CN103756988B - 一种内切β-1,4-木聚糖酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体提供了一种来源于雪白曲霉的新型内切β-1,4-木聚糖酶，并通过将该内切β-1,4-木聚糖酶基因导入黑曲霉中，构建了重组表达该基因的黑曲霉工程菌。所述黑曲霉工程菌能高效表达内切β-1,4-木聚糖酶，摇瓶发酵酶活达1100U/mL。重组内切β-1,4-木聚糖酶的最适作用pH为5.5，最适作用温度为60℃，可作为饲料添加剂，提高肉鸡的采食量和增重量，提高饲料的能量利用率和蛋白质利用率，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。

Description

一种内切β-1,4-木聚糖酶
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种内切β-1,4-木聚糖酶及其应用。
背景技术
植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素等物质组成。这些物质是自然界中主要的可再生资源，被广泛应用于造纸、食品、医药等行业。在当今世界能源日益短缺的情况下，这些资源越来越受到重视。木聚糖是植物半纤维素的重要组分,主要存在于植物的细胞壁中，约占细胞干重的35％，是自然界中仅次于纤维素之后含量第二丰富的多糖。木聚糖多为异聚多糖，主链由β-1,4-糖苷键相连的β-D-吡喃型木糖残基聚合而成，而在其主链和侧链上均具有多种取代基团。它的降解需要多个酶的参与。
木聚糖酶(xylanase)是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，主要包括外切β-1,4-木聚糖酶和内切β-1,4-木聚糖酶，是木聚糖降解的主要作用酶，
现在，木聚糖酶已被用于纸浆制造、生物漂白、禽畜饲料品质改进等生产实践上。木聚糖酶可将饲料的非淀粉多糖分解成较小聚合度的低聚木糖，从而改善饲料性能，消除或降低非淀粉多糖在动物肠胃中因粘度较大而引起的抗营养作用，同时它还可以破坏植物细胞壁的结构，提高内源性消化酶的活性，提高饲料养分的利用。另外，木聚糖酶在造纸、食品和纺织等行业中的应用也较为广泛。木聚糖酶应用pH范围3.5-6.0，适宜温度范围40-60度，并能耐受高温制粒的温度及时间。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型的内切β-1,4-木聚糖酶及其应用。本发明通过构建黑曲霉工程菌，能高效重组表达内切β-1,4-木聚糖酶，广泛应用于饲料领域，从而弥补现有技术的不足。
本发明一方面提供了一种来源于雪白曲霉(Aspergillusniveus)的内切β-1,4-木聚糖酶，包括：
a)氨基酸序列为SEQIDNO:1的酶；
b)与SEQIDNO:1序列相似性高于90％，且具有内切β-1,4-木聚糖酶活性的酶。
所述内切β-1,4-木聚糖酶的一种编码核苷酸序列为SEQIDNO:2。
本发明的另一方面涉及上述内切β-1,4-木聚糖酶在饲料中的应用。
本发明提供了一种来源于雪白曲霉的新型内切β-1,4-木聚糖酶，并通过将该内切β-1,4-木聚糖酶基因导入黑曲霉中，构建了重组表达该基因的黑曲霉工程菌。所述黑曲霉工程菌能高效表达内切β-1,4-木聚糖酶，摇瓶发酵酶活达1100U/mL。重组内切β-1,4-木聚糖酶的最适作用pH为5.5，最适作用温度为60℃，可作为饲料添加剂，提高肉鸡的采食量和增重量，提高饲料的能量利用率和蛋白质利用率，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。
附图说明
图1为黑曲霉XYN发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中泳道1为对照组，泳道2为黑曲霉XYN发酵上清液，箭头所指处为重组表达的内切β-1,4-木聚糖酶。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,3ndEd.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY,3ndEd.(Singletonetal.,2006)和COLLINSDICTIONARYBIOLOGY(Haleetal.,2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
实施例1内切β-1,4-木聚糖酶基因的克隆
以雪白曲霉(Aspergillusniveus)基因组cDNA为模板，利用上下游引物进行扩增，扩增条件为：94℃预变性4min，94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环后，72℃延伸10min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳分析显示，产物大小为942bp。
将扩增产物克隆至pMD18-T载体，送至北京华大基因测序中心进行测序，测得扩增产物的核苷酸序列为SEQIDNO:2，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1。通过NCBI同源序列比对，确定扩增的基因是一个新的内切β-1,4-木聚糖酶基因。
实施例2重组表达载体的构建
将实施例1得到的PCR产物先进行XbaI单酶切。同样，对黑曲霉表达质粒pGAMD也进行XbaI单酶切。利用PCR纯化试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶把酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5α；然后通过PCR验证连接正确与否，最后将相应的阳性克隆表达质粒命名为pVL-XYN。
实施例3转化与验证
