CN103717615A - 结合pcsk9的多肽及使用方法 - Google Patents

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CN103717615A CN201280030490.9A CN201280030490A CN103717615A CN 103717615 A CN103717615 A CN 103717615A CN 201280030490 A CN201280030490 A CN 201280030490A CN 103717615 A CN103717615 A CN 103717615A
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pcsk9
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ldlr
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周丽娟
莫妮卡·贡-贝尔特伦
丹尼尔·柯克霍弗
张映楠
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Abstract

本发明提供结合PCSK9的多肽及其使用方法。

Description

结合PCSK9的多肽及使用方法
相关申请
本申请要求于2011年6月20日提交的美国临时申请序号61/499,034的权益。上述申请的所有教导通过引用结合于此。
序列表
本申请包含序列表，所述序列表以ASCII格式经由EFS-Web提交并且通过引用完整地结合于此。创建于2012年6月14日的所述ASCII复件名为P4562R1W.txt并且大小为10,666字节。
发明领域
本发明涉及结合PCSK9的多肽及其使用方法。
发明背景
前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin型9(Proprotein convertasesubtilisin/kexin type 9)(PCSK9)是哺乳动物前蛋白转化酶枯草溶菌素家族的成员并且充当肝LDL受体(LDLR)的强负调节剂。PCSK9通过控制在血流中循环的低密度脂蛋白(LDL)颗粒的水平而在胆固醇代谢中起关键作用。升高的PCSK9水平已经显示降低肝中LDL-受体水平，导致血浆中高水平的LDL-胆固醇，并且导致增加的对冠状动脉疾病的易感性。(Peterson等，J Lipid Res.49(7):1595-9(2008))。因此，高度有利的是制备抑制或拮抗PCSK9的活性和PCSK9在不同病理条件下所起的相应作用的基于治疗的PCSK9的拮抗剂。
发明概述
本发明部分基于多种结合PCSK9的多肽。PCSK9呈现为重要和有利的治疗靶标，并且本发明提供作为用于靶向与PCSK9的表达和/或活性相关的病理学状态的治疗剂和诊断剂的结合PCSK9的多肽。因此，本发明提供与PCSK9相关的方法、组合物、试剂盒和制品。
在一方面中，本发明提供包含以下氨基酸序列的结合PCSK9的多肽：GX1X2ECLX3NX4GGCSX5X6CX7X8LKIGYECLCPDGFQLVAQRRCE,其中X1是D或T；X2是L或N；X3选自由以下组成的组：A、D、E、H、K、L、R、S、V和Y；X4是L或N；X5选自由以下组成的组：H、W和Y；X6选自由以下组成的组：I、L、T和V；X7选自由以下组成的组：K、N、R和Q；并且X8选自由以下组成的组：A、D、K、N、Q和R(SEQ IDNO:1)。在一些实施方案中，所述多肽包含选自由SEQ ID NOs:2-27组成的组的氨基酸序列(例如显示在图2中的非野生型序列)。在一些实施方案中，所述多肽还包含免疫球蛋白序列，例如抗体恒定区(例如Fc区)，其可以例如来自IgG抗体。
在一些实施方案中，本发明提供分离的编码本发明的多肽的核酸。在一些实施方案中，本发明提供包含编码所述多肽的核酸的载体，例如表达载体。在一些实施方案中，本发明提供包含所述载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是，例如原核的或真核的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供制备本发明的多肽的方法，所述方法包括在适于表达的条件下培养包含本发明的核酸或载体的宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括从宿主细胞回收多肽。
在一些实施方案中，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含本发明的多肽和药用载体。
在一些实施方案中，本发明提供降低受试者的LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的多肽。在一些实施方案中，本发明提供治疗受试者的胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的多肽。在一些实施方案中，本发明提供治疗受试者的高胆固醇血症(hypercholesterolemia)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的多肽。在一些实施方案中，这些方法还包括向所述受试者施用有效量的第二药物，其中所述多肽是第一药物。在一些实施方案中，所述第二药物提高LDLR水平。在一些实施方案中，所述第二药物降低LDL-胆固醇水平。在一些实施方案中，所述第二药物包含他汀类(statin)。在一些实施方案中，所述他汀类选自由以下组成的组：阿托伐他汀(atorvastatin)，氟伐他汀(fluvastatin)，洛伐他汀(lovastatin)，美伐他汀(mevastatin)，匹伐他汀(pitavastatin)，普伐他汀(pravastatin)，罗舒伐他汀(rosuvastatin)，辛伐他汀(simvastatin)，及其任意组合。在一些实施方案中，所述第二药物提高HDL-胆固醇水平。
在一些实施方案中，本发明提供抑制样品中PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法包括向样品添加本发明的多肽。在一些实施方案中，本发明提供抑制受试者中PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本发明的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供检测样品中PCSK9蛋白的方法，所述方法包括将所述样品与本发明的多肽接触并且检测多肽和PCSK9蛋白之间复合物的形成。
本文所述的任何实施方案或其任意组合适用于本文所述的本发明的任何以及所有结合PCSK9的多肽、方法和用途。
附图简述
图1显示与LDLR结合的PCSK9的晶体结构的一部分并且突出显示了在PCSK9的
Figure BDA0000442582370000031
内的LDLR的EGF(A)结构域上的某些残基。
图2显示作为第一序列的野生型EGF的可变区(293-312)(SEQ ID NO:28)和选自EGF文库的变体的序列(分别为SEQ ID NOs:2-27)。序列为IGYECLCPDGFQLVAQRRCE(SEQ ID NO:29)的恒定区(313-332)对于所有克隆来说是相同的并且没有显示。位置编号是来自全长LDLR的那些。“s/n比”是指信号:噪声比，其中“信号”是针对由包被在384孔MaxiSorpTM平板上的NeutrAvidin捕获的生物素化的PCSK9检测到的斑点噬菌体ELISA信号；“噪声”是针对单独的NeutrAvidin的ELISA信号。
图3显示EGF肽(A)和EGF-Fc融合蛋白(B)的抑制活性，如由竞争结合ELISA确定的。竞争物的连续稀释液与0.5μM生物素化的PCSK9混合并添加到包被有rLDLR的平板。结合的生物素化的PCSK9通过链霉亲和素-HRP检测。值是三次独立实验的平均值±SD。
图4显示EGFwt-Fc或EGF66-Fc通过包被有抗-人Fc的传感器芯片捕获。通过以下方式记录EGFwt-Fc(A)或EGF66-Fc(B)的传感图(sensorgram)：在1mM CaCl2(上图)或10mM EDTA(下图)存在下，注射0.078-10μM(对于EGFwt-Fc)或0-2.5μM(对于EGF66-Fc)的PCSK9溶液。
图5显示在PCSK9处理后、在EGFwt-Fc或EGF66-Fc存在下通过FACS监测的在HepG2细胞表面上的LDLR水平。相对荧光单位(RFU)用于量化LDLR表达水平并且表示为未接收PCSK9的对照细胞的百分比。值是三次独立实验的平均值±SD。
图6显示在小鼠模型中在PCSK9处理后EGFwt-Fc和EGF66-Fc拯救肝LDLR水平的能力。小鼠用载体(V)，EGF-Fc(WT)或EGF66-Fc(MUT)注射，之后推注重组人PCSK9(30μg/小鼠)。1小时后收集肝并通过免疫印迹法量化LDLR。每条泳道表示汇集的三只小鼠的肝样品。量化条带强度，相对运铁蛋白(transferring)受体含量进行归一化，并且表示为未处理组(=1.0)的分数。
图7显示，D310K突变使噬菌体展示的EGF不能结合PCSK9。结合曲线通过噬菌体ELISA测量，其中1:3连续稀释的展示EGF的噬菌体被添加到固定于平板的PCSK9并且结合的噬菌体通过抗-M13-HRP检测。
图8显示对EGF66-Fc/PCSK9复合物的SEC-MALS分析。单独注射的EGF66-Fc和PCSK9的尺寸排阻层析(SEC)曲线(profile)显示为蓝色和红色的踪迹。注射具有1:3或3:1摩尔比的EGF66:PCSK9混合物并且SEC曲线显示为绿色和黑色。通过多角光散射(MALS)确定的平均分子量(kDa)指示每个峰。第一峰的分子量与1:2(1EGF66-Fc和2PCSK9)的化学计量一致，第二峰与1:1的化学计量一致。
图9显示EGF66的分子建模。(A)EGF66中的D299A、N301L、V307I、N309R和D310K突变的模拟变化指示改善的与PCSK9的接触的潜力。EGF结构域的主链显示为带(ribbon)，而模拟的、突变的残基显示为棍(stick)。在选择期间N295和H306作为野生型保留并且显示为棍。与突变残基的可能的亲脂相互作用用淡阴影和斜体标记显示在PCSK9的另外的灰色表面上。邻近PCSK9的催化三联体残基的表面为更深的灰色的阴影，并且S153(由PCSK9的自溶性加工产生的N-末端)用“N”标记。(B)EGF66中D310K侧链的模型，其中末端胺使得不再需要Ca2+离子来稳定N-端链在β-发夹上的堆积。左图中的虚线指示Ca2+离子
Figure BDA0000442582370000051
内的原子。右图中的虚线指示赖氨酸侧链和Ca2+-结合环中的原子之间的可能的氢键相互作用。注意，形成氢键的实际原子将取决于赖氨酸末端铵基团的准确位置。
