KR20120076051A - 타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량 방법 - Google Patents

타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량 방법을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 타액 중의 스테로이드 호르몬 테스토스테론, 안드로스텐디온, 코르티졸, 코르티존, 알도스테론 및/또는 프로게스테론을 LC/ESI-MS/MS로 정량할 수 있는 방법을 개시한다. 본 발명의 방법은 고감도이면서 특이성이 높을 뿐만 아니라 재현성과 반복성도 우수하다.

Description

타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량 방법{QUANTITATIVE ANALYTIC METHOD FOR STEROID HORMONES IN SALIVA}
본 발명은 타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량 방법에 관한 것이다.
최근 기초 및 임상분야에서 인체 타액(saliva)이 신체의 다양한 기관의 기능에 대한 중요한 정보를 제공하는 매트릭스로 주목을 받고 있다(Chiappin, S., Antonelli, G., Gatti, R. De Palo, E. F. Clin. Chim. Acta 383, 30-40(2007)). 타액은 기존의 혈액 채취에 비해 스트레스가 없고 간편할 뿐만 아니라, 비침습적이며 의사 처방 없이도 가정에서 쉽게 채취가 가능하다.
특히 인체 타액 성분 중 일부 호르몬들은 혈청(serum)이나 혈장(plasma)내에 존재하는 단백질과 결합하지 않은 자유 호르몬(free hormones)에 대한 매우 좋은 지표가 되는 것으로 알려지고 있다 (Vining, R. F. and McGinley, R. A. J. Steroid Biochem . 27, 81-94(1987); Vining, R. F., McGinley, R. A. and Symons, R. G. Clin . Chem . 29, 1752-1756(1983); Jonsson, B. A. G., Malmberg, B., milon, A., Garde, A. H.and rbaek, P. J. Chromatogr. B 784, 63-68(2003); Umeda, T., Hiramatsu, R., Iwaoka, T., Shimada, T.,Miura, F. and Sato, T. Clin. Chim . Acta 110, 245-253 (1981); Perogamvros, I., Owen, L. J., Newell-Price, J., Ray, D. W., Trainer, P. J. and Keevil, B. G. J. Chromatogr . B 877, 3771-3775(2009); Restituto, P., Galofr, J. C., Gil, M. J., Mugueta, C., Santos, S. Monreal, J. I. and Varo. N. Clin . Biochem . 41, 688-692 (2008)).
이러한 특징들 때문에 호르몬 분석을 통해서 얻어지는 인체 타액 성분내 스테로이드는 질병에 대한 바이오 마커로서의 응용 가능성이 점차 커지고 있는 실정이다. 또한, 타액내 스테로이드 호르몬들은 혈청이나 혈장에 존재하는 스테로이드보다 검출 농도가 10배 정도 낮기 때문에 고감도이면서 매우 특이적인 분석방법의 개발이 중요한 이슈가 되고 있다.
현재 임상연구소나 병원 등에서 스테로이드 routine 분석에 이용되는 대부분의 방법이 immunoassay에 근거하고 있다. 그러나 이 방법은 구조적으로 유사한 내재성 스테로이드들에 의한 간섭 때문에 실제 측정하고자 하는 특정 스테로이드가 종종 과측정되는 문제점이 있다(Marks, V. Clin . Chem . 48, 2008-2016(2002)).
본 발명의 목적은 특이성과 감도가 높은 타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.
본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 타액 중의 스테로이드 호르몬인 테스토스테론(testosterone), 안드로스텐디온(androstenedione), 코르티졸(cortisol), 코르티존(cortisone), 알도스테론(aldosterone) 및/또는 프로게스테론(progesterone)을 정량하기 위하여, 고체상 추출법(Solid-Phase Extraction (SPE))으로 시료를 추출하고, 그 추출된 시료를 액체크로마토그래피/전기분무이온화-탠덤질량분석기(이하 "LC/ESI-MS/MS)로 분석하였으며, 수차례의 예비 실험과 반복 실험을 통하여 특이성과 감도가 높은 최적의 분석 조건을 찾고자 하였다.
구체적으로 본 발명자들은 고체상 추출법을 적용하여 시료를 추출할 때, 세척 용매와 용출 용매가 회수율에 미치는 영향을 탐색하였고, 다음으로는 액체크로마토그래피(이하 "LC")의 최적 조건을 고성능액체크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, 이하 "HPLC")를 이용하여 탐색하였으며, 분석하고자 하는 각 스테로이드 호르몬의 표준용액을 질량분석기에 주입하여 스캔 모두(scan mode)에서 각 스테로이드 호르몬에 적합한 MS/MS 조건을 확립하였다.
이렇게 확립한 조건을 이용한 타액 중 스테로이드 호르몬을 정량하였을 때, 평균 회수율이 79.06% ~ 106.72%의 값을 나타내고, 또 상관계수(correlation coefficient, r 2 )가 0.99985~0.99999의 범위로 뛰어난 직선성을 나타내었다. 또한 일내 정확성 및 정밀성, 그리고 온도에 따른 안정성, 냉?해동에 따른 안정성 등을 평가하였는데, 모두 국제적으로 승인((U.S. Department of Health and Human Services, F.D.A., Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, 2001))된 범주 내의 결과로 나타났다.
이러한 분석 조건의 평과 결과는 본 발명의 정량 분석법이 고감도이면서 특이성이 높고 재현성과 반복성이 높으며, 정량값의 신뢰도가 높음을 의미하는 것이라 할 수 있다.
본 발명의 타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법은 전술한 바를 고려할 때, 고체상 추출법에 따른 시료 추출의 최적 조건, 액체크로마토그래피의 최적 조건, 및/또는 ESI-MS/MS 최적 조건을 이용함에 특징이 있다고 할 수 있다.
구체적으로는 본 발명의 타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법은 (a) 타액 시료를 수득하는 단계, (b) 그 타액 시료를 활성화시킨 고체상 카트리지에 적용하여 메탄올과 물의 혼합 용매로 세척한 후 메탄올로 용출시켜 추출하는 단계, (c) 상기 추출된 시료를 LC/ESI-MS/MS로 분석하는 단계, 및 (d) 분석된 값으로부터 검량선을 이용하여 정량값을 산출하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 "타액 중의 스테로이드 호르몬"은 테스토스테론, 안드로스텐디온, 코르티졸, 코르티존, 알도스테론 및 프로게스테론로 구성된 6종의 호르몬 중에서 선택된 하나 이상을 의미한다. 그러므로 본 발명의 타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법은 상기 6종의 호르몬 모두를 동시에 정량하거나 그 일부 종(2종 내지 5종)의 호르몬을 동시에 정량하는 데 이용될 수 있으며, 경우에 따라서는 상기 6종의 호르몬 중 각 1종의 호르몬만을 정량하는 데 이용될 수도 있다. 본 발명의 아래의 실시예는, 각 스테로이드 호르몬의 표준시료(Calibration Standard, 타액을 활성탄으로 전처리하여 제조한 스테로이드 제거 타액(steroid-free saliva)으로 표준용액을 희석하여 제조한 용액)와 분석시료인 타액 시료를 본 발명의 확립한 조건에 따라 추출하고 LC/ESI-MS/MS로 분석하였을 때 그것의 크로마토그램 등에서 확인되듯이 상기 6종의 호르몬의 동시 분리 및 정량이 가능함을 보여준다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 타액 시료는 건강한 개체(사람임, 이하 같음), 질병을 가진 개체, 질병의 이환 여부의 진단이 필요한 개체 등 임의의 개체로부터 얻어질 수 있다.
예컨대 코르티졸의 경우 정상군에서보다 환자군에서 타액 속에서의 농도가 높은 값을 보이는 쿠싱증후군의 마커로 알려져 있고(Starkman, M. N., Gebarski, S. S., Berent, S. and Schteingart, D. E. Biol . Psychiatry 32, 756-765(1992); Raff, H., Raff, J. L. and Findling, J. W. J. Clin. Endocrinol . Metab . 83(8), 2681-2686(1998)), 이 경우 타액 시료는 쿠싱증후군의 진단 목적, 쿠싱증후군의 중증 정도?치료 경과 등의 평가 목적으로 쿠싱증후군을 가진 개체나 쿠싱증후군 이환 여부의 진단이 필요한 개체로부터 얻어질 수 있다.
