CN103796724A - 新型smb方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于从进料混合物中回收多元不饱和脂肪酸（PUFA）产物的色谱分离方法，所述方法包括以下步骤：（i）在第一分离步骤中，在模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置中对所述进料混合物进行纯化以得到中间产物，所述模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置具有含有作为洗脱剂的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱；以及（ii）在第二分离步骤中，使用模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置对在（i）中得到的所述中间产物进行纯化以得到所述PUFA产物，所述模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置具有含有作为洗脱剂的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱；其中（a）所述第一分离步骤和所述第二分离步骤在同一色谱装置上按顺序进行，在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间将所述中间产物回收，并且在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间对所述色谱装置内的工艺条件进行调节，从而在每个分离步骤中使所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离；或（b）所述第一分离步骤和所述第二分离步骤分别在独立的第一色谱装置和第二色谱装置上进行，将从所述第一分离步骤中得到的中间产物引入至所述第二色谱装置中，并且在每个分离步骤中将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离。

Description

新型SMB方法
技术领域
本发明涉及用于纯化多元不饱和脂肪酸（PUFA）及其衍生物的改进的色谱分离方法。具体地，本发明涉及用于纯化PUFA及其衍生物的改进的模拟移动床色谱分离方法或真实移动床色谱分离方法。
背景技术
脂肪酸（特别是PUFA）及其衍生物是生物学上重要分子的前体，它们在调节诸如血小板聚集、炎症和免疫反应等生物学功能中起着重要作用。因此，PUFA及其衍生物在治疗上可用于治疗广泛的病理病症，这些病理病症包括CNS病症、包括糖尿病神经病变的神经病变、心血管疾病、包括炎性皮肤疾病的全身免疫系统病症和炎性病症。
在诸如蔬菜油和海洋油等天然原材料中发现PUFA。然而，这些PUFA经常以与饱和脂肪酸和许多其他杂质的混合物存在于这些油中。因此，在用于营养或用于药物之前，应该对PUFA进行合意的纯化。
不幸的是，PUFA极易被破坏。因此，当在氧存在下加热时，它们易于发生异构化反应、过氧化反应和低聚反应。因此，难以通过PUFA产物的分馏和纯化来制备纯脂肪酸。即使在真空条件下蒸馏也能导致不可接受的产物降解。
模拟移动床色谱和真实移动床色谱是本领域技术人员所熟悉的已知技术。操作原理涉及液体洗脱剂相和固体吸附剂相的逆流移动。该操作使溶剂的使用量最小化，从而该方法经济可行。已经发现这种分离技术在不同领域中的若干应用，这些领域包括碳氢化合物、工业化学品、油、糖和API中。
众所周知，在常规的固定床色谱系统中，其组分待被分离的混合物渗透通过容器。该容器一般是圆柱形的，并且通常被称为柱。该柱含有对流体表现出高渗透率的多孔材料的填充物（一般称为固定相）。混合物中各组分的渗透速度取决于该组分的物理性质，从而组分接连地且选择性地从柱中出来。因此，一些组分趋向于牢固地固定到固定相，并且因此将缓慢地渗透出，然而其他组分趋向于薄弱地固定到固定相并更快速地从柱中出来。已经提出许多不同的固定床色谱系统并且这些固定床色谱系统被用于分析目的和工业生产目的。
相比之下，模拟移动床色谱装置由含有吸附剂的若干单独的柱组成，这些柱以串联的方式连接在一起。洗脱剂沿第一方向通过这些柱。在系统中原料和洗脱剂的注入点与被分离的组分的收集点借助于一系列阀门而周期性地变换。整体效果是为了模拟含有固体吸附剂的移动床的单个柱的操作，该固体吸附剂以相对于洗脱剂流动的逆流的方向移动。因此，如在常规的固定床系统中一样，模拟移动床系统由含有固体吸附剂的固定床的柱组成，其中，洗脱剂通过该固体吸附剂，但是，在模拟移动床系统中，操作以使得模拟连续的逆流的移动床。
在下列若干专利中描述了用于模拟移动床色谱的方法和设备，这些专利包括：US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148和FR-A-2651149，通过引用将这些专利的全文并入本文中。该主题还在Ganetsos和Barker编辑的“Preparative and Production ScaleChromatography”，Marcel Dekker Inc,New York,1993中得以充分论述，通过引用将其全文并入本文中。
真实移动床系统在操作上类似于模拟移动床系统。但不是借助于阀门系统来变换进料混合物和洗脱剂的注入点与被分离的组分的收集点，而是使一系列吸附单元（即，柱）相对于进料点和排出点进行物理移动。再者，操作以使得模拟连续的逆流的移动床。
在以下若干专利中描述了用于真实移动床色谱的方法和设备，这些专利包括：US6979402、US5069883和US4764276，通过引用将这些专利的全文并入本文中。
PUFA产物的纯化特别具有挑战性。因此，用于制备PUFA产物的许多合适的原料是极其复杂的混合物，该极其复杂的混合物含有大量在色谱装置中具有非常类似的保留时间的不同组分。因此，非常难以将某些PUFA与这些原料分离。然而，特别是对于药物应用和营养食品应用来讲，需要高纯度的PUFA产物。因此历史上，当需要高纯度PUFA产物时，已经使用了蒸馏。然而，如上所讨论，使用蒸馏作为用于难以处理的PUFA的分离技术具有显著的缺点。
到目前为止，还没有色谱技术能够用于获得高纯度的PUFA产物，特别是由可商购的原料如鱼油来获得高纯度的PUFA产物，例如纯度大于95%或97%的PUFA产物。
参照图1，示出了模拟移动床色谱装置中的典型装置。通过考虑含有被分成多段的固定相S的竖直的色谱柱（更准确地说，从柱的底部到柱的顶部该固定相S被分为四个成阶层的子区域I、II、III和IV）来解释模拟移动床色谱分离方法或真实移动床色谱分离方法的概念。借助于泵P在底部的IE处引入洗脱剂。在子区域II和子区域III之间的IA+B处引入待被分离的组分A和B的混合物。在子区域I和子区域II之间的SB处收集主要含有B的提取物，并且在子区域III和子区域IV之间的SA处收集主要含有A的提余物。
在模拟移动床系统的情况下，通过引入点和收集点相对于固体相的移动而引起固定相S的模拟向下移动。在真实移动床系统的情况下，通过多个色谱柱相对于引入点和收集点的移动而引起固定相S的模拟向下移动。在图1中，洗脱剂向上流动，并且在子区域II和子区域III之间注入混合物A+B。组分将根据它们与固定相的色谱相互作用（例如多孔介质上的吸附）而移动。对固定相表现出较强的亲和力的组分B（较慢流动的组分）将会更慢地被洗脱剂带走并且将会有延迟地跟随着洗脱剂。对固定相表现出较弱的亲和力的组分A（较快流动的组分）将会更容易地被洗脱剂带走。如果恰当地评估和控制参数的合适设置（特别是在每个子区域的流速），那么对固定相表现出较弱的亲和力的组分A将作为提余物在子区域III和子区域IV之间被收集，而对固定相表现出较强的亲和力的组分B将作为提取物将在子区域I和子区域II之间被收集。
因此，应该知晓的是，示意性地示出在图1中的常规模拟移动床系统受限于双组分分馏。
有鉴于此，需要一种模拟移动床色谱分离方法或真实移动床色谱分离方法，该方法能够将PUFA或其衍生物与较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大和极性较小的杂质）分离以由可商购的原料（例如鱼油）来生产高纯度的PUFA产物。进一步希望该方法应该涉及在标准温度和压力条件下操作的廉价的洗脱剂。
发明内容
现已惊奇地发现，通过使用含水有机溶剂洗脱剂的模拟移动床装置或真实移动床装置能够有效地从可商购的原料（例如鱼油）中纯化PUFA产物。因此，本发明提供一种用于从进料混合物中回收多元不饱和脂肪酸（PUFA）产物的色谱分离方法，所述方法包括以下步骤：
（i）在第一分离步骤中，在模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置中对所述进料混合物进行纯化以得到中间产物，所述模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置具有含有作为洗脱剂的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱；以及
