MX2010011499A - Variantes de proproteina neutralizante de convertasa subtilisina kexina de tipo 9 (pcsk9) y sus usos. - Google Patents

Abstract

Se describen variantes PCSK9 neutralizantes que interactúan con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR). Se describen métodos y composiciones para tratar trastornos a través de la administración de una cantidad farmacéuticamente efectiva de una variante PCSK9 neutralizante.

Description

VARIANTES DE PROPROTEINA NEUTRALIZANTE DE CONVERTASA SUBTILISINA KEXINA DE TIPO 9 (PCSK9) Y SUS USOS Campo de la Invención La presente invención se refiere a variantes de la proproteína de convertasa subtilisina kexina de tipo 9 (y sus moléculas relacionadas) y métodos para utilizar las variantes (y sus moléculas relacionadas) para tratar varios trastornos.

Antecedentes de Varias Modalidades La proproteína de convertasa subtilisina kexina de tipo 9 (PCSK9, por sus siglas en inglés) es una serina proteasa involucrada en la regulación de los niveles de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR, por sus siglas en inglés) (Horton et al, 2007; Seidah and Prat, 2007) . Los experimentos in vitro han demostrado que la adición de PCSK9 a células HepG2 disminuyen los niveles de LDLR en la superficie celular (Benjannet et al, 2004; Lagace et al, 2006; Maxwell et al, 2005; Park et al, 2004) . Los experimentos con ratones han demostrado que un aumento en los niveles de la proteína PCSK9 disminuye los. niveles de la proteína LDLR en el hígado (Benjannet et al, 2004; Lagace et al, 2006; Maxwell et al, 2005; Park et al, 2004), mientras los ratones agénicos PCSK9 tuvieron niveles incrementados de LDLR (Rashid et al, 2005). Adicionalmente , varias mutaciones de PCSK9 humano dan como resultado ya sea un aumento o Ref. 214332 disminución en los niveles de LDL en plasma que han sido identificados (Kotowski et al, 2006; Zhao et al, 2006). PCSK9 ha demostrado que interactúa directamente con la proteína LDLR, endocitada junto con el LDLR, y co- inmunofluorescencia con el LDLR a través de la trayectoria endosómica (Lagace et al, 2006) . La degradación, del LDLR a través de PCSK9 no ha sido observada y el mecanismo a través del cual disminuye los niveles de la proteína LDLR extracelular es incierto.

PCSK9 es una prohormona-proproteína convertasa en la familia de la subtilisina (S8) de serinas proteasas (Seidah et al, 2003) . Los humanos tienen nueve prohormonas-proproteínas convertasas que pueden dividirse entre las subfamilias S8A y S8B (Rawlings et al, 2006). La furina, PC1/PC3, PC2 , PACE4, PC4 , PC5/PC6 y PC7/PC8/LPC/SPC7 se clasifican en la subfamilia S8B. Las estructural de cristal y NMR de diferentes dominios de furina de ratón y PCI revelaron pro-dominios y dominios catalíticos de tipo subtilisina, y un dominio P directamente C-terminal con el dominio catalítico (Henrich et ah, 2003; Tangrea et al, 2002). Con base en la similitud de la secuencia de aminoácido dentro de esta subfamilia, los siete miembros se pronostican como teniendo estructuras similares (Henrich et al, 2005). SKI-1/SIP y PCSK9 se clasifican en la subfamilia S8A. Las comparaciones de secuencia con estas proteínas también sugieren la presencia de los pro-dominios del dominio catalítico de tipo subtilisina (Sakai et ah, 1998; Seidah et al, 2003; Seidah et al, 1999) . En estas proteínas la secuencia de aminoácido C-terminal para el- dominio catalítico es más variable y no sugiere la presencia de un dominio P.

Las prohormona-proproteína convertasas se expresan como zimógenos y maduran a través de un procedimiento de múltiples pasos. La función del pro-dominio en este procedimiento es de dos veces. El pro-dominio primero actúa sobre un chaperón y se requiere para el pliegue apropiado del dominio catalítico (Ikemura et al, 1987). Una vez que se pliega el dominio catalítico, la autocatálisis ocurre entre el pro-dominio y el dominio catalítico. Después de esta reacción de división inicial, el pro-dominio permanece unido al dominio catalítico en donde actúa como un inhibidor de la actividad catalítica (Fu et al, 2000). Cuando las condiciones son correctas, la maduración avanza con un segundo evento autocatalítico en el sitio dentro del pro-dominio (Anderson et al, 1997). Después de este segundo evento de división ocurre la disociación del pro-dominio del dominio catalítico, dando origen a una proteasa activa.

La autocatálisis del zimógeno PCSK9 ocurre entre GInl52 y Serl53 (VFAQISIP) (Naureckiene et al, 2003), y ha demostrado que se requiere para su secreción de las células (Seidah et al, 2003). Un segundo evento autocatalítico en el sitio dentro del pro-dominio de PCSK9 no ha sido observado.

La PCSK9 purificada se forma de dos especies que pueden separarse a través de SDS-PAGE no de reducción; el pro-dominio a 17 Kd, y el dominio catalítico más C-terminal a 65 Kd. PCSK9 no se ha aislado sin su pro-dominio inhibidor y las mediciones de la actividad catalítica de PCSK9 han sido variables (Naureckiene et al, 2003; Seidah et al, 2003).

Breve Descripción de la Invención En algunas modalidades, la invención comprende una variante PCSK9 y/o uno de sus usos .

En algunas modalidades, la variante PCSK9 puede ser una variante PCSK9 neutralizante que puede incluir un dominio Pro/Cat, o uno de sus fragmentos, que se une a un receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) y un dominio V inactivo para la actividad de LDLR. El dominio V inactivo no da como resultado la degradación LDLR.

En algunas modalidades, la invención comprende una molécula de ácido nucleico que codifica para una variante PCSK9 (o variante neutralizante) .

En algunas modalidades, la invención comprende una célula hospedera que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en la presente que codifica una variante PCSK9.

En algunas modalidades, invención comprende un vector que comprende una molécula de ácido nucleico descrita en la presente que codifica una variante PCSK9.

En algunas- modalidades, la invención comprende una composición farmacéutica que comprende por lo menos una variante PCSK9 neutralizante (o una secuencia de ácido nucleico que codifica la variante PCSK9 neutralizante) y un portador y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En algunas modalidades, la invención comprende un método para tratar o prevenir una afección asociada' con elevado colesterol en el suero en un paciente. En algunas modalidades, el método puede comprender administrar a un paciente en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de por lo menos uno de los compuestos descritos en la presente (que incluye, por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante PCSK9 neutralizante) .

En algunas modalidades, la invención comprende un método para inhibir la unión de PCSK9 endógeno a LDLR én un paciente. Én algunas modalidades, el método comprende administrar una cantidad efectiva de al menos uno de los compuestos descritos en la presente (que incluye, por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante PCSK9 neutralizante) a un sujeto en la necesidad del mismo.

En algunas modalidades, la invención comprende un método para tratar o prevenir una afección asociada con elevado colesterol en el suero en un sujeto. En algunas modalidades, el método puede comprender administrar a un sujeto en la necesidad del mismo una cantidad efectiva de por lo menos uno de los compuestos descritos en la presente (que incluye, por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante PCSK9 neutralizante) simultánea o secuencialmente con un agente - que eleva la disponibilidad de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) .

En algunas modalidades, la invención comprende un método para disminuir el colesterol en el suero en un sujeto. En algunas modalidades, el método puede comprender administrar a un sujeto una cantidad efectiva de por lo menos uno de los compuestos descritos en la presente (que incluye, por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante PCSK9 neutralizante) .

En algunas modalidades, la invención comprende un método para disminuir el colesterol en el suero en un sujeto. En algunas modalidades, el método puede comprender administrar a un sujeto una cantidad efectiva de por lo menos uno de los compuestos descritos en la presente (que incluye, por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante PCSK9 neutralizante) simultánea o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) .

En algunas modalidades, la invención comprende el uso de por lo menos uno de los compuestos descritos en la presente (que incluye., por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante PCSK9 neutralizante) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de hipercolesterolemia .

En algunas modalidades, la invención comprende por lo menos uno de los compuestos descritos en la presente (que incluye, por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante PCSK9 neutralizante) para utilizarse como un medicamento.

En algunas modalidades, la invención comprende por lo menos uno de los compuestos descritos en la presente (que incluye, por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante · y/o una secuencia de ácido nucleico que codifica una variante PCSK9 neutralizante) para utilizarse en el tratamiento de hipercolesterolemia.

En algunas modalidades, la invención comprende una composición farmacéutica que comprende un dominio Pro/Cat, o uno de sus fragmentos, que se une al receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR) , y un domino V inactivo para la actividad de LDLR. El dominio V inactivo no da como resultado la degradación de LDLR. La composición farmacéutica además comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En algunas modalidades, la invención comprende una composición farmacéutica que comprende un dominio Pro/Cat o uno de sus fragmentos, que se une al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) y un dominio V inactivo para la actividad de LDLR. El dominio V inactivo no da como resultado la degradación de LDLR. El dominio pro/cat está presente en una cantidad suficiente para el tratamiento de un trastorno relacionado con el colesterol .

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1A describe una secuencia de aminoácido de la forma madura de PCSK9 con el pro-dominio subrayado.

Las Figuras 1BX-1B describen secuencias de aminoácido de ácido nucleico de PCSK9 con el pro-dominio subrayado y la secuencia de señal en negrillas.

La Figura 1C es una comparación de las secuencias de PCSK9 de varios organismos (cualquier "O" en las Figuras 1C-1E son actualmente "Q" ) .

La Figura ID es una continuación de la Figura 1C. La Figura 1E es una continuación de la Figura ID. La Figura 1F es una alineación del dominio Cat de la proteína PCSK9 de SEC ID NO: 3 con otro dominio Cat de otra proteína PCSK9 La Figura 1G es una alineación del dominio Cat de la proteína PCSK9 de SEC ID NO: 3 con otro dominio Cat de otra proteína PCSK9.

La Figura 1H es una alineación del dominio Cat de la proteína PCSK9 de SEC ID NO: 3 con otro dominio Cat de otra proteína PCSK9.

La Figura II es una alineación de una secuencia de consenso para la secuencia de aminoácido de LDLR.

La Figura 1J es una continuación de la alineación y de la secuencia de consenso para la secuencia de aminoácido de LDLR presentada en la Figura II.

La Figura 1K es una alineación y la secuencia de consenso para la secuencia de aminoácido de LDLR.

La Figura 1L es una continuación de la alineación y la secuencia de consenso para la secuencia de aminoácido de LDLR presentada en la Figura 1K.

Las Figuras lMi y 1M2 describen una modalidad de una proteína "PCSK9.

Las Figuras lNi y 1N2 describen una modalidad de una proteína PCSK9.

Las Figuras 10i y 102 describen una modalidad de una proteína . PCSK9.

Las Figuras lPi y 1P2 describen una modalidad de una proteína PCSK9.

Las Figuras lQi y 1Q2 describen una modalidad de una proteína PCSK9.

Las Figuras 1RX y 1R2 describen una modalidad de una secuencia de consenso para la proteína PCSK9.

Las Figuras lSi y 1S2 describen una modalidad de una proteína PCSK9 humana.

La Figura 2 es una gráfica que describe los resultados de un ensayo de unión entre LDLR y PCSK9 de longitud completa marcada con biotina, que compite con ya sea a) PCSK9 de longitud completa sin marcar, b) los residuos no marcados 31-447 de PCSK9 , o c) el dominio V no marcado de PCSK9 (residuos 450-692) .

La Figura 3A es una gráfica que describe los resultados de la actividad de los residuos 31-447 de PCSK9 en la absorción de LDL.

La Figura 3B es una gráfica que describe los resultados de la actividad de los residuos 31-447 de PCSK9 en la absorción de LDL.

La Figura 4 es una descripción de un Western blot que compara el efecto de PCSK9 de longitud completa contra los residuos 31-447 de PCSK9 (un fragmento Pro/Cat) en los nivele de proteína de LDLR y la absorción de PCSK9. Como se puede ver en el lado izquierdo del gel, PCSK9 de longitud completa (FL PC9) da como resultado una disminución en LDLR, mientras los residuos 31-447 de PCSK9 (un fragmento Pro/Cat que funciona como una variante PCSK9 neutralizante) no da como resultado una disminución en LDLR.

La Figura 5 es una descripción de la estructura de PCSK9 y la sección EGFa de LDLR.

La Figura 6 es una descripción de un modelo estructural de PCSK9 y LDLR.

La Figura 7 es una descripción del modelo estructural de PCSK9 y LDLR desde una perspectiva alternativa.

La Figura 8 es una gráfica que describe los resultados de la actividad de - la variante D374Y de los residuos 31-447 de PCSK9 (un ejemplo de otra variante del dominio Pro/Cat) en la absorción de LDL.

La Figura 9 es una gráfica que describe los resultados de un ensayo de competencia que incluye la variante D374Y de los residuos 31-447 de PCSK9.

Descripción Detallada de la Invención La proproteína de convertasa subtilisina de kexina tipo 9 (PCSK9) es una serina proteasa involucrada en la regulación de los niveles de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) . Se cree que PCSK9 nativo se une a LDLR in vivo y está involucrada en la degradación de LDLR. Esto puede ser problemático debido a la reducción en LDLR disponible que da como resultado una menor unión entre LDLR y LDL, que a su vez da como resultado más LDL en el suero del sujeto, dando como resultado un aumento en el colesterol en el suero.

La proteína PCSK9 de longitud completa incluye una secuencia de señal (generalmente los aminoácidos 1-30) , un pro-dominio N-terminal (dominio "Pro", generalmente los aminoácidos 31-152), un dominio catalítico de tipo subtilisina (dominio "Cat" , generalmente los aminoácidos 153-446), una región de bucle (generalmente los aminoácidos 447-453) y un dominio C-terminal (dominio "V", generalmente los aminoácidos 454-692) .

Algunas modalidades de la invención se refieren al descubrimiento de la habilidad de PCSK9 (o una de sus variantes) para unirse a LDLR que puede separarse de la habilidad de PCSK9 para efectivamente degradar o reducir la cantidad de LDLR disponible. Se ha descubierto que mientras partes de los dominios Pro y/o Cat están involucrados en la unión a PCSK9, el dominio V es importante para la efectiva degradación de LDLR. Además, las variantes de PCSK9 pueden incluir una parte activa del dominio Pro y/o Cat que puede utilizarse para bloquear PCSK9 nativo de la unión a LDLR. De esta forma, en algunas modalidades, la invención se refiere a una variante PCSK9 neutralizante que puede bloquear PCSK9 nativa para la unión a LDLR, mientras la variante PCSK9 neutralizante misma no degradará efectivamente LDLR. En algunas modalidades, la invención comprende una variante de PCSK9 que aún incluye un dominio Pro/Cat activo y que carece de un dominio V funcional (y de esta forma carece de la habilidad de efectivamente disminuir LDLR en un sujeto). Esta variante puede utilizarse para evitar o reducir la PCSK9 nativa de unirse a LDLR. A su vez, esto puede efectivamente elevar el nivel de LDLR en un sujeto y dar como resultado niveles inferiores de LDL en el suero.

Algunas modalidades de la invención se refieren al descubrimiento de que el uso de una variante PCSK9 neutralizante (por ejemplo, una variante que incluye un dominio Pro/Cat activo y un dominio V inactivo) puede dar como resultado que la variante PCSK9 neutralizante competitivamente bloquee y evite que la PCSK9 nativa se una a y degrade. LDLR, mientras aún permite que LDLR lleve a cabo su papel benéfico de secuestrar LDL. Es decir, la variante neutralizante de PCSK9 puede utilizarse para disminuir LDL en el suero en un sujeto. De esta forma, en algunas modalidades, la invención comprende una variante PCSK9 neutralizante (o su uso) , que puede unirse a LDLR y evitar que PCSK9 nativa se una a LDLR, mientras aún permite que LDLR sé una a . y actúe sobre LDL.

Algunas modalidades de la invención se refieren al descubrimiento o el uso de una variante PCSK9 neutralizante (por ejemplo, una variante que incluye un dominio Pro/Cat activo y un dominio V inactivo) puede dar como resultado que la variante PCSK9 neutralizante competitivamente bloquee y evite que la PCSK9 nativa se una a y degrade LDLR, mientras aún permite que LDLR se recicle (por ejemplo, la endocitosis y después regrese de nuevo a la membrana plasmática. De esta forma, en algunas modalidades, la invención comprende una variante PCSK9 neutralizante (o su uso) que puede unirse a LDLR y evitar que PCSK9 nativa se una a LDLR, mientras aún permite que LDLR se recicle.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste o consiste esencialmente de algunos o todos los dominios Pro y/o Cat de PCSK9. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante no incluye algunos o todos los dominios V. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante no tiene un dominio V degradante de LDLR completamente funcional. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante tiene un dominio V inactivo. Como se apreciará por un experto en la técnica, algunas de estas modalidades pueden ser benéficas en situaciones en donde se desea disminuir el colesterol en suero en un sujeto, tal como en hipercolesterolemia . Las variantes PCSK9 neutralizantes pueden utilizarse en varios métodos y composiciones para tratar sujetos con elevados niveles de colesterol en suero, en riesgo de elevados niveles de colesterol en el suero o en los que podrían beneficiarse una reducción en sus niveles de colesterol en suero. De esta forma, varios métodos y técnicas para disminuir, mantener, o prevenir un aumento de colesterol en el suero también se describen en la presente.

Las secuencias de aminoácido PCSK9 humanas ilustrativas se presentan como SEC ID NOs : 1 a 3. Una secuencia de codificación PCSK9 humana ilustrativa se presenta como SEC ID NO: 2, en la Figura 1A (se describe el dominio "pro" de la proteína como subrayado) y en la Figura IB (describe la señal de secuencia en negrillas y el dominio pro subrayado) . Las variantes adicionales de PCSK9 (o el dominio Cat de PCSK9) se muestran en la Figuras 1C-1H. La estructura de la proteína PCSK9 recientemente ha sido resuelta a través de dos grupos (Cunningham et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, y Piper et al., Structure, 15: 1-8, 2007), la totalidad de ambas se incorpora aquí por referencia.

Por conveniencia, las siguientes selecciones generalmente describen los varios significados de los términos utilizados en la presente. Después de esta explicación, los aspectos generales con respecto a las variantes PCSK9 neutralizantes se explican, seguidos por ejemplos específicos.

Definiciones y Modalidades Se entiende que tanto la descripción general anterior como la siguienté descripción detallada son ilustrativas y explicativas solamente y no restringe la invención como se reivindica. En esta solicitud, el uso de singular incluye el plural a menos que se manifieste específicamente lo contrario. En esta descripción, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se declare lo contario. Además, el uso del término "incluyendo" así como otras formas tales como "incluye" y "incluido" no es limitante. También, los términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se especifique lo contrario. También, el uso del término "porción" puede incluir la parte de una fracción o la fracción completa.

La sección de encabezados utilizados en la presente es para propósitos de organización solamente y no se construyen como limitantes del tema descrito en la presente. Todos los documentos, o porciones de documentos, citados en esta solicitud, incluyen pero no se limitan a patentes, solicitudes de patente, artículos, libros y tratados, se incorporan expresamente por referencia en su totalidad para cualquier propósito. Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, deberán de entenderse como teniendo los siguientes significados: El término "proproteína de convertasa a subtilisina kexina de tipo 9) o "PCSK9" , se refiere a un polipéptido según lo dispuesto en SEC ID NO : 1 y/o 3 o sus fragmentos, así como polipéptidos relacionados, que incluyen, pero no se limitan a, variantes alélicas, variantes de empalme, variantes derivadas, variantes de sustitución y/o variantes de inserción que incluye la adición de una metionina N-terrainal, polipéptido de fusión y homólogos inter-especies . Los ejemplos de proteína relacionadas son según lo dispuesto en las Figuras 1C-1H. En algunas modalidades, un polipéptido PCSK9 incluye residuos terminales, tales como, pero no limitándose a, residuos de secuencia líder, residuos de activación, residuos de metionina amino-terminal , residuos de lisina, residuos de etiqueta, y/o residuos de proteína de fusión. "PCSK9" también ha sido referido como FH3 , NARC1, HCH0LA3 , proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9, y apoptosis neural regulada por convertasa 1. El gen PCSK9 codifica una proteína de la proproteína convertasa que pertenece a la subfamilia de proteinasa K de la familia de subtilasa secretora. El término "PCSK9" denota tanto la proproteína como el producto generado después la aut-ocatálisis de la proproteína. Cuando solamente se hace referencia al producto autocatalizado, la proteína puede ser referida como la PCSK9 "dividida" o "procesada" . Cuando solamente se hace referencia la forma inerte, la proteína puede ser referida como la forma "inerte", "pro-forma" o "sin procesar" de PCSK9. El término PCSK9 como se utiliza en la presente también incluye alelos de existencia natural, tales como las mutaciones D374Y, D374H, S127R, F216L, R46L, R237W, L253F, A443T, H553R, y otras (Kotowski IK et al, A spectrum of PCSK9 alíeles contributes to plasma levéis of low-density lipoprotein cholesterol, Am J. Hum. Genet . 2006; 78:410-422). El término PCSK9 también abarca moléculas de PCSK9 que se incorporan de las modificaciones post-traducción de la secuencia de aminoácido de PCSK9 , tales como las secuencias PCSK9 que han sido glicosiladas , PEFGiladas, las secuencias PCSK9 a partir de las cuales la secuencia de señal se ha dividido, la secuencia PCSK9 a partir de la cual su prodominio ha sido dividido del dominio catalítico pero no separado del dominio catalítico (por ejemplo, Figuras 1A y IB) .

El término "actividad de PCS 9" incluye cualquier efecto biológico de PCSK9. En algunas modalidades, la actividad de PCSK9 incluye la habilidad de PCSK9 para interactuar o unirse a un sustrato o receptor. En algunas modalidades, la actividad de PCSK9 está representada por la habilidad de PCSK9 para unirse a un receptor LDL (LDLR) . En algunas modalidades, PCSK9 se une a y cataliza una reacción que involucra LDLR. En algunas modalidades, la actividad de PCSK9 incluye la habilidad de PCSK9 para alterar (por ejemplo, reducir) la disponibilidad de LDLR. En algunas modalidades, la actividad de PCSK9 la habilidad de PCS 9 para aumentar la cantidad de LDL en un sujeto. En algunas modalidades,, la actividad de PCSK9 incluye la habilidad de PCSK9 para disminuir la cantidad LDLR que está disponible para unirse a LDL. En algunas modalidades "la actividad de PCSK9" incluye cualquier actividad biológica que resulta de la señalización de PCSK9. Las actividades ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, la unión de PCSK9 a LDLR, la actividad enzimática dé PCSK9 que divide LDLR u otras proteínas, la unión de PCSK9 a proteínas diferentes de LDLE que facilitan la acción de PCSK9, PCSK9 que altera la secreción de APOB (Sun X-M et al, "Evidence for effect of mutant PCSK9 on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia, Human Molecular Genetics 14: 1161-1169, 2005 y Ouguerram K et al, "Apolipoprotein B100 metabolism in autosomal-dominant hypercholesterolemia related to mutations in PCSK9, Arterioscler thromb Vase Biol. 24: 1448- 1453, 2004), PCSK9 ' s role in liver regeneration and neuronal - cell differentiation (Seidah NG et al, "The secretory proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase 1 (NARC-I) : Liver regeneration and neuronal differentiation" PNAS 100: 928-933, 2003), y PCSK9s role in hepatic glucose metabolism (Costet et al., "Hepatic PCSK9 expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding protein Ic" J. Biol. Chem. 281(10) :621 1- 18, 2006). La actividad de PCSK9 puede ser diferente de los términos "dominio Pro/Cat activo" o "dominio V inactivo" como se define en la presente.

El término "hipercolesterolemia" como se utiliza en la presente, se refiere a una afección en donde los niveles de colesterol están elevados por arriba de un nivel deseado. En algunas modalidades, esto denota que los niveles de colesterol en el suero están elevados . En algunas modalidades, el nivel deseado toma en cuenta varios "factores de riesgo" que se conocen por el experto en la técnica (y se describen o se hace referencia a los mismos en la presente.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico" incluye ambos polímeros de nucleótidos de estructura de cadena individual y estructura de cadena doble. Los nucleótidos comprenden los polinucleótidos que pueden ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Las modificaciones incluyen modificaciones base tales como derivados de bromouridina y de inosina, modificaciones de ribosa tales como 2 ' , 3 ' -didesoxiribosa , y modificaciones del enlace internucleótido tales - como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoamidato El término "oligonucleótido" significa un polinucleótido que comprende 200 o menos nucleótidos. En algunas modalidades, los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases en longitud. En otras modalidades, los oligonucleótidos son de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 nucleótidos en longitud. Los oligonucleótidos pueden ser de estructura de cadena individual o de estructura de cadena doble, por ejemplo, para utilizarse en la construcción de un gen mutante . Los oligonucleótidos puede ser oligonucleótidos sentido o antisentido. Un oligonucleótido puede incluir una etiqueta, que incluye una radioetiqueta, una etiqueta fluorescente, un hapteno o una etiqueta antigénica, para ensayos de detección. Los oligonucleótidos pueden utilizarse, por ejemplo, como iniciadores PCR iniciadores de clonación o sondas de hibridación.

