BR112014000152B1 - processo de separação cromatográfica - Google Patents

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Abstract

PROCESSO DE SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA, E, MEIO DE ARMAZENAMENTO. A presente invenção fornece um processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli insaturado (PUFA) a partir de uma mistura de alimentação, processo este que compreende as etapas de: (i) purificar a mistura de alimentação em uma primeira etapa de separação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, para se obter um produto intermediário; e (ii) purificar o produto intermediário obtido em (i) em uma segunda etapa de separação usando um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, para obter o produto de PUFA; em que (a) a primeira e segunda etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o produto intermediário sendo recuperado entre a primeira e segunda etapas de separação e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a primeira e segunda etapas de separação tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em (...).

Description

[0001] A presente invenção diz respeito a um processo de separação cromatográfica melhorado para purificar ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) e derivados do mesmo. Em particular, a presente invenção diz respeito a um processo de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real melhorado para purificar PUFAs e derivados dos mesmos.
[0002] Os ácidos graxos, em particular PUFAs, e seus derivados são precursores para moléculas biologicamente importantes, que desempenham um papel importante na regulagem de funções biológicas tais como a agregação de plaqueta, inflamação e respostas imunológicas. Assim, PUFAs e seus derivados podem ser terapeuticamente úteis no tratamento de uma ampla faixa de condições patológicas que incluem condições do CNS; neuropatias, que incluem neuropatia diabética; doenças cardiovasculares; condições gerais do sistema imune e inflamatórias, que incluem doenças de pele inflamatórias.
[0003] PUFAs são encontrados em matérias primas naturais, tais como óleos vegetais e óleos marinhos. Tais PUFAs são, entretanto, frequentemente presentes em tais óleos em mistura com ácidos graxos saturados e numerosas outras impurezas. Os PUFAs, portanto desejavelmente devem ser purificados antes dos usos nutricionais ou farmacêuticos.
[0004] Infelizmente, os PUFAs são extremamente frágeis. Assim, quando aquecidos na presença de oxigênio, eles são propensos à isomerização, peroxidação e oligomerização. O fracionamento e purificação dos produtos de PUFA para preparar ácidos graxos puros é, portanto difícil. A destilação, mesmo sob vácuo, pode levar à degradação não aceitável do produto.
[0005] A cromatografia de leito móvel simulado e real são técnicas conhecidas, familiares a aqueles de habilidade na técnica. O princípio de operação envolve movimento em contracorrente de uma fase de eluente líquido e uma fase absorvente sólida. Esta operação permite o uso mínimo de solvente tomando o processo economicamente viável. Tal tecnologia de separação tem encontrado várias aplicações em diversas áreas, que incluem hidrocarbonetos, produtos químicos industriais, óleos, açúcares e APIs.
[0006] Como é bem conhecido, em um sistema cromatográfico de leito estacionário convencional, uma mistura cujos componentes devem ser separados percola através de um recipiente. O recipiente é no geral cilíndrico, e é tipicamente aludido como a coluna. A coluna contém um empacotamento de um material poroso (no geral chamado a fase estacionária) que exibe uma alta permeabilidade aos fluidos. A velocidade de percolação de cada componente da mistura depende das propriedades físicas deste componente de modo que os componentes saiam da coluna sucessiva e seletivamente. Assim, alguns dos componentes tendem a fixar fortemente à fase estacionária e assim percolarào lentamente, ao passo que outros tendem a se fixar fracamente e saem da coluna mais rapidamente. Muitos sistemas cromatográficos de leito estacionário diferentes têm sido propostos e são usados tanto para propósitos analíticos quanto de produção industrial.
[0007] Ao contrário, um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado consiste de várias colunas individuais que contêm absorvente que são conectadas juntas em série. O eluente é passado através das colunas em uma primeira direção. Os pontos de injeção do estoque de alimentação e do eluente, e os pontos de coleta de componente separados no sistema, são periodicamente mudados por meio de uma série de válvulas. O efeito global é simular a operação de uma única coluna que contêm um leito móvel do absorvente sólido, o absorvente sólido movendo-se em uma direção em contracorrente ao fluxo de eluente. Assim, um sistema de leito móvel simulado consiste de colunas que, como em um sistema de leito estacionário convencional, contêm leitos estacionários de absorvente sólido através dos quais o eluente é passado, mas em um sistema de leito móvel simulado a operação é tal como simular um leito móvel em contracorrente contínuo.
[0008] Os processos e equipamento para a cromatografia de leito móvel simulado são descritos em várias patentes, que incluem US 2.985.589, US 3.696.107, US 3.706.812, US 3.761.533, FR-A-2103302, FR-A-2651148 e FR-A-2651149, a totalidade das quais é aqui incorporada por referência. O tópico também é tratado detalhadamente em “Preparative and Production Scale Chromatography’', editado pela Ganetsos and Barker, Marcel Dekker Inc, Nova Iorque, 1993, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência.
[0009] Um sistema de leito móvel real é similar em operação a um sistema de leito móvel simulado. Entretanto, ao invés de mudar os pontos de injeção da mistura de alimentação e o eluente, e os pontos de coleta de componente separados por meio de um sistema de válvulas, ao invés de uma série de unidades de absorção (isto é, colunas) são fisicamente movidos em relação aos pontos de alimentação e remoção. Mais uma vez, a operação é tal como simular um leito móvel em contracorrente contínuo.
[00010] Os processos e equipamento para a cromatografia de leito móvel real são descritos em várias patentes, que incluem US 6.979.402, US 5.069.883 e US 4.764.276, a totalidade das quais é aqui incorporada por referência.
[00011] A purificação dos produtos de PUFA é particularmente desafiador. Assim, muitos estoques de alimentação adequados para preparar os produtos de PUFA são misturas extremamente complexas que contêm um grande número dos componentes diferentes com tempos de retenção muito similares em aparelhos de cromatografia. É portanto muito difícil para separar certos PUFAs de tais estoques de alimentação. Entretanto, um alto grau de pureza dos produtos de PUFA é requerido, particularmente para aplicações farmacêuticas e nutracêuticas. Historicamente, portanto, a destilação tem sido usada quando alta pureza dos produtos de PUFA é requerida. Existem, entretanto, desvantagens significantes para o uso da destilação como urna técnica de separação para PUF As delicados como debatido acima.
[00012] Até agora, nenhuma técnica cromatográfica tem sido disponibilizada para a obtenção de produtos de PUFA com alta pureza, por exemplo, maior do que 95 ou 97 % de pureza, em particular a partir de estoques de alimentação comercialmente disponíveis tais como óleos de peixe.
[00013] Um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado típico é ilustrado com referência à Figura 1. O conceito de um processo de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real é explicado considerando-se uma coluna cromatográfica vertical que contém a fase estacionária S dividida em seções, mais precisamente em quatro subzonas sobrepostas I, II, III e IV indo do fundo para o topo da coluna. O eluente é introduzido no fundo em LE por meio de uma bomba P. A mistura dos componentes AeB que devem ser separados é introduzida em IA + B entre a subzona II e a subzona III. Um extrato que contém principal mente B é coletado em SB entre a subzona 1 e a subzona II, e um rafmato que contém principalmente A é coletado em SA entre a subzona III e a subzona IV.
[00014] No caso de um sistema de leito móvel simulado, um movimento descendente simulado da fase estacionária S é causado pelo movimento dos pontos de introdução e coleta em relação à fase sólida. No caso de um sistema de leito móvel real, o movimento descendente simulado da fase estacionária S é causado pelo movimento das várias colunas cromatográficas em relação aos pontos de introdução e coleta. Na Figura 1, os fluxos de eluente ascendentes e a mistura A + B é injetada entre a subzona II e a subzona III. Os componentes mover-se-ão de acordo com as suas interações cromatográficas com a fase estacionária, por exemplo adsorção em um meio poroso. O componente B que exibe afinidade mais forte com a fase estacionária (o componente que se desloca mais lento) será mais lentamente aprisionado pelo eluente e seguirá o mesmo com demora. O componente A que exibe a afinidade mais fraca com a fase estacionária (o componente que se desloca mais rápido) será facilmente aprisionado pelo eluente. Se o conjunto da direita de parâmetros, especialmente a taxa de fluxo em cada subzona, é corretamente estimado e controlado, o componente A que exibe a afinidade mais fraca com a fase estacionária será coletado entre a subzona III e a subzona IV como um rafinato e o componente B que exibe a afinidade mais forte com a fase estacionária será coletado entre a subzona I e a subzona II como um extrato.
[00015] Portanto será avaliado que o sistema de leito móvel simulado convencional esquematicamente ilustrado na Fig. 1 é limitado ao fracionamento binário.
[00016] Consequentemente, existe uma necessidade quanto a um processo de separação cromatográfica de leito móvel simulado ou real que possa separar PUF As ou seus derivados de componentes que se locomovem tanto mais rápidos quanto mais lentos (isto é, as impurezas mais polares e as menos polar), para produzir produtos de PUF A com alta pureza a partir de estoques de alimentação comercialmente disponíveis tais como óleos de peixe. E ainda desejável que o processo envolva eluentes baratos que operem sob condições de temperatura e pressão padrão.
Sumário da invenção
[00017] Foi agora surpreendentemente descoberto que um produto de PUF A pode ser eficazmente purificado a partir de estoques de alimentação comercialmente disponíveis tais como óleos de peixe pelo aparelho de leito móvel simulado ou real usando um eluente de solvente orgânico aquoso. A presente invenção, portanto fornece um processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (PUFA) a partir de uma mistura de alimentação, processo este que compreende as etapas de:
[00018] (i) purificar a mistura de alimentação em uma primeira etapa de separação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, para se obter um produto intermediário; e
[00019] (ii) purificar o produto intermediário obtido em (i) em uma segunda etapa de separação usando um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, para obter o produto de PUFA; em que
[00020] (a) a primeira e segunda etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o produto intermediário sendo recuperado entre a primeira e segunda etapas de separação e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a primeira e segunda etapas de separação tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação; ou
[00021] (b) a primeira e segunda etapas de separação são realizadas nos aparelhos de cromatografia primários e secundários separados respectivamente, o produto intermediário obtido da primeira etapa de separação sendo introduzido dentro do segundo aparelho de cromatografia, e o produto de PUFA sendo separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação.
