CN103695425A - 用于敲低Syntaxin16的小分子干扰RNA、重组载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于敲低Syntaxin16的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒和宿主细胞及其应用，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白Syntaxin16的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。本发明提供的重组慢病毒载体能通过转录得到Syntaxin16-shRNA；本发明提供的Syntaxin16-shRNA经过宿主细胞加工后可生成能沉默Syntaxin16表达的小分子干扰RNA；本发明提供的小分子干扰RNA能靶向突触融合蛋白Syntaxin16的mRNA，并导致所述mRNA降解，并导致基因沉默效应，降低Syntaxin16的表达水平。

Description

用于敲低Syntaxin16的小分子干扰RNA、重组载体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术以及生物医药领域，具体涉及一种用于敲低Syntaxin16的小分子干扰RNA、重组载体及其应用。

背景技术

Syntaxin16属于SNARE家族，SNARE在细胞囊泡运输过程中起着极其重要的作用，细胞囊泡运输又是细胞内及细胞间的物质运输的主要途径之一，所以研究SNARE家族蛋白如何控制囊泡融合是对研究各项细胞、组织、器官及生物体生命活动都有重要意义的，而研究Syntaxin16在信号通路中的作用有必要提供一种敲低Syntaxin16的表达水平的方法以及稳定敲低Syntaxin16的表达水平的细胞系。

RNA干扰（RNA interference,RNAi）可诱发的基因沉默。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种降低目标蛋白表达水平的有效途径。

因此，有必要提供一种采用RNA干扰技术对Syntaxin16进行基因沉默的方法以及一种稳定敲低Syntaxin16的表达水平的细胞系。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于敲低Syntaxin16的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒和宿主细胞及应用。

本发明提供的小分子干扰RNA能直接特异性靶向Syntaxin16的mRNA并导致mRNA降解，产生基因沉默效应；本发明提供的shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒能通过促使宿主细胞中Syntaxin16的mRNA降解间接地沉默Syntaxin16的表达，降低Syntaxin16的表达水平。

本发明涉及的英文缩写及其中文释义如下：

Syntaxin16：突触融合蛋白16，所述突触融合蛋白16的Genebank登录号为NM_001001433.2；

mRNA：信使RNA；siRNA：小分子干扰RNA；shRNA：短发夹RNA；

Syntaxin16-shRNA：具有靶向突触融合蛋白16的信使RNA的短发夹RNA；

第一方面，本发明提供了一种小分子干扰RNA，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白Syntaxin16的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。

优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21～27bp。

优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。

第二方面，本发明提供了一种shRNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。

优选地，本发明第二方面提供了的一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白Syntaxin16的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。

优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21～27bp。

优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。

第三方面，本发明提供了一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。

优选地，本发明第三方面提供了的一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白Syntaxin16的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。

优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21～27bp。

优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。

优选地，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。

具体地，在此优选条件下，所述SEQ ID NO:3（5’-3’）为：

CTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAGTTTTT；

所述SEQ ID NO:4（5’-3’）为：

AAAAACTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAG。

进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位点。

更进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位点分别为AgeⅠ和EcoRⅠ。

在此优选条件下，所述编码shRNA的DNA具有如SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列。

具体地，所述SEQ ID NO:5（5’-3’）为：

CTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAGTTTTT

所述SEQ ID NO:6（5’-3’）为：

AAAAACTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCT CAATTAG。

其中，双划线标识的碱基处为酶切位点，波浪线表示的序列为siRNA的正义链，单划线标识的序列为siRNA的反义链，斜体标识的序列为形成shRNA发卡时的环区序列。

优选地，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。

进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为人源的U6启动子或人源的H1启动子。

进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为鼠源的U6启动子或鼠源的H1启动子。

第四方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体为在所述重组载体为在pLKO.1质粒的多克隆位点、pEN-hH1c质粒的多克隆位点或pDSL-hpUGIP质粒的重组位点插入如第三方面所述的编码shRNA的DNA得到的重组载体。