Una "molécula de ácido nucleico" significa un ADN o ARN de ARNm, ADNc genómico, o de origen sintético o alguna combinación de estos que no está asociada con todos o una porción de un polinucleótido en el cual el polinucleótido aislado se encuentra en naturaleza, o está enlazado a un polinucleótido que no está enlazado en naturaleza. Para propósitos de esta descripción, deberá entenderse que "una molécula de ácido nucleico que comprende" una secuencia de nucleótido particular no abarca cromosomas intactos. En moléculas de ácido nucleico aisladas "que comprenden" secuencias de ácido nucleico especificadas pueden incluir, además de las secuencias especificadas, secuencias de codificación de hasta 10 o aún otras 20 proteínas o sus porciones, o pueden incluir secuencias reguladoras operablemente enlazadas que controlan la expresión de la reacción de codificación de las secuencias de ácido nucleico recitadas, y/o pueden incluir secuencias vectores.

A menos que se especifique lo contrario, el extremo izquierdo de cualquier secuencia de polinucleótido de estructura de cadena individual explicada en la presente es el extremo 5' . La dirección hacia la izquierda de las secuencias de polinucleótido de estructura de cadena doble son referidas como la dirección 5' . La dirección de 5 ' a la adición 3' de transcriptos de ARN nacientes es referida como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia de la estructura de cadena del ADN tiene la misma secuencia que el transcripto ARN que son 5' al extremo 5' del transcripto ARN que son referidas como "secuencia en corriente arriba" ; las regiones de secuencia de la estructura de cadena de ADN que tiene la misma secuencia que el transcripto de ARN son 3' al extremo 3' del transcripto de ARN que son referidas como "secuencias en dirección 3'".

El término "secuencia de control" se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede afectar la expresión y el procesamiento de las secuencias de codificación a las cuales están ligadas.¦ La naturaleza de tales secuencias de control puede depender del organismo hospedero. En modalidades particulares, las secuencias, de control para procariotes pueden incluir un promotor, un sitio de unión de ribosoma, y una secuencia terminadora de transcripción. Por ejemplo, las secuencias de control para eucariotas pueden incluir promotores que comprenden uno o una pluralidad de sitios de reconocimiento para factores de transcripción, secuencias mej oradoras de la transcripción, y secuencias terminadoras de la transcripción. "Secuencias de control" pueden incluir las secuencias líder y/o secuencias asociadas de fusión.

El término "vector" significa cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus" utilizado para transferir la información de la codificación de la proteína en una célula hospedera.

El término "vector de expresión" o "constructor de expresión" se refiere a un vector que es adecuado para la transformación de una célula hospedera y contiene secuencias de ácido nucleico que dirigen y/o controlan (en conjunción con la célula hospedera) la expresión de una o más regiones de codificación heterólogas operativamente enlazadas al mismo. Un constructo de expresión puede incluir, pero no se limita a, secuencias que afectan o controlan la transcripción, traducción y, si están presentes lo intrones, afectan el empalme del ARN y una región de codificación operablemente enlazada al mismo.

Como se utiliza en la presente, "operablemente enlazado" significa que los componentes a los cuales se aplica el término están en una relación que les permite llevar a cabo sus funciones inherentes bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, una secuencia de control en un vector que está "operablemente enlazado" a una secuencia de codificación de proteína se liga a la misma, de tal forma que la expresión de la secuencia de codificación de proteína se logra bajo condiciones compatibles con la actividad de transcripción de las secuencias de control.

El término "célula hospedera" significa una célula que ha sido transformada, o es capaz de ser transformada, con una secuencia de ácido nucleico y por lo tanto expresar un gen de interés. El término incluye la progenie de la célula progenitora, si o no la progenie es idéntica en morfología o en genética forman la célula progenitora original, mientras el gen de interés está presente.

El término "transíección" significa la absorción de ADN foráneo o exógeno a través de una célula, y una célula ha sido "transíectada" cuando el ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección son bien conocidas en la técnica y se describen en la presente. Ver, por ejemplo, Graham et al, 1973, Virology 52:456; Sambrook et al, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al, 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene J13 : 197. Tales técnicas pueden utilizarse para introducir una o más fracciones de ADN exógenas en una célula hospedera adecuada.

El término "transformación" se refiere a un cambio en las características genéticas de la célula, y una célula ha sido transformada cuando ha sido modificada para contener nuevo ADN o ARN. Por ejemplo, una célula se transforma cuando se modifica genéticamente de su estado nativo mediante la introducción del nuevo material genético a través de transíección, transducción u otras técnicas. Después de la transfección o transducción, el ADN transformado puede recombinarse con el de la célula a través de la integración física en un cromosoma de la célula, o puede mantenerse temporalmente como un elemento episómico sin ser publicado o puede duplicarse independientemente como un plásmido. Una célula se considera que está "establemente transformada" cuando el ADN transformado se duplica con la división de la célula .

Los términos "polipéptido" o "proteína" significan una macromolécula que tiene la secuencia de aminoácido de una proteína nativa, es decir, una proteína producida por una célula de existencia natural y no recombinante ; y se produce a través de modificación genética o célula recombinante, y comprende moléculas que tienen la secuencia de aminoácido de la proteína nativa, o moléculas que tienen eliminaciones de, adiciones a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la secuencia nativa. El término también incluye polímeros de aminoácido en donde uno o más aminoácidos son análogos químicos de un aminoácido y polímeros de existencia natural correspondientes. Los términos "polipéptido" y "proteína" específicamente abarcan variantes PCSK9 neutralizantes, o secuencias que han sido eliminadas de, agregadas a, y/o sustituciones de uno o más aminoácidos de la proteína o variante PCSK9. El término "fragmento de polipéptido" se refiere a un polipéptido que tiene una eliminación amino-terminal, una eliminación carboxilo-terminal , y/o una eliminación interna según comparado con la proteína nativa de longitud completa. Los fragmentos también contener aminoácidos modificados según comparado con la proteína nativa. En algunas modalidades, los fragmentos son de aproximadamente 5 a 500 aminoácidos de largo. Por ejemplo, los fragmentos pueden ser de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-14, 14-20, 20-50, 50-70, 70-100, 100-1 10, 110-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, o 400-450 aminoácidos de largo.

El término "proteína aislada" significa que la proteína (1) está libre de por lo menos algunas otras proteínas con las cuales normalmente se encuentran, (2) está esencialmente libre de otras proteínas del mismo origen, por ejemplo, de las mismas especies, (3) se expresa a través de una célula de diferentes especies, (4) ha sido separada de por lo menos aproximadamente el 50% de polinucleótidos , lípidos, carbohidratos u otros materiales con los cuales está asociada en la naturaleza, (5) está operablemente asociada (a través de interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el cual no está asociada en la naturaleza, o (6) no ocurre en la naturaleza. Típicamente, una "proteína aislada" constituye por lo menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 25%, o al menos aproximadamente 50% de una muestra dada. El ADN, ADNc, AR , u otro ARN genómico, de origen sintético, o cualquier combinación de estos pueden codificar tal proteína aislada. Preferiblemente, la proteína aislada está sustancialmente libre de proteínas o polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que podrían interferir con su uso terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación u otro uso.

El término "aminoácido" incluye su significado normal en la técnica e incluye tanto aminoácidos de existencia natural como no natural .

Una "variante" de un polipéptido (por ejemplo, una variante PCSK9 neutralizante) comprende una secuencia de aminoácido en donde uno o más de los residuos de aminoácido se insertan en, eliminan de y/o sustituyen en la secuencia de aminoácido con relación a otra secuencia de polipéptido. Las variantes incluyen proteínas de fusión.

El término "identidad" se refiere a un relación entre las secuencias de dos o más moléculas de polipéptido o dos o más moléculas de ácido nucleico, según determinado por la alineación y la comparación de las secuencias. "Identidad porcentaje" significa el porcentaje de residuos sintéticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula con base en el tamaño de la molécula más pequeña que se está comparando. Para estos cálculos, los huecos en las alineaciones (si hay alguno) preferiblemente se tratan a través de un modelo matemático particular o programa de computadora (es decir, un "algoritmo") . Los métodos que pueden utilizarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen los descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M. , ed.), 1988, New York: Oxford University Press,· Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W. , ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M. , and Griffin, H. G. , eds . ) , 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; y Carillo et al, 1988, SIAMJ. Applied Math. 48:073.

En el cálculo del porcentaje de identidad, las secuencias que se están comparando típicamente se alinean en una forma que dan la comparación más grande entre las secuencias. Un ejemplo de un programa de computadora que puede utilizarse para determinar el porcentaje de identidad es paquete del programa GCG, el cual incluye GAP (Devereux et al, 1984, Nucí. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of isconsin, Madison, I) . El algoritmo de computara GAP se utiliza para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los cuales se va a determinar el porcentaje de identidad de secuencia. Las secuencias se alinean para una comparación óptima de su aminoácido o nucleótido respectivo ("intervalo emparejado", como se determina por el algoritmo) . Una penalidad de abertura de hueco (que se calcula como 3x de la diagonal promedio, en donde la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se está utilizando; la "diagonal" es la puntuación o el número asignado a cada comparación de aminoácido perfecta a través de una matriz se comparación particular) y una penalidad de extensión de hueco (es usualmente 1/10 veces la penalidad de abertura.de hueco), así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se utilizan junto con el algoritmo. En algunas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver, Dayhoff et al, 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89: 10915-10919 for the BLOSUM 62 comparison matrix) también se utiliza para el algoritmo.

Los ejemplos de parámetros que pueden utilizarse en la determinación del porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótido utilizando un programa GAP son como siguen: Algoritmo: Needleman et al, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453 - Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al, 1992, supra Penalidad de hueco: 12 (pero sin penalidad para huecos extremos) Penalidad de longitud de hueco: 4 - Umbral de Similitud: 0 Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden dar como resultado la comparación de solamente una corta región de las dos secuencias, y esta pequeña región alineada puede tener una identidad de secuencia muy alta aún cuando existe una relación significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, el método de alineación seleccionada (programa GAP) puede ajustarse si se desea para dar como resultado una alineación que abarca por lo menos 50 u otro , número de aminoácidos contiguos del polipéptido obj etivo .

Como se utiliza en la presente, los 20 aminoácidos convencionales (por ejemplo, de existencia natural) y sus abreviaturas siguen en uso convencional. (Ver Immunology—A Synthesis (2a Edición, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds . , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), que se incorpora en la presente por referencia para cualquier propósito. Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los 20 aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como a-, a-aminoácidos disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden componentes adecuados para polipéptidos . Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 2-hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, e-?,?,?-trimetil-lisina, e-?-acetil-lisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N- formilmetionina , 3 -metilhistidina , 5-hidroxilisina, s-?-metilarginina y otros aminoácidos similares e aminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina . En la anotación de polipéptido utilizada en la presente, la dirección hacia la izquierda en la dirección amino-terminal y la dirección hacia la derecha es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con el uso estándar y de convención.

Similarmente, a menos que se especifique lo contrario, el extremo hacia la izquierda de la secuencia de polinucleótido de estructura de cadena individual es el extremo 5'; la dirección hacia la izquierda de la secuencias de polinucleótido de estructura de cadena doble son referidas como la dirección 5'. La dirección de 5' a la adición de 3' de los transcriptos de ARN nacientes es referida como la dirección de transcripción; las regiones de secuencia de la estructura de cadena de ADN están en la misma secuencia que el ARN y que son 5' para el extremo 5' del transcripto ARN son referidas como "secuencias en dirección 5'"; las regiones de secuencia de la estructura de cadena de ADN que tiénen las mismas secuencias que el ARN y que son 3' para el extremo 3' del transcripto ARN son referidas como "secuencias en dirección 5 " " .

Las sustituciones de aminoácido conservadoras pueden abarcar residuos de aminoácido de existencia no natural, que típicamente se incorporan a través de la síntesis de péptido química en lugar de la síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos u otras formas en reversa o invertidas de las fracciones de aminoácido .

Los residuos de existencia natural pueden dirigirse en clases con base en las propiedades de cadena lateral : 1) hidrófoba: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; 2) hidrófila neutral: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) ácida: Asp, Glu; 4) básica: His, Lys, Arg; 5) residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) aromático: Tip, Tyr, Phe .

Por ejemplo, las sustituciones no conservadoras pueden involucrar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Los residuos sustituidos pueden introducirse, por ejemplo, en regiones de una proteína PCSK9 que son homólogos con las proteínas PCSK9 no humanas, o en las regiones no homologas de la molécula.

Al hacer los cambios en la proteína PCSK9 o una de sus variantes, de acuerdo con ciertas modalidades, el índice hidrostático de los aminoácidos puede considerarse. Cada aminoácido ha sido asignado a un índice hidropático, sobre las bases de su hidrofobicidad y características de carga. Esta son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptófano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5) .

La importancia . del índice del aminoácido hidropático al conferir la función biológica interactiva de la proteína se entiende en la técnica. Kyte et al, J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982). Se sabe que ciertos aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos que tienen índice hidropático similar o puntuación y aún se tiene una actividad biológica similar. Al hacer cambios con base en el índice hidropático, en algunas modalidades, la sustitución de los aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de +2 se incluyen. En algunas modalidades, los que están dentro de +1 se incluyen, en algunas modalidades los que están dentro de 0.5 se incluyen.

También se entiende en la técnica que las sustitución de tipo aminoácido pueden hacerse efectivamente sobre la base de la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteína o péptido biológicamente funcional por lo tanto se crea y es prevista para utilizarse en modalidades inmunológicas , como en el caso presente. En algunas modalidades, entre mayor es la hidrofilicidad promedio local de una proteína, según controlada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, que correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biológica de la proteína.

Los siguientes valores de hidrofilicidad han sido asignados a estos residuos de aminoácido: arginina (+3.0); lisina (+3.0); aspartato (+3.0 + 1); glutamato (+3.0 ± 1) ; serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5) y triptófano (-3.4). Al hacer los cambios con base en valores de hidrofilicidad similares, en algunas modalidades, la sustitución de los aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro de +2 se incluyen, en algunas modalidades, los que están dentro de +1 se incluyen, y en algunas modalidades los que están dentro de +5 se incluyen. También se pueden identificar epítopos de secuencias de aminoácidos primarias sobre las bases de la hidrofilicidad . Estas regiones son referidas como "regiones centrales epitópicas" .

Las sustituciones de aminoácido ilustrativas se establecen en la Tabla 1.

TABLA 1 Sustituciones de Aminoácido Residuos Originales Sustituciones Sustituciones Ilustrativas Preferidas Ala Val, Leu, lie Val Arg Lys, Gln, Asn Lys Asn Gln Gln Asp Glu Glu Cys Ser, Ala Ser Gln Asn , Asn Glu Asp Asp Gly Pro, Ala Ala His Asn, Gln, Lys, Arg Arg lie Leu, Val, Met, Ala, Leu Phe Norleucina Leu Norleucina, lie, lie Residuos Originales Sustituciones Sustituciones Ilustrativas Preferidas Val, Met, Ala, Phe Lys Arg, ácido 1,4 Arg Diamino-butírico, Gln, Asn Met Leu, Phe, lie Leu Phe Leu, Val, lie, Ala, Leu Tyr Pro Ala Gly Ser Thr, Ala, Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr , Phe Tyr Tyr Trp, Phe, Thr, Ser Phe Val lie, Met, Leu, Phe, Leu Ala, Norleucina término "derivado" se refiere a una molécula que incluye una modificación química diferente de una inserción, eliminación o sustitución de aminoácidos (o ácidos nucleicos). En algunas modalidades, los derivados comprenden modificaciones covalente que incluye, pero no se limita a, unión química con polímeros, lípidos u otras fracciones orgánicas e inorgánicas. En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante químicamente modificada puede tener una vida media circulante mayor que una variante PCSK9 neutralizante que no está químicamente modificada. En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante químicamente modificada puede tener una capacidad de activación mejorada para las células deseadas, tejidos y/u órganos. En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante derivada está covalentemente modificada para incluir una o más uniones a polímero soluble en agua, que incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol , polioxietilenglicol , o propilenglicol , ver, por ejemplo, las Patentes de E. U. A. Nos. 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 y 4,179,337. En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante derivada comprende uno o más polímeros, incluyendo, pero no limitándose a, monometoxi -polietilenglicol , dextrina, celulosa, u otros polímeros a base de carbohidrato, poli- (N-vinilpirrolidona) -polietilenglicol , homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol y alcohol polivinílico, : así como mezclas de tales polímeros.

En algunas modalidades, un derivado se modifica covalentemente con subunidades de polietilenglicol (PEG) . En algunas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se unen en una o más posiciones específicas, por ejemplo, en el término amino, de un derivado. En algunas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se unen aleatoriamente a una o más cadenas laterales de un derivado. En algunas modalidades, se utiliza PEG para mejorar la capacidad terapéutica de una variante PCSK9 neutralizante. En algunas modalidades, se utiliza PEG para mejorar la capacidad terapéutica de una molécula. Ciertos métodos se explican, por ejemplo, en la Patente de E. U. A. No. 6,133,426, que se incorpora por referencia para cualquier propósito.

Los análogos de péptidp se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como profármacos no de péptido con propiedades análogas a los de péptido de plantilla. Estos tipos de compuestos de no péptidos se denominan "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos" . Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS, p.392 (1985); y Evans et al, J. Med. Chem. , 30: 1229 (1987), que se incorporan aquí por referencia para cualquier propósito. Los compuestos por lo generan se desarrollan con la ayuda de modelación molecular computarizada . Los miméticos de péptido que son estructuralmente similares a los péptidos terapéuticamente útiles pueden utilizarse para producir un efecto terapéutico o profiláctico similar. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a los polipéptidos de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica) , tal como un anticuerpo humano, pero tiene uno o más enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado de: - CH2 NH-, -CH2S-, -CH2 -CH2 --, -CH=CH- (cis y trans) , -C0CH2 -- , -CH(OH)CH2-, y -CH2SO-, a través de métodos bien conocidos en la técnica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de consenso con un D-aminoácido del mismo tipo (D-lisina en lugar de L-lisina) pueden utilizarse en algunas modalidades para generar péptidos más estables. Además, los péptidos más estrechos comprenden una secuencia de consenso o una variación de la secuencia de consenso sustancialmente idéntica que puede generarse por métodos conocidos en la técnica (Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992), incorporada aquí por referencia para cualquier propósito) ; por ejemplo, a través de la adición de residuos de cisteína internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares que ciclizan el péptido.

El término "de existencia natural" como se utiliza en toda en toda la especificación en conexión con materiales biológicos tales como polipéptidos , ácidos nucleicos, células hospederas y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza o una forma de materiales que se encuentra en la naturaleza.

Una "variante PCSK9 neutralizante recombinante" es una proteína hecha utilizando técnicas recombinantes , es decir, a través de la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe en la presente. Los métodos y técnicas para la producción de proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica.

El término "variante PCSK9 neutralizante" se refiere a una variante PCSK9 que se asocia y/o se une a LDLR competitivamente con una PCSK9 humana de longitud completa. La variante PCSK9 neutralizante tiene también una habilidad reducida de degradar o eliminar LDLR de un sistema comparado con la PCSK9 de tipo silvestre (por ejemplo, SEC ID NO: 3) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante carece de un dominio V degradador de LDLR completamente funcional (por ejemplo, la proteína PCSK9 tiene un dominio V inactivo). En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante tiene una habilidad reducida para degradar o eliminar LDLR de un sistema comparado con una variante similar que carece de un dominio V completamente funcional. Dicho de otra forma, una variante PCSK9 neutralizante tiene la habilidad de directa o indirectamente reducir la degradación de LDLR y de esta forma mantener o aumentar los niveles LDLR en un sistema.

El término "pro" o "prodominio" se utiliza para referirse a por lo menos parte del prodominio de PCSK9. En algunas modalidades, el prodominio de PCSK9 está involucrado (ya sea directa o indirectamente (tal como permitiendo el pliegue apropiado del dominio Cat) ) en la unión de PCSK9 a LDLR. Ya que el residuo de inicio y finalización exacto del prodominio puede variar con base en la modalidad específica, el prodominio al menos comprenderá los residuos 61-152 de SEC ID NO: 3 y sus variaciones. Én algunas modalidades, el prodominio comprende los aminoácidos 31-152 de SEC ID NO: 3, o sus variantes. Las variantes del prodominio pueden ser 50% o más (por ejemplo, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, o 99-100 en porciento idénticas con prodominio correspondiente de SEC ID NO: 3 y/o una secuencia de consenso (por ejemplo, mostrado en las Figuras 1C-1E) .

El término "Cat" o "dominio cat" se utiliza para referirse por lo menos una parte del dominio catalítico de PCSK9. En algunas modalidades, el "dominio cat" está involucrado en la unión de PCSK9 a LDLR. Ya que el residuo de inicio y finalización exacto del dominio Cat puede variar con base en la modalidad específica, el dominio Cat por lo menos comprenderá los residuos 153-381 y en algunas modalidades comprenderá los residuos 153-445 de SEC ID NO : 3 y sus variantes. Las variantes del dominio Cat pueden del 50% o más (por ejemplo, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90- 95, 95-98, 98-99, o 99-100 porciento) idénticas al dominio Cat correspondiente de SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, el dominio Cat puede empezar en el residuo 153 de SEC ID NO: 3 (y sus variantes) y terminar en cualquiera de los residuos 447, 448, 449, 450, 451, 452, o 453 de SEC ID NO: 3 (y sus variantes) . De esta forma, el dominio Cat puede incluir los residuos 153-447, 153-448, 153- 449, 153-450, 153-451, 153-452, 153-453, o 153-454 de SEC ID NO: 3 (y sus variantes) y/o una secuencia de consenso (por ejemplo, mostrada en las Figuras 1C-1H y Figuras lRx-lRz, SEC ID NOs : 9, 11, 13, 15, y 30 en donde las Figuras 1F-1H despliegan los ejemplos de un dominio Cat) .

El término "Pro/Cat" o "dominio Pro/Cat" se utiliza para referirse a la sección de PCSK9 que está involucrada en la unión a LDLR. El "dominio Pro/Cat" no necesita incluir ambos dominios Pro y Cat. En particular, algunas veces referido como el "dominio Pro/Cat" puede comprender el dominio Pro sin el dominio Cat, o el dominio Cat sin el dominio Pro. Ya que el término abarca una proteína PCSK9 que incluye tanto el dominio Pro como Cat, ambos dominios son referidos a estar presentes en la frase "domino Pro y dominio Cat" o fase similar en general utilizada. En algunas modalidades, el dominio pro/car puede empezar el residuo 31 ó 61 de SEC ID NO: 3 (y sus variantes) y terminar en cualquiera de los residuos 447, 448, 449, 450, 451, 452, o 453 de SEC ID NO: 3 (y sus variantes) . De esta forma, en algunas modalidades, el dominio Pro/Cat puede incluir los residuos 31-447, 31-448, 31-449, 31-450, 31-451, 31-452, 31-453, 61-447, 61-448, 61-449, 61-450, 61-451, 61-452, y 61-453 de SEC ID NO: 3 (y sus variantes), y/o SEC ID NOs: 4, 5, 6, 7, 8, 24-29 y/o 31 y/o la secuencia de consenso (por ejemplo, mostrado en las Figuras 1C-1E y 1R!-1R2 SEC ID NOs : 9 y 30 (y F-H para el dominio Cat, SEC ID Nos: 11, 13, y 15)). Por supuesto el dominio pro/cat también puede simplemente incluir las regiones Pro o Cat indicadas anteriormente . En algunas modalidades, las variantes del dominio pro/cat pueden ser 50% o más (por ejemplo, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, o 99-100 porciento) idénticas al dominio pro/cat correspondiente de SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, el dominio pro/cat es al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, o más porcentaje idénticas a las secciones conservadas del dominio pro/cat. En algunas modalidades, ya que las secciones del dominio pro/cat que están 100% conservadas (mostradas en las Figuras 1C-1E) se conservan en la variante pro/cat, las posiciones restantes pueden cambiarse. En algunas modalidades, los cambios en estas posiciones restantes pueden dar como resultado una variante pro/cat que es 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, o 99-100 en porcentaje idéntica al dominio pro/cat correspondiente de SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, las posiciones variables son las mostradas .como espacios o huecos en la secuencia de consenso en Figuras 1C-1E y Figura IR1.-IR2 o aminoácidos no específicos en las Figuras 1F-1H (y/o mostrado como "Xaa" en SEC ID NOs : 9, 11, 13, 15, y 30) .

