CN103735555B - 一种葫芦素药物组合物及其制药用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种葫芦素药物组合物及其制药用途。该葫芦素药物组合物包含葫芦素、增溶剂、抗氧剂和pH调节剂，其中：pH调节剂的用量足以将药物组合物的pH值调至3.5～7.5；葫芦素与增溶剂的重量比为1：600～1：3150。本发明的药物组合物可用于制备降低葫芦素毒性的药物，也可用于制备抗肝炎、退黄、抗癌的药物。

Description

一种葫芦素药物组合物及其制药用途

技术领域

本发明属于药物制剂领域，具体涉及一种葫芦素药物组合物及其制药用途。

背景技术

癌症指的是所有的恶性肿瘤，是当前严重影响人类健康、威胁人类生命的主要疾病之一。国际癌症研究中心(IARC)最新报告称：癌症发病人数以年均3～5％的速度递增，预计到2020年全球将有2000万癌症新发病例，死亡病例将达1200万。我国卫生部2007年公布的最新数据显示：中国城乡居民的第一死因均为恶性肿瘤，占死亡人数的1／4。因此，世界卫生组织和各国政府卫生部门都把攻克癌症列为一项首要任务。

化学药物治疗(化疗)作为临床治疗癌症的常用手段已有60多年历史。目前，大约有90多种化疗药物被用于癌症治疗。根据它们的作用机制可分为烷化剂、抗代谢药、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌药、激素和其它。化疗是利用上述化学药物杀死癌细胞、抑制癌细胞的生长繁殖和分化的一种治疗方式，它是一种全身性治疗手段，对原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有治疗作用。虽然化疗在治愈癌症、控制疾病、提高手术切除率及生存率、缓解症状和改善生存质量方面发挥了较大的作用，对于移转和恶性肿瘤的治疗更是十分必要，但是其存在的副作用也很多，例如身体衰弱、免疫功能下降、骨髓抑制、消化障碍、炎症反应、心脏毒性、肾脏毒性、肺纤维化、静脉炎、神经系统毒性、肝脏毒性、膀胱炎等。此外，化疗药物存在极易产生耐药性，也使其应用有一定的局限性。

对于中晚期癌症或身体虚弱的病人，盲目使用化疗，不仅会导致病情迅速恶化，更会加速病人的死亡。因此，探寻一种选择性强、毒副反应小和不易耐药的新药，并通过应用新剂型改变药物体内分布、提高生物利用度、增强疗效、增加药物的靶向性、减少毒副作用成为抗癌药物研究的一个重要方向。

葫芦素(cucurbitacins)是从葫芦科植物中提取的一类高度氧化的四环三萜类化合物，至今已发现40多种。葫芦素类化合物具有如式1所示的基本骨架，它们之间的区别在于C2、C3、C19、C24位的羟基化，C3的羰基，C1-C2之间的双键，C23-C24之间的双键以及C25位羟基的乙酰化。另外，葫芦素衍生物还包括葫芦素糖苷、葫芦素的二乙酸盐等。