优选地，本发明第四方面提供了的一种重组载体，所述重组载体为在所述重组载体为在pLKO.1质粒的多克隆位点、pEN-hH1c质粒的多克隆位点或pDSL-hpUGIP质粒的重组位点插入编码shRNA的DNA得到的重组载体，其中，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，其中，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白Syntaxin16的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。

优选地，所述pLKO.1质粒的多克隆位点为AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点。

优选地，所述pEN-hH1c质粒的多克隆位点为BamHI和XhoI酶切位点。

优选地，所述pDSL-hpUGIP质粒的重组位点为attR1和attR2，其中，attR1位于pDSL-hpUGIP质粒的2614～2738bp位点，attR2位于pDSL-hpUGIP质粒的4194～4318bp位点。

优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21～27bp。

优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。

优选地，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。

具体地，在此优选条件下，所述SEQ ID NO:3（5’-3’）为：

CTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAGTTTTT；

所述SEQ ID NO:4（5’-3’）为：

AAAAACTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAG。

进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位点。

更进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位点分别为AgeⅠ和EcoRⅠ。

在此优选条件下，所述编码shRNA的DNA具有如SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列。

具体地，所述SEQ ID NO:5（5’-3’）为：

CCGGCTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAGTTTTTG；

所述SEQ ID NO:6（5’-3’）为：

AATTCAAAAACTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAG。

在此优选条件下，将目的基因Syntaxin16-shRNA插入到慢病毒pLKO.1质粒的AgeⅠ和EcoRⅠ位点，得到pLKO.1-Syntaxin16-shRNA载体。

优选地，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。

进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为人源的U6启动子或人源的H1启动子。

进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为鼠源的U6启动子或鼠源的H1启动子。

本发明构建的pLKO.1-Syntaxin16-shRNA慢病毒载体具有很高的感染效率以及转录效率，载体上编码shRNA的DNA基因片段能通过重组作用插入宿主基因组，从而持续、稳定地沉默Syntaxin16的表达。

第五方面，本发明提供了一种重组慢病毒，是如第四方面所述重组载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2.G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。

优选地，本发明第五方面提供了的一种重组慢病毒，是重组载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2.G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒，其中，所述重组载体为在pLKO.1质粒的多克隆位点插入编码shRNA的DNA得到的重组载体，其中，所述shRNA具有小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列，所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白Syntaxin16的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。

优选地，所述pLKO.1质粒的多克隆位点为AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点。

优选地，所述pEN-hH1c质粒的多克隆位点为BamHI和XhoI酶切位点。

优选地，所述pDSL-hpUGIP质粒的重组位点为为attR1和attR2，其中，attR1位于pDSL-hpUGIP质粒的2614～2738bp位点，attR2位于pDSL-hpUGIP质粒的4194～4318bp位点。

优选地，所述小分子干扰RNA的长度为21～27bp。

优选地，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2所示。

优选地，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。

具体地，在此优选条件下，所述SEQ ID NO:3（5’-3’）为：

CTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAGTTTTT；

所述SEQ ID NO:4（5’-3’）为：

AAAAACTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAG。

进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端或3’端具有酶切位点。

更进一步优选地，所述SEQ ID NO:3和4所示的核苷酸序列的5’端的酶切位点分别为AgeⅠ和EcoRⅠ。

在此优选条件下，所述编码shRNA的DNA具有如SEQ ID NO:5或6所示的核苷酸序列。

具体地，所述SEQ ID NO:5（5’-3’）为：

CCGGCTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAGTTTTTG；

所述SEQ ID NO:6（5’-3’）为：

AATTCAAAAACTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAG。

在此优选条件下，将目的基因Syntaxin16-shRNA插入到慢病毒pLKO.1质粒的AgeⅠ和EcoRⅠ位点，得到pLKO.1-Syntaxin16-shRNA载体。

优选地，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。

进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为人源的U6启动子或人源的H1启动子。

进一步优选地，所述RNA聚合酶III启动子为鼠源的U6启动子或鼠源的H1启动子。

优选地，将本发明提供的pLKO.1-Syntaxin16-shRNA慢病毒表达载体和包装载体psPAX2以及包膜载体pMD2.G转染293T细胞进行慢病毒包装，即可得到所述重组慢病毒。