또 프로게스테론의 경우 정상군에서보다 유방암 환자들에서 타액 내의 농도가 높은 것으로 보고되고 있고(Wang, D. Y., Fantl, V. E., Habibollahi, F., Clark, G. M., Fentiman, I. S., Hayward, J. L. and Bulbrook, R. D. Eur. J. Cancer Clin . Ongol. 22(4), 427-433(1986)), 임신중독증 환자의 경우는 정상인에 비해 타액 프로게스테론 농도가 낮은 것으로 보고되고 있기 때문에 (Iou, S. G., Salari, S., Eskandari, M., Nanbakhsh, F. and Dabiri, A. Iran J. Med . Sci . 30(4): 186-189(2005)), 타액 내 프로게스테론의 농도는 이들 질환의 진단 목적이나 질병 진행 정도의 평가 목적 등으로 사용될 수 있다. 그러므로 이 경우 타액 시료는 유방암 또는 임신중독증의 진단 목적, 유방암 또는 임신중독증의 중증 정도?치료 경과 등의 평가 목적으로 유방암 또는 임신중독증을 가진 개체나 유방암 또는 임신중독증 이환 여부의 진단이 필요한 개체로부터 얻어질 수 있다.
또 테스토스테론의 경우는 후천성성선저하증 환자군이 정상군에서보다 타액 내 테스토스테론의 농도가 낮은 것으로 보고되고 있으므로(Yasuda, M., Honma, S., Furuya, K., Yoshii, T., Kamiyama, Y., Ide, H., Muto, S. and Horie, S. J. Men's Health 5(1), 56-63(2008); Shibayama, Y., Higashi, T., Shimada, K., Odani, A., Mizokami, A., Konaka, H., Koh, E. and Namiki, M. J. Chromatogr . B Analyt. Technol . Biomed . Life Sci . 877(25), 2615-23 (2009)), 이 경우 타액 시료는 후천성성선저하증을 가진 개체나 후천성성선저하증 이환 여부의 진단이 필요한 개체로부터 얻어질 수 있으며, 또 안드로스텐디온의 경우는, 선천성부신과다형성증 환자군에서 타액 내 안드로스텐디온의 농도가 정상군에 비해 높은 것으로 보고되고 있기 때문에(Otten, B. J., Wellen, J. J., Rijken, J. C., Stoelinga, G. B. and Benraad, T. J. J Clin Endocrinol Metab . 57(6), 1150-1154 (1983); Wood, P. Ann . Chim . Biochem . 46, 183-196(2009)), 이 경우 선천성부신과다형성증을 가진 개체나 선천성부신과다형성증 이환 여부의 진단이 필요한 개체로 얻어질 수 있다. 또 타액 알도스테론의 경우는, 고혈압 원인 중에 하나인 일차성 알도스테론증(콘 증후군)의 생체지표가 되는 것으로 알려져 있는데 (Manolopoulou, J., Gerum, S., Mulatero, P., Rossignol, P., Plouin, P. F., Reincke, M., Bidlingmaier, M. Horm . Metab . Res . 42(6), 400-405(2010)), 이 경우는 타액 시료가 일차성 알도스테론증을 가진 개체나 일차성 알도스테론증 이환 여부의 진단이 필요한 개체로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 고체상 카트리지를 이용한 고체상 추출법을 적용하여 이루어지는 데, 고체상 추출법의 적용시, 본 발명자들은 정량하고자 하는 타액내 스테로이드 호르몬의 극성을 고려하여, 수용성 시료로부터 다양한 물질들의 추출용으로 개발된 Supelco 사(USA)의 소수성의 스티렌(styrene) 폴리머에 친수성 물질이 결합된 HLB(hydrophilic-Lipophilic Balance) 타입의 SUPEL-SELECT HLB SPE 30 mg/1 ml SPE TUBE(catalog #: 54181-U)를 선택?사용하였으며, 이 카트리지를 활성화 용매로 활성화시킨 후, 예비실험을 통하여 회수율이 가장 높은 세척 용매와 용출 용매를 확인하였는데, 50% 메탄올(%는 v/v임)을 세척 용매로 사용하고 100%메탄올을 용출 용매로 사용할 때 가장 높은 회수율을 얻을 수 있었다. 구체적으로 상기 세척 용매와 용출 용매를 사용할 때 평균 회수율이 79.06% ~ 106.72%의 값을 나타내어 향후 임상 검체를 분석할 때 신뢰성 있는 결과를 제공할 것으로 사료된다. 참고로 본 발명자들이 예비실험을 통하여 세척 용매로 30% 메탄올, 80% 메탄올 등을 사용하고, 용출 용매로 에틸아세테이트(ethylacetate), 아세토니트릴(acetonitrile), 헥산(hexane) 등을 사용하였을 때, 각 호르몬들의 회수율이 30-60% 범위로서 상기 회수율보다는 전반적으로 낮은 값을 보였다.
그러므로 상기 (b) 단계는 HLB 타입의 레진으로 충진된 고체상 카트리지를 사용하고 세척 용매로는 50% 메탄올을 사용하고 100% 메탄올을 용출 용매로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 HLB 타입의 레진이 충진된 고체상 카트리지는 바람직하게는 아래의 실시예에서 사용된 Supelco 사(USA)의 SUPEL-SELECT HLB SPE 30 mg / 1 ml SPE TUBE를 사용하는 것이 바람직하며, HLB 타입의 레진이 충진된 임의의 카트리지가 또한 사용되어도 무방하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계를 통하여 추출된 시료는 곧바로 LC/ESI-MS/MS에 주입할 수 있으나, 감도와 특이성을 높이기 위해서 상기 (b) 단계를 통하여 추출된 시료는 용출 용매 제거 후 메탄올과 물의 혼합 용매 바람직하게는 80% 메탄올에 재용해시켜 LC/ESI-MS/MS에 주입하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 상기 (c) 단계의 수행을 위한 LC-ESI-MS/MS의 분석 조건은 LC 조건과 ESI-MS/MS 조건으로 구분하여 볼 수 있는데, 본 발명자들은 먼저 최적의 LC 조건을 확립하기 위하여 고정상으로 C18, C8, phenyl 컬럼, HILIC 컬럼 등을 사용하고 이동상으로 메탄올, 물, 아세토니트릴 등을 사용한 HPLC로 예비실험을 실시하였다. 그 결과 고정상으로 그 결과 고정상으로 C18을 사용하고, 이동상으로 메탄올과 물의 혼합용액을 사용하였을 때 물질의 분리 효율이 가장 우수하였다.
본 발명의 LC 조건은 이러한 예비실험을 통하여 확립된 것으로서, 구체적으로 C18 실리카 레진으로 충진된 칼럼, 바람직하게는 입도(particle size)가 3㎛인 C18 실리카 레진으로 충진된 2.0mm×50mm인 칼럼, 더 바람직하게는 아래의 실시예에서 사용된 Sheseido Capcellpak MG-II C18 (particle size, 3; 2.0 mm x 50 mm; Sheseido, Tokyo, Japan)를 사용하고, 이동상으로서 0.1% 포름산 함유 물(A)과, 0.1% 포름산 함유 메탄올(B)의 농도 구배가 형성된 것을 사용하며, 유속은 0.2㎖/min으로 일정하게 유지시키는 경우이다. 상기 농도 구배 조건은 본 발명의 A : B = 80 : 20 (v/v)에서 4.5분까지 B가 35% 되도록 한 다음, 6.5분까지 B가 100%가 되도록 한 다음, 9.0분까지 유지시킨 후, 10분까지 B가 최초 조건으로 회귀하여 20분까지 유지하는 경우이다. 확립된 농도 구배 조건은 아래의 [표 1]에 정리되어 있다.
