CN113546130B - 一种青蒿鳖甲颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种青蒿鳖甲颗粒及其制备方法，属于中药制备技术领域。该青蒿鳖甲颗粒包括以下重量配比的原料；青蒿9份，知母6份，桑叶6份，鳖甲15份，牡丹皮6份和天花粉6份；制备方法为：将原料加水进行回流提取，将提取液浓缩，然后经干燥、制粒，得到青蒿鳖甲颗粒。本发明在传统青蒿鳖甲汤方剂基础上进行调整，采用简单的制备工艺制备得到了治疗效果好、安全性高的青蒿鳖甲颗粒，该青蒿鳖甲颗粒可用于解热以及治疗营热阴伤证等，同时制备方法简单，颗粒剂型便于携带，服用更加方便。

Description

一种青蒿鳖甲颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及中药制备技术领域，特别是涉及一种青蒿鳖甲颗粒及其制备方法。

背景技术

青蒿鳖甲汤来源于《温病条辨》，方由青蒿6克，鳖甲15克，细生地12克，知母6克，丹皮9克组成。青蒿鳖甲汤的药理作用主要有解热，抗炎，镇静，抗病原微生物等作用。

青蒿鳖甲汤临床有明显的解热作用，能抑制生物体自体免疫和变态反应性炎症，对实验性关节炎有抑制作用，还具有解痉作用，且对伤寒杆菌、痢疾杆菌、白喉杆菌、葡萄球菌、肺炎球菌等均有不同程度的抑制作用。

在青蒿鳖甲汤的方剂基础上进行加减治疗可以保证对症治疗效果及安全有效性，同时，丰富药物剂型也已经成为一项新药研究，制剂水平落后不仅影响药物疗效的发挥，而且导致药品附加值低，直接影响市场竞争和产业经济效益，并且，剂型的多样化也会使得患者服药的选择性更多，颗粒剂为一种极为方便的选择。

因此，提供一种治疗效果好的青蒿鳖甲颗粒以及对应的制备方法，使得药物有效成分得到高效保留，实现优异的治疗效果是目前需要解决的技术难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种青蒿鳖甲颗粒及其制备方法，以解决上述现有技术存在的问题。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种青蒿鳖甲颗粒，包括以下重量配比的原料：

青蒿9份，知母6份，桑叶6份，鳖甲15份，牡丹皮6份和天花粉6份。

本发明还提供一种上述青蒿鳖甲颗粒的制备方法，包括以下步骤：

将所述原料加水进行回流提取，将提取液浓缩，然后经干燥、制粒，得到所述青蒿鳖甲颗粒。

优选的，所述回流提取进行3次，每次提取时间1h。

优选的，进行回流提取时，第一次加水量为原料总质量的14倍，其余两次加水量为原料总质量的12倍。

优选的，所述浓缩的温度为60-70℃，所述浓缩后的浸膏密度为1.05-1.20g/mL。

优选的，所述浓缩后的浸膏密度为1.08-1.13g/mL。

优选的，所述浓缩的温度为60℃，所述浓缩后的密度为1.10g/mL。

优选的，所述干燥为喷雾干燥。

优选的，所述制粒过程添加糊精，所述糊精与干燥后所得干浸膏的质量比为1:1。

优选的，在干燥后还包括添加矫味剂的步骤，所述矫味剂为三氯蔗糖，所述三氯蔗糖的添加量为干燥后所得干浸膏质量的0.1-0.5％。

优选的，所述三氯蔗糖的添加量为干燥后所得干浸膏质量的0.3％。

本发明青蒿鳖甲颗粒1g成品相当于2.40g生药，口服48g生药/d。成人体重按70kg计算，临床剂量为0.69g生药/kg·d。

本发明公开了以下技术效果：

本发明在传统青蒿鳖甲汤方剂基础上进行调整，采用简单的制备工艺制备得到了治疗效果好、安全性高的青蒿鳖甲颗粒，具有良好的解热效果。经口给予大鼠3个月毒性试验以及急性毒性试验显示，本发明制备的青蒿鳖甲颗粒安全无毒性。

本发明的青蒿鳖甲颗粒可用于解热以及治疗营热阴伤证等，制备方法简单，颗粒剂型便于携带，服用更加方便。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为青蒿鳖甲提取液中芒果苷液相色谱图；

图2为芒果苷对照品液相色谱图；

图3为青蒿鳖甲提取液中知母皂苷BⅡ液相色谱图；

图4为知母皂苷BⅡ对照品液相色谱图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明中所述的“份”如无特别说明，均按重量份计。