接种黑曲霉菌丝于PDA平板上生长4天；切取直径约3cm的菌落置于约100mLCMA(2％麦芽提取物、2％葡萄糖，0.1％细菌蛋白胨)的液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20mL裂解酶液(SigmaL1412)酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.8MMgSO4溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000rpm，离心10min；弃上清，加10mL1.2M山梨醇悬浮，然后3000rpm，离心10min；加适量山梨醇悬浮分装(200μL/管，108个/mL)。
取10μgpVL-XYNDNA加入到200μL原生质体中，接着加入50μL25％PEG轻轻混匀，室温静置20min；然后加2mL25％PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50mL左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基(0.059％乙酰胺，0.152％KH2PO4，0.34％CsCl，0.052％KCl，1％葡萄糖,21.85％山梨醇,0.35％琼脂糖)，轻轻混匀后倒入下层基础培养基平板(0.059％乙酰胺,0.152％KH2PO4，0.34％CsCl，0.052％KCl，1％葡萄糖，1％琼脂粉)，30℃黑暗培养数天至转化子长出。,验证阳性转化子。将获得的一个阳性转化子命名为黑曲霉XYN(AspergillusnigerXYN)。
实施例4发酵与酶活测定
将构建得到的上述黑曲霉工程菌XYN接种于50mL发酵培养基(1.2％NaNO3，0.05％KCl，0.15％KH2PO4，0.205％MgSO4·7H2O，0.35％NaH2PO4·H2O，7％柠檬酸钠，4.5％胰蛋白大豆肉汤，微量元素1mL，4.1％葡萄糖)，30℃培养4-5天，离心取上清，进行SDS-PAGE检测分析。结果如图1所示，在33kDa处有一明显的蛋白条带，即为重组表达的内切β-1,4-木聚糖酶，重组蛋白大小与预测的一致。
木聚糖酶酶活测定方法如下所述：
酶活力检测方法：
取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5mlDNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。
酶活单位定义：
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
酶活计算公式：
X D = [ ( A E - A B ) × K + C 0 ] M × t × N × 1000
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
按照上述测定方法测定发酵液上清的酶活为1100U/mL，说明本发明构建的黑曲霉工程菌能高效重组表达内切β-1,4-木聚糖酶。
1)最适pH分析
用pH值分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液进行稀释测定，在温度55℃条件下测定酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组内切β-1,4-木聚糖酶的最适pH值为5.5。
2)最适温度分析
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃，pH5.5的条件下测定酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：本发明的重组内切β-1,4-木聚糖酶的最适温度为60℃。
实施例5内切β-1,4-木聚糖酶在饲料中的应用实验
试验采用单因子设计，日粮采用玉米-小麦-麦麸型日粮进行代谢试验，选用200只21日龄体重接近、体况健康的罗斯肉公鸡，随机分成2个处理组，每个处理10个重复，每个重复10只鸡。一个处理组在日粮中按100U/kg添加本发明的内切β-1,4-木聚糖酶；另一个处理组为对照组,不添加内切β-1,4-木聚糖酶.
试验分为预饲期3天(22～24日龄)和正试期4天(25～28日龄)两个阶段，正试期间进行全收粪采样，记录每日耗料量，预试期、正试期前后分别对试验动物称重，正试期收集的粪样在85℃条件下，进行24小时烘干。
分别测定饲粮和粪样的能量、粗蛋白、粗脂肪和干物质的含量:
1、能值测定采用氧弹式测热法；
2、蛋白质测定用凯氏定氮法；粗脂肪测定用索氏抽提法；干物质测定采用100-105℃烘箱干燥法。
3、酶表观代谢能值(AEV):AEV表示每一个活性单位的木聚糖酶提供的AME值计算公式为:AEV＝加酶后原料AME增加值/添加的内切β-1,4-木聚糖酶活性单位。
试验结果如下表所示：
与对照组相比，试验组只采食量、只增重分别提高7.1％、11.5％；粪样中能量含量、蛋白含量比对照组分别降低了0.6％、4％，表观能量利用率提高了4.1％，蛋白质表观利用率提高了4.6％。说明通过在日粮中添加本发明的内切β-1,4-木聚糖酶，能提高肉鸡的采食量和增重量，提高饲料的能量利用率和蛋白质利用率，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。
SEQUENCELISTING
<110>青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120>一种内切β-1,4-木聚糖酶
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>280
<212>PRT
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840
g
841

Claims (4)

1.一种内切β-1,4-木聚糖酶，其特征在于，所述内切β-1,4-木聚糖酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.编码权利要求1所述内切β-1,4-木聚糖酶的基因。
3.如权利要求2所述基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:2。
4.权利要求1所述内切β-1,4-木聚糖酶在饲料领域中的应用。
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