葫芦素B(缩写为CuB)：R₁-OH，R₂-=O，R₃-H，R₄-Ac，Δ23，24；

异葫芦素B(异CuB)：R₁-=O，R₂-OH，R₃-H，R₄-Ac，Δ23，24；

葫芦素D(缩写为CuD)：R₁-OH，R₂-=O，R₃-H，R₄-H，Δ23，24；

葫芦素E(CuE)：R₁-OH，R₂-=O，R₃-H，R₄-Ac，Δ1，2，Δ23，24；

葫芦素I(缩写为CuI)：R₁-OH，R₂-=O，R₃-H，R₄-H，Δ1，2，Δ23，24。

目前，从甜瓜蒂中提取的药用葫芦素主要成分为葫芦素B和葫芦素E，文献报道的葫芦素类化合物最为主要的药理作用是其细胞毒与抗肿瘤作用以及抗炎作用。Jayaprakasam B等(B.Jayaprakasam，N.P.Seeram，M.G.Nair.Anticancer and antiinflammatory activities of cucurbitacins fromCucurbita andreana.Cancer Letters[J].2003，189(1)，11-16.)从Cucurbitaandreana果实中提取出葫芦素B、D、E和I，并分别评价了这些化合物对人结肠癌(HCT-116)、乳腺癌(MCF-7)、肺癌(NCI-H460)和中枢神经系统肿瘤(SF-268)细胞株的抑制作用，还评价了这些化合物对环氧合酶-1(COX-1)和环氧合酶-2(COX-2)以及对脂质过氧化反应的作用。SunJ等以五种葫芦素同系物——葫芦素A、B、E、I和Q(CuA、CuB、CuE、CuI、CuQ)——研究了其构效关系(SAR)：CuQ可抑制STAT3的激活但不抑制JAK2；CuA抑制JAK2但不抑制STAT3的激活；CuB、E和I可抑制二者的激活。构效关系研究结果证明，这些葫芦素化合物中的C3羰基向羟基的转变可导致抗JAK2活性的丧失，而在C11加入一个羟基可引起抗STAT3活性的丧失。CuQ可选择性抑制STAT3，并可在不抑制JAK2、Src、Akt、Erk或JNK的条件下诱导细胞编程性凋亡。此外，与不含有组成性激活的STAT3的细胞相比(如H-Ras／NIH3T3、MDA-MB-453和NIH3T3细胞)，CuQ可更加有效地诱导含有组成性激活的STAT3的人和鼠肿瘤细胞的细胞编程性凋亡。

综上所述，葫芦素在治疗剂量内对多种癌细胞均表现出与常规化疗药物类似甚至较强的杀伤作用，同时，葫芦素没有表现出常规化疗药物所具有的骨髓造血系统的抑制、肝脏细胞损害、免疫系统的损伤等副作用，相反，葫芦素具有保肝、增强机体免疫力和抗环境化学致癌物等作用，这恰恰是葫芦素比常规化疗药物优越的地方所在。

然而，葫芦素也存在着不可忽视的问题，即毒性较大。作为葫芦素主要来源的甜瓜蒂本身具有毒性，其水煎剂口服过量易引起严重后果。有文献报道，部分病例服用葫芦素后，出现腹部不适、恶心、轻度腹泻等胃肠道反应，少数病例可出现短暂口干、头昏；大剂量使用时，还可引起严重贫血、频繁呕吐和腹泻，甚至呼吸、循环衰竭而死亡。目前，部分文献报道了降低葫芦素毒性的方法，例如杨凯等(杨凯等，葫芦素BE的药理作用研究进展。国际中医中药杂志，2006年1月，第28卷，第1期，第27～29页)指出，在应用CuBE的同时给予醋酸钠、葡萄糖维生素C可降低其毒副反应。但是，醋酸钠、葡萄糖维生素C只能解决部分葫芦素的毒性问题，并且在剂型方面存在局限性。因此，仍然急需寻找能降低葫芦素毒性的其它方式。

近年来，以表面活性剂或高分子载体材料形成的胶束为载体制成的药物胶束制剂正受到越来越多的关注。作为一种药物载体，胶束具有疏水性内核与亲水性外壳，是一种自组装纳米胶体粒子，它具有载药量高、载药范围广、稳定性好、体内滞留时间长等特点。目前，胶束已被成功应用于水不溶性药物的给药中，在体内外显示出较高的稳定性和生物相容性，但是未见用胶束降低葫芦素毒性反应的报道。

发明内容

针对目前葫芦素应用中的毒性问题，本发明人经过深入研究，提供了一种可明显降低葫芦素毒性的药物组合物。

本发明提供的可降低葫芦素毒性的药物组合物主要包含葫芦素、增溶剂、抗氧剂和pH调节剂，其中：pH调节剂的用量足以将药物组合物的pH值调至3.5～7.5、优选4.0～7.0、进一步优选5.0～6.5。

其中，葫芦素与增溶剂的重量比为1：600～1：3150、优选1：650～1：3100、还优选1：700～1：3050、进一步优选1：750～1：3000的范围。

所述增溶剂选自吐温20、吐温80、蔗糖脂肪酸酯(SE30、SE40)、磷脂、泊洛沙姆188(F68)及其衍生物(泊洛沙姆188-胆固醇碳酸酯，简称F68-CHMC)、泊洛沙姆237(F87)及其衍生物(泊洛沙姆237-胆固醇碳酸酯，简称F87-CHMC)、泊洛沙姆338(F108)及其衍生物(泊洛沙姆338-胆固醇碳酸酯，简称F108-CHMC)、泊洛沙姆407(F127)及其衍生物(泊洛沙姆407-胆固醇碳酸酯，简称F127-CHMC)、聚丙交脂-聚乙二醇共聚物(PDLLA-mPEG2000、PDLLA-mPEG5000)、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯(HS15)、蓖麻油聚烃氧酯(Cremophor EL、Cremophor ELP)、聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯(TPGS)等；