（ii）在第二分离步骤中，使用模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置对在（i）中得到的所述中间产物进行纯化以得到所述PUFA产物，所述模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置具有含有作为洗脱剂的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱；其中
（a）所述第一分离步骤和所述第二分离步骤在同一色谱装置上按顺序进行，在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间将所述中间产物回收，并且在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间对所述色谱装置内的工艺条件进行调节从而在每个分离步骤中使所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离；或
（b）所述第一分离步骤和所述第二分离步骤分别在独立的第一色谱装置和第二色谱装置上进行，将从所述第一分离步骤中得到的中间产物引入至所述第二色谱装置中，并且在每个分离步骤中将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离。
还提供了通过本发明的方法而得到的PUFA产物。
通过本发明的方法而生产的PUFA产物以高产率而生产并具有高纯度。另外，通常由PUFA的蒸馏而产生的特有的杂质的含量非常低。如本文中所使用，术语“同分异构杂质”用来表示通常在含PUFA的天然油的蒸馏过程中所产生的那些杂质。这些杂质包括PUFA同分异构体、过氧化反应产物和低聚反应产物。
附图说明
图1示出了用于分离双组分混合物的模拟移动床方法或真实移动床方法的基本原理。
图2示出了本发明第一优选的实施方式，该实施方式适合于将EPA与较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大的杂质和极性较小的杂质）分离。
图3示出了本发明第二优选的实施方式，该实施方式适合于将DHA与较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大的杂质和极性较小的杂质）分离。
图4更详细地示出了本发明第一优选的实施方式，该实施方式适合于将EPA与较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大的杂质和极性较小的杂质）分离。
图5更详细地示出了本发明第二优选的实施方式，该实施方式适合于将DHA与较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大的杂质和极性较小的杂质）分离。
图6更详细地示出了本发明第一优选的实施方式的替代方法，该替代方法适合于将EPA与较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大的杂质和极性较小的杂质）分离。
图7更详细地示出了本发明第二优选的实施方式的替代方法，该替代方法适合于将DHA与较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大的杂质和极性较小的杂质）分离。
图8示出了本发明特别优选的实施方式，该实施方式用于从较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大的杂质和极性较小的杂质）中纯化EPA。
图9示出了本发明特别优选的实施方式的替代方法，该替代方法用于从较快流动的组分和较慢流动的组分（即极性较大的杂质和极性较小的杂质）中纯化EPA。
图10示出了可以进行本发明的色谱分离方法的三种方式。
图11示出了富含EPA的原料的HPLC分析，该富含EPA的原料能够合适地用作本发明方法的进料混合物。
图12示出了来自根据本发明方法的第一分离步骤的提余物流（R）和提取物流（E）的HPLC分析。
图13示出了来自根据本发明方法的第二分离步骤的提余物流（R）和提取物流（E）的HPLC分析。
图14更详细地示出了来自根据本发明方法的第二分离步骤的提取物流的HPLC分析。
图15示出了通过SMB而生产的DHA产物的GC FAMES迹线。
图16示出了通过蒸馏而生产的DHA产物的GC FAMES迹线。
具体实施方式
不同于用于回收多元不饱和脂肪酸（PUFA）产物的色谱分离方法，本发明的色谱分离方法通常是从进料混合物中回收多元不饱和脂肪酸（PUFA）产物，本发明的方法包括将所述进料混合物引入至模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置，所述模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置具有含有作为洗脱剂的含水醇的多个连接的色谱柱，其中，该装置具有至少包括第一区域和第二区域的多个区域，每个区域具有来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由上述提取物流和提余物流能够收集液体，并且其中，（a）从在所述第一区域中的柱中收集含有所述PUFA产物和极性较大的组分的提余物流并且将该提余物流引入至在所述第二区域中的非相邻的柱中，和/或（b）从在所述第二区域中的柱中收集含有所述PUFA产物和极性较小的组分的提取物流并且将该提取物流引入至在所述第一区域中的非相邻的柱中，在每个区域中将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离。
如本文中所使用，在该实施方式中，术语“区域”指多个连接的色谱柱，所述多个连接的色谱柱含有作为洗脱剂的含水醇，并且具有用于进料混合物流的一个或多个注入点，用于水和/或醇的一个或多个注入点，来自所述多个连接的色谱柱的提余物离开流（从该提余物离开流中能够收集液体），以及来自所述多个连接的色谱柱的提取物离开流（从该提取物离开流中能够收集液体）。通常，每个区域仅具有一个用于进料混合物的注入点。在一种实施方式中，每个区域仅具有用于含水醇洗脱剂的一个注入点。在又一实施方式中，每个区域具有用于水和/或醇的两个或更多个注入点。
在国际专利申请PCT/GB10/002339中发现该实施方式进一步的细节，通过引用将其全文并入在本文中。本发明的色谱分离方法通常不同于PCT/GB10/002339中描述的方法。
如本文中所使用，术语“PUFA产物”是指含有一种或多种多元不饱和脂肪酸（PUFA）和/或其衍生物的产物，该产物通常在营养学或药学上是重要的。通常，上述PUFA产物是单种PUFA或其衍生物。或者，上述PUFA产物是两种或更多种PUFA或其衍生物的混合物，例如两种。
术语“多元不饱和脂肪酸”（PUFA）是指含有多于一个双键的脂肪酸。这些PUFA是本领域技术人员所熟知的。如本文中所使用，PUFA衍生物是指单、双或三甘油酯、酯、磷酯、酰胺、内酯或盐形式的PUFA。优选甘油三酯和酯。更优选酯。酯通常是烷基酯，优选C1～C6烷基酯，更优选C1～C4烷基酯。酯的实例包括甲酯和乙酯。最优选乙酯。
通常，PUFA产物含有至少一种ω-3或ω-6PUFA，优选含有至少一种ω-3PUFA。ω-3PUFA的实例包括α-亚麻酸（ALA）、十八碳四烯酸（SDA）、二十碳三烯酸（ETE）、二十碳四烯酸（ETA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳五烯酸（DPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。优选SDA、EPA、DPA和DHA。更优选EPA和DHA。ω-6PUFA的实例包括亚油酸（LA）、γ-亚麻酸（GLA）、二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸（DGLA）、花生四烯酸（ARA）、二十二碳二烯酸、肾上腺酸以及二十二碳五（ω-6）烯酸。优选LA、ARA、GLA和DGLA。
在一种实施方式中，上述PUFA产物是EPA和/或EPA乙酯（EE）。
在另一实施方式中，上述PUFA产物是DHA和/或DHA乙酯（EE）。
在又一实施方式中，上述PUFA产物是EPA和DHA和/或EPA EE和DHA EE的混合物。
在最优选的实施方式中，上述PUFA产物是EPA或EPA乙酯，该EPA或EPA乙酯以大于90%的纯度，优选以大于95%的纯度，并且更优选以大于97%的纯度被生产。
通常，除所述PUFA产物外，在本发明的色谱分离方法中收集另外的第二PUFA产物。优选地，上述PUFA产物是EPA并且上述另外的第二PUFA产物是DHA。
在本发明的另一实施方式中，装置被配置用来收集作为EPA和DHA的浓缩混合物的PUFA产物。因此，使用含有EPA、DHA、极性大于EPA和DHA的组分以及极性小于EPA和DHA的组分的进料混合物。在第一分离步骤中，通常除去极性小于EPA和DHA的材料。在第二分离步骤中，通常除去极性大于EPA和DHA的材料，并且收集作为PUFA产物的EPA和DHA的浓缩混合物。
通过本发明的方法来分馏的合适的进料混合物可以从包括蔬菜油和动物油和动物脂肪的天然源中获得并且可以从包括从基因修饰的植物、动物和包括酵母的微生物中得到油的合成源中获得。实例包括鱼油、海藻油和微藻油以及植物油，例如琉璃苣油、蓝蓟油和月见草油。在一实施方式中，进料混合物是鱼油。在另一实施方式中，进料混合物是海藻油。当期望的PUFA产物是EPA和/或DHA时，海藻油是特别合适的。当期望的PUFA产物是GLA时，基因修饰的红花油是特别合适的。当期望的PUFA产物是EPA时，基因修饰的酵母是特别合适的。