본 발명자들은 나아가 ESI-MS/MS의 최적의 분석 조건을 확립하였는데, 이를 위해서 먼저 각 스테로이드의 표준물질의 질량 스펙트럼을 확인하여 각 표준물질에 적합한 MS 모드와 분자이온([M+H]+ 또는 [M+H]-)를 확인하고 그 모드에서 정량성이 뛰어난 이온과 모드를 선택하였으며, 선택한 이온과 모드에서 충돌에너지를 가하여 분자이온(선구이온)을 생성이온으로 쪼개고 에너지별 쪼개짐과 생성이온의 세기를 비교하여 최적의 생성이온이 생성하는 충돌에너지 및 기타 파라미터를 저장하여 MS/MS의 조건을 확립하였다. 확립된 MS/MS 조건은 아래의 [표 2]에 정리되어 있다.
구체적으로 ESI-MS/MS의 분석 조건은 양이온 모드에서 ESI 방식을 이용하되, 콜리젼 가스(Collision gas, CAD), 커튼 가스(curtain gas, CUR), 이온 소스 가스 1(ion source gas 1, GS1) 및 2 (GS2)로서 질소 가스(nitrogen gas)를 각각 5, 30, 50 및 45 psi로 설정하였고, 소스 온도(source temperature, TEM)는 450℃ 및 이온 분무 전위(ionspray voltage, IS)는 5.5 kV로 설정하였다. 또 테스토스테론는 분자이온을 289.17(m/z), 생성이온을 97.2(m/z)로 하고, DP(declustering potential), EP(entrance potential), CE(collision energy) 및 EXP(collision cell exit potential)은 각각 96V, 10V, 31V 및 8V로 하였고, 안드로스텐디온은 분자이온을 287.17(m/z), 생성이온을 97.0(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 86V, 10V, 31V 및 6V로 하였으며, 코르티졸은 분자이온을 363.24(m/z), 생성이온을 121.20(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 71V, 10V, 31V 및 10V로 하였다. 또 코르티존은 분자이온을 361.25(m/z), 생성이온을 163.20(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 111V, 10V, 33V 및 30V로, 알도스테론은 분자이온을 361.26(m/z), 생성이온을 343.20(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 121V, 10V, 25V 및 18V로, 프로게스테론은 분자이온을 315.25(m/z), 생성이온을 97.2(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 96V, 10V, 31V 및 8V로 최적화하여 설정하였다.
따라서 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 시료를 LC/ESI-MS/MS로 분석하는 단계는 전술한 바의 최적화된 조건에서 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 (d)의 정량값을 산출하는 단계는 상기 단계 (c)의 LC/ESI-MS/MS 분석값을 검량선과 비교하여 정량값을 산출하는 단계이다.
검량선의 작성에는 일반적으로 농도를 알고 있는 표준시료를 이용하여 검량선을 작성하는 외부 표준물법(External Standardization), 시료에 여러 농도의 표준시료를 첨가하여 검량선을 작성하는 표준물 첨가법(Standard Addition), 그리고 표준시료 분석시료에 각각 내부 표준물질을 첨가하고 분석하고자 물질의 분석값과 내부 표준물질(Internal Standard)의 분석값의 비를 이용하여 검량선을 작성하는 내부 표준물법(Internal Standardization)이 사용되고 있다.
분석 과정 중 시료의 증발 등 분석시료의 손실에 따른 오차를 없애기 위해서 내부 표준물법이 사용되고 있다.
본 발명에서도 내부 표준물법에 의해 작성한 검량선을 이용하여 정량값을 산출하였다.
여기서 내부 표준물질은 분석물질과 동일하지 않지만 유사한 화학적 구조를 갖는 화합물로서 분석시료 또는 표준시료에 일정량 첨가되어 분석물질의 손실을 측정하고 보정하기 위해 사용되는 물질이다.
본 발명에서는 코르티졸과 코르티존에 대해서는 중수소 치환 코르티졸(cortisol-9,11,12,12-d 4 )을 사용하였고, 테스토스테론에 대해서는 중수소 치환 테스토스테론(testosterone-16,16,17-d 3)을 사용하였으며, 프로게스테론에 대해서는 중수소 치환 프로게스테론(progesterone-2,2,4,6,6,17,21,21,21-d 9)을 사용하였으며, 안드로스텐디온에 대해서는 중수소 치환 안드로스텐디온(androstenedione-2,2,4,6,6,16,16-d 7 )을 사용하였고, 알도스테론에 대해서는 중수소 치환 알도스테론(aldosterone-2,2,4,6,6,21,21-d 7)을 사용하였다.
상기 내부 표준물질의 ESI-MS/MS의 분석 조건은 예비실험을 통하여 중수소 치환 코르티졸의 경우는 분자이온을 367.19(m/z), 생성이온을 121.10(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 79V, 10V, 33V 및 6V로 설정하였고, 중수소 치환 테스토스테론의 경우는 분자이온을 292.19(m/z), 생성이온을 97.30(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 81V, 10V, 31V 및 8V로 설정하였으며, 중수소 치환 프로게스테론의 경우는 분자이온을 324.29(m/z), 생성이온을 100.10(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 101V, 10V, 31V 및 18V로 설정하였고, 중수소 치환 안드로스텐디온의 경우는 분자이온을 294.23(m/z), 생성이온을 99.90(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 81V, 10V, 35V 및 4V로 설정하였고, 중수소 치환 알도스테론의 경우는 분자이온을 368.21(m/z), 생성이온을 350.30(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 111V, 10V, 25V 및 20V로 최적화하여 설정하였다.
본 발명의 타액 중의 스테로이드 호르몬의 정량방법은 고감도이면서 특이성이 높을 뿐만 아니라 재현성과 반복성도 우수하다. 또한, 기존의 혈액 분석법과 비교하여 시료 채취가 용이하고 스트레스가 적은 비침습적인 방법으로 진단 분야 등의 의료산업에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 steroid-free saliva에 spiking한 6개의 steroid들과 상응하는 internal standard들이 성공적으로 동시 분리됨을 확인할 수 있는 크로마토그램이다. (Testosterone (0.5 ng/ml), Cortisol (5 ng/ml), Cortisone (5 ng/ml), Progesterone (1 ng/ml), Androstenedione (0.1 ng/ml), Aldosterone (50 ng/ml))
도 2는 건강한 성인 남성(33세)의 타액 시료로부터 추출된 6개의 steroid 및 5개의 internal standard 또한 성공적으로 동시 분리됨을 확인할 수 있는 크로마토그램이다. (A: Testosterone, B: Cortisol, C: Cortisone, D: Progesterone, E: Androstenedione, F: Aldosterone, G: Testosterone-d 3, H: Cortisol-d 4, I: Progesterone-d 9, J: Androstenedione-d 7, K: Aldosterone-d 7)
도 3은 직선성 평가 결과 얻어진 테스토스테론의 직선 그래프식 및 상관계수(correlation coefficient)를 나타낸 것이다.
도 4는 직선성 평가 결과 얻어진 코르티졸의 직선 그래프식 및 상관계수(correlation coefficient)를 나타낸 것이다.
도 5는 직선성 평가 결과 얻어진 코르티존의 직선 그래프식 및 상관계수(correlation coefficient)를 나타낸 것이다.
도 6은 직선성 평가 결과 얻어진 프로게스테론의 직선 그래프식 및 상관계수(correlation coefficient)를 나타낸 것이다.
도 7은 직선성 평가 결과 얻어진 안드로스텐디온의 직선 그래프식 및 상관계수(correlation coefficient)를 나타낸 것이다.