所述抗氧剂选自亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、二硫代氨基甲酸盐、抗坏血酸、抗环血酸棕榈酸酯、氢基香豆素、维生素E、乙醇胺、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、去甲二氢愈创木酸、EDTA和EDTA钙钠，抗氧剂的用量占药物组合物的0.00001～0.1％(g／ml)；

所述pH调节剂选自无机酸(盐酸、磷酸、碳酸)，有机酸(醋酸、酒石酸、枸橼酸、苹果酸、草酸、乳酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、羟脯氨酸)，无机碱(氢氧化钠)，有机碱(天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、甜菜碱)及对应的钠盐(磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、酒石酸钠、枸橼酸钠、苹果酸钠、草酸钠、乳酸钠、富马酸钠、马来酸钠和琥珀酸钠)，如上所述其用量为将药物组合物的pH值调至3.5～7.5、优选4.0～7.0、进一步优选5.0～6.5。

本发明的葫芦素可以是从葫芦科植物、十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数本科植物或真菌中提取的四环三帖化合物。葫芦素优选为葫芦素A、葫芦素B、葫芦素C、葫芦素D、葫芦素E、葫芦素BE、葫芦素I、葫芦素Q、葫芦素S、双氢葫芦素A、双氢葫芦素B、双氢葫芦素C、双氢葫芦素D、双氢葫芦素E、双氢葫芦素I、双氢葫芦素Q、双氢葫芦素S、异葫芦素A、异葫芦素B、异葫芦素C、异葫芦素D、异葫芦素E、异葫芦素I、异葫芦素Q、异葫芦素S及其糖苷。

进一步地，本发明的药物组合物还可包含等渗调节剂和冻干保护剂，其中，等渗调节剂占药物组合物的0.5～10％(g／ml)，冻干保护剂占药物组合物的0～30％(g／ml)。所述的等渗调节剂选自葡萄糖、氯化钠、山梨醇、木糖醇和甘露醇。所述的冻干保护剂选自葡萄糖、木糖、神经节苷酯、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇、木糖醇和麦芽醇。

本发明药物组合物的剂型可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、软膏剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、气雾剂、栓剂、滴鼻剂、注射剂、脂质体、微球或纳米粒。

进一步地，本发明的药物组合物可用于制备降低葫芦素毒性的药物，也可以用于制备抗肝炎、退黄或抗癌的药物。

本发明人在研究过程中意外地发现，葫芦素与增溶剂的比例至关重要，并不是将葫芦素增溶至溶液态就可以降低葫芦素毒性。相反，只有当葫芦素与增溶剂的用量达到一定比例时才能起到降低其毒性的目的。同时，本发明人还意外的发现，在可降低葫芦素毒性的组方中，葫芦素与增溶剂之间的比例并不是越高越有利，当葫芦素与增溶剂的重量比大于1：3150时，按1.0mg／kg尾静脉注射给药后，实验小鼠开始出现死亡个体。

此外，本发明人还发现，抗氧剂和pH调节剂对葫芦素药物组合物的稳定性影响很大。当本发明的药物组合物中不加入任何抗氧剂时，制剂经80℃下放置30天之后含量降低接近20％，而加入抗氧剂的组别则含量几乎不变。将不同pH值的制剂于60℃下放置5天之后，在pH小于3.5的酸性介质或pH大于等于9.5的碱性介质中葫芦素B含量均有所下降，因此适宜的pH值为3.5～7.5、优选4.0～7.0、进一步优选5.0～6.5，而在pH4～7的介质中时葫芦素B的含量几乎无明显变化。

与现有技术相比，本发明带来了明显的技术效果，即，本发明的药物组合物显著降低了葫芦素的毒性，同时还增强了葫芦素的疗效；

另外，通过发明人的潜心研究，本发明药物组合物还进一步取得了优异稳定性的效果，并且可制备成例如片剂、胶囊剂、气雾剂、注射剂、脂质体等各种剂型，从而大大扩展了葫芦素的给药途径，满足了临床各类患病人群的需求。

