CN103725694A - 甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT2类基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开两种来源于甘蔗的蔗糖转运蛋白ShSUT2类基因与应用。该类蔗糖转运蛋白基因ShSUT2A、ShSUT2B：氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2、4所示；编码基因ShSUT2A、ShSUT2B碱基序列分别如SEQ ID NO：1、3所示。经过酵母蔗糖吸收缺失功能突变体表明：ShSUT2A和ShSUT2B编码蛋白均具备蔗糖转运活性。它们负责甘蔗植株体内质外体中蔗糖的吸收，参与甘蔗植株蔗糖运输、分配、积累的生理过程。本发明的基因可为改善甘蔗蔗糖运输和分配效率，促进植株生长发育，提高甘蔗产量及糖含量方面提供新途径。

Description

甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT2类基因与应用

技术领域

本发明涉及植物蔗糖转运蛋白编码基因与应用，特别是甘蔗ShSUT2类蔗糖转运蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

甘蔗是一种重要的糖料和能源作物。甘蔗产蔗糖达到世界范围内的70%，占我国食糖产量的92%；甘蔗还用于生产生物燃料酒精和发电等。目前提高甘蔗产量的途径，一方面是通过扩大种植面积，一方面是通过选育和推广优良甘蔗高糖高产新品种或高纤维能源甘蔗新品种。常规育种仍然是培育甘蔗优良品种的主要手段。然而受到甘蔗种质资源遗传背景狭窄、花期不同、育种目标相关性状遗传规律，生理指标研究不够深入等因素限制了甘蔗常规育种的发展，在我国仍缺乏即高糖又高产及能源型甘蔗新品种。甘蔗分子育种多集中于抗病、抗逆品种等方面的研究，仍未有高糖高产品种的报道。高糖品种选育仍是甘蔗育种的重要目标。

通过常规育种进行的高糖品种选育受到了限制，国内外科学家也已经致力于提高甘蔗糖分的分子育种研究，如对甘蔗内源蔗糖和葡萄糖代谢关键酶（液泡酸性转化酶、中性转化酶、蔗糖磷酸合成酶、醛缩酶、UDP葡萄糖水解酶）基因进行改造，转基因甘蔗植株总蔗糖含量没有提高；另外将外源蔗糖异构酶基因、洋蓟果糖基转移酶基因等导入甘蔗中，蔗糖含量下降，酶合成糖类物质含量上升，总糖含量并未提高。甘蔗体内蔗糖积累是一个动态的过程，受多种因素影响，如内在因素（光合作用效率、蔗糖代谢关键酶活性、光合同化物的输出能力、激素等）和外在因素（温度、水分、营养、病虫害、倒伏等），对于甘蔗体内单一基因的改造并没有从根本上提高甘蔗的糖含量，急需进一步深入研究甘蔗蔗糖含量和产量性状的分子遗传机制，发现蔗糖积累调控的关键控制点，才能使甘蔗的遗传改良发生质的变化。

目前关于甘蔗蔗糖积累的分子遗传机制仍不清楚，报道的功能明确的内源调控基因较少。基于高糖和能源甘蔗育种的研究现状和重要性，有必要发掘甘蔗中的蔗糖积累调控关键基因。蔗糖转运蛋白家族基因是目前研究植物碳水化合物运输和分配分子调节机制的热点基因，该类基因在蔗糖的输出、长距离运输以及碳水化合物的分配方面起重要调节作用，并调节植物的生长发育、品质形成和对逆境的适应性等。因此，分离与鉴定甘蔗中蔗糖转运蛋白基因，有利于阐明甘蔗蔗糖积累机制，并通过基因工程手段应用于高糖和能源型甘蔗的定向分子育种。

发明内容

本发明的目的是提供了植物蔗糖转运蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白（ShSUT2)，是一种蔗糖转运蛋白，来源于甘蔗（Saccharumofficinarum L.),是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列2和4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列2和4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且参与蔗糖转运的由序列2和4衍生的蛋白质。

序列表中序列2由598个氨基酸残基组成，而序列表中序列4由592个氨基酸残基组成，都具有GPH-Sucrose super family的保守结构域和MelB domain序列。

为了便于ShSUT2的纯化，可在由序列2和4的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基端或羧基端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5	RRRRR
Poly-His	2个-10(通常为6	HHHHHH
			FLAG	8个	DYKDDDDK

Strep-tagll	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b)中的ShSUT2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b)中的ShSUT2的编码基因可通过将序列表中序列1和3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1和3所示的标签的编码序列得到。

编码上述蔗糖转运蛋白的基因（ShSUT2)也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列1和3所示核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中的序列1和3所示的DNA分子；

3)在严格条件下可与1)或2)限定的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列1由1797个碱基组成，其开放阅读框架（ORF)为自5’末端第1-1797位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2的ShSUT2A蛋白。

序列表中的序列3由1779个碱基组成，其开放阅读框架（ORF)为自5’末端第1-1779位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列4的ShSUT2B蛋白。

