CN103690571B - 从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明是一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法：向孔石莼干粉末加入无水甲醇制得蒸干物，再加入蒸馏水制得上清液；将上清液调pH后加入乙酸乙酯多次萃取制得组分A？B？C？D；将其甲醇溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，合并收集相同<i>R</i>_f处条带溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到11种组分，其中的4种组分再次以划线法点样于硅胶GF₂₅₄上进行纯化制备，制备到6种组分。13种组分为生物碱和酚酸。可用于抑制米氏凯伦藻或者中肋骨条藻的生长。本发明方法可操作性强，制得的酚酸和生物碱纯度高，实现了从孔石莼中提取制得酚酸和生物碱的突破。该方法制得的多种酚酸和生物碱具有海藻抑藻活性，具有实际应用价值。

Description

从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法与用途

技术领域

本发明属于海洋生化工程领域，具体涉及一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法。本发明还涉及该方法制得的酚酸和生物碱的用途。

背景技术

目前，世界各地海岸普遍存在赤潮现象，对近海水域生态环境、人类生活和沿海水产业的可持续发展造成了极大的威胁。在赤潮的发生频率、规模和危害程度愈演愈烈的同时，海洋沿岸带（河口和海湾等）水体较浅的透光层内，以石莼（Ulvasp.）和浒苔（Enteromorphasp.）等绿藻为主要代表的海藻亦开始泛滥，形成海藻水华，给沿海渔业、养殖业和旅游业造成重大的损失。如何科学、有效地利用这些绿潮海藻资源，以减少绿潮带来的经济损失成为亟待解决的问题之一。以这些绿潮海藻为实验材料，将之应用于赤潮生物治理中的研究逐渐引起研究者们的重视。

孔石莼（Ulvapertusa）分类上归属于绿藻门，石莼属，石莼科，广泛分布于西太平洋沿海，是我国野生经济藻类中资源极为丰富的一种，在黄渤海产量最大。自古以来，孔石莼在食用和药用方面就有广泛的应用。目前，孔石莼主要应用在水产养殖饲料和生态肥料等方面，其应用价值还未得到充分发掘。近来研究表明，孔石莼及其提取物具有多种生物活性，降血脂作用、抗病毒和抗菌作用、清除自由基和抗氧化作用、抑藻活性等，在食品领域、海洋天然药物和生态环境保护等方面都显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法，该方法可操作性强，制得的酚酸和生物碱纯度高。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了上述方法所制得的酚酸和生物碱的用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法，其特点是，其步骤如下：

（1）向孔石莼干粉末加入无水甲醇，常温超声波下提取2h，过滤和减压蒸干，制备到蒸干物；将蒸干物加入蒸馏水，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，得上清液；

（2）将上清液调pH至11，加入乙酸乙酯萃取；所得上层减压蒸干，获得组分A，将所得下层调节pH至7，乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，制备到组分B，再将所得下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取，所得上层和下层分别减压蒸干，获得组分C和组分D；将组分A、B、C、D分别溶解于无水甲醇中，得到4种甲醇溶液；

（3）将所得的4种甲醇溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，组分A、组分B和组分C的甲醇溶液以体积比为15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，组分D的甲醇溶液以体积比为8:1的氯仿/甲醇为展开剂；展开后，紫外254nm下观察；组分A甲醇溶液出现1个斑点，R_f为0.550；组分B甲醇溶液出现4个斑点，R_f为0.356、0.466、0.687和0.872；组分C甲醇溶液出现4个斑点，R_f为0.550、0.663、0.775和0.894；组分D的甲醇溶液出现2个斑点，R_f分别为0.216和0.585；在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同R_f处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到11种组分，和前述斑点对应依次记为组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄、组分D₁和组分D₂；其中，组分B₄、组分C₄、组分D₁和组分D₂再次以划线法点样于硅胶GF₂₅₄上进行纯化制备，以体积比为18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，制备到6种组分，依次记为组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₄₁、组分C₄₂、组分D₁₁和组分D₂₁；

（4）经化合物定性检测、波长扫描和薄层层析检测，13种组分物质中，组分D11和组分D21是生物碱，其余组分为酚酸；分别减压蒸干，即得。

以上所述的本发明方法制得的酚酸或者生物碱，可以用来抑制米氏凯伦藻或者中肋骨条藻的生长。

与现有技术相比，本发明方法可操作性强，制得的酚酸和生物碱纯度高，实现了从孔石莼中提取制得酚酸和生物碱的突破。该方法制得的多种酚酸和生物碱具有海藻抑藻活性，具有实际应用价值。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法，其步骤如下：