具体实施方式

为了更清楚的理解本发明，以下通过实施例和试验例来对本发明作进一步的详细说明，但不仅限于此。

实施例1：葫芦素B注射液的制备

处方：

制备方法：将灭菌注射用水在70℃预热备用；将处方量的F68及葫芦素B加入到烧杯中，于70℃下搅拌至全部溶解，继续搅拌30min；磁力搅拌下注入同温度下的灭菌注射用水(其中溶解有20mg的EDTA钙钠)，搅拌至体系呈澄清透明溶液状，然后用灭菌注射用水稀释至1L，混匀后用枸橼酸调节pH值至6；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，分装于2mL棕色西林瓶中，每瓶1mL，充氮气，加塞，铝盖密封，121℃、10min灭菌，即得。

实施例2：葫芦素B注射液的制备

处方：

制备方法：称取处方量的葫芦素B、聚乙二醇1000十二羟基硬脂酸酯于70℃水浴下搅拌均匀，形成油相；称取处方量的F68、丙二醇、抗坏血酸和部分注射用水同样加热至70℃，待两相中物质完全溶解后，搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，然后用注射用水稀释至1L，混匀后用氢氧化钠调节pH值至5；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，分装于2mL棕色西林瓶中，每瓶1mL，充氮气，加塞，铝盖密封，121℃、10min灭菌，即得。

实施例3：葫芦素B冻干制剂的制备

处方：

制备方法：称取处方量的甘露醇和EDTA钙钠，用800mL灭菌注射用水将它们于70℃下完全溶解，预热备用，得水相；将处方量F68及葫芦素B于70℃下搅拌至全部溶解，得油相；待两相中物质完全溶解后，在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，灭菌注射用水稀释至1L，混匀后用苹果酸调节pH值至4.5；过0.22μm微孔滤膜，分装于3mL棕色西林瓶中，每瓶1mL，冻干，充氮气，加塞，铝盖密封，即得。

实施例4：葫芦素BE注射液的制备

处方：

制备方法：称取处方量的葫芦素BE、F68，于70℃水浴下搅拌均匀，形成油相；量取处方量的丙二醇、EDTA和部分灭菌注射用水同样加热至70℃，待两相中物质完全溶解后，在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，然后用灭菌注射用水稀释至1L，用富马酸调节pH值至5.5；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，分装于3mL棕色西林瓶中，每瓶2mL，充氮气，加塞，铝盖密封，121℃、10min灭菌，即得。

实施例5：葫芦素BE供注射用制剂的制备

处方：

制备方法：称取处方量的甘露醇和焦亚硫酸钠，用800mL灭菌注射用水将它们于70℃下完全溶解，预热备用，得水相；将处方量F68及葫芦素BE于70℃下搅拌至全部溶解，得油相；待两相中物质完全溶解后，在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，灭菌注射用水稀释至1L，用酒石酸调节pH值至5；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，经喷雾干燥后分装于5mL棕色西林瓶中，每瓶500mg(含葫芦素BE0.5mg)，加塞，铝盖密封即得。

实施例6：葫芦素D注射液的制备

处方：

制备方法：称取处方量的葫芦素D、大豆磷脂于70℃水浴下加热搅拌至完全溶解，形成油相；量取处方量的F68、山梨醇、EDTA和800mL注射用水，于70℃水浴下搅拌均匀，形成水相；在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，然后用注射用水稀释至1L，用枸橼酸调节pH值至6.5；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，分装于2mL棕色西林瓶中，每瓶1mL，充氮气，加塞，铝盖密封，121℃、10min灭菌，即得。

实施例7：葫芦素D供注射用制剂的制备

处方：

制备方法：称取处方量的海藻糖和亚硫酸氢钠，用800mL灭菌注射用水将它们于70℃下完全溶解，预热备用，得水相；将处方量F68及葫芦素D于70℃下搅拌至全部溶解，得油相；在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，灭菌注射用水稀释至1L，用枸橼酸调节pH值至4.8；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，经喷雾干燥后分装于3mL棕色西林瓶中，每瓶500mg(含葫芦素D0.2mg)，加塞，铝盖密封即得。

实施例8：葫芦素E注射液的制备

处方：

制备方法：称取处方量的葫芦素E、大豆磷脂于70℃水浴下加热搅拌至完全溶解，形成油相；称取处方量的F68、山梨醇、焦亚硫酸钠和800mL注射用水于70℃下搅拌均匀，形成水相；待两相中物质完全溶解后，在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，然后用注射用水稀释至1L，用枸橼酸调节pH值至5.5；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，分装于2mL棕色西林瓶中，每瓶1mL，充氮气，加塞，铝盖密封，121℃、10min灭菌，即得。