本发明通过将编码Syntaxin16-shRNA的DNA构建到慢病毒载体的多克隆位点之间或重组位点之间，得到重组慢病毒表达载体后，通过转染细胞、筛选稳定表达细胞系，可构建得到稳定表达的细胞系，实现目的基因稳定、长期的表达，非常适合于对Syntaxin16的RNA干扰研究。

此外，本发明提供的慢病毒载体还可连同慢病毒包装质粒一起侵染宿主细胞后，得到有活性的能够转录Syntaxin16-shRNA的重组慢病毒。所述重组慢病毒侵染宿主细胞后，能将编码Syntaxin16-shRNA的基因整合到宿主细胞基因组，有助于编码Syntaxin16-shRNA的基因稳定、长期地在宿主细胞内进行转录，从而得到小分子干扰RNA，对Syntaxin16的mRNA进行降解，并导致基因沉默效应，降低Syntaxin16的表达水平。

本发明提供的重组慢病毒不仅具有很高的感染效率，还具有更广泛的宿主范围，能侵染神经元、肌细胞、肝细胞、肿瘤细胞、内皮细胞等多种类型的细胞，又很少引发机体的免疫反应，应用范围十分广泛。

第六方面，本发明提供了一种宿主细胞，包括如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体和如第五方面所述的重组慢病毒中的至少一种。

优选地，所述宿主细胞为293T细胞或Hela细胞。

优选地，所述宿主细胞为稳定敲低Syntaxin16的表达水平的细胞系。

进一步优选地，所述宿主细胞为稳定敲低Syntaxin16的表达水平的Hela细胞系。

第七方面，本发明提供了一种如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或如第五方面所述的重组慢病毒在制备抑制突触融合蛋白Syntaxin16基因表达的药物中的应用。

本发明提供的所述小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒或宿主细胞及其应用具有如下有益效果：

本发明提供的编码shRNA的DNA构建到慢病毒载体的多克隆序列位点之间或重组位点之间可得到重组慢病毒载体，该重组慢病毒载体转染宿主细胞后，或连同慢病毒包装质粒一起侵染宿主细胞后，能将编码Syntaxin16-shRNA的基因整合到宿主细胞基因组，有助于编码Syntaxin16-shRNA的基因稳定、长期地在宿主细胞内进行转录得到Syntaxin16-shRN；

本发明提供的Syntaxin16-shRNA经过宿主细胞加工后可生成能沉默Syntaxin16表达的小分子干扰RNA；

本发明提供的小分子干扰RNA能靶向突触融合蛋白Syntaxin16的mRNA，并导致所述mRNA降解，并导致基因沉默效应，降低Syntaxin16的表达水平。

综上，本发明为降低Syntaxin16的表达水平提供了一种有效的RNA干扰方案，该方案优选为采用本发明提供的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、重组慢病毒或宿主细胞进行RNA干扰。

附图说明

图1为本发明实施例采用的的pLKO.1载体的质粒图谱；

图2为本发明实施例4提供的Hela细胞Syntaxin16的mRNA的RT-PCR检测结

果；

图3为本发明实施例4提供的Hela细胞Syntaxin16表达量的western blot检测结

果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold SpringHarbor）。所用引物及DNA序列均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

本发明采用的pLKO.1载体购自Open Biosystems公司，pLKO.1载体的质粒图谱分别如图1所示；oligo dT、各种限制性内切酶和Taq酶均购自TaKaRa公司，T4DNA连接酶购自NEB公司，胶回收试剂盒和质粒少量抽提试剂盒购自OMEGA公司，质粒大量抽提试剂盒购自Nucleo Bond公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清均购自HyClone公司；转染试剂Magetran购自Origene公司；倒置显微镜为Olympus产品，荧光倒置显微镜为Nikon公司产品。