发明实施方案详述
本文描述或引用的技术和方法一般被很好的理解，并且通常为本领域技术人员使用常规方法所采用，如，例如在以下文献中所述的被广泛使用的方法：Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY(分子生物学中的最新实验方法)(F.M.Ausubel等编辑,(2003))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.)：PCR2:APRACTICAL APPROACH(PCR2：实用方法)(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))，Harlow和Lane编辑(1988)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL(抗体，实验室手册)，和ANIMAL CELLCULTURE(动物细胞培养)(R.I.Freshney编辑(1987))；OligonucleotideSynthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait编辑1984)；Methods in MolecularBiology(分子生物学中的方法),Humana Press；Cell Biology:A LaboratoryNotebook(细胞生物学：实验室手册)(J.E.Cellis编辑1998)Academic Press；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney)编辑,1987)；Introductionto Cell and Tissue Culture(细胞和组织培养导言)(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell和Tissue Culture:Laboratory Procedures(细胞和组织培养：实验室方法)(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)J.Wiley和Sons；Handbook of Experimental Immunology(实验免疫学手册)(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for MammalianCells(用于哺乳动物细胞的基因转移载体)(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(PCR：聚合酶链反应),(Mullis等编辑,1994)；Current Protocols in Immunology(免疫学最新方法)(J.E.Coligan等编辑,1991)；Short Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的小方法)(Wiley和Sons,1999)；Immunobiology(免疫生物学)(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；Antibodies(抗体)(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(抗体：实用方法)(D.Catty编辑,IRL Press,1988-1989)；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(单克隆抗体：实用方法)(P.Shepherd和C.Dean编辑,Oxford University Press,2000)；UsingAntibodies:A Laboratory Manual(使用抗体：实验室手册)(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(抗体)(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,1995)；以及Cancer:Principles和Practice of Oncology(癌症：肿瘤学的原理和实践)(V.T.DeVita等编辑,J.B.Lippincott Company,1993)。
I.定义
除非另外限定，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。Singleton等，Dictionaryof Microbiology(微生物学词典)和Molecular Biology(分子生物学)第2版，J.Wiley&Sons(New York，N.Y.1994)，以及March，Advanced OrganicChemistry Reactions，Mechanisms and Structure(高等有机化学反应，机制和结构)第4版，John Wiley & Sons(New York，N.Y.1992)，对于本申请中所用的许多术语，为本领域技术人员提供了一般指导。本文引用的所有文献(包括专利申请和出版物)通过引用完整地结合。
为了解释本说明书，将使用以下定义，并且只要适当，以单数形式使用的术语也可以包括复数，并且反之亦然。要理解，本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案，并且不意欲是限制性的。在以下所述的任何定义与通过引用结合于本文中的任何文献冲突的情况中，以以下所述的定义为准。
“亲和力”是指分子(例如多肽)的单一结合位点与其结合配偶体(例如另一多肽)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如配体与受体)之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(“Kd”或“KD”)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的那些。用于测量结合亲合力的具体说明性和示例性实施方案描述于以下。
术语“结合PCSK9的多肽”或“结合PCSK9的多肽”是指这样的多肽，所述多肽能够以足够的亲和力结合PCSK9以致所述多肽在靶向PCSK9中可以用作诊断和/或治疗剂。在一个实施方案中，结合PCSK9的多肽与不相关的、非-PCSK9蛋白结合的程度小于与PCSK9结合的程度的约10%，如例如通过定量ELISA测量的。
试剂例如药物制剂的"有效量"是指在需要的剂量和时间阶段有效获得所需的治疗或预防结果的量。
术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C端区域，所述区域包含至少一部分的恒定区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或者可以不存在。除非另外说明，Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，其也被称为EU索引，如在Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(免疫学感兴趣的蛋白质的序列)，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，1991中所述。
术语"宿主细胞"、"宿主细胞系"和"宿主细胞培养物"被可交换地使用并且是指其中引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括"转化体"和"转化的细胞"，其包括原代转化的细胞和来源于其的后代，而不考虑传代的数目。后代在核酸含量上可能与亲本细胞不完全相同，而是可以包含突变。本文中包括与在最初转化的细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变体后代。
术语“高胆固醇血症”当用于本文中时是指其中胆固醇水平升高到期望水平以上的病症。在某些实施方案中，LDL-胆固醇水平升高到期望水平以上。在某些实施方案中，血清LDL-胆固醇水平升高到期望水平以上。
“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。
"分离的"多肽是这样的多肽，其已经与其天然环境的组分分离。在一些实施方案中，将多肽纯化至超过95%或99%纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE，等电聚焦(IEF)，毛细管电泳)或层析(例如，离子交换或反相HPLC)确定的。对于用于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等，J.Chromatogr.B848:79-87(2007)。
"分离的"核酸是指这样的核酸分子，其已经与其天然环境的组分分离。分离的核酸包括包含在通常包含该核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置处。
术语“药物制剂”或“药物组合物”指这样的制剂，其以允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效的形式存在，并且不包含对施用所述制剂的受试者具有不可接受的毒性的另外的成分。
“药用载体”是指药物制剂中不同于活性成分的成分，其对受试者是无毒的。药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
除非另外说明，术语“前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin型9(Proproteinconvertase subtilisin/kexin type9)”、“PCSK9”或“NARC-1”当用于本文中时是指来自任何脊椎动物来源(包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠))的任何天然PCSK9。该术语涵盖“全长”未加工的PCSK9以及由细胞内加工产生的任何形式的PCSK9或其任何片段。该术语还包括天然存在的PCSK9的变体，例如，剪接变体或等位变体。
术语“PCSK9活性”或PCSK9的“生物学活性”当用于本文中时包括PCSK9的任何生物学作用。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性是PCSK9与LDL-受体(LDLR)结合的能力。在某些实施方案中，PCSK9结合并催化涉及LDLR的反应。在某些实施方案中，PCSK9活性包括PCSK9降低或减少LDLR的可用性的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9提高受试者的LDL的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9降低受试者的可以用于与LDL结合的LDLR的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括PCSK9降低可以用于与LDL结合的LDLR的量的能力。在某些实施方案中，PCSK9的生物学活性包括由PCSK9信号传导(signaling)所致的任何生物学活性。