实施例1

一种青蒿鳖甲颗粒，原料配比如下：

青蒿9g，知母6g，桑叶6g，鳖甲15g，牡丹皮6g，天花粉6g。

制备方法如下：

将上述原料加水回流提取3次，每次提取时间1h：第一次加14倍质量的水，其余两次加12倍质量的水；将提取液过滤，合并滤液，将得到的滤液在60℃浓缩得到密度为1.10g/mL的稠浸膏，然后将该稠浸膏经喷雾干燥得到干浸膏(干粉状)，加入干浸膏质量0.3％的三氯蔗糖，之后采用一步制粒法加入糊精进行制粒，糊精与干浸膏的质量比为1:1，制粒过程中保持物料温度为45℃，雾化压力0.2Pa，制得青蒿鳖甲颗粒。

实施例2青蒿鳖甲颗粒的中试制备

一种青蒿鳖甲颗粒，原料配比如下：

青蒿18kg，知母12kg，桑叶12kg，鳖甲30kg，牡丹皮12kg，天花粉12kg。

制备方法如下：

将上述原料加水回流提取3次，每次提取时间1h：第一次加14倍质量的水，其余两次加12倍质量的水；将提取液过滤，合并滤液，将得到的滤液在70℃浓缩得到密度为1.08g/mL的稠浸膏，然后将该稠浸膏经喷雾干燥得到干浸膏(干粉状)，加入干浸膏质量0.1％的三氯蔗糖，之后采用一步制粒法加入糊精进行制粒，糊精与干浸膏的质量比为1:1，制粒过程中保持物料温度为50℃，雾化压力0.2Pa，制得青蒿鳖甲颗粒。

实施例3青蒿鳖甲颗粒的中试制备

一种青蒿鳖甲颗粒，原料配比如下：

青蒿6kg，知母4kg，桑叶4kg，鳖甲10kg，牡丹皮4kg，天花粉4kg。

制备方法如下：

将上述原料加水回流提取3次，每次提取时间1h：第一次加14倍质量的水，其余两次加12倍质量的水；将提取液过滤，合并滤液，将得到的滤液在65℃浓缩得到密度为1.13g/mL的稠浸膏，然后将该稠浸膏经喷雾干燥得到干浸膏(干粉状)，加入干浸膏质量0.5％的三氯蔗糖，之后采用一步制粒法加入糊精进行制粒，糊精与干浸膏的质量比为1:1，制粒过程中保持物料温度为48℃，雾化压力0.2Pa，制得青蒿鳖甲颗粒。

实施例4原料的常温吸水量与高温吸水量

(1)原料的常温吸水量

按处方称取各药味(青蒿9g，知母6g，桑叶6g，鳖甲15g，牡丹皮6g，天花粉6g)，共计48g，加入水480ml，常温放置，每隔1h量取药液体积，结果见表1。

表1常温吸水量结果

(2)原料的高温吸水量

按处方称取各药味(青蒿9g，知母6g，桑叶6g，鳖甲15g，牡丹皮6g，天花粉6g)，共计48g，加水480ml，加热沸腾后停止加热，每隔0.5h量取药液体积，结果见表2。

表2高温吸水量结果

根据上述结果可以看出，青蒿鳖甲处方的吸水量为两倍，故在制备过程中，第一次煎煮多加两倍水。

实施例5提取工艺影响

(1)提取工艺设计

选取知母中芒果苷和知母皂苷BⅡ为评价指标，采用L₉(3⁴)正交表，对影响水提取工艺的溶媒用量、提取时间和提取次数进行考察。

按照青蒿、知母、桑叶、鳖甲、牡丹皮与天花粉质量比9:6:6:15:6:6称取原料药材工120g，平均分成18份，进行水提取工艺研究，正交实验因素表见表3。按L₉(3⁴)正交表进行提取，正交实验表如表4所示，每组实验平行两份实验，提取液滤过滤，合并各次滤液，混匀，准确量取体积，备用。

表3提取工艺正交实验因素水平表

表4提取工艺正交实验表

(2)提取正交实验的出膏率结果

精密移取上述试验的提取液适量，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称定重量，结果见表5。

表5正交实验出膏率结果

(3)提取正交实验的含量结果

a.芒果苷含量测定色谱条件：

检测波长：258nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃，流动相：乙腈(A)-0.2％冰醋酸(B)等度洗脱(10:90)。

供试品溶液的制备：

精密量取18组水提正交提取液适量，置25ml容量瓶中加无水乙醇至刻度，超声30min，放置室温，加50％乙醇至刻度摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：

取芒果苷对照品1.30mg，加入10ml容量瓶，甲醇定容得0.130mg/ml芒果苷对照品溶液。

测定法：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

青蒿鳖甲提取液中芒果苷含量测定的液相色谱图见图1；芒果苷对照品液相色谱图见图2。

正交实验中芒果苷含量转移率结果见表6。

表6正交实验芒果苷含量转移率结果

b.知母皂苷BⅡ苷含量测定色谱条件：

流速：1.0mL/min；柱温：30℃，蒸发光漂移管温度105℃，气体流速2.7ml/min，乙腈(A)-水(B)22:78等度洗脱。

供试品溶液的制备：

精密量取提取液，按照生药量0.2g的提取液于蒸发皿80℃蒸干，用30％丙酮复溶后转移至10ml量瓶中，加30％丙酮至刻度，摇匀，将滤液以6000r/min离心5min，取上清液，即得。