（1）向孔石莼干粉末加入无水甲醇，常温超声波下提取2h，过滤和减压蒸干，制备到蒸干物；将蒸干物加入蒸馏水，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，得上清液；

（2）将上清液调pH至11，加入乙酸乙酯萃取；所得上层减压蒸干，获得组分A，将所得下层调节pH至7，乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，制备到组分B，再将所得下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取，所得上层和下层分别减压蒸干，获得组分C和组分D；将组分A、B、C、D分别溶解于无水甲醇中，得到4种甲醇溶液；

（3）将所得的4种甲醇溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，组分A、组分B和组分C的甲醇溶液以体积比为15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，组分D的甲醇溶液以体积比为8:1的氯仿/甲醇为展开剂；展开后，紫外254nm下观察；组分A甲醇溶液出现1个斑点，R_f为0.550；组分B甲醇溶液出现4个斑点，R_f为0.356、0.466、0.687和0.872；组分C甲醇溶液出现4个斑点，R_f为0.550、0.663、0.775和0.894；组分D的甲醇溶液出现2个斑点，R_f分别为0.216和0.585；在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同R_f处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到11种组分，和前述斑点对应依次记为组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄、组分D₁和组分D₂；其中，组分B₄、组分C₄、组分D₁和组分D₂再次以划线法点样于硅胶GF₂₅₄上进行纯化制备，以体积比为18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，制备到6种组分，依次记为组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₄₁、组分C₄₂、组分D₁₁和组分D₂₁；

（4）经化合物定性检测、波长扫描和薄层层析检测，13种组分物质中，组分D11和组分D21是生物碱，其余组分为酚酸；分别减压蒸干，即得。

实施例2，一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法实验：

孔石莼干品粉碎成0.3mm粉末，加入无水甲醇，在常温超声波下提取2h。反复提取3-4次后，合并提取液，经离心、过滤和减压蒸干，制备到蒸干物；此蒸干物加入适量蒸馏水，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。用2-5mol/L氢氧化钠将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取3-4次。上层减压蒸干，获得组分A。调节下层pH至7，乙酸乙酯萃取3-4次，上层减压蒸干，制备到组分B。再将下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取3-4次，上层和下层分别减压蒸干，获得组分C和组分D。上述4种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。将此4种甲醇溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，组分A、组分B和组分C以氯仿/丙酮/甲酸（15:3:2）为展开剂，组分D以氯仿/甲醇（8:1）为展开剂。展开后，紫外254nm下观察。组分A出现1个斑点，R_f为0.550；组分B出现4个斑点，R_f为0.356、0.466、0.687和0.872；组分C出现4个斑点，R_f为0.550、0.663、0.775和0.894；组分D出现2个斑点，R_f分别为0.216和0.585。在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同R_f处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到11种组分，记为组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄、组分D₁和组分D₂。其中，组分B₄、组分C₄、组分D₁和组分D₂再次以划线法点样于硅胶GF₂₅₄上进行纯化，以氯仿/丙酮/甲酸（18:1:3）为展开剂，制备到6种组分，依次记为组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₄₁、组分C₄₂、组分D₁₁和组分D₂₁。

取0.1mL13种组分的浓缩液，溶剂挥发后，加入1mol/L冰醋酸溶液1mL，充分振荡，加入铁氰化钾-三氯化铁显色剂（0.6%铁氰化钾溶液和0.9%三氯化铁溶液，使用前按0.9∶1.0混合而成，现用现配），观察颜色反应，发现组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄₁和组分C₄₂呈现污绿色，为酚酸类物质的阳性反应；波长扫描显示，此11种组分在260-330nm范围内有特征吸收峰，为酚酸类物质的特征吸收峰；13种组分的0.1mL浓缩液，溶剂挥发后，加入碘化铋钾溶液1mL，充分振荡，仅组分D₁₁和组分D₂₁出现黄色沉淀，为生物碱的阳性反应。将此13种组分溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，分别在氯仿/甲醇，环己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3种展开剂下展开，发现此13种组分均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘）以及专属显色剂（铁氰化钾-三氯化铁溶液或碘化铋钾溶液），发现在此3种显色剂下，此13种组分同样呈现单一斑点，表明纯度达到了薄层纯。最后，抑藻活性检测表明，此13种组分均能抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长。减压蒸干，制备到13种抑藻活性物质。

