CN103705567A - 一种当归补血颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有促进造血功能和免疫功能的畜禽当归补血颗粒及其制备方法。该当归补血颗粒，按重量计，主要成分包括：黄芪245-255份、当归49-51份以及用于颗粒制剂的辅料。其制备方法为取黄芪和当归，按重量以1:8-1:12的比例加入0%-50%乙醇水溶液，80℃煎煮0.5-2h，煎煮1-3次，得到煎煮液；将煎煮液浓缩干燥后得到浸膏干粉；将浸膏干粉与用于颗粒制剂的辅料混合均匀，按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材，制粒，烘干至所含水分百分比少于5%，整粒制得当归补血颗粒。该当归补血颗粒具有明显增强畜禽免疫机能的作用，可有效用于预防早期的畜禽因免疫力丧失而造成的疾病。

Description

一种当归补血颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及当归补血制剂领域，具体而言，涉及一种具有促进造血功能和免疫功能的畜禽当归补血颗粒及其制备方法。

背景技术

近年来，我国家禽业出现的以传染性法氏囊病病毒（IBDV）、鸡传染性贫血病毒(CIAV)、禽网状内皮增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)为代表的病原引起的鸡免疫抑制疾病越来越常见。其临床表现主要以免疫抑制、造血功能损伤为主，由此导致严重贫血、疫苗免疫应答低下及生产性能下降给畜禽生产造成极大的损失。目前临床尚缺乏有效防控此类疾病的手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种当归补血颗粒及其制备方法，以解决上述的问题。

在本发明的实施例中提供的一种当归补血颗粒，按重量计，主要成分包括：黄芪245-255份、当归49-51份以及用于颗粒制剂的辅料。

优选地，所述黄芪为片状，且每片长为3-5cm，宽为1-3cm，厚度为0.2-1.0cm。

优选地，所述当归为片状，且每片长为3-5cm，宽为1-3cm，厚度为0.2-1.0cm。

当归补血颗粒的制备方法，包括下列步骤：

取所述黄芪和所述当归，按重量以1:8-1:12的比例加入0%-50%乙醇水溶液，80℃煎煮0.5-2h，煎煮1-3次，得到煎煮液；

将所述煎煮液浓缩干燥后得到浸膏干粉；

将所述浸膏干粉与所述用于颗粒制剂的辅料混合均匀，按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材，制粒，烘干至所含水分百分比少于5%，整粒制得当归补血颗粒。

优选地，所述用于颗粒制剂的辅料为糊精和蔗糖，相应地，所述将所述浸膏干粉与所述用于颗粒制剂的辅料混合均匀，按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材，制粒，烘干至所含水分百分比少于5%，整粒制得当归补血颗粒的步骤具体为：

取浸膏干粉40份，糊精30-55份，蔗糖5-30份，混合均匀，按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材，14目筛制粒，50-70℃烘干至所含水分百分比少于5%，经14目筛和65目筛整粒制得当归补血颗粒。

优选地，所述浸膏干粉40份，所述糊精50份，所述蔗糖10份。

优选地，所述煎煮采用的液体为30%乙醇水溶液；

所述30%乙醇水溶液的重量为所述黄芪和所述当归总重量的8倍；

所述煎煮的时间为2小时；

所述煎煮的次数为2次。

优选地，所述润湿采用95%乙醇水溶液。

优选地，所述烘干采用50℃干燥4小时。

本发明提供的当归补血颗粒具有明显增强畜禽免疫机能的作用，可有效用于预防早期的畜禽因免疫力的丧失而造成的疾病。

附图说明

图1示出了各实验组中14日龄、28日龄、42日龄肉仔鸡中新城疫抗体的平均滴度；

图2示出了各实验组中14日龄、28日龄、42日龄肉仔鸡中法氏囊抗体的平均滴度；

图3示出了各实验组中14日龄、28日龄、42日龄肉仔鸡中IL-2的相对含量；

图4示出了各实验组中14日龄、28日龄、42日龄肉仔鸡中IL-6的相对含量；

图5示出了各实验组中14日龄、28日龄、42日龄肉仔鸡中淋巴细胞增殖水平。

注：肩标相同表示差异不显著，肩标不同说明差异显著。

具体实施方式

下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。

在本发明的实施例中提供的一种当归补血颗粒，主要成分包括：黄芪250份、当归50份以及用于颗粒制剂的辅料。

为了将黄芪和当归中的营养成分更好的提取出来，节约提取时间。优选地，黄芪或当归均可为片状，且每片长为3-5cm，宽为1-3cm，厚度为0.2-1.0cm。

当归补血颗粒的制备方法，包括下列步骤：

取所述黄芪250份和所述当归50份，按重量以1:8-1:12的比例加入0%-50%乙醇水溶液，80℃煎煮0.5-2h，煎煮1-3次，得到煎煮液；

将所述煎煮液浓缩干燥后得到浸膏干粉；

取浸膏干粉40份，糊精30-55份，蔗糖5-30份，混合均匀，

按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材，14目筛制粒，50-70℃烘干至所含水分百分比少于5%，经14目筛和65目筛整粒制得当归补血颗粒。

