CN103743808A

CN103743808A - 人乳腺癌细胞乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法

Info

Publication number: CN103743808A
Application number: CN201410022161.0A
Authority: CN
Inventors: 王广基; 汤志远; 郝海平; 吴梦秋; 李盈淳
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2014-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2014-04-23

Abstract

本发明属于分析领域，涉及乳腺癌细胞内源性生物大分子乙酰化p53蛋白同位素定量分析，利用免疫共沉淀，凝胶电泳等技术手段对细胞复杂基质样品中乙酰化p53蛋白进行提取分离纯化。步骤如下：利用重组人p53蛋白、乳腺癌细胞内p53蛋白经胰蛋白酶水解产生的特异性肽段进行定性定量的策略，以特异性肽段序列内氨基酸进行稳定碳13、氮15同位素标记的合成肽段为内标，实现了对乳腺癌细胞样品中DNA结合区特异性位点乙酰化p53蛋白的定量。本发明主要包括样品提取及凝胶电泳方法、Obitrap测定方法、标准曲线的制备和精密度测定。本发明方法线性关系良好、准确度高、重现性好，可用于乙酰化p53蛋白在细胞内的定量。

Description

人乳腺癌细胞乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法

技术领域

本发明涉及一种利用同位素标记结合轨道阱(obitrap)质谱技术对人乳腺癌细胞内DNA结合区的功能性位点乙酰化p53蛋白的定量方法。

背景技术

乳腺癌已经成为全球范围女性最常见的癌症，p53基因是迄今为止已发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，与乳腺癌肿瘤生长、调亡及耐药关系密切。乳腺癌细胞受到化疗药物刺激之后，p53蛋白表达上调，启动下游一系列细胞凋亡程序，从而杀死肿瘤细胞，p53蛋白表达量增加，可明显抑制肿瘤血管生成，抑制肿瘤转移。DNA损伤过程中p53经历复杂的翻译后修饰作用，包括磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等，其中乙酰化是p53蛋白活化并产生功能的必要条件，DNA结合区位点的乙酰化与肿瘤细胞凋亡密切相关。现有的p53蛋白定量方法主要是Western Blot方法，这种方法只能达到相对定量的目的，并且无法对一些特定乙酰化位点进行定量。相对于Western Blot方法，同位素质谱定量技术具有更好的选择性和精密度。建立人乳腺癌细胞内DNA结合区位点乙酰化p53的细胞样品同位素定量方法对于观察肿瘤细胞状态，研究化疗药物药效具有重要的意义，对改善临床给药方案，减低抗肿瘤药物毒性反应和肿瘤复发是十分必要的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，建立人乳腺癌细胞DNA结合区的功能性位点乙酰化p53蛋白的提取方法并建立其质谱定性定量方法。

本发明采取的技术方案是，首先利用免疫共沉淀技术，经抗体吸附纯化后用SDS-PAGE分离，硝酸银染色。经胰蛋白酶胶内消化后轨道离子阱质谱(Orbitrap)检测内源性p53蛋白的特异性乙酰化肽段，选择的乙酰化特异性肽段是该的蛋白胰酶水解后独有的。基于轨道离子阱质谱(Orbitrap)，利用多种模式对特异性肽段进行分析，建立可靠，稳定质谱定量方法。合成与特异性乙酰化肽段序列相同并用稳定同位素C13、N15标记该肽段的氨基酸作为内标，进行定量分析建立标准曲线，从而实现特异性肽段的定量，进而对蛋白的表达量进行分析。

本发明的具体技术方案如下所述。

人乳腺癌细胞内源性乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法，包括细胞样品的提取方法和质谱定量方法，具体步骤如下：

A、细胞样品提取方法：

(1)样品总蛋白的制备：收集细胞蛋白，加入NP40温和裂解液100μL(已加蛋白酶抑制剂)，冰上超声破碎，16000g4度离心30分钟，取上清，并测定蛋白浓度。

(2)免疫共沉淀提取过程：

洗磁珠：将50μL磁珠加入到1ml的PBS中，14000g，4℃离心1min，重复2次，弃上清。磁珠加入到蛋白质中，4℃摇床1h。14000g，4℃离心1min，弃底，移上清至新的EP管中，加抗体(1-2μg/200μg细胞总蛋白)及IgG，4℃摇床过夜。

