CN103688175A - 用于筛选选择性降低癌干细胞数量的化合物的测定法 - Google Patents

Abstract

本发明尤其提供了用于鉴定选择性降低癌干细胞(CSCs)数量的试剂的方法。该方法包括(a)将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触；和(b)确定所述候选试剂是否相对于还没有与所述候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化。所述方法可用作高通量筛选。

Description

用于筛选选择性降低癌干细胞数量的化合物的测定法

发明领域

本发明尤其涉及可用于，例如，鉴定选择性降低细胞群体中癌干细胞数量的试剂的方法。

通过引用并入序列表

本申请含有对氨基酸和/或核酸序列的引用，所述氨基酸和/或核酸序列已经作为序列表文本文件“SeqListing0311192.txt”与本申请同时提交，其文件大小为1.12 KB，创建于2010年3月21日。上述序列表根据37 C.F.R. § 1.52(e)(5)整体通过引用并入本文。

背景

癌症是用来定义一组特征在于细胞增殖失调、分化异常和细胞凋亡缺陷的疾病的术语。这些肿瘤疾病共同都具有性质为多方面并且影响独特组织细胞，即所谓的“成体干细胞”的初始转化事件(例如，病毒感染、化学致癌物等)。认为这些转化事件生成负责肿瘤起始和癌症层次组织的“肿瘤/癌干细胞(CSC)”。然而，这种细胞尚未被明确地鉴定或随后表征。

肿瘤由在生长能力、形态和标志物表达方面不同的异质细胞群体组成。癌干细胞假说认为，除了CSCs以外，肿瘤包括小群体的转化扩增克隆原(transit amplifying clonogens)和大集合的分化恶性细胞(Reya等人, 2008; Jordan等人, 2006; Dalerba等人, 2007; Vermeulen等人, 2008)。癌干细胞，像其正常干细胞对应物，应该是未分化的，并且表现出不对称细胞分裂，导致自我更新和分化克隆原的产生，因此促进肿瘤异质性。此外，已经假设CSCs是标准化疗治疗难治的，尽管这种治疗方法经常导致根除最快速分裂的细胞，导致肿瘤应答，但没有导致CSC耗尽 (Gupta等人, 2009; Sharma等人, 2010; Bao等人, 2006; Trumpp等人, 2008; Dean等人, 2005; Costello等人, 2000; Guzman等人, 2002)。该模型解释了以下问题，即为什么标准人癌症化疗经常导致最初的肿瘤缩小，但最终大多数癌症复发，这是因为幸存的CSCs再生。因此，从临床的角度来看，CSCs的鉴定和分子表征对于癌症诊断、预后和新的治疗方法，包括靶向治疗具有根本性意义。

在实体瘤中，先前已经声称CSCs通过细胞表面免疫表型分析和肿瘤起始能力来鉴定。显示这些假定的CSC亚群在乳腺癌中表现出CD44⁺/CD24^{-/ 低}和α6整合素表型(AI-Hajj等人, 2003; Cariati等人, 2008; Fillmore等人, 2008; Ponti等人, 2005)，在脑瘤中表现出CD133⁺/巢蛋白⁺表型(Singh等人, 2004)，和在结肠癌中表现出CD133⁺表型(Ricci-Vitiani等人, 2007; O'Brien等人, 2007)，等。在前列腺癌中，也已经描述了表达高水平CD44的类似假定CSCs的亚群 (Collins等人, 2005; Patrawala等人, 2006; Li等人, 2008; Patrawala等人, 2007)。 可能该领域面临的最具挑战性的问题是，所述CSC亚群并不总是履行定义“干性(stemness)”的典型特性，主要是通过不对称细胞分裂生成分化的子代的能力。此外，上述表面表型亚群的存在在来自具有相同组织病理学诊断的患者的肿瘤组织样品中显著变化。在一些情况下，这些亚群相对少见，而在其他中，它们构成了肿瘤块的大部分 (Quintana等人, 2008; Rosen等人, 2009; Chen等人, 2010; Shmelkov等人, 2008)。这些观察结果突出CSCs一致鉴定的复杂性。

在通过CSCs的特征诸如干性鉴定CSCs中的一致性缺乏已经使对于靶向CSCs的可靠搜索方法变得站不住脚。具体地，鉴定可以调节分化或其他过程而影响细胞群体中CSCs的百分比的试剂已经变得不是可行的。

发明概述

本发明的一个实施方案是用于鉴定选择性地降低癌干细胞(CSCs)数量的试剂的方法。该方法包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触；并且

b. 确定候选试剂是否相对于还没有与候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化。

本发明的另一个实施方案是用于鉴定选择性降低细胞群体中癌干细胞(CSCs)百分比的试剂的高通量筛选方法。该筛选方法包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触；

b. 通过以下确定候选试剂是否相对于还没有与候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化：

i. 将用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较；

ii. 确定处理和未处理的细胞群体中活细胞的百分比，

iii. 确定处理和未处理的细胞群体中非CSC细胞的百分比；并且

iv. 确定处理和未处理的细胞群体中分裂细胞的百分比，

其中，(1)降低CSCs的百分比和降低细胞活力；(2)降低CSCs百分比而不降低细胞活力；(3) 降低CSCs的百分比且增加非CSCs的百分比； (4) 降低CSCs的百分比和降低细胞分裂；或(5) 降低CSCs的百分比而不降低细胞分裂的候选试剂是选择性降低CSCs的百分比的试剂。

本发明的另一个实施方案是用于鉴定选择性降低细胞群体中癌干细胞(CSCs)百分比的试剂的高通量筛选方法，其中CSCs对于标准化疗是难治的。该筛选方法包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触，其中CSC具有以下特性：HLA I^-和HLA II^-；

b. 通过以下确定候选试剂是否相对于还没有与候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化：

i. 使用流式细胞术将用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较；

ii. 使用细胞活力测定确定处理和未处理的细胞群体中活细胞的百分比，

iii. 使用细胞分化测定确定处理和未处理的细胞群体中非CSC细胞的百分比；并且

iv. 使用细胞分裂测定确定处理和未处理的细胞群体中分裂细胞的百分比，

其中，(1)降低CSCs的百分比和降低细胞活力；(2)降低CSCs百分比而不降低细胞活力；(3) 降低CSCs的百分比且增加非CSCs的百分比； (4) 降低CSCs的百分比和降低细胞分裂；或(5) 降低CSCs的百分比而不降低细胞分裂的候选试剂是选择性降低CSCs的百分比的试剂。

本发明的一个进一步实施方案是用于选择性杀死通过本发明的任何方法鉴定的CSCs的试剂。

本发明的一个额外实施方案是药物组合物。该药物组合物包含药学可接受的载体和本发明的试剂。

附图概述

本专利或申请文件含有至少一个以颜色绘制的图。本专利或专利申请公开的具有彩图的拷贝在要求和支付必要费用后由专利和商标局提供。

图1显示了在激素非依赖性前列腺癌细胞中表征多西他赛获得耐受性。图1a显示用渐增剂量多西他赛处理的亲本细胞(22RVI(左小图)和DU145(右小图))和多西他赛获得性耐受细胞(22RVI-DR和DUI45-DR)中细胞活力测定(MTs)的结果。红线表示用于敏感和耐受细胞的药物(多西他赛)的IC₅₀浓度。22RV1-DR多西他赛IC₅₀从25nM增加至10μΜ(增加400倍)，DU145-DR多西他赛IC₅₀从5nM增加至1μΜ(增加200倍)。图1b的左小图显示用渐增剂量多西他赛处理24小时的亲本和多西他赛耐受细胞的集落形成测定的定量分析。图1b的右小图显示用多西他赛连续处理21天的细胞的代表性集落形成测定(22RV1细胞中25nM，DU145细胞中5nM)。在敏感细胞中连续施用多西他赛后没有观察到任何集落，而在耐受细胞中观察到集落。在暴露于药物24小时后观察到类似结果。图1c显示了通过暴露于DMSO(对照)和多西他赛的细胞的膜联蛋白V和碘化丙啶染色而流式细胞术评价细胞凋亡的结果。图1d显示了如指示的各种细胞类型的PARP切割的Western印迹分析。图1(c)和(d)中显示的结果证明获得的多西他赛耐受表型与多西他赛细胞凋亡应答的缺乏相关联。

图2显示了多西他赛耐受细胞的表型表征和肿瘤起始能力。图2a左侧显示在DU145和22RV1细胞获得多西他赛耐受性过程中转录物表达至少2倍增加(↑)或减少(↓)的基因的维恩图。重叠基因= 247。图2a右侧是代表247个重叠基因的基因本体(GO)的直方图。代表具有统计学显著性(P≤0.01)的类别。用黑色星号(*)标记的GO类别涉及细胞增殖、细胞死亡和对药物的应答。用红色星号(*)标记的GO类别涉及发育过程。图2b显示发育基因的热图，该图通过使用Cluster和Treeview的层次成簇来组织。红色颜色编码表示高表达水平，绿色颜色编码表示低表达水平。信号值已经过log2转化。图2c显示匹配的亲本和多西他赛耐受细胞的细胞裂解物针对上皮分化标志物、前列腺相关标志物、MHC I类抗原、WNT/β-联蛋白通路蛋白、NOTCH信号传递蛋白和Hedgehog信号传递通路蛋白的免疫印迹和蛋白定量。图2d显示DU145 (2d)和22RV1 (2d对照)亲本和多西他赛耐受细胞中CKs和HLA I类抗原以及各种转录因子(去磷酸化的β-联蛋白、切割的NOTCH 2、Gli1和Gli2)的表达和亚细胞定位的免疫荧光分析。在与其亲本细胞比较后，发现多西他赛耐受细胞中发育转录因子的核定位。显示缺乏CKs的表达。图2e中提供了将亲本和多西他赛耐受细胞注射到NOD/SCID小鼠中之后显示肿瘤起始能力的直方图和总结肿瘤起始能力和肿瘤潜伏期的表格。*对应于p<0.001，且**对应于p <0.05。图2f显示DU145和22RV1亲本和多西他赛耐受细胞中CKs和HLA I类抗原的表达和亚细胞定位的免疫荧光分析。

