CN103698419A - 八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法，包括以下步骤：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥24h的盐酸小檗碱对照品预定量，加1％的盐酸甲醇溶液制成每1mL含0.01mg的对照品溶液；取八味獐牙菜丸研细取2.5g，加1％的盐酸甲醇溶液预定量，回流加热1小时，将提取液过滤至100ml量瓶中，用1％的盐酸甲醇溶液洗涤残渣，稀释至刻度摇匀；取提取液5ml，置于氧化铝柱上；用乙醇洗脱，收集洗脱液，置25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度摇匀，取2ml至10ml量瓶中，用1％的盐酸甲醇溶液稀释至刻度摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，得供试品溶液；吸取对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪进行测定。
Description
技术领域
本发明涉及中成药成分检测技术领域，特别涉及一种八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法。
背景技术
藏医药是我国民族医药中的一大重要组成部分，是祖国医学中不可分割的一个重要部分。经过一千多年的发展及数代藏医名家的潜心研究与继承发扬，形成了具有独特的一派医药理论体系，对于防止疾病、改善和提高健康水平具有非常重要的作用。藏医药经过千百年的发展，形成和积累完善了治疗各种疾病的许多方剂，其中八味獐牙菜丸为较为著名的方药，具有清热，消炎。用于胆囊炎，初期黄疸性肝炎，疗效卓著，收载于《卫生部药品标准藏药分册第一册》，标准中制定了对小檗皮药材中盐酸小檗碱的鉴别项，但准确度低，灵敏度差，只是做了简单的定性，不能有效体现制剂的质量。
例如，现有技术中提供的检测方法：取本品粉末2g，加乙醚10ml，振摇1小时，滤过，残渣将乙醚挥干,加甲醇5ml振摇1小时，滤过,滤液作为供试品溶液；另取盐酸小檗碱对照品加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液作为对照品溶液；照薄层色谱法试验，吸取上述供试品溶液5μl和对照品溶液1μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以氯仿－甲醇－水(8:3:1)的下层溶液为展开剂，置氨蒸汽饱和的层析缸内，展开，取出，晾干,置紫外光灯(365nm)下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
然而，上述检测方法主要存在以下问题：展开时间长；准确度差，灵敏度低；定量效果差，专属性不强；受外界环境影响大，对显色剂喷雾的要求较高。
发明内容
有鉴于此，有必要提供一种准确、稳定、展开时间短的八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法。
一种八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法，包括以下步骤：
制定采用高效液相色谱法测定八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的色谱条件：流动相：用H3PO4调PH值至3的0.05mol.L-1磷酸二氢钠溶液、乙腈，其中，磷酸二氢钠溶液与乙腈的体积比为70：30；流速：1.0mL/min；检测波长：270 nm；柱温：室温；进样量10μL；
对照品溶液的制备：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥24h 的盐酸小檗碱对照品预定量，加1％的盐酸甲醇溶液制成每1mL含0.01mg的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取八味獐牙菜丸，研细，取2.5g，精密称定，加1％的盐酸甲醇溶液预定量，回流加热1小时，将提取液过滤至100ml量瓶中，用1％的盐酸甲醇溶液洗涤残渣，并稀释至刻度，摇匀；精密吸取上述提取液5ml，置于已处理好的氧化铝柱上，其中处理好的氧化铝柱是指将5g中性氧化铝进行湿法装柱，且内径0.9cm；用乙醇洗脱，收集洗脱液，置25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，至10ml量瓶中，用1％的盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的测定：吸取上述对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，并根据液相色谱仪显示的对应的峰表来计算出八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的含量。
上述八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法中，设置最优的色谱条件，并制备满足上述参数的对照品溶液、供试品溶液，吸取上述对照溶液和供试品溶液并注入液相色谱仪，并根据液相色谱仪显示的对应的峰表来完成八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测，故实现了高度自动化及保留时间短和检测时间快的目的；进一步的，上述色谱条件及满足上述参数的对照品溶液、供试品溶液可以保证测量结果准确度高、灵明度高，专属性强，定量效果好。
附图说明
附图1是一较佳实施方式的八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法流程图。
