CN107253953B - 一种从浒苔中提取叶绿素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及色素提取工艺领域，具体涉及一种采用加酶提取叶绿素的方法。将原料浒苔预处理，然后采用加纤维素酶破壁，有机溶剂提取叶绿素的方法。采用本发明方法所得到的叶绿素提取率高，纯度好。方法操作简单、环保高效、适合浒苔中提取高纯度叶绿素的规模化操作。

Description

一种从浒苔中提取叶绿素的方法
技术领域
本发明涉及色素提取工艺领域，具体涉及一种采用酶解有机溶剂提取叶绿素的方法。
背景技术
叶绿素是存在于植物细胞中的一类极重要的绿色色素，是绿色植物和藻类进行光合作用时吸收、转化和传递光能的主要物质。含有四吡咯环构成的卟啉环，其骨架结构与血红素相似，不同的是四吡咯环中央是一个镁原子。叶绿素主要包括叶绿素a、b两种，他们之间的区别仅仅是一个基团的不同。叶绿素的分子结构与人类和大多数动物体内的血红蛋白分子结构十分相似，在某中意义上讲，叶绿素也是维持生命不可缺少的物质。近年来，由于全球变暖，大气中二氧化碳含量增加，使得海水在与空气交换时增加了碳的含量，而浒苔繁殖力极强，从而导致浒苔的疯长与大面积的扩大。浒苔的爆发可影响海底其它生物的生长，死亡的浒苔还会消耗海水中的氧气，使养殖贝类死亡，大量繁殖还会严重影响景观，干扰旅游观光和水上运动的进行，对环境和水产养殖的负面影响较大，现在国外已经把浒苔一类的大型绿藻大规模爆发称为“绿潮”，并视作和赤潮一样的海洋灾害。我国浒苔资源丰富，特别是近年来青岛近海海域涌现大量浒苔藻类植物并侵入岸边，为此，如何利用浒苔这一资源，变废为宝成为一个热点话题。
发明内容
本发明在于提供一种利用目前我国丰富的浒苔提取叶绿素的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种从浒苔中提取叶绿素的方法，将原料浒苔用清水浸提，过滤后采用酶解有机溶剂浸提叶绿素的方法。
所述原料浒苔为新鲜采取的浒苔，洗净后自然阴干后，粉碎，得到干浒苔样品；
或，为用自来水洗净的新鲜采取的浒苔。
进一步的说，将原料浒苔样品与水按照固液(g/ml)比1：5-40的比例混合后，在35-45℃，90-120r/min振荡提取60-120min，过滤，得去除杂质的滤饼；
将滤饼与蒸馏水按照固液比1：1-20的比例混合,再加入纤维素酶，而后在恒温振荡器中，40-45℃下进行酶解3-24h，酶解后过滤，滤液待用，滤渣用不同的有机溶剂提取，固液比为1:10-40,35-45℃下，避光提取3-10h，得叶绿素提取物，再进一步纯化得叶绿素油状物。
所述叶绿素提取物过滤，40℃旋蒸后置于40℃烘箱中烘干得叶绿素油状物。
干浒苔加酶量为150-200U/g，湿浒苔加酶量为100-150U/g，水浴酶解时干浒苔与蒸馏水固液比为1：5-20，湿浒苔与蒸馏水固液比为1：1-5。
所述有机溶剂为无水乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇或乙酸乙酯，优选为无水乙醇。
所述叶绿素的提取率为干浒苔0.099％，纯度为4.10％；湿浒苔0.038％，纯度为3.07％。
本发明所具有的优点：与传统的有机溶剂提取方法相比，采用本发明方法叶绿素提取率高，纯度高，且在叶绿素提取的过程中，其他浒苔中的活性成分如可溶性多糖、可溶性蛋白、海藻淀粉等得到了充分的利用。该方法操作简单、环保高效、适合浒苔中提取高纯度叶绿素的规模化操作。
附图说明
图1为叶绿素a，b混合物标准品在652nm处吸光度标准曲线图。
图2为本发明实施例提供的不同pH条件下叶绿素浓度变化图。
图3为本发明实施例提供的光照对叶绿素含量影响变化图。
图4金属离子对叶绿素稳定性的影响(A)初始反应(B)反应24h之后。
图5不同氧化剂对叶绿素稳定性的影响(A)初始反应(B)反应24h之后。
