CN111514290B - 一种葫芦素组合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种葫芦素与抗PD‑1及PD‑L1抗体的药物组合物及其应用。该组合物将葫芦素、抗PD‑1抗体及PD‑L1抗体联合使用，对于恶性肿瘤的治疗具有显著的协同疗效，尤其是在治疗乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌、肉瘤方面具有协同作用，具有意料不到的技术效果，为此类疾病患者带来新的希望，同时为研发新型肿瘤药物提供了科学依据，应用前景较广。

Description

一种葫芦素组合物及其用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种包含葫芦素、抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体的药物组合物及其抗肿瘤疾病特别是在治疗三阴乳腺癌和肉瘤中的用途。

背景技术

恶性肿瘤已经成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一，根据最新的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，且近十几年来恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势。恶性肿瘤中，乳腺癌位居我国女性恶性肿瘤死亡率的首位。三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)是雌激素受体(estrogen receptor，ER)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermalgrowth factorreceptor2，HER-2)均呈现阴性的乳腺癌，占乳腺癌发病率的15％。TNBC是乳腺癌的一种特殊亚型，肿瘤细胞缺乏ER、PR和HER-2有效的靶标，至今尚无较好的治疗方案。三阴性乳腺癌一般按乳腺癌常规靶向标准治疗进行，但治疗预后差、易发生侵袭转移，严重危及患者生命，死亡率高。肉瘤则是一种来源于间叶组织(包括结缔组织和肌肉)的恶性肿瘤，多发生于皮肤、皮下、骨膜及长骨两端。目前肉瘤的治疗方式主要有：外科手术、化疗和局部放疗。外科手术中，截肢或根治术是最常用方法，但疗效不理想，部分切除疗效也不理想，目前国内外均倾向保留肢体局部大部分切除再进行化放疗。但由于缺乏针对治疗的特效药物、放化疗治疗效果差等原因，肉瘤患者通常需要通过截肢手术进行治疗，极大地摧毁了患者的身心健全。对于恶性肉瘤而言，迫切需要一种更为有效的给药策略。

葫芦素(Cucurbitacins)属于19-甲基出现在C-9位上的一类四环三萜化合物，主要分布于葫芦科植物中，在十字花科、玄参科、秋海棠科、杜英科、四数木科等高等植物及一些大型真菌中也有发现。目前，我国批准生产的葫芦素(Cucurbitacin)为中药甜瓜蒂(别名：苦丁香)提取物，主要含葫芦素B、E等成分，现有的提取物中葫芦素B含量为60％以上。我国批准上市的葫芦素药物适应症为湿热毒盛所致迁延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌的辅助治疗，目前上市剂型有葫芦素片剂和葫芦素胶囊两种。

已有研究公开了葫芦素可应用于治疗乳腺癌。期刊文献“葫芦素B体外对乳腺癌细胞的生长抑制作用研究”(张美侠等，《实用药物与临床》2010年01期)公开了通过体外实验发现葫芦素B对人乳腺癌细胞的增殖具有抑制作用，诱导乳腺癌细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤效应。专利文献WO2008071968A中公开了葫芦素尤其是葫芦素B通过调节信号转导通路来抑制癌细胞的生长，例如乳腺癌中细胞的生长。专利文献CN106074567A中公开了使用葫芦素B抑制蛋白磷酸酶2A癌性抑制因子(CIP2A)，从而激活其底物抑癌蛋白PP2A活性来治疗胃癌、乳腺癌、肺癌、及神经胶质瘤。至今未见有关葫芦素B治疗三阴性乳腺癌及肉瘤的报道。

在肿瘤治疗的方案中，免疫治疗具有重要地位，特别是PD-1和PD-L1抗体药物。北京时间2018年10月1日下午17点半，公布了诺贝尔生理学或医学奖获奖者，分别为美国免疫学家詹姆斯·艾利森(James Allison)和日本生物学家本庶佑(Tasuku Honjo)，以表彰他们在“发现负性免疫调节治疗癌症的疗法”所做出的贡献。艾利森发现一种名为CTLA-4的蛋白起到了“分子刹车”的作用，从而终止免疫反应。抑制CTLA-4分子，则能使T细胞大量增殖、攻击肿瘤细胞。近十年来，PD-1/PD-L1通路阻断已被证明是在各种癌症适应症中诱导持久抗肿瘤应答的有效途径。虽然抗PD治疗用于治疗多种人类癌症的临床成功已经证实了这种方法，但发现和设计针对临床可应用的新适应症的开发仍是急需且必要的。

组合药物的研制已成为现代药物研发的新趋势。关于葫芦素B、PD-1及PD-L1抗体药物联合用于恶性肿瘤的治疗尤其是乳腺癌(三阴性乳腺癌)、肉瘤的治疗目前未有研究，对这三种药物的组合物进行研制可以为此类疾病患者提供新的治疗方法，亦为其他药物的组合提供新的研究策略。