用于本文时，“治疗(treatment)”（及其语法变化如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”）指在尝试改变待治疗的个体的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括但不限于防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，防止转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的抗体用于延缓疾病的发生或减缓疾病的进展。
术语"载体"当在本文中使用时是指能够增殖与其相连的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及结合到已经引入其的宿主细胞的基因组中的载体。一些载体能够指导与其可操作相连的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为"表达载体"。
II.组合物和方法
在一方面中，本发明部分基于利用结合PCSK9的多肽获得的实验结果。获得的结果显示，利用这些多肽阻断PCSK9的生物学活性导致防止LDLR下降。因此，如本文中所述的本发明的结合PCSK9的多肽提供重要的治疗和诊断剂，其可以用于靶向与PCSK9相关的病症，例如，胆固醇相关疾病。
在某些实施方案中，“胆固醇相关疾病”包括以下中的任一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征(metabolic syndrome)、糖尿病、冠状动脉心脏病(coronary heart disease)、卒中(stroke)、心血管疾病(cardiovascular diseases)、阿尔茨海默病(Alzheimers disease)和一般性的异常脂血症(dyslipidemia)(其显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的VLDL和/或低的HDL)。可以使用结合PCSK9的多肽(单独地或与一种或多种其他药剂组合地)治疗的原发性和继发性异常脂血症的一些非限制性实例包括代谢综合征、糖尿病(diabetesmellitus)、家族性混合性高脂血症(familial combined hyperlipidemia)、家族性高甘油三酯血症(familial hypertriglyceridemia)、家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemias)，包括杂合性高胆固醇血症(heterozygoushypercholesterolemia)、纯合性高胆固醇血症(homozygoushypercholesterolemia)、家族性缺陷性载脂蛋白(familial defectiveapoplipoprotein)B-100；多基因性高胆固醇血症(polygenichypercholesterolemia)；残粒移去障碍病(remnant removal disease)、肝脂肪酶缺失(hepatic lipase deficiency)；继发于以下任何的异常脂血症：饮食不慎(dietary indiscretion)、甲状腺机能障碍(hypothyroidism)、药物(包括雌激素和孕酮疗法、β阻断剂和噻嗪类利尿剂(thiazide diuretics))；肾病综合征(nephrotic syndrome)、慢性肾衰竭(chronic renal failure)、库欣综合征(Cushing's syndrome)、原发性胆汁性肝硬变(primary biliary cirrhosis)、糖原沉积病(glycogen storage diseases)、肝细胞瘤（hepatoma）、胆汁淤积(cholestasis)、肢端肥大症(acromegaly)、胰岛素瘤（insulinoma）、单纯性生长素缺乏症（isolated growth hormone deficiency）和酒精所致高甘油三酯血症(alcohol-induced hypertriglyceridemia)。本文所述的结合PCSK9的多肽可以用于预防或治疗动脉粥样硬化疾病，如例如，冠状动脉心脏病、冠脉疾病、周围动脉疾病(peripheral arterial disease)、卒中(缺血性(ischaemic)和出血性(hemorrhagic))、心绞痛(angina pectoris)或脑血管疾病和急性冠脉综合征(acute coronary syndrome)、心肌梗死(myocardialinfarction)。在某些实施方案中，本文所述的结合PCSK9的多肽可以用于降低以下的风险：非致死性心脏病发作(nonfatal heart attacks)、致死性和非致死性卒中、某些类型的心脏手术、心力衰竭的住院治疗、患有心脏病的患者的胸痛、和/或心血管事件，其由于确定的心脏病导致，如在前的心脏病发作、在前的心脏手术、和/或有阻塞的动脉的证据的胸痛。在某些实施方案中，本文所述的结合PCSK9的多肽和方法可以用于降低复发的心血管事件的风险。
A.重组方法和组合物
本文所述的结合PCSK9的多肽可以使用重组方法和组合物制备，例如，如在美国专利号4,816,567中所述的。在一个实施方案中，提供编码本文所述的结合PCSK9的多肽的分离的核酸。在另一个实施方案中，提供包含所述核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在另一个实施方案中，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含(例如，转化有)编码结合PCSK9的多肽的核酸的载体。在一个实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0，NS0，Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备结合PCSK9的多肽的方法，其中所述方法包括，在适合多肽表达的条件下，培养包含编码所述多肽的核酸的宿主细胞，如上文所提供的，和任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收所述多肽。
为了重组产生结合PCSK9的多肽，分离编码结合PCSK9的多肽(例如上文所描述的多肽)的核酸，并插入一个或多个载体，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。此类核酸易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行)。
用于克隆或表达编码结合PCSK9的多肽的载体的适当宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。例如，结合PCSK9的多肽可在细菌中产生，特别当不需要糖基化时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，见，例如，美国专利号5,648,237，5,789,199和5,840,523。(还见Charlton，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，卷248(B.K.C.Lo，编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第245-254页，描述抗体片段在大肠杆菌中的表达)。在表达后，结合PCSK9的多肽可以从可溶级分中的细菌细胞糊状物分离，并且可以进一步纯化。
除了原核生物以外，真核微生物诸如丝状真菌或酵母也是关于编码结合PCSK9的多肽的载体的合适克隆或表达宿主，包括真菌和酵母菌株，其糖基化途径已经进行“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的结合PCSK9的多肽。参见Gerngross，Nat.Biotech.(自然生物技术)22:1409-1414(2004)，和Li等,Nat.Biotech.(自然生物技术)24:210-215(2006)。
适于表达糖基化结合PCSK9的多肽的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株，其可与昆虫细胞联合使用，特别是用于转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
还可利用植物细胞培养物作为宿主。见，例如，美国专利号5,959,177，6,040,498，6,420,548，7,125,978和6,417,429(其描述了在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
也可以将脊椎动物细胞用作宿主。例如，可以使用被改造以适合于悬浮生长的哺乳动物细胞系。有用哺乳动物宿主细胞系的其它实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如Graham等，遗传病毒学杂志(J.Gen Virol.)36:59(1977)中所描述的)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4细胞，如例如在Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所描述的；MRC5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77:4216(1980))；并且骨髓瘤细胞系如Y0，NS0和Sp2/0。
B.测定
本文中提供的结合PCSK9的多肽可以对其物理/化学特性和/或生物活性，通过本领域中已知的不同测定来识别、筛选或表征。
1.结合测定和其他测定
在一方面中，例如，通过已知方法如ELISA、蛋白印迹法等，测试本发明的结合PCSK9的多肽的PCSK9结合活性。在一些实施方案中，通过生物层干涉法(bio-layer interferometry)或表面等离子共振，测试本发明的结合PCSK9的多肽的PCSK9结合活性。
2.活性测定
在一方面中，提供用于鉴别具有生物学活性的结合PCSK9的多肽的测定。结合PCSK9的多肽的生物学活性可以包括，例如，阻断、拮抗、抑制、干扰、调节和/或降低PCSK9的一种或多种生物学活性。还提供在体内和/或体外具有这样的生物学活性的结合PCSK9的多肽。