附图2是对照品溶液的HPLC色谱图。
附图3是供试品溶液的HPLC色谱图。
附图4是阴性对照品溶液的HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明提供的八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法是经过研发人员反复试验及理论验证后制定出最优参数的色谱条件、最优参数的对照品溶液、最优参数的供试品溶液，并通过高效液相色谱法实现八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的含量检测。以下具体描述本发明的技术方案：
请同时参看图1，一种八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法，包括以下步骤：
步骤S300， 制定采用高效液相色谱法测定八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的色谱条件：流动相：用H3PO4调PH值至3的0.05mol.L-1磷酸二氢钠溶液、乙腈，其中，磷酸二氢钠溶液与乙腈的体积比为70：30；流速：1.0mL/min；检测波长：270 nm；柱温：室温；进样量10μL。
步骤S301，对照品溶液的制备：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥24h 的盐酸小檗碱对照品预定量，加1％的盐酸甲醇溶液制成每1mL含0.01mg的对照品溶液。
步骤S302，供试品溶液的制备：取八味獐牙菜丸，研细，取2.5g，精密称定，加1％的盐酸甲醇溶液预定量，回流加热1小时，将提取液过滤至100ml量瓶中，用1％的盐酸甲醇溶液洗涤残渣，并稀释至刻度，摇匀；精密吸取上述提取液5ml，置于已处理好的氧化铝柱上，其中处理好的氧化铝柱是指将5g中性氧化铝进行湿法装柱，且内径0.9cm；用乙醇洗脱，收集洗脱液，置25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，至10ml量瓶中，用1％的盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
步骤S303，八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的测定：吸取上述对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，并根据液相色谱仪显示的对应的峰表来计算出八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的含量。其中，步骤S303具体为：吸取上述对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪；根据液相色谱仪显示的色谱图来判断峰表中峰面积的是否准确；在判断出峰表中峰面积准确时，根据峰表中盐酸小檗碱峰的峰面积计算出八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的含量。
上述八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法中，设置最优的色谱条件，并制备满足上述参数的对照品溶液、供试品溶液，吸取上述对照溶液和供试品溶液并注入液相色谱仪，并根据液相色谱仪显示的对应的峰表来完成八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测，故实现了高度自动化及保留时间短和检测时间快的目的；进一步的，上述色谱条件及满足上述参数的对照品溶液、供试品溶液可以保证测量结果准确度高、灵明度高，专属性强，定量效果好。
为了进一步说明八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法的测量结果准确度高、重现性好，以下给出实验实时过程描述及相关数据：
1 仪器与试剂
岛津LC-20AT高效液相色谱仪， 岛津SPD-20A紫外检测器；TU-1901双光束紫外可见分光光度计；电子分析天平 AB135-S （梅特勒-托利多仪器有限公司）电子分析天平；盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号110713-200208）；八味獐牙菜丸、阴性样品（宁夏多维药业有限公司）；乙腈（色谱纯，美国天地公司），水（去离子水），其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱：VP-ODS色谱柱（250mm×4.6mm）；流动相：0.05mol.L-1磷酸二氢钠（用H3PO4调PH至3）－乙腈（70：30）；流速：1.0mL/min；检测波长：270 nm；柱温：室温；进样量10μL。
2.2 溶液制备
对照品溶液的制备：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥24h 的八味獐牙菜丸对照品适量，加盐酸－甲醇（1：100）的溶液制成每1mL含0.01mg的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备：取重量差异项下的本品内容物，研细，取约2.5g，精密称定，加盐酸-甲醇(1:100)溶液适量，回流加热1小时，将提取液过滤至100ml量瓶中，用盐酸-甲醇(1:100)溶液洗涤残渣，并稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述提取液5ml，置于已处理好的氧化铝柱(内径约0.9cm，中性氧化铝5g，湿法装柱)上，用乙醇洗脱，收集洗脱液，置25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，至10ml量瓶中，用盐酸－甲醇(1:100)溶液 稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。2.2.3 阴性对照溶液的制备：取除小檗皮外的其他药材，按样品处方比例及制备工艺制成缺小檗皮的制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。