图3显示了亲本多西他赛敏感细胞中细胞角蛋白阴性亚群的鉴定。图3a和3b显示了在亲本细胞(22RVI和DUI45)中CK (18和19)表达的流式细胞术和免疫荧光分析。在列(1)中显示的对于对照(未染色)、CK18、CK19和CK18+19染色细胞的流式细胞术分析的图代表群体。列(2)显示了3次独立实验中CK-细胞的定量。列(3)显示CK 18(红色)、CK19(绿色)和CK18+19的免疫荧光染色。白色箭头表示在两个亲本细胞系中的CK阴性细胞。图3c是两个初始工作假设的图示：通过多西他赛的转化相比于癌干细胞富集。

图4显示含有驱动GFP表达的CK19启动子的质粒的生成和验证和化疗富集具有CK-阴性/HLA-阴性表型的癌干细胞。图4a显示了生成的CK19启动子-GFP报道构建体的示意图。对应于人细胞角蛋白19启动子的1768 bp区域使用DU145细胞的基因组DNA通过PCR来扩增。启动子区域包括5' UTR区域的1142 bp，属于外显子1的480 bp和属于内含子1的146 bp。将PCR产物克隆到pEGFPNl中。获得的构建体具有在GFP蛋白编码区上游并调节其表达的CK19启动子。图4b显示了DU145和22RV1亲本细胞的CKs(红色)和HLA I类(绿色)的免疫荧光共染色。合并小图中的白色箭头指向具有CK-阴性/HLA I类阴性表型的细胞。代表性流式细胞术分析显示了两种不同的细胞群体：CK-阳性/HLA-阳性细胞的主要群体和具有CK-阴性/HLA-阴性表型的细胞的较小群体。图4c显示分选的用质粒稳定转染的GFP +和GFP-细胞的PCR结果。PCR验证GFP +和GFP- DU145分选的细胞中CK19报道构建体的稳定整合。GFP序列片段使用来自分选的用报道质粒稳定转染的GFP+和GFP- DU145细胞的基因组DNA作为模板来PCR扩增。使用未转染的亲本DU145细胞作为阴性PCR对照。

图5显示，化疗富集具有CK19-阴性、GFP阴性表型的癌干细胞。图5a显示工作假设的图示。图5b显示如所示在各个时间点用多西他赛(10 nM)处理的稳定转染的细胞的代表性系列图像。将未分选的DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞用多西他赛(10 nM)处理48h，并且通过延时显微镜成像以研究它们的行为。包括代表性实验的系列图像，其中黑色箭头指向经历细胞分裂并且在化疗后存活的GFP-细胞，而表达GFP的细胞在有丝分裂阻滞后开始死亡。图5c显示多西他赛处理48小时后存活的GFP-和GFP+细胞的百分比的代表性流式细胞术分析和定量。10nM多西他赛处理48小时后，通过流式细胞术分析来自小图(c)的细胞的GFP表达。三次独立实验的代表性图和定量显示，与未经处理的细胞(对照)相比，处理后存活的细胞的GFP-和GFP+群体的百分比有转化。图5d显示用多西他赛(10 nM)连续处理的分选的GFP-/HLA-和GFP+/HLA+细胞的代表性集落形成测定和定量。进行用10nM多西他赛连续培养和在不存在药物(对照)的情况下培养的GFP/HLA分选的DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞(GFP+/HLA+和GFP-/HLA-)的三次独立实验。*对应p<0.001。

图6显示了以下癌干细胞特征的表征：不对称细胞分裂、肿瘤起始和分化。图6a显示描述经历不对称分裂的GFP- (CK-阴性/HLA I类-阴性)细胞的稳定转染的细胞的代表性系列图像。将未分选且未处理的DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞在24小时期间通过延时显微镜成像。代表性实验的系列图像显示不对称分裂且产生GFP+子细胞的GFP- (CK-阴性)细胞。图6b显示在不同时间点源自GFP阴性和GFP阳性分选细胞的GFP细胞群体的代表性流式细胞术分析和定量。将DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞GFP分选，并且将GFP+和GFP-细胞分别铺板，并且生长不同时间段。在不同时间点(第1天、2周、4周)源自GFP-和GFP+分选细胞的培养细胞的三次独立实验的代表性流式细胞术分析图和定量。图6c显示从GFP-阴性/CK-阴性/HLA I类阴性细胞生成的肿瘤异种移植物中分化标志物(GFP、CKs和HLA I类)的实验设计和结果以及免疫荧光分析的示意图。实验设计的示意图显示将GFP/HLA 分选的DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞注射到NOD/SCID 小鼠中和获得的肿瘤。进行三次独立实验，对于每种分选的细胞群体(例如，GFP-阴性/HLA I类阴性)和细胞稀释物(10、100和1000个细胞)包括8只小鼠。显示从GFP-阴性/CK-阴性/HLA I类阴性细胞生成的异种移植肿瘤中分化标志物(GFP、CKs和HLA I类)的代表性免疫荧光分析。图6d中显示将GFP+/HLA+和GFP-/HLA-分选细胞注射到NOD/SCID小鼠中后的肿瘤潜伏期和肿瘤起始能力的定量。*对应于p<0.001，且**对应于p <0.05。条对应于100μm。

图7显示人原发性和转移性前列腺癌组织中的癌干细胞的鉴定。图7a显示在来自两名患者(患者1具有匹配的原发性和转移性肿瘤)的代表性组织样品中的CK18和CK19 免疫组织化学表达。直方图显示来自独立患者的原发性(n = 6)和转移性(n = 20)组织样品中CK-阴性和阳性细胞的百分比。图7b-7d显示在分析的组织样品中CK阴性和阳性细胞的定量，以及基于CKs(CK18 +19)和HLA I类抗原(图7b)、转录因子(切割的Notch-2、活性β-联蛋白、Glil和Gli2)(图7c)和雄激素受体(AR)(图7d)的共表达的代表性免疫荧光分析。显示在鉴定的CK-阴性/HLA-阴性肿瘤细胞中转录因子的核染色。条对应于100μm。

图8显示了HLA I类分选细胞的克隆性能力。进行代表DU145 HLA I类分选细胞的代表性稀释物(10、100和1000个细胞)集落形成测定和三次独立实验的定量。HLA I类阴性分选细胞显示与HLA I类阳性分选细胞相比统计学显著更高的集落形成。*对应于p <0.05。

图9显示，来自不同新鲜人癌症类型的HLA I类阴性上皮肿瘤细胞在NOD/SCID小鼠中具有肿瘤起始能力。图9a显示HLA I类阴性和阳性肿瘤细胞的代表性分选图。图9b显示人前列腺癌HLA分选细胞的稀释测定后的肿瘤起始能力和肿瘤潜伏期。图和对应表格总结了直接来自新鲜人样品(初始注射)和NOD/SCID小鼠中的衍生的异种移植物(二次注射)的人前列腺癌HLA分选细胞(HLA-和HLA+)和未分选的细胞的不同稀释物(10、100和1000个注射的细胞)的肿瘤起始能力和肿瘤潜伏期。对于每种分选的细胞群体和细胞稀释物，在四只小鼠的上侧(HLA-阴性)和下侧(HLA-阳性)注射两次。图9c显示用10² HLA I类-阴性细胞(上)和HLA I类-阳性细胞(下)注射的NOD/SCID小鼠中的代表性肿瘤异种移植物形成。由注射产生的肿瘤通过在人原发性肿瘤和从初次和第二次注射产生的异种移植肿瘤中进行的组织(H＆E)和免疫荧光(CKs、雄激素受体 (AR)和前列腺特异性膜抗原(PSMA))研究被验证为前列腺癌。图9d显示代表其他人癌症(结肠癌、肺癌、乳腺癌和膀胱)HLA分选细胞的稀释测定后的肿瘤起始能力和肿瘤潜伏期。进行来自其他人癌症类型的100个HLA分选细胞的初始和第二次注射。对于每种分选的细胞群体和细胞稀释物，在四只小鼠的上侧(HLA-阴性)和下侧(HLA-阳性)注射两次。图9e显示人原发性和匹配的衍生异种移植物的组织学(H＆E)表征。*对应于p<0.001，**对应于p <0.05，且***对应于p>0.05。条对应于100μm。

图10显示在鉴定的癌干细胞中NOTCH和Hedgehog通路抑制的体外和体内效果。图10a显示当72小时期间暴露于单独或组合(C+CE)的环杷明(C)、化合物-E(CE)时在亲本(DU145和22RV1) HLA-阴性和阳性分选肿瘤细胞中的观察到的亚G1效果的代表性细胞周期分析和定量。图10b显示连续暴露于地塞米松(D)和与图10a中相同的药物的组合时在亲本(DU145和22RV1)分选的HLA-阴性和阳性肿瘤细胞的代表性集落形成测定和定量。图10c显示在将10³ 22RV1和DU145 HLA-阴性分选细胞注射到NOD/SCID小鼠中且暴露于媒介物溶液(对照)、地塞米松(D)、环杷明加地塞米松(D+C)、DBZ加地塞米松(D+DBZ)或三组合(D+C+DBZ)之后的肿瘤起始能力和潜伏期。进行三次独立实验，对于每种HLA分选的细胞系和处理(例如环杷明)包括8只小鼠。图10d显示将来自人前列腺癌异种移植物＃5、＃9和＃12的10³ HLA-阴性分选细胞注射进NOD/SCID小鼠并暴露于与图10c中相同药物和浓度之后的肿瘤起始能力和潜伏期。对于每种前列腺癌情况和处理，实验包括8只小鼠。*对应于p <0.05。

图11显示缺乏细胞角蛋白的肿瘤细胞表现出阴性AR表型。

图12显示了前列腺癌细胞中获得多西他赛耐受性的逆转。图12a显示在各个时间段(4，8和12周)过程中无药物培养的多西他赛耐受细胞(22RV1-DR和DU-145-DR)和多西他赛耐受细胞的细胞活力测定(MTs)的％细胞活力的定量。红线表示用于获得的耐受和逆转的耐受细胞的药物(多西他赛)的IC₅₀浓度。无药物培养的获得的多西他赛耐受细胞以时间依赖的方式变得对多西他赛越来越敏感。停药12周后，22RV1-DR多西他赛IC₅₀从10μΜ下降至50nM，DU145-DR多西他赛IC₅₀从1μΜ下降至25nM。图12b的右小图显示用渐增剂量多西他赛处理24小时的多西他赛耐受细胞和无药物培养的多西他赛耐受细胞的集落形成测定的定量分析。图12b的左小图显示用多西他赛连续处理的细胞的代表性集落形成测定。结果验证了获得的多西他赛耐受性的逆转，因为当用多西他赛处理时逆转的耐受细胞形成更少集落。