Como será evidente para un experto en la técnica, la alineación de secuencias mostradas en las figuras anexas (1C-1H y' 1I-1L) denotan que los residuos que en algunas modalidades (incluyen varias variantes PCSK9 neutralizantes) pueden conservarse con el fin de obtener un dominio Pro, Cat , Pro/Cat, o LDLR funcional o proteína y los que pueden cambiarse (y cómo se cambian) . En algunas modalidades, las secciones denotadas por espacios en las secuencias de consenso son aminoácidos en donde las conservaciones no son requeridas y cualquiera o ningún aminoácido puede utilizarse en estos lugares (por ejemplo, la variación es fácilmente permisible en estas ubicaciones). En algunas modalidades, las secciones denotadas por "+" pueden similarmente alterarse con cualquier aminoácido. En algunas modalidades, las secciones denotadas por "+" son reemplazos conservadores, o reemplazos notados para esa posición en el estado de secuencias (o en los varios organismos para la alineación de secuencias) . Como se observa en la presente, se describen varias secuencias de consenso dentro de las Figuras 1C-1L. De esta forma, las secuencias de consenso . además de la secuencia de consenso explícitamente identificada en las figuras también se describen en la presente.

El término "V" o "dominio V" se utiliza para referirse a la sección de la proteína PCSK9 que está involucrada en la degradación efectiva de LDLR. Ya que los residuos de inicio y finalización exactos del dominio V pueden variar con base en la modalidad específica, el dominio V al menos comprenderá los residuos 455-682 de SEC ID NO: 3 y sus variantes. En algunas modalidades, el dominio V por lo menos comprenderá los residuos 457-679, 454-692, 457-692, 457-682, 455-692, 455-679, 454-682, o 454-679. Las variantes del dominio V pueden ser 55% o más (por ejemplo, 55-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, o 99-100 por ciento idénticas al dominio V correspondiente de SEC ID NO: 3. Simplemente debido a que existe una secuencia de aminoácido en el extremo C-terminal de un dominio pro/cat no hace a la secuencia un dominio V o un dominio V activo. Un dominio V activo también tendrá la función antes mencionada con respecto a LDLR. Como se apreciará por un experto en la técnica, los dominios V inactivos abarcan un alcance mucho más amplio de posibles dominios, secuencias y estructuras que hacen dominios V activos. Cualquier proteína, o la falta de una proteína PCSK9, que no logra la función del dominio V observado anteriormente puede caracterizarse como un dominio V inactivo.

El término "bucle" se utiliza para referirse a la sección entre el dominio V y el dominio Cat . Esta sección no necesita ser llamada explícitamente en cada modalidad. Ya que los residuos de inicio y finalización exactos del bucle pueden variar con base en la modalidad específica, el bucle puede comprender los residuos 447-453 de SEC ID NO : 3 y sus variantes. Las variantes del bucle pueden ser 05 o más (por ejemplo, 0-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50 50-60, 60-70, 70- 80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, 99 por ciento idénticas al bucle de SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, cualquier estructura o sección que conecta el dominio V al dominio Cat puede considerarse como una sección de bucle. En algunas modalidades, el dominio de bucle no se denota explícitamente como tal y es simplemente parte ya sea del dominio Cat o del dominio V.

La frase "degradación de LDLR" se refiere a la habilidad del dominio V (o una de sus subpartes) , cuando parte de la proteína PCSK9 completa, promueve la degradación de LDLR. Como se apreciará por un experto en la técnica en luz de la presente descripción, la habilidad de degradar LDLR del dominio V no necesita ser un papel directo. En particular, puede ser posible para LDLR degradarse a través de variantes PCSK9 que carecen del dominio V. De esta forma, "el papel degradante" o "habilidad de LDLR" del dominio V denota que esta sección de la proteína PCSK9 está involucrada en la degradación efectiva de LDLR. La eliminación del dominio V no necesita completamente evitar toda la degradación de LDLR bajo todas las variables y circunstancias posibles (y, como se observa más adelante en los ejemplos, en algunas circunstancias, no lo hace) .

La frase "degradación de LDLR completamente funcional" o "degradación LDLR completamente funcional" se refiere a la cantidad de degradación de LDLR que ocurre de una proteína PCSK9 que tiene el dominio V de tipo silvestre después del aminoácido 450 de SEC ID NO: 3. De esta forma, un "dominio V degradante de LDLR completamente funcional" degradará LDLR a una velocidad igual a y/o mayor que PCSK9 de tipo silvestre (por ejemplo, SEC ID NO: 3) . Las proteínas que son completamente funcionales para la degradación de LDLR, que tienen un dominio V inactivo, o que carecen de un dominio V degradante de LDLR completamente funcional de gradarán LDLR menos efectivamente que PCSK9 de tipo silvestre. De esta forma, por ejemplo, una variante de PCSK9 que es solamente 90% efectiva como PCSK9 de tipo silvestre puede caracterizarse como faltante de un dominio V degradante de LDLR completamente funcional o como teniendo un dominio V inactivo. Una variante PCSK9 que carece de un dominio V también puede describirse como faltante de un dominio V degradante de LDLR completamente funcional o que tiene un dominio V inactivo. Una proteína PCSK9 que carece de un dominio V degradante de LDLR completamente funcional que tiene un dominio V inactivo, o que carece de un dominio V es menos del 100% tan efectivo como PCSK9 de tipo silvestre (SEC ID NO: 3), e incluye, por ejemplo, las proteínas que son 99-90, 90-80, 80-70, 70-60, 60-50, 50-40, 40-30, 30-20, 20-10, 10-5, 5-1, 1-0.1, 0.1-0.01, 0.01-0.001, 0.001-0.0001, y 0.0001 a 0% tan efectiva como la proteína PCSK9 de tipo silvestre. Como se apreciará por un experto en la técnica, una variante PCSK9 neutralizante puede contener algunos o todos los dominios V, mientras el dominio V no sea completamente funcional para la degradación de LDLR. La funcionalidad del dominio V puede ajustarse a través de varios métodos, que incluyen, por ejemplo, remoción, mutaciones de punto, inserciones, eliminaciones, etc.

El término de la frase "activo" como se utiliza en "dominio Pro activo", "dominio Pro/Cat activo", o "dominio Cat activo" denota que la proteína se puede unir a LDLR.

El término "inactivo" como se utiliza en "domino V inactivo" denota que la molécula en cuestión no tiene un dominio V PCSK9 que funciona en la degradación de LDLR tan efectivamente como el domino V en PCSK9 de tipo silvestre. Un dominio V inactivo no requiere que la secuencia del domino V esté presente. En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante tendrá un dominio V inactivo si carece de una secuencia de proteína del dominio V.

La frase "tiene un dominio V inactivo" denota que la sección del dominio V, si cualquier sección está presente, no es efectiva en la degradación de LDLR como el dominio V en la proteína PCSK9 de longitud completa. Esto no requiere que ninguna parte del domino V actualmente esté presente. De esta forma, una proteína PCSK9 que carece del dominio V completo también puede caracterizarse como "teniendo un dominio V inactivo" . Como anteriormente, la definición no requiere que la proteína con el dominio V inactivo exhiba una ausencia completa de la habilidad degradante de LDLR. Una proteína PCSK9 que tiene un dominio V inactivo tendrá será menos del 100% tan efectivo como la PCSK9 de tipo silvestre (SEC ID NO: 3) . Los ejemplos de tales niveles inferiores de efectividad incluye, por ejemplo, proteínas PCSK9 que tienen dominios V que son 99-90, 90-80, 80-70, 70-60, 60-50, 50-40, 40-30, 30-20, 20-10, 10-5, 5-1, 1-0.1, 0.1-0.01, 0.01-0.001, 0.001-0.0001, y 0.0001 a 0% tan efectivos como la proteína PCSK9 de tipo silvestre. Los ejemplos no limitantes de dominios V inactivos o inactivados incluyen, por ejemplo, proteínas que carecen del dominio V (por ejemplo V completo está ausente de la proteína PCSK9) , proteínas que carecen de 14 o más aminoácidos del extremo (C-terminal) de la proteína PCSK9 (por ejemplo, SEC ID NO: 3), proteínas en el dominio V que está inapropiadamente plegado (en comparación con PCSK9 de tipo silvestre (por ejemplo, la mutación C679X) .

Las frase "carece de la totalidad de los aminoácidos ###-###" denota que las secuencia de aminoácido entera y completa definida en la presente está ausente de la proteína. Las sub-partes de la secuencia de aminoácido o el intervalo pueden estar presentes. Por ejemplo, si la proteína "carece de la totalidad de aminoácidos 10-100 de SEC ID NO: X", los aminoácidos 10-99 o 11-100 de SEC ID NO: X pueden estar presentes, aunque 10-100 se excluyen de estar presentes.

La frase "unido adyacente a un aminoácido ### de SEC ID NO: X" denota que cualquier cosa que se vaya (o no se vaya) a unir está (o no está) unida inmediatamente adyacente a un aminoácido específico (###) . Cuando la frase se está utilizando en un contexto negativo (por ejemplo, como una exclusión) entonces denota que, si el aminoácido ### está presente, entonces el artículo en cuestión no está unido adyacente al mismo. Sin embargo, el uso de esta frase no implica o requiere que el aminoácido ### este actualmente presente cuando se utiliza en su contexto negativo. Como un ejemplo, la frase "carece de la totalidad de los aminoácidos 10-100 de SEC ID NO: X unidos adyacentes a un aminoácido 9 de SEC ID NO: X" denota que todos los 91 aminoácidos de los aminoácidos 10-100 de SEC ID NO: X están faltantes en la posición adyacente al aminoácido 9 de SEC ID NO: X (si el aminoácidos 9 está presente) . De esta forma, los aminoácidos 11-100 pueden estar presente y unidos adyacentes al aminoácido 9, los aminoácidos 10-99 pueden estar presentes y unirse de manera adyacente al aminoácido 9, o los aminoácidos 10-100 pueden estar presentes y unirse a cualquier aminoácido 8 u 11 de SEC ID NO : 3. Se observa que, para el tipo de exclusión anterior, el aminoácido 9 no necesita estar presente. De esta forma, los aminoácidos 1-5 de SEC ID NO: X, podría también cumplir con la descripción anterior (ya que no existe un aminoácido 9 y puede no haber un aminoácido adyacente al mismo) . Además, a menos que se observe explícitamente lo contrario, la posición "adyacente a" de un aminoácido específico es solamente la posición que es mayor que el aminoácido observado. De esta forma, si el aminoácido relevante es 9, entonces solamente la posición adyacente a 9 es 10 (y de esta forma la posición 8 se considera (adyacente a la posición 9 para propósitos de esta definición. En otras palabras, adyacente a solamente se aplica al aminoácido en la dirección carboxi , no en la dirección amino.

La frese "en la posición apropiada" como se utiliza en la frase "en la posición apropiada en la variante" denota que, la posición apropiada está presente en la variante. Por ejemplo, la frase "la variante PCSK9 neutralizante" tiene una cisteína en la posición 30" denota que la variante tiene un aminoácido en la posición 30 y que es una cisteína. Cuando la frase se utiliza con referencia a otra SEC ID NO: denota que la variante es (o no es) similar a la otra SEC ID NO: en la forma descrita. Cuando la frase se utiliza como una exclusión, entonces, como se observa en la definición anterior, la posición misma no necesita estar presente en la variante, pero si es así, entonces no estará en el artículo descrito.

El término "objetivo" se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida a través de una variante PCSK9 neutralizante.

Los términos "compite" o "competitivo" cuando se utilizan con referencia a la "variante PCSK9 neutralizante" se refieren a la competencia entre a) PCSK9 nativa y b) las variantes PCSK9 para LDLR. Se pueden utilizar numerosos tipos de ensayos de unión competitivos para determinar si una variante PCSK9 neutralizante compite con una PCSK9 nativa, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase sólida (RIA) , inmunoensayo enzimático directo o indirecto de fase sólida (EIA) , ensayo de competencia de emparedado (por ver, por ejemplo, Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); EIA de biotina-avidina directa de fase sólida (ver por ejemplo, Kirkland et al, 1986, J. Immunol . 137:3614-3619) ensayo marcado directo de fase sólida, ensayo, de emparedado marcado directo de fase sólida (ver, por ejemplo, Harlow and Lañe, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press) ; RIA de marcación directa de fase sólida utilizando la etiqueta 1-125 (ver, por ejemplo, Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA de biotina-avidina directa de fase sólida (ver, por ejemplo, Cheung, et al, 1990, Virology 176:546-552); y RIA marcada directa (Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82).

Como se utiliza en la presente, "sustancialmente puro" significa que las especies descritas de la molécula es la especie predominante presente, es decir, sobre bases molares es la más abundante que cualquier otra especie individual en la misma mezcla. En algunas modalidades, una molécula sustancialmente pura es una composición en donde las especies objeto comprenden por lo menos 50% sobre una base molar) de todas las especies macromoleculares presente. En otras modalidades, una composición sustancialmente pura comprenderá por lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, o 99% de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En otras modalidades, las especies objeto se purifican a homogeneidad esencial en donde las especies contaminantes no pueden detectarse en la composición a través de métodos de detección convencionales y de esta forma la composición consiste de una sola especies macromolecular detectable .

El término "agente" se utiliza en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos .

Como se utiliza en la presente, los términos "etiqueta" o "marcado" se refiere a la incorporación de un marcador detectable. Los ejemplos incluyen la incorporación de un aminoácido radiomarcado o un anexo a un polipéptido de fracciones de biotina que pueden detectarse a través de avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectase a través de métodos ópticos o colorimétricos) . En algunas modalidades, la etiqueta marcador también ser terapéutico. Los varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteínas se conocen en la técnica y se puede utilizar. Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes radioisótopos o radionúclidos (por 3t ?t, 14,C-,, 15-??t, 35S-1, Y, 99rTpe,,, 111t?„?, I, , etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantanida fosforosa) , etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, ß-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina) , grupos de biotinilo quimiolumiscente , epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, una secuencia par del cierre de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metal, etiquetas de epítopo) . En algunas modalidades, las etiquetas se unen a través de brazos separadores de varias longitudes para reducir la barrera esférica potencial.

El término "muestra biológica" como se utiliza en la presente, incluye, pero no se limita a, cualquier cantidad de sustratos de una cosa viviente o de una cosa anteriormente viva. Tales cosas vivientes incluyen, pero no se limitan a, humanos, ratones, monos, ratas, conejos y otros animales. Las sustancias incluye, pero no se limitan a, sangre, suero, orina, células, órganos, tejidos, hueso, médula espinal, nodos linfoides, y piel.

El término "composición del agente farmacéutico" (o agente o fármaco) como se utiliza en la presente, se refiere a un compuesto químico, composición, agente o fármaco capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se utilizada apropiadamente a un paciente. No necesariamente requiere más de un tipo de ingrediente.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de una variante PCSK9 neutralizante determinada para producir una respuesta terapéutica en un mamífero. Las cantidades terapéuticamente efectivas se evalúan fácilmente por un experto en la técnica.

El término "modulador" como se utiliza en la presente, es una sustancia que cambia o altera la actividad de la función de molécula. Por ejemplo, un modular puede causar un aumento o disminución en la magnitud de una cierta actividad o función de una molécula comparado con la magnitud de la actividad o función observada en la ausencia del modulador. En algunas modalidades, un modulador es un inhibidor, que disminuye la magnitud de por lo menos una actividad o función en una molécula. Ciertas actividades y funciones ilustrativas de una molécula incluyen, pero no se limitan a, afinidad de unión, actividad enzimática, y transducción de señal. Ciertos inhibidores ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos , carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Los pepticuerpos se describen en, por ejemplo, la Patente de E. U. A. No. 6,660,843 (correspondiente a la solicitud PCT No. WO 01/83525) .

El término "paciente" y "sujetos" se utilizan de manera intercambiable e incluyen sujetos animales humanos y no humanos así aquellos que formalmente están diagnosticados con trastornos, los que no tienen trastornos formalmente reconocidos, los que reciben atención médica y los que están en riego de desarrollar los trastornos, etc.

El término "tratar" y "tratamiento" incluyen tratamiento terapéutico, tratamientos profilácticos, y aplicaciones en las cuales se reduce el riesgo que un sujeto desarrollará a un trastorno u otro factor de riesgo. El tratamiento no requiere completar la curación de un trastorno y abarca modalidades en donde se reducen los síntomas y/o los factores de riesgo subyacentes.

El término "prevenir" no requiere el 100% de eliminación de la posibilidad de un evento. Más bien, denota que la probabilidad de la aparición del evento ha sido reducida en la presencia del compuesto o método.

El término "Fe nativo" se refiere a la molécula o secuencia que comprende la secuencia de un fragmento de unión a un no antígeno que resulte de la digestión del anticuerpo completo, ya sea en forma monomérica o multimérica. La fuente de inmunoglobulina original del Fe nativo es preferiblemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas , aunque IgGl e IgG2 son preferidas. Los Fe nativos se forman de polipéptido monoméricos que pueden enlazarse en formas quimérica o multimérica a través de la asociación covalente (es decir, enlaces de disulfuro) y no covalente. El número de enlaces de disulfuro intramoleculares entre las subunidades monoméricas de las moléculas Fe nativas están en el intervalo de 1 a 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA, e IgE) o subclase (por ejemplo, IgGl, IgG2,- IgG3 , IgAl, IgGA2). Un ejemplo de una Fe nativa es un dímero enlazado a un disulfuro que resulta de la digestión de papaína de un IgG (ver, Ellison et al. (1982), Nucleic Acids Res. 10: 4071-9). El término "Fe nativo" como se utiliza en la presente es genérico paras formas monomérica, dimérica y multimérica.

El término "variante Fe" se refiere a una molécula o secuencia que se modifica a partir de una Fe nativa pero aún comprende un sitio de unión para el receptor salvaje, FcRn. Las solicitudes Internacionales WO 97/34631 (publicadas el 25 de septiembre de 1997 y WO 96/32478 describen variantes FC ilustrativas, así como la interacción con el receptor salvaje, y por lo tanto se incorpora por referencia. De esta forma, el término "variante Fe" comprende una molécula o secuencia que se humaniza de una Fe nativa no humana. Además, una Fe nativa comprende sitios que pueden eliminarse debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no se requiere para las moléculas de fusión de PCSK9. De esta forma el término "variante Fe" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios Fe nativos o residuos que afectan o están involucrados en (1) la formación del enlace de disulfuro, (2) incompatibilidad con la células hospedera seleccionada, (3) homogeneidad N-terminal después de la expresión en una célula hospedera seleccionada, (4) glicosilación, (5) interacción con el complemento,- (6) unión a un receptor Fe diferentes de un receptor salvaje, o (7) citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Las variantes Fe se describen con mayor detalle más adelante.

El término "dominio Fe" abarca Fe nativo y moléculas y secuencias variantes Fe como se define anteriormente. Como con las variantes FC, y las Fe nativas, el término "dominio Fe" incluye moléculas en forma monomérica o multimérica, ya sea digeridas de un anticuerpo completo o producidas por otros medios. En algunas modalidades, un domino Fe puede estar asociado con una variante PCSK9 neutralizante (por ejemplo, a través de un enlace covalente entre el dominio Fe y la variante PCSK9 neutralizante) .

El término "multímero" como se aplica a los dominio o moléculas Fe comprende dominios Fe que se refieren a moléculas que tienen dos o más cadenas de polipéptido covalentemente asociadas, no covalentemente o a través de una interacción covalente y covalente. Las moléculas IgG típicamente forman dímeros; IgM, pentámeros; IgD, dímeros; y IgA, monómeros, dímeros, trímeros o tetrámeros. Los multímeros pueden formarse a través de la explotación de la secuencia y la actividad resultante de la fuente Ig nativa de la Fe o a través de derivatización (como se define a continuación) tal como una Fe nativa.

El término "dímero" se aplica a los dominios Fe o moléculas que comprenden dominios Fe que se refieren a moléculas que tienen dos cadenas de polipéptido asociadas covalentemente o no covalentemente .

Se pueden utilizar técnicas estándar para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótido, y cultivo y transformación tisular (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden llevarse a cabo de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden generalmente llevarse a cabo de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y explican a lo largo de la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed.,. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989)), que se incorpora aquí por referencia para cualquier propósito. A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar pueden utilizarse para síntesis química, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y distribución, y tratamiento de pacientes .

Variantes PCSK9 neutralizantes En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante provista en la presente es capaz de unir la inhibición de PCSK9 nativa a LDLR. En algunas modalidades, este bloqueo da como resultado una disminución en la degradación de LDLR in vivo,- por lo tanto dando como resultado la disminución de LDL en el suero de un sujeto.

Como se observó anteriormente, la habilidad de PCSK9 para unirse a LDLR y la habilidad de PCSK9 de tipo silvestre para efectivamente degradar LDLR parece que se debe a dos diferentes secciones de la proteína PCSK9. Como se observa en los ejemplos siguientes, la habilidad PCSK9 para efectivamente degradar LDLR parece que está enlazada al dominio de PCSK9. De esta forma, en algunas modalidades, las variantes PCSK9 que carecen de dominios V degradada antes LDLR completamente funcionales (o que tienen un dominio V inactivo) pueden introducirse en un sistema o sujeto sin adversamente incrementar la cantidad de la degradación de LDLR. Además, como se describe en la presente, la unión PCSK9 o LDLR está mediada por secciones de los dominios Pro y/o Cat de PCSK9. De esta forma, las variantes PCSK9 neutralizantes que contienen suficientes secciones del dominio (s) Pro y/o ¦ Cat aún pueden unirse a LDLR y competir con PCSK9 nativa para la unión a LDLR. En algunas modalidades, cuando la variante también crece de un dominio V degradante de LDLR completamente funcional (o un dominio V inactivo) , entonces la variante PCSK9 no solamente bloquea PCSK9 nativo, sino también disminuirá la degradación de LDLR, por lo tanto aumentando la disponibilidad de LDLR y a su vez disminuyendo la cantidad de LDL en el suero. De esta forma, en algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante es una proteína PCSK9 que tiene un dominio Pro/Cat activo y un dominio V inactivo .

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante incluye, consiste, o consiste esencialmente del dominio (s) Pro y/o Cat de PCSK9. En algunas modalidades, la variante incluye una secuencia de señal (por ejemplo, los aminoácidos 1-30 de SEC ID NO: 3). En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 31-447 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 31-447) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 153-374 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 153-374) .

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 31-374 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 31-374) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 153-454 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 153-454) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 31-449 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 31-449) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 153-381 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 153-381) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 31-381 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 31-381) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 153-382 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 153-382) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de los aminoácidos 31-382 de SEC ID NO: 3 (o una variante de los aminoácidos 31-382). En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante comprende, consiste, o consiste esencialmente de un aminoácido que empieza en cualquiera de las posiciones 31, 61, o 153 de SEC ID NO: 3 y la posición de terminación 374, 381 , 382, 447, 448, 449, 450, 451 , 452, 453, 454, o 455 de SEC ID NO: 3 (o una de sus variantes) . En algunas modalidades, las variantes pueden ser de al menos 50% idénticas, por ejemplo 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99 o una identidad mayor, con la sección relevante (por ejemplo, cualquiera de las secciones indicadas anteriormente) de SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, las variantes pueden tener al menos 70% de homología, por ejemplo 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99 o una homología mayor, con la sección relevante de SEC ID NO: 3.

En algunas modalidades, el dominio V puede completamente eliminarse. En algunas modalidades, una sección del dominio V puede eliminarse o alterarse. La sección puede ser suficiente para evitar que la variante PCSK9 neutralizante degrade significativamente LDLR.

En algunas modalidades, la variante carece de alguna parte o todo el dominio V. En algunas modalidades, el dominio V estará inactivo y no permitirá niveles de tipo silvestre de la degradación de LDLR. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante carece del dominio V completamente. En algunas modalidades, la variante carece de los residuos 447-692, 448-692, 449-692, 450-692, 451-692, 452-692, 453-692, o 454-692 de SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, cualquiera de las secciones faltantes anteriores, puede estar presente en la variante, pero no se colocará inmediatamente adyacente al aminoácido colocado enfrente de SEC ID NO: 3. De esta forma, por ejemplo, 453-692, 454-692, 450-692, o 447-692 de SEC ID NO: 3 pueden estar presentes en la variante, pero no se colocarán después del aminoácido 452, 453, 449, o 446 respectivamente de SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, por lo menos los últimos 14 aminoácidos de términos C de SEC ID NO : 3 están faltantes (o diferentes de los aminoácidos en SEC ID NO: 3) por lo tanto creando un dominio V inactivo. Por ejemplo, los aminoácidos 14-16, 16-20, 20-25, 25-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-120, 120-140, 140-160, 160-200, 200-220, 220-225 pueden eliminarse de la porción C-terminal del domino V para producir un dominio V inactivo.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante incluye una mutación de punto. En algunas modalidades, la mutación punto es la mutación de punto D374Y que tiene una afinidad de unión aumentada a LDL . En algunas modalidades, uno o más de otras mutaciones de punto también se incluyen en la variante PCSK9 neutralizante. Por ejemplo, las mutaciones tales como I474V, R273W, H87N, A103D, G308R, S376G, D480G, R499C, D374X, en donde X puede ser Y, A, H, R, E, F, K, L, , Y142X, C679X, R46L, L253F, A443T, A53V, H553R, Q619P, E670G y las descritas por Kotowski IK et al, Am. J.

