CN103816140A

CN103816140A - 火木层孔菌中甲基苯乙酮在抗禽流感h5n1病毒上的应用

Info

Publication number: CN103816140A
Application number: CN201310401655.5A
Authority: CN
Inventors: 赵晨; 宋爱荣; 孔超; 黄芳; 孙效乐
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2013-09-06
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2033-09-06
Also published as: CN103816140B

Abstract

本发明公开了一种从火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel（裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌Phellinusbaumii、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz）发酵液和子实体中分离的具有抗禽流感活性的甲基苯乙酮。本发明首次公开了甲基苯乙酮的一种新活性，证明其具有抗禽流感作用。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了这种特殊甲基苯乙酮的新活性，证明其具有抗禽流感病毒的作用。为抗禽流感病毒的药物开发及生产开辟了新的思路与方向。

Description

火木层孔菌中甲基苯乙酮在抗禽流感H5N1病毒上的应用

技术领域

本发明涉及一种抗禽流感H5N1病毒的火木层孔菌中活性物质的提取制备方法，尤其涉及的火木层孔菌菌种，已于2013 年8月26日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No.8108，分类名称为火木层孔菌 Phellinus igniarius，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

背景技术

苯乙酮是一种无色晶体，或浅黄色油状液体，有山楂的气味，熔点20.5℃，沸点202.3℃，密度（20/4℃）1.0281g/cm³微溶于水，易溶于多种有机溶剂，能与蒸气一起挥发，氧化时可以生成苯甲酸；还原时可生成乙苯，完全加氢时生成乙基环己烷，用于制香皂和香烟，也用作纤维素酯和树脂等的溶剂和塑料工业生产中的增塑剂等，可由苯与乙酸酐反应制得，或由乙苯氧化制得，也可用乙酰氯与苯在三氯化铝作用下经傅氏反应制得。

目前，抗禽流感病毒的药物种类主要集中于单克隆抗体。种类单一，有一定的局限性。

发明内容

本发明公开了一种从药用菌中分离的具有抗禽流感活性的甲基苯乙酮。本方法较一般化合物应用的优点在于：发现了该种甲基苯乙酮的新活性，具有抗禽流感病毒的作用。为抗球流感病毒提供了新的思路与方向。

本发明的技术方案如下：

首先制备火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉 1-5% 葡萄糖 1-5%

蛋白胨 0.1-0.5% 酵母膏 0.1-0.5%

硫酸镁 0.1-0.5% 磷酸二氢钾 0.01-0.05%

(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物；

(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；

(4)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%，乙醇优选为浓度65-95%的食用乙醇，所用体积优选为浓缩液体积的3-6倍；

(5)对步骤(4)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。

然后从火木层孔菌粗提物中甲基苯乙酮，步骤如下：火木层孔菌粗提物→正相硅胶层析→氯仿与甲醇梯度洗脱→TLC检测→正相硅胶层析→甲醇凝胶层析→TLC检测→反相硅胶层析→TLC检测→减压蒸干→5'-甲基-3'，4'-二羟基苯乙酮。

具体方法为：

(1)首先制备火木层孔菌菌粗提物；

(2)将上述步骤（1）所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；

(3)收集步骤（2）中的最后一次洗脱液，减压干燥，与等体积硅胶拌样，再次进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；

(4)收集上述步骤（3）得到的洗脱液，减压浓缩，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析，用洗脱剂洗脱，使用TLC检测收集的洗脱液，适当合并洗脱液，减压干燥；

(5)将步骤（4）得到的产物进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇：水=10%-80%；

(6)TLC检测，适度合并洗脱液，加压干燥，即为甲基苯乙酮。

优选的，提取步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇；

提取步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为石油醚：丙酮=20:1-40:1；

提取步骤(4)中所述的凝胶为Sephadex LH-20，洗脱剂为甲醇；

提取步骤(5)所述的反相材料为C-18,C-8，洗脱剂为甲醇：水=1：10-1：1

提取步骤(6)所述的TLC检测，展开剂为氯仿：甲醇=12:1-15:1。

（四）具体实施方式

实例1：

火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉 1% 葡萄糖 1%

蛋白胨 0.1% 酵母膏 0.1%

硫酸镁 0.1% 磷酸二氢钾 0.01%

(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25℃温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25℃，发酵罐压力0.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。

(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3；

(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55%；

(5)对步骤(4)所得提取液在70℃条件下，加热1小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；

将上述粗提物称取300g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高1m，直径20cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿：甲醇=100:1，氯仿：甲醇=50:1，分别洗脱3，4，4个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2，Fr-3。将Fr-3等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200—300目正相硅胶。洗脱剂为石油醚与丙酮。减压浓缩洗脱液，使用甲醇溶解，甲醇凝胶柱层析。使用TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压蒸干，10%甲醇溶解，进行反相硅胶层析，洗脱剂为甲醇与水，对洗脱液进行TLC检测，适当合并，加压干燥，进行¹D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ 7.34 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 2.47 (d, J = 15.2 Hz, 3H), 2.23 (s, 3H).证明其是5-甲基-3，4-二羟基苯乙酮。

(7)采用步骤（6）得到的麦角甾酮进行对MDCK细胞毒性的测定，确定其半数中毒浓度(CC₅₀)及最大安全浓度。

在96孔板上，100μl/孔加入4×10⁵ml^-1 浓度的MDCK细胞悬液，培养24 h后，在单层细胞上分别加入不同浓度的含样维持液，每种浓度重复3孔，并设正常细胞对照。置37℃，5%CO₂培养箱中培养48 h后，弃培养液上清，100μl/孔加入5 mg.ml^-1MTT 的维持液，继续培养1h后，弃MTT上清，每孔加溶解液(DMSO)100μl，振荡5-10 min，待结晶完全溶解，酶标仪测492nm处的OD值。计算出样品的半数中毒浓度(CC₅₀)及最大安全浓度。当加样组的OD₄₉₂值不显著低于细胞对照组OD₄₉₂时，此浓度即为样品的最大安全浓度。