[00022] Também é fornecido um produto de PUFA obtenível pelo processo da presente invenção.
[00023] Os produtos de PUFA produzidos pelo processo da presente invenção são produzido em alto rendimento, e têm alta pureza. Além disso, o teor das impurezas distintivas que tipicamente surgem da destilação de PUFAs é muito baixo. Como aqui usado, o termo ‘“impurezas isoméricas” é usado para indicar aquelas impurezas tipicamente produzidas durante a destilação de óleos naturais que contém PUFA. Estes incluem isômeros, produtos de peroxidação e oligomerização de PUF A.
Descrição das Figuras
[00024] A Figura 1 ilustra os princípios básicos de um processo de leito móvel simulado ou real para separar uma mistura binária.
[00025] A Figura 2 ilustra uma primeira forma de realização preferida da invenção que é adequada para separar EPA dos componentes que se locomovem mais rápido e mais lento (isto é, Impurezas mais polares e menos polares).
[00026] A Figura 3 ilustra uma segunda forma de realização preferida da invenção que é adequada para separar DHA dos componentes que se locomovem mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).
[00027] A Figura 4 ilustra em mais detalhes a primeira forma de realização preferida da invenção que é adequada para separar EPA dos componentes que se locomovem mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).
[00028] A Figura 5 ilustra cm mais detalhes a segunda forma de realização preferida da invenção que é adequada para separar DHA dos componentes que se locomovem mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).
[00029] A Figura 6 ilustra em mais detalhes um método alternativo para a primeira forma de realização preferida da invenção que é adequada para separar EPA dos componentes que se locomovem mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).
[00030] A Figura 7 ilustra em mais detalhes um método alternativo para a segunda forma de realização preferida da invenção que é adequada para separar DHA dos componentes que se locomovem mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).
[00031] A Figura 8 ilustra uma forma de realização particularmente preferida da invenção para purificar EPA dos componentes que se locomovem mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares e menos polares).
[00032] A Figura 9 ilustra um método alternativo para uma forma de realização particularmente preferida da invenção para purificar EPA dos componentes que se locomovem mais rápido e mais lento (isto é, impurezas mais polares c menos polares).
[00033] A Figura 10 ilustra três modos em que o processo de separação cromatográfica da invenção pode ser realizado.
[00034] A Figura 11 mostra uma análise de HPLC de um estoque de alimentação rico em EPA que pode ser adequadamente usado como a mistura de alimentação no processo da presente invenção.
[00035] A Figura 12 mostra análises de HPLC das correntes de rafinato (R) e extrato (E) da primeira etapa de separação de um processo de acordo com a presente invenção.
[00036] A Figura 13 mostra análises de HPLC das correntes de rafinato (R) e extrato (E) da segunda etapa de separação de um processo de acordo com a presente invenção.
[00037] A Figura 14 mostra uma análise de HPLC mais detalhada da corrente de extrato da segunda etapa de separação de um processo de acordo com a presente invenção.
[00038] A Figura 15 mostra um traço de GC FAMES de um produto de DHA produzido por SMB.
[00039] A Figura 16 mostra um traço de GC FAMES de um produto de DHA produzido pela destilação.
Descrição detalhada da invenção
[00040] O processo de separação cromatográfica da invenção é tipicamente outro que não um processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (PUFA), a partir de uma mistura de alimentação, processo este que compreende introduzir a mistura de alimentação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um álcool aquoso, em que o aparelho tem uma pluralidade de zonas que compreendem pelo menos uma primeira zona e segunda zona, cada zona tendo uma corrente de extrato e uma corrente de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e em que (a) uma corrente de rafinato que contém o produto de PUFA junto com componentes mais polares é coletada de uma coluna na primeira zona e introduzida em uma coluna não adjacente na segunda zona, e/ou (b) uma corrente de extrato que contém o produto de PUFA junto com os componentes menos polares é coletada de uma coluna na segunda zona e introduzida em uma coluna não adjacente na primeira zona, o dito produto de PUFA sendo separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada zona.
[00041] Como aqui usado nesta forma de realização, o termo “zona” refere-se a uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um álcool aquoso, e tendo um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou álcool, uma corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas. Tipicamente, cada zona tem apenas um ponto de injeção para uma mistura de alimentação. Em uma forma de realização, cada zona tem apenas um ponto de injeção para o eluente de álcool aquoso.
[00042] Em outra forma de realização, cada zona tem dois ou mais pontos de injeção para água e/ou álcool.
[00043] Outros detalhes desta forma de realização devem ser encontrados no pedido de patente internacional no. PCT/GB 10/002339, a totalidade da qual é aqui incorporada por referencia. O processo de separação cromatográfica da invenção é tipicamente outros que não os processos divulgado na PCT/GB 10/002339.
[00044] Como aqui usado, o termo “produto de PUFA” refere-se a um produto que compreende um ou mais ácidos gra.xos poli-insaturados (PUFAs), e/ou derivados dos mesmos, tipicamente de significância nutricional ou farmacêutica. Tipicamente, o produto de PUFA é um único PUFA ou derivado do mesmo. Alternativamente, o produto de PUFA é uma mistura de dois ou mais PUFAs ou derivados do mesmo, por exemplo, dois.
[00045] O termo “ácido graxo poli-insaturado” (PUFA) refere-se a ácidos graxos que contêm mais do que uma ligação dupla. Tais PUFAs são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Como aqui usado, um Derivado de PUFA é um PUFA na forma de um mono-, di- ou triglicerídeo, éster, fosfolipídeo, amida, lactona, ou sal. Os triglicerídeos e ésteres são preferidos. Os ésteres são mais preferidos. Os ésteres são tipicamente ésteres alquílicos, preferivelmente ésteres alquílicos C)-C6, mais preferivelmente ésteres alquílicos C]-C4. Os exemplos de ésteres incluem ésteres metílicos e etílicos. Os ésteres etílicos são os mais preferidos.
[00046] Tipicamente, o produto de PUFA compreende pelo menos um PUFA (0-3 ou ω-6, preferivelmente pelo menos um PUFA ω-3. Os exemplos de PUFAs ω-3 incluem ácido alfa-linolênico (ALA), ácido estearidônico (SDA), ácido eicosatrienóico (ETE), ácido eicosatetraenóico (ETA), ácido eicosapentaenóico (EPA), ácido docosapentaenóico (DPA) e ácido docosahexaenóico (DHA). SDA. EPA, DPA e DITA são preferidos. EPA e DHA são mais preferidos. Os exemplos de PUFAs ω-6 incluem ácido linoléico (LA), ácido gama-linolênico (GLA), ácido eicosadienóíco, ácido dihomo-gama-linolênico (DGLA), ácido araquidônico (ARA), ácido docosadienóico, ácido adrênico e ácido docosapentaenóico (ω-6). LA, ARA, GLA e DGLA são preferidos.
[00047] Em uma forma de realização, o produto de PUFA é EPA e/ou éster etílico de EPA (EE)
[00048] Em outra forma de realização, o produto de PUFA é DHA e/ou éster etílico de DHA (EE).
[00049] Já em outra forma de realização, o produto de PUFA é uma mistura de EPA e DHA e/ou EPA EE e DHA EE.
[00050] Em uma forma de realização mais preferida, o produto de PUFA é EPA ou éster etílico de EPA que é produzido in maior do que 90 % de pureza, preferivelmente mais do que 95 % de pureza, e mais preferivelmente mais do que 97 % de pureza.
[00051] Tipicamente, além do dito produto de PUFA, um produto de PUFA secundário adicional é coletado no processo de separação cromatográfica da invenção. Preferivelmente, o produto de PUFA é EPA e o produto de PUFA secundário adicional é DHA.
[00052] Em outra forma de realização da invenção, o aparelho é configurado para coletar um produto de PUFA que é uma mistura concentrada de EPA e DHA. Assim, uma mistura de alimentação é usada que contém EPA, DHA, componentes que são mais polares do que o EPA e DHA, e os componentes que são menos polares do que o EPA e DHA. Na primeira etapa de separação, o material menos polar do que o EPA e DHA é tipicamente removido. Na segunda etapa de separação, o material que é mais polar do que o EPA e DHA é tipicamente removido, e uma mistura concentrada de EPA e DHA é coletada como o produto de PUFA.
[00053] As misturas de alimentação adequadas para o fracionamento pelo processo da presente invenção pode ser obtido a partir de fontes naturais que incluem óleos e gorduras vegetais e animais, e a partir de fontes sintéticas que incluem óleos obtidos a partir de plantas, animais e micro-organismos geneticamente modificados que incluem leveduras. Os exemplos incluem óleos de peixe, óleos de alga e microalga e óleos vegetais, por exemplo óleo de borragem, óleo de Echium e óleo de onagrácea. Em uma forma de realização, a mistura de alimentação é um óleo de peixe. Em outra forma de realização, a mistura de alimentação é um óleo de alga. Os óleos de alga são particularmente adequados quando o produto de PUFA desejado é EPA e/ou DHA. O óleo de açafrão geneticamente modificado é particularmente adequado quando o produto de PUFA desejado é GLA. Levedura geneticamente modificada é particularmente adequada quando o produto de PUFA desejado é EPA.
[00054] Em uma forma de realização particularmente preferida a mistura de alimentação é um óleo de peixe ou estoque de alimentação derivado de óleo de peixe. Foi vantajosamente descoberto que quando um óleo de peixe ou estoque de alimentação derivado de óleo de peixe são usados, um produto de EPA ou éster etílico de EPA de PUFA pode ser produzido pelo processo da presente invenção em mais do que 90 % de pureza, preferivelmente maior do que 95 % de pureza, e mais preferivelmente maior do que 97 % de pureza.