实施例3，一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法实验：

称取孔石莼干粉末400g，溶解于2000mL无水甲醇，室温下超声波提取2h。提取4次后，合并提取液，经离心、过滤和减压蒸干，制备到42.6g蒸干物。此蒸干物中加入40mL蒸馏水，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。用2mol/L氢氧化钠将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上层40℃下减压蒸干，获得暗绿色蒸干物2.219g（组分A）。调节下层pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上层40℃下减压蒸干，制备到黄色蒸干物0.466g（组分B）。再将下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取4次，上层和下层分别在40℃减压蒸干，获得棕黄色蒸干物2.485g（组分C）和红棕色蒸干物3.219g（组分D）。上述4种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。将此4种甲醇溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，组分A、组分B和组分C以氯仿/丙酮/甲酸（15:3:2）为展开剂，组分D以氯仿/甲醇（8:1）为展开剂。展开后，紫外254nm下观察。组分A出现1个斑点，R_f为0.550；组分B出现4个斑点，R_f为0.356、0.466、0.687和0.872；组分C出现4个斑点，R_f为0.550、0.663、0.775和0.894；组分D出现2个斑点，R_f分别为0.216和0.585。在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同R_f处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到11种组分，记为组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄、组分D₁和组分D₂。其中，组分B₄、组分C₄、组分D₁和组分D₂再次以划线法点样于硅胶GF₂₅₄上进行纯化，以氯仿/丙酮/甲酸（18:1:3）为展开剂，制备到6种组分，依次记为组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₄₁、组分C₄₂、组分D₁₁和组分D₂₁。

取0.1mL13种组分的浓缩液，溶剂挥发后，加入1mol/L冰醋酸溶液1mL，充分振荡，加入铁氰化钾-三氯化铁显色剂（0.6%铁氰化钾溶液和0.9%三氯化铁溶液，使用前按0.9∶1.0混合而成，现用现配），观察颜色反应，发现组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄₁和组分C₄₂呈现污绿色，为酚酸类物质的阳性反应；波长扫描显示，此11种组分在260-330nm范围内有特征吸收峰，为酚酸类物质的特征吸收峰；13种组分的0.1mL浓缩液，溶剂挥发后，加入碘化铋钾溶液1mL，充分振荡，仅组分D₁₁和组分D₂₁出现黄色沉淀，为生物碱的阳性反应。将此13种组分溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，分别在氯仿/甲醇，环己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3种展开剂下展开，发现此13种组分均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘）以及专属显色剂（铁氰化钾-三氯化铁溶液或碘化铋钾溶液），发现在此3种显色剂下，此13种组分同样呈现单一斑点，表明纯度达到了薄层纯。最后，抑藻活性检测表明，此13种组分均能抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长。减压蒸干，制备到13种抑藻活性物质，A₁黄色油状物0.054g、B₁淡黄色针状结晶0.032g、B₂黄色结晶性粉末0.034g、B₃黄色结晶0.026g、B₄₁黄色针状结晶0.006g、B₄₂黄色粉末0.008g、C₁淡黄色粉末0.032g、C₂淡黄色结晶0.083g、C₃黄色粉末0.085g、C₄₁黄色结晶性粉末0.007g、C₄₂黄色粉末0.004g、D₁₁淡黄色粉末0.004g和D₂₁淡黄色结晶0.009g。

