CN101928336B - 一种缺磷反应调控蛋白及其编码基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种缺磷反应调控蛋白及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物吸收磷相关的由序列1衍生的蛋白质。将蛋白的编码基因导入植物，增加了转基因植株对磷的吸收，使其含磷量极显著增高，改善了其磷营养状况，植株的株高、根长均得到明显增加。在同样的土壤肥力的条件下，特别是低磷条件下，转基因植株可以少施肥，减少土壤环境污染，节约资源。本发明对植物，特别是小麦、水稻和棉花等粮食和经济作物的品种改良种将发挥重要的作用，应用前景广阔。

Description

一种缺磷反应调控蛋白及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种缺磷反应调控蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

磷是植物生长所必需的大量营养元素之一，它不仅是植物细胞中ATP、核苷酸和磷脂的重要组成成份，而且在能量转移、蛋白激活和碳氮代谢中起着非常重要的调节作用。土壤中绝对磷含量通常很高(＞1000μM)，但磷在土壤中极易以有机和无机形式固定，因而有效磷的浓度非常低，大约在2-10μM，扩散到根表面的更少，很难满足植物生长发育的需要。在农业生产中，解决土壤缺磷问题的主要途径是向土壤中大量施用磷肥，从而满足植物生长需要，但这不仅会引起农产品成本的增加，而且会造成地质环境的破坏。因此，如何提高植物从土壤中吸收养分的能力从而降低农业成本以及保持环境已成为我们所面临的亟待解决的重要课题。鉴定和分离磷高效吸收利用相关基因，利用基因工程技术改造和改良农作物耐低磷能力和提高磷的吸收利用效率，对培育资源节约型的磷高效农作物新品种，有着重要的理论意义和经济价值。

缺磷反应调控基因的克隆是理解植物如何适应缺磷胁迫的关键。目前对植物适应缺磷的调控基因已有一定的了解，其中一个重要进展是拟南芥AtPHR1基因的克隆。PHR1是高等植物中第一个被确认的调控缺磷反应的调控因子，与在单细胞绿藻Ch1amydomonas中发现的缺磷反应调控因子CrPSR1均属于MYB家族。拟南芥phr1突变体中许多缺磷诱导表达的基因(统称PSI基因)在缺磷条件下的表达不再增强，或增强的幅度被显著降低，这些基因包括PHT1基因，酸性磷酸酶基因，RNA酶基因等。一些研究证明拟南芥、水稻和大麦中许多PSI基因的启动子区含有可与PHR1结合的P1BS调控元件(GNATATNC)。

发明内容

本发明的目的是提供一种缺磷反应调控蛋白及其编码基因和应用。

本发明提供的蛋白来源于小麦属小麦(Triticum aestivum Linn.)，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物吸收磷相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。

所述基因可为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’末端第1至1353位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物吸收磷相关蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物吸收磷相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为pBINPLUS-TaPHR1-EGFP；所述pBINPLUS-TaPHR1-EGFP是将限制性内切酶Sac I和Xho I双酶切重组质粒乙得到的小片段和限制性内切酶SacI和Sal I双酶切pBinplus得到的大片段连接得到的；所述重组质粒乙是将所述基因插入重组质粒甲的Sal I和BamH I酶切位点之间得到的；所述重组质粒甲是将EGFP基因插入pJIT163载体的BamH I和EcoRI酶切位点之间(35S启动子下游)得到的。所述EGFP基因具体可如序列表的序列3自5’末端第4至765位核苷酸所示。

扩增所述基因的全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到吸收磷的能力和/或低磷环境中生长能力高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物，如拟南芥。所述生长能力高具体体现为主根长度长和/或平均根毛长度长。

本发明还保护所述基因在植物育种中的应用。

转TaPHR1基因株系的含磷量极显著高于野生型植株，TaPHR1过表达后增加了转基因植株对磷的吸收，从而可改善植株的磷营养状况，使得植株的株高，根长与野生型植株相比均得到明显增加。由于过表达TaPHR1可增加植物的吸磷能力，因而在同样的土壤肥力的条件下，特别是低磷条件下，TaPHR1转基因植株可以少施肥，减少土壤环境污染，节约资源。本发明的基因及其编码蛋白在植物中，特别是小麦，水稻和棉花等粮食和经济作物的品种改良中将发挥重要的作用，应用前景广阔。