在某些实施方案中，结合PCSK9的多肽结合人PCSK9并防止与LDLR的相互作用。在某些实施方案中，结合PCSK9的多肽特异性结合人PCSK9和/或基本上抑制人PCSK9与LDLR的结合达至少约20%-40%，40-60%，60-80%，80-85%或以上(例如，通过在体外竞争性结合测定中测量结合)。在某些实施方案中，本发明提供分离的结合PCSK9的多肽，其特异性地结合PCSK9，并且当在体外使用本文中公开的HepG2细胞中的LDLR减量调节测定测量时，拮抗PCSK9介导的对LDLR水平的作用。
C.用于诊断和检测的方法和组合物
在某些实施方案中，本文中提供的任何结合PCSK9的多肽可以用于检测PCSK9在生物样品中的存在。术语“检测”用于本文中时，包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品是血、血清或生物来源的其他液体样品。在某些实施方案中，生物样品包含细胞或组织。
在一个实施方案中，提供用于诊断或检测方法的结合PCSK9的多肽。在另一个方面中，提供检测PCSK9在生物样品中的存在的方法。在某些实施方案中，方法包含检测PCSK9蛋白在生物样品中的存在。在某些实施方案中，PCSK9是人PCSK9。在某些实施方案中，所述方法包括将生物样品与如本文所述的结合PCSK9的多肽在允许结合PCSK9的多肽与PCSK9结合的条件下接触，并检测在结合PCSK9的多肽和PCSK9之间是否形成复合物。该方法可以是体外或体内方法。在一个实施方案中，结合PCSK9的多肽被用于选择适合利用结合PCSK9的多肽治疗的受试者，例如其中PCSK9或LDL-胆固醇是用于选择患者的生物标记物。
可以使用本发明的多肽诊断的示例性疾病包括胆固醇相关疾病(其包括“血清胆固醇相关疾病”)，其包括以下的任何一种或多种：高胆固醇血症、心脏病、代谢综合征、糖尿病、冠状动脉心脏病、卒中、心血管疾病、阿尔茨海默病和一般性的异常脂血症(其可以显示为例如提高的总血清胆固醇、提高的LDL、提高的甘油三酯、提高的极低密度脂蛋白(VLDL)和/或低的HDL)。在一方面中，本发明提供治疗或预防个体中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状的方法：异常脂血症、动脉粥样硬化、心血管疾病(CVD)或冠状动脉心脏病，所述方法包括向所述个体施用有效量的结合PCSK9的多肽。在某些实施方案中，本发明提供有效量的结合PCSK9的多肽，其用于治疗或预防受试者中的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状：异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。本发明还提供有效量的拮抗胞外或循环PCSK9的结合PCSK9的多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防个体的高胆固醇血症和/或至少一种以下症状：异常脂血症、动脉粥样硬化、CVD或冠状动脉心脏病。
在某些实施方案中，提供标记的结合PCSK9的多肽。标记包括但不限于，被直接检测的标记或部分(如荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，和放射性标记)，以及被间接检测的结构部分，如酶或配体，例如，通过酶促反应或分子相互作用检测。示例性标记包括但不限于，放射性同位素32P，14C，125I，3H，和131I，荧光团如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，罗丹明及其衍生物，丹酰(dansyl)，伞形酮(umbelliferone)，荧光素酶(luceriferase)，例如，萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)，荧光素(luciferin)，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶解酶，糖类氧化酶，例如，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，加上利用过氧化氢氧化染料前体的酶如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶(microperoxidase)，生物素/亲和素，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基，等等。
D.药物制剂
本发明还包括包含结合PCSK9的多肽的组合物(包括药物制剂)和包含编码结合PCSK9的多肽的序列的多核苷酸。在某些实施方案中，组合物包含一种或多种结合PCSK9的多肽或一种或多种包含编码一种或多种结合PCSK9的多肽的序列的多核苷酸。这些组合物还可以包含合适的载体，如本领域中公知的药用赋形剂，包括缓冲剂。
如本文所述的结合PCSK9的多肽的药物制剂通过将具有所需纯度的所述多肽与一种或多种任选的药用载体(Remington's PharmaceuticalSciences，第16版，Osol，A.编(1980))混合，以冻干制剂或水溶液的形式来制备。药用载体通常在所用剂量及浓度对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐及其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄铵、氯化六羟季铵、苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，如钠；金属复合体(例如Zn-蛋白质复合体)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文中的示例性药用载体还包括药物间质分散剂，如可溶性中性-活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(
Figure BDA0000442582370000151
Baxter International，Inc.)。某些示例性sHASEGPs及使用方法，包括rHuPH20，描述于美国专利公开号2005/0260186及2006/0104968中。在一方面中，sHASEGP与一种或多种其他葡糖胺聚糖酶例如软骨素酶组合。
本文的制剂还可以包含超过一种活性成分，所述活性成分是被治疗的特定适应证所需的，优选具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。例如，理想的是还提供他汀类。所述活性成分以对于目的用途有效的量合适地组合存在。
可以将活性成分截留于例如通过凝聚技术或通过界面聚合所制备的微囊，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊中、胶状药物传递系统(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳液、纳米颗粒及纳米胶囊)中或粗滴乳状液中。这些技术披露于Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编(1980)中。
可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半渗透基质，所述基质呈成形物品，例如薄膜或微囊形式。
欲用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌可以例如借助通过无菌过滤膜的过滤而轻易地实现。
E.治疗方法和组合物
任何本文提供的结合PCSK9的多肽可以用于治疗方法。
在一方面中，提供用作药物的结合PCSK9的多肽。在另一方面中，提供用于治疗与胆固醇相关疾病相关联的病症的结合PCSK9的多肽。在某些实施方案中，提供用于治疗与升高的LDL-胆固醇水平相关联的病症的结合PCSK9的多肽。在某些实施方案中，提供用于治疗方法中的结合PCSK9的多肽。在某些实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于治疗具有与升高的LDL-胆固醇水平相关联的病症的个体的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的结合PCSK9的多肽。在某些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，他汀类。在某些实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于降低受试者的LDL-胆固醇水平。在另外的实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于降低受试者的血清LDL-胆固醇水平。在某些实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于增加受试者的LDLR的可用性。在某些实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于抑制受试者中的PCSK9与LDLR的结合。在某些实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于降低个体的LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述个体施用有效的结合PCSK9的多肽以降低LDL-胆固醇水平。在某些实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于降低个体的血清LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括向所述个体施用有效的结合PCSK9的多肽以降低血清LDL-胆固醇水平。在某些实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于增加个体的LDLR的利用度的方法，所述方法包括向所述个体施用有效的结合PCSK9的多肽以提高LDLR的利用度。在某些实施方案中，本发明提供结合PCSK9的多肽，所述结合PCSK9的多肽用于抑制个体中的PCSK9与LDLR的结合的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的结合PCSK9的多肽以抑制PCSK9与LDLR的结合。根据任何以上实施方案的“个体”优选是人。
在其他方面中，本发明提供结合PCSK9的多肽在生产或制备药物中的用途。在一个实施方案中，所述药物用于治疗胆固醇相关疾病。在某些实施方案中，胆固醇相关疾病是高胆固醇血症。在另一个实施方案中，所述药物用于治疗高胆固醇血症的方法，所述方法包括向具有高胆固醇血症的个体施用有效量的所述药物。