[00055] A mistura de alimentação pode sofrer tratamento quimico antes do fracionamento pelo processo da invenção. Por exemplo, a mesma pode sofrer transesterificação de glicerídeo ou hidrólise de glicerídeo seguido em certos casos pelos processos seletivos tais como cristalização, destilação molecular, fracionamento de ureia, extração com nitrato de prata ou outras soluções de sal metálico, iodolactonisação ou fracionamento de fluido supercrítico. Alternativa mente, uma mistura de alimentação pode ser usada diretamente sem nenhuma etapa de tratamento inicial.
[00056] As misturas de alimentação tipicamente contêm o produto de PUFA e pelo menos um componente mais polar e pelo menos um componente menos polar. Os componentes menos polares têm uma aderência mais forte ao absorvente usado no processo da presente invenção do que o produto de PUFA. Durante a operação, tais componentes menos polares tipicamente se movem com a fase absorvente sólida em preferência à fase de eluente líquido. Os componentes mais polares têm uma aderência mais fraca ao absorvente usado no processo da presente invenção do que o produto de PUFA. Durante a operação, tais componentes mais polares tipicamente se move com a fase de eluente líquido em preferência à fase absorvente sólida. No geral, os componentes mais polares serão separados dentro de uma corrente de rafinato, e os componentes menos polares serão separados em uma corrente de extrato.
[00057] Os exemplos dos componentes mais e menos polares incluem (1) outros compostos que ocorrem em óleos naturais (por exemplo óleos marinhos ou óleos vegetais), (2) subprodutos formados durante as etapas de armazenagem, refino e concentração anteriores e (3) contaminantes de solventes ou reagentes que são utilizados durante as etapas de concentração ou purificação anteriores.
[00058] Os exemplos de (1) incluem outros PUFAs não desejados; ácidos graxos saturados; esteróis, por exemplo, colesterol; vitaminas; e poluentes ambientais, tais como policlorobifenila (PCB), pesticidas de hidrocarboneto poliaromático (PAH), pesticidas clorados, dioxinas e metais pesados. PCB, PAH, dioxinas e pesticidas clorados são todos componentes altamente não polares.
[00059] Os exemplos de (2) incluem isômeros e produtos da oxidação ou decomposição do produto de PUFA, por exemplo, produtos poliméricos de auto-oxidação dos ácidos graxos ou seus derivados.
[00060] Os exemplos de (3) incluem ureia que pode ser adicionada para remover ácidos graxos saturados ou monoinsaturados da mistura de alimentação.
[00061] Preferivelmente, a mistura de alimentação é um óleo marinho que contém PUFA (por exemplo, um óleo de peixe), mais preferivelmente um óleo marinho (por exemplo, um óleo de peixe) que compreende EPA e/ou DHA.
[00062] Uma mistura de alimentação típica para preparar EPA concentrado (EE) pelo processo da presente invenção compreende de 50 a 75 % de EPA (EE), de 0 a 10 % de DHA (EE), e outros componentes que incluem outros ácidos graxos ω-3 e ω-6 essenciais.
[00063] Uma mistura de alimentação preferida para preparar EPA concentrado (EE) pelo processo da presente invenção compreende 55 % de EPA (EE), 5 % de DHA (EE), e outros componentes que incluem outros ácidos graxos ω-3 e to-6 essenciais. DHA (EE) é menos polar do que o EPA(EE).
[00064] Uma mistura de alimentação típica para preparar DHA concentrado (EE) pelo processo da presente invenção compreende de 50 a 75 % de DHA (EE), de 0 a 10 % de EPA (EE), e outros componentes que incluem outros ácidos graxos ω-3 e ω-6 essenciais.
[00065] Uma mistura de alimentação preferida para preparar DHA concentrado (EE) pelo processo da presente invenção compreende 75 % de DHA (EE), 7 % de EPA (EE) e outros componentes que incluem outros ácidos graxos ω-3 e ω-6 essenciais. EPA (EE) é mais polar do que DEIA (EE).
[00066] Uma mistura de alimentação típica para preparar uma mistura concentrada de EPA (EE) e DHA (EE) pelo processo da presente invenção compreende mais do que 33 % de EPA (EE), e mais do que 22 % de DHA (EE).
[00067] Cada etapa de separação do processo da presente invenção é realizada em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real.
[00068] Qualquer aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real conhecido pode ser utilizado para os propósitos do método da presente invenção, contanto que o aparelho seja usado de acordo com o processo da presente invenção. Aqueles aparelhos descritos na US 2.985.589, US 3.696.107, US 3.706.812, US 3.761.533, FR.-A-2103302, FR-A-2651148, FR- A-2651149, US 6.979.402, US 5.069.883 e US 4.764.276 podem ser todos usados se configurados de acordo com o processo da presente invenção.
[00069] Como aqui usado, o termo “aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real’* tipicamente refere-se a uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, e tendo um ou mais pontos de injeção para uma corrente de mistura de alimentação, um ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico, urna corrente de retirada de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas, e uma corrente de retirada de extrato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas.
[00070] O aparelho de cromatografia usado era cada etapa do processo da presente invenção tem um único arranjo de colunas de cromatografia ligadas em série que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso. Tipicamente, cada uma das colunas de cromatografia é ligada às duas colunas no aparelho adjacentes a esta coluna. Assim, a saída de uma dada coluna no arranjo está conectada à entrada da coluna adjacente no arranjo, que está a jusante com respeito ao fluxo de eluente no arranjo. Assim, o eluente pode fluir em tomo do arranjo de colunas de cromatografia ligadas. Tipicamente, nenhuma das colunas de cromatografia são ligadas a colunas não adjacentes no aparelho.
[00071] Como aqui usado o termo “não adjacente” refere-se às colunas, por exemplo, no mesmo aparelho, separadas por uma ou mais colunas, preferivelmente 3 ou mais colunas, mais preferivelmente 5 ou mais colunas, o mais preferivelmente em torno de 5 colunas.
[00072] Tipicamente, cada aparelho tem apenas um ponto de injeção para uma mistura de alimentação. Em uma forma de realização, cada aparelho tem apenas um ponto de injeção para o eluente de solvente orgânico aquoso. Em outra forma de realização, cada aparelho tem dois ou mais pontos de injeção para água e/ou solvente orgânico.
[00073] O termo “rafinato” é bem conhecido pela pessoa habilitada na técnica. No contexto da cromatografia de leito móvel real e simulado o mesmo se refere à corrente dos componentes que se movem mais rapidamente com a fase de eluente líquido comparada com a fase absorvente sólida. Assim, uma corrente de rafinato é tipicamente enriquecida com componentes mais polares, e esgotada de componentes menos polares comparada com uma corrente de alimentação.
[00074] O termo “extrato” é bem conhecido pela pessoa habilitada na técnica. No contexto da cromatografia de leito móvel real e simulado o mesmo se refere à corrente dos componentes que se movem mais rapidamente com a fase absorvente sólida comparada com a fase de eluente líquido. Assim, uma corrente de extrato é tipicamente enriquecida com componentes menos polares, e esgotada de componentes mais polares comparada com uma corrente de alimentação.
[00075] O número de colunas usadas em cada aparelho não é parti cu 1 arm ente limitado. Uma pessoa habilitada facilmente seria capaz de determinar um número apropriado de colunas para o uso. O número de colunas é tipicamente 4 ou mais, preferivelmente 6 ou mais, mais preferivelmente 8 ou mais, por exemplo 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 colunas. Na forma de realização preferida, 5 ou 6 colunas, mais preferivelmente 6 colunas são usadas. Em outra forma de realização preferida, 7 ou 8 colunas, mais preferivelmente 8 colunas são usadas. Tipicamente, não existe mais do que 25 colunas, preferivelmente não mais do que 20, mais preferivelmente não mais do que 15.
[00076] Os aparelhos cromatográficos usados na primeira e segunda etapas de separação tipicamente contêm o mesmo número de colunas. Para certas aplicações eles podem ter números diferentes de colunas.
[00077] As dimensões das colunas usadas no aparelho não são particularmente limitadas, e dependerão do volume da mistura de alimentação a ser purificada. Uma pessoa habilitada facilmente seria capaz de determinar colunas apropriadamente dimensionadas para o uso. O diâmetro de cada coluna está tipicamente entre 10 e 1000 mm, preferivelmente entre 10 e 500 mm, mais preferivelmente entre 25 e 250 mm, ainda mais preferivelmente entre 50 e 100 mm, e o mais preferivelmente entre 70 e 80 mm. O comprimento de cada coluna está tipicamente entre 10 e 300 cm. preferivelmente entre 10 e 200 cm, mais preferivelmente entre 25 e 150cm, ainda mais preferivelmente entre 70 e 110 cm, e o mais preferivelmente entre 80 e 100 cm.
[00078] As colunas nos aparelhos cromatográficos usados na primeira e segunda etapas de separação tipicamente têm dimensões idênticas mas podem, para certas aplicações, ter dimensões diferentes.
[00079] As taxas de fluxo para a coluna são limitadas pelas pressões máximas através da série de colunas e dependerão das dimensões da coluna e tamanho de partícula das fases sólidas. Uma pessoa habilitada na técnica facilmente será capaz de estabelecer a taxa de fluxo requerida para cada dimensão de coluna para garantir dessorção eficiente. As colunas de diâmetro maior no geral necessitarão de fluxos mais altos para manter o fluxo linear através das colunas.