图13显示在DU145和22RV1细胞中与分化细胞表型恢复相关联的多西他赛耐受性逆转。图13的左小图显示western印迹分析，且图13的右小图显示直方图，其是亲本敏感细胞、多西他赛获得耐受细胞和多西他赛逆转耐受细胞中上皮分化标志物(CK18和CK19)和HLA I类抗原的表达的蛋白定量。逆转的耐受细胞表现出比多西他赛获得耐受细胞更高的蛋白表达水平，实现与亲本敏感细胞中观察到的那些类似的水平。

图14显示含有驱动GFP表达的CK19启动子的质粒的生成和验证。图14a显示了用pCK19-GFP质粒稳定转染的DU145亲本细胞的CK19(红色)和GFP(绿色)的免疫荧光染色。合并小图中的白色箭头指向缺乏CK19和GFP表达的细胞。流式细胞术定量验证了存在内源CK和GFP的共表达，从而验证了GFP表达作为该稳定细胞系中CK表达的读出值的用途。图14b显示了用pCK19-GFP质粒稳定转染的DU145亲本细胞的HLA I类(红色)和GFP(绿色)的免疫荧光染色。合并小图中的白色箭头指向缺乏HLA I类和GFP表达的细胞。流式细胞术定量确认GFP和HLA I类抗原的共表达。表达GFP的细胞是HLA I类阳性的，而不表达GFP的细胞也是HLA I类阴性的。

图15显示了HLA I类分选细胞的肿瘤起始能力。亲本DU145和22RV1细胞通过HLA标志物表达进行分选。将HLA-阴性和HLA-阳性群体的两种不同细胞稀释物(10和100个细胞)注射到NOD/SCID小鼠中。进行三次独立实验，对于每种HLA分选的细胞系和细胞稀释度包括8只小鼠。上小图中的图和下小图中的对应表格总结了这三次独立实验分别的肿瘤起始能力和肿瘤潜伏期。在这两个细胞系中，仅注射10个HLA-阴性分选细胞显示致瘤能力，而10个HLA阳性细胞不形成肿瘤。*对应p<0.0001。

图16显示从注射GFP-阴性/HLA-阴性分选细胞生成的肿瘤异种移植物的GFP/HLA亚群的定量。肿瘤异种移植物中GFP/HLA细胞亚群的代表性流式细胞术分析图和定量显示，观察到两种不同的细胞群体：GFP -阳性/HLA-阳性细胞的主要群体和具有GFP-阴性/HLA-阴性表型的细胞的较小群体。

发明详述

已经发现标准化疗难治的CSC。尽管化疗根除某些肿瘤细胞亚群包括分裂细胞，但是它无法耗尽鉴定的CSC群体。这提供了关于以下问题的解释，即为什么标准化疗经常导致最初的肿瘤缩小，但最终大多数癌症复发，这是因为幸存的CSCs再生。鉴定降低或根除如本文定义的CSCs数量的试剂将推动癌症治疗领域。

已经开发了本发明的方法来鉴定选择性降低本文鉴定的具有表型特征和CSCs的功能性化疗耐受性的癌干细胞(“CSCs”)的数量的试剂。本发明的体外筛选提供了用于测试候选试剂以鉴定可以降低CSC的生存或生长或增加CSC的分化的试剂的测定。测定的实施允许测试各种各样的候选试剂并且促进鉴定具有假定CSC抑制作用的试剂。

相应地，本发明的一个实施方案是用于鉴定选择性地降低癌干细胞(CSCs)数量的试剂的方法。该方法包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触；并且

b. 确定候选试剂是否相对于还没有与候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化。

癌干细胞(“CSC”)是HLA^-的癌细胞。这种细胞进一步由作为CD24^-、CD133^-、Notch⁺、Gli1⁺、Gli2⁺、胶质原纤维酸性蛋白^- (GFAP^-)、神经丝^-和细胞角蛋白^-中的至少一种所定义。此外，也可以考虑任何或所有上述的组合。这种CSCs进一步由具有以下额外特性中的至少一种所定义：自我更新的能力、经历不对称细胞分裂、具有致瘤能力、具有转移潜能、具有多向分化特性、对Notch和Hedgehog抑制剂敏感和具有广泛的化学耐受性。此外，也可以考虑任何或所有上述的组合。CSCs进一步特性列举在，例如，表1中。表1中任何鉴定的特征连同HLA^-的组合对于鉴定CSC细胞是足够的。

表1总结了许多进一步定义癌干细胞表型的生物标志物。这种表型可包括“胚胎干细胞”和“组织/成体干细胞”的发育通路和生物标志物诸如某些同源盒调节因子(例如，Sox2、Sox4)、干细胞标志物(例如，Scal、Gata2、Gata3、巢蛋白)、转录因子(例如，Notch-2、Glil、Gli2、核β-联蛋白)、不对称细胞分裂(例如，RMND5A)和多药耐受性相关的膜转运蛋白(例如，MDRI/P-糖蛋白、MRP1、MRP2、MRP3、ABC3)的表达。主要相关性中，这些CSCs通常缺乏组织相容性蛋白包括所有HLA I类和HLA II类分子的表达，这有助于逃逸宿主免疫监视，因此对于转移扩散是关键的。

如本文所使用的，“HLA I^-”是指没有主要组织相容性复合体(MHC) I类分子。MHC是表现在细胞表面上的负责淋巴细胞识别和抗原递呈的一组分子。MHC I类分子将抗原递呈至细胞毒性T细胞。MHC I类分子被发现在几乎所有类型的体细胞上。

如本文所使用的，“HLA II^-”是指没有主要组织相容性复合体(MHC) II类分子。MHC II类分子将抗原递呈至辅助性T细胞。MHC II类分子仅被发现在巨噬细胞、树突状细胞和B细胞上。“HLA^-”优选是指“HLA I^-”和“HLA II^-”。

可以使用基于例如特定细胞表面标志物的表达或不表达鉴定细胞和维持细胞活力的任何常规或已知技术完成从癌细胞群体鉴定HLA^-细胞。优选地，该鉴定通过如实施例中更详细公开的荧光激活细胞分选(FACS)分析来实施。

如本文所使用的，“自我更新的能力”是指，例如，CSC具有通过许多细胞分裂周期同时保持其未分化状态的能力。

如本文所使用的，“不对称细胞分裂”是指，例如，能够具有导致产生具有不同特性的两个细胞的细胞分裂，诸如例如一个细胞保持CSC表型，而另一个细胞被编程，例如，来分化。

如本文所使用的，“致瘤能力”是指，例如，细胞，诸如CSC，当被移植到宿主动物中时具有生成肿瘤的能力。

如本文所使用的，“转移潜能”是指，例如，细胞诸如CSC在机体中移动至第二位置，即转移和生成肿瘤的能力。

如本文所使用的，“多向分化特性”是指，例如，细胞分化成多于一种细胞类型的能力。

如本文所使用的，“对Notch和Hedgehog抑制剂的敏感性”是指细胞，诸如CSC受Notch和Hedgehog通路的抑制剂所调节。这种抑制剂是本领域中已知的。参见例如K. Garber, JNCI, 99(17): 1284-1285 (2007) (Notch抑制剂)和Martinson等人, 美国专利号7,695,965 (hedgehog抑制剂)。

如本文所使用的，“广泛的化学耐受性”是指细胞诸如CSC，对一定范围的化学试剂，诸如，例如，用于治疗癌症的试剂是耐受的。如本文所使用的，用于治疗癌症的试剂进行广义理解，并且可以包括任何已知的化疗化合物、组合物或其组合。例如，试剂可以是DNA损伤药物和/或抗有丝分裂剂。试剂的进一步非限制性实例包括：微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇、米托蒽醌、顺铂、多西他赛、秋水仙素类似物、三尖杉酯碱、高三尖杉酯碱、喜树碱、喜树碱类似物、鬼臼毒素、以及它们的组合。

如本文所使用的，“细胞群体”是指不同细胞的混合物。例如，CSCs不必与细胞类型诸如例如癌细胞群体的其余部分相分离。

如本文所使用的，“癌细胞群体”或“癌/肿瘤细胞群体”被广义地解释为包括癌/肿瘤细胞系，例如通过例如ATCC容易获得并且可能永生化的(例如，可以在体外无限繁殖)的癌/肿瘤细胞系和例如从受试者诸如人、兽医动物或研究动物诸如小鼠、大鼠等获得的非永生化癌材料(“非永生化样品”)的样品。癌材料可以是例如从活检或其他外科程序，从例如实体肿瘤、基于血液的肿瘤或神经系统肿瘤获得的细胞和/或组织和/或流体。癌材料来源的非限制性实例也包括血液、血浆、尿、脑脊液、腹水、肿瘤腹水、以及它们的组合。

因此，癌细胞群体可以使用众所周知的技术、包括在下面实施例中公开的那些通过从细胞培养物收获癌细胞而获得。此外，癌细胞群体可以通过从癌症患者获取肿瘤样品而获得。癌细胞群体可以是原发性癌细胞或转移性癌细胞。癌细胞可源自各种组织来源，例如，前列腺癌细胞、膀胱癌细胞、结肠癌细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞、黑色素瘤或肉瘤。在本发明范围内的其他这些癌症的进一步非限制性实例包括白血病、淋巴瘤和胶质瘤。

根据本发明的细胞群体也可以是针对HLA I^-和HLA II^-的细胞进行富集的哺乳动物CSC系。“哺乳动物”优选是指人、小鼠或其他研究哺乳动物，诸如例如，大鼠。如本文所使用的，“富集的”是指相对于没有用例如用于治疗癌症的试剂处理的对照细胞系，具有增加的CSCs数量的癌细胞系。增加数量的CSCs可以是短暂的，例如，一些CSC可能分化，或者可以持续较长时间。此外，这种细胞系可能纯或可能不纯，例如，基本上不含HLA⁺细胞。

如上所述，CSCs可以具有以下额外特性中的至少一种：CD24^-、CD133^-、Notch⁺、Gli1⁺、Gli2⁺、GFAP^-、神经丝^-和细胞角蛋白^-。此外，也可以考虑任何或所有上述的组合。CSCs可以进一步具有以下特性中的至少一种：自我更新的能力、经历不对称细胞分裂、具有致瘤能力、具有转移潜能、具有多向分化特性、对Notch和Hedgehog抑制剂敏感和具有广泛的化学耐受性。此外，也可以考虑任何或所有上述的组合。