分别对黄芪和当归的有效成分进行试验测定，所得测定结果中黄芪的主要药效物质为黄芪甲苷、黄芪多糖；当归的主要药效物质为阿魏酸和当归多糖。按重量计，取黄芪250份，当归50份，以黄芪甲苷、阿魏酸、黄芪多糖和当归多糖含量及浸膏干粉得率作为质量控制标准，设计了4因子3水平的正交试验。如表1所示，设置的4个影响因子分别为乙醇水溶液的浓度A、料液比B、提取时间C、提取次数D，乙醇水溶液分别设置为0%、30%和50%的浓度；料液比分别设置为1:8、1:10和1:12；提取时间分别设置为0.5h、1h和2h；提取次数分别设置为1次、2次和3次，以此设计了4因子3水平的正交试验，得到了如表2和表3的正交试验结果。

表1当归补血颗粒煎煮提取因素水平表

表3试验结果表明，A、D这两个因子变化对试验结果有极显著的影响，而B和C这两个因子变化对试验结果无显著影响。表2试验结果表明，最优提取工艺条件为：A2B1C3D2。即以30%的乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1:8，80℃提取2次，每次2h。

表2当归补血颗粒提取工艺正交试验表与试验结果

表3煎煮法提取工艺正交试验结果方差分析表

F0.01(1,2)=99F0.05(2,2)=19

将上述最优提取工艺进行了验证，具体步骤为：分别称取三份药材，每份含黄芪500g，当归100g，加入4800g的30%乙醇水溶液作为提取溶剂，80℃提取2次，每次2h。合并提取液，过滤，减压干燥，分别测定提取物中黄芪甲苷含量、阿魏酸含量、黄芪多糖含量、当归多糖含量以及浸膏干粉得率。采用购自湖南衡阳东泰医药机械制造有限公司的自控多功能提取器ZHDTQ-1000L（容积：1000L；工作压力：0.09MPa）进行提取。结果见表4。

由表4可知，三个试验数据之间无明显差异，且黄芪甲苷含量、阿魏酸含量、总多糖含量、浸膏得率均高于正交样品，因此，最终确定煎煮提取工艺为A2B1C3D2。此外，试验数据还表明，当归补血颗粒提取工艺稳定可靠，适合规模化生产。

表4最佳工艺条件验证结果

因此，优选地，所述煎煮采用的液体为30%乙醇水溶液；所述30%乙醇水溶液的重量为所述黄芪和所述当归总重量的8倍；所述煎煮的时间为2小时；所述煎煮的次数为2次。

颗粒剂的辅料主要包括填充剂、润湿剂、粘合剂和矫味剂等，填充剂主要包括蔗糖、糊精等，蔗糖兼有矫味剂作用。参考《中国兽药典》颗粒剂相关生产工艺并结合大生产实际，还为了节约成本，本实验选择蔗糖、糊精作为填充剂，如表5所示，将浸膏干粉、蔗糖和糊精设置了4个重量比例，对当归补血颗粒的外观性状、溶化性、吸湿性指标进行了验证。

外观性状采用目测的方法检测。

溶化性检测方法：取当归补血颗粒10g，加热水200ml，搅拌5分钟，立即观察。

吸湿性检测方法：将底部盛有氯化钠过饱和溶液的玻璃干燥器室温放置48h，使其达到平衡，此时干燥器内的相对湿度为75%。在已干燥恒重的5mL称量瓶底部放入1g的样品，轻摇使其分布均匀，精确称量后，称量瓶盖揭开置于盛有氯化钠过饱和溶液的干燥器内，48h后称重，计算吸湿百分率。吸湿百分率=（吸湿后药粉重量-吸湿前药粉重量）÷吸湿前药粉重量×100%。

表5采用不同比例的填充剂所制备的颗粒剂效果

表5结果表明，浸膏粉：蔗糖：糊精比例为40：50：10时，制备的当归补血颗粒外观性状好，颗粒疏松，防潮性和溶化性均较好。此外，随着糊精用量的增大，当归补血颗粒防潮性更好，但溶化性相对较差。因此，优选地，浸膏干粉40份，糊精50份，蔗糖10份。