对照品溶液的制备：

取知母皂苷BⅡ对照品4.21mg，加入10ml容量瓶，甲醇定容得0.421mg/ml知母皂苷BⅡ对照品溶液。

测定法：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

青蒿鳖甲提取液中知母皂苷BⅡ含量测定的液相色谱图见图3；知母皂苷BⅡ对照品液相色谱图见图4。

正交实验中知母皂苷BⅡ含量转移率结果见表7。

表7知母皂苷BⅡ含量转移率结果

(4)正交实验结果分析

以芒果苷含量转移率和知母皂苷BⅡ含量转移率对水提取正交实验进行分析，方差分析结果见表8-9。

表8芒果苷方差分析表

表9知母皂苷BⅡ方差分析表

从表中可知，芒果苷9组正交数据结果显示，芒果苷最佳提取工艺为A3B1C3，知母皂苷最佳提取工艺为A3B2C3，且无显著性差异，以芒果苷和知母皂苷BⅡ转移率为指标对工艺1(A3B1C3)和工艺2(A3B2C3)进行正交结果验证。

(5)正交实验结果验证

根据上述的正交结果分析进行实验验证，每个工艺进行三次平行实验。以芒果苷转移率和知母皂苷BⅡ为评价指标，实验结果见表10和11。

表10芒果苷转移率实验验证结果

表11知母皂苷BⅡ转移率实验验证结果

由上述可以看出，芒果苷工艺验证1实验中转移率最高，芒果苷在工艺1(12倍水，每次提取1h，提取3次)提取率最高；知母皂苷BⅡ在工艺1和工艺2两组条件下转移率分别为57.68％，56.18％，检验无显著性差异。

实施例6浓缩工艺影响

(1)浓缩温度

按处方比例称取药材，以实施例5中最佳提取工艺1进行提取，合并提取液等分为6份，对提取液进行减压浓缩，浓缩温度考察设置为60℃，70℃，80℃，考察不同温度条件下浓缩对有效成分的影响。

芒果苷含量测定色谱条件：

检测波长：258nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃，流动相：乙腈(A)-0.2％冰醋酸(B)等度洗脱(10:90)。

供试品溶液的制备：

精密量取提取液适量于25ml容量瓶中，加入乙醇至刻度，称定重量，超声30min，放置室温，称重补重，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：

称取芒果苷，配制为约0.15mg/ml的对照品溶液，备用。

测定法

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

不同浓缩温度下芒果苷含量转移率见表12。

表12不同浓缩温度下芒果苷含量转移率

知母皂苷BⅡ苷含量测定色谱条件：

流速：1.0mL/min；柱温：30℃，蒸发光漂移管温度105℃，气体流速2.7ml/min，乙腈(A)-水(B)22:78等度洗脱。

供试品溶液的制备：

精密量取提取液适量，于蒸发皿80℃蒸干，用30％丙酮复溶后转移至10ml量瓶中，加30％丙酮至刻度，摇匀，续滤液6000r/min，离心5min，取上清液，即得。

对照品溶液的制备：

取知母皂苷BⅡ对照品适量，加甲醇定容制浓度约为0.4mg/ml知母皂苷BⅡ对照品溶液。

测定法：

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

不同浓缩温度下知母皂苷BⅡ含量转移率见表13。

表13不同浓缩温度下知母皂苷BⅡ含量转移率结果

从浓缩温度数据可知，芒果苷和知母皂苷BⅡ在60℃、70℃条件下损失率较低，80℃条件下芒果苷和知母皂苷BⅡ损失率较高，故选择60-70℃进行浓缩。

(2)浓缩密度

按处方比例称取药材，以实施例5最佳提取工艺1进行提取，合并提取液等分为8份，在60-70℃进行减压浓缩，浓缩密度考察设置为1.05g/mL，1.10g/mL，1.15g/mL，1.20g/mL。

芒果苷、知母皂苷BⅡ含量测定方法同实施例6(1)部分。

不同浓缩密度下芒果苷含量转移率见表14，知母皂苷BⅡ含量转移率见表15。

表14不同浓缩密度下芒果苷含量转移率结果

表15不同浓缩密度下知母皂苷BⅡ含量转移率结果

从浓缩密度数据可知，芒果苷、知母皂苷BⅡ在1.05-1.20范围内，转移率基本一致，该密度范围内稳定性良好。

实施例7干燥工艺影响

按处方比例称取药材，以实施例5最佳提取工艺1进行提取后，减压浓缩至一定相对密度，考察微波干燥、真空干燥、喷雾干燥对主要成分的影响(每种条件下进行两组平行实验)。

微波干燥：将浓缩后的稠浸膏放于微波干燥器中进行微波干燥，微波功率500W，干燥4h后取出干浸膏，共得到45.13g和44.29g干浸膏，备用。

真空干燥：将浓缩后的稠浸膏放于真空干燥箱中，60℃真空干燥18h后取出干浸膏，共得到49.38g和49.79g干浸膏，备用。

喷雾干燥：将浓缩后的两份稠浸膏进行喷雾干燥，先对稠浸膏进行加热，过100目筛，测定密度1.08(40℃)，进风口温度为160℃，出风口温度为80℃，空气流速为4m/s，备用。