本发明实施例的Hela细胞培养基为含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基。

若无特别说明，本发明采用的其他试剂均为市售商品。

实施例1

一种制备编码Syntaxin16-shRNA的DNA的方法，包括如下步骤：

根据GeneBank序列库中已有的人Syntaxin16序列和shRNA设计原则，利用siRNA在线设计工具（http://www.sirnawizard.com/index.php）对人Syntaxin16序列的编码DNA（干涉片段）进行设计，并在NCBI网站对设计的片段进行BLAST验证，保证人的其它基因（Syntaxin16除外）中没有此片段的同源序列，得到如下序列：

Syntaxin16-shRNA（SEQ ID NO:3）（5’-3’）：

AAAAACCTCTATCATAAGTCGCCAAACTCGAGTTTGGCGACTTATGATAGAGG；

Syntaxin16-shRNA（SEQ ID NO:4）（5’-3’）：

AAAAACCAGAGGATCTCTTCTAACATCTCGAGATGTTAGAAGAGATCCTCTGG；

并分别引入限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，合成得到如下Syntaxin16-shRNA的引物序列：

Syntaxin16-shRNA-F（SEQ ID NO:5）（5’-3’）：

CTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAGTTTTT

Syntaxin16-shRNA-R（SEQ ID NO:6）（5’-3’）：

AAAAACTAATTGAGAGAGCGTTATTTCTCGAGAAATAACGCTCTCTCAATTAG；

在所述SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中，下划线部分分别为AgeⅠ和EcoRⅠ的酶切位点。

实施例2

一种慢病毒重组载体pLKO.1-Syntaxin16-shRNA的构建方法，通过应用DNA亚克隆技术的方式，将合成的干涉片段Syntaxin16-shRNA-F和Syntaxin16-shRNA-R进行混合并退火后，通过粘性末端连接到载体pLKO.1的AgeⅠ和EcoRⅠ多克隆微点，得到pLKO.1-Syntaxin16-shRNA慢病毒重组载体，将得到慢病毒重组载体pLKO.1-Syntaxin16-shRNA进行测序鉴定。

具体包括以下步骤：

1、干涉片段退火

将新合成的成对干涉片段溶解为50uM溶液，分别吸取10uL于PCR管中混匀后，放入95℃水浴锅10min，随即关闭水域自然降温至室温。

反应体系如下：

总体系	20μl
		Syntaxin16-shRNA-F	10μl
Syntaxin16-shRNA-R	10μl

2、空载体pLKO.1双酶切与胶回收

1）空载体pLKO.1双酶切

将pLKO.1空载体用限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，反应体系如下：

总体系	20μl
		10xdisgestion Buffer	2μl
pLKO.1空载体	5μl
		AgeⅠ和EcoRⅠ	1μl
MiliQ-H2O	12μl

配制好充分混匀后放入37℃水浴3小时，电泳检测。

2）将酶切产物进行胶回收

采用天根生物（北京）有限公司的柱式DNA胶回收试剂盒纯化酶切产物。方法如下：

柱平衡步骤：向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL,12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量；

向胶块中加入3倍体积溶胶液PN；

50℃水浴放置10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中，室温放置2min，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；

向吸附柱CA2中加入600ul漂洗液PW，12,000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。重复操作步骤5；

将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，彻底地晾干；

将吸附柱CA2放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量无菌水，（洗脱缓冲液E B应置于65-70℃水浴预热），室温放置2min。12,000rpm离心2min收集DNA溶液。

3、干涉片段和空载体pLKO.1的连接和转化

用上一步所得到的退火片段与pLKO.1载体酶切回收产物进行连接(目的片段和载体的比例控制在3:1-6:1)，反应体系如下配制：

总体系	20μl
		10×Ligation Buffer	2μl
退火产物	5μl
		pLKO.1载体	8μl
T4DNA连接酶	1.5μl
		MiliQ-H2O	3.5

配制好充分混匀后放于16℃连接12小时。

将连接产物进行转化。转化步骤如下：①取100μl感受态细胞冰浴中融解；②迅速将连接产物加入感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30分钟；③42℃，热激30秒，冰浴冷却2分钟；④加SOC培养基1000μl，放于37℃恒温箱中培养1小时；⑤取适量涂于LB培养板（氨苄青霉素抗性）上，倒置于37℃恒温箱中过夜培养。