早期的润湿剂多使用水,制得颗粒粘性较差,易结块。按重量计，取浸膏干粉40份，糊精50份，蔗糖10份混合均匀，按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材。如表6所示，分别选用浓度为95%，85%，75%浓度的乙醇水溶液作为润湿剂和粘合剂，验证制得的颗粒剂性状。

表6不同浓度的乙醇溶液作粘合剂所制备的颗粒剂效果

表6结果表明，乙醇浓度越小，颗粒越硬，因此，优选地，所述润湿采用95%乙醇水溶液。

对上述得到的软材经14目筛制粒，对其进行干燥，将当归补血颗粒分别放置于如表7所示的50℃，60℃,70℃三个干燥箱中分别进行烘干，每小时翻动1次，水分控制在5%以内，得到干燥时间和颗粒性状。

表7不同烘干温度对颗粒剂的影响

表7结果表明，50℃干燥4h，得到的颗粒疏松不结块，方便过筛整粒。因此，优选地，所述烘干采用50℃干燥4小时。

根据《兽用中药、天然药物质量标准分析方法验证指导原则》和《新兽药研制管理办法》中的基本要求，在制备工艺成熟后对“当归补血颗粒”的性状、鉴别、含量等方面进行了系统研究，并制定了《“当归补血颗粒”质量标准草案》(标准附后)，试制三批本品经检验，符合《“当归补血颗粒”质量标准草案》。在鉴别方面，与人药“当归补血口服液”相比，本品增加了当归有效成分蒿苯内酯的薄层鉴别；在含量测定方面，本品利用高效液相色谱法检测黄芪甲苷和阿魏酸含量，每克颗粒剂含阿魏酸不低于0.18mg，黄芪甲苷不低于0.85mg。

稳定性试验

将制得的当归补血颗粒进行了稳定性考察。在影响因素试验中，本品在60℃条件下放置10天，黄芪甲苷含量无明显变化，阿魏酸含量下降低于1.8%，符合药品稳定性要求，产品质量稳定；在高湿条件下（RH75%,25℃）放置10天，本品吸湿增重3.5%，但黄芪甲苷和阿魏酸无明显降解；在光照条件下暴露于4500±500Lx，并分别于5、10天取样测定，得到阿魏酸含量显著下降，因此，本品需遮光防潮置于阴凉处保存。

在长期稳定性试验中，取样品3批（批号为20130310，20130311，20130312），按市售包装，在温度40℃±2℃，相对湿度75%±5%的条件下放置6个月，阿魏酸含量有所下降，符合质量控制标准；在温度25℃±2℃，相对湿度60%±10%的条件下放置12个月，样品的各项检测指标均符合质量标准要求，12个月以上长期稳定性试验观察仍在进行中。

药理学实验

一、当归补血颗粒的一般药理学试验

【原理】动物给予当归补血颗粒，观察当归补血颗粒除主要药效作用以外的其它广泛药理作用，主要包括观察给药前后活动情况、行为变化（神经系统）、心电图、血压等（心血管系统）、呼吸频率、节律及深度（呼吸系统）的影响。

【材料】

动物：昆明种小鼠120只，雌性各半，体重18～22g，由成都中医药大学实验动物中心提供。动物饲养于SPF级动物房、实验环境符合国家大鼠、小鼠、豚鼠、兔屏障系统使用设施标准，四川省实验动物管理会许可证第100号。

器材：XZ-4型小动物活动计数仪（中国医学科学院药物研究所研制），RM-6000八导生理记录仪（日本岛津）。药品及试剂：当归补血颗粒，临用时以蒸馏水配制。阳性药物用安定片，规格2.5mg/片，100片/瓶，重庆制药七厂生产。

【方法】

1.对小鼠自发活动的影响

（1）实验设计

动物数：小鼠60只，每组雌性各5只，共6组。

分组及剂量设计：设正常对照组（蒸馏水）、阳性药物组（安定片2.5mg/kg）、当归补血颗粒3个对照组（原生药4g、8g、16g/kg体重，分别相当于临床使用剂量的4、8、16倍）。