[00080] Para os tamanhos de coluna típicos esboçados acima, tipicamente a taxa de fluxo de eluente no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é de 1 a 4,5 L/min., preferivelmente de 1,5 a 2,5 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo do extrato do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é de 0,1 a 2,5 L/min., preferivelmente de 0,5 a 2,25 L/min. Nas formas de realização onde parte do extrato da primeira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação, a taxa de fluxo de reciclo é tipicamente de 0,7 a 1,4 L/min., preferivelmente de cerca de 1 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo do rafinato do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é de 0,2 a 2,5 L/min., preferivelmente de 0,3 a 2,0 L/min. Nas formas de realização onde parte do rafinato da primeira etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação, a taxa de fluxo de reciclo é tipicamente de 0,3 a 1,0 L/min., preferivelmente de cerca de 0,5 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo de introdução da mistura de alimentação no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é de 5 a 150 ml/min., preferivelmente de 10 a 100 ml/min., mais preferivelmente de 20 a 60 ml/min.
[00081] Para os tamanhos de coluna típicos esboçados acima, tipicamente a taxa de fluxo de eluente no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é de 1 a 4 L/min., preferivelmente de 1,5 a 3,5 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo do extrato do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é de 0,5 a 2 L/min., preferivelmente de 0,7 a 1,9 L/min. Nas formas de realização onde parte do extrato da segunda etapa de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação, a taxa de fluxo de reciclo é tipicamente de 0,6 a 1,4 L/min., preferivelmente de 0,7 a 1,1 L/min., mais preferivelmente de cerca de 0.9 L/min. Tipicamente, a taxa de fluxo do rafinato do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é de 0,5 a 2,5 L/min., preferivelmente de 0,7 a 1.8 L/min., mais preferivelmente de cerca de 1,4 L/min. Nas formas de realização onde paite do rafinato da segunda etapa de separação é reciclado de volta paia dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação, a taxa de fluxo de reciclo é tipicamente de 0,3 a 1,0 L/min., preferivelmente de cerca de 0,5 L/min.
[00082] Como a pessoa habilitada avaliará, referências às taxas nas quais líquido é coletado ou removido por intermédio das várias correntes de extrato e rafinato referem-se aos volumes de líquido removidos em uma quantidade de tempo, tipicamente L/minuto. Similarmente, referências às taxas nas quais líquido é reciclado de volta para dentro de um aparelho, tipicamente para uma coluna adjacente no aparelho, referem-se aos volumes de líquido reciclados em uma quantidade de tempo, tipicamente L/minuto.
[00083] O tempo da etapa, isto é, o tempo entre a mudança dos pontos de injeçào da mistura de alimentação e eluente, e os vários pontos de coleta das frações coletadas, não é particularmente limitado, e dependerá do número e dimensões das colunas usadas, e da taxa de fluxo através do aparelho. Uma pessoa habilitada facilmente seria capaz de determinar tempos de etapa apropriados para o uso no processo da presente invenção. O tempo da etapa é tipicamente de 100 a 1000 segundos, preferivelmente de 200 a 800 segundos, mais preferivelmente de cerca de 250 a cerca de 750 segundos. Em algumas formas de realização, um tempo de etapa de 100 a 400 segundos, preferivelmente 200 a 300 segundos, mais preferivelmente de cerca de 250 segundos, é apropriado. Em outras formas de realização, um tempo de etapa de 600 a 900 segundos, preferivelmente de 700 a 800 segundos, mais preferivelmente de cerca de 750 segundos é apropriado.
[00084] No processo da presente invenção, a cromatografia de leito móvel real é preferida.
[00085] Absorventes convencionais conhecidos na técnica para sistemas de leito móvel real e simulado podem ser usados no processo da presente invenção. Cada coluna cromatográfica pode conter o mesmo ou um absorvente diferente. Tipicamente, cada coluna contém o mesmo absorvente. Os exemplos de tais materiais habitualmente usados são pérolas poliméricas, preferivelmente poliestireno reticulado com DVB (divinilbenzeno); e gel de sílica, preferivelmente gel de sílica ligado em fase reversa com alcanos C8 ou Cig, especialmente C18. O gel de sílica ligado em fase reversa Cl8 é preferido. O absorvente usado no processo da presente invenção é preferivelmente não polar.
[00086] A forma do material absorvente da fase estacionária pode ser. por exemplo, pérolas esféricas ou não esféricas, preferivelmente pérolas substancialmente esféricas. Tais pérolas tipicamente têm um diâmetro de 5 a 500 micron, preferivelmente de 10 a 500 micron, mais preferivelmente de 15 a 500 micron, mais preferivelmente de 40 a 500 micron, mais preferivelmente de 100 a 500 micron, mais preferivelmente de 250 a 500 micron, ainda mais preferivelmente de 250 a 400 micron, o mais preferivelmente de 250 a 350 micron. Em algumas formas de realização, as pérolas com um diâmetro de 5 a 35 micron podem ser usadas, tipicamente de 10 a 30 micron, preferivelmente de 15 a 25 micron. Alguns tamanhos de partícula preferidos são um pouco maiores que os tamanhos de partícula das pérolas usadas no passado em processos de leito móvel simulado e real. O uso de partículas maiores permite que uma pressão mais baixa de eluente seja usada no sistema. Isto, por sua vez, tem vantagens em termos de economias de custo, eficiência e tempo de vida do aparelho. Foi surpreendentemente descoberto que as pérolas absorventes de tamanho de partícula grande podem ser usadas no processo da presente invenção (com as suas vantagens associadas) sem nenhuma perda em resolução.
[00087] O absorvente tipicamente tem um tamanho de poro de 10 a 50 nm, preferivelmente de 15 a 45 nm, mais preferivelmente de 20 a 40 nm, o mais preferivelmente de 25 a 35 nm.
[00088] Tipicamente, o processo da presente invenção é conduzido de 15 a 55 °C, preferivelmente de 20 a 40 °C, mais preferivelmente em tomo de 30 °C. Assim, o processo é tipicamente realizado na temperatura ambiente, mas pode ser conduzido em temperaturas elevadas.
[00089] O processo da presente invenção compreende uma primeira e segunda etapas de separação.
[00090] Estas duas etapas podem ser facilmente realizadas em um único aparelho cromatográfico. Assim, em uma forma de realização, (a) a primeira e segunda etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o produto intermediário sendo recuperado entre a primeira e segunda etapas de separação e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a primeira e segunda etapas de separação tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação. Uma forma de realização preferida deste processo de separação é mostrada como a Figura 10a. Assim, a primeira etapa de separação (lado á esquerda) é realizada em um aparelho SMB tendo 8 colunas. Entre a primeira e segunda etapas de separação o produto intermediário é recuperado, por exemplo, em um recipiente, as condições de processo no aparelho de cromatografia são ajustadas tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação. A segunda etapa de separação (lado à direita) é depois realizada no mesmo aparelho SMB tendo 8 colunas.
[00091] Na forma de realização (a), ajustar as condições de processo tipicamente refere-se a ajustar as condições de processo no aparelho como um todo, isto é, fisicamente modificando o aparelho de modo que as condições sejam diferentes. Isto não se refere a simplesmente reintroduzir o produto intermediário de volta para dentro de uma parte diferente do mesmo aparelho onde as condições de processo poderia acontecer de ser diferente.
[00092] Altemativamente, o primeiro e segundo aparelhos cromatográficos separados podem ser usados na primeira e segunda etapas de separação. Assim, em outra forma de realização, (b) a primeira e segunda etapas de separação são realizadas nos aparelhos de cromatografia primários e secundários separados respectivamente, o produto intermediário obtido da primeira etapa de separação sendo introduzido dentro do segundo aparelho de cromatografia, e o produto de PUFA sendo separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação.
[00093] Na forma de realização (b), as duas etapas de separação podem ser cada uma realizadas de modo sequencial ou simultaneamente.
[00094] Assim, na forma de realização (b) no caso onde as duas etapas de separação são realizadas sequencialmente, a primeira e segunda etapas de separação são realizadas sequencialmente nos aparelhos de cromatografia primários e secundários separados respectivamente, o produto intermediário sendo recuperado entre a primeira e segunda etapas de separação e as condições de processo no primeiro e segundo aparelhos de cromatografia sendo ajustadas tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação. Uma forma de realização preferida deste processo de separação é mostrada como a Figura 10b. Assim, a primeira etapa de separação (lado à esquerda) é realizada em um aparelho SMB tendo 8 colunas, de um a oito. Entre a primeira e segunda etapas de separação o produto intermediário é recuperado, por exemplo, em um recipiente, e depois introduzido dentro de um segundo aparelho SMB separado. A segunda etapa de separação (lado à direita) é realizada no segundo aparelho SMB separado que tem 8 colunas, nove a dezesseis. As condições de processo nos dois aparelhos de cromatografia são ajustadas tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação.
[00095] Na forma de realização (b) no caso onde as duas etapas de separação são realizadas simultaneamente, a primeira e segunda etapas de separação são realizadas nos aparelhos de cromatografia primários e secundários separados respectivamente, o produto intermediário sendo introduzido dentro do aparelho de cromatografia usado na segunda etapa de separação, e as condições de processo no primeiro e segundo aparelhos de cromatografia sendo ajustadas tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação. Uma forma de realização preferida deste processo de separação é mostrada como a Figura 10c. Assim, a primeira etapa de separação (lado à esquerda) é realizada em um aparelho SMB tendo 8 colunas, de um a oito. O produto intermediário obtido na primeira etapa de separação é depois introduzido dentro do segundo aparelho de cromatografia separado usado na segunda etapa de separação. O produto intermediário pode ser passado da primeira etapa de separação à segunda etapa de separação diretamente ou indiretamente, por exemplo, por intermédio de um recipiente. A segunda etapa de separação (lado à direita) é realizada no segundo aparelho SMB separado que tem 8 colunas, de nove a dezesseis. As condições de processo nos dois aparelhos de cromatografia são ajustadas tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação.