附图说明

图1为pBinplus-TaPHR1-EGFP的结构示意图

图2为转基因拟南芥植株根系中EGFP荧光显示结果。

图3为转基因拟南芥在高磷(200μM Pi)和低磷(5μM Pi)条件下的基因表达量。

图4为转基因拟南芥在高磷(200μM Pi)和低磷(5μM Pi)条件下的生长情况。

图5为转基因拟南芥在高磷(200μM Pi)和低磷(5μM Pi)条件下植株根系和地上部的磷含量。

图6为转基因拟南芥在高磷(200μM Pi)和低磷(5μM Pi)条件下植株根系的生长情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株，T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

小麦品种小偃54：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Xinghong Yang et al.，Journal of Plant Physiology，3：318-326。

pJIT163载体：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Guerineau et al.，Plant Molecular Biology，1992，18：815-818。

质粒pBinplus：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：van Engelen FA，Trangenic Research，1995，4：288-290。

农杆菌GV3101：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Jun Miao et al.，2009，Journal of Genetics and Genomics，2009，8：455-466。

哥伦比亚生态型拟南芥(WT)：公众可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献：Jun Miao et al.，2009，Journal of Genetics and Genomics，2009，8：455-466。

实施例1、TaPHR1蛋白及其编码基因的发现

根据拟南芥的AtPHR1(At4g28610)和绿藻的CrPSR1(AF174480)的氨基酸序列，搜查NCBI dbEST数据库，根据同源型、预测氨基酸序列的长度和结构域分析，获得可能编码PHR1基因的小麦EST序列，它们分别为BE419425、BE591320、BQ806133、CA650533、CD453381、CD886393和CK210329，并用软件进行比对分析。

设计引物，以小麦(小麦品种小偃54)cDNA为模板扩增目的片段。测序后获得1条约1.5kb的cDNA序列，含有1个完整的ORF，推测编码451个氨基酸残基组成的多肽，大小与AtPHR1(409aa)接近，并含有典型的MYB和Coiled-coil结构域。

将序列表的序列1所示的蛋白命名为TaPHR1蛋白，由451个氨基酸残基组成。将TaPHR1蛋白的编码基因命名为TaPHR1基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示(1356bp)。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、TaPHR1基因的克隆

用Invetrogen公司的Trizol试剂提取小麦品种小偃54的总RNA，DNase I(RNase-free)处理后，取4μg用Promega公司的M-MLV反转录酶进行反转录合成cDNA第一链，用其作为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(TaPHR1基因)。

PCR引物(正向引物中引入Sal I酶切位点；反向引物中去除终止密码子TAA，并引入BamH I酶切位点)序列如下：

正向引物：5′-TCAGTCGACATGAGGAGGTGTGATCTGAG-3′；

反向引物：5′-AGTGGATCCACTATCATGCACCCTTC-3′。

PCR反应体系：超纯水39.5μl、10×PCR buffer 5μl，模板2μl，浓度为10μM的正、反向引物各1μl，Pfu酶(5u/μl)0.5μl、dNTPs(10mM)1μl。

PCR反应条件：94℃4分钟；94℃1分钟、56℃1分钟、72℃3分钟，42个循环；72℃8分钟。

用QIAquick胶回收试剂盒纯化PCR扩增产物，与pMD18-T载体(TAKARA，产品号D101A)在16℃下连接8小时，得到重组质粒pMD18-TaPHR1。

使用2mm电极杯，2500V将重组质粒pMD18-TaPHR1转化大肠杆菌DH5α(全式金，产品号CD201)，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选阳性克隆。

从阳性克隆中提取质粒，使用AbI PRISM 3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/AppliedBiosystem)进行测序。测序结果表明，pMD18-T载体中插入了序列表的序列2自5’末端第1至1353位核苷酸所示的TaPHR1基因。

二、重组表达载体的构建

构建TaPHR1在拟南芥中超量表达的重组表达载体：先将TaPHR1和EGFP连接在pJIT163的35S启动子下，使其表达TaPHR1的C端带EGFP标记的融合蛋白；然后将35S-TaPHR1：：EGFP-终止子一起切下连入pBinplus的多克隆位点。

具体过程如下：

1、以EGFP(Cat.#4999-100，Clontech，Palo Alto，CA)为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(EGFP基因)，将其与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD18-EGFP。