实施例4，一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法实验：

称取孔石莼干粉末600g，溶解于3000mL无水甲醇，室温下超声波提取2h。提取4次后，合并提取液，经离心、过滤和减压蒸干，制备到58.4g蒸干物。此蒸干物中加入60mL蒸馏水，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。用3mol/L氢氧化钠将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上层40℃下减压蒸干，获得暗绿色蒸干物3.466g（组分A）。调节下层pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上层40℃下减压蒸干，制备到黄色蒸干物0.531g（组分B）。再将下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取4次，上层和下层分别在40℃减压蒸干，获得棕黄色蒸干物2.875g（组分C）和红棕色蒸干物3.658g（组分D）。上述4种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。将此4种甲醇溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，组分A、组分B和组分C以氯仿/丙酮/甲酸（15:3:2）为展开剂，组分D以氯仿/甲醇（8:1）为展开剂。展开后，紫外254nm下观察。组分A出现1个斑点，R_f为0.550；组分B出现4个斑点，R_f为0.356、0.466、0.687和0.872；组分C出现4个斑点，R_f为0.550、0.663、0.775和0.894；组分D出现2个斑点，R_f分别为0.216和0.585。在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同R_f处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到11种组分，记为组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄、组分D₁和组分D₂。其中，组分B₄、组分C₄、组分D₁和组分D₂再次以划线法点样于硅胶GF₂₅₄上进行纯化，以氯仿/丙酮/甲酸（18:1:3）为展开剂，制备到6种组分，依次记为组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₄₁、组分C₄₂、组分D₁₁和组分D₂₁。取0.1mL13种组分的浓缩液，溶剂挥发后，加入1mol/L冰醋酸溶液1mL，充分振荡，加入铁氰化钾-三氯化铁显色剂（0.6%铁氰化钾溶液和0.9%三氯化铁溶液，使用前按0.9∶1.0混合而成，现用现配），观察颜色反应，发现组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄₁和组分C₄₂呈现污绿色，为酚酸类物质的阳性反应；波长扫描显示，此11种组分在260-330nm范围内有特征吸收峰，为酚酸类物质的特征吸收峰；13种组分的0.1mL浓缩液，溶剂挥发后，加入碘化铋钾溶液1mL，充分振荡，仅组分D₁₁和组分D₂₁出现黄色沉淀，为生物碱的阳性反应。将此13种组分溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，分别在氯仿/甲醇，环己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3种展开剂下展开，发现此13种组分均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘）以及专属显色剂（铁氰化钾-三氯化铁溶液或碘化铋钾溶液），发现在此3种显色剂下，此13种组分同样呈现单一斑点，表明纯度达到了薄层纯。最后，抑藻活性检测表明，此13种组分均能抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长。减压蒸干，制备到13种抑藻活性物质，A₁黄色油状物0.082g、B₁淡黄色针状结晶0.051g、B₂黄色结晶性粉末0.049g、B₃黄色结晶0.047g、B₄₁黄色针状结晶0.008g、B₄₂黄色粉末0.010g、C₁淡黄色粉末0.048g、C₂淡黄色结晶0.096g、C₃黄色粉末0.098g、C₄₁黄色结晶性粉末0.009g、C₄₂黄色粉末0.005g、D₁₁淡黄色粉末0.005g和D₂₁淡黄色结晶0.011g。

实施例5，一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法实验：

称取孔石莼干粉末800g，溶解于3500mL无水甲醇，室温下超声波提取2h。提取4次后，合并提取液，经离心、过滤和减压蒸干，制备到84.2g蒸干物。此蒸干物中加入100mL蒸馏水，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，保留上清液。用5mol/L氢氧化钠将上清液pH调至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上层40℃下减压蒸干，获得暗绿色蒸干物4.081g（组分A）。调节下层pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上层40℃下减压蒸干，制备到黄色蒸干物0.782g（组分B）。再将下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取4次，上层和下层分别在40℃减压蒸干，获得棕黄色蒸干物3.725g（组分C）和红棕色蒸干物5.383g（组分D）。上述4种组分分别溶解于无水甲醇中，制备到4种甲醇溶液。将此4种甲醇溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，组分A、组分B和组分C以氯仿/丙酮/甲酸（15:3:2）为展开剂，组分D以氯仿/甲醇（8:1）为展开剂。展开后，紫外254nm下观察。组分A出现1个斑点，R_f为0.550；组分B出现4个斑点，R_f为0.356、0.466、0.687和0.872；组分C出现4个斑点，R_f为0.550、0.663、0.775和0.894；组分D出现2个斑点，R_f分别为0.216和0.585。在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同R_f处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到11种组分，记为组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄、组分D₁和组分D₂。其中，组分B₄、组分C₄、组分D₁和组分D₂再次以划线法点样于硅胶GF₂₅₄上进行纯化，以氯仿/丙酮/甲酸（18:1:3）为展开剂，制备到6种组分，依次记为组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₄₁、组分C₄₂、组分D₁₁和组分D₂₁。取0.1mL13种组分的浓缩液，溶剂挥发后，加入1mol/L冰醋酸溶液1mL，充分振荡，加入铁氰化钾-三氯化铁显色剂（0.6%铁氰化钾溶液和0.9%三氯化铁溶液，使用前按0.9∶1.0混合而成，现用现配），观察颜色反应，发现组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄₁和组分C₄₂呈现污绿色，为酚酸类物质的阳性反应；波长扫描显示，此11种组分在260-330nm范围内有特征吸收峰，为酚酸类物质的特征吸收峰；13种组分的0.1mL浓缩液，溶剂挥发后，加入碘化铋钾溶液1mL，充分振荡，仅组分D₁₁和组分D₂₁出现黄色沉淀，为生物碱的阳性反应。将此13种组分溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，分别在氯仿/甲醇，环己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3种展开剂下展开，发现此13种组分均呈现单一斑点；同时，采用通用型显色剂（10%硫酸溶液和碘）以及专属显色剂（铁氰化钾-三氯化铁溶液或碘化铋钾溶液），发现在此3种显色剂下，此13种组分同样呈现单一斑点，表明纯度达到了薄层纯。最后，抑藻活性检测表明，此13种组分均能抑制米氏凯伦藻和中肋骨条藻的生长。减压蒸干，制备到13种抑藻活性物质，A₁黄色油状物0.098g、B₁淡黄色针状结晶0.059g、B₂黄色结晶性粉末0.060g、B₃黄色结晶0.048g、B₄₁黄色针状结晶0.010g、B₄₂黄色粉末0.014g、C₁淡黄色粉末0.058g、C₂淡黄色结晶0.147g、C₃黄色粉末0.152g、C₄₁黄色结晶性粉末0.011g、C₄₂黄色粉末0.006g、D₁₁淡黄色粉末0.007g和D₂₁淡黄色结晶0.016g。