在某些实施方案中，被治疗的疾病是可以通过消除、抑制或降低PCSK9的活性而被改善、减缓、抑制或预防的任何疾病或病症。在某些实施方案中，通常通过使用他汀类可解决的(可治疗或可预防的)疾病或病症也可以被治疗。在某些实施方案中，可以受益于阻止胆固醇合成或提高的LDLR表达的疾病或病症也可以通过本发明的结合PCSK9的多肽治疗。在某些实施方案中，可通过本发明的结合PCSK9的多肽和治疗方法治疗的个体包括适用LDL单采血液成分术(apheresis)的个体，具有PCSK9活化突变的个体(获得功能突变，"GOF")，具有杂合家族性高胆固醇血症(heFH)的个体，具有原发性高胆固醇血症、不耐受他汀类或是他汀类不受控的个体，和处于发生高胆固醇血症的风险、可以被预防性治疗的个体。其他适应征包括与继发性病因如II型糖尿病相关联的异常脂血症，胆汁淤积性肝病(cholestatic liver diseases)(原发性胆汁性肝硬化(primary biliarycirrhosis))，肾病综合征，甲状腺机能障碍，肥胖，和预防和治疗动脉粥样硬化和心血管疾病。
在某些实施方案中，本文所述的方法和用途还包括向所述个体施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，他汀类。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂用于预防和/或治疗动脉粥样硬化和/或心血管疾病。在某个实施方案中，所述另外的治疗剂用于降低复发的心血管事件的风险的方法。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂用于提高受试者的HDL-胆固醇水平。
在另一方面中，本发明提供药物制剂，所述药物制剂包含任何本文提供的结合PCSK9的多肽，例如，用于任何以上的治疗方法。在一个实施方案中，所述药物制剂包含任何本文提供的结合PCSK9的多肽和药用载体。在另一个实施方案中，所述药物制剂包含任何本文提供的结合PCSK9的多肽和至少一种另外的治疗剂，例如，他汀类。
在治疗中，本发明的结合PCSK9的多肽可以单独使用或与其他试剂组合使用。例如，本发明的结合PCSK9的多肽可以与至少一种另外的治疗剂一起共同给药。在某些实施方案中，这样的另外的治疗剂提升LDLR的水平。在某些实施方案中，另外的治疗剂是降低LDL-胆固醇的药物如他汀类，例如，阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，罗舒伐他汀，辛伐他汀或其任意组合，例如，
Figure BDA0000442582370000181
，
Figure BDA0000442582370000182
或
Figure BDA0000442582370000183
。在某些实施方案中，另外的治疗剂是提高HDL-胆固醇的药物。
这样的以上所述的组合疗法包括组合给药(其中两种以上治疗剂被包含在相同或分开的制剂中)，和分别给药，其中，本发明的结合PCSK9的多肽的给药可以发生在另外的治疗剂和/或佐剂的给药前、同时和/或之后。
本发明的结合PCSK9的多肽(以及任何另外的治疗剂)可以通过任何合适的方法给药，包括肠胃外给药，肺内给药和鼻内给药，并且，如果局部治疗需要，病变内给药。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。在一定程度上根据用药是短期或长期性而定，可通过任何适合途径，例如通过注射，例如静脉内或皮下注射用药。本文中涵盖各种用药时程，包括，但不限于，单次给药或在多个时间点多次给药、推注给药及脉冲输注。
本发明的结合PCSK9的多肽将以与良好医疗实践相一致的方式配制、给药和施用。在该背景下考虑的因素包括待治疗的具体病症、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状态、病症的原因、递送试剂的位点、施药方法、施药时间安排、和医疗从业者已知的其他因素。所述结合PCSK9的多肽不需要，但任选地，与目前用于预防或治疗待讨论病症的一种或多种试剂一起配制。所述其他试剂的有效量取决于制剂中存在的结合PCSK9的多肽的量、病症或治疗的类型、和以上讨论的其他因素。这些一般以相同剂量，并使用如本文中所述的施药途径，或以本文中所述的剂量的约1-99%，或以通过经验/临床确定合适的任意剂量和任何途径来使用。
为了预防或治疗疾病，本发明的结合PCSK9的多肽的合适剂量（当单独或与一种或多种其他另外的治疗剂组合使用时）将取决于待治疗疾病的类型、疾病的严重性和进程、所述多肽是以预防目的施用还是以治疗目的施用、以前的治疗、患者的临床病史和对所述多肽的应答，和主治医师的判断力。所述结合PCSK9的多肽以一次治疗或经过一系列治疗合适地施用于患者。根据疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg（例如0.1mg/kg-10mg/kg）的结合PCSK9的多肽可以是用于向患者施用的最初候选剂量，无论，例如，通过一次或多次分别施药，或通过连续输注。一个典型的每日剂量可以在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内，其取决于上文提及的因素。为了重复施用数日或更长，根据病症，通常将持续治疗直至出现疾病症状的理想抑制。所述结合PCSK9的多肽的一个示范性剂量应该在约0.05mg/kg-约10mg/kg范围内。因此，约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg（或其任意组合）的一个或多个剂量可以施用于患者。这样的剂量可以间隔地，例如每周或每三周施用（例如以使得患者接受约2-约20或例如约6个剂量的所述多肽）。可以施用最初较高的负荷剂量，随后是一个或多个较低的剂量。
在某些实施方案中，使用无变化的固定(flat-fixed)用药方案来将结合PCSK9的多肽施用于个体。取决于疾病的类型和严重性，示例性的无变化的固定剂量可以为10至1000mg的结合PCSK9的多肽。多肽的一个示例性剂量为约10mg至约600mg。多肽的另一个示例性剂量为约100mg至约600mg。在某些实施方案中，150mg、300mg或600mg的结合PCSK9的多肽被给药于个体。然而，其它治疗方案可以是有用的。该疗法的进展可以容易地通过常规方法和测定来监测。
F.制品
在本发明的另一方面中，提供一种制品，所述制品包含可用于治疗、预防和/或诊断上述病症的材料。该制品包括容器和在容器上或与容器一起的标签或包装说明书(package insert)。适合的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器、IV溶液包等。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有组合物，所述组合物是单独地或与可有效用于治疗、预防和/或诊断所述病症的另一种组合物结合，对于所述疾患的治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活性试剂是本发明的结合PCSK9的多肽。标签或包装说明书标明该组合物是用于治疗特定的病症。此外，所述制品可以包含(a)其中包含组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的结合PCSK9的多肽；和(b)其中包含组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其他的治疗剂。在某些实施方案中，第二容器包含第二治疗剂，其中所述第二治疗剂是“他汀类”类别的降胆固醇药。在某些实施方案中，他汀类是和/或包含阿托伐他汀(例如，
Figure BDA0000442582370000201
或Torvast)，氟伐他汀(例如，
Figure BDA0000442582370000202
)，洛伐他汀(例如，
Figure BDA0000442582370000203
，ALTOCORTM或)，美伐他汀(匹伐他汀(例如，
Figure BDA0000442582370000205
或
Figure BDA0000442582370000206
)，普伐他汀(例如，
Figure BDA0000442582370000207
Figure BDA0000442582370000208
Figure BDA0000442582370000209
)，罗舒伐他汀(例如，
Figure BDA00004425823700002010
，辛伐他汀(例如，
Figure BDA00004425823700002011
Figure BDA00004425823700002012
)或其任意组合，例如，
Figure BDA00004425823700002013
Figure BDA00004425823700002014
或
Figure BDA00004425823700002015
本发明的该实施方案中的制品还可以包括包装说明书，所述包装说明书指明所述组合物可以用于治疗特定病症。备选地，或另外地，所述制品还可以包括第二(或第三)容器，所述第二(或第三)容器包含药用缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。从商业和用户立场，它还可以包括所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤膜、针头和注射器。
III.实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。要理解，根据以上提供的一般性描述，可以实施多种其他实施方案。
实施例1：生产高亲和力结合PCSK9的多肽
PCSK9结合LDLR的第一表皮生长因子样结构域EGF(A)，并且结构研究揭示，EGF(A)结合位点位于蛋白酶结构域上(Kwon等(2008)Proc NatlAcad Sci USA105(6)，1820-1825)。天然存在的PCSK9功能增加的(gain-of-function)突变D374Y(Cunningham等(2007)Nat Struct Mol Biol14(5)，413-419；Lagace等(2006)J Clin Invest116(11)，2995-3005；Timms等(2004)Hum Genet114(4)，349-353)位于PCSK9-EGF(A)界面区的周围并且邻近EGF(A)结构域中的家族性高胆固醇血症相关突变H306Y。复合物的结构还提供了理解观察到的PCSK9-D374Y和EGF-H306Y突变亲和力增加的分子基础(Kwon等，同上)。