发明内容

为克服上述现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种葫芦素与抗PD-1及PD-L1抗体的药物组合物及其应用。该组合物将葫芦素、抗PD-1抗体及PD-L1抗体联合使用，对于恶性肿瘤的治疗具有显著的协同疗效，尤其是在治疗乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌、治疗肉瘤方面均具有协同作用，具有意料不到的技术效果。

本发明的首要目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物包含葫芦素或其药学上可接受的盐、抗PD-1及PD-L1抗体。

本发明所述葫芦素或其药学上可接受的盐可以以游离或溶剂合物形式存在。例如可以通过吸收空气中的水分而以水合物形式存在。溶剂合物没有特别限制，只要其是药学上可接受的。具体地，溶剂合物优选为水合物、乙醇溶剂合物等。所述药学上可接受的盐包括与合适的有机或无机酸/碱成盐。

本发明的一个实施方式中，所述葫芦素或其药学上可接受的盐、抗PD-1及PD-L1抗体可以作为活性成分包含在同一制剂中。在另一个实施方式中，所述葫芦素或其药学上可接受的盐、PD-1及PD-L1抗体包含在不同的制剂中并且同时或不同时间施用。

本发明所述葫芦素中包含葫芦素B，所述葫芦素中葫芦素B的纯度为1％～100％(例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％)。优选的，本发明所述葫芦素中葫芦素B的纯度大于90％。更优选的，所述葫芦素中葫芦素B的纯度为100％。

本发明所述药物组合物中，葫芦素(以葫芦素B计)与PD-1及PD-L1抗体的重量比为1:5～50:2～40。优选的，本发明所述药物组合物中，葫芦素(以葫芦素B计)与抗PD-1及PD-L1抗体的重量比为1:10～40:5～30。更优选的，本发明所述药物组合物中，葫芦素(以葫芦素B计)与抗PD-1及PD-L1抗体的重量比为1:20～30:10～20。

本发明所述药物组合物可以与药学上可接受的载体制成适于人或动物使用的任何剂型。例如可以将所述药物组合物直接混合做成制剂；或者将所述药物组合物中的葫芦素或其药学上可接受的盐和抗PD-1及PD-L1抗体分别与相应的载体混合分别做成制剂，然后再按照常规的方式包装或结合在一起；或者，所述药物组合物中的葫芦素或其药学上可接受的盐和PD-1及PD-L1抗体分别与相应的载体混合后，再混合做成制剂。药学上可接受的载体是指作为制剂材料使用的各种有机载体物质或无机载体物质。药学上可接受的载体可举例如下，包括但不限于固体制剂中的赋形剂、润滑剂、粘合剂以及崩解剂，或液状制剂中的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、pH调节剂等。另外，可以根据需要使用防腐剂、抗氧化剂、着色剂以及甜味剂等添加剂。适于人或动物使用的任何剂型例如可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型包括但不限于溶液剂、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)；固体剂型包括但不限于片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸等；半固体剂型包括但不限于软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明的另一个目的是提供一种药物组合物在制备治疗乳腺癌疾病的药物中的用途。优选的，本发明提供一种药物组合物在制备治疗三阴性乳腺癌疾病的药物中的用途。所述药物组合物包含葫芦素或其药学上可接受的盐和抗PD-1及PD-L1抗体。

本发明的目的还包括提供一种药物组合物在制备治疗肉瘤疾病的药物中的用途。所述药物组合物包含葫芦素或其药学上可接受的盐和抗PD-1及PD-L1抗体。

本发明的其它目的还包括提供一种治疗乳腺癌疾病尤其是三阴性乳腺癌的方法。所述方法包括给患者使用有效量的药物组合物。所述药物组合物包含葫芦素或其药学上可接受的盐和抗PD-1及PD-L1抗体。

本发明的其它目的还包括提供一种治疗肉瘤疾病的方法。所述方法包括给患者使用有效量的药物组合物。所述药物组合物包含葫芦素或其药学上可接受的盐和PD-1及PD-L1抗体。

本发明中提供的药物组合物或者药物可以根据患者的性别、年龄、体重以及症状等，适当确定给药量，以达到有效量。有效量是指达到所希望的结果所必需的药物组合物或药物的量，是实现治疗或处置的状态进展的延迟、抑制、预防、逆转或治愈所必需的量。

本发明所述药物组合物的剂量，通常如下，葫芦素或其药学上可接受的盐(葫芦素B计)剂量0.1～1mg/kg，优选0.2～0.8mg/kg，最优选0.3～0.6mg/kg；抗PD-1抗体的给药剂量为1～50mg/kg，优选5～20mg/kg，最优选10～20mg/kg；抗PD-L1抗体的给药剂量为1～20mg/kg，优选5～10mg/kg。可以一天一次或者分多次给药。当分多次给药药物组合物时，该药物组合物优选一天给药1～4次。另外，也可以以每天、每隔一天、每周一次、每隔一周、每月一次等各种给药频率对药物组合物进行给药。优选地，给药频率很容易由医生等确定。另外，根据需要，可以使用超出上述范围的量。

