸馏水洗，显微镜观察。该法检测凋亡阳性细胞的细胞核呈棕黑色，阴性的细胞核为蓝色，结果以阳性百分率表示。

实验结果：TUNEL法检测各组心肌细胞凋亡率，结果显示，模型组心肌细胞凋亡率显著高于空白对照组（P<0.001），经不同剂量rLZ-8及生脉注射液治疗后，治疗组心肌细胞凋亡率显著下降（P<0.01~P<0.001），见表3所示。

表3 rLZ- 8对慢性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡率的影响（x±s）

注：*** P<0.001 与K组比较； ^▲▲ P<0.01， ^▲▲▲ P<0.001 与A组比较。

6）凋亡调控基因表达量方面：

实验方法：本发明采用SABC-AP免疫组化染色试剂盒进行心肌细胞免疫化学染色进行免疫组化染色，检测心脏组织中心肌细胞中Caspase 3、Caspase 9、Fas等凋亡相关蛋白的表达，操作步骤来源于该试剂盒所提供的说明，具体操作方法如下：

切片常规脱蜡至水。

3%H₂O₂，室温10min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。

热修复抗原：将切片浸入0.01M 枸橼酸盐缓冲液（pH6.0），加热至沸腾后断电，间隔10min后，反复2次。冷却后PBS（pH7.2-7.6）洗涤2次。

滴加5%BSA封闭液，室温20min。甩去多余液体，不洗。

滴加适当1:300稀释一抗（兔IgG），37 ℃ 1h。PBS（pH7.2-7.6）洗2min×3次。

滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 20min。PBS（pH7.2-7.6）洗2min×3次。

滴加试剂SABC，37℃ 20min。PBS（pH7.2-7.6）洗5min×4次。

DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片，室温显色。

苏木素轻度复染，显微镜观察。Fas、Caspase-3、Caspase-9细胞质阳性为棕黄色，细胞核由苏木精复染为蓝色，染色结果采用Motic Images Advanced 3.2图像分析软件测灰度值，灰度值越大阳性表达越低，灰度值越小阳性表达越高。

实验结果：采用 SABC法进行免疫组化染色，检测心脏组织中心肌细胞中Caspase 3、Caspase 9、Fas等凋亡相关蛋白的表达，免疫组化染色结果采用Motic Images Advanced 3.2图像分析软件测灰度值，灰度值越大阳性表达越低，灰度值越小阳性表达越高。结果见表4，表中数值为灰度值。 Fas、C-3、C-9测灰度值，Tunel测阳性百分率。

表4 rLZ- 8对慢性心力衰竭大鼠心肌凋亡蛋白表达的影响（x±s）

组别	剂量	Fas	caspase 3	caspase 9
					K组		167.8±1.7	170.3±6.2	152.3±3.0
A组		85.3±4.0^***	82.8±4.0^***	82.3±2.2^***
					B组	5μg/kg	138.3±4.9^▲▲▲	145.3±3.8^▲▲▲	133.3±7.6^▲▲▲
C组	10μg/kg	129±11.2^▲▲▲	132.5±6.6^▲▲▲	123±5.1^▲▲▲
					D组	50μg/kg	102±7.2^▲▲	98.3±4.6^▲▲	108±7.2^▲▲▲
Y组	4ml/kg	131.8±6.9^▲▲▲	140±2.2^▲▲▲	108±7.3^▲▲

结果显示，A组心肌细胞Caspase 3、Caspase 9、Fas表达量显著低于K组（P<0.001），经不同剂量rLZ-8后，治疗组心肌细胞Caspase 3、Caspase 9、Fas表达量显著下降（P<0.01~P<0.001）。

Claims

1.重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在制备治疗慢性心力衰竭药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于有效改善心功能。

3.如权利要求2所述的改善心功能，包括增强心肌收缩和舒张，减少心肌过氧化损伤与钙超载，降低心肌细胞凋亡率以及心肌细胞中相关凋亡蛋白的表达。

4.如权利要求1所述药物，其特征在于该药物制剂核心成分是由权利要求1所述的重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）和任选的药学可接受的辅剂组成。

5.如权利要求1、4所述的药物制剂给药途径为口服和非肠道给药，其中，口服包括口服液，片剂，丸剂和胶囊；非肠道给药包括外用药和注射剂。