PCR引物(正向引物中去除起始密码子ATG，并引入BamH I酶切位点；反向引物中引入EcoR I酶切位点)序列如下：

正向引物：5′-TCAGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG-3′；

反向引物：5′-AGTGAATTCCTACAAATGTGGTATGGCTGA-3′。

PCR反应体系与PCR反应条件同步骤一。

将重组质粒pMD18-EGFP用限制性内切酶BamH I和EcoRI进行双酶切，回收770bp左右的小片段(EGFP基因)。

2、用限制性内切酶BamH I和EcoRI双酶切pJIT163载体，回收载体骨架。

3、将步骤1回收的小片段与步骤2回收的载体骨架连接，得到重组质粒甲(pJIT163-EGFP)；重组质粒甲中，序列表的序列3自5’末端第4至765位核苷酸所示的EGFP基因插入了pJIT163载体的35S启动子下游，BamH I和EcoRI酶切位点之间。

4、用限制性内切酶Sal I和BamH I双酶切pMD18-TaPHR1，回收1.35kb左右的片段。

5、用限制性内切酶Sal I和BamH I双酶切重组质粒甲，回收载体骨架。

6、将步骤4回收的片段和步骤5回收的载体骨架连接，得到重组质粒乙(pJIT163-TaPHR1-EGFP)；重组质粒乙中，序列表的序列2自5’末端第1至1353位核苷酸所示的TaPHR1基因插入了重组质粒甲的35S启动子和EGFP基因之间的Sal I和BamH I酶切位点之间。

7、用限制性内切酶Sac I和Xho I双酶切重组质粒乙(pJIT163-TaPHR1-EGFP)，回收约3.6kb左右的片段(含有35S启动子、TaPHR1基因、EGFP基因和终止子)。

8、用限制性内切酶Sac I和Sal I双酶切质粒pBinplus，回收载体骨架。

9、将步骤7回收的片段和步骤8回收的载体骨架连接(Xho I与Sal I是同尾酶)，得到重组质粒pBINPLUS-TaPHR1-EGFP，其结构示意图见图1。

三、转基因植株的获得

1、将重组质粒pBINPLUS-TaPHR1-EGFP导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌；培养重组农杆菌，得到重组农杆菌菌液。

2、转基因植株的获得

(1)用重组农杆菌菌液通过浸花法转化哥伦比亚生态型拟南芥。得到T₀代种子；

(2)用卡那霉素(50mg/L)筛选2代；

(3)将阳性植株(T₂代)进行GFP荧光单株挑选，即在含抗生素(50mg/L卡那霉素)的MS平板上发芽，2-3周后整株观察根部细胞的荧光情况，显示荧光的植株即为T₃代转TaPHR1基因植株(见图2)。

TaPHR1-3和TaPHR1-9分别为不同的独立的T₃代转TaPHR1基因株系。

四、对照载体的构建和对照植株的获得

用pBinplus质粒代替重组质粒pBINPLUS-TaPHR1-EGFP转化拟南芥，方法同步骤三，得到转空载体植株。

五、转基因植株的鉴定

一、低磷处理和高磷处理

完全培养液组成如下：KH₂PO₄，0.2mmol/L；Ca(NO₃)₂.4H₂O，2.0mmol/L；FeEDTA，0.1mmol/L；MgSO₄.7H₂O，0.5mmol/L；KCl，1.5mmol/L；CaCl₂，1.5mmol/L；H₃BO₃，0.001mmol/L；(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O，0.0001mmol/L；CuSO₄.5H₂O，0.0005mmol/L；ZnSO₄.7H₂O，0.001mmol/L；MnSO₄.H₂O，0.001mmol/L；完全培养液中，无机磷(Pi)浓度为200μM。

低磷培养液组成如下：KH₂PO₄浓度改为0.005mmol/L，为了使营养液中的K离子浓度保持一致，将KCl的浓度改为1.695mmol/L，其它同完全培养液；低磷培养液中，无机磷(Pi)浓度为5μM。

1、低磷处理

分别将生长状况相同的T₃代TaPHR1-3株系幼苗30株、T₃代TaPHR1-9株系幼苗30株、T₃代转空载体幼苗30株和野生型幼苗(WT)30株置于23℃温室中进行水培(完全营养液，3天换一次营养液)，培养4-5周时改用低磷培养液培养7天(3天更换一次)，然后观察拍照并测定植株中的TaPHR1基因表达量、植物根长、植物地上部(叶和茎)和根的含磷量。