次日，洗磁珠2次。14000g，4℃离心1min。向磁珠中加入抗体蛋白混合液，4℃摇床3h。14000g，4℃离心1min。弃上清，留底(磁珠)。洗磁珠3次(第一，第二次用PBS，第三次用lysis)，瞬时离心。向磁珠中加入2X bμffer(25～30μL)，沸水煮5min，12000rpm，离心5min，电泳。

银染过程：固定：配制固定液，固定1～3h，摇床，室温。敏化：固定结束后换用敏化液，敏化30min。水洗：倒出敏化液，以ddH2O洗5min×3次。染色：银染20min。水洗：倒出银染液后，以ddH2O洗1.5min×1次。显色：加入显色液后仔细观察凝胶显色情况，直至蛋白质点完全显现为止，一般约需要5～10min左右。终止：倒出显色液后，立即加入终止液，终止显色10min。保存：终止后以ddH2O洗10min×2次，换成10％乙醇溶液保存使用。

打开通风橱，用水和酒精小心仔细擦拭超净台；用ddH2O洗胶3次，每次超声5min(胶污染较多时，可用10％乙醇代替ddH2O)；3000rpm，1min离心，弃液，用ACN脱色5min，银染胶为灰白色有弹性为止；3000rpm，1min离心，弃液，加入10mM DTT50μL，56℃水浴1h；3000rpm，1min离心，弃液，加入55mM IAA50μL，暗处避光，45min；3000rpm，1min离心，弃液，依次加入25mMNH4HCO3，50％ACN，100％ACN，逐级脱水；

(3)蛋白样品的胰蛋白酶消化：加酶(10ng/μL)，一个胶粒对应2～3μL，每多一个胶粒，多加1μL的酶，4℃或冰上静止30min，小心吸出多余酶液。加入8.5μLNH4HCO3作为覆盖液，放入37℃水浴，过夜。加入2％TFA终止反应，至终浓度为0.1％。

(4)低温冻干，复溶，样品肽段除盐后进样。

B、LTQ Orbitrap Velos质谱仪条件为：

反相分离肽段所用的A相跟B相体系是：A相(含0.1％的甲酸的乙腈)，B相(含0.1％的甲酸的水)。肽段分析：运用LTQ Orbitrap Velos质谱仪与纳升液相色谱柱串联来完成的。质谱扫描后获得分析谱图的质核比范围是350-1800，从一级扫描图谱中选取20个强度最高的离子进行HCD模式碎裂获得二级谱图(用Xcalibur质谱软件进行实时监测)，动态质谱窗口间隔是60秒。Orbitrap Velos检测得到的RAW文件用MaxQuant(v1.2.2.5)检索，根据标准工作流程检索鉴定到的谱图，峰值列表检索对照UniProtKB人类蛋白质组序列数据库，接着计算乙酰化p53蛋白量。

表1肽段监测值

C、定量标准曲线的制备：

(1)将重组人GST-p53(500μg／mL)分别稀释至1，2，5，10，25，50，100ng／mL。

(2)将含上述不同浓度蛋白样品加入H1299细胞基质(p53蛋白不表达)中，经由A步骤处理，加入2μL的稳定同位素标记内标，高速离心后进行LTQ OrbitrapVelos分析，进样量为10μL。以蛋白浓度为横坐标，特异性肽段响应和标记内标响应的面积比为纵坐标，用加权W=1／x最小二乘法进行回归运算，所求得的即为p53蛋白的标准曲线。回归方程为：y=0.0136x+0.3873(R²=0.996)，定量范围1-100ng/ml。

(3)LTQ Orbitrap Velos质谱仪所测得到不同浓度p53蛋白响应值，将乙酰化p53蛋白响应用上述标准曲线进行对比，计算出乙酰化p53蛋白量。

本发明的人乳腺癌细胞乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法中，固定液是10％冰乙酸，40％乙醇，50％去离子水；敏化液每100mi液量：25ml无水乙醇，0.3g无水硫代硫酸钠，6.8g无水醋酸钠，ddH₂O溶解后，定容至100ml；染色液是硝酸银0.27g，加入ddH₂O溶解，最后定容至100ml，临用前加入37％甲醛40μL；显色液是2.5g无水碳酸钠加ddH₂O，溶解后定容至100ml，临用前加入37％甲醛30μL；终止液是0.41g甘氨酸，加ddH₂O至100ml。所述的酶解终止液，是2％TFA；所述的内标溶液，是2μg／mL的合成肽段内标水溶液。

本发明的乳腺癌细胞乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法中，所述的Obitrap对乙酰化p53蛋白定量色谱条件中的梯度洗脱，程序见表2