在特别优选的实施方式中，进料混合物是鱼油或鱼油衍生的原料。有利地，已经发现，当使用鱼油或鱼油衍生的原料时，通过本发明的方法能够生产出纯度大于90%，优选纯度大于95%，更优选纯度大于97%的EPA或EPA乙酯的PUFA产物。
在通过本发明的方法进行分馏之前，进料混合物可以进行化学处理。例如，原料可以进行甘油酯酯交换或甘油酯水解，随后在某些情况下进行选择性的处理，例如结晶、分子蒸馏、尿素分馏、用硝酸银或其他金属盐溶液萃取、卤内酯化反应或超临界流体分馏。或者，可以直接使用进料混合物，而不进行初始处理步骤。
进料混合物通常含有PUFA产物和至少一种极性较大的组分和至少一种极性较小的组分。与PUFA产物相比，上述极性较小的组分对在本发明的方法中使用的吸附剂具有较强的粘附力。在操作过程中，上述极性较小的组分随固体吸附剂相的移动通常优先于随液体洗脱剂相的移动。与PUFA产物相比，极性较大的组分对在本发明的方法中使用的吸附剂具有较弱的粘附力。在操作过程中，上述极性较大的组分随液体洗脱剂相的移动通常优先于随固体吸附剂相的移动。总体来讲，极性较大的组分将被分离成提余物流，而极性较小的组分将被分离成提取物流。
极性较大的组分和极性较小的组分的实例包括（1）存在于天然油（例如，海洋油或蔬菜油）中的其他化合物，（2）在贮藏、精炼和先前的浓缩步骤过程中形成的副产物以及（3）来自在先前浓缩或纯化步骤过程中使用的溶剂或试剂的致污物。
实例（1）包括其他不需要的PUFA；饱和脂肪酸；甾醇，例如胆固醇；维生素；以及环境污染物，例如多氯联苯（PCB）、多环芳烃（PAH）杀虫剂、氯化杀虫剂、二噁英和重金属。PCB、PAH、二噁英和氯化杀虫剂都是高度非极性组分。
实例（2）包括来自PUFA产物的同分异构体以及氧化产物或分解产物，例如，脂肪酸及其衍生物的自氧化聚合产物。
实例（3）包括可以加入以从进料混合物中除去饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸的尿素。
优选地，进料混合物是含PUFA的海洋油（例如，鱼油），更优选的是含有EPA和/或DHA的海洋油（例如，鱼油）。
用于通过本发明的方法来制备浓缩的EPA（EE）的典型进料混合物包含50～75%的EPA（EE）、0～10%的DHA（EE）以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。
用于通过本发明的方法来制备浓缩的EPA（EE）的优选的进料混合物包含55%的EPA（EE）、5%的DHA（EE）以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。DHA（EE）的极性小于EPA（EE）的极性。
用于通过本发明的方法来制备浓缩的DHA（EE）的典型进料混合物包含50～75%的DHA（EE）、0～10%的EPA（EE）以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。
用于通过本发明的方法来制备浓缩的DHA（EE）的优选的进料混合物包含75%的DHA（EE）、7%的EPA（EE）以及包括其他必要的ω-3和ω-6脂肪酸的其他组分。EPA（EE）的极性大于DHA（EE）的极性。
用于通过本发明的方法来制备EPA（EE）和DHA（EE）的浓缩混合物的典型的进料混合物包含大于33%的EPA（EE）和大于22%的DHA（EE）。
本发明方法中的每一个分离步骤都在模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置中进行。
任何已知的模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置，只要根据本发明的方法来使用，这些装置都可以用于本发明方法的目的。如果根据本发明的方法来配置，可以使用那些在US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148、FR-A-2651149、US6979402、US5069883和US4764276中描述的所有的装置。
如本文中所使用，术语“模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置”通常是指多个连接的色谱柱，所述多个连接的色谱柱含有作为洗脱剂的含水醇，并且具有用于进料混合物流的一个或多个注入点，用于水和/或醇的一个或多个注入点，来自所述多个连接的色谱柱的提余物离开流（从该提余物离开流中能够收集液体），以及来自所述多个连接的色谱柱的提取物离开流（从该提取物离开流中能够收集液体）。
在本发明方法的每个步骤中使用的色谱装置具有以串联的方式连接在一起的色谱柱的单一阵列，这些色谱柱含有作为洗脱剂的含水有机溶剂。通常，每个色谱柱被连接到在装置中与该色谱柱相邻的两个柱上。因此，在该阵列中的给定柱的出口连接到该阵列中相邻柱的入口，相对于阵列中洗脱剂的流动该相邻柱的入口是下游。因此，洗脱剂能够流遍上述连接的色谱柱的阵列。通常，不将色谱柱连接到在装置中不相邻的色谱柱上。
如在本文所使用，术语“不相邻”是指在例如同一装置中被一个或多个柱，优选3个或更多个柱，更优选5个或更多个柱，最优选约5个柱隔开的柱。
通常，每个装置仅具有一个用于进料混合物的注入点。在一实施方式中，每个装置仅具有一个用于含水有机溶剂洗脱剂的注入点。在另一实施方式中，每个装置具有两个或更多个用于水和/或有机溶剂的注入点。
术语“提余物”是本领域技术人员所熟知的。在真实移动床色谱和模拟移动床色谱的情况下，它是指随液体吸附剂相的移动比随固体洗脱剂相的移动更快的组分的流。因此，与进料流相比，提余物流通常富集极性较大的组分，并且耗尽极性较小的组分。
术语“提取物”是本领域技术人员所熟知的。在真实移动床色谱和模拟移动床色谱的情况下，它是指随固体吸附剂相的移动比随液体洗脱剂相的移动更快的组分的流。因此，与进料流相比，提取物流通常富集极性较小的组分，并且耗尽极性较大的组分。
在每个装置中使用的柱的数量没有特别限制。技术人员能够容易地确定使用的柱的合适数量。柱的数量通常为4个或多于4个，优选为6个或多于6个，更优选为8个或多于8个，例如4、5、6、7、8、9或10个柱。在优选的实施方式中，使用5个或6个柱，更优选使用6个柱。在另一优选的实施方式中，使用7个或8个柱，更优选使用8个柱。通常，不超过25个柱，优选不超过20个柱，更优选不超过15个柱。
在第一分离步骤和第二分离步骤中使用的色谱装置通常具有相同数量的柱。对于某些应用，它们可以具有不同数量的柱。
在上述装置中使用的柱的尺寸没有特别限制，并且其尺寸将取决于待纯化的进料混合物的体积。技术人员将能够容易地确定使用的合适尺寸的柱。每个柱的直径通常在10mm和1000mm之间，优选在10mm和500mm之间，更优选在25mm和250mm之间，甚至更优选在50mm和100mm之间，且最优选在70mm和80mm之间。每个柱的长度通常在10cm和300cm之间，优选在10cm和200cm之间，更优选在25cm和150cm之间，甚至更优选在70cm和110cm之间，最优选在80cm和100cm之间。
在第一分离步骤和第二分离步骤中使用的色谱装置中的柱通常具有一致的尺寸，但对于某些应用，可以具有不同的尺寸。
柱的流速受横跨（across）在整个系列的柱上的最大压力限制，并且将取决于柱的尺寸和固体相的粒径。本领域技术人员将能够容易地建立用于每种柱尺寸所需的流速以确保有效的解吸附。较大直径的柱通常需要较大的流量以保持线性地流经柱。
对于上文列出的通常的柱尺寸，通常进入在第一分离步骤中使用的色谱装置的洗脱剂的流速是1～4.5L/min，优选1.5～2.5L/min。通常，来自在第一分离步骤中使用的色谱装置的提取物的流速是0.1～2.5L/min，优选0.5～2.25L/min。在将来自第一分离步骤的提取物的一部分循环回在第一分离步骤中使用的装置中的实施方式中，循环的流速通常是0.7～1.4L/min，优选约1L/min。通常，来自在第一分离步骤中使用的色谱装置的提余物的流速是0.2～2.5L/min，优选0.3～2.0L/min。在将来自第一分离步骤的提余物的一部分循环回在第一分离步骤中使用的装置中的实施方式中，循环的流速通常是0.3～1.0L/min，优选约0.5L/min。通常，将进料混合物引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的流速是5～150mL/min，优选10～100mL/min，更优选20～60mL/min。
对于上文列出的典型的柱尺寸，通常进入在第二分离步骤中使用的色谱装置的洗脱剂的流速是1～4L/min，优选1.5～3.5L/min。通常，来自在第二分离步骤中使用的色谱装置的提取物的流速是0.5～2L/min，优选0.7～1.9L/min。在将来自第二分离步骤的提取物的一部分循环回在第二分离步骤中使用的装置中的实施方式中，循环的流速通常是0.6～1.4L/min，优选0.7～1.1L/min，更优选约0.9L/min。通常，来自在第二分离步骤中使用的色谱装置的提余物的流速是0.5～2.5L/min，优选0.7～1.8L/min，更优选约1.4L/min。在将来自第二分离步骤的提余物的一部分循环回在第二分离步骤中使用的装置中的实施方式中，循环的流速通常是0.3～1.0L/min，优选约0.5L/min。