在该实施方案的一个方面，CSCs可能是标准化疗难治的。如本文所使用的，“难治的”是指耐受的。例如，癌/肿瘤细胞的样品可以源自对化疗耐受的受试者的癌材料的样品，或者CSCs可以从对化疗耐受的癌症细胞系获得。用于生成这种耐受肿瘤细胞系的方法在本领域中是已知的，并且在实施例中进一步详细公开。

在该实施方案的另一个方面，候选试剂选自化学剂、生物剂和其组合。如本文所使用的，“生物剂”是指源自活生物体或由活生物体产生或合成以模拟体内衍生的试剂或其衍生物或产物的物质。生物剂可以是，例如，核酸、多肽或多糖。“化学剂”是指具有确定化学组成和特征特性且不是生物剂的物质。化学剂的非限制性实例包括有机小化合物和无机小化合物。候选试剂的非限制性实例包括本文实施例中公开的Hedgehog和Notch抑制剂。

在该实施方案的一个额外方面，所述确定步骤进一步包括将用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较，其中与未经处理的细胞中的CSCs百分比相比降低处理的细胞群体中CSCs百分比的候选试剂是选择性降低CSCs数量的试剂。

在该实施方案的另一个方面，所述确定步骤包括进行选自以下的程序：流式细胞术分析、细胞活力测定、细胞分化测定、细胞分裂测定以及它们的组合。

如上所述，流式细胞术，诸如FACS，可用于从非CSC分离和/或鉴定CSCs。它也可用于评价细胞活力、分化或分裂。

如本文所使用的，“细胞活力”测定法是从死细胞鉴定和/或分离活细胞的测定法。细胞活力测定法的一个非限制性实例公开于实施例中。

如本文所使用的，“细胞分化”测定法是如实施例中公开的基于例如细胞分化标志物诸如例如细胞角蛋白表达而鉴定和/或分离分化细胞或非分化细胞的测定法。

如本文所使用的，“细胞分裂”测定法是如实施例中公开的例如通过进行细胞周期分析从未分裂细胞鉴定和/或分离分化细胞的测定法。

在本实施方案的另一个方面，细胞群体包含CSCs和成体干细胞，并且所述试剂降低细胞群体中CSCs的数量，而基本上不降低成体干细胞的数量。如本文所使用的，“成体干细胞”是指胚胎发育后，在整个机体诸如成人机体发现的未分化细胞，其通过细胞分裂增殖以补充死亡细胞和再生受损组织。成体干细胞充当机体的修复系统。因此，基本上不降低成体干细胞数量的试剂将基本上不影响机体的正常修复系统。

本发明的方法可以使用高通量筛选来实施。优选高通量筛选来使筛选降低CSCs数量的潜在化合物或生物剂的能力最大化。

如本文所使用的，短语“高通量筛选”或“高通量筛选方法”定义了其中对于针对目标分子或目标细胞诸如例如CSC的生物活性快速且平行测试大量试剂例如化合物的过程。在某些实施方案中，“大量试剂例如化合物”可以是，例如，多于100或多于300或多于500或多于1,000种化合物。优选地，该过程是自动化过程。

在本实施方案的另一个方面，所述确定步骤可以进一步包括如下的步骤i和步骤ii、iii和iv中的至少一个：

i. 将用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较；

ii. 确定处理和未处理的细胞群体中活细胞的百分比；

iii. 确定处理和未处理的细胞群体中非CSC细胞的百分比；并且

iv. 确定处理和未处理的细胞群体中分裂细胞的百分比；

其中，(1)降低CSCs的百分比和降低细胞活力；(2)降低CSCs百分比而不降低细胞活力；(3) 降低CSCs的百分比且增加非CSCs的百分比； (4) 降低CSCs的百分比和降低细胞分裂；或(5) 降低CSCs的百分比而不降低细胞分裂的候选试剂是选择性降低CSCs数量的试剂。

优选地，所述确定步骤包括进行选自以下的程序：流式细胞术分析、细胞活力测定、细胞分化测定、细胞分裂测定以及它们的组合。

本发明的另一个实施方案是用于鉴定选择性降低细胞群体中癌干细胞(CSCs)百分比的试剂的高通量筛选方法。该筛选方法包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触；

b. 通过以下确定候选试剂是否相对于还没有与候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化：

i. 将用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较；

ii. 确定处理和未处理的细胞群体中活细胞的百分比，

iii. 确定处理和未处理的细胞群体中非CSC细胞的百分比；并且

iv. 确定处理和未处理的细胞群体中分裂细胞的百分比，

其中，(1)降低CSCs的百分比和降低细胞活力；(2)降低CSCs百分比而不降低细胞活力；(3) 降低CSCs的百分比且增加非CSCs的百分比； (4) 降低CSCs的百分比和降低细胞分裂；或(5) 降低CSCs的百分比而不降低细胞分裂的候选试剂是选择性降低CSCs的百分比的试剂。上文公开了CSC的特性。

本实施方案的步骤(i)优选通过流式细胞术实施。

本实施方案的步骤(ii)优选通过细胞活力测定法实施。

本实施方案的步骤(iii)优选通过细胞分化测定法实施。

本实施方案的步骤(iv)优选通过细胞分裂测定法实施。

在该实施方案的另一个方面，候选试剂选自化学剂、生物剂和其组合。

在该实施方案的一个额外方面，CSCs是标准化疗难治的。

本发明的进一步实施方案是用于鉴定选择性降低细胞群体中癌干细胞(CSCs)百分比的试剂的高通量筛选方法，其中CSCs对于标准化疗是难治的。该方法包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触，其中CSC具有以下特性：HLA I^-和HLA II^-；

b. 通过以下确定候选试剂是否相对于还没有与候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化：

i. 使用流式细胞术将用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较；

ii. 使用细胞活力测定确定处理和未处理的细胞群体中活细胞的百分比，

iii. 使用细胞分化测定确定处理和未处理的细胞群体中非CSC细胞的百分比；并且

iv. 使用细胞分裂测定确定处理和未处理的细胞群体中分裂细胞的百分比，

其中，(1)降低CSCs的百分比和降低细胞活力；(2)降低CSCs百分比而不降低细胞活力；(3) 降低CSCs的百分比且增加非CSCs的百分比； (4) 降低CSCs的百分比和降低细胞分裂；或(5) 降低CSCs的百分比而不降低细胞分裂的候选试剂是选择性降低CSCs的百分比的试剂。如上文公开的，进一步定义了CSC的特性。

在该实施方案的一个方面，候选试剂选自化学剂、生物剂和其组合。

本发明的一个进一步实施方案是用于选择性杀死通过本文公开的方法鉴定的CSCs的试剂。

本发明的另一个实施方案是包含药学可接受的载体和上文鉴定的选择性杀死CSCs的试剂或其药学可接受的盐的药物组合物。

如本文所使用的药学可接受的盐是用于选择性地杀死CSCs的试剂与生理上相容的无机酸或有机酸的盐，所述无机酸诸如盐酸、硫酸、亚硫酸或磷酸，所述有机酸诸如甲磺酸、对甲苯磺酸、乙酸、乳酸、三氟乙酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、酒石酸、琥珀酸或水杨酸。术语“药学可接受的盐”是指这些盐。其中存在酸性基团的试剂还可以与碱形成盐。这些盐的实例是碱性盐、碱土盐和铵盐，诸如例如钠盐、钾盐、钙盐和三甲基铵盐。术语“药学可接受的盐”还指这些盐。

本发明的药物组合物可以任何所需和有效的方式进行施用：用于口服，或作为软膏或滴剂用于眼睛的局部施用，或用于以任何适当方式的肠胃外或其他施用，诸如腹膜内、皮下、局部、皮内、吸入、肺内、直肠、阴道、舌下、肌内、静脉内、动脉内、鞘内、或淋巴内。进一步，本发明的药物组合物可以连同其他治疗进行施用。如果需要，本发明的药物组合物可以进行封装或以其他方式保护免于胃或其他分泌物的破坏。

本发明的药物组合物包含一种或多种活性成分，例如，一种或多种通过本发明的方法鉴定的试剂，其与一种或多种药学可接受的载体和，任选地，一种或多种其他化合物、药物、成分和/或材料相混合。无论选择的施用途径，通过本领域技术人员已知的常规方法将本发明的试剂/化合物配制成药学可接受的剂型。参见例如Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21^st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA.)。

药学可接受的载体是本领域众所周知的(参见例如，Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21^st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA.)和The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.))，包括糖类(例如乳糖、蔗糖、甘露糖醇和山梨糖醇)、淀粉、纤维素制剂、磷酸钙(例如，磷酸二钙、磷酸三钙和磷酸氢钙)、柠檬酸钠、水、水溶液(例如，盐水、氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏液)、醇类(例如，乙醇、丙醇和苄醇)、多元醇(例如，甘油、丙二醇和聚乙二醇)、有机酯类(例如，油酸乙酯和甘油三酯)、可生物降解的聚合物(例如，聚交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酐))、弹性体基质、脂质体、微球、油类(例如，玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、棉籽油和花生油)、可可脂、蜡类(例如，栓剂蜡)、石蜡、有机硅、滑石粉、水杨酸酯(silicylate)等。用于本发明的药物组合物中的每种药学可接受的载体在与制剂的其他成分相容且对受试者无害的意义上必须是“可接受的”。适用于选择剂型和预期施用途径的载体在本领域中是众所周知的，并且用于选择剂型和施用方法的可接受的载体可以使用本领域普通技术进行确定。