表2LTQ Orbitrap Velos质谱仪液相梯度洗脱程序

其中A是含体积百分数0.1％甲酸的乙腈，B是0.1％甲酸的水。

本发明的人乳腺癌细胞乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法中准确度与精密度验证，配制三个浓度质量控制样品(1，50，and100ng／mL)，考证方法学批内和批间精密度。批内精密度三个浓度质控样品各5个一批测定，批间精密度三个浓度质控样品各5个分三批测定。计算质控样品准确度，考证方法学。具体见表3。

表3乳腺癌细胞内源性p53蛋白及乙酰化p53蛋白质谱定性定量方法质量控制样品准确度

附图说明

图1：人乳腺癌细胞内源性乙酰化p53蛋白同位素定量方法中的色谱图，其中A峰为人内源性p53蛋白特异性肽段ALPNNTSSSPQPK。

图2：人乳腺癌细胞内源性乙酰化p53蛋白同位素定量方法中的色谱图，其中A峰为乙酰化p53特异性肽段AMAIYK(Ac)QSQHMTEVVR，B峰为乙酰化p53同位素标记内标肽段AMAIYK(Ac)QSQHMTEVV[13C，15N]R。

具体实施方式

实施例1：测定化疗药物阿霉素给药后不同时间的人乳腺癌细胞中乙酰化p53蛋白量

主要步骤如下：

取对数生长期的人乳腺癌细胞MCF-7敏感细胞，用0.1％胰酶消化细胞，离心后用完全培养基重悬细胞，血细胞计数板计数，以1×10⁴个／孔接种于6孔培养板中。24h后，待细胞基本贴壁后更换培养基，每孔加入含阿霉素无血清培养基200μl，给药浓度为10μM。每种细胞同时设置溶剂对照给药组(0.1％DMSO)，各组均为3个复孔。给药后细胞培养板置于培养箱中于37℃，含5％CO₂，相对湿度90％的环境中培养。给药0.5h，1h，2h，4h，8h，12h，24h后分别收集细胞，按上述步骤进行样品提取及检测，得到人乳腺癌细胞内源性p53蛋白及乙酰化p53蛋白的量，结果如下：

表4阿霉素给药不同时间人乳腺癌细胞中乙酰化p53蛋白表达量及总p53量

Claims

人乳腺癌细胞内源性乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法，包括样品的提取方法和质谱定量方法，具体步骤如下：

1.生物样品提取方法：

提取制备样品总蛋白；利用免疫共沉淀进行提取，其中抗体浓度为1-2μg／200μg细胞总蛋白；蛋白样品的胰蛋白酶消化；加酶(10ng／uL)，一个胶粒对应2到3uL，每多出一个胶粒，多加至少1uL的酶，4℃或冰上静止放置30min，小心地吸出多余酶液。并加入8.5uL NH₄HCO3作为覆盖液，再放入37℃水浴，保持温度过夜；次日再加入2％TFA终止反应，至终浓度达到0.1％。低温冻干，0.1％甲酸复溶样品，肽段经过除盐后进样。
2.LTQ Orbitrap Velos质谱仪条件为：

反相分离肽段所用的A相跟B相体系是：A相(含0.1％的甲酸的乙腈)，B相(含0.1％的甲酸的水)。肽段分析：运用LTQ Orbitrap Velos质谱仪与纳升液相色谱柱串联来完成的。质谱扫描后获得分析谱图的质核比范围是350-1800，从一级扫描图谱中选取20个强度最高的离子进行HCD模式碎裂获得二级谱图(用Xcalibur质谱软件进行实时监测)，动态质谱窗口间隔是60秒。Orbitrap Velos检测得到的RAW文件用MaxQuant(v1.2.2.5)检索，根据标准工作流程检索鉴定到的谱图，峰值列表检索对照UniProtKB人类蛋白质组序列数据库，接着计算乙酰化p53蛋白量。

特异性乙酰化肽段监测设定值，Q1：967.5，Q3：1086.5；内标肽段多重反应监测设定值，Q1：970.5，Q3：1092.5。
3.根据权利要求1、2所述的人乳腺癌细胞内源性乙酰化p53蛋白同位素标记定量方法，其特征在于所述的定量内标肽段为稳定同位素碳13、氮15标记的特征乙酰化肽段，内标溶液浓度为2μg/mL。标准曲线利用H1299细胞基质(p53蛋白不表达)作为空白基质。