[00096] Na forma de realização (b) no caso onde as duas etapas de separação são realizadas simultaneamente, o eluente circula separadamente nos dois aparelhos cromatográficos separados. Assim, o eluente não é compartilhado entre os dois aparelhos cromatográficos separados além daquele eluente que pode estar presente como solvente no produto intermediário que é purificado na segunda etapa de separação, e que é introduzido no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. As colunas cromatográficas não são compartilhadas entre os dois aparelhos cromatográficos separados usados na primeira e segunda etapas de separação.
[00097] Depois que o produto intermediário é obtido na primeira etapa de separação, o eluente de solvente orgânico aquoso pode ser parcial ou totalmente removido antes que o produto intermediário seja purificado na segunda etapa de separação. Altemativamente, o produto intermediário pode ser purificado na segunda etapa de separação sem a remoção de qualquer solvente presente.
[00098] Como mencionado acima, o produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação. Na forma de realização (a), as condições de processo do único aparelho SMB usado em ambas as etapas de separação são ajustadas entre a primeira e segunda etapas de separação tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação. Na forma de realização (b), as condições de processo nos dois aparelhos de cromatografia separados usados na primeira e segunda etapas de separação são ajustadas tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação.
[00099] Assim, as condições de processo na primeira e segunda etapas de separação variam. As condições de processo que variam podem incluir, por exemplo, o tamanho das colunas usadas, o número de colunas usadas, o empacotamento usado nas colunas, o tempo da etapa do aparelho de SMB, a temperatura do aparelho, ou o eluente usado nas etapas de separação.
[000100] O produto intermediário obtido na primeira etapa de separação é tipicamente enriquecido no produto de PUFA comparado com a mistura de alimentação.
[000101] O produto intermediário obtido na primeira etapa de separação é depois introduzido no aparehio cromatográfico usado na segunda etapa de separação.
[000102] O produto intermediário é tipicamente coletado como a corrente de rafinato ou extrato do aparelho cromatográfico usado no primeiro processo de separação.
[000103] Tipicamente, o produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de extrato na segunda etapa de separação. Assim, a corrente de rafinato coletado na primeira etapa de separação é usada como a mistura de alimentação na segunda etapa de separação. A corrente de rafinato coletada na primeira etapa de separação tipicamente contém o produto de PUFAjunto com os componentes mais polares.
[000104] Altemativamente, o produto intermediário é coletado como a corrente de extrato na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de rafinato na segunda etapa de separação. Assim, a corrente de extrato coletada na primeira etapa de separação é usada como a mistura de alimentação na segunda etapa de separação. A corrente de extrato coletada na primeira etapa de separação tipicamente contém o produto de PUFA junto com os componentes menos polares.
[000105] O produto de PUFA é separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação. Tipicamente, os componentes separados em cada etapa de separação do processo da presente invenção têm polaridades diferentes.
[000106] Preferivelmente, o produto de PUFA é separado dos componentes menos polares da mistura de alimentação na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes mais polares da mistura de alimentação na segunda etapa de separação.
[000107] Tipicamente, (a) parte da corrente de extrato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e/ou
[000108] (b) parte da corrente de rafinato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e/ou
[000109] (c) parte da corrente de extrato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e/ou
[000110] (d) parte da corrente de rafinato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação.
[000111] Preferivelmente, (a) parte da corrente de extrato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e
[000112] (b) parte da corrente de rafinato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e
[000113] (c) parte da corrente de extrato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e
[000114] (d) parte da corrente de rafinato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação.
[000115] Esta reciclagem envolve alimentar parte da corrente de extrato ou rafinato fora do aparelho de cromatografia usado na primeira ou segunda etapas de separação de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa, tipicamente dentro de uma coluna adjacente. Esta coluna adjacente é a coluna adjacente que está a jusante com respeito ao fluxo de eluente no sistema.
[000116] A taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato ou rafinato na primeira ou segunda etapas de separação é reciclado de volta para dentro do aparelho de cromatografia usado nesta etapa é a taxa na qual o líquido coletado por intermédio desta corrente é alimentado de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa, tipicamente dentro de uma coluna adjacente, isto é, a coluna a jusante com respeito ao fluxo de eluente no sistema.
[000117] Isto pode ser observado com referência a uma forma de realização preferida na Figura 9. A taxa de reciclo de extrato na primeira etapa de separação é a taxa na qual o extrato coletado do fundo da coluna 2 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é alimentado no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, isto é, a taxa de fluxo do líquido no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.
[000118] A taxa de reciclo de extrato na segunda etapa de separação é a taxa na qual o extrato coletado no fundo da coluna 2 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é alimentado no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, isto é, a taxa de fluxo do líquido no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.
[000119] A reciclagem das correntes de extrato e/ou rafinato na primeira e/ou segunda etapas de separação é tipicamente efetuada pela alimentação do líquido coletado por intermédio desta corrente nesta etapa de separação dentro de um recipiente, e depois bombeando uma quantidade deste líquido do recipiente de volta para dentro do aparelho usado nesta etapa de separação, tipicamente dentro de uma coluna adjacente. Neste caso, a taxa de reciclo de líquido coletado por intermédio de uma corrente de extrato ou rafinato particular na primeira e/ou segunda etapas de separação, tipicamente de volta para dentro de uma coluna adjacente, é a taxa na qual o líquido é bombeado para fora do recipiente de volta para dentro do aparelho de cromatografia, tipicamente dentro de uma coluna adjacente,
[000120] Como a pessoa habilitada avaliará, a quantidade de líquido que é introduzido dentro de um aparelho de cromatografia por intermédio das correntes de eluente e estoque de alimentação é equilibrada com a quantidade de líquido removido do aparelho, e reciclado de volta para dentro do aparelho.
[000121] Assim, com referência à Figura 9, para a corrente de extrato, a taxa de fluxo de eluente (dessorvente) no(s) apareIho(s) cromatográfico(s) usado(s) na primeira e segunda etapas de separação (D) é igual à taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de extrato nesta etapa de separação acumula em um recipiente (El e E2) adicionada na taxa na qual o extrato é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação particular (D-El e D-E2).
[000122] Para a corrente de rafinato de uma etapa de separação, a taxa na qual o extrato é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação particular (D-El e D-E2) adicionado na taxa na qual o estoque de alimentação é introduzido no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação particular (F e Rl) é igual à taxa na qual o líquido coletado por intermédio da corrente de rafinato nesta etapa de separação particular acumula em um recipiente (Rl e R2) adicionada na taxa na qual o rafinato é reciclado de volta no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação particular (D+FE1-R1 e D+R1-E2-R2).
[000123] A taxa na qual o líquido coletado de uma corrente de extrato ou rafinato particular de um aparelho de cromatografia acumula em um recipiente também pode ser considerada como a taxa líquida de remoção desta corrente de extrato ou rafinato deste aparelho de cromatografia.
[000124] O eluente usado no processo da presente invenção é um solvente orgânico aquoso.
[000125] O solvente orgânico aquoso tipicamente compreende água e um ou mais alcoóis, éteres, ésteres, cetonas ou nitrilas, ou misturas dos mesmos.
[000126] Os solventes de álcool são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Os alcoóis são tipicamente alcoóis de cadeia curta. Os alcoóis tipicamente são da fórmula ROH, em que R é um grupo alquila Ci-Cβ reto e ramificado. O grupo alquila C]-Cò é preferivelmente não substituído. Os exemplos de alcoóis incluem metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, n- butanol, i-butanol, s-butanol e t-butanol. Metanol e etanol são preferidos. Metanol é o mais preferido.
[000127] Os solventes de éter são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Os éteres são tipicamente éteres de cadeia curta. Os éteres tipicamente são da fórmula R-O-R’, em que R e R’ são os mesmos ou diferentes e representam um grupo alquila C[-C() reto e ramificado. O grupo alquila C|-C6 é preferivelmente não substituído. Os éteres preferidos incluem éter dietílico, éter diisopropílico, e éter metil t-butílico (MTBE).
[000128] Os solventes de éster são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. Os ésteres são tipicamente ésteres de cadeia curta. Os ésteres tipicamente são da fórmula R-(C=O)O-R’, em que R e R’ são os mesmos ou diferentes e representam um grupo alquila C|-C6 reto e ramificado.
[000129] Os ésteres preferidos incluem acetato de metila e acetato de etila.
[000130] Os solventes de cetona são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. As cetonas são tipicamente cetonas de cadeia curta. As cetonas tipicamente são da fórmula R-(C=O)-R’, em que R e R’ são os mesmos ou diferentes e representam um grupo alquila CrC6 reto e ramificado. O grupo alquila Cj-C6 é preferivelmente não substituído. As cetonas preferidas incluem acetona, metil etil cetona e metil isobutil cetona (MTBK).
[000131] Os solventes de nitrila são bem conhecidos pela pessoa habilitada na técnica. As nitrilas são tipicamente nitrilas de cadeia curta. As nitrilas tipicamente são da fórmula R-CN, em que R representa um grupo alquila C)-Cò reto e ramificado. O grupo alquila Ci-C6 é preferivelmente não substituído. As nitrilas preferidas incluem acetonitrila.
[000132] Tipicamente, o solvente orgânico aquoso é álcool aquoso ou acetonitrila aquosa.
[000133] O solvente orgânico aquoso é preferivelmente metanol aquoso ou acetonitrila aquosa. O metanol aquoso é o mais preferido.
[000134] Tipicamente, o eluente não está em um estado supercrítico. Tipicamente, o eluente é um líquido.
[000135] Tipicamente, a razão de água:solvente orgânico média, por exemplo a razão de água:metanol, do eluente no aparelho inteiro é de 0,1:99,9 a 9:91 partes em volume, preferivelmente de 0,25:99,75 a 7:93 partes em volume, mais preferivelmente de 0,5:99,5 a 6:94 partes em volume.
[000136] Quando o solvente orgânico aquoso é acetonitrila aquosa, o eluente tipicamente contém até 30 % em peso de água, o resto acetonitrila. Preferivelmente, o eluente contém de 5 a 25 % em peso de água, o resto acetonitrila. Mais preferivelmente, o eluente contém de 10 a 20 % em peso de água, o resto acetonitrila. Ainda mais preferivelmente, o eluente contém de 15 a 25 % em peso de água, o resto acetonitrila.