도 8은 직선성 평가 결과 얻어진 알도스테론의 직선 그래프식 및 상관계수(correlation coefficient)를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
1. 시약 및 실험 방법
1-1: 시약
Testosterone과 androstenedione은 Tokyo Chemical Industry(Japan)사로부터 구매하였고, cortisol, cortisone, aldosterone 및 progesterone은 Sigma-Aldrich (USA)사로부터 구매하였다. Internal standard들로 사용된 deuterated cortisol(cortisol-9,11,12,12-d4, 98%)과 deuterated testosterone (testosterone-16,16,17-d 3)은 cambridge isotope (USA)사에서 구매하였고, deuterated progesterone(progesterone-2,2,4,6,6,17a,21,21,21-d 3)과 deuterated androstenedione (androstenedione-2,2,4,6,6,16,16-d 7 )은 CDN isotope (Canada)사에서 구매하였고, deuterated aldosterone 은 (aldosterone-2,2,4,6,6,21,21-d 7) Santa Cruz (USA)사에서 구매하였다.
Methanol, acetonitrile 및 water는 HPLC용 grade를 사용하였고, 모든 용매는 사용 전에 Advantec membranes (pore size 0.45 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)에 여과시킨 후 사용하였다. Activated charcoal은 Sigma-Aldrich (USA)사로부터 구매하여 사용하였다.
1-2: LC - MS / MS 분석
본 연구는 Agilent 1200 series(Palo Alto, CA, USA)의 high-performance liquid chromatography (HPLC)에 TurboIonSpray probe (ABI/MDS Sciex, CA, USA)가 장착된 triple-quadruple mass spectrometer API-4000TM가 연결된 LC-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)상에서 분석을 수행하였다.
HPLC 본 컬럼은 Sheseido Capcellpak MG-II C18 (particle size, 3; 2.0 mm x 50 mm; Sheseido, Tokyo, Japan)을 사용하였다. HPLC 이동상은 0.1%의 formic acid가 포함된 water (이하 A라 칭함)와 0.1% formic acid가 포함된 methanol (이하 B라 칭함)을 용매 gradient 방법을 사용하여 분석하였다.
조건은 A : B = 80 : 20 (v/v)에서 4.5분까지 B가 35% 되도록 한 다음, 6.5분까지 B가 100%가 되도록 한 다음, 9.0분까지 유지시킨 후, 10분까지 B가 최초 조건으로 회귀하여 20분까지 유지시켰다.
본 연구에서 사용한 최적화된 HPLC 용매의 시간에 따른 gradient 조건이 [표 1]에 요약되어 있다. 유속은 0.2 mL/min으로 일정하게 유지시켰다.
Figure pat00001
모든 steroid들의 mass peak들은 positive ion mode에서 electrospray ionization(전기분무이온화) 방식을 이용해서 multiple reaction mornitoring (MRM) 모드로 정량화되었다. Collision gas (CAD), curtain gas (CUR), ion source gas 1 (GS1) 및 2 (GS2)로서 nitrogen gas를 각각 5, 30, 50 및 45 psi로 설정하였고, source temperature (TEM)는 450℃ 및 ionspray voltage (IS)는 5.5 kV로 설정하였다.
Testosterone의 signal은 m/z 289.17 → 97.2로 하고, testosterone의 declustering potential (DP), entrance potential (EP), collision energy (CE) 및 collision cell exit potential (EXP)은 각각 96V, 10V, 31V 및 8V으로 최적화하여 설정하였고, 이에 대한 내부표준물질로 사용하는 testosterone-d 3의 signal은 m/z 292.19 → 97.3으로, 이때 DP, EP, CE 및 EXP는 각각 81V, 10V, 31V 및 8V로 설정하여 분석하였다.
Androstenedione의 signal은 m/z 287.17 → 97.0으로 하고, androstenedione의 DP, EP, CE 및 EXP는 각각 86V, 10V, 31V 및 6V로 최적화하여 설정하였고, 이에 대한 내부표준물질로 사용하는 androstenedione-d 7 의 signal은 m/z 294.23 → 99.90으로, 이때 DP, EP, CE 및 EXP는 각각 81V, 10V, 35V 및 4V로 설정하여 분석하였다.
Cortisol의 signal은 m/z 363.24 → 121.20 및 cortisone의 signal은 m/z 361.25 → 163.20으로 하였다. 이때 cortisol의 DP, EP, CE 및 EXP은 각각 71V, 10V, 31V 및 10V으로 최적화하여 설정하였고, cortisone의 DP, EP, CE 및 EXP은 각각 111V, 10V, 33V 및 30V로 최적화하여 설정하였다. 이에 대한 내부표준물질로 사용하는 cortisol-d 4의 signal은 m/z 367.19 → 121.10으로 하였고, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 79V, 10V, 33V 및 6V로 설정하여 분석하였다.
Aldosterone의 signal은 m/z 361.26 → 343.20으로 하고, 이때 DP, EP, CE 및 EXP는 각각 121V, 10V, 25V 및 18V로 최적화하여 설정하였고, 이에 대한 내부표준물질로 사용하는 aldosterone-d 7의 signal은 m/z 368.21 → 350.30로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 111V, 10V, 25V 및 20V로 최적화하여 설정하였다.
Progesterone은 m/z 315.25 → 97.2으로 하고, 이때 DP, EP, CE 및 EXP는 각각 96V, 10V, 31V 및 8V로 설정하였다. 이에 대한 내부표준물질로 사용하는 progesterone-d 9의 signal은 m/z 324.29 → 100.10으로 DP, EP, CE 및 EXP는 각각 101V, 10V, 31V 및 18V로 설정하여 분석하였다.
각 steroid와 상응하는 internal standard의 peak area를 Sciex Analyst 1.5 data processing software를 사용하여 분석하였다. 본 발명에서 분석에 사용한 tandem mass spectrometry의 최적화된 parameter 조건은 [표 2]에 요약되어 있다.
Figure pat00002
1-3: 샘플 수집
어떠한 호르몬 대체요법을 받고 있지 않은 총 13명 (평균 나이: 36.5세)의 건강한 성인 남?여(n=13, male=7, female=6)로부터 오전 11:00 ~ 12:00 사이에 saliva 시료가 모아졌다. 이때 saliva 수집은 상업적으로 판매되고 있는 citric acid preparation을 포함하고 있는 cotton swab이 들어 있는 Salivette tube (Sarstedt, Germany) 에 직접 모아졌고 saliva가 수집된 tube를 4000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후, 상징액을 분석 전까지 -70℃에 보관시켰다. Saliva 제공자들은 saliva 수집 전 1시간 이내에는 음식물이나 음료를 먹지 않았으며, 수집 전 1시간 이내에 양치질도 하지 않았다.
1-4: 샘플 준비
Background matrix로 사용하기 위해서 건강한 성인들로부터 제공받은 타액을 1g의 activated charcoal과 혼합한 뒤 실온에서 overnight으로 교반시킨 후에, 4000 rpm에서 15분 동안 원심분리시켰다.
그 상등액이 steroid-free saliva로서 사용되었다. Calibration standard와 QC sample들이 이 steroid-free saliva를 이용해 만들어졌다. Steroid hormone 6종(cortisol, cortisone, testosterone, progesterone, androstendione, aldosterone)의 standard들을 100% methanol에 녹여 농도를 각각 100 ㎍/mL로 만든 후 냉장(4℃) 보관하고, 이 용액을 steroid-free saliva로 단계적으로 희석하여 최종 testosterone의 농도가 각각 0.01, 0.05, 0.10, 0.50, 1.00 및 5.00 ng/mL, 최종 cortisol의 농도가 각각 0.10, 0.50, 1.00, 5.00, 10.00 및 20.00 ng/ml, 최종 cortisone의 농도가 각각 0.20, 1.00, 2.00, 5.00, 10.00 및 20.00 ng/mL, 최종 progesterone의 농도가 각각 0.05, 0.10, 0.50, 1.00, 2.00 및 5.00 ng/mL, 최종 androstenedione의 농도가 각각 0.002, 0.01, 0.05, 0.10, 0.50 및 1.00 ng/mL, 최종 aldosterone의 농도가 각각 5.0, 10.0, 20.0, 50.0, 100.0 및 200.0 ng/mL이 되도록 각각의 calibration standard를 만들었다. 그리고 내부표준물질들로서 testosterone-d 3 , progesterone-d 9 및 aldosterone-d 7는 acetonitrile에 녹여서 각각 최종농도가 100 ng/mL이 되도록 제조하였고, cortisol-d 4 및 androstenedione-d 7 은 acetonitrile에 녹여 각각 최종 농도를 1 ㎍/mL이 되게 제조한 후에, 상기에서 제조한 각각의 calibration standard 용액 1mL에 내부표준물질 20 ㎕를 첨가하였다.