实施例9：葫芦素E供注射用制剂的制备

处方：

制备方法：称取处方量的海藻糖和EDTA钙钠，用800mL灭菌注射用水将它们于70℃下完全溶解，预热备用，得水相；将处方量F68及葫芦素E于70℃下搅拌至全部溶解，得油相；在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，灭菌注射用水稀释至1L，用酒石酸调节pH值至5；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，经喷雾干燥后分装于3mL棕色西林瓶中，每瓶500mg(含葫芦素E0.2mg)，加塞，铝盖密封即得。

实施例10：葫芦素B口服液的制备

处方：

制备方法：称取处方量的葫芦素B、聚氧乙烯氢化蓖麻油，搅拌均匀，形成油相；称取处方量的木糖醇、叔丁基对羟基茴香醚和800mL重蒸水，搅拌均匀，形成水相；将两相分别加热至70℃，待两相中物质完全溶解后，在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，枸橼酸调节pH值至5.8，重蒸水稀释至1L，过0.8μm微孔滤膜，分装于3mL棕色西林瓶中，每瓶2mL，充氮气，加塞，铝盖密封，100℃、30min灭菌，即得。

实施例11：异葫芦素B冻干制剂的制备

处方：

制备方法：称取处方量的甘露醇、焦亚硫酸钠，用800mL灭菌注射用水将它们于70℃下完全溶解，预热备用，得水相；将处方量F68及异葫芦素B于70℃下搅拌至全部溶解，得油相；待两相中物质完全溶解后，在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，灭菌注射用水稀释至1L，用半胱氨酸调节pH值至5；过0.22μm微孔滤膜，分装于2mL西林瓶中，每瓶1mL，冻干，即得异葫芦素B冻干制剂。

实施例12：双氢葫芦素D胶囊的制备

处方：

制备方法：按处方称取各组分，充分混匀后，灌装胶囊10000粒。

实施例13：异葫芦素Q片剂的制备

处方：

制备方法：称取处方量的异葫芦素Q、乳糖和F68，混合均匀后，加入1000g淀粉制成的10％淀粉浆，喷雾制粒，再加入PVP100g、硬脂酸镁100g、亚硫酸氢钠和枸橼酸，混合均匀后压制成10000片。

实施例14：不同比例的增溶剂对葫芦素毒性的影响

实验方法：

按照活性物质的不同，本实验分为葫芦素B、葫芦素BE、双氢葫芦素D和异葫芦素I共四组，每组取昆明小鼠83×20只，雌雄各半，禁食12h后随机分成83小组，每小组20只小鼠。具体分组如下：

一、葫芦素B组

第1小组：葫芦素B：F68(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)：

第2小组：葫芦素B：HS15(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)：

第3小组：葫芦素B：RH40(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第4小组：葫芦素B：TPGS(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第5小组：葫芦素B：吐温80(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第6小组：葫芦素B：PDLLA-mPEG2000(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第7小组：葫芦素B：F68-CHMC(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第8小组：葫芦素B：SE30(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第9小组：葫芦素B：Cremophor EL(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)。

二、葫芦素BE组

第1小组：葫芦素BE：F68(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第2小组：葫芦素BE：HS15(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第3小组：葫芦素BE：RH40(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第4小组：葫芦素BE：TPGS(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第5小组：葫芦素BE：吐温80(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第6小组：葫芦素BE：PDLLA-mPEG2000(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第7小组：葫芦素BE：F68-CHMC(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第8小组：葫芦素BE：SE30(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第9小组：葫芦素BE：Cremophor EL(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)。

三、双氢葫芦素D组

第1小组：双氢葫芦素D：F68(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第2小组：双氢葫芦素D：HS15(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第3小组：双氢葫芦素D：RH40(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第4小组：双氢葫芦素D：TPGS(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第5小组：双氢葫芦素D：吐温80(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第6小组：双氢葫芦素D：PDLLA-mPEG2000(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第7小组：双氢葫芦素D：F68-CHMC(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第8小组：双氢葫芦素D：SE30(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第9小组：双氢葫芦素D：Cremophor EL(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)。

四、异葫芦素I组

第1小组：异葫芦素I：F68(1：250、1：500、1：750、1∶1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第2小组：异葫芦素I：HS15(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第3小组：异葫芦素I：RH40(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第4小组：异葫芦素I：TPGS(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第5小组：异葫芦素I：吐温80(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第6小组：异葫芦素I：PDLLA-mPEG2000(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第7小组：异葫芦素I：F68-CHMC(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第8小组：异葫芦素I：SE30(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)；