注：1g当归补血颗粒颗粒相当于原生药2.5g。

（2）给药途径和次数：采用等容积不等浓度药液灌胃给药1次，给药体积为0.1ml/10g体重。

（3）药品溶剂：蒸馏水。

（4）药品配制：临用前分别称取一定量的当归补血颗粒，用蒸馏水配成不同浓度的药液。

（5）实验方法及观察指标：将小鼠置于小动物活动计数仪内，记录给药前及给药后30分钟、60分钟小鼠在5分钟内的自发活动数，同时记录灌胃给药后小鼠一般行为、姿势、步态、有无流涎、肌颤等。

2.对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响

（1）实验设计

动物数：小鼠60只，每组雌性各5只，共6组。

分组及剂量设计：设正常对照组（蒸馏水）、阳性药物组（安定片2.5mg/kg）、当归补血颗粒3个对照组（原生药4g、8g、16g/kg体重，分别相当于临床使用剂量的4、8、16倍）

（2）给药途径和次数：采用等容积不等浓度药液灌胃给药1次，给药体积为0.1ml/10g体重。

（3）药品溶剂：蒸馏水。

（4）药品配制：临用前分别称取一定量的当归补血颗粒，用蒸馏水配成不同浓度的药液。

（5）实验方法及观察指标：给药1小时后给小鼠腹腔注射戊巴比妥钠28mg/kg（0.1ml/10g体重），然后记录30分钟内小鼠翻正反射消失达1分钟以上者（入睡动物数）

【结果】

1.对小鼠自发活动的影响由表8可见，当归补血颗粒所试3个剂量组给药前及给药后30分钟、60分钟动物在5分钟内的自发活动数与对照组小鼠自发活动数比较无明显差异（P>0.05）。给药后未见小鼠流涎、肌颤等异常现象，小鼠一般行为、姿势、步态亦未见明显异常。

2.对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响由表9可见，当归补血颗粒3个剂量组入睡动物数与对照组之间无显著差异，表明当归补血颗粒与戊巴比妥钠之间无明显协同作用。

表8当归补血颗粒对小鼠自发活动次数的影响（x±s）

表9当归补血颗粒对小鼠戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响

与对照组比较（t检验）：*P>0.05；**P<0.01

二、当归补血颗粒小鼠灌胃给药最大给药量的测定

【原理】最大给药量测定是指以最大浓度、最大容积，单次或24小时内多次（2～3次）给药的最大给药剂量。中药新药研究当受试物的毒性很低，或者因浓度或体积的限制，选择拟推荐临床试验的给药途径，对药物安全性进行评估。为临床用药提供参考。当归补血颗粒由预试验灌胃未见动物出现死亡的情况下，测定受试物24小时内2次灌胃给予动物后的最大给药量，同时观察给药后14天内受试动物的毒性反应情况。

【材料】

动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体重18～22g。

器材：电子天平（d=0.01）、电子天平（d=1mg）、小鼠灌胃针头、手术器械。

药品与试剂：当归补血提取物、当归补血颗粒。

【方法】

（一）当归补血提取物小鼠灌胃给药最大给药量的测定

1.动物分组取健康昆明种小鼠20只，雌性各半，体重18～22g，试验前小鼠禁食不禁水16小时，根据体重和性别随机分为对照组和给药组，每组10只。

2.给药对照组给蒸馏水。给药组当归黄芪补血提取物，加适量蒸馏水碾磨均匀，配制成刚好能通过16号灌胃针的混悬液最大浓度4.76g（原生药）/ml，一日之内灌胃两次，灌胃容积为0.4ml/10动物体重（小鼠灌胃最大容积），间隔时间为6小时。

3.给药后即开始观察药物的毒性反应情况，连续观察14天，计算最大给药量，并推算该剂量相当于临床每日推荐用量的倍数。

计算方法见下公式：

（二）当归补血颗粒小鼠灌胃给药最大给药量的测定

1.动物分组取健康昆明种小鼠20只，雌性各半，体重18～22g，试验前小鼠禁食不禁水16小时，根据体重和性别随机分为对照组和给药组，每组10只。

2.给药对照组给蒸馏水。给药组当归补血颗粒，加适量蒸馏水碾磨均匀，配制成刚好能通过16号灌胃针的混悬液最大浓度1.5g（原生药）/ml，一日之内灌胃两次，灌胃容积为0.4ml/10动物体重（小鼠灌胃最大容积），间隔时间为6小时。

3.给药后即开始观察药物的毒性反应情况，连续观察14天，计算最大给药量，并推算该剂量相当于临床每日推荐用量的倍数。

计算方法见下公式：

【结果】

1.给当归补血提取物后观察14天内，无动物死亡。试验结束时肉眼解剖未见明显病理改变。给药期间动物体重变化给药组与对照组差异不显著。鸡的临床用量为1g（原生药）/kg体重，每只小鼠的最大给药量3.8g（原生药），小鼠平均体重为20g，观察14天，无一只死亡。按上式计算相当于临床每日用药量的190倍。