2、高磷处理

分别将生长状况相同的T₃代TaPHR1-3株系幼苗30株、T₃代TaPHR1-9株系幼苗30株、T₃代转空载体幼苗30株和野生型幼苗(WT)30株置于23℃温室中进行水培(完全营养液，3天换一次营养液)，培养4-5周时继续用完全培养液培养7天(3天更换一次)，然后观察拍照并测定植株中的TaPHR1基因表达量、植物根长、植物地上部(叶和茎)和根的含磷量。

二、形态观察和各个参数的测定

1、TaPHR1基因表达量的检测

提取地上部的RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板进行Real-time PCR扩增。

扩增TaPHR1基因的引物如下：

正向引物：5′-TTCCCAGGTTCGGCTGATG-3′；

反向引物：5′-CTGCCCACCATTCATTTTGTT-3′。

以进行相同处理后野生型植株中TaPHR1基因的表达量为1，计算低磷处理和高磷处理后植株中TaPHR1基因的相对表达量，见图3。野生型的表达量数值很小，无法在图上显示。低磷处理植株的TaPHR1基因的表达量高于高磷处理后植株。野生型植株和转空载体植株中TaPHR1基因的表达量没有显著差异。

2、形态观察

野生型植株和TaPHR1-9株系植株的照片见图4。低磷和高磷条件下，野生型植株和转空载体植株形态均没有显著差异。低磷和高磷条件下，TaPHR1-3株系植株和TaPHR1-9株系植株形态均没有显著差异。高磷条件下，转基因植株、野生型植株和转空载体植株的形态没有显著差异。低磷条件下，转基因植株的根系长度远长于野生型植株和转空载体植株，即转基因植株的长势更好。

3、含磷量的检测

采用钼锑抗比色法测定分别检测植株地上部分和根中的含磷量。

(1)植物材料的处理和反应液的配制

称取适量(约0.1g)地上部或根装入一个2.0mL离心管中，然后用研磨仪磨匀；再加入2mL 2％(体积百分含量)冰醋酸水溶液，在42℃水浴中温浴30min；然后12000rpm离心2min；取上清作为待测液，备测无机磷(Pi)浓度。

AMES反应液由1体积份A液和6体积份B液混合而成；A液：10％(10g/100ml)抗坏血酸水溶液(当天配当天用)；B液：钼酸铵溶于0.5M H₂SO₄水溶液中，钼酸铵的质量百分含量为0.42％。

(2)制作标准曲线

绘制标准曲线：称取0.44g KH₂PO₄(80℃干燥2h)溶于蒸馏水中，定容至1000mL，获得母液(无机磷浓度为100μg/mL)；然后用母液配置无机磷浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1和2μg/mL的标准液，蒸馏水为空白对照。

取500μL上述标准液(或蒸馏水)，加入500μL AMES反应液，37℃反应1小时；4℃放置5min终止反应；分光光度计波长820nm波长下测量，自动拟和标准曲线。

(3)待测溶液的含磷量检测

取500μL待测液(以2％的醋酸溶液作为空白对照)，加入500μL AMES反应液，37℃反应1小时；4℃放置5min终止反应；于820nm波长下比色，记录吸光度，对照标准曲线计算出无机磷浓度。

检测结果见图5(FW代表鲜重)。无论是高磷还是低磷条件，无论是地上部还是根，转基因植株的无机磷浓度均显著高于野生型植株和转空载体植株。野生型植株和转空载体植株中的地上部和根中的无机磷浓度均没有显著差异。

4、根长检测

主根长和平均根毛长的测量统计结果见图6。低磷条件下，转基因植株的主根长度和平均根毛长度均显著长于野生型植株。野生型植株和转空载体植株中主根长度和平均根毛长度均没有显著差异。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：它为如下1)或2)的DNA分子：

1)序列表中序列2自5’末端第1至1353位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体为pBINPLUS-TaPHR1-EGFP；所述pBINPLUS-TaPHR1-EGFP是将限制性内切酶Sac I和XhoI双酶切重组质粒乙得到的小片段和限制性内切酶Sac I和Sal I双酶切pBinplus得到的大片段连接得到的；所述重组质粒乙是将pJIT163载体作为骨架载体，在骨架载体的Sal I和BamH I酶切位点之间插入所述基因，在骨架载体的BamH I和EcoRI酶切位点之间插入EGFP基因得到的。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到吸收磷的能力和/或低磷环境中生长能力高于所述目的植物的转基因植物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入所述目的植物中。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥。

10.权利要求2或3所述基因在植物育种中的应用。

Images