-70℃에 보관했던 건강한 성인 남?여의 sample들을 실온에서 녹이고, 1분간 vortexing 한 후에, 1 ml을 취하여 eppendrof tube에 분주한다. 각각의 sample에 상기한 내부표준물질들을 각각 20 ㎕를 첨가하였다.
1-5 : 샘플 추출
상기의 calibration standards와 QC samples을 포함한 steroid-free saliva와 healthy donors의 sample들에서 steroids을 추출하기 위해 solid phase extraction (SPE)을 다음과 같이 수행하였다. 사용한 kit로는 SUPEL-SELECT HLB SPE 30 mg/1 ml SPE TUBE (Supelco)로서 우선, 이 kit에 methanol 및 water를 각각 1 mL로 activation 시킨 후, 제조한 sample들을 loading 한 후에 50% methanol로 washing하고, 100% methanol을 이용하여 최종 추출하였다. 추출된 sample을 nitrogen evaporator (EYELA, Japan)를 이용하여 용매를 제거한 다음 80% methanol 80 ㎕에 재용해하였다. 이중 20 ㎕를 취하여 LC-ESI-MS/MS에 주입하였다.
1-6 : Method validation
모든 validation이 과정이 국제 가이드라인 (U.S. Department of Health and Human Services, F.D.A., Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation, 2001)에 따라서 수행되었다.
1-6-1 : 직선성
모든 Calibration curve들은 1-4의 샘플 준비에서 기술한 것처럼 6개의 steroid들에 대해서 각각 6개의 다른 농도로 제조되었으며, calibration standard들의 peak area ratios (steroid/internal standard)를 사용하였고 가중치(1/X)를 주어 만들어졌다. 직선성(linearity)은 상기한 calibration standard들의 calibration curve로부터 얻어지는 상관계수(correlation coefficient, r 2)를 분석함으로서 평가되었다.
1-6-2 : 정확성 및 정밀성
정확성(accuracy)과 정밀성(precision; coefficient variation (CV; 변동계수)은 각 steroid들의 3개의 다른 농도로 만들어진 QC sample들을 측정함으로서 평가되었고, 각 값들은 %로 나타내었다. 이때, 일내 정확성(intra-assay accuracy)과 정밀성(intra-assay precision)은 하루에 3가지 농도의 QC sample들을 5번 반복 분석함으로서 평가되었고, 일간 정확성(inter-assay accuracy) 및 정밀성(inter-assay precision)은 서로 다른 5일 동안 3가지 농도의 QC sample들을 분석함으로서 평가되었다.
1-6-3 : 정량한계
Limits of quantification (LOQ)는 signal-to-noise (S/N) ratio가 10이상이 되는 가장 낮은 농도를 정량하였다.
1-6-4 : 안정성
안정성(stability)은 온도에 따른 안정성, -70℃에서 7일 저장 후의 안정성 및 냉?해동 안정성에 대해서 분석하였다.
1-6-4-1 : 다른 온도에 따른 안정성
온도에 따른 안정성을 분석하기 위해서 1-4 샘플 준비에서 기술한 것처럼 steroid-free saliva에 저농도 (testosterone : 0.05 ng/mL, cortisol : 0.5 ng/mL, cortisone : 1.0 ng/mL, progesterone : 0.1 ng/mL, androstenedione : 0.01 ng/mL, aldosterone : 10.0 ng/mL), 중농도 (testosterone : 0.5 ng/mL, cortisol : 5.0 ng/mL, cortisone : 5.0 ng/mL, progesterone : 1.0 ng/mL, androstenedione : 0.1 ng/mL, aldosterone : 50.0 ng/mL) 및 고농도 (testosterone : 5.0 ng/mL, cortisol : 20.0 ng/mL, cortisone : 20.0 ng/mL, progesterone : 5.0 ng/mL, androstenedione : 1.0 ng/mL, aldosterone : 200.0 ng/mL)로 각각 제조한 후에, 1-5의 샘플 추출 방법에 의해 기술한 것처럼 추출한 시료들을 10℃에서는 0h(basal time) 및 24h 보관한 후에 분석하였고, room temperature(실온)에서는 0h 및 6h 보관한 후에 분석하였다.
1-6-4-2 : -70℃에서 1주 및 2주 저장 후의 안정성
-70℃에서 1주 및 2주 저장후의 안정성을 분석하기 위해서 1-4의 Sample preparation에서 기술한 것처럼 steroid-free saliva에 저농도 (testosterone : 0.05 ng/mL, cortisol : 0.5 ng/mL, cortisone : 1.0 ng/mL, progesterone : 0.1 ng/mL, androstenedione : 0.01 ng/mL, aldosterone : 10.0 ng/mL), 중농도 (testosterone : 0.5 ng/mL, cortisol : 5.0 ng/mL, cortisone : 5.0 ng/mL, progesterone : 1.0 ng/mL, androstenedione : 0.1 ng/mL, aldosterone : 50.0 ng/mL) 및 고농도 (testosterone : 5.0 ng/mL, cortisol : 20.0 ng/mL, cortisone : 20.0 ng/mL, progesterone : 5.0 ng/mL, androstenedione : 1.0 ng/mL, aldosterone : 200.0 ng/mL)로 각각 제조한 후에, -70℃의 deep freezer에서 1주 및 2주 동안 각각 보관한 후에, 1-5 샘플 추출 방법에 의해 기술한 것처럼 추출한 시료들을 각각 분석하였다.
1-6-4-3 : 냉?해동 안정성
냉?해동 안정성을 분석하기 위해서 1-4의 샘플 준비에서 기술한 것처럼 steroid-free saliva에 저농도 (testosterone : 0.05 ng/mL, cortisol : 0.5 ng/mL, cortisone : 1.0 ng/mL, progesterone : 0.1 ng/mL, androstenedione : 0.01 ng/mL, aldosterone : 10.0 ng/mL), 중농도 (testosterone : 0.5 ng/mL, cortisol : 5.0 ng/mL, cortisone : 5.0 ng/mL, progesterone : 1.0 ng/mL, androstenedione : 0.1 ng/mL, aldosterone : 50.0 ng/mL) 및 고농도 (testosterone : 5.0 ng/mL, cortisol : 20.0 ng/mL, cortisone : 20.0 ng/mL, progesterone : 5.0 ng/mL, androstenedione : 1.0 ng/mL, aldosterone : 200.0 ng/mL)로 각각 제조한 후에, 24h 간격으로 3회 냉?해동을 거친 후 1.5의 샘플 추출 방법에 의해 기술한 것처럼 시료를 추출하여 분석하였다. 이때, 냉동은 -70℃에서 수행하였고, 해동은 room temperature에서 어떠한 물리,화학적인 해동작업 없이 수행하였다.
1-6-5: 회수율
회수율 (recovery(%))은 1-4의 샘플 준비에서 기술한 것처럼 steroid-free saliva에 저농도 (testosterone : 0.05 ng/mL, cortisol : 0.5 ng/mL, cortisone : 1.0 ng/mL, progesterone : 0.1 ng/mL, androstenedione : 0.01 ng/mL, aldosterone : 10.0 ng/mL), 중농도 (testosterone : 0.5 ng/mL, cortisol : 5.0 ng/mL, cortisone : 5.0 ng/mL, progesterone : 1.0 ng/mL, androstenedione : 0.1 ng/mL, aldosterone : 50.0 ng/mL) 및 고농도 (testosterone : 5.0 ng/mL, cortisol : 20.0 ng/mL, cortisone : 20.0 ng/mL, progesterone : 5.0 ng/mL, androstenedione : 1.0 ng/mL, aldosterone : 200.0 ng/mL)로 각각 제조한 후에, 1-5의 샘플 추출 방법에 의해 기술한 것처럼 추출한 시료의 분석결과와 100% 회수를 의미하는 추출하지 않은 각각 steroid standard와 internal standard의 ratio를 비교하여 분석하였다.