2.给当归补血颗粒后观察14天内，无动物死亡。试验结束时肉眼解剖未见明显病理改变。给药期间动物体重变化给药组与对照组差异不显著。鸡的临床用量为1g（原生药）/kg，每只小鼠的最大给药量1.5g（原生药），小鼠平均体重为20g，观察14天，无一只死亡。按上式计算相当于临床每日用药量的75倍。

三、当归补血颗粒大鼠灌胃给药长期毒性试验

【原理】大鼠长期毒性试验是目前最常用的啮齿类长期毒性试验项目，主要是发现所试中药是否有毒性及中毒的靶器官。它描述大鼠重复给予受试物后的毒性特征，也为进一步可能进行的非啮齿类长期毒性试验提供参考资料。长期毒性试验研究是中药新药安全评价的重要内容，是判断一个新药能否过渡到临床试用的主要依据之一。它为临床安全用药的剂量设置提供参考依据，为临床毒副反应的监护和生理生化指标的监测提供依据。

【材料】

动物：SPF级大鼠150只（雌75只、雄75只），体重110g，年龄8周龄。动物在全不锈钢丝（40cm×27.5cm×22.5cm）笼内笼养，雌雄分笼饲养，每笼5只，实验前饲养观察1周，记录进食量、体重及一般情况，无明显异常者方可作为受试动物。

器材：电子天平（d=0.01g）、电子天平（d=1mg）、HC-9883型临床电解质分析仪、兰波Coa DATA4001血凝分析仪、F-820血细胞分析仪、PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪、LEACA RM2135切片机、TSJ-Q型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、LD5-2A离心机、Olympus光学显微镜、雷勃（Finnpipette）连续可调移液器5～50μl、100～1000μl、1～5ml，贝克曼CX4全自动生化分析仪、四川省医学科学院XYTX-2000药品非临床安全性评价全自动病理图像定量分析系统。

药品试剂：当归补血颗粒。PK-30L血细胞稀释液、QUICKLYSER-Ⅱ溶血素、凝血酶原时间（PT）检测试剂盒，血清K+、Na+、Cl-离子检测试剂、血液生化检测试剂（AST、ALT、TP、ALB、Crea、BUN、T-BIL、T-CHO、GLu、ALP、TG CK），甲醛（分析纯）、乙醇（95%分析纯）、二甲苯（分析纯）、生理盐水等。

【方法】

1.剂量和分组大鼠在实验室饲养观察1周后按体重随机分成五组，每组30只大鼠。即当归补血提取物高、中、低三个剂量组分别是95g、38g、9.5g（原生药）/kg体重，相当于临床剂量的95倍、38倍和9.5倍，1个空白对照组（蒸馏水）和1个辅料对照组（按照制剂比例提供辅料，9.5g/kg体重）。

2.给药途径与方法采用灌胃法，每日上午8～10时定时专人给药。取提取物50g，加入40ml水，碾磨搅拌均匀即得70ml药液。即4.76g（原生药）/ml（1g提取物相当于原药6.67g），作为最高剂量组，并按要求稀释配制中剂量0.95g（原生药）/ml、低剂量0.476g（原生药）/ml组及辅料对照组。用不等浓度等体积的药液每天灌胃1次，灌胃容积为2ml/100g体重，每天给药，连续4周。对照组灌胃等体积的蒸馏水和辅料。实验期每天称体重，并按新的体重计算给药量。

3.可逆性观察给药4周后，当归补血提取物3个剂量组、辅料组和空白对照组各留下1/3动物不给受试药物，继续观察2周，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的延迟性毒性。

4.试验周期本研究根据其临床疗程在1周以内，确定本次长期毒性试验周期4周。恢复性观察2周。

5.指标观察

（1）一般表现：每日给药前后观察各剂量组每只动物的外观体征，行为活动，大小便形状、颜色，各天然孔有无异常分泌物等。给药前称重2次，给药期间每周称重1次。

（2）血液学指标：活杀动物时股动脉、静脉切断取血，用F-820血液细胞分析仪测定WBC（白细胞）、RBC（红细胞）、HGB（血红蛋白）、PLT（血小板计数）。

（3）血液生化学指标：活杀动物时，股动脉、静脉切断取血分离血清，用半自动生化分析仪检测，AST（天冬氨酸氨基转移酶）酶法、ALT（丙氨酸氨基转移酶）酶法、ALP（碱性磷酸酶）速率法、TP（总蛋白）双缩脲法、Alb（清蛋白）BCG法、TBIL（总胆红素）重氮法、BUN（尿素氮）尿酶-波氏比色法、Glu（葡萄糖）FOD-POD法、TC（总胆固醇）CE-COD-POD法、Crea（肌酐）苦味酸两点法。电解质仪测定Na+、K+、Cl-。酶动力学法测CK。