4、重组质粒pLKO.1-Syntaxin16-shRNA的提取和鉴定

挑取单个菌落进行质粒的提取，并选取合适的内切酶进行酶切检测，以确保载体的插入片段为目的基因。具体操作步骤按照天根试剂盒说明书进行。

1)向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500ul的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)取1-5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12000rpm离心1min，尽量吸除上清。

3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250ul溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4)向离心管中加入250ul溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

5)向离心管中加入350ul溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。

6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7)向吸附柱CP3中加入600ul漂洗液PW，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

8)重复操作步骤7。

9)将吸附柱CP3放入收集管中,12000rpm离心2min。

10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100ul MlliQ-H2O，室温放置2min，12000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

质粒提取完成后，进行AgeⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定。

电泳检测后将初步确定为阳性克隆的质粒送到英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，选取阳性克隆命名为pLKO.1-Syntaxin16-shRNA。

实施例3

一种pLKO.1-Syntaxin16-shRNA慢病毒包装和生产的方法，包括以下步骤：

1）293T细胞铺板(铺板时用普通pH7.4的DMEM完全培养基)，6cm平板中正常培养的密度约85-95%的293T细胞，一分二于两个新的6cm平板中(约6*10⁵个细胞)，铺板后12-18h为最佳转染时间；

2）转染：转染前用pH7.4的DMEM完全培养基换液。取两只1.5ml EP管，分别加入300ul DMEM完全培养基，将质粒pLKO.1-Syntaxin16-shRNA4ug、包膜载体psPAX23ug以及包装载体pMD2.G1ug溶于EP管内，将24ul polyjet转染试剂溶于另一只EP管中，初步混匀后移入含有质粒的EP管内，进一步轻柔吹打混匀数次，静置15min后逐滴均匀加入待转染的平板中；

3）转染13-18h后，用普通pH7.4的DMEM完全培养基3ml换液。分别在转染后48h,72h,96h在荧光显微镜下观察，拍照，同时连收3次病毒原液，先收获的病毒原液可暂存4℃冰箱中，得到pLKO.1-Syntaxin16-shRNA慢病毒；

4）病毒浓缩：将三次收获的病毒集中用0.45um滤膜过滤去除细胞碎片，取15ml过滤后的病毒原液于100kD超滤柱收集池内，4℃，4000g离心25-30min，收集池内剩余约200ul病毒浓缩液，进行病毒滴度测定，50ul/管分装于1.5ml EP管内，置-80℃可长期保存。

为充分说明本发明的有益效果，本发明还提供了一种采用本实施例提供的pLKO.1-Syntaxin16-shRNA慢病毒制备稳定降低Syntaxin16表达的细胞系，包括如下步骤：取本实施例制备的pLKO.1-Syntaxin16-shRNA慢病毒感染（infect）Hela细胞，用puromycin筛选基因组稳定整合shRNA序列的细胞，得到稳定敲低Syntaxin16基因的细胞系，即能稳定降低Syntaxin16表达的细胞系。

实施例4

一种稳定降低Syntaxin16表达的细胞系的制备方法，包括如下步骤：

（1）确定筛选培养基中合适浓度的G418浓度

G418的配制：配制1M HEPES：23.8g HEPES粉末溶于100ml ddH2O，10NNaOH调节pH至7.3，过滤除菌，4℃保存，终浓度为1mol/L；

制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml、1100μg/ml、1200μg/ml24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配；

（2）将冻存的细胞复苏培养，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（20000/孔），12h换液，加筛选培养基培养；

确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准；本实施例得到的最佳筛选浓度为1200μg/ml；

（3）Magetran试剂转染贴壁细胞及抗性细胞克隆的筛选

接种Hela细胞至6孔板，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养至密度约为70%～80%时可用于转染；