采用抑藻圈实验进行抑藻活性检测。在数个直径为1.5cm的圆形滤纸片上，分别滴加5μL待测组分丙酮浓缩液和丙酮（作为对照组），待丙酮完全挥发后，将滤纸片放置于接种对数生长期的中肋骨条藻的固体培养基上，置于GXZ-260B智能型光照培养箱中培养，温度（26±1）℃，光照强度62μmolm^-2s^-1，光暗比为12:12。2d后，观察滤纸片及周围受试微藻的生长，发现13种待测组分均对中肋骨条藻的生长表现出较为明显的抑制作用。通过测定抑藻圈，此13种待测组分的抑藻圈均超过1.0cm。

Claims (2)

1.一种从孔石莼中分离纯化制备酚酸和生物碱的方法，其特征在于，其步骤如下：

(1)向孔石莼干粉末加入无水甲醇，常温超声波下提取2h，过滤和减压蒸干，制备到蒸干物；将蒸干物加入蒸馏水，充分振荡，4℃下静置过夜，离心、过滤，去除沉淀，得上清液；

(2)将上清液调pH至11，加入乙酸乙酯萃取；所得上层减压蒸干，获得组分A，将所得下层调节pH至7，乙酸乙酯萃取，所得上层减压蒸干，制备到组分B，再将所得下层pH调节至2，乙酸乙酯萃取，所得上层和下层分别减压蒸干，获得组分C和组分D；将组分A、B、C、D分别溶解于无水甲醇中，得到4种甲醇溶液；

(3)将所得的4种甲醇溶液点样于硅胶GF₂₅₄上，组分A、组分B和组分C的甲醇溶液以体积比为15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，组分D的甲醇溶液以体积比为8:1的氯仿/甲醇为展开剂；展开后，紫外254nm下观察；组分A甲醇溶液出现1个斑点，R_f为0.550；组分B甲醇溶液出现4个斑点，R_f为0.356、0.466、0.687和0.872；组分C甲醇溶液出现4个斑点，R_f为0.550、0.663、0.775和0.894；组分D的甲醇溶液出现2个斑点，R_f分别为0.216和0.585；在此基础上，以划线法多次点样，合并收集相同R_f处条带，重新溶解于丙酮，经离心和减压浓缩，制备到11种组分，和前述斑点对应依次记为组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分B₄、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分C₄、组分D₁和组分D₂；其中，组分B₄、组分C₄、组分D₁和组分D₂再次以划线法点样于硅胶GF₂₅₄上进行纯化制备，以体积比为18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸为展开剂，制备到6种组分，依次记为组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₄₁、组分C₄₂、组分D₁₁和组分D₂₁；

(4)经化合物定性检测、波长扫描和薄层层析检测，13种组分物质中，组分D11和组分D21是生物碱，组分A₁、组分B₁、组分B₂、组分B₃、组分C₁、组分C₂、组分C₃、组分B₄₁、组分B₄₂、组分C₄₁、组分C₄₂为酚酸；分别减压蒸干，即得。

2.如权利要求1所述方法制得的酚酸或者生物碱作为唯一活性成份在抑制米氏凯伦藻或者中肋骨条藻的生长中的用途。