第9小组：异葫芦素I：Cremophor EL(1：250、1：500、1：750、1：1000、1：1500、1：2000、1：3000、1：3250、1：3500)。

上述不同比例均为重量比。

阴性对照组均为：等体积的5％葡萄糖注射液。

阳性对照组分别为：0.1mg／mL葫芦素B溶液(溶剂为5％乙醇溶液)；0.1mg／mL葫芦素BE溶液(溶剂为5％乙醇溶液)；0.1mg／mL双氢葫芦素D溶液(溶剂为5％乙醇溶液)；0.1mg／mL异葫芦素I溶液(溶剂为5％乙醇溶液)。

按照实施例1的处方和制备方法，分别制备葫芦素B、葫芦素BE、双氢葫芦素D和异葫芦素I的注射液，这些注射液处方的不同之处在于药物和增溶剂的种类及重量比参照上述分组。

各组小鼠按葫芦素的剂量为1.0mg／kg进行尾静脉注射。

(2)、评价指标：

将各组药物溶液、阳性对照组和阴性对照组分别对小鼠进行尾静脉注射，然后记录24h内的存活率。

存活率的计算公式为：(存活的小鼠数量／试验小鼠总量)×100％。

小鼠的存活率越高，表明所注射制剂的毒性越低。

(3)、试验结果：

不同比例葫芦素和增溶剂制成的药物组合物对小鼠存活率的影响结果见表1。

表1不同比例葫芦素和增溶剂制成的药物组合物对小鼠存活率的影响

由表1可以看出，对于不同的增溶剂类型，当葫芦素与增溶剂的重量比在1：750～1：3000的范围内时，小鼠的存活率达到100％，与阴性对照组(葡萄糖组)相当，而各阳性对照组小鼠全部死亡。

此外，发明人还对葫芦素D、葫芦素E、葫芦素I和葫芦素Q与增溶剂中F68的比例进行了验证，结果表明，从小鼠的存活率来看，各种葫芦素与F68的重量比范围宜为1：600～1：3150、优选1：650～1：3100、还优选1：700～1：3050、进一步优选1：750～1：3000的范围，在1：750～1：3000内时，小鼠的存活率能达到100％，与阴性对照组(葡萄糖组)相当，而各阳性对照组小鼠全部死亡，即葫芦素与F68的重量比范围在1：600～1：3150内时能有效降低葫芦素的毒性。

另外，从给药后小鼠的毒性反应来看，当增溶剂与葫芦素的重量比小于600：1时，各组小鼠均表现出极为明显的毒副反应，如给药后30秒左右出现死亡个体、肌肉松弛、原地不动、呼吸加速、失去平衡、小鼠抽搐、闭目、蜷缩等，并且类似的毒副反应随着增溶剂与葫芦素的重量比的降低变的更为明显。而这从反面说明了葫芦素与增溶剂之间的比例对降低葫芦素毒性的重要性；上述实验也表明，并不是增溶剂与葫芦素的重量比越大越有利，当增溶剂与葫芦素的重量比大于3150：1时，各组小鼠也出现了不同程度的毒性反应，甚至死亡。

由此得出结论，将葫芦素与增溶剂的重量比在1：600～1：3150的范围内进行配制，可显著降低葫芦素的毒性。

实施例15：抗氧剂对葫芦素药物组合物稳定性的影响

按照实施例1中的方法制备葫芦素B注射液No.1-9，其中，注射液No.1不加任何抗氧剂；注射液No.2为实施例1的葫芦素B注射液；注射液3-9分别以亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、二硫代氨基甲酸钠、抗坏血酸、二叔丁基对甲酚、去甲二氢愈创木酸和EDTA替换EDTA钙钠作为抗氧剂。将上述葫芦素B注射液No.1-9在80℃下放置30天之后测定含量，将测得的含量与初始制剂的含量(换算为100％)做对比，求得百分比。结果如表2所示。

表2抗氧剂对葫芦素B注射液稳定性的影响

结果表明，不加任何抗氧剂的葫芦素B制剂经80℃下放置30天之后含量降低接近20％，而加入抗氧剂的组别则含量几乎不变，符合质量要求。由此可见，抗氧剂的加入对于葫芦素药物组合物的稳定性有很大影响。因此，本发明的组合物中应该加入适量的抗氧剂，确保以组合物制备的制剂在长期放置过程中含量稳定不变。