本领域技术人员将知晓，经由多种提取物流和提余物流来收集或除去液体的速率的基准是指在一定时间内除去的液体的体积，通常为L/min。类似地，将液体循环至装置中，通常是循环至该装置中的相邻的柱中的速率的基准是指在一定时间内循环的液体的体积，通常为L/min。
步骤时间，即变换进料混合物和洗脱剂的注入点与收集的馏分的各个离开点之间的时间，没有特别限制，并且将取决于所使用的柱的数量和尺寸以及穿过该装置的流速。技术人员将能够容易地确定在本发明的方法中使用的合适的步骤时间。步骤时间通常是100～1000秒，优选是200～800秒，更优选是约250～约750秒。在一些实施方式中，100～400秒，优选200～300秒，更优选约250秒的步骤时间是合适的。在其他实施方式中，600～900秒，优选700～800秒，更优选约750秒的步骤时间是合适的。
在本发明的方法中，优选真实移动床色谱。
在本领域中已知的用于真实移动床系统和模拟移动床系统的常规吸附剂可用于本发明的方法中。每个色谱柱可包含相同或不同的吸附剂。通常，每个柱包含相同的吸附剂。这些常用的材料的实例是聚合物珠（优选具有DVB（二乙烯基苯）的聚苯乙烯网），和硅胶（优选具有C8或C18烷烃特别是C18烷烃的反相键合硅胶）。优选C18键合反相硅胶。在本发明的方法中使用的吸附剂优选是非极性的。
吸附剂固定相的材料的形状可以是例如球形珠或非球形珠，优选基本上为球形珠。这样的珠的直径通常是5～500微米，优选10～500微米，更优选为15～500微米，更优选40～500微米，更优选100～500微米，更优选250～500微米，甚至更优选250～400微米，最优选250～350微米。在一些实施方式中，可以使用直径是5～35微米，通常是10～30微米，优选是15～25微米的珠。一些优选的粒径稍微大于过去在模拟移动床方法和真实移动床方法中使用的珠的粒径。使用较大的颗粒使能够在系统中使用较低压力的洗脱剂。反过来，这在成本节约、装置的效率和寿命方面具有优点。已经令人惊奇地发现，大粒径的吸附剂珠可以在本发明的方法中使用（伴随着它们相关的优点），而在分辨率方面没有任何损失。
吸附剂通常具有10～50nm的孔径，优选15～45nm，更优选20～40nm，最优选25～35nm。
通常，本发明的方法在15～55℃下进行，优选在20～40℃下进行，更优选在约30℃下进行。因此，该方法通常在室温下进行，但也可在升高的温度下进行。
本发明的方法包括第一分离步骤和第二分离步骤。
这两个步骤可以容易地在单个色谱装置上进行。因此，在一实施方式中，（a）第一分离步骤和第二分离步骤在同一色谱装置上按顺序进行，在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间回收中间产物，并且在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间对所述色谱装置内的工艺条件进行调节从而在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。图10a示出了这种分离方法的优选的实施方式。因此，第一分离步骤（左手侧）是在具有8个柱的SMB装置上进行。在第一分离步骤和第二分离步骤之间将中间产物回收在例如容器中，对色谱装置内的工艺条件进行调节从而在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。然后第二分离步骤（右手侧）是在具有8个柱的同一SMB装置上进行。
在实施方式（a）中，调节工艺条件通常是指整体调节装置中的工艺条件，即物理地改动（modify）该装置，使得条件是不同的。它不是指简单地将中间产物重新引入至工艺条件可能凑巧不同的同一装置的不同部分。
或者，在第一分离步骤和第二分离步骤中可以使用第一分离色谱装置和第二分离色谱装置。因此，在另一实施方式中，（b）第一分离步骤和第二分离步骤分别在独立的第一色谱装置和第二色谱装置上进行，将从第一分离步骤中得到的中间产物引入至第二色谱装置中，并且在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
在实施方式（b）中，两个分离步骤既可以按顺序进行也可以同时进行。
因此，在实施方式（b）中，在两个分离步骤是按顺序进行的情况下，第一分离步骤和第二分离步骤按顺序分别在独立的第一色谱装置和第二色谱装置上进行，在第一分离步骤和第二分离步骤之间将中间产物回收，并且对第一色谱装置和第二色谱装置内的工艺条件进行调节从而在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。图10b示出了这种分离方法的优选的实施方式。因此，第一分离步骤（左手侧）在具有8个柱（即1至8）的SMB装置上进行。在第一分离步骤和第二分离步骤之间将中间产物回收在例如容器中，然后将中间产物引入至第二分离SMB装置中。第二分离步骤（右手侧）在具有8个柱（即9至16）的第二分离SMB装置上进行。对两个色谱装置中的工艺条件进行调节从而在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
在实施方式（b）中，在两个分离步骤是同时进行的情况下，第一分离步骤和第二分离步骤分别在独立的第一色谱装置和第二色谱装置上进行，将中间产物引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置中，并且对第一色谱装置和第二色谱装置内的工艺条件进行调节从而在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。图10c示出了这种分离方法的优选的实施方式。因此，第一分离步骤（左手侧）在具有8个柱（即1至8）的SMB装置上进行。然后将在第一分离步骤中得到的中间产物引入至在第二分离步骤中使用的第二分离色谱装置中。中间产物可以直接或间接（例如，经由容器）从第一分离步骤传到第二分离步骤。第二分离步骤（右手侧）在具有8个柱（即9至16）的第二分离SMB装置上进行。对两个色谱装置内的工艺条件进行调节从而在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
在实施方式（b）中，在两个分离步骤是同时进行的情况下，洗脱剂在两个独立的色谱装置中独立地流通。因此，除在中间产物中作为溶剂存在的洗脱剂外，在两个独立的色谱装置之间不共享洗脱剂，上述中间产物在第二分离步骤中被纯化并且被引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置中。在第一分离步骤和第二分离步骤中使用的两个独立的色谱装置之间不共享色谱柱。
在第一分离步骤中得到中间产物之后，在第二分离步骤中纯化中间产物之前可以部分或全部除去含水有机溶剂洗脱剂。或者，在第二分离步骤中对中间产物进行纯化而不除去任何存在的溶剂。
如上面所提到的，在每个分离步骤中将PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。在实施方式（a）中，在第一分离步骤和第二分离步骤之间对在两个分离步骤中使用的单个SMB装置内的工艺条件进行调节从而在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。在实施方式（b）中，对在第一分离步骤和第二分离步骤中使用的两个独立的色谱装置内的工艺条件进行设置从而在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。
因此，在第一分离步骤和第二分离步骤中的工艺条件是变动的。工艺条件的变动可以包括例如使用的柱的尺寸、使用的柱的数量、柱内使用的填充物、SMB装置的步骤时间、装置的温度，或在分离步骤中使用的洗脱剂。
与进料混合物相比，在第一分离步骤中得到的中间产物通常富集PUFA产物。
然后，将在第一分离步骤中得到的中间产物引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置中。
中间产物通常作为提余物流或提取物流而从在第一分离步骤中使用的色谱装置中被收集。
通常，在第一分离步骤中，中间产物作为提余物流被收集；而在第二分离步骤中，PUFA产物作为提取物流被收集。因此，在第一分离步骤中收集的提余物流被用作在第二分离步骤中的进料混合物。在第一分离步骤中收集的提余物流通常含有PUFA产物和极性较大的组分。
或者，在第一分离步骤中，中间产物作为提取物流被收集；而在第二分离步骤中，PUFA产物作为提余物流被收集。因此，在第一分离步骤中收集的提取物流被用作在第二分离步骤中的进料混合物。在第一分离步骤中收集的提取物流通常含有PUFA产物和极性较小的组分。
在每个分离步骤中使PUFA产物与进料混合物的不同组分分离。通常，在本发明的方法的每个分离步骤中分离的组分具有不同的极性。
优选地，在第一分离步骤中，PUFA产物与进料混合物的极性较小的组分分离；而在第二分离步骤中，PUFA产物与进料混合物的极性较大的组分分离。
通常，（a）将来自在第一分离步骤中使用的装置中的提取物流的一部分循环回在第一分离步骤中使用的装置中；和/或
（b）将来自在第一分离步骤中使用的装置中的提余物流的一部分循环回在第一分离步骤中使用的装置中；和/或