上述严格条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

含上述编码基因的转基因细胞系、重组载体以及重组菌株也属于本发明的保护范围之内。

扩增上述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围之内。

上述的编码基因基因在在改良农作物性状中的应用也属于本发明的保护范围之内。

本发明的基因ShSUT2具有蔗糖转运蛋白的转运功能，能恢复酵母突变体，有助于了解植物生长发育过程中潜在的内外部因素对蔗糖转运蛋白调控的作用机理，为揭示蔗糖转运机制对植物生长发育和品质改良的调节功能，为提高作物产量与改良品质的基因工程研究提供遗传学依据。

附图说明

图1为RNA提取电泳图；

图2为ShSUT2基因3’端序列扩增电泳图；

图3为ShSUT2基因5’端序列扩增电泳图；

图4为ShSUT2基因全长序列扩增电泳图；

图5为ShSUT2结构域示意图；

图6为ShSUT2亲疏水性预测；

图7为ShSUT2跨膜结构模式图；

图8为pDR-SUT2A、pDR-SUT2B酶切电泳图；

图9为含有pDR-SUT2A和pDR-SUT2B SuSy7在蔗糖培养基上生长图；

图10为ShSUT2类基因不同茎节相对表达量；

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rded.)或酵母遗传法实验指南（Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring HarborLaboratory CourseManual，Adams A et al编，Cold Spring Harbor Laboratory,1998出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一ShSUT2基因全长编码区的克隆与分析

1.总RNA的提取

取0.1克新鲜甘蔗7-9节茎（从生长点向下数），削成片状，于液氮中研磨成粉末；加入1mL Trizol（Gibco，Japan），按照试剂盒使用说明提取总RNA,进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2.cDNA第一链的合成

取甘蔗总RNA5μg与反转录引物（oligo-（dT）接头引物）1μL（10pmol/L）混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃15min，最后放入-80℃保存备用。

3.引物设计依据，引物合成的方法

从GenBank中下载近源物种（如玉米、高粱、水稻等）蔗糖转运蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计简并引物，扩增片段大小约为400bp。引物设计后交给上海生物工程生物公司合成。

引物序列为：

ShSUT2F：5’-GTGTTGGTGTYTGGAGTGAY-3’

ShSUT2R：5’-ACAAGCTTCACAGCAKGCTCTTG-3

4.甘蔗SUT2基因序列的克隆

以上述合成的第一链cDNA作为模板，用保守引物进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl23μL，2.5mmol/L dNTP2μL，10nmol/L引物ShSUT2F和ShSUT2R各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为，95℃5min，一个循环，95℃1min，50℃1min，72℃1min，35个循环，72℃6min，4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，结果如图2所示，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD－18T载体中，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经酶切检测后，将具有插入片段的质粒DNA交上海生物工程生物公司进行双向测序。

根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术（Rapid Amplification of cDNA ends,RACE）对目的基因的3’和5’末端进行PCR扩增。

在3’RACE中，利用半巢式（semi-nested）PCR方法，首先由外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物稀释50倍后，取1μL作为模板，利用内侧和接头引物再进行PCR扩增。

反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl23μL,2.5mmol/LdNTP2μL，10nmol/L正反向引物各2μL，Taq酶1.2U，用PCR水将反应体系补充至50μL。

反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸7min；4℃保温。

基因外侧引物：5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’

基因内侧引物：5’-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’

接头引物：5’-GGCCACGCGACTAGTAC-3’

在5’RACE中，利用末端转移酶和dATP在cDNA末端加上poly（A）尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和Oligo（dT）进行第一次PCR扩增，所得PCR产物取1μL作为模板，再利用内侧引物和OligodT进行第二次PCR扩增。反应体系及反应条件同3’RACE。

基因外侧引物：5’-GATCTCTTCAGCGAAGTACAGG-3’

基因内侧引物：5’-CACAAGCTTCACAGCAGGCTCTTGTCGTTAG-3’

Oligo-dG：5’-GGGGGGGGGGGGGGGH-3’

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，结果如图3所示，将PCR产物纯化后，克隆到pMD－18T载体（TaKaRa公司）中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），挑取阳性克隆，交上海生物工程生物公司进行双向测序，测序所得序列再与保守区引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。最终得到ShSUT2基因全长cDNA的拼接序列。

5.基因全长序列获得

具体的引物序列如下：

SUT2Fq：5’-AGCCTGAGCCCCAGATCTCACT-3’

SUT2Rq：5’-ATGGGCGGCTCTTACATACACT-3’

以上述步骤2反转合成第一链cDNA为模板。反应条件为：95℃10min，95℃1min，60℃1min，72℃3min，35个循环，72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准（北京全式金生物技术有限公司）的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为2000bp左右的目的片段，结果如图4所示。回收并纯化PCR产物，将其连接到PMD-18T载体（TaKaRa公司）上，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司），筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，对测序结果进行BLAST分析。测序结果编码区序列如序列1和3所示，经分析表明，该片段长分别为1797bp和1779bp，命名为ShSUT2A、ShSUT2B，其编码598和592个氨基酸的蛋白，将其编码的蛋白（氨基酸序列如序列表中序列2和4所示）命名为ShSUT2A和ShSUT2B