实施例16：pH调节剂对葫芦素药物组合物稳定性的影响

参照2005版《中国药典》配制pH2.0～12.0的PBS缓冲液，并以pH计进行校正，得不同pH值的磷酸缓冲液。

按照实施例1的方法制备葫芦素B注射液制剂共180mL，分成9份，每份20mL，用上述不同pH值的磷酸缓冲液调节pH值，依次为3.0～11.0，分别测定各pH值下的制剂的含量，作为初始含量，记为初始含量，为100％，之后将各pH值下的制剂于60℃下放置5天之后测定含量，将测得的含量与初始制剂的含量做对比，求得百分比。结果如表3所示。

表3pH对葫芦素B注射液稳定性的影响

结果表明，将不同pH值的制剂于60℃下放置5天之后，在pH小于3.0的酸性介质或pH大于等于8的碱性介质中葫芦素B含量均有所下降，而在pH3.5～7.5的介质中时葫芦素B的含量无明显变化。因此，为保证本发明药物组合物的稳定性，应将药物组合物的pH值维持在3.5～7.5的范围内。

实施例17：葫芦素B制剂对小鼠免疫性肝炎的保护作用

1.主要试剂：

实施例1的葫芦素B注射液；0.9％氯化钠注射液；卡介苗(BCG)，由北京结核病控制研究所提供；脂多糖(LPS)：由晶美生物工程广州分公司产品。

2.实验动物

健康昆明种小鼠，体重22-26克。

3.实验方法

取昆明种小鼠120只，雌雄各半，分成6组，空白对照组；模型组；联苯双酯组(150mg／kg.d)；葫芦素B高剂量组(1.00mg／kg.d)、葫芦素B中剂量组(0.50mg／kg.d)、葫芦素B低剂量组(0.25mg/kg.d)。除正常对照组外，其余5组小鼠尾静脉注射卡介苗5×10⁶个菌／鼠；各组小鼠在尾静脉注射卡介苗的当天开始尾静脉注射给药(正常对照组和模型对照组小鼠给予等量的0.9％氯化钠注射液)连续给药11d，每天1次，在末次给药前的16h再尾静脉注射脂多糖7.5μg／鼠，造成免疫性肝炎模型。眼眶放血，离心血清测定ALT、AST和ALB等生化指标。

4.实验结果

表4葫芦素B制剂对小鼠免疫性肝炎的保护作用

注：同模型组比较，*P>005，**P<0.05，***P<0.01

实验结果表明，葫芦素B注射液高、中、低剂量组及联苯双酯组均有降低免疫性肝炎模型小鼠血清ALT、AST的作用，即本发明所制备的葫芦素B制剂对小鼠免疫性肝炎有显著的保护作用。

实施例18：葫芦素B制剂的抗癌作用

1.主要试剂：

实施例1的葫芦素B注射液；0.9％氯化钠注射液。

2.实验动物

荷S180瘤的昆明种小鼠

3.实验方法

将28只接种S180肿瘤的昆明种小鼠随机分为4组(每组7只)：生理盐水对照组、葫芦素B高剂量组(1mg／kg，0.1ml／10g)、葫芦素B中剂量组(0.5mg／kg，0.1ml／10g)、葫芦素B低剂量组(0.25mg／kg，0.1ml／10g)。各组小鼠均于接种后第3天开始给药，给药方式为尾静脉注射，每隔2天给药1次，共给药8次，生理盐水组给予等量的生理盐水(0.1ml／10g体重)，于第8次给药后第三天，即接瘤后第27天将小鼠脱颈处死，完整剥离皮下肿瘤，称重，计算抑瘤率。

4.实验结果

表5给药后各组小鼠抑瘤率结果

实验结果表明，葫芦素B注射液高、中、低剂量组的抑瘤率均大于40％，这说明葫芦素B注射液高、中、低剂量组均能够有效抑制S180肿瘤。

实施例19：葫芦素B制剂的退黄作用

1.主要试剂：

实施例1的葫芦素B注射液；腺苷蛋氨酸片，雅培制药，500mg／片；0.9％氯化钠注射液；ANIT(a-萘异硫氰酸酯)，ACROS。

2.实验动物

健康昆明种小鼠，体重22-26克。

3.实验方法

取昆明种小鼠35只，体重22-26g，雄性，随机分为5组(每组7只)：正常组，模型组，腺苷蛋氨酸组(500mg／kg,0.1ml／10g)，葫芦素B高剂量组(1mg／kg,0.1ml／10g)、中剂量组(0.5mg／kg,0.1ml／10g)、低剂量组(0.25mg／kg,0.1ml／10g)。正常组和模型组给予等量的生理盐水(0.1ml／10g体重)。各组每日灌胃给药1次，于第8天灌胃给药后1小时，正常对照组等量大豆油灌胃，其余各组ANIT的油溶液(临用前用大豆油配制6mg／ml的溶液，按0.1ml／10g)灌胃。继续给药，于第10天给药后1h(中毒48h，禁食12h，自由饮水)，眼眶静脉丛取血，分离血清，用全自动生化分析仪检测血清总胆红素(TBIL)。