将Magetran试剂及pLKO.1-Syntaxin16-shRNA质粒溶液平衡至室温，在离心管内准备下列混合液：200μl opti-DMEM、2μgpLKO.1-Syntaxin16-shRNA质粒、6μl Magetran转染试剂，震荡混匀后静置室温孵育15min；

给细胞更换新的培养基后将混合液加入培养盘中，摇匀，然后置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养12小时候移除培养基，更换为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基继续培养，转染24小时后加最佳筛选浓度培养基，隔天换液；在换液一两次后（换液后培养过夜），细胞达50%-80%时，吸出所有培养液，离心3000-4000rpm，吸上清0.22μm过滤，加入2倍体积的新鲜的最佳筛选浓度培养液，混匀4℃备用；培养6天左右细胞大量死亡时，可以换用适应性培养基，或者可以增加血清浓度培养，例如原来用10%血清，此时则可以采用20%血清；培养10天后将G418浓度减半，维持筛选压力；筛选约14天后可见有抗性克隆出现，挑单克隆，在高倍镜下标记阳性克隆，采用套环法或刮除法结合有限稀释法筛选阳性克隆，将其转入多孔板培养。

本实施例通过将pLKO.1-Syntaxin16-shRNA重组载体转染Hela细胞后，使用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基（G418浓度为1200μg/ml）进行筛选，获得抗性克隆，其中，在含G418的培养液中，未转染质粒的细胞死亡；再将获得的抗性细胞混合克隆再用G418进行系列稀释、鉴定、选择后得到单克隆抗性细胞株，即稳定敲低Syntaxin16（Syntaxin16knock-down）的Hela细胞系，该稳定敲低Syntaxin16的Hela细胞系用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基持续培养。

为了充分说明本发明的有益效果，本实施例还对所得稳定降低Syntaxin16表达的细胞系单克隆进行鉴定：包括RT-PCR检测目的基因的表达；及western检测目的基因表达，步骤如下：

1、real-time-PCR检测目的基因的表达

将所得稳定降低Syntaxin16表达的细胞进行总RNA的提取，同时，设置未转染pLKO.1-Syntaxin16-shRNA的Hela细胞作为空白对照。然后反转录成cDNA模板，以设计的特异性的引物检测Syntaxin16的mRNA是否进行转录：

上游引物（SEQ ID NO:7）:5’-CACAGTCAGGCTACCTCAAAC-3’

下游引物（SEQ ID NO:8）:5’-GTCCTCTGTAAAACCCCGATG-3’；

总RNA提取的主要步骤为：

1）吸出细胞培养皿中的培养基，用PBS轻柔清洗细胞后，吸去PBS；

2）每10cm²面积的培养皿加1mL的Trizol；

3）直接在培养皿中用枪吹打细胞数次使细胞裂解，将混合液转入一支洁净的无RNA酶的离心管中；

4）室温静置5min使核蛋白复合物完全裂解；

5）每1mL的Trizol加入0.2mL的氯仿，小心盖好离心管盖；

6）剧烈涡旋振荡15s；

7）室温静置2～3min；

8）4℃，12000×g离心15min；

9）将离心管小心倾斜45°，小心将上层水相溶液转移到另一离心管中；

10）加入与上层水相等体积的异丙醇（有助于剔除小片段的干扰）或2～3倍体积的无水乙醇，混匀；

11）室温静置10min；

12）4℃，12000×g离心10min；（RNA在离心后会形成胶状沉淀物附着在管底或管壁上。）

13）弃上清，每1mL的Trizol加入1mL由DEPC处理过的双蒸水现配的80%乙醇。短暂涡旋样品，然后4℃，7500×g离心5min；小心倒掉洗出液，并用20μL移液枪吸去管底多余的液体，枪头不要碰到RNA；并在洁净环境中放置数分钟使RNA沉淀干燥（不要让RNA完全干燥，因为这样会使RNA的可溶性降低；RNA的部分溶解使A260/280<1.6）；