本发明的药物组合物可任选地含有通常用于这种药物组合物中的额外成分和/或材料。这些成分和材料在本领域是众所周知的，并且包括(1) 填充剂或膨胀剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(2) 粘合剂，诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和阿拉伯树胶；(3) 保湿剂，诸如甘油；(4) 崩解剂，诸如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和碳酸钠；(5) 溶液延迟剂，诸如石蜡；(6) 吸收加速剂，诸如季铵化合物；(7) 润湿剂，诸如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8) 吸收剂，诸如高岭土和膨润土粘土；(9) 滑润剂，诸如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和月桂基硫酸钠；(10) 悬浮剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶；(11) 缓冲剂；(12) 赋形剂，诸如乳糖、牛奶糖、聚乙二醇、动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、可可油、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、硅酸、滑石粉、水杨酸盐、氧化锌、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末；(13) 惰性稀释剂，诸如水或其他溶剂；(14) 防腐剂；(15) 表面活化剂；(16) 分散剂; (17) 控制释放或吸收延迟剂，诸如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基质、可生物降解的聚合物、脂质体、微球、单硬脂酸铝、明胶和蜡类；(18) 遮光剂；(19) 佐剂；(20) 润湿剂；(21) 乳化剂和悬浮剂；(22), 增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油 (具体而言，棉子油、花生油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、山梨聚糖的脂肪酸酯；(23) 推进剂，诸如氯氟烃和挥发性未取代烃，诸如丁烷和丙烷；(24) 抗氧化剂；(25) 使制剂与预期受体的血液等渗的试剂，诸如糖类和氯化钠；(26) 增稠剂；(27) 包衣材料，诸如卵磷脂；和(28) 甜味料、香料、着色剂、芳香剂和防腐剂。每种这样的成分或材料在与制剂的其他成分相容且对受试者无害的意义上必须是“可接受的”。适用于选择剂型和施用途径的成分和材料在本领域中是众所周知的，并且用于选择剂型和预期施用方法的可接受成分和材料可以使用本领域普通技术进行确定。

适用于口服施用的药物组合物可以是胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、粉剂、颗粒剂、水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油或油包水液体乳剂、酏剂或糖浆、锭剂、丸剂、干药糖剂或糊状物的形式。这些制剂可通过本领域中已知的方法，例如，借助传统的盘式包衣、混合、造粒或冷冻干燥过程来制备。

用于口服施用的固体剂型(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂、粒剂等)可以，例如，通过将一种或多种活性成分与一种或多种药学可接受的载体，和任选地，一种或多种填料、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、溶液延迟剂、吸收促进剂、润湿剂、吸收剂、润滑剂、和/或着色剂混合来制备。相似类型的固体组合物可以用作使用合适的赋形剂的软和硬填充明胶胶囊中的填料。片剂可通过任选地与一种或多种辅助成分压制或模制来制备。压制片剂可使用合适的粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂、表面活性剂或分散剂来制备。模压片剂可通过在合适机器中模压而制备。片剂和其他固体剂型诸如糖衣丸、胶囊、丸剂和颗粒剂可任选地使用药物配制领域中众所周知的包衣和外壳诸如肠溶包衣和其他包衣进行刻痕或制备。它们还可配制以提供其中活性成分的缓慢或控制释放。它们可以通过，例如，过滤通过细菌截留滤器而进行除菌。这些组合物还可任选地含有遮光剂，并且可以是组合物，使得它们仅或优选地在胃肠道的某些部分中，任选地，以延迟方式释放活性成分。活性成分还可以是微胶囊化的形式。

用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液剂、微乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆和酏剂。液体剂型可包含通常适用于本领域的惰性稀释剂。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括辅剂诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、增甜剂、着味剂、着色剂、香味剂和防腐剂。悬浮剂可包括助悬剂。

用于直肠或阴道施用的药物组合物可以制成栓剂，其可以通过将一种或多种活性成分与一种或多种合适的无刺激性的载体(在室温下为固体，但在体温下为液体，因此，在直肠或阴道腔内将熔化并且​​释放活性化合物)混合来制备。适用于阴道施用的药学组合物还包括阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂，其含有本领域已知适当的这种药学可接受的载体。

用于局部或透皮施用的剂型包括粉剂、喷剂、膏剂、糊剂、乳剂、洗液、凝胶剂、溶液剂、贴剂、滴剂和吸入剂。活性剂/化合物可在无菌条件下与合适的药学可接受的载体混合。膏剂、糊剂、乳剂与凝胶剂可包含赋形剂。粉末与喷剂可以包含赋形剂和推进剂。

适于胃肠外施用的药物组合物包含一种或多种试剂/化合物组合一种或多种药学可接受的无菌等渗含水或非水溶液、分散剂、混悬剂或乳液剂，或在临用前即时可重构成无菌注射溶液或分散剂的无菌粉末，其可包含合适的抗氧化剂、缓冲剂、使制剂与目标受体的血液等渗的溶质或者助悬剂或增稠剂。例如通过使用涂敷材料(coating materials)，在分散剂的情况下通过保持期望颗粒大小以及通过使用表面活性剂可维持适当的流动性。这些组合物还可包含合适的辅剂，诸如润湿剂、乳化剂和分散剂。还可以期望包括等渗剂。另外，通过包含延迟吸收剂可导致注射药物形式的吸收延长。

在一些情况下，为了延长药物(例如，药物制剂)的效果，期望减慢其从皮下或肌内注射的吸收。这可通过使用具有差水溶性的晶体或无定形材料的液体悬浮液来实现。

活性剂/药物的吸收速率然后取决于其溶解速率，其溶解速率进而可能取决于晶体大小和结晶形式。或者，肠胃外施用的试剂/药物的延迟吸收可以通过将活性剂/药物溶解或悬浮在油媒介物中而实现。可注射的储存形式可通过在可生物降解的聚合物中形成活性成分的微胶囊基质而形成。根据活性成分与聚合物的比例和采用的特定聚合物的性质，可以控制活性成分释放的速率。储存注射制剂也通过将药物包埋在与机体组织相容的脂质体或微乳液中而制备。可注射的材料可以通过，例如，过滤通过细菌截留滤器而进行除菌。

制剂可以提供在单位剂量或多剂量密封的容器中，例如安瓿和小瓶中，并且可以储存在冻干条件下，仅需要在临使用前添加无菌液体载体，例如注射用水。可以从上述类型的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备临时注射溶液和悬浮液。

额外定义

本文所用术语只用于描述具体实施方案的目的，并无意限制。如本说明书和随附权利要求所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。

对于本文叙述的数字范围，明确包括每一个介于其间的具有相同精确度的数字。例如对于6-9的范围，除6和9以外还包括数字7和8，对于6.0-7.0的范围，还明确包括数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6,9和7.0。

核酸

本文所用“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指至少两个核苷酸共价连接在一起。单链的描述也限定了互补链的序列。因此，核酸还包括所描述单链的互补链。核酸的许多变体可用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还包括基本相同的核酸及其互补序列。单链提供可在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还包括在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可为单链或双链，或可含有双链和单链序列两者的部分。核酸可以是DNA (基因组和cDNA两者)、RNA或杂合体，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合及包括以下碱基的组合：尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。核酸可以合成为单链分子，或使用合成基因在细胞(在体外或体内)中表达。核酸可通过化学合成方法或通过重组方法获得。

核酸也可以是RNA诸如mRNA、tRNA、shRNA、siRNA、Piwi-相互作用RNA、pri-miRNA、pre-miRNA、miRNA、或抗-miRNA，如描述于，例如，美国专利申请号11/429,720、11/384,049、11/418,870和11/429,720和公开的国际申请号WO 2005/116250和WO 2006/126040。

siRNA基因靶向可以通过将siRNA瞬时转移到细胞中来实施，通过经典方法如脂质介导的转染(诸如封装在脂质体中，与阳离子脂质、胆固醇和/或缩合聚合物复合，电穿孔，或显微注射)来实现。siRNA基因靶向也可以通过施用与抗体缀合的siRNA或与融合蛋白复合的siRNA来实施，所述融合蛋白包含与结合siRNA的双链(ds)RNA结合结构域(DRBD)缀合的细胞穿透肽(参见例如，美国专利申请公开号2009/0093026)。

核酸也可以是适配体(aptamer)、intramer或spiegelmer。术语“适配体”是指结合特定分子目标的核酸或寡核苷酸分子。适配体源自体外进化过程(例如，SELEX(通过指数富集系统进化配体)，公开于美国专利号5,270,163)，其从大组合文库选择目标特异性适配体序列。适配体组成可以是双链或单链的，并且可包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核苷酸衍生物或其他核苷酸样分子。适配体的核苷酸组分可以具有经修饰的糖基(例如，核糖核苷酸的2'-OH基团可以被2'-F或2'-NH₂替代)，这可以改善期望的特性，例如，对核酸酶的耐受性或血液中更长的寿命。适配体可以是缀合至其他分子，例如，高分子量载体，以减慢适配体从循环系统的清除。可以将适配体特异性交联到其同源配体，例如，通过光激活交联剂(Brody, E. N.和L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13)。

术语“intramer”是指在体内表达的适配体。例如，基于牛痘病毒的RNA表达系统已用于在白细胞的细胞质中以高水平表达特异性RNA适配体(Blind, M.等人(1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610)。

术语“spiegelmer”是指其包括L-DNA、L-RNA或其他左手核苷酸衍生物或核苷酸样分子的适配体。含有左手核苷酸的适配体对天然存在的酶的降解耐受，其通常作用于含有右手核苷酸的底物。

核酸一般含有磷酸二酯键，但可包括可具有至少一个不同键的核酸类似物(所述键例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯(methylphosphoroamidite)键)和肽核酸骨架和或多个键。其他核酸类似物包括具有阳性骨架、非离子骨架和非核糖骨架的核酸，包括美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的核酸。含有一个或多个非天然存在的或修饰核苷酸的核酸也包括在核酸的定义中。修饰核苷酸类似物可位于例如核酸分子的5'端和/或3'端。核苷酸类似物的代表性实例可选自糖或骨架修饰的核糖核苷酸。然而，应当注意，核碱基修饰的核糖核苷酸，即含有非天然存在的核碱基而不是天然存在的核碱基的核糖核苷酸也是适宜的，所述非天然存在的核碱基诸如在5位修饰的尿苷或胞苷，例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8位修饰的腺苷和鸟苷，例如8-溴鸟苷；脱氮核苷酸，例如7-脱氮-腺苷；O-和N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷。2'-OH基团可被选自以下的基团置换：H、OR、R、卤素、SH、SR、NH₂、NHR、NR₂或CN，其中R为C₁-C₆烷基、烯基或炔基，卤素为F、Cl、Br或I。修饰核苷酸还包括通过例如以下文献中描述的羟脯氨醇键(hydroxyprolinol linkage)与胆固醇缀合的核苷酸：Krutzfeldt 等人，Nature (Oct. 30, 2005)，Soutschek等人，Nature 432:173-178 (2004)和美国专利申请公开号20050107325。修饰核苷酸和核酸还可以包括锁定核酸(LNA)，如公开于美国专利申请公开号20020115080。额外的修饰核苷酸和核酸公开于美国专利申请公开号20050182005。可出于多种原因对核糖-磷酸骨架进行修饰，例如提高这类分子在生理环境的稳定性和半衰期、促进跨细胞膜的扩散或作为生物芯片上的探针。可制备天然存在的核酸和类似物的混合物；或者，可制备不同核酸类似物的混合物和天然存在的核酸和类似物的混合物。