（4）系统尸解和病理组织学检查：按照试验设计方案断头处死动物后，按本实验室《实验动物尸体解剖操作规程》进行全面系统尸解。取心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、子宫、卵巢、睾丸、前列腺等13种实质器官称重、计算脏器系数，并速将心、肝、脾、肺、肾、脑、脊髓、胸骨柄、食道-胃-十二指肠、回肠、结肠、胸腺、胰腺、肾上腺、甲状腺、膀胱、（肠系膜）淋巴结、睾丸、附睾、前列腺、子宫、卵巢、垂体等脏器组织置于10%福尔马林液固定，首先对高剂量组和对照组进行常规石蜡切片，苏木素-伊红染色，光镜下作组织病理学检查，若高剂量组发现病理变化，则对中、低剂量组相应脏器进行组织病理学检查。

6.指标观察时间一般状况和症状观察每天观察一次。每周记录体重和进食量1次。末次给药后24小时和恢复期（停药后继续观察2周）结束时各进行一次各项指标全面检测。

7.统计学处理所有数据采用SPSS6.0软件分析处理。

【结果】

1.一般表现当归补血提取物给药4周及停药恢复观察2周，给药组的动物外观体征、行为活动、大、小便无异常，眼、耳、生殖器等天然孔均无异常分泌物。雄鼠高、中、低剂量组体重低于对照组，组间统计差异显著（P<0.05）。停药恢复观察两周，雄鼠各剂量组和雌鼠各剂量组体重均与对照组差异不显著（P>0.05）。动物体重降低可能与灌胃容积过大引起的不适以及影响营养物质消化吸收有关。

2.血液细胞学指标如表10所示，当归补血提取物连续灌胃给药4周，高、中、低三个剂量组及辅料对照组RBC和HGB均增加（P<0.05），说明当归补血提取物具有一定的促进造血功能的作用，停药后恢复正常。其余各差异指标均在本实验室正常参考值范围内，并且无明显量效关系，也未见相关联指标变化，故可认为未见药物引起的这些血液学指标变化。

表10当归补血提取物大鼠长毒试验第28天血常规检测统计结果（x±s）

与对照组比较（t检验）：*P>0.05；**P<0.01

3.血液生化指标当归补血提取物连续灌胃给药4周，辅料组、中、低剂量组CK降低（P<0.05）；中剂量、低剂量Ｔ-Bil降低（P<0.05）；高、中、低剂量组及辅料对照组TP升高（P<0.05）,辅料组、中剂量、低剂量CK降低（P<0.01）。（见表11），恢复观察2周均在正常范围内。由于上述各差异指标均在本实验室正常参考

值范围内，并且无明显量效关系，也未见相关联指标变化，故可认

为未见药物引起的血液生化学指标异常变化。

表11当归补血提取物大鼠长毒试验第28天生化检测统计结果（x±s）

与对照组比较（t检验）：*P>0.05；**P<0.01

4.系统尸体解剖对每只动物进行仔细的系统尸体解剖，肉眼观察可见各组均有个别大鼠肺脏出现轻微出血点。其中，对照组6只（雄4雌2），高剂量组5只（雄2雌3），中剂量组3只（雄2雌1），小剂量组4只（雄2雌2），辅料组4只（雄雌1）。各组无明显差异，与受试药物无关，原因应归咎于处死大鼠方式不当。如表12所示，高剂量组肝脏指数升高（P<0.05），子宫指数降低（P<0.05）。停药恢复2周，与对照组无显著差异。中剂量组子宫指数升高（P<0.05），停药恢复2周，与对照组无显著差异。其余各组各脏器指数无显著差异。