[000137] Tipicamente, o eluente de solvente orgânico aquoso usado em cada etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente. A razão de água:solvente orgânico usada em cada etapa de separação é preferivelmente ajustada tal que o produto de PUFA possa ser separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação.
[000138] A força de eluição do eluente usado em cada uma das etapas de separação é tipicamente diferente. Preferivelmente, a força de eluição do eluente usado na primeira etapa de separação é maior do que aquela do eluente usado na segunda etapa de separação. Na prática isto é obtido pela variação das quantidades relativas de água e solvente orgânico usadas em cada etapa de separação.
[000139] Dependendo da escolha do solvente orgânico, eles podem ser dessorvedores mais poderosos do que água. Altemativamente, eles podem ser dessorvedores menos poderosos do que água. Acetonitrila e alcoóis, por exemplo, são dessorvedores mais poderosos do que água.
[000140] Assim, quando o solvente orgânico aquoso é álcool ou acetonitrila aquosos, a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na primeira etapa de separação é tipicamente maior do que a quantidade de álcool ou acetonitrila no eluente usado na segunda etapa de separação.
[000141] Tipicamente, a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda etapa de separação. Assim, o eluente na primeira etapa de separação tipicamente contém mais solvente orgânico, preferivelmente álcool, mais preferivelmente metanol, do que o eluente na segunda etapa de separação.
[000142] Nas formas de realização onde o solvente orgânico aquoso usado em cada etapa de separação tem uma razão de água:solvente orgânico diferente, a razão de águarsolvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é tipicamente de 0:100 a 5:95 partes em volume, preferivelmente de 0,1:99,9 a 2.5:97,5 partes em volume, mais preferivelmente de 0,25:99,75 a 2:98 partes em volume, e o mais preferivelmente de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes em volume. Nestas formas de realização, a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda etapa de separação é tipicamente de 2:98 a 8:92 partes em volume, preferivelmente de 3:97 a 7:93 partes em volume, mais preferivelmente de 4:96 a 6:94 partes em volume, e ainda mais preferivelmente de 4,5:95,5 a 5,5:94,5 partes em volume.
[000143] Em uma forma de realização particularmente preferida onde o solvente orgânico aquoso usado em cada etapa de separação tem um teor de água e solvente orgânico diferente, a razão de água:solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes em volume, e a razão de água:solvente orgânico do eluente na segunda etapa de separação é de 4,5:95:5 a 5,5:94,5 partes em volume.
[000144] Será avaliado que as razões de água e solvente orgânico em cada etapa de separação aludida acima são razões médias dentro da totalidade do aparelho cromatográfico.
[000145] Tipicamente, a razão de água:solvente orgânico do eluente em cada etapa de separação é controlada pela introdução de água e/ou solvente orgânico dentro de uma ou mais colunas nos aparelhos cromatográficos usados nas etapas de separação. Assim, por exemplo, para se obter uma razão de água: sol vente orgânico mais baixa na primeira etapa de separação do que na segunda etapa de separação, água é tipicamente introduzida mais lentamente no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação do que na segunda etapa de separação.
[000146] Em algumas formas de realização, solvente orgânico essencialmente puro e água essencialmente pura podem ser introduzidos em pontos diferentes no aparelho cromatográfico usado em cada etapa de separação. As taxas de fluxo relativas destas duas correntes determinarão o perfil de solvente global no aparelho cromatográfico. Em outras formas de realização, misturas de solvente orgànico/água diferentes podem ser introduzidas em pontos diferentes em cada aparelho cromatográfico usado em cada etapa de separação. Isto envolverá introduzir duas ou mais misturas de solvente orgânico/água diferentes no aparelho cromatográfico usado em um etapa de separação particular, cada mistura de solvente orgânico/água tendo uma razão de solvente orgânico :água diferente. As taxas de fluxo relativas e as concentrações relativas das misturas de solvente orgânico/água nesta forma de realização determinarão o perfil de solvente global no aparelho cromatográfico usado nesta etapa de separação.
[000147] Em uma forma de realização particularmente preferida, (1) o produto intermediário que contêm o produto de PUFA junto com os componentes mais polares é coletado como a corrente de rafinato na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de extrato na segunda etapa de separação; ou
[000148] (2) o produto intermediário que contêm o produto de PUFA junto com os componentes menos polares é coletado como a corrente de extrato na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é coletado como a corrente de rafinato na segunda etapa de separação.
[000149] A forma de realização particularmente preferida (1) é adequada para purificar EPA a partir de uma mistura de alimentação.
[000150] Esta forma de realização particularmente preferida (1) é ilustrada na Figura 2. Uma mistura de alimentação F que compreende o produto de PUFA (B) e os componentes mais polar (C) e o menos polar (a) é purificada na primeira etapa de separação. Na primeira etapa de separação, os componentes menos polares (a) são removidos como corrente de extrato El. O produto de PUFA (B) e os componentes mais polares (C) são coletados como corrente de rafinato RI. A corrente de rafinato RI é o produto intermediário que é depois purificado na segunda etapa de separação. Na segunda etapa de separação, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinato R2. O produto de PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E2.
[000151] Esta forma de realização é ilustrada em mais detalhes na Figura 4. A Figura 4 é idêntica à Figura 2, exceto que os pontos de introdução do solvente orgânico dessorvente (D) e água (W) em cada aparelho cromatográfico são mostrados. O solvente orgânico dessorvente (D) e água (W) junto compõem o eluente. A fase (D) é tipicamente solvente orgânico essencialmente puro, mas pode, em certas formas de realização ser uma mistura de solvente orgânico/água que compreende principalmente solvente orgânico. A fase (W) é tipicamente água essencialmente pura, mas pode, em certas formas de realização ser uma mistura de solvente orgânico/água que compreende principalmente água, por exemplo, uma mistura de 98 % de água/2 % de metanol.
[000152] Outra ilustração desta forma de realização particularmente preferida é mostrada na Figura 6. Aqui não existe nenhum ponto de injeção de água separado, e ao invés um solvente orgânico aquoso dessorvente é injetado em (D).
[000153] A separação em corrente de rafinato e extrato pode ser auxiliada pela variação da força de dessorção do eluente dentro de cada aparelho cromatográfico. Isto pode ser obtido pela introdução do componente de solvente orgânico (ou rico em solvente orgânico) do eluente e do componente de água (ou rico em água) em pontos diferentes em cada aparelho cromatográfico. Assim, tipicamente, o solvente orgânico é introduzido a montante do ponto de coleta de extrato c a água é introduzida entre o ponto de coleta de extrato e o ponto de introdução da alimentação no aparelho cromatográfico, em relação ao fluxo de eluente no sistema. Isto é mostrado na Figura 4.
[000154] Os solventes típicos para o uso nesta forma de realização mais preferida são alcoóis aquosos ou acetonitrila aquosa, preferivelmente metanol aquoso.
[000155] Tipicamente, nesta forma de realização particularmente preferida, o eluente de solvente orgânico aquoso usado na primeira etapa de separação contém mais solvente orgânico do que o eluente usado na segunda etapa de separação, isto é, a razão de água:sol vente orgânico na primeira etapa é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico na segunda etapa.
[000156] Nesta forma de realização particularmente preferida a primeira corrente de rafinato na primeira etapa de separação é tipicamente removida a jusante do ponto de introdução da mistura de alimentação no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.
[000157] Nesta forma de realização particularmente preferida, a primeira corrente de extrato na primeira etapa de separação é tipicamente removida a montante do ponto de introdução da mistura de alimentação no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.
[000158] Nesta forma de realização particularmente preferida, a segunda corrente de rafinato na segunda etapa de separação é tipicamente removida a jusante do ponto de introdução do produto intermediário no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.
[000159] Nesta forma de realização particularmente preferida, a segunda corrente de extrato na segunda etapa de separação é tipicamente coletada a montante do ponto de introdução do produto intermediário no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.
[000160] Tipicamente nesta forma de realização particularmente preferida, o solvente orgânico ou solvente orgânico aquoso é introduzido no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação a montante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.
[000161] Tipicamente nesta forma de realização particularmente preferida, quando água é introduzida no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, a água é introduzida no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação a montante do ponto de introdução da mistura de alimentação mas a jusante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.
[000162] Tipicamente nesta forma de realização particularmente preferida, o solvente orgânico ou solvente orgânico aquoso é introduzido no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação a montante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.
[000163] Tipicamente nesta forma de realização particularmente preferida, quando água é introduzida no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, a água é introduzida no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação a montante do ponto de introdução do produto intermediário, mas a jusante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.
[000164] A forma de realização particularmente preferida (2) é adequada para purificar DHA a partir de uma mistura de alimentação.
[000165] A forma de realização particularmente preferida (2) é ilustrada na Figura 3. Uma mistura de alimentação F que compreende produto de PUFA (B) e os componentes mais polares (C) e os menos polares (a) é purificada na primeira etapa de separação. Na primeira etapa de separação, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinato RI. O produto de PUFA (B) e os componentes menos polares (a) são coletados como corrente de extrato El. A corrente de extrato EI é o produto intermediário que é depois purificado na segunda etapa de separação. Na segunda etapa de separação, os componentes menos polares (a) são removidos como corrente de extrato E2. O produto de PUFA (B) é coletado como corrente de rafinato R2.
[000166] Esta forma de realização é ilustrada em mais detalhes na Figura 5. A Figura 5 é idêntica à Figura 3, exceto que os pontos de introdução do solvente orgânico dessorvente (D) e água (W) dentro de cada aparelho cromatográfico são mostrados. Como acima, a fase (D) é tipicamente solvente orgânico essencialmente puro, mas pode, em certas formas de realização ser uma mistura de solvente orgânico/água que compreende principalmente solvente orgânico. A fase (W) é tipicamente água essencialmente pura, mas pode, em certas formas de realização ser uma mistura de solvente orgânico/água que compreende principalmente água, por exemplo, uma mistura de 98 % de água/2 % de metanol.