2. 분석 결과
2-1. Spiking 한 steroid sample 과 healthy subject 의 saliva 샘플의 분석 결과
본 연구를 위해 수립한 최적화된 HPLC 조건 및 최적화된 tandem mass spectrometry의 parameter 조건 하에서, "1-4의 샘플 준비"에서 상기한 steroid-free saliva에 spiking한 6개의 steroid들과 상응하는 internal standard들이 성공적으로 동시 분리가 이루어진다는 것이 크로마토그래피상에서 확인되었으며, 6개의 모든 steroid들과 5개의 internal standard가 13분 이내에 분리되어짐을 알 수 있었다(도 1).
Healthy donor 중 한 명의 saliva sample로부터 추출된 6개의 steroid 및 5개의 internal standard 또한 13분 이내의 각각의 retention time으로 완전히 분리가 이루어졌다.
이때 testosterone의 retention time은 12.20 min, cortisol은 11.48 min, cortisone은 11.32 min, progesterone은 12.83 min, androstenedione은 11.99 min, aldosterone은 11.32 min, testosterone-d 3은 12.19 min, cortisol-d 4는 11.47 min, progesterone-d 9은 12.79 min, androstenedione-d 7 은 11.96 min 및 aldosterone-d 7는 11.24 min 이었다(도 2).
따라서 6종의 steroid와 5종의 internal standard가 steroid-free saliva에 spiking되었을 때와 실제 사람의 saliva에서 검출하였을 때 차이가 나지 않는다는 것이 확인되었다.
2-2. 직선성에 대한 validation 결과
6종의 steroid에 대한 직선성 평가 결과, 모두 0.99000 이상으로 얻어졌으면 이것은 매우 좋은 correlation coefficient (r 2) 라 할 수 있다.
이때, testosterone의 직선의 그래프식과 r 2은 y = 0.61074x + 0.00309, r 2 = 0.99997 (도 3), cortisol은 y = 0.07741x + 0.00196, r 2 = 0.99999 (도 4), cortisone은 y = 0.13653x + 0.00706, r 2 = 0.99985 (도 5), progesterone은 y = 0.57107x + 0.01834, r 2 = 0.99998 (도 6), androstenedione은 y = 4.60449x + 0.01519, r 2 = 0.99990 (도 7), aldosterone은 y = 0.03710x + 0.07558, r 2 = 0.99992 (도 8)로 각각 평가되었다.
따라서 이러한 직선성에 대한 validation 분석 결과들은 국제적으로 승인된 범주 내에 있으며, 본 연구에서 saliva 내 6종 steroid을 동시에 정량 분석시에 정량값 산출에 신뢰성을 줄 수 있는 결과라 볼 수 있다.
2-3. 일내 및 일간 정확성 및 정밀도에 대한 validation 결과
Testosterone의 경우, 최저정량한계인 0.01 ng/mL을 제외한 3개의 QC sample에 대해서 분석 결과, 일내 정확도 및 정밀성이 각각 93.24 ~ 106.04% 및 0.78 ~ 2.51%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 97.80 ~ 102.16% 및 1.77 ~ 6.62% (표 3), cortisol의 경우, 최저정량한계인 0.10 ng/mL을 제외한 3개의 QC sample의 일내 정확도 및 정밀성이 각각 99.16 ~ 100.04% 및 1.44 ~ 5.59%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 99.20 ~ 103.70% 및 2.29 ~ 6.22% (표 4), cortisone의 경우, 최저정량한계인 0.20 ng/mL을 제외한 3개의 QC sample의 일내 정확도 및 정밀성이 각각 96.40 ~ 99.74% 및 4.19 ~ 4.72%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 102.04 ~ 106.40% 및 2.16 ~ 5.81% (표 5), progesterone의 경우, 최저정량한계인 0.05 ng/mL을 제외한 3개의 QC sample의 일내 정확도 및 정밀성이 각각 98.56 ~ 101.28% 및 1.16 ~ 3.81%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 99.44 ~ 105.24% 및 2.13 ~ 5.50% (표 6), androstenedione의 경우, 최저정량한계인 0.002 ng/mL을 제외한 3개의 QC sample의 일내 정확도 및 정밀성이 각각 94.24 ~ 102.82% 및 0.96 ~ 6.15%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 96.30 ~ 106.40% 및 0.81 ~ 5.15% (표 7), aldosterone의 경우, 최저정량한계인 5.00 ng/mL을 제외한 3개의 QC sample의 일내 정확도 및 정밀성이 각각 95.00 ~ 102.12% 및 2.76 ~ 5.15%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 98.88 ~ 103.20% 및 2.21 ~ 5.42% (표 8)로 각각 평가되었다. 따라서 이러한 정확성 및 정밀도에 대한 validation 분석 결과들은 국제적으로 승인된 범주 내에 있다는 것을 의미하며, 본 연구에서 개발한 방법이 일내 및 일간 재현성 및 반복성이 뛰어나다는 것을 의미한다고 볼 수 있다.
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
Figure pat00008
2-4. 최저정량한계 및 이의 일내 및 일간 정확성 및 정밀성 validation 결과
6종의 steroid들의 최저정량한계 측정 결과, testosterone의 경우, 0.01 ng/mL으로 측정되었으며, 일내 정확도 및 정밀성이 각각 103.32% 및 3.42%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 99.56% 및 0.47% (표 3, 표 9), cortisol의 경우, 0.10 ng/mL으로 측정되었으며, 일내 정확도 및 정밀성이 각각 97.20% 및 4.06%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 101.00% 및 6.06% (표 4, 표 9), cortisone의 경우, 0.20 ng/mL으로 측정되었으며, 일내 정확도 및 정밀성이 각각 99.80% 및 7.57%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 100.00% 및 4.96% (표 5, 표 9), progesterone의 경우, 0.05 ng/mL으로 측정되었으며, 일내 정확도 및 정밀성이 각각 95.16% 및 4.67%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 97.12% 및 2.09% (표 6, 표 9), androstenedione의 경우, 0.002 ng/mL으로 측정되었으며, 일내 정확도 및 정밀성이 각각 95.20% 및 3.05%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 95.30% 및 3.53% (표 7, 표 9), 그리고 aldosterone의 경우, 5.00 ng/mL으로 측정되었으며, 일내 정확도 및 정밀성이 각각 98.00% 및 5.29%, 그리고 일간 정확도 및 정밀성이 95.08% 및 3.57% (표 8, 표 9)로 각각 평가되었다. 이러한 최저정량한계 분석에 대한 validation 결과들은 본 연구에서 개발한 방법의 민감도(sensitivity)가 매우 뛰어나다는 것을 의미한다고 볼 수 있다.