肽、多肽、蛋白

术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文中可互换使用。在本发明中，这些术语是指氨基酸的连接序列，所述氨基酸可以是天然氨基酸、合成氨基酸、或修饰，或天然氨基酸和合成氨基酸的组合。该术语包括抗体、抗体模拟物、结构域抗体、脂笼、靶向性蛋白酶、和多肽模拟物。该术语还包括旨在产生针对肽或肽片段的抗体的含有肽或肽片段的疫苗。

本文所使用的“抗体”包括类别IgG、IgM、IgA、IgD、或IgE的抗体，或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双抗体、双特异性抗体和双功能抗体。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、亲和纯化的抗体或其混合物，其显示出针对所需表位或由其衍生的序列的足够结合特异性。抗体也可以是嵌合抗体。抗体可以通过连接本领域中已知的一种或多种化学、肽或多肽部分而进行衍生化。抗体可以与化学部分缀合。抗体可以是人或人源化抗体。这些和其他抗体公开于美国公开专利申请号20070065447。

其他抗体样分子也在本发明的范围内。这种抗体样分子包括，例如，受体陷阱(诸如entanercept)、抗体模拟物(诸如adnectins、基于纤连蛋白的“可寻址”的治疗结合分子，来自例如，Compound Therapeutics, Inc.)、结构域抗体(天然存在的单结构域抗体的最小功能片段(诸如例如，纳米抗体(nanobodies)；参见例如Cortez-Retamozo等人, Cancer Res. 2004 Apr 15;64(8):2853-7))。

合适的抗体模拟物通常可用作本文所述抗体和抗体片段的替代物。这种抗体模拟物可以伴随有利特性(例如，它们可以是水溶性的、对水解耐受的和/或非免疫原性的)。例如，已经提出并且生成了包含模拟单克隆抗体的第二互补决定区(CDR)的合成的β-环结构。参见例如Saragovi等人, Science. Aug. 16, 1991;253(5021):792-5。肽抗体模拟物也已通过使用肽作图以确定“活性”抗原识别残基、分子建模和分子动力学轨迹分析以便从多个CDR设计含有抗原接触残基的肽模拟物而生成。参见例如Cassett等人, Biochem Biophys Res Commun. Jul. 18, 2003;307(1): 198-205。适用于本发明上下文中的相关原理、方法等的其他讨论提供于，例如，Fassina, Immunomethods. October 1994;5(2):121-9。

如本文所使用的，“肽”包括靶向的蛋白酶，其能够，例如，底物靶向的抑制翻译后修饰，诸如公开于，例如，美国专利申请公开号20060275823。

在本发明中，“肽”进一步包括anticalins。可以针对降低癌干细胞数量的试剂筛选Anticalins。Anticalins是已经基于脂笼蛋白支架构建的配体结合蛋白 (Weiss, G. A.和H. B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184; Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275)。脂笼蛋白的蛋白结构可以包括具有8个反平行β-链的β-桶，其支持在其开口端的四个环。这些环形成脂笼蛋白的天然配体结合位点，可以通过氨基酸取代将该位点在体外重新工程改造，以赋予新的结合特异性。氨基酸取代可以使用本领域中已知的方法进行，并且可以包括保守取代(例如，不改变结合特异性的取代)或适度、中度或显著改变结合特异性的取代。

通常，多肽模拟物(“拟肽”)是模拟多肽生物学活性的分子，但其在化学本质上不是肽类。在某些实施方案中，尽管拟肽是不含肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的分子，但是术语拟肽可以包括本质上不完全是肽类的分子，诸如假肽、半肽和类肽。一些广义上的拟肽(例如，其中多肽的部分被缺乏肽键的结构所取代)的实例如下文所述。不论本质上是完全非肽还是部分非肽，本发明的拟肽可提供反应性化学部分的空间排列，这种排列接近类似于多肽中活性基团的三维排列。作为这种相似活性位点几何学的结果，拟肽可展示类似于多肽的生物学活性的生物学效果。

使用给定多肽的模拟物比使用多肽本身具有几个潜在的优点。例如，多肽可能表现出两种非所需的性质，即，低的生物利用度和短的作用持续时间。拟肽通常很小，足以口服有效并具有长的作用持续时间。多肽还存在与稳定性、贮存和免疫反应性有关的问题，而拟肽可以减少这些问题。

具有所需的生物学活性的多肽能够被用于开发具有类似生物学活性的拟肽。从多肽开发拟肽的技术是已知的。肽键可以被非肽键取代，这种非肽键使拟肽具有与原始多肽类似的结构，因此有类似的生物学活性。进一步的修饰还可以用结构、形状或反应性类似的其他化学基团来取代氨基酸的化学基团来进行。可以通过NMR光谱、结晶和/或计算机辅助分子模拟测定自由的或与配体结合的原始多肽的三级结构来辅助开发拟肽。这些技术帮助开发比原始多肽具有更高效价和/或更高生物利用度和/或更高稳定性的新型组合物

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多糖

术语“多糖”是指聚合的碳水化合物结构，其由通过糖苷键连接在一起的重复单元(单糖或二糖)形成。单糖或二糖的单元可以是相同或不同的。多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素和几丁质。

有机或无机小分子

短语“有机小分子”或“无机小分子”包括除了多糖、多肽和核酸以外的可以影响生物过程的任何化学或其他部分。小分子可以包括目前已知并使用的任何多种治疗剂，或者可以合成在用于筛选生物学功能的这种分子文库中。小分子在大小上不同于大分子。本发明的小分子一般具有的分子量小于约5000道尔顿(Da)，优选为小于约2500 Da，更优选为小于1000 Da，最优选为小于约500 Da。

本文使用的术语“有机化合物”指除了大分子诸如核苷酸和多肽以外的任何基于碳原子的化合物。除了碳原子，有机化合物可以含有钙、氯、氟、铜、氢、铁、钾、氮、氧、硫及其他元素。有机化合物可以是芳香族或脂肪族形式。有机化合物的非限制性实例包括：丙酮、醇类、苯胺、碳水化合物、单糖、二糖、氨基酸、核苷、核苷酸、脂质、类视黄醇、类固醇、蛋白聚糖、酮类、醛类、饱和脂肪、不饱和脂肪、多饱和脂肪、油脂和蜡、烯烃、酯类、醚类、硫醇、硫化物、环状化合物、杂环化合物、咪唑和苯酚。本文使用的有机化合物还包括硝化的有机化合物和卤代的(如氯代)有机化合物。通过诸如加速质谱测定法(AMS)的技术对本发明定义的小分子集合及小分子进行表征(AMS；参见：

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优选的小分子是在生产、配制或制备上相对容易、成本较低的。优选的小分子在多种贮存条件下是稳定的。优选的小分子可以与大分子紧密结合而形成具有生物学活性且药学特征得到改善的分子。改善的药学特征包括在循环时间、分布、代谢、修饰、排泄、分泌、消除和稳定性方面有利于所需生物学活性的变化。改善的药学特征包括化学实体在毒理和效力特征方面的变化。

提供下面实施例以进一步说明本发明的方法和组合物。这些实施例仅仅为了说明的目的，而不是为了以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

对多西他赛耐受的前列腺癌细胞显示与细胞干性一致的发育分子特征。

多西他赛是一种目前用作激素难治性前列腺癌患者的标准治疗的抗有丝分裂剂(Petrylak等人, 2004; Tannock等人, 2004)。然而，所有患者最终都经历疾病进展，并且在该背景下没有其他治疗控制该疾病。由于该耐药现象的临床相关性，生成使用良好确立的前列腺癌激素非依赖性细胞株DU145和22RV1的体外多西他赛耐受模型来表征负责这样事件的分子变化。(图1a-d)。

DU145和22RV1细胞暴露于渐增剂量的多西他赛，并且通过细胞活力、集落形成、膜联蛋白V和聚-(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割测定来表征和验证所获得的化学耐受性。(图1a-d)。生成的多西他赛耐受(DR)的细胞表现出对DNA损伤药物(米托蒽醌、盐酸多柔比星和顺铂)以及其他抗有丝分裂剂(长春瑞滨和紫杉醇)的交叉耐受性，这与多药耐受性表型相一致(数据未显示)。

进行使用寡核苷酸微阵列的基因表达谱分析来比较敏感(DU145和22RV1 - 亲本细胞)和获得性耐受性(DU145-DR和22RV1-DR)前列腺癌细胞。选择转录物表达增加或减少至少2倍的基因用于进一步分析。该分析公开了分别在DU145-DR和22RV1-DR细胞中1245和990个失调的基因，其中有247个基因重叠(图2a左侧)。这些重叠基因中，29.5％上调，70.5％下调。令人惊讶的是，通常失调的247种转录物的生物过程的基因本体类别评价表明，除了预期的细胞增殖、细胞死亡和药物响应生物学过程的富集以外，发育和免疫监视类别也明显表示(图2a右侧)。被发现上调或下调的前列腺癌生物学和干性(stemness)中相关的基因包括：a)上皮分化生物标志物 – 细胞角蛋白(CK18和19)，和前列腺特异性标志物诸如雄激素受体(AR)，前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)；b) 免疫监视抗原 - 主要组织相容性复合体I类(MHC I类)；和c) 干性信号传递通路-Wnt/β-联蛋白、Notch和Hedgehog。选择的相关基因显示在下面表1和2中。20位转移性前列腺癌患者的组织样品的某些细胞结构基因和信号传递通路以及临床病理和表型特征的转录物水平总结在下表3中。

表 1

表2

注：NE= 未表达。NS=不显著。

发现与其亲本敏感细胞DU145和22RV1)相比在多西他赛耐受细胞(DU145-DR和22RV1-DR)中上调或下调的基因总结在表2中。使用匹配的敏感和耐受细胞之间的t检验进行基于对数均一化显示≥2倍变化的基因的平均表达平均差异的统计分析。参与上皮分化、前列腺特异性标志物和免疫监视标志物的基因的转录水平下降。另一方面，发育转录因子的基因转录物上调。