采用HPLC测试不同干燥方式有效成分的含量。芒果苷、知母皂苷BⅡ含量结果见表16。

表16不同干燥方式芒果苷、知母皂苷BⅡ含量

从干燥方式数据可知，芒果苷及知母皂苷BⅡ在微波干燥和真空干燥条件下损失较大，喷雾干燥条件有效成分含量较高。

实施例8制粒工艺影响

本发明的处方药液味道苦涩难以下咽，且咽服后舌头有明显酸苦感，故需考虑加入适量的矫味剂，以改善制剂口感，提高患者用药顺应度。在矫味剂的选择上，考察了三氯蔗糖、阿斯巴甜，因加入阿斯巴甜后的药液滋腻感较重，因此舍去阿斯巴甜，对三氯蔗糖用量进行筛选，结果见表17。

表17甜味剂的种类及用量的筛选

从表18可知，2号样品的接受程度较好，确定矫味方案为加入颗粒量0.3％的三氯蔗糖，其甜度适宜。

实施例9制粒工艺影响

一步制粒参数设置：调节进风口温度为80℃～100℃，使得物料温度控制在50℃左右，风机频率24～30Hz吹起物料，使物料保持较好的流动性。出现结块，要增大风机频率，使物料恢复流动性。供液速度初期要快，易于粒子的形成，后期减缓。物料(糊精)：干浸膏(稠浸膏蒸干所得干粉)＝1:1。

按照上述参数进行实验，制粒完成后，将颗粒状态较好。

综上，青蒿鳖甲颗粒一步制粒参数如下：进风口温度80℃～100℃，物料温度45℃～50℃，雾化压力0.2Pa。

实施例10青蒿鳖甲颗粒的药效学实验

A.青蒿鳖甲颗粒对2，4-二硝基苯酚致大鼠发热的解热作用

1.实验动物：SD大鼠，SPF级，48只，雌雄各半，6-8周龄，体重(221±18)g。购自重庆医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK(渝)2018-0003。

2.动物饲养环境：屏障环境，温度20-21℃，相对湿度46-58％，12h/12h昼夜明暗交替。实验动物使用许可证号：SYXK(川)2020-225。

饲料：鼠全价饲料，购自成都达硕实验动物有限公司。

饮水：灭菌水，装入饮水盒中动物自由饮用。

3.实验开始后，48只动物按体温随机分层分组如下：

正常对照组(Control组，C，NS灌胃+NS皮下注射)：8只。

模型对照组(Model组，Mo，NS灌胃+模型)：8只。

阳性对照组(LBQ组，L，氯丙嗪灌胃+模型)：8只。

青蒿鳖甲颗粒高剂量组(QH-H，QH，青蒿鳖甲颗粒高剂量灌胃+模型)：8只。

青蒿鳖甲颗粒中剂量组(QH-M，QM，青蒿鳖甲颗粒中剂量灌胃+模型)：8只。

青蒿鳖甲颗粒低剂量组(QH-L，QL，青蒿鳖甲颗粒低剂量灌胃+模型)：8只。

4.皮下注射2，4-二硝基苯酚致大鼠发热模型

配制造模用2，4-二硝基苯酚溶液：将2，4-二硝基苯酚溶于生理盐水中，得到3.4mg/mL的溶液。

方法：给药第5d，除正常对照组外，其余各组大鼠在自然清醒的状态下按5mL/kg剂量于背部皮下注射3.4mg/mL的2，4-二硝基苯酚溶液，全程无菌操作。正常对照组同法注射等量生理盐水。

5.给药剂量与疗程

各组大鼠按表18给予不同药物灌胃，1次/d，连续5d，其中第5d为造模后灌胃给药。

表18动物给药剂量表

6.观测指标

a.大鼠一般情况观察：每日观察动物的一般状态(呼吸情况、自主运动情况、唾液分泌、竖毛、排小便、排大便、皮肤)，实验期间各组大鼠均未出现异常。

b.体重测量：

给药第1d和末次给药(给药第5d)测量大鼠体重并记录，比较各组差异。大鼠体重变化见表19。

表19大鼠体重变化表(g，

)