3 方法学考察
系统适用性试验：取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液，进行分析，结果见图2、图3、图4，其中，1为盐酸小檗碱色谱峰；盐酸小檗碱的保留时间约为10分钟，盐酸小檗碱与其他组分峰的分离度均大于1.5，阴性对照品溶液对测定无干扰。
线性关系考察：精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加盐酸－甲醇（1：100）溶液制成每1mL含盐酸小檗碱0.032mg的对照品溶液。精密吸取对照品溶液2，4，6，8，10mL，分别置10mL容量瓶中，加盐酸－甲醇（1：100）溶液至刻度，摇匀，各精密吸取10μL，分别注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积为纵坐标，以质量浓度为横坐标绘制标准曲线，盐酸小檗碱的线性回归方程为：y=1.55×108X－3.83×105 r=0.999 8（n=5），表明盐酸小檗碱 在0.0064～0.032 mg.mL-1范围内与峰面积线性关系良好。
稳定性试验： 吸取同一供试品溶液10μL，于0，2，4，8，12h进行测定。结果峰面积RSD=1.17%（n=5），结果表明供试品溶液在常温下12小时内稳定性良好。
精密度试验：精密吸取0.01mg/mL的对照品溶液10μL，连续进样6次。结果峰面积的RSD=0.54%（n=6）。表明仪器精密度良好。
重复性试验：取同一批样品6份，按供试品溶液制备方法，制备溶液并测定。结果盐酸小檗碱平均含量0.53mg/粒，RSD=1.02%（n=6）。
加样回收率试验：精密称取已知含量为 （2.21mg/g）的样品6份，分别按照所取供试品含量的80%，100%，120%准确加入盐酸小檗碱对照品溶液适量各2份，按供试品溶液制备方法制备溶液并测定，计算回收率，结果见表1。
表1 加样回收试验结果（n=6）
4 样品含量测定
按供试品溶液制备项下方法分别制得3批供试品溶液，分别精密吸取供试品溶液10μL，依次进样，测定。每批次供试品溶液测定3次，按测得的峰面积积分值取平均值，并按照如下计算公式计算出盐酸小檗碱的含量：含量=
，公式中 Ax为供试品溶液的峰面积；Ar为对照品溶液的峰面积；Cr为对照品溶液的浓度；
为平均丸重；V 为稀释倍数；W为称样量。计算结果见表2。
表2 样品中盐酸小檗碱含量测定结果（n=3）
Claims (2)
1.一种八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
制定采用高效液相色谱法测定八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的色谱条件：流动相：用H3PO4调PH值至3的0.05mol.L-1磷酸二氢钠溶液、乙腈，其中，磷酸二氢钠溶液与乙腈的体积比为70：30；流速：1.0mL/min；检测波长：270 nm；柱温：室温；进样量10μL；
对照品溶液的制备：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥24h 的盐酸小檗碱对照品预定量，加1％的盐酸甲醇溶液制成每1mL含0.01mg的对照品溶液；
供试品溶液的制备：取八味獐牙菜丸，研细，取2.5g，精密称定，加1％的盐酸甲醇溶液预定量，回流加热1小时，将提取液过滤至100ml量瓶中，用1％的盐酸甲醇溶液洗涤残渣，并稀释至刻度，摇匀；精密吸取上述提取液5ml，置于已处理好的氧化铝柱上，其中处理好的氧化铝柱是指将5g中性氧化铝进行湿法装柱，且内径0.9cm；用乙醇洗脱，收集洗脱液，置25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，精密吸取2ml，至10ml量瓶中，用1％的盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液；
八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的测定：吸取上述对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，并根据液相色谱仪显示的对应的峰表来计算出八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的含量。
2.如权利要求1所述的八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的检测方法，其特征在于：在“八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的测定”的步骤具体为：
吸取上述对照溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪；
根据液相色谱仪显示的色谱图来判断峰表中峰面积是否准确；
在判断出峰表中峰面积准确时，根据峰表中盐酸小檗碱峰的峰面积计算出八味獐牙菜丸中盐酸小檗碱的含量。
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