（c）将来自在第二分离步骤中使用的装置中的提取物流的一部分循环回在第二分离步骤中使用的装置中；和/或
（d）将来自在第二分离步骤中使用的装置中的提余物流的一部分循环回在第二分离步骤中使用的装置中。
优选地，（a）将来自在第一分离步骤中使用的装置中的提取物流的一部分循环回在第一分离步骤中使用的装置中；和
（b）将来自在第一分离步骤中使用的装置中的提余物流的一部分循环回在第一分离步骤中使用的装置中；和
（c）将来自在第二分离步骤中使用的装置中的提取物流的一部分循环回在第二分离步骤中使用的装置中；和
（d）将来自在第二分离步骤中使用的装置中的提余物流的一部分循环回在第二分离步骤中使用的装置中。
该循环涉及将从在第一分离步骤或第二分离步骤中使用的色谱装置中出来的提取物流或提余物流的一部分供回至在该步骤中使用的装置中，通常供回至相邻的柱中。该相邻的柱是相对于系统中洗脱剂的流动是下游的相邻的柱。
将在第一分离步骤或第二分离步骤中经由提取物流或提余物流而被收集的液体循环回在该步骤中使用的色谱装置中的速率是将经由该提取物流或提余物流而被收集的液体供回至在该步骤中使用的装置中（通常供回至相邻的柱中，即，相对于系统中洗脱剂的流动是下游的柱）的速率。
参见图9中示出的优选的实施方式可以看出这一点。在第一分离步骤中的提取物的循环的速率是将从在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱2的底部收集的提取物供给至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱3的顶部的速率，即进入在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱3的顶部的液体的流速。
在第二分离步骤中的提取物的循环的速率是将从在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱2的底部收集的提取物供给至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱3的顶部的速率，即进入在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱3的顶部的液体的流速。
在第一分离步骤和/或第二分离步骤中的提取物流和/或提余物流的循环通常是这样实现的：通过将经由在该第一分离步骤和/或第二分离步骤中的该提取物流和/或提余物流而被收集的液体供给到容器中，并且随后将一定量的该液体从容器中泵入回在该分离步骤中使用的装置，通常泵入回相邻的柱。在这种情况下，在第一分离步骤和/或第二分离步骤中经由具体的提取物流或提余物流而被收集的液体循环速率，通常循环回相邻柱的速率为将液体泵出容器而泵回至色谱装置中的速率，通常泵回至相邻的柱的速率。
正如技术人员将知晓的是，经由洗脱剂流和原料流被引入至色谱装置的液体的量与从装置中除去并且循环回装置的液体量相平衡。
因此，参见图9，对于提取物流，进入在第一分离步骤和第二分离步骤中使用的色谱装置中的洗脱剂（解吸剂）的流速（D）等于在该分离步骤中经由提取物流而被收集的液体积累在容器中的速率（E1和E2）加上将提取物循环回在该具体分离步骤中使用的色谱装置中的速率（D-E1和D-E2）。
对于来自分离步骤的提余物流，将提取物循环回在该具体分离步骤中所使用的色谱装置的速率（D-E1和D-E2）加上将原料引入至在该具体分离步骤中使用的色谱装置的速率（F和R1）等于将在该具体分离步骤中经由提余物流而被收集的液体积累在容器中的速率（R1和R2）加上将提余物循环回在该具体分离步骤中使用的色谱装置中的速率（D+F-E1-R1和D+R1-E2-R2）。
将从色谱装置的具体提取物流或具体提余物流中收集的液体积累在容器中的速率也可被认为是从该色谱装置中除去该提取物流或提余物流的净速率。
在本发明的方法中使用的洗脱剂为含水有机溶剂。
上述含水有机溶剂通常包括水和一种或多种醇、醚、酯、酮或腈，或它们的混合物。
醇溶剂对于本领域技术人员来说是熟知的。醇通常为短链的醇。醇通常为分子式ROH，其中R为直链或支链的C1～C6烷基。优选地，C1～C6烷基是未被取代的。醇的实例包括甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。甲醇和乙醇是优选的。甲醇是更优选的。
醚溶剂对于本领域技术人员来说是熟知的。醚通常为短链的醚。醚通常为分子式R-O-R'，其中R和R'为相同的或不同的，并且表示直链或支链的C1～C6烷基。优选地，C1～C6烷基是未被取代的。优选的醚包括乙醚、二异丙醚和甲基叔丁基醚（MTBE）。
酯溶剂对于本领域技术人员来说是熟知的。酯通常为短链的酯。酯通常为分子式R-(C=O)O-R'，其中R和R'为相同的或不同的，并且表示直链或支链的C1～C6烷基。优选的酯包括乙酸甲酯和乙酸乙酯。
酮溶剂对于本领域技术人员来说是熟知的。酮通常为短链的酮。酮通常为分子式R-(C=O)-R'，其中R和R'为相同的或不同的，并且表示直链或支链的C1～C6烷基。优选地，C1～C6烷基是未被取代的。优选的酮包括丙酮、甲基乙基酮和甲基异丁基酮（MTBK）。
腈溶剂对于本领域技术人员来说是熟知的。腈通常为短链的腈。腈通常为分子式R-CN，其中R表示直链或支链的C1～C6烷基。优选地，C1～C6烷基是未被取代的。优选的腈包括乙腈。
通常，含水有机溶剂为含水醇或含水乙腈。
优选地，含水有机溶剂为含水甲醇或含水乙腈。含水甲醇是更优选的。
通常，洗脱剂并未处于超临界状态。通常，洗脱剂为液体。
通常，在整个装置中洗脱剂的平均水与有机溶剂的比例，例如水与甲醇的比例为0.1:99.9至9:91体积份，优选0.25:99.75至7:93体积份，更优选0.5:99.5至6:94体积份。
当含水有机溶剂为含水乙腈时，洗脱剂通常含有至多30wt%的水，余量的乙腈。优选地，洗脱剂含有5～25wt%的水，余量的乙腈。更优选地，洗脱剂含有10～20wt%的水，余量的乙腈。甚至更优选地，洗脱剂含有15～25wt%的水，余量的乙腈。
通常，在每个分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱剂具有不同的水与有机溶剂的比例。优选地，对在每个分离步骤中使用的水与有机溶剂的比例进行调节以在每个分离步骤中使PUFA产物能够与进料混合物的不同组分分离。
在每个分离步骤中使用的洗脱剂的洗脱能力通常是不同的。优选地，在第一分离步骤中使用的洗脱剂的洗脱能力高于在第二分离步骤中使用的洗脱剂的洗脱能力。实际上，这可通过改变在每个分离步骤中使用的水和有机溶剂的相对量来实现。
取决于有机溶剂的选择，它们可以是比水更强有力的解吸剂。或者，它们可以是比水更弱的解吸剂。例如，乙腈和醇是比水更强有力的解吸剂。因此，当含水有机溶剂为含水醇或含水乙腈时，在第一分离步骤中使用的洗脱剂中的醇或乙腈的量通常大于在第二分离步骤中使用的洗脱剂中的醇或乙腈的量。
通常，在第一分离步骤中洗脱剂的水与有机溶剂的比例低于在第二分离步骤中洗脱剂的水与有机溶剂的比例。因此，在第一分离步骤中的洗脱剂通常比在第二分离步骤中的洗脱剂含有更多的有机溶剂，优选醇，更优选甲醇。
在每个分离步骤中使用的含水有机溶剂具有不同的水与有机溶剂的比例的实施方式中，在第一分离步骤中洗脱剂的水与有机溶剂的比例通常为0:100～5:95体积份，优选0.1:99.9～2.5:97.5体积份，更优选0.25:99.75～2:98体积份，并且最优选0.5:99.5～1.5:98.5体积份。在这些实施方式中，在第二分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例通常为2:98～8:92体积份，优选3:97～7:93体积份，更优选4:96～6:94体积份，并且甚至更优选4.5:95.5～5.5:94.5体积份。
在每个分离步骤中使用的含水有机溶剂具有不同的水和有机溶剂含量的特别优选的实施方式中，在第一分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例为0.5:99.5～1.5:98.5体积份，而在第二分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例为4.5:95:5至5.5:94.5体积份。
将要知晓的是，上述所提到的在每个分离步骤中的水与有机溶剂的比例为在整个色谱装置中的平均比例。
通常，通过将水和/或有机溶剂引入至在分离步骤中使用的色谱装置中的一个或多个柱来控制在每个分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例。因此，例如，与被引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置相比，水通常被更慢地引入至在第一分离步骤中使用的色谱分离装置，以实现在第一分离步骤中水与有机溶剂的比例低于在第二分离步骤中水与有机溶剂的比例。
在一些实施方式中，在不同点处将基本上纯的有机溶剂和基本上纯的水引入至在每个分离步骤中使用的色谱装置。这两个流的相对流速将决定在色谱装置中的溶剂整体组成分布（profile）。在其他实施方式中，在不同点处可将不同的有机溶剂/水混合物引入至在每个分离步骤中使用的每个色谱装置。这将涉及将两种或更多种不同的有机溶剂/水混合物引入至在具体分离步骤中使用的色谱装置，每种有机溶剂/水混合物具有不同的有机溶剂与水的比例。在该实施方式中的有机溶剂/水混合物的相对流速和相对浓度将决定在该分离步骤中使用的色谱分离装置中的溶剂整体组成分布。