与正常对照组比较，模型对照组大鼠体重无明显差异(P>0.05)。与模型对照组比较，各组大鼠体重无明显差异(P>0.05)。

c.体温测量

实验前测肛温，1日1次，连续3d，以平均值作为基础肛温。测量注射2，4-二硝基苯酚后1、2、3、4、5h动物的肛温，计算各组动物在给药后不同时间的体温上升值，比较各组差异，结果见表20。

表20大鼠体温变化表(℃，

)

造模后1h，与正常对照组比较，模型对照组大鼠体温升高(P<0.0000)。与模型对照组比较，阳性对照组大鼠体温降低(P<0.001)；青蒿鳖甲颗粒高剂量组大鼠体温降低(P<0.001)；其余各组大鼠体温均无明显差异(P>0.05)。

造模后2h，与正常对照组比较，模型对照组大鼠体温升高(P<0.05)。与模型对照组比较，阳性对照组大鼠体温降低(P<0.001)；青蒿鳖甲颗粒高剂量组大鼠体温降低(P<0.05)；其余各组大鼠体温均无明显差异(P>0.05)。

造模后3h，与正常对照组比较，模型对照组大鼠体温升高(P<0.01)。与模型对照组比较，阳性对照组大鼠体温降低(P<0.001)；青蒿鳖甲颗粒高剂量组大鼠体温降低(P<0.01)；青蒿鳖甲颗粒中剂量组大鼠体温降低(P<0.05)；其余各组大鼠体温均无明显差异(P>0.05)。

造模后4h，与正常对照组比较，模型对照组大鼠体温升高(P<0.05)。与模型对照组比较，阳性对照组大鼠体温降低(P<0.001)；青蒿鳖甲颗粒高剂量组大鼠体温降低(P<0.05)；其余各组大鼠体温均无明显差异(P>0.05)。

造模后5h，与正常对照组比较，模型对照组大鼠体温无明显差异(P＞0.05)。与模型对照组比较，各组大鼠体温均无明显差异(P>0.05)。

7.血清中TNFα、IL-1β、PGE2含量检测

最后一次测温后，大鼠腹主动脉采血，3000r·min^-1离心10min，取上清液，-20℃保存，备用。按试剂盒方法分别测定血清中TNFα、IL-1β、PGE2含量，结果见表21。

表21大鼠血清中TNFα、IL-1β、PGE2含量变化表(pg/mL，

)

与正常对照组比较，模型对照组大鼠血清中TNFα、IL-1β、PGE2含量无明显差异(P＞0.05)。与模型对照组比较，各组大鼠血清中TNFα、IL-1β、PGE2含量无明显差异(P＞0.05)。

实施例11青蒿鳖甲颗粒经口给予大鼠3个月毒性实验

1.实验动物

SD大鼠120只，许可证编号：SCXK(京)2016-0006，70-90g(4-5周龄)。

2.动物分组

设置4个组别，空白对照组(灌胃给予等体积实验动物饮用水)和给药3个剂量组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)。适应期结束之日称未禁食体重，采用分层随机法，根据此体重每5g分层对纳入试验的120只大鼠按性别分别进行分组，参考“SOP-1-TQ030实验动物的随机分组”。将120只大鼠随机分为4组，每组大鼠30只，雌雄各15只。为便于毒性试验评价，供试品为未添加辅料的干浸膏(干膏粉)，每g干浸膏药粉相当于5.03g生药。

其中，3个给药剂量，配制浓度、给药体积、剂量和临床剂量倍数见表22。

表22

3.给药途径与方法

给药途径：经口给予(灌胃)。与临床给药途径一致。

给药浓度：低、中、高剂量组分别给予0.114、0.229、0.457g干膏粉/ml，对照组给予等体积实验动物饮用水。

给药体积:15ml/kg/次。给药期每次称量未禁食体重后的次日按照新的体重给予相应体积的药液/实验动物饮用水。

给药频率:每日给药1次，每周给药7天。

给药时间:每日上午(配药后至少放置1h方可给药)。

给药期：检疫适应8天后，称体重、分组。分组后次日给药。

给药首日为给药期第1天(D1)，♂动物连续给药91天，♀动物连续给药92天。

恢复期：给药结束后，♀♂大鼠均取部分动物准备剖检，剩余动物次日开始进入恢复期。恢复期期间不给药，持续28天。

期限选择依据：青蒿鳖甲颗粒临床疗程15天，功效养阴透热，适应症为温病后期，邪伏阴分证，夜热早凉，热退无汗，舌红苔少，脉细数。按照相关指导原则要求，进行大鼠3个月长期毒性试验支持药物上市申请。

4.一般状态观察:

给药期内每次给药后观察动物，记录动物的一般状况、毛色、活动、步态、神态、大便、尿液等。观察有无中毒症状发生，及发生的时间和持续时间、恢复情况，记录死亡或濒死动物。恢复期每天观察一次。