Hum. Genet. 2006; 78:410-422, (incorporada aquí por referencia) .

En algunas modalidades, cualquiera de las variaciones anteriores (incluyendo mutaciones) y longitudes del dominio V pueden incluirse o excluirse de cualquiera de las variaciones anteriores (incluyendo mutaciones) en los dominios Pro y/o Cat indicados anteriormente con el fin de producir una variante PCSK9 neutralizante. De esta forma, por ejemplo, la variante neutralizante puede carecer de los residuos 453-692, 454-692, 450-692, o 447-692 de SEC ID NO: 3 (o una de sus variantes) colocada enseguida de las posiciones 452, 453, 449, o 446 respectivamente de SEC ID NO: 3, mientras tiene cualquiera de las regiones Pro y/o Cat anteriores (por ejemplo, 331-454, 31-447, 31-449, 153-374, 153-454, y 31-374 de SEC ID NO: 3 (o una de sus variantes)). Además, cualquiera de las variantes PCSK9 neutralizantes descritas en la presente pueden incluir una valina en 474 (en lugar de una isoleucina) , una glicina en 670 (en lugar de un glutamato) , y/o un glutamato en 620 (en lugar de una glicina) . En algunas modalidades, la proteína PCSK9 de tipo silvestre es la secuencia definida en Genbank como secuencia NM_174936. Otras variantes SNP pueden encontrarse en Kotowski IK et al, Am. J. Hum. Genet. 2006; 78:410-422 e incluir R46L, A53V, L253F, R237 , A443T, 1474 V, Q619P, E670G, y otras.

En algunas modalidades, las variantes de la proteína PCSK9 neutralizante se seleccionan comparando varias secuencias PCSK9 entre sí con el fin de determinar las posiciones que se conservan y las posiciones que varían entre las secuencias PCSK9. En algunas modalidades, los aminoácidos en los dominios Pro y/o Cat están conservados entre varios organismos que se conservan mientras los aminoácidos que no se conservan a través de dos o más especies pueden variar. Tales variantes aún pueden tener un dominio (s) Pro y/o Cat que aún compite con PCSK9 nativo para la unión. Un ejemplo de una alineación de secuencia entre las proteínas PCSK9 de varios organismos puede encontrarse en las Figura 1C a 1E. Como será evidente para un experto en la técnica, el espacio (s) en la secuencia de consenso puede llenarse con cualquiera de los aminoácidos en la comparación en la ubicación correspondiente o, en algunas modalidades, cualquier aminoácido. Las Figuras 1F-1H describen otra serie de alineaciones de solamente el dominio Cat (la secuencia superior en las figuras se forma de SEC ID NO: 3, en donde los aminoácidos 1-153 (de SEC ID NO: 3) y los aminoácidos 321-454 (de SEC ID NO: 3)). Como se apreciará por un experto en la técnica, el espacio (s) en las secuencias de consenso pueden llenarse con cualquiera de los otros aminoácidos en la comparación en la ubicación correspondiente, o, en algunas modalidades, cualquier aminoácido. Dada la similitud entre las secuencias en las Figuras 1C-1H y SEC ID NO : 3, la presente invención contempla que cualquiera de los dominios Pro y/o Cat anteriores puede funcionar según se desee en una variante PCSK9 neutralizante (incluyendo variante que contienen cualquiera de las secuencias de consenso identificadas). Es decir, en algunas modalidades, cualquier posición que varía entre las diferentes secuencias PCSK9, puede ser una posición que puede alterarse en una variante PCSK9 neutralizante. En algunas modalidades, la posición se altera a otro aminoácido indicado en la alineación. En algunas modalidades, la posición se altera a un aminoácido diferente. Se observa que la secuencia PCSK9 humana en las Figuras 1C-1E, mientras son similares a SEC ID NO: 3, incluyen series extras de aminoácido en el extremo de la secuencia, incluyendo una glicina, seguido por una prolina, seguido por 8 histidina. Ya que la glicina o la prolina pueden estar presentes o pueden ausentes en varias modalidades, las histidinas solamente son parte de una etiqueta de histidina, y no son necesariamente parte de la alineación o cualquiera de las proteínas en alineación. De esta forma, la secuencia de consenso no necesita tener ninguna de las histidinas en ella (las 8 pueden eliminarse en algunas modalidades ya que nos son elementos estructuras de la proteína) . En algunas modalidades, la secuencia rat en las Figuras 1C-1E tiene una glicina, seguido por una prolina seguida por 8 histidinas en su extremos, justo igual que las otras secuencias mostradas en la Figura 1E. Las modalidades adicionales de las secuencias PCSK9 pueden encontrarse en las Figuras IM1-IS2, SEC ID NOs : 25-31.

Como se observa anteriormente, las secuencias de consenso mostradas en las figuras anexas (1C-1H) indican que los residuos que en algunas modalidades, pueden conservarse con el fin de obtener un dominio Pro/Cat funcional y las que pueden cambiarse (y cómo se cambian) . En algunas modalidades, las secuencias de la secuencia de consenso denotadas por los espacios son aminoácidos en donde la conservación no es requerida y cualquiera o ningún aminoácido puede utilizarse en estos lugares (por ejemplo, la variación es fácilmente permisible en estos lugares) . En algunas modalidades las secciones denotadas por "+" pueden similarmente alterarse con cualquier aminoácido. En algunas modalidades, las secciones denotadas por "+" son reemplazados conservadores, o los reemplazo observados para esa posición en el listado de secuencias (o en varios organismos para la alineación de secuencias) .

En las Figuras 1C-1E, ya que se han alineado más de dos secuencias de aminoácido, la secuencia de consenso no describe espacios en cada posición del aminoácido que puedan variar sin el dominio Pro/Cat perdiendo su funcionalidad. De esta forma, en esta alineación, para algunas modalidades, aún cuando los aminoácidos designados como un aminoácido específico en la secuencia de consenso explícitamente indicada pueden variar y aún dar como resultado en un dominio Pro/Cat funcionando. Por ejemplo, en algunas modalidades, una posición del aminoácido que se asigna a un aminoácido específico en la secuencia de consenso (en Figuras 1C-1E) , pero varía entre varios organismos, puede alterarse. De esta forma, en algunas modalidades, las posiciones del aminoácido que se conservan entre los ¡ organismos (por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1C-1E) , se conservan en la variante PCSK9 neutralizante, pero las otras posiciones del aminoácido (aquellas que son diferentes entre los varios organismos) pueden reemplazarse con aminoácidos que son diferentes del aminoácido indicado en su posición particular de la secuencia de consenso. En algunas modalidades, el aminoácido que reemplaza el aminoácido en la secuencia de consenso es cualquier aminoácido (o ninguno) y no necesita limitarse a los aminoácidos que aparecen en las diferentes secuencias mostradas en las Figuras 1C-1E. En algunas modalidades, el cambio de aminoácido es a un aminoácido que es el mismo, por lo menos uno de los aminoácidos mostrados en esa posición en las varias secuencias de aminoácido mostradas. En algunas modalidades, si los aminoácidos alineados para una posición son diferentes, pero se conservan, entonces la posición del aminoácido en la secuencia de consenso puede ser cualquier aminoácido que tiene propiedades conservadas (por ejemplo, polar) . En algunas modalidades, mientras los aminoácidos que son idénticos entre una o más de las especies están presentes en la variante PCK9 están presentes, uno o más de los otros aminoácidos en las otras posiciones varían. En algunas modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,' 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, o más aminoácidos que no son idénticos entre los varios organismos en las Figuras 1C-1E pueden reemplazarse por cualquier otro aminoácido. En algunas modalidades, mientras los aminoácidos que son idénticos a través de todas las especies observadas en las figuras se mantienen iguales, los aminoácidos en las otras posiciones pueden variar, con tanto como 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de estos aminoácidos que son alterados a otro aminoácido. En algunas modalidades, los aminoácidos conservados indicados en las figuras pueden alterarse o reemplazarse por otro aminoácido (s) , En algunas modalidades, en la creación de una variante PCSK9 neutralizante, los aminoácidos en el dominio V se conservan entre varias proteínas PCSK9 de varios organismos que se alteran con los aminoácidos que no se conservan a través de una o más especies que se conservan, por lo tanto produciendo una proteína en donde el domino V no está activo (o está inactivo) . Un ejemplo de esta comparación, entre PCSK9 de varios animales, puede encontrarse en las Figuras 1C a 1E. De esta forma, en algunas modalidades, cualquiera de los aminoácidos conservados en el domino V de PCSK9 puede alterarse mientras los aminoácidos conservados en los dominios Pro y/o Cat pueden mantenerse con el fin de producir una variante PCSK9 neutralizante. En algunas modalidades, el aminoácido se altera a otro aminoácido observado en la alineación. En algunas modalidades, el aminoácido se altera a un aminoácido diferente.

En algunas modalidades, los residuos que son importantes en la unión de PCSK9 a LDLR se mantienen en el dominio (s) pro y/o cat. Por ejemplo, aquellos residuos identificados en la presente como parte de la superficie de unión entre LDLR y LDL o LDLR y PCSK9 , o involucrado en la presión de la superficie de unión, así como aquellos residuos explicados en "Molecular basis for LDL recognition by PCSK9" (PNAS, 105:1820-1825, 2008), tales como Arg 194 y Phe 379 se mantienen, si están presentes dentro de una secuencia de fragmento. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante incluye por lo menos los residuos 194-379.

En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante puede inhibir, interferir con o modular una o más de las actividades biológicas de PCSK9. En una modalidad, la variante PCSK9 neutralizante compite con PCSK9 nativa para la unión a LDLR. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante reduce la unión de PCSK9 nativa a LDLR en al menos 1%, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100% de reducción de la unión de PCSK9 nativa a LDLR.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante tienen un IC50 para bloquear la unión de PCSK9 nativa a LDLR menor de 1 microMolar, 1000 nM a 100 nM, 100 nM a 10 nM, 10 nM a 1 nM, 1000 pM a 500 pM, 500 pM a 200 pM, menor de 200 pM, 200 pM a 150 pM, 200 pM a 100 pM, 100 pM a 10 pM, 10 pM a 1 pM. Este IC50 puede medirse entre la PCSK9 nativa a LDLR y la variante PCSK9 neutralizante a LDLR.

En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante no incluye una mutación de punto C679X y/o Q554E. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante no incluye- una etiqueta His. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes no incluye una etiqueta GST. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante incluye el residuo 453 de SEC ID NO: 3, en la posición correspondiente a la variante. En algunas modalidades, la variante PCSK9 no tiene la totalidad de los residuos 453-692 eliminados de la proteína. Por ejemplo, en algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes incluye los residuos 31-453. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes carece de los residuos tales como 447, 448, 449, 450, 451, y 452 (o una combinación de estos) de SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes carece de cualquier aminoácido en estas posiciones. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante carece del aminoácido correspondiente en la posición específica identificada por arriba con respecto a SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, cuando se declara explícitamente, las variantes PCSK9 neutralizantes pueden excluir las variantes PCSK9 descritas en la solicitud de E.

U. A 12/197093, presentada el 22 de agosto del 2008, incorporada aquí por referencia en su totalidad y especialmente con respecto a su descripción con respecto a las proteínas de unión a antígeno y proteínas PCSK9 y sus variantes. Por ejemplo, cuando se declare explícitamente, las variantes PCSK9 neutralizantes pueden excluir proteínas/variantes tales como PCSK9 ProCat 31-449 y/o PCSK9 ProCat 31-454, con o sin una etiqueta his. En algunas modalidades, cuando se declara explícitamente, las variantes PCSK9 neutralizantes pueden excluir las variantes PCSK9 que consisten de los residuos 1-452 (que tienen una etiqueta Hiso o una GST, (la numeración de secuencias como se define en Fan et al., American Chemical Society, "Self-Association of Human PCSK9 Correlates with its LDLR-Degrading Activity"); los residuos 1-454, y 1-681 219-692 (numeración de secuencia como se define en Benjannet et al., Journal of Biological Chemistry, "NARC- 1/PCSK9 and Its Natural Mutants" , 279:48865-48875, 2004) ; los residuos 219-692 (numeración de secuencia como se define en Benhannet et al., J. of Biol . Chemistry, "The Proprotein Convertase (PC) PCSK9 is Inactivated by Furin and/or PC5/6A", 281 (41) : 30561-30572 (2006); los residuos 1-452 y 423-692 (numeración de secuencia como se define en Fan et al., Biochemistry, "Self-Association of Human PCSK9 Correlates with its LDLR-Degrading Activity", 47:1631-1639 2008); los residuos 1-455, 1-454, y/o los residuos 31-454 (numeración de secuencia como se define por Nassoury et al., Traffic, "The Cellular Trafficking of Secretory Proprotein Convertase PCSK9 and its Dependence on the LDLR" , 8:718-732, 2007) ; cualquier eliminación C-terminal en WO 2007/128121; los residuos 1-454 (numeración de secuencia como se define por Zhang et al., PNAS, "Structural Requirements for PCSK9-mediated degradation of the low-density lipoprotein Receptor", 105:13045-13050, 2008); los residuos 1-425, 1-453, 1-694, 31-453, y 1-507 (numeración de secuencia como se define por Naureckiene S. et al, Archives of Biochemistry and Biophysics, "Functional Characterization of Narcl, a Novel Proteinase Related to Proteinase K" , 420:55-67, 2003); los residuos 31-451 y/o los residuos 53-451 (incluyendo las variantes de cualquiera de estos, tales los siguientes: P155G, W156L, N157K, L158A, I161A, R194A, D238A, D374Y, S386A, con o sin una etiqueta his) (numeración de secuencia como se define en Bottomley et al., J. of Biological Chemistry, "Structural and Biochemical Characterization of the Wild Type PCSK9/EGF-AB Complex and Natural FH mutants" , 284: 1313-23, 2008); una eliminación en la estructura de ocho exones de 58 aminoácidos, por ejemplo, eliminación de los residuos 395-452 (manteniendo 1-394 y 453 en el extremo, como se describe en Schmidt et al., DNA and Cell Biology, "A Novel Splicing Variant of' Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin Type 9, 27: 183-189, 2008); y/o los residuos 1-692 (humanos), 1-691 (rata) , 1-316 (rata) , 1-390 (rata) , 1-390 (S385A, rata) , 1-425 (rata) , 1-453 (rata) , 1-507 (rata) , 31-691 (rata) , 148-691 (rata) , 1-691 (rata, incluyendo la eliminación opcional de 31-147, la eliminación opcional de 148-425, la eliminación opcional de 219-395, histidina 225 para triptófano, serina 385 para alanina, o histidina 225 para triptófano y una serina 385 para alanina), 1-142, y/o 1-679 (numeración de secuencia como se define en Bingham et al., Cytometry A., "Proapoptotic effects of NARC 1 (= PCSK9) , the gene encoding a novel serine proteinase" , 69(1 1): 1 123-31, 2006). La totalidad de la descripción de cada una de las referencias antes indicadas, se incorpora aquí por referencia, especialmente con respecto a sus descripciones de las varias secuencias PCSK9 y la explicación de las mismas. En algunas modalidades, cualquiera o más de las variantes anteriores están abarcadas dentro del grupo de variantes PCSK9 neutralizantes útiles. En algunas modalidades, cualquiera o todos los anteriores pueden combinarse con o en un portador farmacéuticamente aceptable o utilizarse para la preparación de un medicamento.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes tiene un dominio pro/cat que es diferente del dominio pro/cat en la secuencia de ADNc de NM-174936 o gi31317306. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante incluye mutaciones de punto en por lo menos una de las siguientes posiciones: 474, 620, o 670. En algunas modalidades, la mutación de punto es Val474Iso, Gly670Glu, y/o Glu620Gly.

Vehículos El término "vehículo" se refiere a una molécula que evita la degradación y/o aumenta la vida media reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad, o aumenta la actividad biológica de una proteína terapéutica cuando se une covalente o covalentemente a la proteína terapéutica. Los vehículos ilustrativos incluyen un dominio Fe (incluyendo, por ejemplo, Fe nativo, variantes de Fe, dominios Fe, multímeros, y dímeros) así un como un polímero lineal (por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , polilisina, dextrina, etc.); un polímero de cadena ramificada (ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 4,289,872 de Denkenwalter et al., emitida en Sep. 15, 1981; Patente de E. U. A. No. 5,229,490 de Tam, publicada el 20 de julio de 1993; O 93/21259 por Frechet et al., publicada el 28 de octubre de 1993); un lípido; un grupo de colesterol (tal como un esteroide) ; un carbohidrato u oligosacáridos ; o cualquier proteína, polipéptido o péptido natural o sintético que se une a un receptor salvaje. Los vehículos además se describen en Patente de E. U. A. No. 6,660,843, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En algunas modalidades, se utilizan vehículos múltiples, por ejemplo, Fe en cada término o un Fe en un término un grupo PEG en los otros términos o en una cadena lateral. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se combina, asociada, mezcla o une con cualquiera de uno o más de los vehículos anteriores.

Un vehículo alternativo podría ser una proteína, polipéptido, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo o molécula que tiene (por ejemplo, un compuesto peptidomimético) capaz de unirse a un receptor salvaje. Por ejemplo, se podría utilizar como vehículo un polipéptido como se describe en Patente de E . U. A-. No. 5,739,277, emitida el 14 de abril de 1998 de Presta et al. Los péptidos también podrían seleccionarse a través de despliegue de fago para unión al receptor salvaje FcRn. Tales compuestos de unión al receptor salvaje también se incluyen dentro del significado de "vehículo" y están dentro del alcance de esta invención. Tales vehículos deberán seleccionarse para una vida media incrementada (por ejemplo, evitando secuencias que se reconocen a través de proteasa) e inmunogenicidad disminuida (por ejemplo, favoreciendo las secuencias no inmunogénicas , como se descubre en la humanización del anticuerpo) .

Como se observó anteriormente, los vehículos de polímero también pueden utilizarse. Varios medios para unir fracciones químicas útiles como vehículos están actualmente disponibles, ver, por ejemplo la Publicación Internacional No. WO 96/11953 del Tratado de Cooperación de Patentes ("PCT") titulada "N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods" , incorporada aquí por referencia en su totalidad. Esta publicación PCT describe, entre otras cosas, la unión selectiva de polímeros solubles en agua al N-terminal de las proteínas.

En algunas modalidades, el vehículo de polímero es polietilenglicol (PEG) . El grupo PEG puede ser de cualquier peso molecular conveniente y puede ser lineal o ramificado. El peso molecular promedio del PEG preferiblemente estará en el intervalo de aproximadamente 2 kiloDalton ("kD") a aproximadamente 100 kDa, y más preferiblemente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 50 kDa. Los grupos PEG generalmente se unirán a la variante PCSK9 neutralizante a través de acilación o alquilación reducida a través de un grupo reactivo en la fracción PEG (por ejemplo, un aldehido, amino, tiol o grupo éster) a un grupo reactivo en el compuesto de la invención (por ejemplo, un aldehido, amino, o grupo éster) .

En algunas modalidades, una estrategia útil para la pegilación de los péptidos sintéticos involucra combinar, a través de la formación de un enlace de conjugado en solución, un péptido y una fracción PEG, cada una llevando una f ncionalidad especial que es mutuamente reactiva hacia la otra. Los péptidos pueden fácilmente prepararse con síntesis de fase sólida convencional. Los péptidos se "preactivan" con un grupo funcional apropiado en un sitio específico. Los precursores se purifican y caracterizan completamente antes de la reacción con la fracción PEG. La ligación del péptido con PEG usualmente toma lugar en una fase acuosa y puede fácilmente monitorearse a través de HPLC analítica de fase inversa. Los péptidos pegilados pueden fácilmente purificarse a través de HPLC preparativa y caracterizarse a través de HPLC analítica, análisis de aminoácido y espectrometría de masa de desabsorción láser.

Los polímeros de polisacáridos son otro tipo de polímeros solubles en agua que pueden utilizarse para la modificación de la proteína. Las dextrinas son polímeros de polisacárido comprendidas de subunidades individuales . de glucosa predominantemente enlazadas a través de enlaces alfa 1-6. La dextrina por sí misma está disponible en muchos intervalos de peso molecular, y está fácilmente disponible en pesos moleculares de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 70 kD. La dextrina es un polímero soluble en agua adecuado para utilizarse como un vehículo por sí mismo o en combinación con otro vehículo (por ejemplo, Fe) . Ver, por ejemplo WO 96/11953 y WO 96/05309. El uso de dextrina conjugado con inmunoglobulinas terapéuticas o diagnósticas ha sido reportado; ver, por ejemplo, la Publicación de Patente Europea No. 0 315 456, que se incorpora aquí por referencia. La dextrina de aproximadamente 1 kD a aproximadamente 20 kD puede utilizarse.

En otra modalidad un vehículo es un péptido o polipéptido no Fe que se conoce o se sabe que evita la degradación y/o aumenta la vida media, reduce la toxicidad, reduce la inmunogenicidad o aumenta la actividad biológica de una proteína terapéutica. Los ejemplos de tales vehículos de proteína incluyen transtiretina o fusiones de proteína HSA. Estos vehículos pueden fusionarse a la variante PCSK9.

Enlazadores Cualquier grupo "enlazador" es opcional. Cuando está presente, su estructura química no es crítica, ya que sirve preliminarmente como un separador. El enlazador puede formarse de aminoácidos enlazados juntos a través de enlaces de péptido. De esta forma, en algunas modalidades, el enlazador se forma de hasta a 1 a 20 aminoácidos enlazador a través de enlaces de péptido, en donde los aminoácidos se seleccionan de 20 aminoácidos de existencia natural. Algunos de estos aminoácidos pueden glicosilarse, como es bien entendido en la técnica. En algunas modalidades, de los 1 a 20 aminoácidos se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. En algunas modalidades, un enlazador se forma de hasta la mayoría de los aminoácidos que están estéricamente sin obstaculizar, tales como glicina y alanina. En algunas modalidades, los enlazadores son poliglicinas (particularmente (Gly) , (Gly) 5) , poli (Gly-Ala) , y polialaninas . Otros ejemplos específicos de enlazadores son: (Gly)3 Lys(Gly)4; (Gly) 3 ASnGlySCr (Gly) 2 ; (Gly)3 Cys(Gly)4; y GlyProAsnGlyGly .

Para explicar la nomenclatura anterior, por ejemplo, (Gly) 3 Lys(Gly)4 significa Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Las combinaciones de Gly y Ala también son preferidas. Los enlazadores mostrados en la presente son ilustrativos y pueden ser mucho más largos y pueden incluir otros residuos.

Los enlazadores no de péptido también son posibles.

Por ejemplo, los enlazadores de alquilo tales como - NH-- (CH2) 5- -C (0) - - , en donde s=2-20 podría utilizarse. Esos enlazadores de alquilo pueden además sustituirse por cualquier grupo no estéricamente obstaculizado tal como alquilo inferior (por ejemplo, acilo inferior de Ci-C6) , halógeno (por ejemplo, Cl, Br) , CN, NH2, fenilo, etc. Un enlazador no de péptido ilustrativo es un .enlazador PEG, en donde el enlazador tiene un peso molecular de 100 a 5000 kD, por ejemplo, 100 a 500 kD. Los enlazadores de péptido pueden alterarse para formar derivados en la misma forma como se describió anteriormente.

Derivados En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante (y/o el vehículo) se derivativa. Tales derivados pueden mejorar la solubilidad, absorción, vida media biológica, y similar de los compuestos. Las fracciones pueden alternativamente eliminar o atenuar cualquier efecto secundario o indeseable de los compuestos y similar. En algunas modalidades, la afección puede adicionar propiedades adicionales a la molécula como un todo. Los derivados ilustrativos son provistos en la presente.

La variante PCSK9 neutralizante o una de sus porciones son cíclicas. Por ejemplo, la porción de péptido puede modificarse para contener dos o más residuos Cys (por ejemplo, en el enlazador) , que podría ciclizarse a través de la formación del enlace de disulfuro.

La variante PCSK9 neutralizante está entrelazada o se hace capaz de entrelazarse entre las moléculas. Por ejemplo, la porción de péptido puede modificarse para contener un residuo de Cys y por lo tanto ser capaz de formar un enlace de disulfuro intermolecular con una molécula similar. El compuesto también puede entrelazarse a través de su C-terminal.