表12当归提取物大鼠长毒试验第30天脏器系数（脏器g/100g体重）（x±s）

与对照组比较（t检验）：*P>0.05；**P<0.01

5.病理组织学检查肝脏：空白对照组3例（3/30）、高剂量组12例（12/30）、中剂量组6例（6/30）动物肝小叶结构清晰，肝细胞弥漫性水肿变性。其余动物肝小叶结构完整，未见增生及假小叶形成，小叶中央静脉未见淤血，肝细胞未见变性及坏死；也未见肝细胞增生、纤维化及癌变，肝细胞内及细小胆管内无胆汁淤积，未见各类细胞浸润，汇管区无明显扩大及纤维结缔组织增生。小叶间胆管无扩张及增生，被膜完整，未见增厚及渗出。结合肝脏指数可以认为，高剂量当归补血颗粒长期服用对大鼠有一定肝脏毒性，停药2周后可恢复。

肺脏：空白对照组6例（6/30）、高剂量组5例（5/30）、中剂量组3例（3/30）、低剂量组4例（4/30）、辅料组4例（4/30）动物肺弥漫性出血。其余动物肺脏层胸膜无结缔组织增生、增厚，未见炎性渗出；各级支气管腔内及肺泡内未见渗出水肿液、出血及炎细胞浸润，支气管粘膜假复层纤毛柱状上皮无增生、萎缩、变性、坏死脱落。均可见部分动物肺和气管有不同程度的非特异性炎症。个别动物偶见膀胱、肾有轻度非特异性炎症，回肠、结肠黏膜炎细胞浸润，经统计学结果检验表明，对照组与高剂量组无明显差异。

综上所述，本实验结论提示，当归补血提取物95g、38g、9.5g（原生药）/kg，给大鼠每日灌胃1次，连续30天，停药恢复性观察2周。当归补血提取物给药期间动物体重有一定程度降低，停药后恢复性观察未见异常。动物体重降低可能与灌胃动物容积过大引起的不适以及影响营养物质消化吸收有关。高剂量组大鼠肝脏指数显著高于对照组，子宫指数显著低于对照组，病理观察可见部分高剂量组大鼠肝脏出现轻微病变，停药2周可恢复。其余血液细胞学、血液生化学、系统尸体解剖、病理组织学指标均未见与药物毒性相关的异常变化。故可得知本次大鼠长期毒性试验结果表明当归补血提取物无明显毒性作用。

对上述优选实施例制得的当归补血颗粒进行功能性验证：

取240只1日龄的肉仔鸡，随机分为4组，A组（0.5%当归补血颗粒）、B组（2.0%当归补血颗粒）、C组（环磷酰胺对照）和D组（空白对照），每个鸡笼放12只，每组有5个鸡笼；所有肉仔鸡一起养殖，环境温度根据肉仔鸡的日龄从36℃-22℃逐渐降低；24小时光照；统一提供新鲜鸡饲料和饮用水。

4-7日龄，对A、B和C组中的肉仔鸡每天进行腹腔注射环磷酰胺，剂量为为100mg/kg体重，以产生免疫抑制；D组中的肉仔鸡注射生理盐水。目的是构建免疫抑制模型，是免疫性测试的常用手段。

8-42天，A和B组肉仔鸡在饮用水中分别补加0.5%和2.0%的当归补血颗粒，C和D组不变。

1日龄和7日龄的所有肉仔鸡，通过滴眼剂的方式接受活的新城疫疫苗；14日龄的所有肉仔鸡，通过滴眼剂的方式接受活的鸡传染性腔上囊疫苗；28日龄的所有肉仔鸡，肌肉注射补充0.2ml灭活的新城疫疫苗。

1.分别在14、28、42日龄的肉仔鸡的心脏取5ml血，血清用于测定新城疫抗体滴度和鸡传染性法氏囊抗体滴度，采用相应的ELISA试剂盒测定，步骤按照说明书进行。

以天数为横坐标，新城疫抗体在OD450测定的滴度平均值为纵坐标，得到图1。

从图1中可看出，28日龄和42日龄的当归补血颗粒组新城疫抗体的平均滴度均显著高于环磷酰胺对照组，说明当归补血颗粒对雏鸡新城疫抗体生成有显著促进作用。

以天数为横坐标，法氏囊抗体在OD450测定的滴度平均值为纵坐标，得到图2。

从图2可看出，28日龄健康对照组法氏囊抗体平均滴度显著高于免疫抑制试验组（A、B、C组），说明环磷酰胺免疫抑制模型成功，42日龄0.5%当归补血颗粒法氏囊抗体的平均滴度显著高于C组，说明当归补血颗粒对免疫抑制条件下法氏囊抗体生成有显著促进作用。