整个试验期间，各组雌雄动物均未见明显的变化，动物活动、步态等均基本正常，口、鼻、眼无异常分泌物，未见呼吸困难等异常改变，未见呕吐和腹泻等胃肠道反应，均无大鼠发生死亡。

5.体重和摄食量观察

测定方法：于给药第一日每笼定量添加饲料；前4周每周称2次，每笼定量添加饲料；之后的给药期和恢复期，每周一次称量每笼剩余饲料量，视动物进食情况，及时定量补充饲料，计算每笼饲料消耗量g(添加饲料总量-剩余饲料量)，除以每笼动物数和天数，即得该笼平均摄食量(g饲料/鼠日)。

测定频次：给药期：D1、D3、D7、D10、D14、D17、D21、D24、D28、D35、D42、D49、D56、D63、D70、D77、D84、D91；恢复期：D7、D14、D21、D28。

在给药期和恢复期，青蒿鳖甲颗粒各剂量组雌、雄大鼠的体重均呈现不同程度的增长趋势，未出现负增长现象。

给药3个月和恢复期，与对照组比较，青蒿鳖甲颗粒各剂量组雌雄大鼠的体重均未见明显差异。给药3个月和恢复期，与对照组比较，青蒿鳖甲颗粒各剂量组雌雄大鼠的摄食量均未见明显差异。

6.眼科检查

检测指标：①眼外观检查：包括眼睑、眼眶、眼球形态和泪腺区。②眼前节检查：包括结膜、角膜、瞳孔、前房和房水。

给药3个月和恢复期处死动物前由病理部人员进行眼科检查，检查结果均未见异常。

7.尿液检查

尿样收集：给药期D91(♂)、D92(♀)，恢复期D28，将大鼠传送至代谢间(动物实验室五)，单只放入代谢笼中，禁食15-16h，自由饮水，收集大鼠15-16h尿液。

尿液收集时间为16:00-17:00～次日7:00-8:00。

检测指标：①尿量(ml)：(代谢后尿杯重量-代谢前空尿杯重量)/尿液比重。全自动尿液分析工作站采用折射光度法测定尿液比重，尿液比重参考该检测值。

②饮水量(ml)：代谢后水瓶重量-代谢前定量加水的水瓶重量(水的比重按1g/ml计算)。

③尿液性状：观察和记录每只大鼠尿液的颜色和澄清度。

④尿液检测(干化学分析)：胆红素(BIL)、尿胆原(UBG)、酮体(KET)、维生素C(ASC)、葡萄糖(GLU)、蛋白质(PRO)、潜血(BLD)、pH值(pH)、亚硝酸盐(NIT)、白细胞(LEU)、比重(SG)。

青蒿鳖甲颗粒恢复期，高剂量组雄性大鼠的尿量、饮水量与对照组比较均明显增加，但给药期3个剂量组雌雄大鼠的尿量和饮水量与对照组比较均未见明显差异。给药期和恢复期均未见肾脏等相关脏器的病理改变，且尿量和饮水量的数值在同种属同性别动物的背景值范围内。

3个剂量组雌雄大鼠的尿液颜色在给药3个月均有一定程度的加深，♀大鼠出现红色至棕色的改变，高剂量组加深明显，可能与受试物中一些有颜色的水溶性小分子物质溶解在尿液中有关，恢复期雌雄大鼠基本恢复为正常尿液颜色，认为无明确的毒理学意义。尿液中其他有改变的指标，KET和BLD降低无毒理学意义，pH升高仍在正常值范围内(均值6.8)，认为无明确的毒理学意义。

8.血液学检测(血象)

样本类型：EDTA-2K抗凝血，当日测定。

检测指标：红细胞计数(RBC)、红细胞比积(HCT)、平均红细胞容量(MCV)、红细胞体积分布宽度(RDW)、血红蛋白(HGB)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数(PLT)、血小板比积(PCT)、平均血小板体积(MPV)、血小板分布宽度(PDW)、白细胞计数(WBC)、白细胞分类(其中LYM为淋巴细胞，NEUT为中性粒细胞，MONO为单核细胞)、网织红细胞百分比(RET％)、网织红细胞计数(RET)。

9.血液学检测(凝血指标)

样本类型：血浆，当日测定。

检测指标：凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。

青蒿鳖甲颗粒高剂量组给药3个月对♀♂大鼠的外周血中的RET％和RET有一定的升高影响，但骨髓象分析结果显示，仅♂大鼠可见早幼红细胞的明显降低，中/晚幼红细胞变化不明显，♀大鼠早/中/晚幼红细胞变化均不明显。外周血中RET指标的改变未见与骨髓象的一致性，外周血中红细胞和血红蛋白相关指标亦未见明显贫血现象。综合分析认为青蒿鳖甲颗粒给药3个月未见有明确毒理学意义的骨髓象改变。恢复期后，上述有改变的指标均恢复，未见迟发性毒性反应。