Uno o más enlaces de peptidilo [--C(0)NR-] (enlaces) se reemplaza por un enlace no de peptidilo. Los enlaces no de peptidilo ilustrativos son -CH2 -carbamato [--CH2 -0C(0)NR--], fosfonato, -CH2 -sulfonamida [-CH2 -S(0)2 NR-], urea [-NHC (0) NH-] , -CH2 - amina secundaria, y el péptido alquilado [--C(0)NR6 — en donde R6 es alquilo inferior] .

El N-terminal se derivatiza. Típicamente, el N- terminal puede acilarse o modificarse a una amina sustituida. Los grupos derivados de N-terminal ilustrativos incluyen — RRi (diferente de -NH2) , -NRC(0)R4, -NRC(0)OR,, -NRS(0)2 Ri, -NHC (0) NHR, , succinimida, o benciloxicarbonil-NH— (CBZ-NH-), en donde R y Ri son cada uno independientemente hidrógeno o alquilo inferior y en donde el anillo fenilo puede sustituirse con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de alquilo de Ci-C4, alcoxi de Ci-C4, cloro, y bromo .

El C-terminal libre se' derivatiza. Típicamente, el C-terminal se esterifica o amida. Por ejemplo, se pueden utilizar los métodos descritos en la técnica para agregar (NH-CH2 -CH2 - NH2)2 neutralizantes. Igualmente, se pueden utilizar los métodos descritos en la técnica para agregar -NH2 a las variantes PCSK9 neutralizantes. Los grupos derivados C-terminal ilustrativos incluyen, por ejemplo, C(0)R2 en donde R2 es alcoxi inferior o -NR3 R4 en donde R3 y R4 son independientemente hidrógeno o alquilo de Ci-C8 (preferiblemente alquilo de Ci-C ) .

Un enlace de disulfuro se reemplaza con otro, preferiblemente más estable, fracción entrelazada (por ejemplo un alquileno) . Ver, por ejemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9; Alberts et al. (1993) Thirteenth Am. Pep. Symp . , 357-9.8. Uno o más residuos de aminoácidos individuales se modifican. Varios agentes de derivatización se sabe que reaccionan específicamente con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados, como se describe con detalle a continuación.

Los residuos de lisinilo y los residuos amino-terminal pueden reaccionar con anhídrido de ácido succínico u otros anhídridos de ácido carboxílico, que invierten la carga de los residuos de lisinilo. Otros residuos adecuados para la derivatización de residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como metil picolinimidato ; piridoxal fosfato; piridoxal; cloroborohidruro, ácido trinitrobencensulfónico; O-metilisourea ; 2 , 4 -pentandiona ; y la reacción catalizada por transaminasa con glicoxilato. Los residuos de arginilo pueden modificarse a través de la reacción con uno o una combinación de varios reactivos convencionales, que incluyen fenilglioxal , 2 , 3 -butandiona , 1 , 2 -ciclohexandiona y ninhidrina. La derivatización de los residuos de arginilo requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al alto pKa de un grupo funcional de guanidina . Además, estos reactivos pueden reaccionar con los de lisina así como con el grupo Epsilon-amino de arginina. La modificación específica de los residuos de tirosilo se ha estudiado extensivamente, con interés particular en la introducción de etiqueta de espectro en los residuos de tirosilo a través de la reacción de compuestos de diazonio aromático o tetranitrometano . Más comúnmente, se utilizan N-acetilimidazol y tetranitrometano para formar especies de o-acetil tirosilo y derivados de 3 -nitro respectivamente. Los grupos de cadena lateral de carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden selectivamente modificarse a través de la reacción con carbodiimidas (R1—N=C=N--R' ) tales como l-ciclohexil-3- (2-morfolinil- (4-etil) carbodiimida o 1-etil -3 - (4 -azonia-4 , 4 - dimetilpentil ) carbodiimida . Además, los residuos de aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos de asparaginilo y glutaminilo a través de la reacción con iones de amonio. Los residuos de glutaminilo y asparaginilo pueden desanidarse a los residuos de glutamilo y asparagilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan bajo condiciones ácidas ligeras. Los residuos de cisteinilo pueden reemplearse por residuos de aminoácido u otras fracciones ya sea para eliminar el enlace del disulfuro o, inversamente, para estabilizar el entrelazamiento. Ver, por ejemplo, Bhatnagar et al. (1996), J. Med. Chem. 39: 3814-9.

La derivatización con agentes bifuncionales puede ser útil para el entrelazamiento de los péptidos o sus derivados funcionales a una matriz de soporte insoluble en agua u otros vehículos macromolares . Los agentes de entrelazamiento comúnmente utilizados incluye, por ejemplo, 1 , 1-bis (diazoacetilo) -2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4- azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales , incluyendo ésteres de disuccinimidilo tales como 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato) , y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1, 8-octano. . Los agentes de derivatización tales como metil-3-[(p-azidofenilo) ditio] propioimidato producen intermediaros fotoactivables que son capaces de formar entrelazamientos en la presencia de luz. Alternativamente, las matrices insolubles en agua reactivas tales como carbohidratos activados con bromo cianógenos y los sustratos reactivos descritos en las Patentes de E. U. A. Nos. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; y 4,330,440 se utilizan para la inmovilización de la proteína.

Los grupos carbohidrato (oligosacáridos) pueden unirse a sitios que se sabe que son sitios de glicosilación en las proteínas. Generalmente, los oligosacáridos 0-enlazados se unen a residuos de serina (Ser) o treonina (Thr) mientras los oligosacáridos N-enlazados se unen a residuos de asparagina (Asn) cuando son partes de la secuencia Asn-X-Ser/Thr, en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. X es preferiblemente uno de los 19 aminoácidos de existencia natural diferentes de prolina. Las estructuras de los oligosacáridos N-enlazados y O-enlazados y los residuos de azúcar encontrados en cada tipo son diferentes. Un tipo de azúcar que comúnmente se encuentra en ambos el ácido N-acetil neuramínico (referido como ácido siálico) . El ácido siálico usualmente es el residuo terminal de ambos oligosacáridos N-enlazado y O-enlazado y, en virtud de carga negativa, puede conferir propiedades ácidas al compuesto glicosilado. El sitio (s) puede incorporarse en el enlazador de la variante PCSK9 neutralizantes y puede glicosilarse a través de una célula durante la producción recombinante de los compuestos de polipéptido (por ejemplo, en las células de mamífero tales como CHO, BHK, COS) . Sin embargo, tales sitios además pueden glicosilarse a través de procedimientos sintéticos o semi-sintéticos conocidos en la técnica.

Otras posibles modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, la oxidación del átomo de azufre en Cys, la mutilación de los grupos alfa-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina. Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp . 79-86 (1983) .

En algunas modalidades, la cisteína(s), arginina(s) y/o lisina (s) pueden introducirse en la variante PCSK9 neutralizantes como una cita(s) de pegilación.

Las variantes PCSK9 neutralizantes pueden cambiar el nivel de ADN, también. La secuencia de ADN de cualquier porción del compuesto puede cambiarse a codones más compatibles con la célula hospedera seleccionada. Los codones pueden sustituirse para eliminar los sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula hospedera seleccionada. El vehículo, el enlazador y las secuencias de ADN de péptido pueden modificarse para incluir cualquiera de los siguientes cambios de secuencia.

En algunas modalidades, las variantes PCSK9 neutralizantes incluyen la glicosilación en donde el número y/o tipo de glicosilación ha sido alterado comparado con las secuencia de aminoácido del polipéptido progenitor. En algunas modalidades, las variantes de proteína comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilación N-enlazados que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación N-enlazado se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-Thr, en donde el residuo de aminoácido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoácido excepto prolina. La sustitución de los residuos de aminoácido para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato N-enlazada. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia eliminarán una cadena de carbohidrato N-enlazada existente. También se proporciona la reconfiguración de las cadenas de las cadenas de carbohidrato N-enlazadas en donde uno o más de los sitios de glicosilación N-enlazados (típicamente los que son de existencia natural) se eliminan y uno o más de los nuevos sitios N-enlazados se crean. Las variantes preferidas adicionales incluyen variantes de cisteínas. en donde uno o más de los residuos de cisteína se eliminan de o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) según comparado con la secuencia de aminoácido progenitora. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos residuos de cisteína que la proteína nativa, y típicamente tienen un número par para minimizar interacciones que resultan de cisteínas no emparejadas.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante está asociada con por lo menos parte de un anticuerpo. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante es parte de una proteína de fusión del anticuerpo. Como se apreciará por un experto en la técnica, una proteína de fusión puede incluir varias secuencias de anticuerpo. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se fusiona a un anticuerpo de longitud completa. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes se funciona a un anticuerpo que se une a LDLR por lo tanto además se aumenta la probabilidad de que la variante PCSK9 neutralizantes se dirija a su objetivo. Las fusiones de anticuerpo no neutralizantes también forman un aspecto de la presente invención. En esta modalidad, el anticuerpo no neutralizante fusionado a una variante PCSK9 puede llevar a cabo la función de aumentar la vida media de la variante PCSK9.

En algunas modalidades, como se observó anteriormente, la variante PCSK9 neutralizante se fusiona a un fragmento de un anticuerpo, tal como un dominio Fe. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprenderá, o consistirá esencialmente de un dominio Fe. En algunas modalidades, la proteína de fusión comprenderá, o consistirá esencialmente de una región Fe nativa. En algunas modalidades, el anticuerpo o el fragmento de unión de grupo que está unido o fusionado a la variante PCSK9 neutralizante se unirá a LDLR.

En algunas modalidades, cualquiera de las variantes PCSK9 neutralizantes descritas en la presente, incluyendo las fusiones del anticuerpo, pueden hacerse de secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de proteína. De esta forma, las secuencias de ácido nucleico, los vectores y las células que comprenden estos compuestos también se contemplan en la presente.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se une a la variante LDLR. En algunas modalidades, las variantes de LDLR son al menos 50% idénticas a LDLR humanas. Se observa que las variantes de LDLR son conocidas por el experto en la técnica (por ejemplo, Brown MS et al, "Calcium cages, acid baths and recyeling receptors" Nature 388: 629-630, 1997). En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante puede elevar el nivel de LDLR efectivo en el heterocigoto hipercolesterolemia familiar (en donde una pérdida de la función de la variante LDLR está presente) . Tres secuencias LDLR ilustrativas se muestran en las Figuras 1I-1L (secuencias de aminoácido de ratón, mono, cynomolgus, humanos) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes se unirá a una proteína que comprende por lo menos una de las secuencias en las Figuras II -1L. En algunas modalidades, la variante PCSK9 nativa se unirá a una variante LDLR que comprende, consiste o consiste esencialmente de la secuencia de consenso en las Figuras 1L-1L. En algunas modalidades, la variante LDLR comprenderá cada uno de los aminoácidos conservados identificados en la secuencia de consenso en las Figuras 1I-1L. Como se apreciará por un experto en la técnica, el espacio (s) en la secuencia de consenso puede llenarse con cualquiera de los otros aminoácidos - en la comparación en la ubicación correspondiente, o, en algunas modalidades, cualquier aminoácido.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se une a y bloquea LDLR de unirse a otras variantes de PCSK9. Estas variantes de PCSK9 son al menos 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, o mayor porcentaje de identidad a la forma de PCSK9 descrita en la Figura 1A. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante es una variante humana, tales como las variantes en la posición 474. En algunas modalidades, el aminoácido en la posición 474 es valina (como en otros humanos) o treonina (como en cyno y ratón) .

En algunas modalidades, las variantes de PCSK9 se contemplan, en donde una muta libremente los aminoácidos en el exterior de PCSK9, mientras altera conservativamente los que están dentro de PCSK9. En algunas modalidades, las variantes de PCSK9 se contemplan en donde una no altera o solamente altera conservativamente los residuos en la superficie de unión entre PCSK9 y LDL , mientras altera libremente o conservativamente los residuos en el resto de la superficie de PCSK9 o dentro de la proteína. Se explican varias variantes PCSK9 neutralizantes en la presente y en las secciones anteriores.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes comprende una proteína que tiene una secuencia que inicia en los residuos 31 ó 61 de SEC ID NO : 3 (y sus variantes) y los extremos de cualquiera de los residuos 447, 448, 449, 450, 451, 452, o 453 de SEC ID NO: 3 (y sus variantes) . De esta forma, en algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes puede incluir los residuos 31-447, 31-448, 31-449, 31-450, 31-451, 31-452, 31-453, 61-447, 61-448, 61-449, 61-450, 61-451, 61-452, y 61-453 de SEC ID NO: 3 (y sus variantes) y/o una secuencia de consenso (por ejemplo, mostrada en las Figuras 1C-1E, Figura 1RI-1R2 (SEC ID NO: 30) y Figura F-H (para el dominio Cat) . En algunas modalidades, las variantes pueden ser 50% o más (por ejemplo, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, o 99-100%) idénticas al dominio pro/cat de SEC ID NO: 3 sobre la longitud de secuencia específica. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes es al menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99%, o más idéntica a las secciones conservadas del dominio pro/cat. En algunas modalidades, ya que las secciones del dominio pro/cat en la variante PCSK9 neutralizantes están 100% conservadas (por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1C-1E) están presentes, las posiciones restantes pueden cambiarse. En algunas modalidades, los cambios en estas posiciones restantes pueden dar como resultado una sección pro/cat en la variante PCSK9 neutralizantes que es 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, o 99-100% idéntica al domino pro/cat . correspondiente de SEC ID NO: 3.

Adicionalmente, un experto en la técnica puede revisar los estudios de estructura-función que identifican residuos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructural. En vista de tal comparación, se puede pronosticar la importancia de los residuos de aminoácidos en una proteína que corresponde a los residuos de aminoácido que son importantes para la actividad o la estructura en proteínas similares. Un experto en técnica puede optar por . sustituciones de aminoácido químicamente similares para tales residuos de aminoácido importantes pronosticados.

Un experto en la técnica también puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoácido con relación a esa estructura. En vista de tal información, un experto en la técnica puede pronosticar la alineación de los residuos de aminoácido de un fragmento de proteína con respecto a su estructura tridimensional. En algunas modalidades, un experto en la técnica puede seleccionar no hacer cambios radicales a los residuos de aminoácido pronosticados como estando en la superficie de la proteína, ya que tales residuos pueden involucrar interacciones importantes con otras moléculas. Además, un experto en la técnica puede generar y probar variantes que contienen una sola sustitución de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Las variantes después pueden clasificarse utilizando ensayos de actividad, conocidos por el experto en la técnica, o como se describen en los ejemplos descritos en la presente. Tales variantes pueden utilizarse para obtener información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si descubre que un cambio a un residuo de aminoácido particular da como resultado una actividad destruida, indeseablemente reducida o inadecuada, las variantes tales como un cambio puede evitarse. En otras palabras, con base en la información obtenida de tales experimentos de rutina, un experto en la técnica puede fácilmente determinar los aminoácidos en donde las sustituciones adicionales serán evitadas ya sea solas o en combinación con otras mutaciones.

Se ha dedicado un número de publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Ver Moult J., Curr. Op . in Biotech. , 7(4):422-427 (1996), Chou et al, Biochemistry, 13 (2) : 222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 1 13(2) :21 1-222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol . , 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem. , 47:251-276 y Chou et al, Biophys. J., 26:367-384 (1979) . Además, los programas de computadora están actualmente disponibles para ayudar en el pronóstico de la estructura secundaria. Un método para pronosticar la estructura secundaria se basa en la modelación de la homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor de 30%, o similarmente mayor de 40% por lo general tienen topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural de la proteína (PDB) ha proporcionado un grado de pronóstico mejorado de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de pliegues con una estructura del polipéptido o proteína. Ver Holm et al, Nucí. Acid. Res., 27 (1) :244- 247 (1999) .

Los métodos adicionales para pronosticar la estructura secundaria incluyen "enlazamiento" (Jones, D. , Curr. Opin. Struct. Biol . , 7(3):377-87 (1997); Sippl et al, Structure, 4(1): 15-19 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie et al, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al, Meth. Enzym. , 183:146-159 (1990); Gribskov et al, Proc . Nat . Acad. Sci. USA, 84 (13) :4355-4358 (1987)), y "enlace evolutivo" (ver Holm, supra (1999), y Brenner, supra (1997)).

De acuerdo con ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido son aquellas en donde: (1) se reduce la susceptibilidad a la proteólisis, (se reduce la susceptibilidad a la oxidación, (3) se altera la afinidad de unión para formar complejos de proteína, (4) se alteran las afinidades de unión y/o (5) se confieren o modifican otras propiedades fisicoquímicas o funcionales en tales polipéptidos . De acuerdo con ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido individuales o múltiples (en algunas modalidades, sustituciones de aminoácido conservadoras) pueden hacerse en la secuencia de existencia natural (en algunas modalidades, la porción del polipéptido fuera del dominio (s) que forman los contactos intramoleculares). En algunas modalidades, una sustitución de aminoácido conservadora típicamente no puede sustancialmente cambiar las características estructurales de la secuencia progenitora (por ejemplo, un remplazo de aminoácido no deberá tender a separar una hélice que ocurre en la secuencia progenitora, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracterizan la secuencia progenitora) . Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias del polipéptido reconocidas en la técnica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden & J. Tooze, eds . , Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); y Thornton et al, Nature, 354: 105 (1991), que se incorporan aquí por referencia.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante (o secuencia de ácido nucleico que la codifica) es una variante sin la secuencia de ácido nucleico que codifica la variante PCSK9 neutralizante particular puede selectivamente hibridar a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína en SEC ID NO: 3 bajo condiciones moderadamente estrictas o estrictas. En una modalidad, las condiciones moderadamente estrictas adecuadas incluyen prelavado en una solución de 5XSSC; 0.5% de SDS, 1.0 mM de EDTA (pH 8:0); hibridación a 50°C, -65°C, 5xSSC, durante la noche o en el caso de homología de especies cruzadas a 45 °C con 0.5xSSC, seguido por un lavado dos veces a 65 °C durante 20 minutos con cada uno de 2x, 0.5x y 0.2xSSC conteniendo 0.1% de SDS. Tales secuencias de ADN hibridizantes también están dentro del alcance de esta invención, como las secuencias de nucleótido que, debido a su degeneración de código codifican una variante que se codifica por una secuencia de ADN hibridizante y las secuencias de aminoácido que están codificadas por estas secuencias de ácido nucleico. En algunas modalidades, las condiciones altamente estrictas adecuadas se utilizan e incluyen la hibridación a aproximadamente 65 °C en 0. lxSSC . En algunas modalidades, las condiciones altamente estrictas adecuadas incluyen lavado en 0. IxSSPE y 0.2% SDS a 65 °C por 15 minutos. En algunas modalidades, las condiciones altamente estrictas incluyen 31% v/v a 50% v/v de formamida y de 0.0 1M a 0.15M de sal a 42 °C y condiciones de lavado de 0.1 xSCC, 0.5% p/v SDS a 60 °C. Tales secuencias de ADN hibridizante también están dentro del alcance de esta invención, ya que son secuencias de nucleótido que como, debido a su degeneración del código codifican una variante que se codifica por una secuencia de ADN hibridizante y las secuencia se aminoácido que se codifican por estas secuencias de ácido nucleico.

La frase "selectivamente hibridiza" se refiere en este contexto a una unión detectable y selectiva. Tales, polinucleótidos , oligonucleótidos , y sus fragmentos selectivamente hibridizan estructuras de ácido nucleico bajo hibridación y condiciones de lavado que minimizan las cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Las condiciones altamente estrictas pueden utilizarse para lograr condiciones de hibridación selectivas como se conoce en la técnica y se explica en la presente. En general, la homología de la secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos , oligonucleótidos y fragmentos y una secuencia de ácido nucleico de interés serán de al menos 80%, y más típicamente preferiblemente homologías en aumento de por lo menos 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%. Las dos secuencias de aminoácido son homologas si existe una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que 85% de los aminoácidos son idénticos cuando las dos secuencias se alinean para una comparación máxima. Los huecos (en cualquiera de las dos secuencias que se están comparando) se dejan maximizar en la comparación; las longitudes de hueco de 5 o menos son preferidas con dos o menos siendo más preferidas. Alternativa y preferiblemente, dos secuencias de proteína (o secuencias de polipéptido derivadas de al menos 30 aminoácidos en longitud) son homologas, como este término se utiliza en la presente, si tienen una puntuación de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y penalidad de hueco de 6 o mayor. Ver Dayhoff, M. 0., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-1 10 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) y Suplemento 2 de este volumen, I p. 1-10. Las dos secuencias o partes de la misma son preferiblemente homologas si sus aminoácidos son mayores que o igual a 50% idénticos cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se utiliza en la presente para significar una secuencia de polinucleótido que es homologa (es decir, es idéntica, no estrictamente relacionada con la evolución) a toda o una porción de la secuencia de polinucleótido de referencia, o que una. secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia. El contraste, el término "complementarios a" se utiliza en la presente para significar que la secuencia complementaria es homologa a todo o una porción de la secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótido "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y su complemento a una secuencia de referencia "GTATA" .

POr ejemplo, una "sustitución de aminoácido conservadora" puede involucrar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo de tal forma que existe poco o ningún efecto sobre la polaridad o cambio del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina y/o arginina, como se describe previamente para "mutagénesis de exploración de alanina" y "mutagénesis de exploración de arginina" .

Las sustituciones de aminoácido deseadas (ya conservadoras o no conservadoras) pueden determinarse por el experto en la técnica en el momento en tales sustituciones se desean. En algunas modalidades, las sustituciones de aminoácido pueden utilizarse para identificar residuos importantes de PCSK9, o para aumentar o disminuir la afinidad de la variante PCSK9 neutralizantes como se describe en la presente .

Anticuerpos para Variantes PCSK9 Neutralizantes En algunas modalidades, los anticuerpos de cualquiera de las secuencias o, variantes PCSK9 neutralizantes descritas en la presente pueden hacerse y utilizarse. Estos anticuerpos son selectivos para la variante PCSK9 neutralizantes sobre la PCSK9 nativa. En algunas modalidades, el anticuerpo se une a una variante PCSK9 neutralizante que consiste esencialmente del dominio Pro/Cat de PCSK9. En algunas modalidades, el anticuerpo es selectivo para esta variante PCSK9 neutralizantes sobre la PCSK9 de tipo silvestre .

Como se apreciará por un experto en la técnica, los anticuerpos pueden crearse haciendo surgir anticuerpos para la variante PCSK9 neutralizante y después identificando esos anticuerpos que no se unirán (o no unirán, efectivamente como anticuerpos a la PCSK9 nativa) para la PCSK9 nativa. En algunas modalidades, los anticuerpos se unirán a la variante PCSK9 neutralizante con un KD que es al menos 1, 1-10, 10-50, o 50-100% mejor que el KD del anticuerpo para PCSK9 humana. En algunas modalidades, los anticuerpos se unirán a la variante PCSK9 neutralizantes con un KD que es al menos 2-5, 5-10, 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-10,000, 10,000-100,000, o 100, 000 -106 mejor que el KD del anticuerpo para la PCSK9 nativa. Como se apreciará por un experto en la técnica, ya que la variante PCSK9 neutralizantes tendrá un domino V inactivo que puede ser estructuralmente diferente (o estar aún ausente) de la proteína PCSK9 de tipo silvestre, tales anticuerpos selectivos serán fácilmente obtenibles dada la presente descripción. En algunas modalidades, se utiliza un adyuvante con la variante PCSK9 neutralizante para crear los anticuerpos anteriores.

Como se apreciará por un experto en la técnica, los anticuerpos pueden utilizarse para selectivamente observar la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante sin inadvertidamente detectar PCSK9 nativa también.

Líneas Celulares y Expresión de las Variantes PCSK9 neutralizantes En algunas modalidades, las variantes PCS 9 neutralizantes puede expresarse en líneas celulares. En algunas modalidades, las secuencias que codifican las variantes PCSK9 neutralizantes particulares pueden utilizarse para la transformación de una célula hospedera de mamífero adecuada. De acuerdo con ciertas modalidades, la transformación puede ser a través de método conocido para introducir polinucleótidos en una células hospedera, incluyendo, por ejemplo, el empaque del polinucleótido en un virus (o un vector viral) y la transducción de la célula hospedera con el virus (o vector) o a través de procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica por Patentes de E. U. A. Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, y 4,959,455 (cuyas patentes se incorporan por referencia para cualquier propósito) . En algunas modalidades, el procedimiento de transformación utilizado puede depender del hospedero a ser transformado. Los métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en las células de mamífero son bien conocidos en la técnica e incluye, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrina, precipitación de calcio-fosfato, -transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, encapsulación del polinucleótido (s) en liposomas, y la microinyección directa del ADN en el núcleo.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como hospederos para la expresión son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la colección de cultivo de tipo americano (ATCC) , que incluyen pero no se limitan a células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular de humano (por ejemplo, Hep G2) , y un número de otras líneas celulares. En algunas modalidades, las líneas celulares pueden seleccionarse a través de la determinación de cuáles líneas celulares tienen altos niveles de expresión. Los vectores de expresión apropiados para células hospederas de mamífero son bien conocidos.