4.实验结果

表6给药后各组小鼠血清TBIL的水平

注：模型组vs正常对照组，**P<0.01；腺苷蛋氨酸组vs模型组，##P<0.01；CU-B高剂量组vs模型组，#P<0.01。

实验结果表明，腺苷蛋氨酸组(500mg／kg)和葫芦素B高／中剂量组能很好的降低血清总胆红素。

Claims (15)

1.一种葫芦素药物组合物，其特征在于，该药物组合物包含葫芦素、增溶剂、抗氧剂和pH调节剂，其中：pH调节剂的用量足以将药物组合物的pH值调至3.5～7.5；葫芦素与增溶剂的重量比为1∶600～1∶3150。

2.根据权利要求1所述的葫芦素药物组合物，其特征在于，所述pH调节剂的用量足以将药物组合物的pH值调至4.0～7.0。

3.根据权利要求2所述的葫芦素药物组合物，其特征在于，所述pH调节剂的用量足以将药物组合物的pH值调至5.0～6.5。

4.根据权利要求1所述的葫芦素药物组合物，其特征在于，葫芦素与增溶剂的重量比为1∶600～1∶3150，

5.根据权利要求4所述的葫芦素药物组合物，其特征在于，葫芦素与增溶剂的重量比为1∶650～1∶3100。

6.根据权利要求4所述的葫芦素药物组合物，其特征在于，葫芦素与增溶剂的重量比为1∶700～1∶3050。

7.根据权利要求4所述的葫芦素药物组合物，其特征在于，葫芦素与增溶剂的重量比为1∶750～1∶3000。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的葫芦素药物组合物，其特征在于，

增溶剂选自吐温20、吐温80、蔗糖脂肪酸酯、磷脂、泊洛沙姆188及其衍生物、泊洛沙姆237及其衍生物、泊洛沙姆338及其衍生物、泊洛沙姆407及其衍生物、聚丙交脂-聚乙二醇共聚物、聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯、蓖麻油聚烃氧酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯；

抗氧剂选自亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐、二硫代氨基甲酸盐、抗坏血酸、抗环血酸棕榈酸酯、氢基香豆素、维生素E、乙醇胺、没食子酸丙酯、叔丁基对羟基茴香醚、二叔丁基对甲酚、去甲二氢愈创木酸、EDTA和EDTA钙钠，抗氧剂的用量占药物组合物的0.00001～0.1％(g/ml)。

9.根据权利要求1～7中任一项所述的葫芦素药物组合物，其特征在于药物组合物还包含等渗调节剂和冻干保护剂，其中，等渗调节剂占药物组合物的0.5～10％(g/ml)，冻干保护剂占药物组合物的0～30％(g/ml)。

10.根据权利要求1～7中任一项所述的葫芦素药物组合物，其特征在于pH调节剂选自无机酸，有机酸，无机碱及对应的钠盐。

11.根据权利要求1～7中任一项所述的葫芦素药物组合物，其特征在于葫芦素是从葫芦科植物、十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数本科植物或真菌中提取的四环三帖化合物。

12.根据权利要求9所述的葫芦素药物组合物，其特征在于冻干保护剂选自葡萄糖、木糖、神经节苷酯、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、海藻糖、甘露醇、木糖醇和麦芽醇。

13.根据权利要求9所述的葫芦素药物组合物，其特征在于等渗调节剂选自葡萄糖、氯化钠、山梨醇、木糖醇和甘露醇。

14.权利要求1-13之一所述的葫芦素药物组合物在制备用于降低葫芦素毒性的药物中的用途，其中所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、软膏剂、混悬剂、糖浆剂、口服液、气雾剂、栓剂、滴鼻剂、注射剂、脂质体、微球或纳米粒。

15.权利要求1-13之一所述的葫芦素药物组合物在制备抗肝炎、退黄、抗癌药物中的用途。