Figure pat00009
2-5. 안정성에 대한 validation 결과
6종 steroid들의 온도에 따른 안정성 분석 결과, testosterone의 경우, 10℃에서 0hr (basal time)에 비해서 24hr까지 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 10℃에서의 24hr 후에 측정한 결과, 94.93 ~ 103.33%의 정확성과 2.21 ~ 11.31%의 정밀성을 보였고, 실온(room temperature)에서는 6hr 까지 방치한 후에 측정한 결과, basal time에 비해서 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 실온에서 6hr 후에 측정한 결과, 93.17 ~ 108.67%의 정확성과 1.68 ~ 3.62%의 정밀성을 보였다 (표 10). Cortisol의 경우, 10℃에서 basal time에 비해서 24hr까지 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 10℃에서의 24hr 후에 측정한 결과, 94.80 ~ 101.40%의 정확성과 1.38 ~ 5.78%의 정밀성을 보였고, 실온에서는 6hr 까지 방치한 후에 측정한 결과, basal time에 비해서 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 실온에서 6hr 후에 측정한 결과, 95.27 ~ 103.33%의 정확성과 2.07 ~ 2.60%의 정밀성을 보였다 (표 11). Cortisone의 경우, 10℃에서 basal time에 비해서 24hr까지 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 10℃에서의 24hr 후에 측정한 결과, 92.30 ~ 101.83%의 정확성과 2.32 ~ 5.32%의 정밀성을 보였고, 실온에서는 6hr 까지 방치한 후에 측정한 결과, basal time에 비해서 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 실온에서 6hr 후에 측정한 결과, 86.57 ~ 96.47%의 정확성과 1.89 ~ 4.08%의 정밀성을 보였다 (표 12). Progesterone의 경우, 10℃에서 basal time에 비해서 24hr까지 안정성에 큰 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 10℃에서의 24hr 후에 측정한 결과, 90.47 ~ 97.83%의 정확성과 1.44 ~ 7.49%의 정밀성을 보였고, 실온에서는 6hr 까지 방치한 후에 측정한 결과, basal time에 비해서 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 실온에서 6hr 후에 측정한 결과, 92.23 ~ 95.70%의 정확성과 0.56 ~ 7.21%의 정밀성을 보였다 (표 13). Androstenedione의 경우, 10℃에서 basal time에 비해서 24hr까지 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 10℃에서의 24hr 후에 측정한 결과, 93.73 ~ 108.00%의 정확성과 1.92 ~ 10.35%의 정밀성을 보였고, 실온에서는 6hr 까지 방치한 후에 측정한 결과, basal time에 비해서 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 실온에서 6hr 후에 측정한 결과, 91.13 ~ 107.33%의 정확성과 1.66 ~ 3.53%의 정밀성을 보였다 (표 14). Aldosterone의 경우, 10℃에서 basal time에 비해서 24hr까지 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 10℃에서의 24hr 후에 측정한 결과, 90.47 ~ 105.67%의 정확성과 1.91 ~ 3.32%의 정밀성을 보였고, 실온에서는 6hr 까지 방치한 후에 측정한 결과, basal time에 비해서 안정성에 변화가 없음이 확인되었다. 즉, 실온에서 6hr 후에 측정한 결과, 90.50 ~ 104.33%의 정확성과 2.23 ~ 5.06%의 정밀성을 보였다 (표 15). 따라서 이러한 6종 steroid들의 온도에 따른 안정성에 대한 validation 결과들은 국제적으로 승인된 범주내에 있다는 것을 의미하며, saliva내 6종 steroid들을 동시에 정량적으로 분석시에 10℃에서 최소한 24hr까지, 그리고 실온에서 최소한 6hr까지는 안정성을 확보할 수 있다는 것을 의미한다.
6종 steroid들의 -70℃에서 1주 및 2주 보관후의 안정성 분석 결과, testosterone의 경우, 1주 후에도 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 97.03 ~ 106.00%의 정확성과 1.15 ~ 2.49%의 정밀성을 보였고, 2주 후에도 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 94.20 ~ 103.67%의 정확성과 1.13 ~ 4.60%의 정밀성을 보였다(표 16). Cortisol의 경우, 1주 후에도 안정성에 변화가 없었고, 이때, 96.60 ~ 100.77%의 정확성과 2.10 ~ 3.47%의 정밀성을 보였고, 2주 후에도 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 92.00 ~ 101.57%의 정확성과 0.53 ~ 5.74%의 정밀성을 보였다(표 17). Cortisone의 경우, 1주 후에도 안정성에 변화가 없었고, 이때, 98.53 ~ 100.97%의 정확성과 1.73 ~ 2.02%의 정밀성을 보였고, 2주 후에도 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 102.67 ~ 106.67%의 정확성과 1.72 ~ 2.86%의 정밀성을 보였다(표 18). Progesterone의 경우, 1주후에도 안정성에 변화가 없었고, 이때, 94.23 ~ 97.10%의 정확성과 1.23 ~ 2.89%의 정밀성을 보였고, 2주 후에도 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 92.43 ~ 98.43%의 정확성과 0.52 ~ 3.24%의 정밀성을 보였다(표 19). Androstenedione의 경우, 1주후에도 안정성에 변화가 없었고, 이때, 95.10 ~ 111.33%의 정확성과 1.29 ~ 3.15%의 정밀성을 보였고, 2주 후에도 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 94.57 ~ 101.37%의 정확성과 2.19 ~ 5.70%의 정밀성을 보였다(표 20). Aldosterone의 경우, 1주 후에도 안정성에 변화가 없었고, 이때, 89.07 ~ 100.47%의 정확성과 0.70 ~ 3.05%의 정밀성을 보였고, 2주 후에도 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 89.13 ~ 102.00%의 정확성과 0.98 ~ 1.71%의 정밀성을 보였다(표 21). 따라서 -70℃에서 1주 및 2주 보관후의 안정성에 대한 validation 결과들은 국제적으로 승인된 범주내에 있다는 것을 의미하며, saliva내 6종 steroid들을 동시에 정량적으로 분석시에 -70℃에서 최소 2주 동안은 안정성을 확보할 수 있다는 것을 의미한다.
6종 steroid들을 24hr 주기로 냉?해동 과정을 거친 후의 안정성 분석 결과, testosterone의 경우, 3회 냉?해동 과정 후에 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 3회 냉?해동 후에 91.93 ~ 108.00%의 정확성과 0.45 ~ 2.73%의 정밀성을 보였다(표 22). Cortisol의 경우도, 3회 냉?해동 과정 후에 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 3회 냉?해동 후에 94.07 ~ 103.00%의 정확성과 0.61 ~ 1.66%의 정밀성을 보였다(표 23). Cortisone의 경우도, 3회 냉?해동 과정 후에 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 3회 냉?해동 후에 85.83 ~ 99.63%의 정확성과 1.21 ~ 2.24%의 정밀성을 보였다(표 24). Progesterone의 경우도, 3회 냉?해동 과정 후에 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 3회 냉?해동 후에 94.33 ~ 96.80%의 정확성과 1.15 ~ 1.20%의 정밀성을 보였다(표 25).
Androstenedione의 경우도, 3회 냉?해동 과정 후에 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 3회 냉?해동 후에 89.97 ~ 106.00%의 정확성과 0.68 ~ 1.24%의 정밀성을 보였다(표 26). Aldosterone의 경우도, 3회 냉?해동 과정 후에 안정성에 변화가 없음이 확인되었으며, 이때 3회 냉?해동 후에 99.20 ~ 108.00%의 정확성과 1.60 ~ 5.14%의 정밀성을 보였다(표 27). 따라서 이러한 냉?해동 과정 후의 안정성에 대한 validation 결과들은 국제적으로 승인된 범주 내에 있다는 것을 의미하며, saliva내 6종 steroid들을 동시에 정량적으로 분석 시에 최소 3번의 냉?해동 과정 동안은 안정성을 확보할 수 있다는 것을 의미한다.
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2-6. 회수율에 대한 결과
6종의 steroid들에 대해서 각각 저, 중 및 고농도로 제조한 sample에 대한 회수율 분석 결과 (표 28), testosterone의 경우, 평균 101.31%의 회수율을 보였고, cortisol의 경우, 평균 102.09%의 회수율을 보였고, cortisone의 경우, 평균 79.06%의 회수율을 보였고, progesterone의 경우, 평균 98.53%의 회수율을 보였고, androstenedione의 경우, 평균 97.16%의 회수율을 보였고, aldosterone의 경우, 평균 106.72%의 회수율을 보였다. 회수율 결과들로 판단해 볼 때, 6종 steroid 모두 매우 좋은 회수율을 보였다. 그리고 6종의 steroid 각각에 대해서 저, 중 및 고농도에서 제조한 sample 모두 일정한 회수율을 보임으로서 본 연구에서 개발한 분석방법이 향후 임상 검체 분석에 적용할 경우에도 신뢰할 수 있는 데이터를 제공할 수 있을 것으로 판단되었다.