根据本发明所述的药物组合物，也可以与其它抗癌剂并用。并用是指在规定期间内将药物组合物和抗癌剂对同一患者给药。并用时，优选将药物组合物与抗癌剂在时间上同时给药，不过也可以在一个的效果仍然存在的期间给药另一个，在时间上前后分别单独给药。在并用中，药物组合物以及抗癌剂的给药途径可以相同，也可以不同。

并用的抗癌剂没有特别限制，只要对乳腺癌或肉瘤有效，作为抗癌剂可以列举，例如，烷基化剂、抗代谢剂、抗癌抗生素、植物生物碱、铂制剂(铂化合物制剂)、生物治疗剂、激素剂以及分子靶标药等。作为抗癌剂，具体可以列举顺铂、卡铂、奥沙利铂、环磷酰胺、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、阿霉素、伊立替康、盐酸吉西他滨、替加氟尿嘧啶、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、拉帕替尼、来那替尼、索拉非尼、吉非替尼、舒尼替尼、厄洛替尼、坦西莫司、依维莫司、哌泊赛克雷以及多西他赛等。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明将葫芦素(尤其是葫芦素B)和抗PD-1及PD-L1抗体联合使用，对乳腺癌特别是三阴性乳腺癌以及肉瘤的治疗具有显著的协同疗效，为此类疾病患者带来新的希望，同时为研发新型肿瘤药物提供了科学依据，应用前景广。

(2)本发明将葫芦素(尤其是葫芦素B)和抗PD-1及PD-L1抗体组合，一方面可以多靶点、多通路调节抑制乳腺癌细胞、肉瘤细胞的生长和增殖；另一方面葫芦素(尤其是葫芦素B)和抗PD-1及PD-L1抗体联合使用，对细胞的毒副作用小，安全方面也有所保证。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通与/或改变都将落入本发明保护范围。

实施例1注射液

处方：

制备方法：将灭菌注射用水在70℃预热备用；将处方量的F68及葫芦素B(纯度大于99％)加入到烧杯中，于70℃下搅拌至全部溶解，继续搅拌30min；磁力搅拌下注入同温度下的灭菌注射用水(其中溶解有20mg的EDTA钙钠)，搅拌至体系呈澄清透明溶液状，然后用灭菌注射用水稀释至1L，混匀后用枸橼酸调节pH值至6；向其中加入适量活性炭，室温下搅拌30min之后，过滤除去活性炭；过0.22μm微孔滤膜，分装于2mL棕色西林瓶中，每瓶1mL，充氮气，加塞，铝盖密封，121℃、10min灭菌，即得。

实施例2冻干制剂

处方：

制备方法：称取处方量的甘露醇和EDTA钙钠，用800mL灭菌注射用水将它们于70℃下完全溶解，预热备用，得水相；将处方量F68及葫芦素B(纯度大于99％)于70℃下搅拌至全部溶解，得油相；待两相中物质完全溶解后，在磁力搅拌的条件下，将水相缓慢加入油相中，继续搅拌30min，灭菌注射用水稀释至1L，混匀后用苹果酸调节pH值至4.5；过0.22μm微孔滤膜，分装于3mL棕色西林瓶中，每瓶1mL，冻干，充氮气，加塞，铝盖密封，即得。

实验例1不同给药方案的抗4T1肿瘤研究

实验材料：选择小鼠乳腺癌4T1细胞(中科院上海细胞库)作为三阴乳腺癌模型。

PD-1抗体：InVivoMab anti-mouse PD-1(CD279)、PD-L1抗体：InVivoMab anti-mouse PD-L1(B7-H1)，均来自于BioXcell公司。

实验方法：从液氮中取出保存的小鼠乳腺癌4T1细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的4T1细胞悬液进行体外培养，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将4T1细胞混悬液接种于Balb/c小鼠乳房垫上，共接种42只，将小鼠随机分成7组，每组6只。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm³后开始给药(腹腔注射，葫芦素B、PD-1及PD-L1按照表1分组及剂量分别进行注射给药，葫芦素B使用实施例1注射液，PD-1和PD-L1直接注射)，每3天1次，共给药5次(接种后第8、11、14、17与20天)，对照组给予0.9％氯化钠注射液。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量、死亡事件等数据。抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤的平均质量－实验组肿瘤的平均质量)/对照组肿瘤的平均质量×100％。结果见表1。