在特别优选的实施方式中，（1）在第一分离步骤中含有PUFA产物和极性较大的组分的中间产物作为提余物流而被收集，而在第二分离步骤中PUFA产物作为提取物流而被收集；或
（2）在第一分离步骤中含有PUFA产物和极性较小的组分的中间产物作为提取物流而被收集，而在第二分离步骤中PUFA产物作为提余物流而被收集。
特别优选的实施方式（1）适用于从进料混合物中纯化EPA。
图2示出了该特别优选的实施方式（1）。在第一分离步骤中纯化含有PUFA产物（B）和极性较大的组分（C）和极性较小的组分（A）的进料混合物F。在第一分离步骤中，极性较小的组分（A）作为提取物流E1被除去。PUFA产物（B）和极性较大的组分（C）作为提余物流R1被收集。提余物流R1为中间产物，该中间产物随后在第二分离步骤中被纯化。在第二分离步骤中，极性较大的组分（C）作为提余物流R2被除去。PUFA产物（B）作为提取物流E2被收集。
图4中更详细地示出了该实施方式。除了示出了用于将有机溶剂解吸剂（D）和水（W）引入至每个色谱装置的点外，图4和图2是一致的。有机溶剂解吸剂（D）和水（W）一起形成洗脱剂。（D）相通常为基本上纯的有机溶剂，但是在某些实施方式中也可以是主要包括有机溶剂的有机溶剂/水混合物。（W）相通常为基本上纯的水，但是在某些实施方式中也可以是主要包括水的有机溶剂/水混合物，例如98%水/2%甲醇混合物。
图6中示出了该特别优选的实施方式的进一步图示。在该图中，不存在单独的水注入点，而是替代为在（D）处注入含水有机溶剂解吸剂。
通过改变每个色谱装置内的洗脱剂的解吸能力可辅助提余物流和提取物流的分离。这可通过在不同点处将洗脱剂的有机溶剂（或富含有机溶剂）组分和水（或富含水）组分引入至每个色谱装置来实现。因此，通常，相对于在系统中的洗脱剂的流动，在提取物离开点的上游引入有机溶剂，而在提取物离开点和用于将原料引入至色谱装置的点之间引入水。图4中示出了该实施方式。
在该最优选的实施方式中使用的典型溶剂为含水醇或含水乙腈，优选为含水甲醇。
通常，在该特别优选的实施方式中，与在第二分离步骤中使用的洗脱剂相比，在第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱剂含有更多的有机溶剂，即，在第一步骤中的水与有机溶剂的比例低于在第二步骤中的水与有机溶剂的比例。
在该特别优选的实施方式中，相对于洗脱剂的流动，通常在用于将进料混合物引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的点的下游除去在第一分离步骤中的第一提余物流。
在该特别优选的实施方式中，相对于洗脱剂的流动，通常在用于将进料混合物引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的点的上游除去在第一分离步骤中的第一提取物流。
在该特别优选的实施方式中，相对于洗脱剂的流动，通常在用于将中间产物引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的点的下游除去在第二分离步骤中的第二提余物流。
在该特别优选的实施方式中，相对于洗脱剂的流动，通常在用于将中间产物引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的点的上游收集在第二分离步骤中的第二提取物流。
通常，在该特别优选的实施方式中，相对于洗脱剂的流动，在第一提取物流的除去点的上游，将有机溶剂或含水有机溶剂引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置。
通常，在该特别优选的实施方式中，当将水引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置时，相对于洗脱剂的流动，在进料混合物的引入点的上游并且第一提取物流的除去点的下游，将水引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置。
通常，在该特别优选的实施方式中，相对于洗脱剂的流动，在第二提取物流的除去点的上游，将有机溶剂或含水有机溶剂引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置。
通常，在该特别优选的实施方式中，当将水引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置时，相对于洗脱剂的流动，在中间产物的引入点的上游并且第二提取物流的除去点的下游，将水引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置。
特别优选的实施方式（2）适用于从进料混合物中纯化DHA。
图3中示出了特别优选的实施方式（2）。在第一分离步骤中纯化含有PUFA产物（B）和极性较大的组分（C）和极性较小的组分（A）的进料混合物F。在第一分离步骤中，极性较大的组分（C）作为提余物流R1被除去。PUFA产物（B）和极性较小的组分（A）作为提取物流E1被收集。提取物流E1为中间产物，该中间产物随后在第二分离步骤中被纯化。在第二分离步骤中，极性较小的组分（A）作为提取物流E2被除去。PUFA产物（B）作为提余物流R2被收集。
图5更加详细地示出了该实施方式。除了示出了用于将有机溶剂解吸剂（D）和水（W）引入至每个色谱装置的点外，图5和图3是一致的。如上所述，（D）相通常为基本上纯的有机溶剂，但是在某些实施方式中也可以是主要包括有机溶剂的有机溶剂/水混合物。（W）相通常为基本上纯的水，但是在某些实施方式中也可以是主要包括水的有机溶剂/水混合物，例如，98%水/2%甲醇混合物。
图7中示出了该特别优选的实施方式的进一步图示。在该图中，不存在单独的水注入点，而是替代为在（D）处注入含水有机溶剂解吸剂。
在该最优选的实施方式中使用的典型溶剂为含水醇或含水乙腈，优选为含水甲醇。
通常，在该实施方式中，与在第二分离步骤中使用的洗脱剂相比，在第一分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱剂含有更少的有机溶剂，即，在第一分离步骤中的水与有机溶剂的比例高于在第二分离步骤中的水与有机溶剂的比例。
在该实施方式中，相对于洗脱剂的流动，通常在用于将进料混合物引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的点的下游除去在第一分离步骤中的第一提余物流。
在该实施方式中，相对于洗脱剂的流动，通常在用于将进料混合物引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的点的上游除去在第一分离步骤中的第一提取物流。
在该实施方式中，相对于洗脱剂的流动，通常在用于将中间产物引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的点的下游除去在第二分离步骤中的第二提余物流。
在该实施方式中，相对于洗脱剂的流动，通常在用于将中间产物引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的点的上游收集在第二分离步骤中的第二提取物流。
通常，在该实施方式中，相对于洗脱剂的流动，在第一提取物流的除去点的上游，将有机溶剂或含水有机溶剂引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置。
通常，在该实施方式中，当将水引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置时，相对于洗脱剂的流动，在进料混合物的引入点的上游并且第一提取物流的除去点的下游，将水引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置。
通常，在该实施方式中，相对于洗脱剂的流动，在第二提取物流的去除点的上游，将有机溶剂或含水有机溶剂引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置。
通常，在该实施方式中，当将水引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置时，相对于洗脱剂的流动，在中间产物的引入点的上游并且第二提取物流的除去点的下游，将水引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置。
在本发明的优选的实施方式中，在第一分离步骤和第二分离步骤中使用的每个模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置包括八个色谱柱。这些柱称为柱1至柱8。在每个装置中，八个柱以串联的方式布置从而柱1的底部连接至柱2的顶部，柱2的底部连接至柱3的顶部……以及柱8的底部连接至柱1的顶部。可选地，这些连接可经由具有进入下一个柱的循环流的存储容器（holdingcontainer）来实现。洗脱剂为从柱1至柱2至柱3等来流经系统。吸附剂穿过系统的有效流动为从柱8至柱7至柱6等。