图6为本发明实施例提供的提取出叶绿素产品图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的解释说明。
实施例1
原料预处理，在实验中，取新鲜采取的浒苔，洗净。取100克鲜浒苔样品，按照1:5固液(g/ml)比加入蒸馏水，充分搅碎得到湿浒苔样品。上述样品在震荡培养箱中，45℃浸提2h后，过滤，滤液用于提取浒苔的可溶性活性组分，滤渣用于进一步的叶绿素提取。
用于与本发明方法的实验对比，首先采用直接浸提法提取叶绿素，实验中分别取滤渣2g，而后各自与无水乙醇按料液比为1:20(g/ml)混合，置于振荡器以120r/min，温度45℃下提取4h。提取后过滤，滤液在645nm和663nm下测定吸光值，计算提取率。
表1 无水乙醇为溶剂，料液比为1:20条件下，提取温度对鲜浒苔叶绿素提取率的影响
表2 无水乙醇为溶剂，料液比为1:20条件下，提取时间对鲜浒苔叶绿素提取率的影响
提取时间 A<sub>645</sub> A<sub>663</sub> 提取率
1h 0.246 0.467 0.018％
2h 0.327 0.616 0.023％
3h 0.262 0.499 0.019％
4h 0.342 0.620 0.024％
5h 0.326 0.612 0.023％
表3 无水乙醇为溶剂，45℃条件下，料液比对鲜浒苔叶绿素提取率的影响
料液比 A<sub>645</sub> A<sub>663</sub> 提取率
1：10 0.263 0.459 0.018％
1：20 0.274 0.501 0.019％
1：30 0.276 0.503 0.019％
由上表1-3可知，传统的有机溶剂提取法，提取率很低。
实施例2
原料预处理与实施例1中相同，水提取后的滤渣用于本发明方法酶解醇提的叶绿素提取。
滤渣按照固液比1:5加入蒸馏水，然后按照干浒苔样品中酶加量为150U/g，湿浒苔样品酶加量为100U/g加入纤维素酶。
加入酶后将样品置于恒温振荡器中，于40℃条件下酶解3h进行酶解处理。酶解后，过滤，滤渣用固液比1:20(g/mL)的无水乙醇提取，浸提后过滤，滤液在645nm和663nm下测定吸光值，计算提取率。
表4 不同加酶量对湿浒苔叶绿素提取率的影响
加酶量 A<sub>645</sub> A<sub>663</sub> 提取率
25U/g 0.466 0.870 0.033％
50U/g 0.519 0.908 0.036％
100U/g 0.534 0.880 0.036％
150U/g 0.520 0.804 0.034％
200U/g 0.470 0.782 0.032％
表5 不同加酶量对干浒苔叶绿素提取率的影响
加酶量 A<sub>645</sub> A<sub>663</sub> 提取率
25U/g 0.791 1.217 0.078％
50U/g 0.845 1.411 0.086％
100U/g 0.926 1.588 0.095％
150U/g 0.980 1.611 0.099％
200U 0.908 1.564 0.093％
表9 不同提取方法对叶绿素提取率和纯度的影响
不同条件 A<sub>645</sub> A<sub>663</sub> 提取率 纯度
干浒苔不加酶 0.877 1.354 0.056％ 2.06％
湿浒苔不加酶 0.346 0.620 0.024％ 1.46％
干浒苔加酶 0.980 1.611 0.099％ 4.10％
湿浒苔加酶 0.519 0.908 0.036％ 3.07％
由上述结果可知，通过本专利方法所得叶绿素的提取率和纯度都得到了大幅度提高。
实施例3提取的叶绿素的稳定性研究
1、将上述实施例提取所得叶绿素进行色素的热处理检测：
精确称取适量提取出的叶绿素配成待测液5份，每份10mL，放入具塞试管中，在4℃,37℃，45℃,60℃及常温25℃各不同温度的水浴中保温，待冷却后，用比色皿在645nm和663nm处测定吸光度值，并记录颜色变化。