表1不同给药方案对小鼠4T1抑制作用实验结果

实验结果：由表1可知，单独使用葫芦素B几乎没有抗三阴乳腺癌作用，葫芦素B与抗PD-1、PD-L1抗体联合使用具有明显的抗三阴乳腺癌的协同作用。

实验例2不同给药方案的抗S180研究

实验材料：选择S180肉瘤细胞(中科院上海细胞库)作为肉瘤模型。

PD-1抗体：InVivoMab anti-mouse PD-1(CD279)、PD-L1抗体：InVivoMab anti-mouse PD-L1(B7-H1)，均来自于BioXcell公司。

从液氮中取出保存的S180细胞冻存管，迅速置于37℃水中复苏。将复苏的S180细胞悬液接种于昆明小鼠腹腔内。6～8天后在无菌条件下抽取乳白色粘稠腹水，在倒置显微镜下计数，当肿瘤细胞活度大于95％时加生理盐水稀释成细胞混悬液并调整稀释倍数。采用75％酒精消毒，将S180细胞混悬液接种于小鼠右前腋下的皮下组织，每只小鼠接种0.2mL，共接种42只，随机分成7组，每组6只。各组小鼠均于肿瘤体积到达100mm³后开始给药(腹腔注射，葫芦素B、PD-1及PD-L1按照表2分组及剂量分别进行注射给药，葫芦素B使用实施例1注射液，PD-1和PD-L1直接注射)，每3天1次，共给药5次，对照组给予0.9％氯化钠注射液。在整个药效学试验期间，记录肿瘤体积、体质量、死亡事件等数据。抑瘤率(％)＝(对照组肿瘤的平均质量－实验组肿瘤的平均质量)/对照组肿瘤的平均质量×100％。结果见表2。

表2不同给药方案对小鼠S180抑制作用实验结果

由表2结果可知，单独PD-1和单独PD-L1没有抗肿瘤效果，葫芦素B同时联合PD-1与PD-L1的三药治疗方案的抗肉瘤S180的抑瘤率最高，具有明显的协同治疗作用。

Claims (19)

1.一种药物组合物，所述药物组合物包含葫芦素或其药学上可接受的盐、抗PD-1及PD-L1抗体，其中葫芦素或其药学上可接受的盐，以葫芦素B计与抗PD-1及PD-L1抗体的重量比为1:5～50:2～40。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：其中葫芦素或其药学上可接受的盐，以葫芦素B计与抗PD-1及PD-L1抗体的重量比为1:10～40:5～30。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：其中葫芦素或其药学上可接受的盐，以葫芦素B计与抗PD-1及PD-L1抗体的重量比为1:20～30:10～20。

4.如权利要求1-3任一项的药物组合物，其特征在于：其中所述葫芦素或其药学上可接受的盐中包含葫芦素B，所述葫芦素中葫芦素B的纯度为大于90%。

5.如权利要求1-3任一项的药物组合物，其特征在于：所述葫芦素或其药学上可接受的盐、抗PD-1及PD-L1抗体作为活性成分包含在同一制剂或不同制剂中。

6.如权利要求1-3任一项的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物可以与药学上可接受的载体制成适于人或动物使用的剂型。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述剂型选自液体剂型、固体剂型或半固体剂型。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于：所述液体剂型选自溶液剂、混悬剂、注射剂；固体剂型选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸；半固体剂型选自软膏剂、凝胶剂、糊剂。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述注射剂选自水针剂、粉针剂或者输液；片剂选自普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片或者口腔崩解片；胶囊剂选自硬胶囊、软胶囊或者肠溶胶囊。

10.权利要求1-9任意一项药物组合物在制备治疗乳腺癌疾病的药物中的用途，所述乳腺癌疾病为三阴性乳腺癌。

11.权利要求1-9任意一项药物组合物在制备治疗肉瘤疾病的药物中的用途。

12.如权利要求10-11任一项所述的用途，其中所述葫芦素或其药学上可接受的盐，以葫芦素B计，给药剂量0.1～1mg/kg。

13.如权利要求10-11任一项所述的用途，其中所述葫芦素或其药学上可接受的盐，以葫芦素B计，给药剂量0.2～0.8mg/kg。

14.如权利要求10-11任一项所述的用途，其中所述葫芦素或其药学上可接受的盐，以葫芦素B计，给药剂量0.3～0.6mg/kg。

15.如权利要求10-11任一项所述的用途，其中所述抗PD-1抗体的给药剂量为1～50mg/kg。

16.如权利要求10-11任一项所述的用途，其中所述抗PD-1抗体的给药剂量为5～20mg/kg。

17.如权利要求10-11任一项所述的用途，其中所述抗PD-1抗体的给药剂量为10～20mg/kg。

18.如权利要求10-11任一项所述的用途，抗PD-L1抗体的给药剂量为1～20mg/kg。

19.如权利要求10-11任一项所述的用途，抗PD-L1抗体的给药剂量为5～10mg/kg。