2.血清中IL-2和IL-6的水平采用相应的ELISA试剂盒测定，

以天数为横坐标，IL-2的平均OD值为纵坐标，平均OD值表示IL-2的相对含量得到图3。

从图3中可看出，14日龄和28日龄的当归补血颗粒组白细胞介素2（IL-2）均显著高于环磷酰胺对照组，说明当归补血颗粒对提高雏鸡IL-2水平有显著促进作用。

以天数为横坐标，IL-6的平均OD值为纵坐标，平均OD值表示IL-6的相对含量得到图4。

图4中可看出，14日龄各当归补血颗粒组白细胞介素6（IL-6）均显著高于环磷酰胺对照组，说明当归补血颗粒对提高雏鸡IL-6水平有显著促进作用。

采用MTT实验方法测定外周血淋巴细胞增殖水平，以天数为横坐标，刺激因子的平均值为纵坐标，得到图5。

图5中可看出，14日龄和28日龄各当归补血颗粒组对伴刀豆蛋白（ConA）诱导外周血淋巴细胞增殖水平均显著高于环磷酰胺对照组，说明当归补血颗粒对提高淋巴细胞增殖有显著促进作用。

以上结果均表明，当归补血颗粒对提高雏鸡抗体水平、调节白介素水平和淋巴细胞增殖水平均有显著效果，可作为免疫增强剂在畜牧兽医临床使用。

本发明提供的当归补血颗粒，对其进行了制剂处方与工艺研究，筛选出了较好的处方及合理的生产工艺；完成了质量研究工作，起草了质量标准草案；按照筛选出的处方、工艺进行放大试验，制备了3批样品，并按我们建立的质量标准进行了检验，3批样品均合格；进行了药物稳定性研究，初步稳定性试验表明，试验的3批样品在所采用储藏条件下性质稳定。大量的药理、毒理试验及临床研究的结果表明，在临床推荐剂量下，没有发现明显的主、客观异常，不良作用发生率较低，安全性高，具有良好的安全性能。临床试验证明，本发明提供的当归补血颗粒具有明显增强畜禽免疫机能的作用和具有一定的促进造血功能的作用，可有效用于预防早期的畜禽因免疫力的丧失而造成的疾病。

应当说明的是，由于称量工具的精度会存在一定的误差，因此本发明所规定的黄芪和当归的用量均为标准用量，实际用量误差控制在2%的范围内均可实现本发明。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种当归补血颗粒，其特征在于，按重量计，主要成分包括：黄芪245-255份、当归49-51份以及用于颗粒制剂的辅料。

2.根据权利要求1所述的当归补血颗粒，其特征在于，所述黄芪为片状，且每片长为3-5cm，宽为1-3cm，厚度为0.2-1.0cm。

3.根据权利要求2所述的当归补血颗粒，其特征在于，所述当归为片状，且每片长为3-5cm，宽为1-3cm，厚度为0.2-1.0cm。

4.根据权利要求1-3任一项所述的当归补血颗粒的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：

取所述黄芪和所述当归，按重量以1:8-1:12的比例加入0%-50%乙醇水溶液，80℃煎煮0.5-2h，煎煮1-3次，得到煎煮液；

将所述煎煮液浓缩干燥后得到浸膏干粉；

将所述浸膏干粉与所述用于颗粒制剂的辅料混合均匀，按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材，制粒，烘干至所含水分百分比少于5%，整粒制得当归补血颗粒。

5.根据权利要求4所述的当归补血颗粒的制备方法，其特征在于，所述用于颗粒制剂的辅料为糊精和蔗糖，相应地，所述将所述浸膏干粉与所述用于颗粒制剂的辅料混合均匀，按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材，制粒，烘干至所含水分百分比少于5%，整粒制得当归补血颗粒的步骤具体为：

取浸膏干粉40份，糊精30-55份，蔗糖5-30份，混合均匀，按重量比加入5%-15%的75%-95%乙醇水溶液润湿制成软材，14目筛制粒，50-70℃烘干至所含水分百分比少于5%，经14目筛和65目筛整粒制得当归补血颗粒。

6.根据权利要求5所述的当归补血颗粒的制备方法，其特征在于，所述浸膏干粉40份，所述糊精50份，所述蔗糖10份。

7.根据权利要求6所述的当归补血颗粒的制备方法，其特征在于，所述煎煮采用的液体为30%乙醇水溶液；

所述30%乙醇水溶液的重量为所述黄芪和所述当归总重量的8倍；

所述煎煮的时间为2小时；

所述煎煮的次数为2次。

8.根据权利要求7所述的当归补血颗粒的制备方法，其特征在于，所述润湿采用95%乙醇水溶液。

9.根据权利要求8所述的当归补血颗粒的制备方法，其特征在于，所述烘干采用50℃干燥4小时。

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