图8示出了最优选的实施方式。将含有PUFA产物（B）和极性较大的组分（C）和极性较小的组分（A）的进料混合物F引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱5的顶部。将有机溶剂解吸剂引入至在第一分离装置中使用的色谱装置的柱1的顶部。将水引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱4的顶部。在第一分离步骤中，极性较小的组分（A）作为提取物流E1从柱2的底部被除去。PUFA产物（B）和极性较大的组分（C）作为提余物流R1从柱7的底部被除去。提余物流R1为中间产物，通过在柱5的顶部将其引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置，该中间产物随后在第二分离步骤中被纯化。将有机溶剂解吸剂引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱1的顶部。将水引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱4的顶部。在第二分离步骤中，极性较大的组分（C）作为提余物流R2在柱7的底部被除去。PUFA产物（B）作为提取物流E2在柱2的底部被收集。
在该最优选的实施方式中，通常将有机溶剂引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱1的顶部。
在该最优选的实施方式中，通常将水引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱4的顶部。
在该最优选的实施方式中，通常将有机溶剂引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱1的顶部。
在该最优选的实施方式中，通常将有机溶剂引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱4的顶部。
在该最优选的实施方式中，通常将进料流引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱5的顶部。
在该最优选的实施方式中，第一提余物流通常作为中间产物从在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱7的底部被收集。该中间产物随后在第二分离步骤中被纯化，并且通常将其引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱5的顶部。可选地，在第一提余物流在第二分离步骤中被纯化之前，可被收集在容器中。
在该最优选的实施方式中，通常从在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱2的底部除去第一提取物流。可选地，可将第一提取物流收集在容器中并且重新引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱3的顶部。
在该最优选的实施方式中，通常从在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱7的底部除去第二提余物流。
在该最优选的实施方式中，通常从在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱2的底部收集第二提取物流。该第二提取物流通常含有经纯化的PUFA产物。可选地，可将第二提取物流收集在容器中并且重新引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱3的顶部。
在该最优选的实施方式中，使用的洗脱剂通常为含水醇，优选含水甲醇。水与醇的比例通常为0.5:99.5至6:94体积份。
通常，在该最优选的实施方式中，在第一分离步骤中使用的色谱装置中的水与有机溶剂的比例低于在第二分离步骤中使用的色谱装置中的水与有机溶剂的比例。因此，与在第二步骤中使用的洗脱剂相比，在第一分离步骤中的洗脱剂通常含有更多的有机溶剂。
在第一分离步骤中的水与有机溶剂的比例通常为0.5:99.5至1.5:98.5体积份。在第二分离步骤中的水与有机溶剂的比例通常为2:98至6:94体积份。
尽管图8的实施方式被配置为图10a中所示出的，图10b和图10c示出的配置也可用于该实施方式中。
图9示出了另一最优选的实施方式。将含有PUFA产物（B）和极性较大的组分（C）和极性较小的组分（A）的进料混合物F引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱5的顶部。将含水有机溶剂解吸剂引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱1的顶部。在第一分离步骤中，极性较小的组分（A）作为提取物流E1从柱2的底部被除去。PUFA产物（B）和极性较大的组分（C）作为提余物R1从柱7的底部被除去。提余物流R1为中间产物，通过将其引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱4的顶部，该中间产物在第二分离步骤中被纯化。将含水有机溶剂解吸剂引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱1的顶部。在第二分离步骤中，极性较大的组分（C）作为提余物流R2在柱7的底部被除去。PUFA产物（B）作为提取物流E2在柱2的底部被收集。
在该最优选的实施方式中，通常将含水有机溶剂引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱1的顶部。
在该最优选的实施方式中，通常将含水有机溶剂引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱9的顶部。
在该最优选的实施方式中，通常将进料流引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱5的顶部。
在该最优选的实施方式中，第一提余物流通常作为中间产物从在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱7的底部而被收集。该中间产物随后在第二分离步骤中被纯化，并且通常将其引入至在第二分离步骤中使用的色谱装置的柱5的顶部。可选地，在第一提余物流在第二分离步骤中被纯化之前，可被收集在容器中。
在该最优选的实施方式中，通常从在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱2的底部除去第一提取物流。可选地，可将第一提取物流收集在容器中，并且将其一部分重新引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱3的顶部。将经由第一分离步骤中的提取物流而被收集的液体循环回在第一分离步骤中使用的色谱装置的速率为将液体从该容器泵入柱3的顶部的速率。
在该最优选的实施方式中，通常从在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱7的底部除去第二提余物流。
在该最优选的实施方式中，通常从在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱2的底部收集第二提取物流。该第二提取物流通常含有经纯化的PUFA产物。可选地，可将第二提取物流收集在容器中并且将其一部分重新引入至在第一分离步骤中使用的色谱装置的柱3的顶部。将经由第二分离步骤的提取物流而被收集的液体循环回在第二分离步骤中使用的色谱装置的速率为将液体从该容器泵入柱3的顶部的速率。
在该最优选的实施方式中，使用的洗脱剂通常为含水醇，优选含水甲醇。水与醇的比例通常为0.5:99.5至6:94体积份。
通常，在该最优选的实施方式中，在第一分离步骤中使用的色谱装置中的水与有机溶剂的比例低于在第二分离步骤中使用的色谱分离装置中的水与有机溶剂的比例。因此，与在第二步骤中使用的洗脱剂相比，在第一分离步骤中使用的洗脱剂通常含有更多的有机溶剂。
在第一分离步骤中的水与有机溶剂的比例通常为0.5:99.5至1.5:98.5体积份。在第二分离步骤中的水与有机溶剂的比例通常为2:98至6:94体积份。
尽管图9的实施方式被配置为图10a中所示出的，图10b和图10c示出的配置也可用于该实施方式中。
本发明的方法使能够得到纯度远远高于常规色谱技术所达到的纯度的PUFA产物。通过本发明的方法而生产的PUFA产物还具有尤其有利的杂质组成分布，该杂质谱与通过已知技术而制备的油中观察到那些相当不同。因此，本发明还涉及一种包括PUFA产物的组合物，例如包括通过本发明的方法所得到的PUFA产物。
实际上，本发明的方法一般将通过计算机来控制。因此，本发明还提供了一种用于控制如本文所限定的色谱装置的计算机程序，该计算机程序包括代码模块，当所述计算机程序运行时，所述代码模块指示所述装置执行本发明的方法。
下列实施例对本发明进行说明。
实施例
实施例1
根据图9示意性示出的系统，利用真实移动床色谱系统对鱼油衍生的原料（55wt%EPA EE，5wt%DHA EE）进行分馏，其中该真实移动床色谱系统以C18键合硅胶（粒径5μm）作为固定相，以及以含水甲醇作为洗脱剂。如图9中所示，8个柱（直径：4.6mm，长度：250mm）以串联形式连接。