En algunas modalidades, cualquiera de una variedad de vectores de expresión/sistemas hospederos puede utilizarse para expresar moléculas de polinucleótido que codifican polipéptidos que comprenden uno o más segmentos de proteína. Tales sistemas incluye, pero no se limitan a microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante , plásmido o vectores de expresión de ADN de cósmico; levadura transformada con vectores de expresión de levadura; sistemas celulares de insecto infectados con vectores de expresión virus (por ejemplo, baculovirus) ; sistemas celulares de plantas transfectadas con vectores de virus (por ejemplo, el virus de mosaico de coliflor, CaMV, el virus de mosaico de tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, el plásmido Ti o pBR322) ; o sistemas celulares de animal.

En algunas modalidades, un polipéptido que comprende una o más de variantes PCSK9 neutralizantes se expresa recombinante en levaduras. Ciertas de tales modalidades utilizan sistemas de expresión comercialmente disponibles, por ejemplo, el Sistema de Expresión Pichia Invitrogen, San Diego, CA) , siguiendo las instrucciones del fabricante. En algunas modalidades, tal sistema se basa en la secuencia pre-pro-alfa para la secreción directa. En algunas modalidades, la transcripción del inserto se conduce a través del promotor de alcohol oxidasa (A0X1) después de la inducción a través de metanol .

En algunas modalidades, un polipéptido secretado que comprende una o más variantes PCSK9 neutralizantes se purifica de un medio de crecimiento con levadura. En algunas modalidades, el método utilizado para purificar un polipéptido del medio de crecimiento de levadura es igual al utilizado para purificar el polipéptido de los sobrenadantes celulares de bacteria y de mamífero..

En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una o más variantes PCSK9 neutralizantes se clona en un vector de expresión de baculovirus, tal como pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA) . En algunas modalidades, tal vector puede utilizarse de acuerdo con las direcciones del fabricante (PharMingen) para infectar células Spodoptera frugiperda en un medio sin proteína sF9 y para producir un polipéptido recombinante. En algunas modalidades, un polipéptido se purifica y se concentra a partir de tal medio utilizando una columna de heparina-sepharose (Pharmacia) .

En algunas modalidades, un polipéptido que comprende una o más de las variantes PCSK9 neutralizantes se expresa en un sistema de insecto. Ciertos sistemas de insectos para la expresión del polipéptido son conocidos por el experto en la técnica. Uno de tales sistemas, el virus de polihedrosis nuclear de Autograp a californica (AcNPV) se utiliza como un vector para - expresar genes foráneos en células Spodoptera frugiperda o en la larva de Trichoplusia . En algunas modalidades, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido puede insertarse en un gen no esencial del virus, por ejemplo, dentro del gel de polihedrina y colocarse bajo un control del promotor para ese gen. En algunas modalidades, la inserción exitosa de una molécula de ácido nucleico convertirá al gen no esencial en inactivo. En algunas modalidades, la inactivación da como resultado una característica detectable. Por ejemplo, la inactivación del gen de polihedrina da como resultado la producción de un virus que carece de una proteína de recubrimiento .

En algunas modalidades, los virus recombinantes pueden utilizarse para infectar células S. frugiperda o la larva Trichoplusia larvae. Ver, por ejemplo, Smith et al, J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard et al, Proc . Nat . Acad.

Sci. (USA), 91:3224-7 (1994).

En algunas modalidades, los polipéptidos que comprenden una o más variantes PCSK9 neutralizantes hechas de células bacterianas se producen como cuerpos de inclusión insolubles en la bacteria. En algunas modalidades, las células hospederas que comprenden los cuerpos de inclusión se recolectan a través de centrifugación; se lavan en 0.15 M de NaCl, 10 mM de Tris, pH 8, 1 mM de EDTA; y se tratan con 0.1 mg/ml de lisozima (Sigma, St. Louis, MO) durante 15 minutos a temperatura ambiente. En algunas modalidades, el lisado se purifica a través de sonicación, y los restos celulares se granulan a través de centrifugación durante 10 minutos a 12,000 X g. En algunas modalidades, el gránulo que contiene el polipéptido se vuelve a suspender en 50 mM de Tris, pH 8, y 10 mM de EDTA; se coloca en capas sobre 50% de glicerol; y se centrifuga durante 30 minutos a 6000 X g. En algunas modalidades, el gránulo puede volverse a suspender en solución salina regulada en pH con fosfato estándar (PBS) sin Mg++ y Ca++. En algunas modalidades, el polipéptido además se purifica fraccionando el gránulo resuspendido en una gel de poliacrilamida SDS desnaturalizante (ver, por ejemplo, Sambrook et al, supra) . En algunas modalidades, tal gel puede empaparse en 0.4 M de KC1 para visualizar la proteína, que puede extirparse y electrodiluirse en SDS sin regulador de pH corriendo en gel. De acuerdo con ciertas modalidades, se produce una proteína de fusión de glutationa-S-Transferasa (GST) en la bacteria como una proteína soluble. En algunas modalidades, tal proteína de fusión GST se purifica utilizando el Módulo de Purificación GST (Pharmacia) .

En algunas modalidades, se desea "plegar de nuevo" ciertos polipéptidos , por ejemplo los polipéptidos que comprenden una o más variantes PCSK9 neutralizantes. En algunas modalidades, tales polipéptidos se producen utilizando ciertos sistemas recombinantes descritos en la presente. En algunas modalidades, los polipéptido se "vuelven a plegar" y/u oxidar para formar estructuras terciarias deseadas y/o para generar enlaces de disulfuro. En algunas modalidades, tal estructura y/o enlaces se relacionan con cierta actividad biológica de un polipéptido. En algunas modalidades, el pliegue de nuevo se logra utilizando cualquiera de un número de procedimientos conocidos en la técnica. Los métodos ilustrativos, incluyen, pero no se limitan, a exposición del agente del polipéptido solubilizado a un pH típicamente por arriba de 7 en la presencia de un agente caotrópico. Un agente caotrópico ilustrativo es guanidina. En algunas modalidades, la solución de repliegue/oxidación también contiene un agente de reducción y la forma oxidada del agente de reducción. En algunas modalidades, el agente de reducción y su forma oxidada están presentes en una relación que generará un potencial redox particular que permite que ocurra la reorganización del disulfuro. En algunas modalidades, tal reorganización permite la formación de puentes de cisteína. Los acoplamientos de redox ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, cisteína/cisteína , glutationa/ditiobisGSH, cloruro cúprico, ditiotreitol DTT/ditian DTT, y 2 -mercaptoetanol (bME) /ditio-bME . En algunas modalidades, se utiliza un co-solvente para aumentar la eficiencia del re-pliegue. Los co-solventes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, glicerol, polietilenglicol de varios pesos moleculares y arginina .

En algunas modalidades, un polipéptido que comprende una o más variantes PCSK9 neutralizantes está sustancialmente purificado. Ciertas técnicas de purificación de proteínas son conocidas por el experto en la técnica. En algunas modalidades, la purificación de la proteína involucra el fraccionamiento en crudo de los fraccionamientos del polipéptido de fracciones no de polipéptido. En algunas modalidades, los polipéptido se purifican utilizando técnicas cromatográficas y/o electroforáticas . Los métodos de purificación ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, precipitación con sulfato de amonio; precipitación con PEG; inmunoprecipitación; desnaturalización con calor seguida por centrifugación; cromatografía, incluyendo, pero no a limitándose a, cromatografía por afinidad (por ejemplo, proteína-A-Sepharose) , cromatografía de intercambio de ión, cromatografía de exclusión, y cromatografía de fase inversa; filtración en gel; cromatografía en hidroxiapatita ; enfoque isoeléctrico; electroforesis en gel de poliacrilamida; y combinaciones de éstas y otras técnicas. En algunas modalidades, un polipéptido se purifica a través de cromatografía líquida de proteína rápida o a través de cromatografía líquida de alta presión (HPLC) . En algunas modalidades, los pasos de purificación pueden cambiarse o ciertos pasos pueden omitirse, y aún dar como resultado el método adecuado para la preparación de un polipéptido sustancialmente purificado.

En algunas modalidades, se cuantifica el grado de purificación de una preparación de polipéptido. Ciertos métodos para cuantificar el grado de purificación son conocidos por el experto en la técnica. Ciertos métodos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, determinación de la actividad de unión específica de la preparación y evaluar la cantidad de polipéptido dentro de la preparación a través de análisis SDS/PAGE. Ciertos métodos ilustrativos para evaluar la cantidad de purificación de una preparación de polipéptido comprenden calcular la actividad de unión de una preparación y compararla con la actividad de unión de un extracto inicial. En algunas modalidades, los resultados de tal cálculo se expresan como "veces de purificación" las unidades utilizadas para representar la cantidad de actividad de unión dependen de del ensayo particular realizado. En algunas modalidades, un polipéptido comprende una o más variantes PCSK9 neutralizantes que están parcialmente purificadas. En algunas modalidades, la purificación parcial puede lograrse a través del uso de menos pasos de purificación o a través del uso de diferentes formas del mismo esquema de purificación general, por ejemplo, en algunas modalidades, la cromatografía en columna de intercambio de catión se lleva a cabo utilizando un aparato HPLC que generalmente dará como resultado una "veces de purificación" mayor que la misma técnica utilizando un sistema cromatográf ico de baja presión. En algunas modalidades, los métodos dan como resultado un grado inferior de purificación que pueden tener ventajas en la recuperación total de polipéptido, o en el mantenimiento de la actividad de unión de un polipéptido.

En ciertos casos, la migración electroforética de un polipéptido puede variar, algunas veces significativamente, con diferentes condiciones de SDS/PAGE. Ver, por ejemplo, Capaldi et al, Biochem. Biophys. Res. Comm. , 76: 425 (1977). Se apreciará que bajo diferentes condiciones de electroforesis , los pesos moleculares aparentes del polipéptido purificado o parcialmente purificado pueden ser diferentes.

Ejemplos de Usos Terapéuticos y Composiciones Farmacéuticas En ciertos casos, la actividad de PCSK9 se correlaciona con un número de estados de enfermedad humanos, por ejemplo, en ciertos casos, demasiada o muy poca actividad PCSK9 se correlaciona con ciertas afecciones, tales como hipercolesterolemia . Por consiguiente, en ciertos casos, la modulación de la actividad de PCSK9 puede ser terapéuticamente útil.

En algunas modalidades, se utiliza una variante PCSK9 neutralizante para modular por lo menos la actividad de una PCSK9 nativa (por ejemplo, la unión de la PCSK9 nativa a LDLR) . Tales métodos pueden tratar y/o prevenir y/o reducir el riesgo de trastornos que se relacionan con niveles elevados de colesterol en suero o. en donde los niveles elevados de colesterol son relevantes.

Como se apreciará por un experto en la técnica, en luz de la presente descripción, los trastornos que se relacionan con, involucran., o pueden tener influencia a través de colesterol variable, LDL o niveles de LDLR puede tratarse a través varias modalidades de las variantes PCSK9 neutralizantes. Las variantes PCSK9 neutralizantes pueden utilizarse en una variedad de aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, en algunas modalidades, las variantes PCSK9 neutralizantes son útiles para tratar afecciones asociadas con PCSK9, tales como trastornos relacionados con el colesterol (o "trastornos relacionados con colesterol en el suero") tales como hipercolesterolemia , como se describe adicionalmente aquí. Algunas de las variantes PCSK9 neutralizantes descritas en la presente son útiles en el tratamiento de consecuencias, síntomas y/o la patología asociada con la actividad de PCSK9.

En algunas modalidades, un "trastorno relacionado con el colesterol" (incluye "trastornos relacionados con el colesterol en el suero") incluyen cualquiera de uno o más de los siguientes: hipercolesterolemia, enfermedad cardiaca, síndrome metabólico, diabetes, enfermedad cardiaca coronaria, infarto, enfermedades cardiovasculares, enfermedad de Alzheimer y generalmente dislipidemias , que pueden manifestarse, por ejemplo, por un elevado colesterol en el suero total, elevado LDL, elevados triglicéridos, VLDL elevado y/o HDL bajo. Algunos ejemplos no limitantes de dislipidemias primarias y secundarias que pueden tratarse utilizando una variante PCSK9 neutralizante, ya sea sola en combinación con uno o más de otros incluye síndrome metabólico, diabetes mellitus, hiperlipidemia combinada familiar, hipertrigliceridemia familiar, hipercolesterolemias familiares, incluyendo hipercolesterolemia heterocigoto, hipercolesterolemia de heterocigoto, apopliproteína B-100 defectuosa familiar; hipercolesterolemia poligénica; enfermedad de remoción residual, deficiencia de lipasa hepática; dislipidemia secundaria para cualquiera de los siguientes: indiscreción dietética, hipotiroidismo, fármacos incluyendo terapia con estrógeno y progestina, beta-bloqueadores y diuréticos de tiazida, síndrome nefrótico, falla renal crónica, síndrome de Cushing, cirrosis biliar primaria, enfermedades de almacenamiento de glucógeno, hepatoma, coléstasis, acromegalia, insulinoma, deficiencia de hormona de crecimiento aislada e hipertrigliceridemia inducida por alcohol. Las variantes PCSK9 neutralizantes también pueden ser útiles en la prevención o el tratamiento de enfermedades ateroescleróticas , tales como, por ejemplo, enfermedad cardiaca coronaria, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad de arteria periférica, infarto (isquémico y hemorrágico) , angina de pecho o enfermedad cerebrovascular y síndrome coronario agudo, infarto al miocardio. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante es útil en la reducción del riesgo de:, ataques cardiacos no fatales, infarto fatal y no fatal; ciertos tipos de cirugía de corazón, hospitalización para falla cardiaca, dolor de pecho en pacientes con enfermedades cardiacas, y/o eventos cardiovasculares debidos a una falla cardiaca establecida tal como antes del ataque cardiaco, cirugía antes del corazón y/o dolor de pecho con evidencia de arterias obstruidas. En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante de PCSK9 y los métodos pueden utilizarse para reducir el riesgo de eventos cardiovasculares recurrentes.

Como se apreciará por un experto en la técnica, las enfermedades y trastornos que son generalmente tratables (ya sea tratables o evitables) a través del uso de estatinas también pueden beneficiarse de la aplicación de las variantes PCSK9 neutralizantes instantáneas. Además, en algunas modalidades, los trastornos o enfermedades pueden beneficiarse de la prevención de síntesis de colesterol o expresión LDLR incrementada que también pueden tratarse a través a través de varias modalidades de las variantes PCSK9 neutralizantes. Además, como se apreciará por un experto en la técnica, el uso de variantes PCSK9 neutralizantes puede ser especialmente útil en el tratamiento de diabetes. No solamente es diabetes un factor de riesgo para enfermedad de cardiaca coronaria, sino que la insulina aumenta la expresión de PCSK9. Es decir, las personas con diabetes tienen niveles elevados de lípido en plasma (que pueden estar relacionados con altos niveles de PCSK9) y pueden beneficiarse de disminuir esos niveles o modular la actividad de esos niveles. Esto generalmente se explica con mayor detalle en Costet et al. ("Hepatic PCSK9 Expression is Regulated by Nutirtional Status via Insulin and Sterol Regulatiory Element-binding Protein 1C" , J. Biol . Chem. , 281:621 1-6218, 2006) , la totalidad de la cual se incorpora aquí por referencia.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes se administra a aquellos que tienen diabetes mellitus, aneurisma aórtica abdominal, ateroesclerosis y/o enfermedad vascular periférica con el fin de disminuir sus niveles de colesterol en suero a un intervalo más seguro. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se administra a pacientes en riesgo de desarrollar cualquiera de los trastornos descritos aquí. En algunas modalidades, las variantes PCSK9 neutralizantes se administran a sujetos que fuman, que tienen hipertensión o un historial familiar de ataques cardiacos tempranos .

En algunas modalidades, se administra a un sujeto una variante PCSK9 neutralizante si está en un riesgo moderado o mayor en los objetivos de tratamiento 2004 NCEP. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se administra a un sujeto si los niveles de colesterol LDL del sujeto son mayores de 160 mg/ml. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se administra si el nivel de colesterol de LDL del sujeto es mayor de 130 (y tienen un riesgo moderado o moderadamente alto de acuerdo con los objetivos de tratamiento 2004 NCEP) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se administra si el nivel del colesterol LDL del sujeto es mayor de 100 (y tienen un riesgo alto o muy alto de acuerdo con los objetivos de tratamiento 2004 NCEP) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes se administra si el nivel de colesterol LDL del sujeto no llega a un objetivo menor de 90, o tiene menos de 80, o tiene menos de 70 mg/ml . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se administra si el sujeto es intolerante o resistente a otros regímenes y medicamentos que modifican los lípidos.

Un médico puede ser capaz de seleccionar un tratamiento apropiado con base en las indicaciones y los niveles de lípido objetivos dependiendo del perfil individual de un paciente particular. Un estándar bien aceptado para guiar el tratamiento de hiperlipidemias es el Tercer Reporte del Panel de Expertos del Programa de Educación del Colesterol Nacional (NCEP) en el reporte final de detección, evaluación y tratamiento de alto colesterol en la sangre en adultos (Panel II del Tratamiento en Adultos) de los Institutos Nacionales de Salud, Publicación NIH No. 02-5215 (2002) , la publicación impresa de la cual se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

En algunas modalidades, las variantes PCSK9 neutralizantes para PCSK9 se utilizan para disminuir la cantidad de la actividad de PCSK9 (degradación de PCSK9) de un nivel anormalmente alto o aún un nivel normal . En algunas modalidades, las variantes PCSK9 neutralizantes para PCSK9 se utilizan para tratar o prevenir la hipercolesterolemia y/o en la preparación de medicamentos de los mismos y/o para otros trastornos relacionados con el colesterol (tales como los indicados en la presente). En algunas modalidades, se utiliza una variante PCSK9 neutralizante para tratar o prevenir afecciones tales como hipercolesterolemia en donde la actividad de PCSK9 es normal. En tales afecciones, por ejemplo, la reducción de la actividad de PCSK9 por debajo de lo normal puede proporcionar un efecto terapéutico.

En algunas modalidades, se utiliza más una variante PCSK9 neutralizante para modular la actividad de PCSK9.

En algunas modalidades, se proporcionan métodos para tratar un trastorno relacionado con el colesterol, tai como hipercolesterolemia que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una o más variantes PCSK9 neutralizantes y otro agente terapéutico.

En algunas modalidades, se administra una variante PCSK9 neutralizante sola. En algunas modalidades, se administra una variante PCSK9 neutralizante antes de la administración de por lo menos otro agente terapéutico. En algunas modalidades, se administra una variante PCSK9 neutralizante concurrentemente con la administración de por lo menos otro agente terapéutico. En otras modalidades, se administra una variante PCSK9 ' neutralizante posteriormente en la administración de por lo menos otro agente terapéutico. En otras modalidades, se administra una variante PCSK9 neutralizante antes de la administración de por lo menos otro agente terapéutico. Los agentes terapéuticos (aparte de la variante PCSK9 neutralizante) incluyen, pero no se limitan a, por lo menos otro agente para disminuir el colesterol (colesterol en el suero y/o total en cuerpo) o un agente. En algunas modalidades, el agente aumenta la expresión de LDLR, que ha sido observada que aumenta los niveles de HDL en el suero, disminuye los niveles de LDL en el suero, o disminuye los niveles de triglicéridos . Los agentes ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, estatinas (atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina) , ácido nicotínico (Niacina) (NIACOR, NIASPA (niacina de liberación lenta) , SLO-NIACIN (niacina de liberación lenta) ) , ácido Fíbrico (LOPID (Gemfibrozil) , TRICOR ( fenofibrato) , secuestrantes de ácido biliar (QUESTRA (colestiramina) , colesevelam (WELCHOL) , COLESTID (colestipol) ) , inhibidores de absorción de colesterol (ZETIA (ezetimibe) ) , combinación de ácido nicotínico con estatina (ADVICOR (LOVASTATIN y NIASPAN) , combinación de una estatina con un inhibidor de la absorción (VYTORIN (ZOCOR y ZETIA) y/o agentes modificadores de lípidos. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizantes se combina con agonistas PPAR gamma, agonistas PPAR alfa/gamma, inhibidores de escualeno sintasa, inhibidores de CETP, anti-hipertensivos , agentes anti- diabéticos tales como sulfinil ureas, insulina, análogos de GLP-1, inhibidores de DDPIV) , moduladores ApoB, inhibidores MTP y/o tratamientos que eliminan la ateroesclerosis . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se combina con un agente que aumenta el nivel de la proteína LDLR en un sujeto, tales como estatinas, ciertas citosinas, como la oncoestatina M, estrógeno, y/o ciertos ingredientes herbicidas tales como berberina. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se combinan con un agente que aumenta los niveles de colesterol en el suero en un sujeto (tales como ciertos agentes anti-psicóticos , ciertos inhibidores de proteasa VIH factores dietéticos tales como alta fructosa, sacarosa, colesterol o ciertos ácidos grasos o ciertos agonistas y antagonistas del receptor nuclear para RXR, RAR, LXR, FXR) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se combina con un agente que aumenta el nivel de PCS 9 en un sujeto, tales como estatinas y/o insulina. La combinación de dos puede permitir efectos secundarios indeseables de otros agentes a ser mitigados por la variante PCSK9 neutralizante. Como se apreciará por un experto en la técnica, en algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se combina con otro agente/compuesto. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante y otro agente se administran concurrentemente. En otras modalidades, la variante PCSK9 neutralizante y otro agente no se 1 administran simultáneamente, con la variante PCSK9 -neutralizantes que se administra o después de que se administra el agente. En algunas modalidades, el sujeto recibe tanto la variante PCSK9 neutralizantes como el otro agente (que aumenta el nivel de LDLR) durante un mismo periodo de prevención, aparición de un trastorno y/o periodo de tratamiento.

Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinados con otro agente. En algunas modalidades, la terapia . de combinación comprende la variante PCSK9 neutralizante, en combinación con por lo menos un agente anti -colesterol . Los agentes incluye, pero no se limitan a, composiciones químicas sintéticamente preparadas in Vitro, anticuerpos, regiones de unión a antígeno, y combinaciones y conjugados de los mismos. En algunas modalidades, un agente actuar como un agonista, antagonista, modulador alostérico, o toxina. En algunas modalidades, un agente puede actuar para inhibir o estimular su objetivo (por ejemplo, activación o inhibición de receptor o enzima) , y por lo tanto promover la expresión aumentada LDLR o disminuir los niveles de colesterol en el suero.

En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante puede administrarse antes, concurrentemente con y posteriormente al tratamiento con un agente que disminuye el colesterol (colesterol en el suero y/o total) . En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante puede administrarse profilácticamente para evitar o mitigar el inicio y la hipercolesterolemia , enfermedad cardiaca, diabetes y/o cualquiera de los trastornos relacionados con el colesterol. En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante puede administrarse para el tratamiento de una afección de hipercolesterolemia existente. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante retrasa el inicio del trastorno y/o síntomas asociados con el trastorno. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se proporciona a un sujeto que carece de cualquiera de los síntomas de cualquiera de los trastornos relacionados con el colesterol o un subgrupo de los mismos.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se utiliza con agentes terapéuticos particulares para tratar varios trastornos relacionados con el colesterol, tales como hipercolesterolemia. En algunas modalidades, en vista de la afección y el nivel deseado de tratamiento, se pueden administrar 2, 3 ó 4 agentes. En algunas modalidades, tales agentes pueden ser provistos juntos a través de la inclusión en la misma formulación. En algunas modalidades, tal agente (s) y una variante PCSK9 neutralizante pueden proveerse juntas mediante la inclusión en la misma formulación. En algunas modalidades, tales agentes pueden formularse en manera separada y proporcionarse junto a través de la inclusión en kit de tratamiento. En algunas modalidades, tales agentes y la variante PCSK9 neutralizante pueden formularse de manera separada y proporcionarse juntos a través de la inclusión en un kit de tratamiento. En algunas modalidades, tales agentes pueden ser provistos de manera separada. En algunas modalidades, cuando se administra a través de terapia de gen, los genes que codifican los agentes de proteína y/o la variante PCSK9 neutralizante pueden incluirse en el vector. En algunas modalidades, los genes que codifican los agentes de proteína y/o la variante PCSK9 neutralizante estar bajo el control de la misma región promotora. En algunas modalidades, los genes que codifican los agentes de proteína y/o una variante PCSK9 neutralizante puede estar en vectores separados.

En algunas modalidades, una composición farmacéutica que comprende una variante PCSK9 neutralizante se combina con un diluyente, portador, solubilizante , emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable .

En algunas modalidades, una composición farmacéutica que comprende una variante PCSK9 neutralizante y una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un agente terapéutico adicional se combinan junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante puede utilizarse con por lo menos un agente terapéutico para inflamación. En algunas modalidades,.... una variante PCSK9 neutralizante puede utilizarse con por lo menos un agente terapéutico para un trastorno inmunitario. Los agentes terapéuticos ilustrativos para inflamación y trastornos inmunitarios incluye, pero no se limitan a, moduladores de molécula pequeña, inhibidores de ciclooxigenasa de tipo 1 (COX-1) y ciclooxigenasa de tipo 2 (COX-2) de proteína cinasa activada con mitógeno de 38 kDa (p38-MAPK) ; moduladores de molécula pequeña de moléculas intracelulares involucradas en la trayectoria de inflamación, en donde las moléculas intracelulares incluye, pero no se limitan a, jnk, IKK, NF-??, ZAP70, y lck. Ciertos agentes terapéuticos ilustrativos para inflamación se describen en CA. Dinarello & L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians 3a Edición (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas incluirán más de una variante (s) de PCSK9 neutralizante diferente. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas incluirán más de una variante PCSK9 neutralizante en donde las variantes PCSK9 neutralizantes se unen a más un epítopo. En algunas modalidades, las varias variantes PCSK9 neutralizantes no competirán entre sí para la unión a PCSK9.

En algunas modalidades, los materiales de formulación aceptables preferiblemente son no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones utilizadas. En algunas modalidades, el material (s) de la formulación es para administración s.c y/o I.V. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el dolor, la esterilidad, la estabilidad, el grado de disolución o liberación, la adsorción o penetración de la composición. En algunas modalidades, los materiales formulación adecuados incluyen, pero no limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina) ; antimicrobianos; antioxidantes (tal como ácido ascórbico, sulfito de sodio o sulfito ácido de sodio) ; reguladores de pH (tal como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) , agentes de volumen (tales como manitol o glicina) ; agentes quelatadores (tal como ácido etilenodiamina tetracético (EDTA) ) ; agentes formadores de complejos (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropilo, beta-ciclodextrina) ; llenadores; monosacáridos ; disacáridos; y otros carbohidratos (tales como glucosa, mañosa o dextrina) ; proteínas (tal como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina) ; agentes colorantes, saborizantes y de dilución); agentes emulsionantes; polímeros hidrófilos (tal como polivinilpirrolidona ; polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tal como sodio) ; conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno , propilparabeno , clorhexidina, ácido sórbico o peróxido ácido) ; solventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol) ; alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol) ; agentes de suspensión; agentes tensioactivos o humectantes (tales como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, tritón, tromatamina, lecitina, colesterol y tiloxapal) ; agentes mejoradores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol) ; agentes mejoradores de la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino, preferiblemente cloruro sodio o potasio, manito, sorbitol); vehículos para la distribución; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, A. R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company (1995) .

Como se observó anteriormente, en algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante y/o una molécula terapéutica se enlazan a un vehículo que extiende la vida media conocida en la técnica. Tales vehículos incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol , glicógeno (por ejemplo, en la glicosilación de la variante PCSK9 neutralizantes y dextrina, tales vehículos se describen en, por ejemplo, la Solicitud de Patente de E. U. A. No. de Serie 09/428,082, ahora Patente de E. U. A. No. 6,660,843 y Solicitud PCT publicada No. WO 99/25044, que se incorporan aquí por referencia para cualquier propósito.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica óptica puede determinarse a un experto en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la ruta de administración prevista, el formato de distribución y la dosis deseada. Ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. En algunas modalidades, tales composiciones pueden influenciar el estado físico, el estado físico, la estabilidad, el grado de liberación in vivo y el grado de purificación in vivo de las variantes de PCSK9.

En algunas modalidades, el vehículo portador primario en una composición farmacéutica puede ser ya sea acuoso o no acuoso en naturaleza. Por ejemplo, en algunas modalidades, un vehículo portador adecuado puede ser agua para inyección, solución de salina fisiológica o fluido cerebroespinal artificial posiblemente complementado con otros materiales comunes en las composiciones para administración parenteral . En algunas modalidades, la salina comprende salina regulada en pH con fosfato isotónica. En algunas modalidades, la salina regula en pH neutral o la salina mixta con albúmina de suero son vehículos ilustrativos adicionales. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden regulador de pH Tris de aproximadamente pH 7.0-8.5, o regulador de pH de acetato de aproximadamente pH 4.0-5.5, que además pueden incluir sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En algunas modalidades, una composición comprende una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional, y pueden prepararse para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) en la forma de una torta liofilizada o una solución acuosa. Además, en algunas modalidades, una composición que comprende una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional, puede , formularse como un liofilizado utilizando excipientes apropiados tales como sacarosa.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede seleccionarse para distribución parenteral . En algunas modalidades, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para distribución a través del tracto digestivo, tal como oralmente. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la habilidad de un experto en la técnica.

En algunas modalidades, los componentes de la formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En algunas modalidades, se utilizan reguladores de pH para mantener la composición a un pH fisiológico, o ligeramente un pH inferior, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.

En algunas modalidades, cuando se contempla la administración parenteral una composición terapéutica puede estar en la forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable sin pirógeno que comprende una variante PCSK9 neutralizante deseada, con o sin agentes terapéuticos adicionales, en vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, un vehículo para inyección parenteral se esteriliza en agua destilada en donde la variante PCSK9 neutralizante, con o sin agente terapéutico adicional, se formula como una solución isotónica, estéril apropiadamente conservada. En algunas modalidades, la preparación puede involucrar la formulación de la molécula deseada con un agente, tales como micro-esferas inyectables, partículas bio-erosionables , compuestos polímeros (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación controlada o sostenida del producto que después puede distribuirse a través de una inyección de depósito. En algunas modalidades, también puede utilizarse ácido hialurónico, y puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. En algunas modalidades, los dispositivos de distribución de fármacos implantables pueden utilizarse para introducir la molécula deseada.

En algunas modalidades, una composición farmacéutica puede formularse para inhalación. En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional puede formularse como un polvo seco para inhalación. En algunas modalidades, la solución de inhalación comprende una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional, que puede formularse con propulsor para la distribución en aerosol. En algunas modalidades, las soluciones pueden neubilizarse . La administración pulmonar además se describe en la solicitud PCT No. PCTUS94/001875 , que describe la distribución pulmonar de proteínas químicamente modificadas.

En algunas modalidades, se contempla que las formulaciones pueden administrarse oralmente. En algunas modalidades, una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional, que se administrarse en esta forma puede formularse con o sin esos portadores comúnmente utilizados en la formación de compuestos de formas de dosificación sólida tales como tabletas y cápsulas. En algunas modalidades, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación pre-sistémica se minimiza. En algunas modalidades, por lo menos un agente adicional puede incluirse para facilitar la absorción de la variante PCSK9 neutralizante y/o cualquier agente terapéutico adicional. En algunas modalidades, también pueden utilizarse agentes diluyentes, saborizantes , ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales lubricantes, agentes de suspensión, agentes discrepantes de tabletas y aglutinantes.

En algunas modalidades, una composición farmacéutica pude involucrar una cantidad efectiva de una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional en una mezcla con excipientes no tóxicos son adecuados para la fabricación de tabletas. En algunas modalidades, a través de la disolución de las tabletas en agua estéril,, u otro vehículo apropiado, las soluciones pueden prepararse en una forma de dosis unitaria. En algunas modalidades, los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio y bicarbonato, lactosa, o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes tales como almidón, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.

Las composiciones farmacéuticas adicionales serán evidentes para el experto en la técnica, incluyendo formulaciones que involucran variantes PCSK9 neutralizantes, con o sin por lo menos otro agente (s) terapéutico adicional, en formulaciones de distribución sostenida o controlada. En algunas modalidades, las técnicas para formular una variedad de otros medios de distribución sostenidos o controlados, tales como portadores de liposoma, micropartículas bio-erosionables o perlas porosas e inyecciones depósito, también se conocen por el experto en la técnica, ver, por ejemplo, la solicitud PCT No. PCT/US93/00829 que describe la liberación controlada de micropartículas poliméricas porosas para la distribución de composiciones farmacéuticas. En algunas modalidades, las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en la forma de artículos moldeados, por ejemplo películas o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (U.S. 3,773,919 y EP 058,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil L-glutamato (Sidman et al, Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato etileno vinilo (Langer et al, supra) o ácido poli -D ( - ) -3 -hidroxibutírico (EP 133,988). En algunas modalidades, las composiciones de liberación sostenida pueden también incluir liposomas que pueden prepararse a través de los varios métodos conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Eppstein et al, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 y EP 143,949.

Las composiciones farmacéuticas a ser utilizadas para administración in vivo típicamente son estériles. En algunas modalidades, esto puede lograrse a través de membranas de filtración estériles. En algunas modalidades, cuando la composición se liofiliza, la esterilización utilizando este método puede conducirse ya sea antes de o después de la liofilización y la reconstitución. En algunas modalidades, la composición para administración parenteral puede almacenarse en una forma liofilizada o en solución. En algunas modalidades, las composiciones parenteralmente generalmente se colocan en un contenedor que tiene un cuerpo de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o recipiente que tiene un obturador perforable a través de una aguja de inyección hipodérmica. En algunas modalidades, la composición farmacéutica es estéril.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprenderá por lo menos una cantidad suficiente de la variante PCSK9 neutralizante para reducir una cantidad de unión de la PCSK9 nativa en un humano, in vivo. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprenderá por lo menos una cantidad suficiente de la variante PCSK9 neutralizante para reducir un síntoma de un "trastorno relacionado con el colesterol" (que incluye "trastornos relacionados con el colesterol en el suero"). En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprenderá por lo menos una cantidad suficiente de la variante PCSK9 neutralizante para modular por lo menos la actividad de una PCSK9 nativa (por ejemplo, la unión de PCSK9 nativa a LDLR) .

En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende por lo menos una cantidad de una variante PCSK9 neutralizante suficiente para tratar cualquiera o más de los trastornos relacionados con el colesterol descrito en la presente. En algunas modalidades, la composición farmacéutica comprende por lo menos una cantidad de una variante PCSK9 neutralizante suficiente para tratar un síntoma de un trastorno relacionado con el colesterol de un adulto hombre y/o mujer. En algunas modalidades, la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante es al menos suficiente para tratar (por ejemplo reducir un síntoma de) un adulto hombre con un peso entre 10 y 250 kg. En algunas modalidades, la cantidad es al menos suficiente para tratar 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, o 200 kg del sujeto para así disminuir un síntoma de por lo menos cualquiera de los trastornos relacionados con el colesterol, para elevar el nivel de LDLR en el sujeto, o para disminuir el nivel de LDL en el sujeto. En algunas modalidades, la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante presente en la composición farmacéutica es al menos suficiente para elevar el nivel de LDLR en un sujeto en alguna cantidad detectable. En algunas modalidades, el nivel de LDLR en un sujeto se eleva en al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%. En algunas modalidades, el nivel de LDLR en un sujeto se aumenta en por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 veces sobre un sujeto saludable sin tratar y/o sobre un sujeto sin tratar que tiene un trastorno relacionado con el colesterol. En aún otras modalidades, la variante PCSK9 neutralizante es suficiente para mantener el nivel de LDLR en un sujeto a un nivel deseado. El nivel apropiado puede determinarse a través del proveedor del cuidado de la salud del sujeto y puede tomar en cuenta aspectos particulares de la condición física del sujeto y aspectos y preocupación de salud.

En algunas modalidades, la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante presente en la composición farmacéutica es al menos suficiente para bloquear una cantidad significativa de la actividad de la PCSK9 nativa in vivo. En algunas modalidades, la cantidad es suficiente para bloquear por lo menos 1% de la actividad de la PCSK9 nativa, por ejemplo, al menos 1, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, 99-100% de la PCSK9 nativa se bloquea por la cantidad PCSK9 presente en la composición farmacéutica.

En algunas modalidades, la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante presente en la composición farmacéutica es al menos suficiente para disminuir el LDL en el suero en un sujeto. En algunas modalidades, la cantidad es suficiente para disminuir la cantidad de LDL en el suero en un sujeto en al menos 1% del nivel nativo de LDL en el suero, por ejemplo al menos 1, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-98, 98-99, 99-100% del nivel de LDL en el suero para el sujeto, para un sujeto que tiene un trastorno relacionado con el colesterol o un sujeto sano.

En algunas modalidades, la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante presente en la composición farmacéutica es una cantidad significativa. En algunas modalidades, la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante presente en una dosis farmacéutica a ser dada a un sujeto es al menos 1 ng, por ejemplo, la cantidad es al menos 1, 10, 20, 50, 100, 500, 1000, 10,000, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, u 1011 nanogramos, incluyendo cualquier cantidad definida entre cualquiera de dos de los números previos y cualquier cantidad por arriba de cualquiera de los números previos. En algunas modalidades, la cantidad está en una sola pildora. En algunas modalidades, la cantidad está en múltiples pildoras. En algunas modalidades, la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante administrada es de aproximadamente 1 a 500 mg, 50 a 400 mg, o 100 a 300 mg .

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante se incluye en una forma sólida, tal como una tableta o pildora.

En algunas modalidades, la cantidad de variante PCSK9 neutralizante es una dosis suficiente para lograr cualquiera de los objetivos descritos en la presente (o cantidad de) durante al menos 1 hora. En algunas modalidades, la cantidad es suficiente para tratar un trastorno relacionado con el colesterol durante al menos 1 hora, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas. En algunas modalidades, la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante que está presente es suficiente para lograr cualquiera de los objetivos aquí descritos durante al menos 1 día. De esta forma, en algunas modalidades, la dosis es una cantidad de una vez al día.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante es relativamente pura. En algunas modalidades, aparte del portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y la variante PCSK9 neutralizante, nada más está presente en la composición. En algunas modalidades, un compuesto que comprende una variante PCSK9 neutralizante es al menos 0.01% de una variante PCSK9 neutralizante (en peso) . En algunas modalidades, por lo menos 1X10"8, 1X10"7, 1X10"6, 1X10"5, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 99, o 100% del compuesto es una variante PCSK9 neutralizante. En algunas modalidades, el porcentaje está en un intervalo definido entre cualquiera de dos de los porcentajes previos.

Como se apreciará por un experto en la técnica, cualquiera de los parámetros anteriores que describen la cantidad de la variante PCSK9 neutralizante presente puede combinarse con cualquiera de los otros parámetros. Por ejemplo, cualquiera de los parámetros con respecto al porcentaje de PCSK9 nativa bloqueada in vivo puede combinarse para cualquiera de los pesos específicos suministrados por los sujetos.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye ingredientes que son dañinos para un sujeto.

En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 50 mM de fosfato de sodio y/o 50 mM de cloruro de sodio. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye fosfato de sodio y/o cloruro de sodio. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no contiene lisados celulares. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no contiene un medio celular. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye BS3 (bis [sulfosuccinimidil] suberato) . En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye formiato de potasio. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye PEG 3350. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 0.2 M de formiato potásico. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 20% de PEG 3350. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 50 mM de Tris. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 4 mM de EDTA. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 0.01-2% de Tritón X-100. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 0.5 de desoxicolato sódico. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 0.1-2% de dodecil sulfato de sodio. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 10-20% de glicerol. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 1M de NDSB . En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye 1-20 mM de cloruro de calcio. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye KH2P04/NaOH. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye ácido cítrico y fosfato de sodio En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye Na2HP04 y NaOH. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye la combinación de dos o más de los ingredientes anteriores. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye la combinación tres o más de los ingredientes anteriores. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye la combinación de cuatros o más de los ingredientes anteriores. En algunas modalidades, la composición farmacéutica no incluye uno más de los ingredientes anteriores.

En algunas modalidades, la variante PCSK9 neutralizante no se crea en E. coli. En algunas modalidades, cualquiera de las variantes PCSK9 neutralizantes descritas en la presente es una proteína auto-procesada o auto-dividida. En algunas modalidades, cualquiera de las variantes PCSK9 neutralizantes descritas en la presente es una proteína procesada o dividida.

En algunas modalidades, una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, puede almacenarse en recipientes estériles como una solución, suspensión, gel, emisión, sólido o como un polvo deshidratado o liofilizado. En algunas modalidades, tales formulaciones pueden almacenarse ya sea en una forma lista para utilizarse o en una forma (por ejemplo, liofilizada que se reconstituye antes de la administración.

En algunas modalidades, se proporciona kits para producir una unidad de administración de una sola dosis, en algunas modalidades, el kit puede contener tanto un primer contenedor que tiene una proteína seca y un segundo contenedor que tiene una formulación acuosa. En algunas modalidades, los kits contienen jeringas pre- llenadas individuales o de multicámara (por ejemplo, jeringas líquidas y lisoj eringas) se incluyen.

En algunas modalidades, la cantidad efectiva de una composición farmacéutica comprende una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional, a ser utilizado terapéuticamente que dependerá, por ejemplo, del contexto terapéutico y los objetivos. Un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosis apropiados para el tratamiento, de acuerdo con ciertas modalidades, de esta forma variarán en parte, dependiendo de la molécula suministrada,, la indicación para la cual una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional, se está utilizando, la ruta de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y/o afección (la edad y la salud general) del paciente. En algunas modalidades, un médico puede determinar la cantidad de dosis y modificar la ruta de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. El algunas modalidades, una dosis típica está en el intervalo de aproximadamente 0.1 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En algunas modalidades, la dosis puede estar en el intervalo de 0.1 g/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 1 ug/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg.

En algunas modalidades, la frecuencia de la dosificación tomará en cuenta los parámetros farmacocinéticos de una variante PCSK9 neutralizante y/o cualquier agente terapéutico adicional en la formulación utilizada. En algunas modalidades, un médico administrará la composición hasta que llegue a una dosis que logre el efecto deseado. En algunas modalidades, la composición por consiguiente puede administrar con una dosis individual, como dos o más dosis (que pueden o no pueden contener la misma cantidad de la molécula deseada) con el tiempo, o como una infusión continua a través de un dispositivo de implante o catéter. El refinamiento adicional de la dosis apropiada se hace rutinariamente por el experto en la técnica y está dentro del ambiente de las tareas rutinariamente realizadas por ellos. En algunas modalidades, las dosis apropiadas pueden evaluarse a través del uso de los datos de dosis-respuesta apropiadas. En algunas modalidades, la cantidad de la frecuencia de administración pueden tomar en cuenta el "nivel de colesterol deseado (suero y/o total) a ser obtenido y el nivel de colesterol presente en el sujeto, el nivel LDL y/o los niveles LDLR, todos los cuales pueden obtenerse a través de los métodos bien conocidos por el experto en la técnica.

En algunas modalidades, la ruta de administración de la composición farmacéutica está de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, oralmente, a través de inyección mediante administración intravenosa, intraperitoneal , intracerebral ( intra-parénquima) , intracerebroventricular, intramuscular, subcutánea, intra-ocular, intraarterial , intraportal, o intralesional ; a través de sistemas de liberación sostenida o dispositivos de implante. En algunas modalidades, las composiciones pueden administrarse mediante inyección de bolo¦ o continuamente a través de infusión o a través de un dispositivo de implante. En algunas modalidades, la composición se configura para administración a través de cualquiera de estas rutas .

En algunas modalidades, la composición puede administrarse localmente a través de un implante de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el cual la molécula deseada ha sido absorbida o encapsulada . En algunas modalidades, cuando se utiliza un dispositivo de implante, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u órgano adecuado, y distribuir la molécula deseada a través de infusión, bolo de liberación cronometrado o administración continua .

En algunas modalidades, puede ser deseable utilizar una composición farmacéutica que contiene una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional, en una forma ex vivo. En tales casos las células, tejidos y/u órganos que han sido removidos del paciente se exponen a una composición farmacéutica que comprende una variante PCSK9 neutralizante, con o sin por lo menos un agente terapéutico adicional, después de lo cual las células, tejidos y/u órganos posteriormente se implantan de regreso en el paciente.

En algunas .modalidades, una variante PCSK9 neutralizante y/o cualquier agente terapéutico adicional puede distribuirse a través el implante de ciertas células que han sido genéticamente modificadas, utilizado métodos como aquellos descritos en la presente, para expresar y secretar los polipéptidos . En algunas modalidades, tales células pueden ser células de animal o de humano, y pueden análogas, heterólogas, o xenogeneicas . En algunas modalidades, las células pueden ser inmortalizadas. En algunas modalidades, con el fin de disminuir el riesgo de una respuesta inmunológica, las células pueden encapsularse para evitar la infiltración en tejidos circundantes. En algunas modalidades, los materiales de encapsulación son típicamente recintos poliméricos semi-permeables biocompatibles o membranas que permiten la liberación del producto (s) de la proteína pero evitan la destrucción de las células a través del sistema inmunitario del paciente o través de otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Con base en la habilidad de la variante PCSK9 neutralizante para significativamente neutralizar la actividad de PCSK9 (como se demuestra en los siguientes ejemplos) estas variantes PCSK9 neutralizantes tendrán efectos terapéuticos en el tratamiento y prevención de los síntomas y afecciones que resultan de la afinidad mediada. por PCSK9, tal como hipercolesterolemia .

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y los resultados obtenidos, son provistos para propósitos ilustrativos solamente y no se construyen como limitantes de la presente invención...

EJEMPLO 1 Demostración de la unión de la variante PCSK9 neutralizante receptor LDL - ensayo de competencia LDLR Este ejemplo está dirigido a la habilidad de una variante PCSK9 neutralizante para competir con PCSK9 de longitud completa en la unión a LDLR.

Se cubrieron placas de 96 cavidades, transparentes (Nunc) durante la noche con 2 microgramos/ml de anticuerpo LDL anti-receptor de cabra (R&D Systems) diluido en regulador de pH A (100 mM de cacolidato de sodio, pH 7.4) . Las placas se lavaron a fondo con regulador de pH A y después se bloquearon por 2 horas con regulador de pH B (1% de leche en regulador de pH A) . Después del lavado, las placas se incubaron por 5 horas con 2.0 ug/ml de receptor LDL (R&D Systems) diluido en regulador de pH C (regulador de pH B suplementado con 10 mM de CaCl2) . Concurrente con esta incubación, 100 ng/ml de PCSK9 humano de tipo silvestre bioteñido (hPCSK9), diluido en regulador de pH C, se incubaron con varias concentraciones de proteínas competidoras no bioteñidas (por ejemplo 31-447 de PCSK9 (SEC ID NO: 3), PCSK9 de longitud completa, y el dominio V de PCSK9, residuos 450-692) también diluidos en regulador de pH C, o regulador de pH C solo (control) . Las placas conteniendo el LDL del receptor se lavaron. La mezcla de PCSK9 bioteñido/proteína competidora se transfirió a las placas se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La unión de PCSK9 bioteñido al LDL del receptor se detectó mediante la incubación con estreptavidina-HRP (Biosource) a 500 ng/ml en regulador de pH C seguido por el sustrato TMB (KPL) . Se midió la absorbencia a 650 nm.

Los resultados se presentan en la FIG. 2. Ambas, la variante . PCSK9 neutralizante (aminoácidos 31-447 de SEC ID NO: 3) , y la PCSK9 de longitud completa (fl PCSK9) , compitieron contra PCSK9 de longitud completa marcada con biotina para la unión a LDLR inmovilizado. La proteína del dominio V no lo hizo. Estos datos demuestran que no son requeridos más que los aminoácidos 31-447 (de SEC ID NO: 3) para la unión a LDLR.

EJEMPLO 2 Efecto de una variante PCSK9 neutralizante en la absorción de LDL en la célula El ejemplo está dirigido a la habilidad de una variante PCSK9 neutralizante para tener impacto en la absorción de LDL. Se sembraron células HepG2 en placas de 96 cavidades (Costar) a una concentración de 5xl05 células por cavidad en medio DMEM (Mediatech, Inc) suplementado con 10% de suero de bovino fetal (FBS) y se incubaron durante la noche a 37°C (5% de C02 ) . El día siguiente, las células se lavaron dos veces con PBS . Se hizo una dilución de 1:2 serial de PCSK9 de tipo silvestre o la variante PCSK9 neutralizante (31-447 de SEC ID NO: 3), en el intervalo de 1.6 ug/ml a 50 ug/ml, y después se agregó a las células. Después de la adición de 6 ug/ml de BODIPY-LDL (Invitrogen) e incubación por 3 horas a 37°C (5% de C02) , las células se lavaron a fondo con PBS. Finalmente, la señal fluorescente asociada con las células se detectó por Safire (TECAN) a 480-520 nm (excitación) y 520~600nm (emisión) .

Los resultados se presentan en las FIGs . 3A y 3B que representan el diseño realizado en diferentes fechas. Como se puede observar en las figuras, PCSK9 de longitud completa (teniendo una etiqueta de purificación de histidina H8) bloqueó la absorción del LDL marcado en las células cultivadas como se demuestra por la disminución en la fluorescencia de las células con un aumento en los niveles PCSK9 adicionado al medio del cultivo. En contraste, la variante PCSK9 neutralizante permitió que las células absorbieran LDL.