单独的野生型LDLR-EGF(A)结构域和EGF(A,B)串联结构域是LDLR结合PCSK9的竞争性抑制剂并且在基于细胞的测定中可以部分恢复LDLR水平(Shan等(2008)Biochem Biophys Res Commun375(1)，69-73；Bottomley等(2009)J Biol Chem284(2)，1313-1323；McNutt等(2009)J BiolChem 284(16)，10561-10570)。然而，野生型EGF(A)对PCSK9的结合亲和力低，在中性pH报道的KD值为～1μM(Shan等，同上)，而EGF(A,B)的亲和力仅稍好(KD0.34μM)(Bottomley等，同上)。因此，认为野生型EGF(A)结构域缺乏作为可能的PCSK9中和剂的足够潜能。
为了鉴别更有效的EGF(A)结构域抑制剂，我们设计了具有109的理论多样性的EGF(A)文库用于在噬菌体上的表面展示，并且鉴定了具有提高的结合亲和力和拮抗剂活性的多个EGF变体。通过修饰之前描述的噬菌粒pS2202d(Skelton等(2003)J Biol Chem278(9)，7645-7654)，LDLR的EGF(A)结构域(G293-E332)被展示在M13噬菌体的表面上。使用标准分子生物学技术来将pS2202d编码gD标记和Erbin PDZ结构域的片段替换为编码LDLR的EGF(A)结构域的DNA片段。所得的噬菌粒(p3EGF(A))含有编码麦芽糖结合蛋白分泌信号的开放阅读框，之后是EGF(A)并且以M13小外壳蛋白p3的C-端结构域结束。载有p3EGF(A)的大肠杆菌(E.coli)用M13-KO7辅助噬菌体共感染，并且将培养物在30ml补充以50μg/ml羧苄青霉素(carbenecillin)和25μg/ml卡那霉素的2YT培养基中在30℃过夜培养。根据标准实验方案(Tonikian等(2007)Nat Protoc2(6)，1368-1386)纯化增殖的噬菌体并将其重悬在1ml PBT缓冲液(PBS，0.5%BSA和0.1%
Figure BDA0000442582370000211
20)中，导致包封p3EGF(A)DNA并且展示EGF(A)结构域的噬菌体颗粒的产生。展示水平使用噬菌体ELISA进行分析。
通过基于PCSK9:EGF(A,B)复合物的晶体结构(Kwon等，同上)随机化在距PCSK9
Figure BDA0000442582370000212
内的EGF(A)残基(排除半胱氨酸)来设计所述文库。为了最大化文库多样性，将Ca2+-结合环(N-端和β-发夹环)的残基也随机化并且不尝试保持Ca2+-结合，在不含Ca2+的缓冲液中进行噬菌体淘选。遵循Kunkel突变发生方法(Kunkel等(1987)Methods Enzymol154,367-382)构建EGF(A)结构域突变文库。利用NNK密码子随机化残基N295，D299，N301，H306，V307，N309和D310。终止模板是在H306-D310区中含有三个终止密码子的p3EGF(A)的单链DNA，并被用于构建包含～2x1010独特成员的文库。在溶液中针对生物素化的PCSK9使文库循环通过数个轮次的结合选择。对于第一轮，将20μg的生物素化的PCSK9与1ml的噬菌体文库(～1x1013pfu/ml)在4℃在PBS、1%BSA和0.1%Tween20中温育2小时，并且通过之前已经用封闭缓冲液(PBS，1%BSA)封闭的200μl的
Figure BDA0000442582370000221
MyOne链霉亲和素在室温对其进行捕获，达15分钟。抛弃上清，用PBS、0.1%
Figure BDA0000442582370000222
20将小珠洗涤三次。结合的噬菌体用400μl0.1M HCl洗脱7分钟，并且立即用60μl的1M Tris、pH13中和。扩增洗脱的噬菌体，如由Tonikian等(2007)Nat Protoc2(6)，1368-1386所述。对于第二轮，实验方案与第一轮相同，除了使用10μg生物素化的PCSK9和100μl的Dynabeads以外。对于第三轮，将2μg生物素化的PCSK9与来自前一轮的扩增的噬菌体温育，并且通过之前用封闭缓冲液处理过的NeutrAvidin包被的平板捕获噬菌体-PCSK9复合物。第四轮与前三轮相同，除了使用链霉抗生素包被的平板来捕获生物素-PCSK9-噬菌体复合物以外。在30℃，在大肠杆菌XL1-blue中用M13-KO7辅助噬菌体增殖噬菌体。
在四轮结合选择后，挑取个体噬菌体克隆并将其接种到在96孔块中的含有50μg/ml羧苄青霉素和M13-KO7辅助噬菌体的450μl2YT培养基中，将其在37℃培养过夜。利用斑点噬菌体ELISA如下地对上清进行分析：生物素化的PCSK9被捕获至NeutrAvidin包被的384孔MaxiSorpTM免疫平板并将用PBT缓冲液稀释(1:3)的噬菌体上清加入到孔中。对所述平板进行洗涤，结合的噬菌体利用抗-M13-HRP以及之后的TMB底物进行检测。在这些测定中，平行地测试单独的结合NeutrAvidin的噬菌体以评估背景结合。对PCSK9的结合信号是对NeutrAvidin(背景)的结合信号超过4倍高的克隆被认为是阳性的。对阳性克隆进行DNA序列分析。
通过以下方式没有检测到结合信号：将野生型EGF(A)-展示噬菌体施用至固定的PCSK9，使用噬菌体ELISA测定，其中信号窗<0.2并且信号:噪声比<2(图2，第一行)。在四轮淘选后，鉴定出26个独特的克隆，其具有通过ELISA检测到的中等到强烈的结合信号(信号窗>0.2并且信号:噪声比>4)(图2)。这些克隆的序列比对指示Asn295是高度保守的，而Asn309已被突变为Arg或Lys。四个克隆显示强的结合亲和力(信号窗>1.4并且信号:噪声比>20)并且选择它们以用于更广泛的表征。它们被指定为EGF52、EGF59、EGF66和EGF75。与野生型EGF(A)(EGFwt)相比，这四个克隆的主要序列变化为Asn301变为Leu；Asn309变为Arg或Lys以及Asp310变为Lys。此外，对于EGF52、EGF66和EGF75，Asp299分别变为Ser、Ala和Lys，但是其在EGF59中保持不变。
EGF52和EGF59的斑点ELISA信号类似，其主要不同在于Asp299，这表明该位置对于结合不是关键的。在N309处分别单个突变为Arg、Lys和Lys的三个克隆EGF50、EGF56和EGF62显示与野生型相比的结合的中等增加，但是与四个最佳克隆相比，增加低得多。这表明了N309对结合的适度的贡献。在所有四个高亲和力结合物中Asn301都被突变为Leu，这表明其对亲和力增加的关键作用。为了评估Asp310突变对结合的贡献，我们制备了D310K的单个突变并且使用噬菌体ELISA测量了EGF-展示噬菌体与PCSK9的结合曲线。如图7中所示，D310K的单个突变使得完全不能结合，指示单独的D310K不能产生亲和力增加，而是需要结合其他突变，例如N301L，以实现高亲和力结合。
实施例2:EGF变体具有提高的亲和力和抑制潜力
首先通过肽合成然后通过体外折叠来制备所选的四个EGF变体。在自动化Protein Technologies,Inc.合成仪上制备全部EGF合成肽，EGFwt，EGF52，EGF59，EGF66，和EGF75。典型地，使用标准Fmoc合成方案将40个氨基酸的肽装配在Fmoc-Glu(OtBu)-Rapp聚合物(置换=0.24meq/gm)上。对于六个半胱氨酸氨基酸，结合Fmoc-Cys(Trt)-OH。在完成直链后，利用三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/水(95:2.5:2.5)将肽从固体载体上切下来，室温3小时。将TFA蒸发，利用乙醚沉淀所述肽，用乙酸、乙腈、水萃取，并冻干。将粗制的直链EGF肽重新溶解在DMSO中并通过反相C18色谱使用乙腈/水缓冲液进行纯化。纯化的级分通过lcms(PE/Sciex)分析，将其合并并冻干。
对于肽折叠，典型地将50mg纯的直链EGF肽溶解在500ml水中(0.1mg肽/ml水)并将pH调至>8。使直链肽在室温被空气氧化达3天，然后冻干。粗制的环状肽通过制备型反相HPLC分离。完全环化的肽的身份通过质谱确认，其中最终质量比对应于形成三个二硫键的直链肽小6个质量单位。半胱氨酸配对如下，Cys(I和III)，Cys(II和IV)，以及Cys(V和VI)。
通过以下方式使EGF变体和EGFwt形成EGF(A)-Fc融合蛋白：经由短的接头将EGF融合到人IgG1的Fc结构域。LDLR的EGF结构域(G293-E332)，以及实施例1中所述的变体，加上序列为GGGSGAAQVTNKTHT(SEQ ID NO:30)的接头，以及之后的人IgG1的Fc结构域(C222-K443)被克隆到pRK5载体中，其被指定为EGF-Fc-pRK5。EGF-Fc蛋白在CHO中瞬时表达并在Protein A树脂上纯化，之后是凝胶过滤色谱。蛋白的身份通过质谱和SDS-PAGE确认。含有组氨酸(His)8C-端标签(SEQ ID NO:31)的人PCSK9(
Figure BDA0000442582370000241
EF692496)互补脱氧核糖核酸(cDNA)被克隆到哺乳动物表达载体(pRK5)中。重组人PCSK9蛋白在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中瞬时表达并且从条件培养基纯化，使用在镍次氮基三乙酸琼脂糖柱(Qiagen；Germantown，MD)上的亲和力色谱法，之后是在
Figure BDA0000442582370000242
S200柱(GE Healthcare；Piscataway，NJ)上的凝胶过滤。蛋白的身份通过质谱以及还原和非还原SDS PAGE确认。然后在体外使用
Figure BDA0000442582370000243
Sulfo-NHS-生物素化试剂盒(货号21435，Thermo Scientific，Rockford，IL)遵循制造商的说明将蛋白生物素化。
因为单个EGF-Fc蛋白含有两个EGF结构域，所以可能的是，EGF-Fc能够同时结合两个PCSK9。这通过以下方式检验：通过与MALS(多角光散射)偶联的尺寸排阻层析(SEC)确定EGF66-Fc/PCSK9复合物在溶液中的化学计量。将EGF66-Fc和PCSK9在40mM Tris pH7.4、150mM NaCl和2mM CaCl2中混合并且温育24小时，之后通过尺寸排阻层析(SEC)和多角光散射(MALS)进行分析。分析约150μg的摩尔比分别为3:1和1:3的EGF66-Fc:PCSK9复合物。此外，独立的运行两种蛋白作为对照。使用相同的缓冲液在Superdex20010/300GL柱(GE Healthcare)上进行分离，流速为0.5mL/分钟。洗脱曲线通过280nm处的UV吸光度(Agilent 1260DAD)，静态光散射(Wyatt Technologies Dawn Hellios-II)和差示折射率(Wyatt Technologies Optilab rEX)监测。散射强度和差示折射率数据经由齐姆图(Zimm plot)利用Astra5.3.4.20软件包(Wyatt Technologies)进行分析以确定洗脱自Superdex200柱的多个单分散峰的摩尔质量。