使进料混合物穿过在第一分离步骤中的SMB装置。在第一分离步骤中，对工艺条件进行调节以从DHA和其他流动缓慢的杂质中纯化EPA。在作为中间产物的提余物流中收集EPA和其他流动快速的杂质。舍弃含有DHA和其他流动缓慢的杂质的提取物流。
随后为第二分离步骤调节SMB装置的工艺条件。在第二分离步骤中，调节工艺条件以从较快流动的杂质中纯化EPA。与在第一分离步骤中使用的含水甲醇洗脱剂相比，在第二分离步骤中使用的含水甲醇洗脱剂具有较高的水与有机溶剂的比例。在第二分离步骤中将中间产物作为进料混合物引入至SMB装置。高纯度的EPA作为提取物流而被收集。摒弃含有较快流动的杂质的提余物流。
生产出最终纯度为～95%的EPA，并且回收率为～95%。
图11示出了原料的HPLC分析。
图12示出了来自第一分离步骤的提余物流（R）和提取物流（E）的HPLC分析。
图13示出了来自第二分离步骤的提余物流（R）和提取物流（E）的HPLC分析。图14示出了来自第二分离步骤的提取物流的详细的HPLC分析。
图12和图13还示出了用于第一分离步骤和第二分离步骤的工艺条件。
对照例1
进行实验以比较通过SMB而生产的两种PUFA产物中存在的环境污染物的量与通过蒸馏而制备的类似的油中存在的环境污染物的量。下表1中示出了这些油的污染物组成分布。
表1
Figure BDA0000453721910000301
1）二噁英限度包括多氯二苯并对二噁英类（PCDD）和多氯二苯并呋喃类（PCDF）的总和并且表示为使用世界卫生组织（WHO）毒性当量因子（TEF）的WHO毒性当量。这意味着将涉及毒性担忧的17种单独的二噁英同类物的分析结果表示为单个可量化的单位：TCDD毒性当量浓度或TEQ
2）二噁英和呋喃的最大值保持在2pg/g
对照例2
进行实验以确定通过SMB而制备的油中与通过蒸馏而制备的等同的油中存在的同分异构杂质的量。
图15示出了通过SMB而制备的富含DHA的油的GC迹线。在GC迹线中没有同分异构杂质的迹象。
图16示出了通过蒸馏而制备的油的GC迹线。具有比DHA峰的洗脱时间更长的洗脱时间的四个峰对应于DHA同分异构体。从GC迹线可以看出，通过蒸馏而制备的油含有约1.5wt%的同分异构杂质。
对照例3
比较了通过SMB而生产的两种富含EPA的产物和通过蒸馏而生产的富含EPA的油。以下示出了它们的组分PUFA的wt%分析。
对照例4
比较了通过SMB而生产的富含EPA/DHA的产物和通过蒸馏而生产的富含EPA/DHA的油。以下示出了它们组分PUFA的wt%分析。
Figure BDA0000453721910000321

Claims (17)

1.一种用于从进料混合物中回收多元不饱和脂肪酸（PUFA）产物的色谱分离方法，所述方法包括以下步骤：
（i）在第一分离步骤中，在模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置中对所述进料混合物进行纯化以得到中间产物，所述模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置具有含有作为洗脱剂的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱；以及
（ii）在第二分离步骤中，使用模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置对在（i）中得到的所述中间产物进行纯化以得到所述PUFA产物，所述模拟移动床色谱装置或真实移动床色谱装置具有含有作为洗脱剂的含水有机溶剂的多个连接的色谱柱；其中
（a）所述第一分离步骤和所述第二分离步骤在同一色谱装置上按顺序进行，在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间将所述中间产物回收，并且在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤之间对所述色谱装置内的工艺条件进行调节，从而在每个分离步骤中将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离；或
（b）所述第一分离步骤和所述第二分离步骤分别在独立的第一色谱装置和第二色谱装置上进行，将从所述第一分离步骤中得到的中间产物引入至所述第二色谱装置中，并且在每个分离步骤中将所述PUFA产物与所述进料混合物的不同组分分离。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，每个装置具有来自所述多个连接的色谱柱的提取物流和提余物流，由所述提取物流和提余物流能够收集液体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，与所述进料混合物相比，在所述第一分离步骤中得到的中间产物富集所述PUFA产物。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
（a）在所述第一分离步骤中，所述中间产物作为提余物流而被收集，而在所述第二分离步骤中，所述PUFA产物作为提取物流而被收集；或
（b）在所述第一分离步骤中，所述中间产物作为提取物流而被收集，而在所述第二分离步骤中，所述PUFA产物作为提余物流而被收集。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述第一分离步骤中，将所述PUFA产物与所述进料混合物的极性较小的组分分离，而在所述第二分离步骤中，将所述PUFA产物与所述进料混合物的极性较大的组分分离。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述PUFA产物含有至少一种ω-3PUFA。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述PUFA产物含有EPA和/或DHA。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述洗脱剂是水与醇、醚、酯、酮或腈的混合物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述洗脱剂是水和甲醇的混合物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述进料混合物是鱼油或鱼油衍生的原料，所述PUFA产物是EPA或EPA乙酯，以及所述PUFA产物以大于90%的纯度，优选以大于95%的纯度，并且更优选以大于97%的纯度生产。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
（a）将来自在所述第一分离步骤中使用的装置的提取物流的一部分循环回在所述第一分离步骤中使用的装置中；和/或
（b）将来自在所述第一分离步骤中使用的装置的提余物流的一部分循环回在所述第一分离步骤中使用的装置中；和/或
（c）将来自在所述第二分离步骤中使用的装置的提取物流的一部分循环回在所述第二分离步骤中使用的装置中；和/或
（d）将来自在所述第二分离步骤中使用的装置的提余物流的一部分循环回在所述第二分离步骤中使用的装置中。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在每个分离步骤中使用的含水有机溶剂洗脱剂具有不同的水与有机溶剂的比例。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，对在每个分离步骤中使用的水与有机溶剂的比例进行调节，从而在每个分离步骤中使所述PUFA产物能够与所述进料混合物的不同组分分离。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述第一分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例低于在所述第二分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述第一分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例为0.5:99.5至1.5:98.5体积份，以及在所述第二分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例为4.5:95:5至5.5:94.5体积份。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过将水和/或有机溶剂引入至在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤中使用的装置中的一个或多个柱中来控制在所述第一分离步骤和所述第二分离步骤中的洗脱剂的水与有机溶剂的比例。
17.一种用于控制如前述权利要求中任一项所限定的色谱装置的计算机程序，所述计算机程序包括代码模块，当所述计算机程序运行时，所述代码模块指示所述装置执行根据前述权利要求中任一项所述的方法。
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