由上述的检测可见温度升高会在一定程度上破坏叶绿素的稳定性，且观察可见不同温度(4℃,37℃，45℃,60℃及常温25℃)保存一小时后叶绿素颜色并无明显变化。故叶绿素应在低温下保存。
2、将上述实施例提取所得叶绿素进行pH对叶绿素稳定检测：
取叶绿素待测液10份，每份10mL，用0.1mol/L的HCl或0.1mol/L的NaOH调节pH＝3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0并且在10min内用比色皿在645nm和663nm处测定吸光度值，并记录颜色变化。
由上述检测可知，叶绿素在中性环境下较为稳定，酸性或碱性环境都会破坏叶绿素的稳定性(参见图2)。
3、将上述实施例提取所得叶绿素进行光照处理实验：
取色素待测液4份置于10mL具塞试管中，在培养箱日光灯下分别照射0、2、4、10h后用比色皿在645nm和663nm处测定吸光度值，并记录颜色变化。
由上述检测可知，光照对叶绿素稳定性破坏作用明显，故叶绿素在测定及保存时一定要进行避光处理。(见图3)
4、将上述实施例提取所得叶绿素进行金属离子对叶绿素稳定的检测：
取CaCl2、FeSO4·7H2O、MgSO4、Al(NO3)3·9H2O、CuSO4.5H2O、NaCl、KCl配制成0.01mol/L Ca2+、Fe2+、Mg2+、Al3+、Cu2+、Na+、K+的水溶液，吸取每种金属溶液5mL，分别加叶绿素待测液5mL中，摇匀，测定初始645nm和663nm值和放置后的吸光度值，并记录颜色变化。
由上述检测可知，Ca2+使叶绿素a吸光度增加。金属离子对叶绿素稳定性有一定影响。放置24h后，K+会使叶绿素颜色加深，Na+对叶绿素没有明显影响。而其余五种金属离子会在一定程度破坏叶绿素分子。故在保存时应尽量避免与这五种离子接触。(见图4)
5、将上述实施例提取所得叶绿素进行氧化还原剂对叶绿素的影响的实验：
取叶绿素待测液，分别加入浓度为0.01mol/L的K2Cr2O7、NaS2O3·5H2O、FeSO4·7H2O、草酸、KMnO4溶液4mL，并取蒸馏水4mL，摇匀，室温静置
24h后测定在645nm和663nm的吸光度值，并记录颜色变化。
由上述检测可见经过24h的放置，氧化还原试剂虽然没有没有发生很大颜色的改变，但是各溶液吸光度却有很大差别，说明氧化还原试剂对叶绿素具有明显的影响。

Claims (5)

1.一种从浒苔中提取叶绿素的方法，其特征在于：将原料浒苔用清水浸提，过滤后采用酶解有机溶剂浸提叶绿素的方法；
具体为将原料浒苔样品与水按照固液比1：5-40的比例混合后，在35-45℃，90-120r/min振荡提取60-120min，过滤，得去除杂质的滤饼；
将滤饼与蒸馏水按照固液比1：1-20的比例混合,再加入纤维素酶，而后在恒温振荡器中，40-45℃下进行酶解3-24h，酶解后过滤，滤液待用，滤渣用不同的有机溶剂提取，固液比为1:10-40，35-45℃下，避光提取3-10h，得叶绿素提取物，再进一步纯化得叶绿素油状物。
2.按权利要求1所述的浒苔中提取叶绿素的方法，其特征在于：
所述原料浒苔为新鲜采取的浒苔，洗净后自然阴干后，粉碎，得到干浒苔样品；
或，为用自来水洗净的新鲜采取的浒苔。
3.按权利要求1所述的浒苔中提取叶绿素的方法，其特征在于：所述叶绿素提取物过滤，40℃旋蒸后置于40℃烘箱中烘干得叶绿素油状物。
4.按权利要求1所述的浒苔中提取叶绿素的方法，其特征在于：干浒苔加酶量为150-200U/g，湿浒苔加酶量为100-150U/g，水浴酶解时干浒苔与蒸馏水固液比为1：5-20，湿浒苔与蒸馏水固液比为1：1-5。
5.按照权利要求1所述的浒苔中提取叶绿素的方法，其特征在于：有机溶剂为无水乙醇、甲醇、丙酮、异丙醇或乙酸乙酯。
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