14）用适量（20-50μL）温热至55℃的DEPC水溶解RNA沉淀，然后55～60℃放置数分钟（助溶），定量；

15）继续进行后续试验，或将RNA溶液放置于-80℃保存。

反转录步骤：将提取的总RNA进行浓度测定，加入2μg总RNA，1μloligo(dT)，加入DEPC水至12μl，在68℃孵育5分钟。取出产物后立即放置冰上2-5分钟，分别加入4μl Reaction Buffer，2μl10mM dNTP Mix,1μl ReverseTranscriptase，MMLV-Reverse和1μl RNase Inhibitor。在42℃孵育60分钟，将获得的产物进行稀释后，即获得cDNA模板。以我们设计的特异性引物进行PCR扩增，扩增的反应条件为：94℃预变性2分钟，以98℃变性10秒，59℃退火30秒，68℃延伸1分钟30秒，扩增35个循环，再以72℃充分延伸10分钟。体系为10ul，配制如下：

本实施例的real-time PCR检测结果如图2所示。在图2中，由图2可知，相比对照组（pLKO.1空载转染的Hela细胞组），经由pLKO.1-Syntaxin16-shRNA转染的Hela细胞组（实验组）中Syntaxin16的mRNA明显降低。

2、western blot检测目的基因表达

将正常的Hela细胞与本实施例提供的稳定敲低Syntaxin16的Hela细胞系同时收样做蛋白检测：首先，去除培养基后加入4℃PBS将细胞用细胞刮刮下来放入15ml离心管中，2000转5min离心，去除上清，再每管加入1ml4℃PBS把细胞沉淀吹匀后转移到1.5ml EP管内再次离心并去上清；接着开始裂解细胞，将RAPA强裂解液与蛋白酶抑制剂，100:1的比例混合后加到细胞沉淀中，4℃摇晃裂解1h后，4℃14000转离心，取上清即样品；最后测样品蛋白浓度，并加入Loading buffer煮沸8min，再调平上样量用SDS-聚丙烯凝胶电泳跑胶；电泳3小时，转膜2小时，之后抗体孵育，一抗2小时，二抗1小时，显色曝光，其中，一抗为EPITOMICS公司的Syntaxin16抗体（mAb rabbit），货号：6644-1）。

western blot结果如图3所示，actin为内参，STX16表示Syntaxin16蛋白，pLKO-ctrl泳道和pLKO-STX16泳道分别表示对照组和实验组的结果；由图3可知，Syntaxin16的蛋白表达量比正常细胞明显降低，说明目的基因（即编码Syntaxin16-shRNA的DNA）能在本发明提供的稳定敲低的Syntaxin16细胞系中进行持续转录，并生产siRNA，对Syntaxin16的mRNA进行降解，从而降低Syntaxin16的表达水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种小分子干扰RNA，其特征在于：所述小分子干扰RNA具有与翻译突触融合蛋白Syntaxin16的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。

2.如权利要求1所述的小分子干扰RNA，其特征在于，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。

3.一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1或权利要求2所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。

4.一种编码shRNA的DNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1或权利要求2所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的编码shRNA的DNA，其特征在于，所述编码shRNA的DNA的含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

6.如权利要求4所述的编码shRNA的DNA，其特征在于，所述编码shRNA的DNA还包括RNA聚合酶III启动子。

7.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体为在pLKO.1质粒的多克隆位点、pEN-hH1c质粒的多克隆位点或pDSL-hpUGIP质粒的重组位点插入如权利要求4～6任一所述的编码shRNA的DNA得到的重组载体。

8.一种重组慢病毒，其特征在于，是如权利要求7的b）所述的重组载体与包膜载体psPAX2和包装载体pMD2.G共转染哺乳动物细胞得到的重组慢病毒。

9.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求3所述的shRNA、如权利要求4所述的编码shRNA的DNA、如权利要求7的b）所述的重组载体和如权利要求8的所述的重组慢病毒中的至少一种。

10.如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求3所述的shRNA、如权利要求4所述的编码shRNA的DNA、如权利要求7的b）所述的重组载体和如权利要求8的所述的重组慢病毒中的至少一种在制备抑制突触融合蛋白Syntaxin16基因表达的药物中的应用。

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