表 3

通过western印迹(图2c)和免疫荧光测定(图2d和2f)对这些基因的蛋白确认验证，获得的耐受细胞的上皮分化蛋白、前列腺特异性生物标志物和免疫监视抗原下降，并且表现出发育信号传递通路的激活(核表达) (图2d)。当比较多西他赛耐受细胞和主要表现出胞质/膜表达的亲本敏感细胞时，激活的β-联蛋白、Gli1、Gli2和经切割的NOTCH-2显示蛋白表达以及核免疫定位的显著增加。此外，发现这些表型与化疗耐受现象关联，因为反向获得的耐受细胞恢复分化表型(图13)。

至于对分化的研究，评价作为上皮标志物的细胞角蛋白(CKs)以及前列腺相关的生物标志物包括AR、PSA和PSMA的表达。以前已报道CKs对于人分化的上皮细胞是特异性的，在细胞完整性的维持中发挥作用，同时也在信号转导和细胞分化过程中起作用 (Brulet等人, 1980; Lu等人, 1980; Oshima等人, 1981; Tesar等人, 2007)。低分子量CKs(例如，CK18和CK19)在管腔正常人前列腺细胞和前列腺癌中特异性表达，而高分子量CKs(例如，CK5和CK10)在基底正常前列腺细胞中鉴定到，并且在肿瘤细胞群体中很少观察到(Ali等人，2008)。多西他赛耐受细胞在低分子量CKs的基因转录和蛋白表达中显示显著下降。DU145-DR细胞分别显示CKs 19和18的蛋白表达减少6.25倍和16.6倍。同样，当进行定量且与敏感的亲本细胞比较时，22RV1-DR显示这些CKs 减少14.3倍和6.7倍。CK19和CK18免疫荧光染色验证了其在多西他赛耐受细胞中表达下降(图2)。此外，高分子量CKs继续如同在其相应亲本细胞中一样在多西他赛耐受细胞中检测不到(数据未显示)，表明在获取多西他赛耐受性的过程中，细胞失去上皮分化标志物，并且不经历从管腔(低分子量CK)到基底样(高分子量CK)表型的转变。此外，当暴露于多西他赛时，表达前列腺相关分化标志物包括AR、PSMA和PSA的22RV1细胞显示出这些标志物的基因和蛋白表达水平的显著下降(图2)。22RV1-DR细胞分别显示AR、PSMA和PSA的蛋白表达下降16.6倍、20.0倍和11.1倍。免疫荧光分析进一步验证了这些结果(数据未显示)。

关于免疫逃逸机制，发现，多西他赛耐受细胞显示MHC I类分子的失调。观察到，对于将抗原有效递呈至细胞毒性T淋巴细胞和随后肿瘤细胞裂解关键的MHC-I类抗原在基因转录和蛋白水平两者中下调(图2)。基因表达谱分析揭示了所有MHC I类抗原(A、B、C、E、F、G)的显著下调，该事实在蛋白水平通过MHC I类抗原A、B、C的免疫印迹和免疫荧光染色得到验证(图2)。因此，这些细胞表现出有利于免疫逃逸的表型，使它们无法被宿主免疫系统检测到。

关于干细胞表型的研究，表征了WNT/β-联蛋白、Notch和Hedgehog的鉴定的失调表达。这些通路已经牵涉于祖细胞的自我更新和分化(Katoh等人, 2007; McDonald等人, 2006; van den Brink等人, 2004; Radtke等人, 2006; Leong等人, 2008; 和Grigoryan等人, 2008)。在前列腺中，这些信号传递通路在发育模式形成、上皮再生和前列腺癌肿瘤发生中发挥重要作用 (Wang等人, 2006, Karhadkar等人, 2004)。多西他赛耐受细胞在WNT抑制剂Dickkopf-I (DKKI)(WNT/β-联蛋白信号传递网络的众所周知的抑制剂)的基因转录物和蛋白水平中显示显著下降 (Fedi等人, 1999)。DKK1表达的这种下降与去磷酸化(活性的)的β-联蛋白(其是WNT信号传递中的主要关键效应物)的表达增加相关。免疫荧光分析表明，亲本多西他赛敏感细胞表现出β-联蛋白的膜表达(这与其作为粘附分子起作用相关)，而多西他赛耐受细胞显示该蛋白的显著核定位(图2)，据报道对于经典WNT信号传递通路的激活是必要的(Willert等人，2006)。此外，多西他赛耐受细胞也表现出NOTCH信号传递网络的增加。NOTCH2基因转录物水平在耐受细胞中显著增加，并且与经切割的Notch2蛋白表达的增加相关，这与蛋白的核易位相关，在核中，其发挥其转录活性(图2)。最后，多西他赛耐受细胞的Hedgehog受体Patched和胶质瘤相关癌基因同系物转录因子Gli1和Gli2的表达增加。这些发现与上述转录因子的蛋白表达增加和核易位相关(图2)，这种情况已经与Hedgehog通路的激活相关。令人惊讶的是，其他已报道的干细胞表面标志物，诸如CD44和CD133，在本研究中如在基因转录物和蛋白水平两者中均未发现上调(数据未显示)。

基于多西他赛耐受细胞表现出与干性一致的表型的事实，测试这些细胞是否表现出比亲本细胞更高的肿瘤起始能力。在NOD/SCID小鼠中皮下注射10²和10³多西他赛耐受细胞(22RV1-DR和DU145-DR)产生了比其亲本敏感细胞显著更多的肿瘤(图2e)。注射10² DU145-DR和22RV1-DR细胞分别在83.3±7.8％和79.0±10.4％的受体中诱导肿瘤；然而注射亲本DU145和22RV1细胞仅分别在38.8±15.2％和46.0±9.3％的受体中诱导肿瘤形成(p <0.0001)。此外，尽管当注射10⁴亲本和耐受细胞时肿瘤形成没有差异，但是肿瘤潜伏期对于耐受细胞显著更短。DU145亲本细胞的肿瘤潜伏期为59.2±4.9天，与之相比，耐受细胞为43.2±2.6天(p<0.0001)。同样，与耐受细胞 (35.3±1.9天)相比，22RV1细胞的肿瘤潜伏期(54.9±1.5天)显著(p <0.0001)更长。因此，多西他赛耐受细胞的干性分子特征通过其高肿瘤起始能力而功能性增强。

实施例2

前列腺癌干细胞的鉴定和表征

考虑到生成的多西他赛耐受细胞的干性特征和较高肿瘤起始能力，研究化疗耐受现象是否是由于敏感细胞向具有干性特征的耐受细胞的转变导致的，或者化疗是否选择预先存在的前列腺癌干细胞(图3c)。因为DU145和22RV1多西他赛耐受细胞通常表现出CK19和CK18以及MHC-I类抗原的下调，确定具有CK-阴性/HLA I类-阴性表型的细胞是否已经存在于亲本细胞系中。免疫荧光染色显示在两种细胞系中小CK-阴性/HLA I类-阴性亚群的存在，当通过流式细胞术定量时，其分别占DU145和22RV1亲本细胞的总群体的2.19±0.95％和3.58±0.79％(图4b)。

然后研究鉴定的CK-阴性/HLA I类阴性肿瘤细胞是否能够在多西他赛暴露后生存，因此负责获得的化疗耐受现象。对于该目的，DU145亲本细胞用含有驱动绿色荧光蛋白(GFP)表达的CK19启动子的质粒稳定转染。(图14a和14b) DU145亲本细胞用含有驱动绿色荧光蛋白(GFP)表达的CK19启动子的质粒稳定转染(图6a)。CK19和GFP的共表达通过流式细胞术和免疫荧光来验证(图6b)。表达CK19的细胞是GFP阳性的(GFP+)，而不表达CK19的细胞是GFP阴性的(GFP-)。此外，CK19/GFP阴性细胞中启动子构建体的稳定插入通过PCR验证(图6C)。此外，通过流式细胞术和免疫荧光表明这些CK19/GFP阴性细胞都是HLA阴性的(图6d)。

将未分选的DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞接种并且暴露于多西他赛(10 nM)，进行实时成像，持续长达48小时的期间。获得的视频显示，多西他赛暴露选择在治疗下能够分裂和退出有丝分裂的具有GFP阴性表型的细胞，而GFP阳性细胞在有丝分裂停滞后死亡(图5b)。流式细胞术分析揭示，多西他赛处理导致存活细胞基于其各自表型的比例的明显转变(图5c)。尽管最初显示GFP阳性表型的细胞占总群体的87.5±10.4％，但是观察到处理后该表型下降，仅占总细胞群体的28.3±10.6％(p <0.001)。相比之下，处理后，具有GFP阴性表型的细胞在比例上从总群体的6.4±4.3％增加至73.1±10.2％(p <0.001)。通过GFP/HLA I类表达分选的DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞的集落形成实验验证了这些结果，因为只有具有GFP-阴性/HLA I类-阴性表型的肿瘤细胞在连续暴露于多西他赛时能够形成克隆。(图5d)。集落形成实验验证了这些结果，因为只有具有GFP-阴性表型的肿瘤细胞在连续暴露于多西他赛时能够形成克隆(图5d)。因此，该结果强调了在标准化疗后幸免并且可以负责肿瘤复发的具有未分化表型(CK-阴性/HLA I类阴性)的细胞群体的存在。

还证明具有CK-阴性/HLA I类-阴性/GFP-阴性表型的肿瘤细胞亚群具有通过不对称细胞分裂而分化的独特干细胞特性。当接种未分选的DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞时，观察到GFP阴性细胞通过该过程产生进入分化程序(变得GFP阳性)的子细胞，而GFP阴性细胞保留了其原有身份(图6a)。相比之下，显示GFP阳性表型的细胞对称分裂，意味着所有子细胞继续具有相同特征。在4周期间培养的DU145-CK19启动子-GFP稳定GFP分选细胞的流式细胞术分析揭示，在该时间期间之后，源自GFP阴性的分选细胞的细胞主要由分化的(GFP+)细胞构成，而由GFP阳性分选细胞生长的细胞保持分化的表型(图6b)。因此，该结果解释了以下事实，CK-阴性/HLA I类阴性细胞占亲本细胞系内部的少数肿瘤细胞群体，而分化的恶性细胞的大集合构成该总细胞群体的主要部分。

最后，细胞的鉴定亚群中肿瘤起始的功能癌干细胞特性得到解决。通过GFP/HLA I类表达分选DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞，将获得的GFP分选的细胞亚群皮下注射到免疫缺陷的NOD/SCID小鼠，并且只有GFP-阴性/HLA I类阴性细胞表现出肿瘤起始能力(图6c)。注射具有GFP阴性表型的10个细胞在63.0±14.6％的受体中产生肿瘤，而注射相同量的GFP阳性细胞后没有观察到肿瘤形成(图6d)。