实施例二、ShSUT2及其编码蛋白的生物信息学分析

利用DNAMAN和OMIGA软件对实施例1获得的ShSUT2的全长cDNA序列进行生物信息学分析，ShSUT2A该序列全长1797bp，编码由598个氨基酸残基组成的蛋白质。ShSUT2B该序列全长1779bp，编码由592个氨基酸残基组成的蛋白质，ShSUT2的结构示意图如图5所示。用在线Blast工具分析ShSUT2的结构域，结果表明，该蛋白属于GPH sucrose superfamily，表明该蛋白是SUT家族中的一员。用膜蛋白在线预测工具TopPred2预测该蛋白的疏水性(图6)和是一个12次跨膜的蛋白（图7)，符合蔗糖转运蛋白家族结构，说明属于蔗糖转运蛋白家族。

实施例三、ShSUT2在酵母突变体中的功能分析

将实施例1扩增得到的ShSUT2基因通过含有SpeⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物扩增（引物序列F：5’-GGACTAGT AGCCTGAGCCCCAGATCTCACT-3’，R：5’-GGATGGGCGGCTCTTACATACACT-3’)，将扩增得到的目的片段回收并纯化，将其连接到pMD-19T simple(TaKaRa Code：D104A)载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，扩增出的片段具有序列2中的编码区的核苷酸序列。提取测序结果正确的克隆中的质粒，用SpeⅠ和XhoⅠ酶切后插入到通过同样酶切的酵母表达载体PDR196的SpeⅠ和XhoⅠ酶切位点间，将获得的重组载体命名为PDR196-ShSUT2。酶切结果见附图8。将重组载体PDR196-ShSUT2导入到SUT基因功能缺失的酵母突变体SUSY7株系中，用转入PDR196空载体的转基因酵母和作为负对照。其中，酵母表达载体PDR196记载的文献是：Kühn C,Quick WP，Schulz A,Riesmeler TW,Sonnewald U,FrommerWB(1996).Companion cell-specific inhibition of the potato sucrose transporterSUT1.Plant Cell Environ.19:1115-1123，公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得；酵母突变体SUSY7/ura3株系：记载的参考文献：Rlesmeier JW,Willmitzer L,Frommer WB(1992).Isolation and characterization of a sucrose carriercDNA from spinach by functional expression in yeast.EMBO J.11:4705-4713,公众可从中国热带农业科学院热带生物技术研究所获得。

将转PDR196-ShSUT2的转基因酵母、转PDR196空载体的转基因酵母分别分别涂在蔗糖为唯一碳源的MD培养基（1.7g/L无氨基酸酵母氮源，2%蔗糖，5g/L硫酸铵，20mg/L色氨酸和1.5%琼脂，调整PH=5.0)平板上进行30℃连续培养5天。观察酵母菌落生长情况。图9为蔗糖为唯一碳源的MD培养基中a、b、c生长情况。a为转入空载体PDR196的酵母菌株（作为负对照）的生长情况b表示转入ShSUT2A的转基因酵母菌株系的生长，c表示转入ShSUT2B的转基因酵母菌株系的生长。结果表明，在蔗糖为唯一碳源的MD培养基中，a不能正常生长，b、c则能正常生长。结果说明ShSUT2能够编码有功能的ShSUT2蛋白，可互补蔗糖转运蛋白功能缺失的酵母突变体株系，使其正常生长。

实施例四、ShSUT2在不同组织表达模式分析

取成熟期的甘蔗进行不同组织半定量分析。分别通过RT-PCR(引物为：ShSUT2：F:5'-ACGGTGTTGTTGGCGSSGTC-3';R:5'-CTCTCTGTGTATGGTTATCGGGTTC-3';Actin F:5'-CACGGCCACTGGAAGCA-3',R:5'-TCCTCAGGGTTCCTGATGCC-3'，反应条件为：94℃4min；94℃30s,55℃30s,72℃30s，28个循环)结果（如图10)表明，无论是未成熟茎节还是成熟茎节中ShSUT2类基因相对表达量差别明显，可能具有蔗糖信号感应功能并同时具有调节功能类蔗糖转运蛋白，主要影响甘蔗的生长,同时可能具备调节糖分的积累能力。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

Claims (6)

1.甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT2类基因，其特征在于：包括蔗糖转运蛋白基因ShSUT2B；

1）ShSUT2B其氨基酸如SEQ ID NO：4所示；

2）将SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残疾的取代和/或缺失和/或添加且与植物蔗糖转运相关的由1）衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT2的编码基因，其特征在于：

1）其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO：3的基因；

2）在严格条件下可与1）限定的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；

3）与1）限定的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.含有权利要求2所述基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。

4.扩增权利要求2所述基因的全长或任一片段的引物对。

5.权利要求2所述的甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT2的编码基因在培育高产高糖转基因甘蔗中的应用。

6.权利要求2所述甘蔗蔗糖转运蛋白ShSUT2类基因在蔗糖转运缺失酿酒酵母突变体中的应用。

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