[000167] Outra ilustração desta forma de realização particularmente preferida é mostrada na Figura 7. Aqui não existe nenhum ponto de injeção de água separado, e ao invés um solvente orgânico aquoso dessorvente é injetado em (D).
[000168] Os solventes típicos para o uso nesta forma de realização mais preferida são alcoóis aquosos ou acetonitrila aquosa, preferivelmente metanol aquoso.
[000169] Tipicamente nesta forma de realização, o eluente de solvente orgânico aquoso usado na primeira etapa de separação contém menos solvente orgânico do que o eluente usado na segunda etapa de separação, isto é, a razão de água:solvente orgânico na primeira etapa de separação é mais alta do que na segunda etapa de separação.
[000170] Nesta forma de realização a primeira corrente de rafinato na primeira etapa de separação é tipicamente removida a jusante do ponto de introdução da mistura de alimentação no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.
[000171] Nesta forma de realização, a primeira corrente de extrato na primeira etapa de separação é tipicamente removida a montante do ponto de introdução da mistura de alimentação no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.
[000172] Nesta forma de realização, a segunda corrente de rafinato na segunda etapa de separação é tipicamente removida a jusante do ponto de introdução do produto intermediário no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.
[000173] Nesta forma de realização, a segunda corrente de extrato na segunda etapa de separação é tipicamente coletada a montante do ponto de introdução do produto intermediário no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, com respeito ao fluxo de eluente.
[000174] Tipicamente nesta forma de realização, o solvente orgânico ou solvente orgânico aquoso é introduzido no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação a montante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.
[000175] Tipicamente nesta forma de realização, quando água é introduzida no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação, a água é introduzida no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação a montante do ponto de introdução da mistura de alimentação mas a jusante do ponto de remoção da primeira corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.
[000176] Tipicamente nesta forma de realização, o solvente orgânico ou solvente orgânico aquoso é introduzido no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação a montante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.
[000177] Tipicamente nesta forma de realização, quando água é introduzida no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação, a água é introduzida no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação a montante do ponto de introdução do produto intermediário mas a jusante do ponto de remoção da segunda corrente de extrato, com respeito ao fluxo de eluente.
[000178] Em uma forma de realização preferida da invenção, cada um do aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real usado na primeira e segunda etapas de separação consiste de oito colunas cromatográficas. Estas são aludidas como colunas de 1 a 8. Em cada aparelho as oito colunas são dispostas em série de modo que o fundo da coluna 1 esteja ligado ao topo da coluna 2, o fundo da coluna 2 esteja ligado ao topo da coluna 3...etc... e o fundo da coluna 8 esteja ligado ao topo da coluna 1. Estas ligações opcionalmente podem ser por intermédio de um recipiente de contensão, com uma corrente de reciclagem dentro da coluna seguinte. O fluxo de eluente através do sistema é da coluna 1 para a coluna 2 para a coluna 3 etc. O fluxo de absorvente eficaz através do sistema é da coluna 8 para a coluna 7 para a coluna 6 etc.
[000179] Uma forma de realização mais preferida é ilustrada na Figura 8. Uma mistura de alimentação F que compreende o produto de PUFA (B) e os componentes mais polar (C) e o menos polar (a) são introduzidos no topo da coluna 5 no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. O solvente orgânico dessorvente é introduzido no topo da coluna 1 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. Agua é introduzida no topo da coluna 4 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. Na primeira etapa de separação, os componentes menos polares (a) são removidos como corrente de extrato El do ftindo da coluna 2. O produto de PUFA (B) e os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinato RI do fundo da coluna 7. A corrente de rafinato RI é o produto intermediário que é depois purificado na segunda etapa de separação, sendo introduzido no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação no topo da coluna 5. O solvente orgânico dessorvente é introduzido no topo da coluna l no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. A água é introduzida no topo da coluna 4 no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. Na segunda etapa de separação, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinato R2 no fundo da coluna 7. O produto de PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E2 no fundo da coluna 2.
[000180] Nesta fornia de realização mais preferida, o solvente orgânico é tipicamente introduzido no topo da coluna 1 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.
[000181] Nesta forma de realização mais preferida, a água é tipicamente introduzida no topo da coluna 4 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.
[000182] Nesta forma de realização mais preferida, o solvente orgânico é tipicamente introduzido no topo da coluna 1 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.
[000183] Nesta forma de realização mais preferida, o solvente orgânico é tipicamente introduzido no topo da coluna 4 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.
[000184] Nesta forma de realização mais preferida, a corrente de alimentação é tipicamente introduzida no topo da coluna 5 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.
[000185] Nesta fôrma de realização mais preferida, uma primeira corrente de rafinato é tipicamente coletada como o produto intermediário do fundo da coluna 7 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. Este produto intermediário é depois purificado na segunda etapa de separação e é tipicamente introduzido no topo da coluna 5 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. A primeira corrente de rafinato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente antes de ser purificada na segunda etapa de separação.
[000186] Nesta forma de realização mais preferida, uma primeira corrente de extrato é tipicamente removida do fundo da coluna 2 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. A primeira corrente de extrato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente e reintroduzida no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.
[000187] Nesta forma de realização mais preferida, uma segunda corrente de rafinato é tipicamente removida do fundo da coluna 7 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.
[000188] Nesta forma de realização mais preferida, uma segunda corrente de extrato é tipicamente coletada do fiindo da coluna 2 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. Esta segunda corrente de extrato tipicamente contém o produto de PUFA purificado. A segunda corrente de extrato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente e reintroduzido no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.
[000189] Nesta forma de realização mais preferida, o eluente usado é tipicamente álcool aquoso, preferivelmente metanol aquoso. A razão de águaiálcool é tipicamente de 0,5:99,5 a 6:94 partes em volume.
[000190] Tipicamente, nesta forma de realização mais preferida, a razão de água:solvente orgânico no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água: sol vente orgânico no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. Assim, o eluente na primeira etapa de separação tipicamente contém mais solvente orgânico do que o eluente usado na segunda etapa de separação.
[000191] A razão de águarsolvente orgânico na primeira etapa de separação é tipicamente de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes em volume. A razão de água:solvente orgânico na segunda etapa de separação é tipicamente de 2:98 a 6:94 partes em volume.
[000192] Embora a forma de realização da Figura 8 esteja configurada como mostrada na Figura 10a, as configurações mostradas nas Figuras 10b e 10c também podem ser usadas nesta forma de realização.
[000193] Outra forma de realização mais preferida é ilustrada na Figura 9. Uma mistura de alimentação F que compreende o produto de PUFA (B) e os componentes mais polar (C) e o menos polar (a) são introduzidos no topo da coluna 5 no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. O solvente orgânico aquoso dessorvente é introduzido no topo da coluna 1 no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. Na primeira etapa de separação, os componentes menos polares (a) são removidos como corrente de extrato El do fundo da coluna 2. O produto de PUFA (B) e os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinato RI do fundo da coluna 7. A corrente de rafinato R1 é o produto intermediário que é purificado na segunda etapa de separação sendo introduzido no topo da coluna 4 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. O solvente orgânico aquoso dessorvente é introduzido no topo da coluna 1 no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. Na segunda etapa de separação, os componentes mais polares (C) são removidos como corrente de rafinato R2 no fundo da coluna 7. O produto de PUFA (B) é coletado como corrente de extrato E2 no fundo da coluna 2.
[000194] Nesta forma de realização mais preferida, o solvente orgânico aquoso é tipicamente introduzido no topo da coluna 1 no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.
[000195] Nesta forma de realização mais preferida, o solvente orgânico aquoso é tipicamente introduzido no topo da coluna 9 no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação.
[000196] Nesta forma de realização mais preferida, a corrente de alimentação é tipicamente introduzida no topo da coluna 5 no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.
[000197] Nesta forma de realização mais preferida, uma primeira corrente de rafinato é tipicamente coletada como o produto intermediário do fundo da coluna 7 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. Este produto intermediário é depois purificado na segunda etapa de separação e é tipicamente introduzido no topo da coluna 5 do aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. A primeira corrente de rafinato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente antes de ser purificada na segunda etapa de separação.
[000198] Nesta forma de realização mais preferida, uma primeira corrente de extrato é tipicamente removida do fondo da coluna 2 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. A primeira corrente de extrato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente e uma porção reintroduzida no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. A taxa de reciclo de líquido coletado por intermédio da corrente de extrato na primeira etapa de separação de volta para o aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é a taxa na qual o líquido é bombeado deste recipiente para o topo da coluna 3.
[000199] Nesta forma de realização mais preferida, uma segunda corrente de rafinato é tipicamente removida do fundo da coluna 7 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação.
[000200] Nesta forma de realização mais preferida, uma segunda corrente de extrato é tipicamente coletada do fundo da coluna 2 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. Esta segundo corrente de extrato tipicamente contém o produto de PUFA purificado. A segunda corrente de extrato opcionalmente pode ser coletada em um recipiente e uma porção reintroduzida no topo da coluna 3 do aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação. A taxa de reciclo de líquido coletado por intermédio da corrente de extrato da segunda etapa de separação de volta para o aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação é a taxa na qual o líquido é bombeado deste recipiente para o topo da coluna 3.
[000201] Nesta forma de realização mais preferida, o eluente usado c tipicamente álcool aquoso, preferivelmente metanol aquoso. A razão de águaiálcool é tipicamente de 0,5:99,5 a 6:94 partes em volume.
[000202] Tipicamente, nesta forma de realização mais preferida, a razão de água:solvente orgânico no aparelho cromatográfico usado na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão de água:solvente orgânico no aparelho cromatográfico usado na segunda etapa de separação. Assim, o eluente usado na primeira etapa de separação tipicamente contém mais solvente orgânico do que o eluente usado na segunda etapa de separação.