摩尔比为1:3或3:1的两种EGF66-Fc/PCSK9混合物的SEC曲线都给出两个主要复合物峰以及之后的过量分子的单体峰。在两种情况中，第一峰的平均分子量都是约170kDa，这与1:2复合物的化学计量大致一致，第二峰的平均分子量为约120kDa，这与1:1复合物一致(图8)。在过量PCSK9存在下，形成的大部分复合物为1:2复合物，说明EGF-Fc蛋白可以与PCSK9进行二价相互作用。
EGF肽和EGF-Fc融合蛋白的阻断活性使用竞争结合ELISA确定。利用在包被缓冲液(50mM碳酸钠，pH9.6)中的1μg/mL的重组人LDLR胞外结构域(rLDLR)(R&D Systems；Minneapolis，MN)对384孔MaxiSorpTM平板(Nalge Nunc International；Rochester，NY)在4℃进行过夜包被。然后将在测定缓冲液(25mM HEPES，pH7.2，150mM NaCl，0.2mM CaCl2，0.1%BSA，0.05%
Figure BDA0000442582370000251
20)中的0.5μg/ml的生物素化的PCSK9与等体积的连续稀释的EGF肽(0.017-6000nM)或EGF-Fc(0.034-6000nM)混合，并且温育30分钟。将所述溶液加入rLDLR包被的平板并温育2小时。结合的生物素化的rPCSK9通过连续添加链霉亲和素-辣根过氧化酶(GEHealthcare；Buckinghamshire，UK)和底物3,3’,5,5’四甲基联苯胺(TMBE1000，Moss；Pasadena，MD)来检测。来自一式两份的孔的平均吸光度值作为抗体浓度的函数被作图，并且对于每个抗体，使用KaleidaGraph(Synergy Software；Reading，PA)来将数据拟合为四参数方程。
合成的EGF肽的结果显示在图3A中。EGF变体的IC50值是EGFwt的IC50值的38-247倍低，EGF66是最有效的拮抗剂(表I)。与EGFwt-Fc相比，在抑制PCSK9-LDLR结合方面，所有的EGF-Fc变体都显示好得多的能力(图3B)，这与合成的EGF肽变体的结果类似(图3A，表I)。在两个测定中，EGF66-Fc都是最强的拮抗剂。
表I.EGF(A)结构域变体抑制PCSK9与LDLR结合
IC50是在方法中所述的竞争结合ELISA中竞争剂阻断50%的PCSK9与LDLR的结合的浓度。值是三次独立实验的平均值±SD。
Figure BDA0000442582370000261
*ND，未确定
EGF-Fc融合蛋白与PCSK9的结合亲和力通过生物层干涉法在OctetRED 384(Fortebio)上测量。Fc生物传感器(Fortebio，货号18-5063)被加载以在含有0.05%Tween20和0.5%BSA和1mM CaCl2的TrisHCl pH7.5缓冲液中的EGF-Fc，在相同缓冲液中进行洗涤，并且将其转移到含有在相同缓冲液中的浓度为0-500nM的PCSK9的孔中。将针对仅含有缓冲液的参比孔的信号从所有结合数据中减去。亲和力KD通过将响应非线性拟合为稳态算法使用Octet软件获得。概括在表II中的确定的KD值显示：与EGFwt-Fc相比，EGF-Fc变体的亲和力增加7.5至33倍。
表II.通过生物层干涉法测量的EGFwt-Fc及其变体与PCSK9的结合亲和力。KD值通过将数据拟合为稳态方程来确定。值是三次独立实验的平均值±SD。
KD(稳态)(nM)
EGFwt-Fc 900±85
EGF52-Fc 120±14
EGF59-Fc 50±7
EGF66-Fc 56±7
EGF75-Fc 27±3
实施例3：EGF66-Fc与PCSK9的不依赖钙的结合
EGF(A)结构域与PCSK9的相互作用需要钙(Malby等(2001)Biochemistry 40(8)，2555-2563；Saha等(2001)Structure9(6)，451-456)。残基Glu296和Asp310的侧链对于EGF(A)结构域配位单个Ca2+原子有重要的贡献。所有EGF变体在第310位都具有Lys残基而不是Asp310，说明钙结合被严重破坏。因此，我们检验了与EGFwt-Fc相比的EGF66-Fc与PCSK9的结合对钙的需求。PCSK9和EGFwt-Fc或EGF66-Fc之间在Ca2+存在或不存在下的结合亲和力通过表面等离子共振在
Figure BDA0000442582370000271
3000仪器(GE Healthcare)上确定。传感器芯片使用人抗体捕获试剂盒(货号BR-1008-39)遵循制造商提供的说明书来制备。注射稀释在工作缓冲液(50mM Tris，pH7.5，150mM NaCl，0.005%P20)中的EGFwt-Fc(0.307μg/ml)和EGF66-Fc(0.35μg/ml)，EGF75-Fc(1μg/ml)，EGF52-Fc(1μg/ml)和EGF59-Fc(1μg/ml)分别产生85.9RU，231.8RU，144RU，142RU和146RU的结合信号。在1mM CaCl2或10mM EDTA存在下，在3分钟PCSK9溶液的注射期间，记录传感图。数据获得自0.078μM至10μM(对于EGFwt-Fc)和0μM至2.5μM(对于EGF66-Fc)的PCSK9的2倍连续稀释液，流速为30μl/min并且温度为25℃。通过减去仅含捕获抗体的参比孔的背景信号来校正数据。动力学参数(ka和kd)通过使用
Figure BDA0000442582370000272
3000BIAevaluation软件(版本4.1)拟合数据来确定，并且计算KD值(KD=kd/ka)。
我们在这些实验中发现：在钙存在下，EGFwt-Fc以935nM的KD与PCSK9结合，而当不存在钙时(即，在10mM EDTA存在下)，没有检测到结合信号(图5A，表III)。相比之下，所有四种EGF突变体蛋白对PCSK9的亲和力在存在和不存在钙的情况下是大致相同的(图5B，表III)。EGF66-Fc和EGF52-Fc显示实际上相同的结合常数，而在不存在Ca2+的情况下EGF59-Fc和EGF75-Fc仅具有下降2倍的亲和力，这主要是由于下降2倍的kon(表III)。不希望受制于理论，EGF变体不依赖Ca2+最可能是因为在不含Ca2+的缓冲液中进行克隆选择方法。此种特别的选择压力有利于出现具有“适应性”突变(包括Asp310变为赖氨酸)的克隆。此外，结果显示：在存在或不存在Ca2+的情况下，与EGFwt-Fc相比，EGF66-Fc具有最高的结合亲和力(KD71nM)以及约12倍的亲和力提高。
表III.在存在或不存在Ca2+的情况下，通过表面等离子共振测量的EGFwt-Fc或EGF52-Fc，EGF59-Fc，EGF66-Fc或EGF75-Fc与PCSK9结合的动力学参数。值是三次独立实验的平均值±SD。
ka(x104M-1s-1) kd(x10-2s-1) KD(nM)
EGFwt-Fc，1mM Ca2+ 5.9±0.4 5.5±0.5 935±6
EGFwt-Fc，10mM EDTA ND* ND ND
EGF52-Fc，1mM Ca2+ 18.1±0.7 2.0±0.9 113±9
EGF52-Fc，10mM EDTA 9.0±0.1 2.2±0.2 238±8
EGF59-Fc，1mM Ca2+ 18.3±0.3 2.0±0.3 111±4
EGF59-Fc，10mM EDTA ±15.6±0.7 2.1±0.6 135±4
EGF66-Fc，1mM Ca2+ 32.6±2.5 2.3±0.1 71±1
EGF66-Fc，10mM EDTA 32.4±1.1 2.3±0.2 72±2
EGF75-Fc，1mM Ca2+ 17±0.2 2.0±0.6 121±9
EGF75-Fc，10mM EDTA 9.5±0.2 2.1±0.8 224±3
*ND未检测到
实施例4：EGF66-Fc的体外和体内效力
基于其优异的抑制活性，在利用HepG2细胞的LDLR降解测定中将EGF66-Fc用作PCSK9拮抗剂。将HepG2细胞(ATCC；Manassas，VA)以1x105细胞/孔接种到48孔板(Corning；Corning，NY)中在含有2mM谷氨酰胺(Sigma)，青霉素/链霉素(Gibco)和10%FBS(Sigma)的高葡萄糖培养基(DMEM，Gibco；Carlsbad，CA)中，并且温育过夜。然后将培养基变为含有10%缺乏脂蛋白的血清(LPDS，Intracel；Frederick，MD)的DMEM。24小时后，将15μg/ml PCSK9与连续稀释的EGFwt-Fc和EGF66-Fc融合蛋白混合，将其加入细胞并在37℃温育4小时。将细胞用PBS清洗并用2.5mM EDTA(EMD；Gibbstown，NJ)使其脱附。在离心后，将重悬的细胞与1:20抗-LDLR抗体(Progen Biotechnik；Heidelberg，Germany)在冰上孵育15分钟。然后将样品用PBS洗涤并将其与1:200稀释的山羊抗小鼠IgGAlexa 
Figure BDA0000442582370000291
488(Invitrogen；Carlsbad，CA)在冰上孵育15分钟。在两次PBS洗涤后，将细胞重悬在含有10μg/ml碘化丙啶的PBS中并在双激光流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson；Franklin Lakes，NJ)上进行分析。使用相对荧光单位(RFU)来量化HepG2细胞表面上的LDLR表达水平。细胞表面LDLR水平被表示为在不存在PCSK9的情况下测量的LDLR水平(=对照)的百分比。
EGF66-Fc蛋白以依赖于浓度的方式防止PCSK9介导的LDLR降解(图5)。在测试的最高浓度(5μM)，LDLR表面水平为在不存在PCSK9的情况下测量的对照水平的约80%。相比之下，在测试的最高浓度(20μM)，EGFwt-Fc在恢复LDLR表面水平方面的能力低得多(图5)：达到对照水平的56%。对于EGF66-Fc和EGFwt-Fc，使LDLR水平恢复至对照的50%的浓度(有效浓度，EC50)分别为1.6μM和11μM。
为了确定提高的亲和力和细胞效力是否能够转化为提高的治疗潜力，我们比较了EGFwt-Fc和EGF66-Fc在小鼠模型中在用PCSK9处理后在拯救肝LDLR方面的效果。八周龄雄性C57BL/6小鼠购自被批准的厂家并且在开始实验前家养2周。基于体重将小鼠随机分为3组(3只小鼠/组)，并且通过静脉注射途径以指定剂量给予其EGFwt-Fc或EGF66-Fc融合蛋白或PBS(载体/对照)。2小时后，小鼠被静脉注射给药以在PBS中的30μg的PCSK9。1小时后，收集肝并速冻。
将约200mg的每种肝在补充以蛋白酶抑制剂混合物(Cocktail)(
Figure BDA0000442582370000301