表1 5-甲基-3，4-二羟基苯乙酮各浓度对细胞生长的影响

由表1知：5-甲基-3，4-二羟基苯乙酮最大安全浓度为50ug/mL。

实例2：

火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉 3% 葡萄糖 2%

蛋白胨 0.5% 酵母膏 0.5%

硫酸镁 0.5% 磷酸二氢钾 0.05%

(2)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30℃温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2.5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30℃，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通气量0.5-1.1vvm，搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用火木层孔菌菌丝体发酵全液制备火木层孔菌粗提物。

(3)取步骤(2)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5；

(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70%；

(5)对步骤(4)所得提取液在55℃条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10；

将上述粗提物称取200g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高1m，直径15cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿：甲醇=100:1，氯仿：甲醇=50:1，分别洗脱2,3,3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-1,Fr-2，Fr-3。将Fr-3等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200—300目正相硅胶。洗脱剂为石油醚与丙酮。进行甲醇凝胶柱层析。进行反相硅胶层析，TLC检测收集的洗脱液适当合并，减压干燥，进行¹D-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为δ 7.34 (s, 1H), 7.28 (s, 1H), 2.47 (d, J = 15.2 Hz, 3H), 2.23 (s, 3H).证明其是5-甲基-3，4-二羟基苯乙酮。

(7)采用步骤（6）得到的最大安全浓度范围内进行样品在MDCK细胞水平上对H5N1毒株的作用，计算样品的半数毒性浓度(CC₅₀)和半数有效浓度(EC₅₀)，得到样品的选择指数(SI)=CC₅₀／EC₅₀，计算抑制率。

试验中，设置正常细胞对照组（只加细胞维持液），病毒对照组（只加病毒液），质量浓度在无毒范围内2倍稀释4个质量浓度，设置3孔重复。弃96孔细胞培养板孔内上清，100μl/孔加入10000TCID₅₀病毒液（10^-4.43），设置3个重复。37℃吸附2 h，弃病毒液上清，100μl/孔加入不同浓度的样液。置37℃，5% CO₂培养箱中继续培养48h。采用MTT法测定OD₄₉₂值，计算半数有效浓度（EC₅₀）。当加样组的OD₄₉₂值显著大于病毒对照组OD₄₉₂时，表明此样液能够显著抑制病毒感染MDCK，具有抗病毒的活性。

根据计算出的细胞病变率和病毒抑制率。用统计学软件SPSS11.5的Probit回归法，计算样品的半数毒性浓度(CC₅₀)和半数有效浓度(EC₅₀)，得到样品的选择指数(SI)=CC₅₀／EC₅₀。

[0021] 根据下公式计算病毒抑制率：

病毒抑制率=(A-B)/(C-B)×100%

A: 样液处理组OD值，B: 病毒对照组OD值，C: 细胞对照组OD值

表2化合物对H5N1病毒的抑制作用实验结果

Figure DEST_PATH_66281DEST_PATH_IMAGE002

由表2知：5-甲基-3，4-二羟基苯乙酮在0.390625ug/ml浓度下对H5N1毒株可达到最高443.6%的抑制率，此时CC₅₀为20.566ug/ml，EC₅₀为11.4284ug/ml，SI为1.8。

Claims

1.甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用。

2.如权利要求1所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于甲基苯乙酮是从火木层孔菌中提取的，提取步骤顺序如下：

(1) 制备火木层孔菌粗提物；

(2)将上述步骤（1）所得的乙醇沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，并干燥，进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次；

(6)TLC检测，适度合并洗脱液，加压干燥，即为甲基苯乙酮。

3.如权利要求2所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述火木层孔菌粗提物，由下述方法制得：

(1)将火木层孔菌菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20～35℃温度，摇瓶转速为80～280r/min，pH 3～8条件下，震动培养7～15天；培养中当pH值降到2.5～4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20～35℃，发酵罐压力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH 3～8，通气量0.5～1.1vvm，搅拌速度100～280转/分的条件，培养7～15天，即可得到火木层孔菌菌丝体发酵全液；

(2)取步骤(1)中所得火木层孔菌菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2～1/5；

(3)用体积百分比为60～95%的乙醇对上述步骤(2)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2～8倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60～90%；

(4)对步骤(3)所得提取液在50～70℃条件下，加热1～2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5～1/10；

(5)将将步骤(4)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得火木层孔菌粗提物。

4.如权利要求3所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于所述液体培养基配方以克/100毫升计是：

玉米淀粉 1-5% 葡萄糖 1-5%

蛋白胨 0.1-0.5% 酵母膏 0.1-0.5%

硫酸镁 0.1-0.5% 磷酸二氢钾 0.01-0.05%。

5.如权利要求3所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于火木层孔菌粗提物制备步骤（3）的乙醇为浓度65%-95%食用乙醇，所用体积为3-6倍体积。

6.如权利要求2所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶，层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇。

7.如权利要求2所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为石油醚：丙酮=20:1-40:1。

8.如权利要求2所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(4)中所述的凝胶为Sephadex LH-20，洗脱剂为甲醇。

9.如权利要求2所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(5)所述的反相材料为C-18,C-8，洗脱剂为甲醇：水=1：10-1：1。

10.如权利要求2所述的甲基苯乙酮在制备抗禽流感H5N1病毒药物上的应用，其特征在于，步骤(6)所述的TLC检测，展开剂为氯仿：甲醇=12:1-15:1。