EJEMPLO 3 Análisis Western Blot de los Efectos Celulares de una PCSK9 Neutralizante Este ejemplo está dirigido a los efectos celulares de la presencia de una variante PCSK9 neutralizante.

Las células HepG2 en placas de 6 cavidades se cultivaron a una confluencia a 37°C en medio DMEM con 10% de suero de bovino fetal, (FBS) . Algunas células se pre-trataron por 30 minutes con 100 uM de cloroquina para inhibir la acidificación de endosomas. Las células después se trataron con cualquier vehículo (PBS, menos de 50 ul) , PCSK9 de longitud completa (50 ug/ml, 0.65 uM) , o variante PCSK9 neutralizante (31-447 de SEC ID NO: 3) (30 microgramos/ml , 0.65 uM) en 750 ul de DMEM con 1% de FBS por 4 horas a 37°C. Las células se lavaron tres veces con PBS y se preparó el lisado celular completo utilizando regulador de pH de lisis (125 mM de Tris, 2 mM de CaCl2, 1% tritón X-100, pH 8.5). Se resolvieron 50 ug de proteína de sobrenadante celular por SDS PAGE y se determinaron los niveles de LDLR utilizando anticuerpo policlonal LDLR anti-humano de conejo (RDI-PRO61099, Fitzgerald Industries International Inc.). El PCSK9 recombinante asociado con las células se detectó por el anticuerpo monoclonal PCSK9 anti-humano que detecta de prodominio de PCSK9 de -14 kDa. Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) y ECL (GE Healthcare) se utilizaron para la detectar la señal. (Veh=vehículo (PBS) , FL = longitud completa, PC9=PCSK9) .

Los resultados se muestran en la FIG. 4. Como se puede ver en la figura, la variante PCSK9 neutralizante (31-447 de SEC ID NO: 3) se asoció con las células pero no causó la degradación de LDLR, a diferencia de PCSK9 de longitud completa.

Como se apreciará por un experto en la técnica, los datos de los Ejemplos anteriores indican que mientras una variante PCSK9 neutralizante (por ejemplo, 31-447 de SEC ID NO: 3) se puede unir a LDLR no evita la unión a LDL y la absorción de LDL por las células y no causa la degradación de LDLR. Además, la variante PCSK9 neutralizante (31-447 de SEC ID NO: 3) permite el reciclaje de LDLR, conservando la función normal de LDLR.

Dados los resultados presentes, es evidente que las variantes PCSK9 neutralizantes se pueden unir a LDLR en la superficie celular evitando la interacción de PCSK9 de longitud completa (tipo silvestre) con LDLR. Debido a que la variante PCSK9 neutralizante conserva la función LDLR normal actúa como un terapéutico que protege al LDLR de los efectos de PCSK9 de longitud completa endógena.

EJEMPLO 4 Usos de una Variante PCSK9 Neutralizando para el Tratamiento de Trastornos Relacionados con Colesterol Se administra a un paciente humano que exhibe un Trastorno Relacionado con Colesterol (en donde una reducción en el colesterol (tal como colesterol en suero) puede ser benéfica) una cantidad terapéuticamente efectiva de una variante PCSK9 neutralizante. A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente se monitoreó para determinar si había aminorado un síntoma del trastorno. Después del tratamiento, se encontró que los pacientes que experimentaron el tratamiento con la variante PCSK9 neutralizante tuvieron niveles reducidos de colesterol en suero, en comparación con pacientes que no se trataron.

EJEMPLO 5 Usos de la Variante PCSK9 Neutralizante para el Tratamiento de Hipercolesterolemia Se administró a un paciente humano que exhibe síntomas de hipercolesterolemia una cantidad terapéuticamente efectiva de una variante PCS 9 neutralizante. A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente humano se monitoreó para determinar si el nivel de colesterol en suero 1 (ya sea como, colesterol total o más específicamente colesterol LDL) había descendido. Después del tratamiento, se encontró que el paciente que recibió tratamiento con una variante PCSK9 neutralizando tuvo niveles reducidos de colesterol en suero en comparación con los pacientes con artritis que no recibieron el tratamiento.

EJEMPLO 6 Usos de la Variante . PCSK9 Neutralizante para la Prevención de Enfermedad Cardiaca Coronaria y/o Eventos Cardiovasculares Recurrentes Se identificó un paciente humano en riesgo de desarrollar enfermedad cardiaca coronaria. Se administró al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una variante PCSK9 neutralizante, ya sea sola, concurrente o secuencialmente con con una estatina, por ejemplo, simvastatina . A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente humano se monitoreó para determinar si cambia el nivel de colesterol en suero total del paciente. A lo largo del tratamiento preventivo, se encontró que el paciente que recibe el tratamiento con la variante PCSK9 neutralizante tiene un colesterol en suero reducido por lo tanto reduciendo su riesgo de enfermedad cardiaca coronaria o eventos cardiovasculares . recurrentes en comparación con los pacientes que no reciben tratamiento.

EJEMPLO 7 Uso de una Variante PCSK9 Neutralizante para la Prevención de Hipercolesterolemia Se identificó un paciente humano que exhibe un riesgo de desarrollar hipercolesterolemia a través de análisis del historial familiar y/o estilo de vida, y/o niveles de colesterol actuales. Se administró al sujeto regularmente (por ejemplo, una vez semanalmente) una cantidad terapéuticamente efectiva de una variante PCSK9 neutralizante. A tiempos periódicos durante el tratamiento, el paciente se monitoreó para determinar si los niveles de colesterol en suero habían disminuido. Después del tratamiento, se encontró que los sujetos que experimentaron tratamiento preventivo con una variante PCSK9 neutralizante tuvieron niveles disminuidos de colesterol en suero, en comparación con sujetos no se trataron.

EJEMPLO 8 Modelo de Ratón para PCSK9 El presente ejemplo describe cómo generar un modelo de ratón para ensayar varias variantes PCSK9 neutralizantes. Para generar ratones que sobre-expresen PCS 9 humano, se inyectaron 6 ratones TS C57B1 de tres semanas de edad mediante administración en la vena de la cola con varias concentraciones de virus adeno-asociado virus (AAV) , recombinantemente modificado para expresar PCSK9 humano, para determinar la concentración correcta que proporcionaría un aumento miscible de colesterol LDL en los ratones. Utilizando este virus particular que expresa PCSK9 humano, se determinó que 4.5 x 1012 pfu de virus daría como resultado un nivel de LDL-colesterol en de aproximadamente 40 mg/dL en la sangre circulante (los niveles normales de LDL en un ratón de TS son aproximadamente 10 mg/dL) . Los niveles de PCSK9 humano en estos animales se encontró como siendo de aproximadamente 13 ug/mol. Se generó una colonia de ratones utilizando este criterio de inyección.

Una semana después de la inyección, los ratones se evaluaron para niveles dé control de LDL-colesterol .

EJEMPLO 9 Los ratones del Ejemplo 8 pueden utilizarse para ensayar varias variantes PCSK9 neutralizantes para determinar que tan efectivas son y que variantes funcionan in vivo.

Una variante PCSK9 neutralizante puede administrarse, a través de inyección en la vena de la cola, en una sola inyección de bolo, o por sobre-expresión inducida por AAV. Los sub-grupos de animales (n=6-7) después pueden sacrificarse a las 24 y 48 horas después de la administración de la variante PCSK9 neutralizante. Los niveles LDL después pueden examinarse y opcionalmente compararse con varios controles (por ejemplo, PCSK9 de tipo silvestre, una inyección de agua o proteína no relacionada, y el dominio pro/cat) . Las variantes PCSK9 completas que dan como resultados niveles LDL en suero más bajos en los ratones serán las variantes que pueden ser efectivas para, disminuir los niveles de LDL en suero.

EJEMPLO 10 El dominio EGFa de LDLR se une al Dominio Catalítico de PCSK9 El presente ejemplo presenta la estructura de cristal resuelta de PCSK9 Pro/Cat (31-454) unido al dominio EFGa de LDLR (293-334) a una resolución de 2.9 A (las condiciones de la cual se describen en los siguientes ejemplos) .

Una representación de la estructura de la unión de PCSK9 a EGFa se muestra en la FIG. 5. La estructura decristal (y su descripción en la FIG. 5) reveló que el dominio EFGa de LDLR se une al dominio catalíticoO de PCSK9. Además, la interacción de PCSK9 y EGFa parece que ocurre a través de una superficie de PCSK9 que está entre los residuos D374 y S153 en la estructura descrita en la FIG. 5.

Los residuos de aminoácido de PCSK9 centrales específicos de la interface de interacción con el dominio EGFa de LDLR se definen como residuos PCSK9 que están dentro de 5 Á del dominio EGFa.

Los residuos centrales son como sigue: S153, 1154, P155, R194, D238, A239, 1369, S372, D374, C375, T377, C378, F379, V380, y S381.

Los residuos del límite del aminoácido PCSK9 de la interface de la interface de la interacción con el dominio EGFa LDLR se definieron como residuos PCSK9 que son 5-8 Á del dominio EGFa. Los residuos del límite son como sigue: W156, N157, L158, E159, H193, E195, H229, R237, G240, K243, D367, 1368, G370, A371, S373, S376, y Q382. Los residuos que están subrayados están casi o completamente sepultados dentro de PCSK9.

Como se apreciará por un experto en la técnica, los resultados de este ejemplo demuestran en donde PCSK9 y EGFa interactúan. De esta forma, la variantes PCSK9 neutralizantes que interactúan con o bloquean cualquiera de estos residuos pueden ser útiles para inhibir la interacción entre PCSK9 nativo y el dominio EGFa de LDLR (y/o LDLR generalmente) . En algunas modalidades, las variantes PCSK9 neutralizantes que, cuando se unen a PCSK9, interactúan con o bloquean cualquiera de los residuos anteriores o están dentro de 15-8, 8, 8-5, o 5 angstroms de los residuos anteriores se contemplan para proporcionar la inhibición de la unión de PCSK9 a LDLR.

EJEMPLO 11 Interacción Estructural de LDLR y PCSK9 Se hizo un modelo de la unión de la proteína PCSK9 de longitud completa a una representación de longitud completa de LDLR utilizando la estructura del complejo PCSK9 Pro/Cat 31-454/EGFa. La estructura de PCSK9 de longitud completa (Piper, D.E. et al. La estructura de cristal of PCSK9 : a regulator of plasma LDL-cholesterol . La estructura 15, 545-52 (2007)) se colocó por encima de PCSK9 Pro/Cat 31-454 del complejo y la estructura de LDLR en su conformación con pH bajo (Rudenko, G. et al . Structure of the receptor LDL extracellular domain at endosomal pH. Science 298, 2353-8 (2002)) se colocó por encima del dominio EGFa del complejo. Las descripciones del modelo se muestran en las FIGs . 6 y 7. El dominio EGFa del complejo PCSK9 Pro/Cat -31-454/EGFa se encasillan dentro del cuadro. Las figuras muestran las regiones del exterior del LDLR del dominio de unión EGFa inmediato que yacen en cercana proximidad al PCSK9.

EJEMPLO 12 Expresión y Purificación de Muestras de Proteína El presente ejemplo describe algunos métodos a través de los cuales se hacen y purifican las varias modalidades de las proteínas/variantes PCSK9 (incluyendo el dominio EFGa de LDLR) . Las proteínas/variantes de PCSK9 (por ejemplo, PSCK9 31-692 N533A, PCSK9 449TEV y PCSK9 Pro/Cat 31-454) se expresaron en células de insecto Hi-5 infectadas con baculovirus con un péptido de señal de melitina de miel de abeja N-terminal seguido por una etiqueta His6. Las proteínas PCSK9 se purificaron por cromatografía de afinidad en níquel, cromatografía de intercambio de ión y cromatografía de exclusión de tamaño. La etiqueta de melitina-His6 se eliminó durante la purificación a través de la división de la TEV proteasa. El constructo PCSK9 449TEV se utilizó para generar las muestras del dominio PCSK9 Pro/Cat 31-449 y dominio V (450-692) . Este constructo tuvo un sitio de división de TEV proteasa insertado entre los residuos 449 y 450 de PCSK9.

El dominio EFGa de LDLR (293-334) se expresó como una proteína de fusión GST en E. coli. El dominio EGFa se purificó por cromatografía de intercambio de ión cromatografía, de afinidad con glutationa-sepharose y cromatografía de exclusión de tamaño. La proteína GST se eliminó durante la purificación a través de la división de la PreScission proteasa.

EJEMPLO 13 Formación del Complejo y Cristalización El presente ejemplo describe cómo los complejos y cristales utilizados en los Ejemplos de examen de la estructura anterior se hicieron.

El complejo PCSK9 31-454/EGFa se hizo mezclando un exceso molar de 1.2 del dominio EGFa con PCSK9 31-454. El complejo del dominio PCSK9 31-454/EGFa se cristalizó en 0.2 M de formiato de potasio, 20% PEG 3350.

EJEMPLO 14 Recolección de Datos y Determinación de la estructura El presente ejemplo describe como se recolectan los grupos de datos y se determinan las estructuras para los Ejemplos de Exanimación de estructura anteriores.

El grupo de datos de PCSK9 31-454/EGFa se recolectó en la línea de rayo de Berkeley Advanced Light Source 5.0.2. Todos los grupos de datos se procesaron con denzo/scalepack o HKL2000 (Otwinowski, Z., Borek, D., Majewski, W. & Minor, W. Multiparametric scaling of diffraction intensities. Acta Crystallogr A 59, 228-34 (2003)).

Los cristales del dominio PCSK9/EGFa se cultivaron en un grupo de espacio P6522 con dimensiones celulares unitarias de a=b=70.6, c=321.8 A y difracción a 2.9 A de resolución. La estructura del dominio PCSK9/EGFa se resolvió por reemplazo molecular con el programa OLREP utilizando PCSK9 Pro/Cat como el modelo de búsqueda de partida. El análisis de los mapas de densidad de electrón mostró una clara densidad de electrón para el dominio EGFa . El dominio LDLR EGFa se adaptó a mano y el modelo se mejoró con múltiples rondas de construcción del modelo con Quanta y refinamiento con cnx.

Los aminoácidos .de la interface de interacción central se determinaron como siendo todos los residuos de aminoácido con al menos un átomo menor que o igual a 5 Á de la proteína asociada PCSK9. Se seleccionó 5 Á como la distancia de corte, de la región central para permitir que los átomos dentro del radio de van der aals más un hidrógeno mediado por agua posible se unieran. Los aminoácidos de la interface de interacción limítrofes se determinaron como todos los residuos de aminoácido con al menos un átomo menor que o igual a 8 Á de la proteína asociada PCSK9 como la distancia de corte de la región limítrofe para permitir la longitud de un aminoácido de arginina extendido. Los aminoácidos que cumplen con este criterio de distancia se calcularon con el programa PyMOL . (DeLano, W.L. The PyMOL Molecular Graphics System. (Palo Alto, 2002)).

Las coordenadas para la estructura de cristales explicada. en los ejemplos anteriores se presentan en la Tabla 35.2 de la Solicitud de Patente Prov. de E.U.A. No. 61/010630, presentada el 9 de Enero del 2008, la totalidad de la cual se incorpora por referencia. Las variantes PCSK9 neutralizantes que interactúan con las áreas o residuos relevantes de la estructura de of PCSK9 (incluyendo las áreas o residuos dentro de 15, 15-8, 8, 8-5, 5, o menos angstroms a partir de las cuales EFGa interactúa con PCSK9) descritas en las figuras y/o sus posiciones correspondientes en las estructuras de las coordenadas también se contemplan.

EJEMPLO 15 Variantes PCSK9 Neutralizantes Adicionales Este ejemplo describe la habilidad de la mutación de punto D374Y en una variante PCSK9 neutralizante (aminoácidos 31-447 de SEC ID NO: 3) para alterar la absorción del LDL celular (FIG. 8) y competir con PCSK9 de longitud completa para la unión con LDLR (FIG. 9) .

El protocolo seguido fue generalmente similar al descrito anteriormente con respecto a la absorción de LDL en la presencia de la variante PCSK9 neutralizante (aminoácidos 31-447 de SEC ID NO: 3), excepto que se utilizó la PCSK9 D374Y de longitud completa, una variante PCSK9 neutralizante (aminoácidos 31-447 de SEC ID NO : 3) que tiene la mutación de punto D374Y, y una hPCSK9 de tipo silvestre de longitud completa. Los resultados se muestran en la FIG. 8.

Además del experimento anterior, también se capturó LDLR en una placa ELISA a través de un anticuerpo LDLR (2 ug/ml) . Después de esto, se agregaron biotina-TS_PCSK9 (100 ng/ml) y varias concentraciones de PCSK9 D374Y de longitud completa sin bioteñir, el dominio V (dominio V) , y D374Y Pro/Cat (31-447) a la placa. La unión de biotina-PCSK9 se detectó por estreptavidina-HRP . Los resultados se presentan en la FIG. 9 y demuestran la habilidad del dominio D374Y Pro/Cat y D374Y PCSK9 de longitud completa para competir con PCSK9 TS de longitud completa para competir por la unión a LDLR.

Como se puede ver en los resultados desplegados en las FIGs . 8 y 9, las variantes PCSK9 neutralizantes también trabajarán para aumentar la cantidad de absorción de LDL con respecto a la absorción que ocurre en la presencia de otras formas de PCSK9.

Incorporación por Referencia Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo patentes, solicitudes de patente, papeles, libros de texto, y similares y las referencias citadas ahí, al grado al cual aún no están, se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Al grado en donde cualquiera de las definiciones o términos provistos en las referencias incorporadas por referencia difieren de los términos y la explicación provista en la presente, se controlan los presentes términos y definiciones.

Equivalentes La especificación escrita anterior se considera como suficiente para permitir a un experto en la técnica practicar la invención. La descripción y los ejemplos anteriores detallan ciertas modalidades de la invención. Se apreciará, sin embargo, que no importa que tan detallado aparezca lo anterior ; en el texto, la invención puede practicarse en muchas formas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (55)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. - Una variante PCSK9 neutralizante caracterizada porque comprende: un dominio Pro/Cat, o uno de sus fragmentos, que se une al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) ; y un dominio V inactivo para la actividad de LDLR, en donde V inactivo no da como resultado la degradación LDLR.

2. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende los aminoácidos 61 a 374 de SEC ID NO: 3, y en donde la variante PCSK9 neutralizante carece de la secuencia de proteína definida de los aminoácidos 453 al aminoácido 692 de SEC ID NO: 3.

3. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende los aminoácidos 31 a 374 de SEC ID NO : 3.

4. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende los aminoácidos 61 a 446 de SEC ID NO : 3.

5. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende los aminoácidos 31 a 449 de SEC ID NO: 3, y en dominio V carece de por lo menos los últimos 14 aminoácidos de SEC ID NO: 3.

6. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la variante PCSK9 neutralizante carece de los aminoácidos 453 a 692 de SEC ID NO: 3.

7. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio Pro/Cat consiste esencialmente de los aminoácidos 447 de SEC ID NO: 3.

8. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio Pro/Cat consiste de los aminoácidos 31 a 447 de SEC ID NO: 3.

9. - Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque codifica la variante PCSK9 de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

10. - La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la molécula de ácido nucleico está operablemente enlazada a una secuencia de control .

11. - Un vector caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico , de conformidad con la reivindicación 9.

12. - Una célula hospedera caracterizada porque comprende la molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 9.

13. - Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 11.

14. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende por lo menos una variante PCSK9 neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y 28-32, y un portador farmacéuticamente aceptable .

15.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque además comprende un agente activo adicional.

16. - La composición de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el agente activo adicional se selecciona del grupo que consiste de un radioisótopo, radionúclido, una toxina, o un grupo terapéutico y quimioterapéutico .

17. - Por lo menos una variante PCSK9 neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque se usa en el tratamiento o prevención de una afección asociada con colesterol de suero elevado en un paciente.

18. - Una variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la afección es hipercolesterolemia.

19. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque se usa en la unión inhibitoria de PCSK9 a LDLR en un paciente .

20. - Por lo menos una variante PCSK9 neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para administración simultánea o secuencial un agente que eleva la disponibilidad de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR), caracterizada porque se usa en el tratamiento o prevención de una afección asociada con colesterol de suero elevado en un sujeto.

21. - una variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el agente que eleva la disponibilidad de la proteína LDLR comprende una estatina.

22. - Una variante . PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la estatina preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina , lovastatina, mevastatina, pitavastatina, pravastatina, rosuvastatina, simvastatina , y algunas de sus combinaciones.

23. - Por lo menos una variante PCSK9 neutralizante aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque se usa para bajar el colesterol de suero en un sujeto, preferiblemente para administrar simultanea o secuencialmente con un agente que eleva la disponibilidad de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR)

24.- El uso de una variante PCSK9 neutralizante de conformidad con las reivindicaciones 1-8 en la fabricación del medicamento para el tratamiento de hipercolesterolemia .

25.- La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1-8, caracterizada para utilizarse como un medicamento.

26.- La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1-8, caracterizada porque se utiliza en el tratamiento de hipercolesterolemia.

27.- Una variante PCSK9 neutralizante caracterizada porque comprende : un dominio Pro/Cat, o uno de sus fragmentos, que se une al receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR) , en donde la variante PCSK9 neutralizante bloquea la unión de PCSK9 (SEC ID NO: 3) a LDLR, mientras permite que LDL se una a LDLR.

28.- La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la variante PCSK9 neutralizante tiene un dominio V inactivo.

29.- La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la variante PCSK9 neutralizante no tiene un dominio V.

30.- La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 1 o 27, caracterizada porque además, comprende un anticuerpo, o uno de sus fragmentos, conjugado con la variante PCSK9 neutralizante.

31.- La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el anticuerpo o su fragmento, comprende un dominio Fe de un anticuerpo.

32. - La variante PCSK9 neutralizante de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el fragmento del anticuerpo consiste de un dominio Fe de un anticuerpo.

33. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende por lo menos una variante PCSK9 neutralizante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la variante PCSK9 neutralizante está presente en una cantidad efectiva para el tratamiento de un trastorno relacionado con el colesterol .

34. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la cantidad efectiva comprende una cantidad efectiva para disminuir el nivel de LDL en un humano.

35. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la cantidad efectiva comprende una cantidad que eleva la disponibilidad de la proteína del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) en un humano.

36. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la elevación es de al menos 5%.

37. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la elevación es de al menos 20%.

38. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la elevación es de al menos 50%.

39. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la elevación es de al menos 100%.

40. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la elevación es de al menos 300%.

41. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque el humano es hombre de 100 kg.

42. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque el humano es un hombre de 50 kg .

43. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende : un dominio Pro/Cat, o uno de sus fragmentos, que se une al receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR) , y un dominio V inactivo para actividad de LDLR, en donde el domino V inactivo no da como resultado la degradación de LDLR; y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable .

44. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende los aminoácidos 61 a .374 de SEC ID NO: 3, y en donde la variante PCSK9 neutralizante carece de la secuencia de proteína definida del aminoácido 453 al aminoácido 692 de SEC ID NO: 3.

45. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende los aminoácidos 31 a 374 de SEC ID NO: 3.

46. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende los aminoácidos 61 a 446 de SEC ID NO : 3.

47. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende los aminoácidos 31 a 449 de SEC ID NO : 3, y en donde el dominio V carece de por lo menos los últimos 14 aminoácidos de SEC ID NO: 3.

48. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la variante PCSK9 neutralizante carece de los aminoácidos 453 a 692 de SEC ID NO : 3.

49. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el dominio Pro/Cat consiste esencialmente de los aminoácidos 31 a 447 de SEC ID NO : 3.

50. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el dominio Pro/Cat consiste de los aminoácidos 31 a 447 de SEC ID NO: 3.

51. - Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un dominio Pro/Cat, o uno de sus fragmentos, que se une al receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR) , y un dominio V inactivo para la actividad de LDLR, en dominio V inactivo no da como resultado la degradación de LDLR, en donde el dominio pro/cat está presente en una cantidad suficiente para el tratamiento de un trastorno relacionado con el colesterol

52. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el dominio Pro/Cat comprende la secuencia de aminoácido del dominio Pro/Cat en SEC ID NO: 9 o 30.

53. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el dominio Cat comprende una secuencia de aminoácido del dominio Cat de por lo menos una secuencia de aminoácido de SEC ID NOs : 9, 11, 13, 15, o 30.

54. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque' el dominio Pro/Cat consiste de la secuencia de aminoácido del dominio Pro/Cat en SEC ID NO: 9 ó 30.

55. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque el dominio Pro/Cat consiste esencialmente de la secuencia de aminoácido del dominio Pro/Cat en SEC ID NO: 9 ó 30.