Native Membrane Protein Extraction Kit(非变性膜蛋白提取试剂盒)，货号444810，Calbiochem)的提取缓冲液1中使用TissueLyser(Qiagen)根据制造商的说明书均质化。将裂解液离心，并将细胞沉淀(pellet)重悬在补充以蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)的提取缓冲液II中。4℃温和搅拌30分钟后，将样品离心，并且使用Bradford测定来量化含有膜蛋白的上清液。加入4X SDS样品缓冲液。对于每个组(n=3)，将肝蛋白质汇集达总计100μg蛋白并且煮5分钟。将样品加载到4-12%Bis-Tris Midi凝胶上，并且通过SDS-PAGE分离蛋白。在使用
Figure BDA0000442582370000302
(Invitrogen)转移至硝化纤维素膜后，将膜用5%脱脂奶在室温封闭1小时。将印迹(blot)与1:200抗-LDLR(Abcam)在5%脱脂奶中4℃温育过夜。将印迹用TBS-T(10mMTRIS，pH8.0，150mM NaCl，0.1%
Figure BDA0000442582370000303
20)洗涤三次，达15分钟。然后将印迹与1:5000抗-兔辣根过氧化酶(GE Healthcare)在5%脱脂奶中温育1小时。在用TBS-T洗涤后，使用ECL-Plus(GE Healthcare)并且曝光于XAR胶片(Kodak)来使蛋白可视化。然后将所述膜用TBS-T洗涤并且与1:5000抗-运铁蛋白受体(Invitrogen)在室温温育2小时。在用TBS-T洗涤后，将膜在1:10000抗-小鼠辣根过氧化酶(GE Healthcare)中温育1小时并再次洗涤。使用ECL Plus并曝光于XAR胶片来使蛋白可视化。
首先给小鼠注射载体、EGFwt-Fc和EGF66-Fc，之后推注重组人PCSK9(30μg/小鼠)，并且在1小时后收集肝并进行分析。如在图6中所示，PCSK9处理显著降低肝LDLR至正常水平(未进行PCSK9处理)的<10%。利用EGFwt-Fc的预处理在最高剂量(60mg/kg)将肝LDLR拯救至小于对照水平的50%，而利用EGF66-Fc的预处理在20mg/kg的中等剂量能够将LDLR水平拯救至70%并且在最高剂量(60mg/kg)将LDLR水平拯救至～100%。该结果说明：在体内，提高的EGF66的亲和力转化为显著提高的拮抗能力。
实施例5：EGF变体的结构分析
建立EGF66的模型以研究为什么EGF66结合PCSK9不需要钙以及为什么在噬菌体优化方法中选择特定的氨基酸(图9A)。利用PyMOL(ThePyMOL Molecular Graphics System，V1.2r3pre，
Figure BDA0000442582370000311
 LLC)使用PCSK9和LDL受体的EGF(A)结构域之间的复合物的结构(PDB登记号3BPS)(Kwon等，同上)，将存在于EGF66中的突变进行人工建模。在所有五种情况中，所述突变可以被容纳而不需要任何主链构象的改变。选择来自标准PyMOL旋转异构体文库的侧链几何形状(geometry)以便使与EGF结构域的其他原子或PCSK9的原子的冲突最小化。该文库中的几何形状来源于在公开的蛋白结构中通常出现的侧链构象并且因此代表低能态。在D310K的例子中，扩充初始低能赖氨酸侧链构象：在χ-3，～10°位移，在χ-4，～120°变化，以使Nε原子邻近在野生型蛋白中观察到的Ca2+离子。因为所有侧链二面角是交错的并且与其他蛋白原子的冲突最小，所以此位置处的赖氨酸可以采取低能构象，其中铵离子在Ca2+-结合环中，而主链构象没有显著变化。
D299在26个噬菌体序列的14个中得到保留。虽然比距PCSK9的N末端(S153)的氢键结合距离稍远，但是天冬氨酸侧链可以参与与PCSK9N-端胺的有利极性接触(Bottomley等，同上)。从模拟的结构中，在EGF66中的该位置处选择丙氨酸的理由不是非常明显的。野生型EGF中的N301参与两个分子内氢键但是不与PCSK9进行任何分子间接触。在噬菌体选择期间，野生型残基被保留(10例)或被亮氨酸替换(16例)。EGF66的模型表明此位置中的亮氨酸能够参与与PCSK9的I369(Cγ1和Cδ1)、V380(Cα)和S381(Cβ)的有利的疏水相互作用。V307位于主要EGFβ-发夹的一端。在此位点处的大部分的噬菌体选择是将全部有助于稳定β-链构象的β-分支的氨基酸。此外，EGF66中的V307I置换也可以允许另外的与PCSK9的D374(Cβ)、V380(Cγ2)或C378(Sγ)的疏水接触。N309的侧链涉及两个氢键，一个是分子内的(与E316Oε)，一个是分子间的(与PCSK9-T377Oγ1)。除了一个以外的所有噬菌体克隆将N309替换为碱性残基。该偏好可能是由增加的与E316的相互作用(稳定EGFβ-发夹)或提高的碱性残基的亚甲基和非极性斑块之间的疏水接触所致，所述非极性斑块位于由C375-C378二硫键和T377的甲基形成的PCSK9表面上。
两个另外的残基在噬菌体-文库中变化但是保留EGF66中的野生型残基。在残基295处的天冬酰胺存在于除了一个以外的所有噬菌体序列中，说明其两个侧链氢键相互作用(分子内的，与C297主链N；分子间的，与D238Oδ)的重要性。残基306是野生型EGF结构域中的组氨酸并且已经提出其在低pH经由与PCSK9的D374的电荷-电荷相互作用而有助于增强LDLR对PCSK9的亲和力(Bottomley等，同上)。咪唑环也靠着EGF结构域内的P320的侧链堆积。H306的芳香性在所有噬菌体序列中都得到保留(His、Trp、Tyr)。组氨酸、色氨酸和酪氨酸都能够接触P320侧链，这表明此种环堆积可能对于稳定EGF的N端和C端子结构域的定向是重要的。之前已经证实EGF-H306Y更紧密地结合PCSK9，其通过与D374的直接氢键的潜在形成阐释(Bottomley等，同上)。
Ca2+的螯合是EGF结构域的一般特性，并且猜测其使结构域折叠稳定，并且还推测其在结构域间的相互作用中起作用(Handford等(1991)Nature351:164-167)。LDLR的EGF(A)结构域螯合Ca2+，并且D310的侧链在接触该离子方面起重要作用。此外，EGF与PCSK9结合是依赖Ca2+的。考虑到该作用，来源于26个噬菌体中的13个的序列在该位点保留天冬氨酸可能也就不令人惊奇了。然而，来源于26个噬菌体中的9个的序列的D310被替换为赖氨酸，这将不能够螯合Ca2+。值得注意，在不存在外源添加的Ca2+的情况下进行噬菌体选择，这可以给在此位置具有补偿性氨基酸变化的噬菌体克隆增加选择压力。不希望受制于理论，D310K突变可以减少使EGF能够与PCSK9结合中对Ca2+的需要。一个有趣的可能性是：K310的侧链氨基起到与Ca2+离子类似的作用，其通过使用极性相互作用在309-316β-发夹(L311和G314的主链氧)和EGF66的N端链(例如M292和T294的主链氧；E296的侧链)之间搭桥由此稳定后者在EGF结构域上的堆积(图9B)。
虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。
Figure IDA0000442582430000021
Figure IDA0000442582430000031
Figure IDA0000442582430000051
Figure IDA0000442582430000071
Figure IDA0000442582430000081

Claims (27)

1.结合PCSK9的多肽，其包含以下氨基酸序列：
GX1X2ECLX3NX4GGCSX5X6CX7X8LKIGYECLCPDGFQLVAQRRCE,
其中X1是D或T；X2是L或N；X3选自由以下组成的组：A、D、E、H、K、L、R、S、V和Y；X4是L或N；X5选自由以下组成的组：H、W和Y；X6选自由以下组成的组：I、L、T和V；X7选自由以下组成的组：K、N、R和Q；并且X8选自由以下组成的组：A、D、K、N、Q和R(SEQ ID NO:1)。
2.权利要求1的多肽，其中所述多肽包含选自由SEQ ID NOs:2-27组成的组的氨基酸序列。
3.权利要求1或2的多肽，其还包含免疫球蛋白序列。
4.权利要求3的多肽，其中所述免疫球蛋白序列是抗体恒定区。
5.权利要求4的多肽，其中所述抗体恒定区是Fc区。
6.权利要求5的多肽，其中所述Fc区来自IgG抗体。
7.分离的核酸，其编码权利要求1-6中任一项的多肽。
8.载体，其包含权利要求7的核酸。
9.权利要求8的载体，其中所述载体是表达载体。
10.宿主细胞，其包含权利要求8或9的载体。
11.权利要求10的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核的。
12.权利要求10的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核的。
13.制备权利要求1-6中任一项的多肽的方法，所述方法包括：在适于表达编码所述多肽的核酸的条件下培养权利要求10的宿主细胞。
14.权利要求13的方法，其还包括：从所述宿主细胞回收所述多肽。
15.药物组合物，其包含：权利要求1-6中任一项的多肽和药用载体。
16.降低受试者的LDL-胆固醇水平的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项的多肽。
17.治疗受试者的胆固醇相关疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项的多肽。
18.治疗受试者的高胆固醇血症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项的多肽。
19.权利要求16、17或18的方法，其还包括：向所述受试者施用有效量的第二药物，其中所述多肽是第一药物。
20.权利要求19的方法，其中所述第二药物提高LDLR水平。
21.权利要求19的方法，其中所述第二药物降低LDL-胆固醇水平。
22.权利要求19的方法，其中所述第二药物包含他汀类。
23.权利要求22的方法，其中所述他汀类选自由以下组成的组：阿托伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，普伐他汀，罗舒伐他汀，辛伐他汀，及其任意组合。
24.权利要求19的方法，其中所述第二药物提高HDL-胆固醇水平。
25.抑制样品中PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法包括：向所述样品添加权利要求1-6中任一项的多肽。
26.抑制受试者中PCSK9与LDLR结合的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的权利要求1-6中任一项的多肽。
27.检测样品中PCSK9蛋白的方法，所述方法包括：
(a)将所述样品与权利要求1-6中任一项的多肽接触；和
(b)检测所述多肽和所述PCSK9蛋白之间的复合物的形成。
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