Figure pat00028
2-7. 건강한 대상자들의 sample 분석 결과
본 연구에서 개발한 saliva내 6종 steroid들의 동시 정량 분석법에 근거하여 건강한 성인 남?여 대상으로 오전 11시부터 12시 사이에 수집된 saliva내 6종 steroid들을 남(n=7), 여(n=6)별로 정량분석 한 결과 (표 29), 남성들의 경우 testosterone의 평균값이 0.05±0.01 ng/mL 이었고, 여성들의 경우 0.02±0.01 ng/mL 로 측정되었다. Cortisol의 경우, 남성들은 0.70±0.37 ng/mL 이었고, 여성들은 0.90±0.50 ng/mL으로 측정되었다. Cortisone의 경우, 남성들은 3.96±0.49 ng/mL 이었고, 여성들은 5.30±0.00 ng/mL으로 측정되었다. Progesterone의 경우, 남성들은 0.058±0.012 ng/mL 이었고, 여성들은 0.155±0.064 ng/mL 으로 측정되었다. Androstenedione의 경우, 남성들은 0.005±0.001 ng/mL 이었고, 여성들은 0.007±0.004 ng/mL으로 측정되었다. Aldosterone의 경우, 남성들은 26.615±01.368 ng/mL 이었고, 여성들은 28.923±0.925 ng/mL 으로 측정되었다.
결과적으로 본 연구에서 개발한 saliva내 6종 steroid들의 동시 정량분석법은 빠르고, 고감도이면서 특이성이 높고 재현성과 반복성이 높으며, 기존의 혈액 분석법에 비해서 비침습적이며 비스트레스적이고 saliva 채취가 편리한 새로운 분석법이라고 할 수 있다. 또한 본 연구에서 개발된 분석법을 통해 saliva 내에 임상적으로 중요한 6종의 steroid들의 동시 profiling이 가능할 것이며, 이를 통해 인체내 hormone metabolism에 대한 정보를 제공해 줄 수 있는 새로운 방법 중 하나가 될 것으로 판단된다.
Figure pat00029

Claims (10)

  1. 테스토스테론, 안드로스텐디온, 코르티졸, 코르티존, 알도스테론 및 프로게스테론로 구성된 6종의 호르몬 중에서 선택된 하나 이상의 스테로이드 호르몬을 정량하는 방법에 있어서,
    (a) 타액 시료를 수득하는 단계,
    (b) 그 타액 시료를 활성화시킨 고체상 카트리지에 적용하여 메탄올과 물의 혼합 용매로 세척한 후 메탄올로 용출시켜 추출하는 단계,
    (c) 상기 추출된 시료를 LC/ESI-MS/MS로 분석하는 단계, 및
    (d) 분석된 값으로부터 검량선을 이용하여 정량값을 산출하는 단계를 포함하여 구성되는
    타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 타액 중 스테로이드 호르몬의 정량방법은 상기 6종의 호르몬을 모두 정량하는 동시 정량방법인 것을 특징으로 하는
    타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 타액 시료를 수득하는 단계는 건강한 개체, 질병을 가진 개체, 또는 질병의 이환 여부의 진단이 필요한 개체로부터 타액 시료를 수득하는 것임을 특징으로 하는
    타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 상기 고체상 카트리지는 소수성의 스티렌(styrene) 폴리머에 친수성 물질이 결합된 레진으로 충진된 고체상 카트리지이고, 상기 물과 메탄올의 혼합 용매는 50% 메탄올임을 특징으로 하는
    타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계를 통하여 추출된 시료를 용출 용매 제거 후 메탄올과 물의 혼합 용매에 재용해시키는 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는
    타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 상기 추출된 시료를 LC/ESI-MS/MS로 분석하는 단계에서,
    LC는 입도(particle size)가 3㎛인 C18 실리카 레진으로 충진된 칼럼을 사용하고, 이동상으로서 0.1% 포름산 함유 물(A)과, 0.1% 포름산 함유 메탄올(B)의 농도 구배가 형성된 것을 사용하며, 유속은 0.2㎖/min으로 일정하게 유지시키며,
    상기 농도 구배 조건은 본 발명의 A : B = 80 : 20 (v/v)에서 4.5분까지 B가 35% 되도록 한 다음, 6.5분까지 B가 100%가 되도록 한 다음, 9.0분까지 유지시킨 후, 10분까지 B가 최초 조건으로 회귀하여 20분까지 유지하는 것을 특징으로 하는 타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 ESI-MS/MS의 수행 조건은
    양이온 모드에서 ESI 방식을 이용하되,
    콜리젼 가스(Collision gas, CAD), 커튼 가스(curtain gas, CUR), 이온 소스 가스 1(ion source gas 1, GS1) 및 2 (GS2)로서 질소 가스(nitrogen gas)를 각각 5, 30, 50 및 45 psi로 설정하고, 소스 온도(source temperature, TEM)는 450℃로 설정하고, 이온 분무 전위(ionspray voltage, IS)는 5.5 kV로 설정하며,
    테스토스테론는 분자이온을 289.17(m/z), 생성이온을 97.2(m/z)로 하고, DP(declustering potential), EP(entrance potential), CE(collision energy) 및 EXP(collision cell exit potential)은 각각 96V, 10V, 31V 및 8V로 설정하며,
    안드로스텐디온은 분자이온을 287.17(m/z), 생성이온을 97.0(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 86V, 10V, 31V 및 6V로 설정하며,
    코르티졸은 분자이온을 363.24(m/z), 생성이온을 121.20(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 71V, 10V, 31V 및 10V로 설정하며,
    코르티존은 분자이온을 361.25(m/z), 생성이온을 163.20(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 111V, 10V, 33V 및 30V로 설정하며,
    알도스테론은 분자이온을 361.26(m/z), 생성이온을 343.20(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 121V, 10V, 25V 및 18V로 설정하며,
    프로게스테론은 분자이온을 315.25(m/z), 생성이온을 97.2(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 96V, 10V, 31V 및 8V로 설정하는 것을 특징으로 하는
    타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (d)의 정량값을 산출하는 단계는 내부표준물법에 의하여 이루어지는 것을 특징으로 하는
    타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 내부 표준물질은 테스토스테론에 대해서는 중수소 치환 테스토스테론(testosterone-16,16,17-d 3), 코르티졸과 코르티존에 대해서는 중수소 치환 코르티졸(cortisol-9,11,12,12-d 4), 안드로스텐디온에 대해서는 중수소 치환 안드로스텐디온(androstenedione-2,2,4,6,6,16,16-d 7 )을 사용하고, 알도스테론에 대해서는 중수소 치환 알도스테론(aldosterone-2,2,4,6,6,21,21-d 7)을 사용하며, 프로게스테론에 대해서는 중수소 치환 프로게스테론(progesterone-2,2,4,6,6,17a,21,21,21-d 9)을 사용하는 것을 특징으로 하는 타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    내부 표준물질의 ESI-MS/MS의 분석 조건은
    중수소 치환 코르티졸의 경우는 분자이온을 367.19(m/z), 생성이온을 121.10(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 79V, 10V, 33V 및 6V로 설정하고,
    중수소 치환 테스토스테론의 경우는 분자이온을 292.19(m/z), 생성이온을 97.3(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 81V, 10V, 31V 및 8V로 설정하고,
    중수소 치환 프로게스테론의 경우는 분자이온을 324.29(m/z), 생성이온을 100.10(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 101V, 10V, 31V 및 18V로 설정하고,
    중수소 치환 안드로스텐디온의 경우는 분자이온을 294.23(m/z), 생성이온을 99.90(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 81V, 10V, 35V 및 4V로 설정하고,
    중수소 치환 알도스테론의 경우는 분자이온을 368.21(m/z), 생성이온을 350.30(m/z)로, DP, EP, CE 및 EXP는 각각 111V, 10V, 25V 및 20V로 최적화하여 설정하는 것을 특징으로 하는
    타액 중 스테로이드 호르몬의 정량 방법.
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