[000203] A razão de água:solvente orgânico na primeira etapa de separação é tipicamente de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes em volume. A razão de água:solvente orgânico na segunda etapa de separação é tipicamente de 2:98 a 6:94 partes em volume.
[000204] Embora a forma de realização da Figura 9 esteja configurada como mostrado na Figura 10a, as configurações mostradas nas Figuras 10b e 10c também podem ser usadas nesta forma de realização.
[000205] O processo da invenção permite que purezas muito mais altas de produto de PUFA sejam obtidas do que tem sido possivel com as técnicas cromatográficas convencionais. Os produtos de PUFA produzidos pelo processo da invenção também têm perfis de impureza particularmente vantajosos, que são muito diferentes daqueles observados em óleos preparados pelas técnicas conhecidas. A presente invenção, portanto também diz respeito às composições que compreendem um produto de PUFA, por exemplo uma obtenível pelo processo da presente invenção.
[000206] Na prática, o processo da presente invenção no geral será controlado por um computador. A presente invenção, portanto também fornece um programa de computador para controlar um aparelho cromatográfico como aqui definido, o programa de computador contendo meios de codificação que quando executado instrui o aparelho para realizar o processo da invenção.
[000207] Os Exemplos que seguem ilustram a invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1
[000208] Um estoque de alimentação derivado de óleo de peixe (55 % em peso de EPA EE, 5 % em peso de DHA EE) é fracionado usando um sistema de cromatografia de leito móvel real usando gel de sílica C)s ligado (tamanho de partícula 5 pm) como fase estacionária e metanol aquoso como eluente de acordo com o sistema esquematicamente ilustrado na Figura 9. 8 colunas (diâmetro: 4,6 mm, comprimento 250 mm) são conectadas em série como mostrado na Figura 9.
[000209] A mistura de alimentação foi passada através do aparelho SMB em uma primeira etapa de separação. Na primeira etapa de separação, as condições de processo foram ajustadas para purificar EPA de DHA e outras impurezas que se locomovem lentamente. EPA junto com outras impurezas que se locomovem rápido foi coletado na corrente de rafinato como o produto intermediário. A corrente de extrato que contêm DHA e outras impurezas que se locomovem lentamente foi rejeitada.
[000210] As condições de processo do aparelho de SMB foram depois ajustadas para a segunda etapa de separação. Na segunda etapa de separação, as condições de processo foram ajustadas para purificar EPA das impurezas que se locomovem mais rápido. O eluente de metanol aquoso usado na segunda etapa de separação teve uma razão de água:solvente orgânico mais alta do que o eluente de metanol aquoso usado na primeira etapa de separação. O produto intermediário foi introduzido dentro do aparelho SMB como a mistura de alimentação na segunda etapa de separação. EPA de alta pureza foi coletado como a corrente de extrato. A corrente de rafinato que contêm impurezas que se locomovem mais rápido foi rejeitada.
[000211] EPA foi produzido com uma pureza final de ~95 % e recuperação de -95 %.
[000212] Uma análise de HPLC do estoque de alimentação é mostrada como a Figura 11.
[000213] As análises de HPLC das correntes de rafinato (R) e extrato (E) da primeira etapa de separação são mostrados como a Figura 12.
[000214] As análises de HPLC das correntes de rafinato (R) e extrato (E) da segunda etapa de separação são mostrados como a Figura 13. Uma análise de HPLC mais detalhada da corrente de extrato da segunda etapa de separação é mostrada como a Figura 14.
1000215] As Figuras 12 e 13 também mostram as condições de processo para a primeira e segunda etapas de separação.
Exemplo de Referência 1
[000216] Um experimento foi realizado para comparar a quantidade de poluentes ambientais presentes em dois dos produtos de PUFA produzidos por SMB com óleos similares preparados pela destilação. Os perfis de poluente dos óleos são mostrados na Tabela 1 abaixo.
Figure img0001
Os limites de dioxina incluem a soma de dibenzeno-para-dioxinas policloradas (PCDDs) e dibenzofuranos policlorados (PCDFs) e expressados em equivalentes tóxicos da World Health Organisation (WHO) usando fatores de equivalente tóxico (TEFs) da WHO. Isto significa que os resultados analíticos que dizem respeito al7 congêneres de dioxina individuais de interesse toxicológico são expressados em uma única unidade quantificável: concentração de equivalente tóxico TCDD ou TEQ 21 O máximo para a dioxina e Furanos permanece em 2 pg/g
Exemplo de Referência 2
[000217] Um experimento foi realizado para determinar a quantidade de impurezas isoméricas presentes em um óleo preparado por SMB comparada com um óleo equivalente preparado pela destilação,
[000218] Um traço de GC do óleo rico em DHA preparado por SMB é mostrado como a Figura 15. Não existe nenhuma evidência de impurezas isoméricas no traço de GC.
[000219] Um traço de GC do óleo preparado pela destilação é mostrado como a Figura 16. Os quatro picos com tempos de eluição mais longos do que do pico de DHA correspondem aos isômeros de DHA. A partir do traço de GC pode ser observado que o óleo preparado pela destilação contém cerca de 1,5 % em peso de impurezas isoméricas. Exemplo de Referência 3
[000220] Dois produtos ricos em EPA produzidos por SMB foram comparados com óleos ricos em EPA produzidos pela destilação. A análise em % em peso de seus componentes PUFA é mostrada abaixo.
Figure img0002
Exemplo de Referência 4
[000221] Um produto rico em EPA/DHA produzido por SMB foi comparado com um óleo rico em EPA/DHA produzido pela destilação. A análise em % em peso de seus componentes PUFA é mostrada abaixo.
Figure img0003

Claims (14)

1. Processo de separação cromatográfica para recuperar um produto de ácido graxo poli-insaturado (PUFA) a partir de uma mistura de alimentação, processo este que compreende as etapas de: (i) purificar a mistura de alimentação em uma primeira etapa de separação em um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, para se obter um produto intermediário; e (ii) purificar o produto intermediário obtido em (i) em uma segunda etapa de separação usando um aparelho de cromatografia de leito móvel simulado ou real tendo uma pluralidade de colunas de cromatografia ligadas que contêm, como eluente, um solvente orgânico aquoso, para obter o produto de PUFA; em que (a) a primeira e segunda etapas de separação são realizadas sequencialmente no mesmo aparelho de cromatografia, o produto intermediário sendo recuperado entre a primeira e segunda etapas de separação e as condições de processo no aparelho de cromatografia sendo ajustadas entre a primeira e segunda etapas de separação tal que o produto de PUFA seja separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação; ou (b) a primeira e segunda etapas de separação são realizadas nos aparelhos de cromatografia primários e secundários separados respectivamente, o produto intermediário sendo recuperado da primeira etapa de separação e introduzido dentro do segundo aparelho de cromatografia, e o produto de PUFA sendo separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação, e em que o eluente de solvente orgânico aquoso usado em cada etapa de separação tem uma razão por volume de água: solvente orgânico diferente, caracterizado pelo fato de que (1) o produto intermediário é coletado como a corrente de rafinato na primeira etapa de separação e o produto PUFA é coletado como a corrente de extrato na segunda etapa da separação; ou (2) o produto intermediário é coletado como a corrente de extrato na primeira etapa de separação, e o produto PUFA é coletado como a corrente de refinato na segunda etapa de separação.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada aparelho tem uma corrente de extrato e uma corrente de rafinato a partir da qual líquido pode ser coletado da dita pluralidade de colunas de cromatografia ligadas.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o produto intermediário recuperado da primeira etapa de separação é enriquecido no produto de PUFA comparado com a mistura de alimentação.
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o produto de PUFA é separado dos componentes menos polares da mistura de alimentação na primeira etapa de separação, e o produto de PUFA é separado dos componentes mais polares da mistura de alimentação na segunda etapa de separação.
5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o produto de PUFA compreende pelo menos um PUFA ω-3.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o produto de PUFA compreende ácido eicosapentaenóico (EPA) e/ou ácido docosahexaenóico (DHA).
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o eluente é uma mistura de água e um álcool, um éter, um éster, uma cetona ou uma nitrila.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o eluente é uma mistura de água e metanol.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a mistura de alimentação é um óleo de peixe ou estoque de alimentação derivado de óleo de peixe, o produto de PUFA é EPA ou éster etílico de EPA, e o produto de PUFA é produzido em uma pureza maior do que 90 % de pureza, preferivelmente maior do que 95 % de pureza, e mais preferivelmente maior do que 97 % de pureza.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que (a) parte da corrente de extrato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e/ou (b) parte da corrente de rafinato do aparelho usado na primeira etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na primeira etapa de separação; e/ou (c) parte da corrente de extrato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação; e/ou (d) parte da corrente de rafinato do aparelho usado na segunda etapa de separação é reciclada de volta para dentro do aparelho usado na segunda etapa de separação.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a razão por volume de água: solvente orgânico usada em cada etapa de separação é ajustada tal que o produto de PUFA possa ser separado dos componentes diferentes da mistura de alimentação em cada etapa de separação.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 all, caracterizado pelo fato de que a razão por volume de água: solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é mais baixa do que a razão por volume de água: solvente orgânico do eluente na segunda etapa de separação.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a razão por volume de água: solvente orgânico do eluente na primeira etapa de separação é de 0,5:99,5 a 1,5:98,5 partes em volume, e a razão de água: solvente orgânico do eluente na segunda etapa de separação é de 4,5:95:5 a 5,5:94,5 partes em volume.
14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a razão por volume de água:solvente orgânico do eluente na primeira e segunda etapas de separação é controlada pela introdução de água e/ou solvente orgânico dentro de uma ou mais colunas nos aparelhos usados na primeira e segunda etapas de separação.
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