10.血液生化学检测(常规指标)

样本类型：血清，当日测定。

检测指标：血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、γ-谷氨酰基转肽酶(GGT)、尿素(UREA)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)、总胆红素(TBIL)、总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、肌酸激酶(CK)。

与对照组比较，青蒿鳖甲颗粒灌胃给予大鼠给药3个月，可见♀大鼠高剂量组TP的降低(-8％)和GGT的升高(+93％)，但均未见明确的量效关系，且TP的降低不大，GGT的升高幅度虽较大，但未见其他如ALT、AST、TBIL、ALP等相关生化指标的改变。亦未见肝脏的病理形态学改变。认为毒理学意义不明确。

恢复期♂大鼠K⁺降低不排除与尿量增加有关。机体饮水量增加导致血容量增加，为维持渗透压的平衡，肾小管重吸收减少使尿量增加，远端肾小管的Na⁺离子增加，从而通过Na⁺-K⁺交换使尿液中K+浓度升高，血液中K⁺浓度降低。但饮水量的增加数值仍在本中心背景数值内，尿量亦在正常值的范围内，K⁺的含量的降低未见明显的量效关系。认为毒理学意义不明确。

其余有统计学意义的指标，如♂大鼠TBIL、CHO的降低，♀大鼠TBIL的降低等无明确的临床意义，无毒理学意义。

11.病理学检查

系统尸检(大体病理观察):放血处死动物后，体表检查动物体质、发育和营养状况等。肉眼观察动物外表、所有孔窍、头颅、胸腹腔及其内的脏器，包括但不限于脑、唾液腺、甲状腺、胸腺、肺及支气管、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、睾丸、附睾、卵巢、子宫、胃、十二指肠、小肠(空肠、回肠)、大肠(结肠、直肠)、盲肠、膀胱、胸骨、股骨、眼球、视神经、胰腺等，记录是否有异常情况。

脏器重量与系数:对以下脏器：心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脑、胃、♂睾丸、♂附睾、♀卵巢、♀子宫称重。按照每只动物的禁食体重，计算脏器重/体重系数(脏体系数，g脏器/100g体重)；按照每只动物的脑重，计算脏器重/脑重系数(脏脑系数，g脏器/g脑重)：

青蒿鳖甲颗粒给药3个月，♂大鼠高剂量组可见胃体系数的升高，♀大鼠可见中、高剂量组胃重量、胃体系数和胃脑系数的升高。上述胃脏器重量及系数的改变可能与本次试验给药体积较大(15ml/kg)、浓度较为粘稠有关，恢复期上述指标均恢复，无明确的毒理学意义。

大鼠经口反复给予青蒿鳖甲颗粒3个月，在8.6、17.3和34.5g生药/kg体重的3个剂量给药条件下，对给药3个月和停药后1个月的恢复期动物进行了肉眼的大体检查和显微镜下的组织病理学检查，未见明显毒性损伤作用。

实施例12青蒿鳖甲颗粒急性毒性实验

1.实验动物

ICR小鼠120只，♂60♀60只。

2.动物分组

设6组：对照组(灌胃给予等体积实验动物饮用水)和5个剂量的给药组，5个剂量的配制浓度、给药体积、剂量和临床剂量倍数见表23。

表23

分组体重情况如表24(g，均值±标准差)：

表24

3.给药途径与方法

给药途径：经口给予(灌胃)。与临床给药途径一致。

给药浓度：青蒿鳖甲颗粒各给药组给予相应浓度的药液，对照组给予等体积实验动物饮用水。

给药体积：40ml/kg/次。

给药频率：1次/天给药。

给药时间：禁食体重分组后当天给药。

试验阶段及期限选择依据：参照“药物单次给药毒性研究技术指导原则”(CFDA2014-5-13发布)，单次给药后连续观察2周。以给药当日为D0，次日为D1，观察至D14，于D15对存活动物进行剖检。

4.一般状态观察

给药后，密切观察动物毒性反应，给药后进行密切观察至少2h。给药当日上下午均观察，之后每天1次观察动物，记录动物的一般状况、毛色、活动、步态、神态、大便、尿液等。观察有无中毒症状发生，及发生的时间和持续时间、恢复情况，记录死亡或濒死动物。

(1)给药后观察期间，对照组未见毒性反应。

(2)供试品在给药后的毒性反应症状：青蒿鳖甲颗粒以134.40、107.52、86.02、68.81和55.05g生药/kg，40ml/kg给药体积，1次/天经口给予小鼠，首次给药后可观察到动物的主要毒性反应为腹泻，未见恶心、呕吐、流涎、流泪、抽搐、惊厥、呼吸增快或呼吸困难等症状。给药后40min各组动物陆续出现腹泻症状，上述5个剂量组的腹泻发生率分别为50％(♂6/10，♀4/10)、10％(2/10，0/10)、10％(1/10，1/10)、0％和0％，腹泻动物除134.40g生药/kg剂量组1只雌性动物外，其余均在给药当天下午第2次观察时(约给药后4.5h)恢复正常，给药当天未恢复的动物在给药D1恢复正常。

(3)死亡：134.40g生药/kg剂量组有1只雌性动物于给药后1.5h内死亡，其余各组未出现动物死亡。死亡的动物在死亡前的表现主要为少动、静卧至俯卧、翻正反射消失至死亡，未见兴奋、惊厥、抽搐、震颤等症状，上述症状的发生可能与中枢神经系统存在一定的相关性。对死亡小鼠及时进行剖检，大体观察均可见双肺粉色、药液均在胃中，未发现食管气管破裂等，可排除灌胃意外导致死亡；其余主要脏器颜色、质地、大小、位置等均未见明显异常。此后直至观察期14天结束，存活动物的一般情况、活动、步态、呼吸、进食、饮水、二便、皮毛等均未见异常。

5.体重

给药后观察期间定期称未禁食体重。

给药后D1、D2、D3、D5、D8、D11、D14称量动物未禁食体重。

♂：给药后第1天，与对照组比较，青蒿鳖甲颗粒134.40g生药/kg剂量组动物体重明显降低(P＜0.01)，有统计学显著性意义；其他时间点各剂量组动物和对照组比较体重稍有升降(幅度均在±6％以内)，差异均无统计学显著性意义(P>0.05)。

♀：各给药组体重在所有时间点和对照组比较均仅见轻微差异(幅度在±6％以内)，差异无统计学显著性意义(P>0.05)。

6.摄食量

测定方法：每笼加定量饲料(200g/笼)，一定时间后称剩余饲料，每次称剩余饲料后继续加定量饲料(200g/笼)。计算每笼饲料消耗量，除以每笼动物数和相隔天数，即得该笼平均摄食量(g饲料/鼠日)。

测定频次：

给药当天(D0)给药结束后1.5小时定量添加饲料。

给药后D1、D2、D3、D5、D8、D11称剩余饲料量后定量添加饲料。

给药后D14称剩余饲料后不再定量添加饲料。

对小鼠体重和摄食量综合分析显示，青蒿鳖甲颗粒134.40g生药/kg剂量组动物体重在给药后D1明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，摄食量未见显著性差异，可能与动物给药后腹泻，导致体重快速减低有关。D2后动物各种状态未见明显异常。因此，该动物体重值降低属于给药初期的一过性反应。

7.观察期结束时的处理

禁食：D14称体重和剩余饲料后，下午停食不停水。

禁食体重：停食次日(禁食时间16h)，称禁食体重，动物传送至解剖间进行处死，至剖检结束禁食时间为17.5h。

处死方式：脱颈椎处死。

处死后检查：进行大体病理观察，观察各脏器(包括但不限于心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、胃、肠、睾丸、前列腺、卵巢、子宫)的变化，如果发现器官出现体积、颜色、质地等改变时，则对改变的器官用10％福尔马林固定，用石蜡包埋、切片，采用HE(Haematoxylin&Eosin)染色，用显微镜进行组织病理学检查。

所有存活动物肉眼观察未见明显异常，免去组织固定和病理组织学检查。

8.试验期间死亡和濒死动物的检查

给药后发现动物死亡，及时剖检，进行大体病理观察。

14天观察期结束，解剖后肉眼观察，动物胸、腹腔未见渗液、出血和粘连，心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胃肠、膀胱、睾丸、附睾等均未见充血、瘀血、出血、渗液、粘连、糜烂、溃疡等肉眼可见的病变。

给药后1只雌性动物死亡，剖检未发现异常。

青蒿鳖甲颗粒对小鼠的最大耐受剂量为107.52g生药/kg，最大无毒剂量为68.81g生药/kg。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (1)

1.一种青蒿鳖甲颗粒的制备方法，其特征在于，所述青蒿鳖甲颗粒由以下重量配比的原料制成：

青蒿9份，知母6份，桑叶6份，鳖甲15份，牡丹皮6份和天花粉6份；

制备方法包括以下步骤：将所述原料加水进行回流提取，将提取液浓缩，然后经干燥、制粒，得到所述青蒿鳖甲颗粒；

所述回流提取进行3次，每次提取时间1h；

进行回流提取时，第一次加水量为原料总质量的14倍，其余两次加水量为原料总质量的12倍；

所述浓缩的温度为60℃，所述浓缩后的密度为1.10g/mL；

所述干燥为喷雾干燥；

所述制粒过程添加糊精，所述糊精与干燥后所得干浸膏的质量比为1:1；

在干燥后还包括添加矫味剂的步骤，所述矫味剂为三氯蔗糖，所述三氯蔗糖的添加量为干燥后所得干浸膏质量的0.3％。

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