为了进一步验证观察到的发现(其中只有DU145 CK-阴性/HLA I类-阴性/GFP-阴性表型细胞显示肿瘤起始能力)，基于表面标志物HLA I类抗原分选亲本细胞系(DU145和22RV1)，并且测试其肿瘤起始能力。(图13和15)。与用GFP阴性细胞获得的结果类似，只有HLA I类阴性细胞在稀释测定后表现出肿瘤起始能力。注射10个HLA I类阴性DU145和22RV1细胞分别在83.3±19.1％和100％受体中产生肿瘤，而在用表现出HLA I类阳性表型的10个细胞注射198天后没有观察到肿瘤形成。来自HLA I类阴性生成的肿瘤异种移植物的系列移植后观察到类似结果(数据未显示)。

因此，肿瘤起始的功能癌干细胞特性对于具有CK-阴性/HLA I类-阴性表型的细胞亚群是固有的。此外，除了是被赋予肿瘤起始能力的唯一细胞之外，HLA I类阴性细胞也表现出与HLA I类阳性细胞相比统计学显著更高的克隆性能力(图8)。最重要但并不奇怪的是，由异种移植的GFP阴性细胞生成的肿瘤显示分化(GFP-阳性/CK-阳性/HLA-阳性)的表型(图6c)，并且保留了占总肿瘤群体的3.93±0.85％的GFP-阴性/HLA-阴性细胞的小群体(图16)。

综上所述，体外和体内结果鉴定了具有肿瘤起始能力的CK-阴性/HLA I类阴性表型的细胞群体，所述细胞群体通过不对称细胞分裂生成转化扩增克隆原(transit amplifying clonogens)，所述转化扩增克隆原压倒性地填入具有分化细胞的正在进化的肿瘤。因此，验证了前列腺癌干细胞的发现。考虑到所有上述结果，包括新生成的多西他赛耐受细胞的干性特征和肿瘤起始能力，假设化疗诱导前列腺癌干细胞的富集(图9a)。由于多西他赛耐受细胞表现出上皮分化标志物(包括CK19和CK18)的下调，所以最初在亲本系中定量CK-阴性细胞群体。流式细胞术分析揭示，两种亲本细胞都具有散布的CK19和CK18阴性亚群(图6a)。22RV1细胞表现出3.4％ CK19阴性细胞和4.7％ CK18阴性细胞。类似地，DU145细胞显示出2.1％ CK19阴性细胞和2.3％ CK18阴性细胞。此外，当用两种CK共同染色时，22RV1具有2.6％的CK阴性细胞，DU145具有1.3％的CK阴性细胞。因此，免疫荧光染色验证了稀有CK阴性亚群和共表达两种CK的优势亚群的存在。

实施例3

在人转移性前列腺肿瘤样品中鉴定癌干细胞

鉴于上述结果，研究鉴定的前列腺癌干细胞群体是否存在于人前列腺癌组织样品中。转移性(n = 20)和匹配的原发性(n = 6)人前列腺癌组织的免疫组织化学研究揭示了CK-阴性肿瘤细胞的散布亚群(图7a)。这些细胞对于HLA I类抗原也是阴性的(图7b)，表现出关键发育转录因子的激活(图7c)并且缺乏前列腺相关分化标志物的表达(图7d)，对应于先前在体外研究中观察到的干性特征。

所有分析的人前列腺癌样本含有CK-阴性(CK18和CK19)肿瘤细胞的散布亚群，分别占原发性和转移性病变中所有肿瘤细胞的0.05％至0.3％和0.4％至1.8％(图7a)。接下来，进行基于免疫荧光的双染法以评价CK表达和目标标志物之间的关联。在该分析中，一致性地观察到，CK表达与HLA I类表达显著相关(p<0.0001)。更具体地，观察到，CK阴性肿瘤群体在97.8±0.7％细胞中不表达HLA I类抗原。尽管如此，所有(100％)CK-阳性细胞表现出阳性的HLA I类抗原表型(图7b)。此外，持续发现CK-阴性/HLA-阴性肿瘤细胞当与分化的CK-阳性/HLA-阳性细胞相比时发育转录因子的核表达(激活)的显著(p<0.0001)增加。CK-阴性/HLA-阴性细胞在63.9±22.6％细胞中表现出去磷酸化β-联蛋白的核表达，在72.8±15.1％细胞中表现出切割的Notch2的核表达，在67.5±17.3％细胞中表现出Gli1的核表达，和在67±17.3％细胞中表现出Gli2的核表达，而CK-阳性/HLA-阳性细胞仅在5.8±11.9％细胞中表达核去磷酸化的β-联蛋白，在6.7±7.9％细胞中表达切割的Notch2，在1.2±7.9％细胞中表达Gli1，在1.5±10.6％细胞中表达Gli2(图7c )。此外，还观察到CK-阴性/HLA I类阴性肿瘤细胞不显示核AR的表达，而CK-阳性/HLA I类阳性细胞在71.8±14.3％细胞中表现出核AR(图7d)。因此，前列腺癌干细胞不表现出阳性AR表型的事实表明这些细胞可能不依赖于功能性AR信号传递，这可以解释这些细胞如何负责观察到的激素治疗后的复发(这是未来研究中待探索的问题)。总而言之，这些结果验证了人前列腺癌组织样品中前列腺癌干细胞亚群的存在和鉴定其的能力。

鉴于在原发性和转移性前列腺癌中都鉴定出癌干细胞群体，设计一系列实验，其目标在于研究来自新鲜人肿瘤样品的这种细胞群体的致瘤能力。为了评价具有这种表型的前列腺癌细胞是否负责肿瘤起始，获得来自经受针对原发性前列腺癌的根治性前列腺癌切除术的48位患者的肿瘤。(表4)。基于细胞表面标志物HLA I类的表达通过流式细胞术分离细胞(图9a)。该分析显示，所有原发性前列腺癌样品主要由占总群体的98.9±0.35％(范围为98.7％-99.5％)中值的HLA I类阳性细胞所构成，而只有中值为1.2 ±0.65％(范围为0.5％-1.5％)的小百分比细胞显示HLA I类-阴性表型，这与上述报道的免疫组织化学的发现相一致。接下来，将与基质胶混合的相同数量(10、10²和10³)的HLA I类-阴性、HLA I类阳性和未分选的细胞注射到NOD/SCID小鼠中。总体而言，在34.5周的中值随访时间(范围为21.0-45.3周)后从注射原发性前列腺癌细胞产生4(8.3％)/48的异种移植肿瘤。当与HLA-阳性细胞相比时，20.8周(范围为9.3-39.6周)，并且系列移植后，只有HLA-阴性细胞可以维持它们的致瘤潜力(图9b和下面的表5)。

表 4

在48个注射的新鲜人原发性前列腺肿瘤中的临床病理特征和HLA-阴性细胞的百分比

注：由其产生肿瘤异种移植物的灰色框进行突出表示。

表5总结了当注射10、100和1000个HLA-I类分选和未分选的来自原发性前列腺癌组织的细胞时，通过肿瘤发生率(肿瘤数/注射数)和以周(平均值±SD)表示的肿瘤潜伏期测量的肿瘤起始能力。对于每种分选的细胞群体和细胞稀释物，在四只小鼠的上侧(HLA-阴性)和下侧(HLA-阳性)注射两次。还注射来自每份肿瘤样本的未分选的细胞。

表 5

在初始注射10³个细胞后，观察到与HLA-阳性细胞(12.5±17.6％)相比，显著更高的肿瘤起始能力来自HLA-阴性分选的细胞(87.5±17.6％)，该事实与HLA-阴性异种移植物中更低的肿瘤潜伏期(14.2±4.5周相比于24.6±3.1周)相联系。此外，进一步稀释到10²和10³个细胞揭示只有HLA-阴性细胞被赋予肿瘤起始能力。这些观察结果通过第二次移植实验进行验证，在所述第二次移植实验中，注射10²和10³个分选的细胞继续表明，肿瘤发生限制于HLA-阴性的细胞亚群(图9b)。第二次注射来自HLA-阳性细胞的很少生成的异种移植物的HLA分选细胞验证了该结果，因为HLA-阳性细胞不具有肿瘤起始能力。组织学和免疫组织化学分析揭示，源自HLA-阴性分选的细胞的肿瘤忠实地再现了初始原发性人肿瘤的表型(图9c)，显示HLA-I类抗原在大多数其肿瘤细胞中的表达，以及上皮和前列腺相关标志物(CK和AR)的表达。因此，这些结果显示，HLA-阴性群体富含能够在NOD/SCID小鼠中起始前列腺癌异种移植物的细胞，并且再现了大多数人癌症独特的分子和表型异质性。

此外，似乎这是普遍现象，因为从各种新鲜人实体肿瘤(包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和膀胱癌)中分离到当连续注射到NOD/SCID小鼠中负责肿瘤起始的HLA-阴性肿瘤细胞(图9d，和下表6)。总体而言，从注射新鲜人肿瘤样品产生了4/10(40％)个结肠异种移植肿瘤、2/10(20％)肺异种移植肿瘤、2/12(16.6％)个乳腺异种移植肿瘤和2/18个(11.1％)膀胱异种移植肿瘤。其他原发性实体瘤类型的特征显示在下表7中。来自其他实体癌组织类型的HLA分选细胞的肿瘤起始能力和肿瘤潜伏期显示在下表8中。

表 6

表 7

其他原发性实体肿瘤类型的特征。

注：由其产生肿瘤异种移植物的灰色框进行突出表示。

表8

来自其他实体癌组织类型的HLA分选细胞的肿瘤起始能力和肿瘤潜伏期

表8总结了当注射100个HLA-I类分选的来自其他原发性肿瘤组织类型的细胞时，通过肿瘤发生率(肿瘤数/注射数)和以周(平均值±SD)表示的肿瘤潜伏期测量的肿瘤起始能力。对于每种分选的细胞群体和细胞稀释物，在四只小鼠的上侧(HLA-阴性)和下侧(HLA-阳性)注射两次。

在初次注射之后，当与HLA-阳性分选细胞相比时，10² HLA-阴性细胞的肿瘤起始能力显著更高。更重要的是，在系列移植后，只有HLA-阴性细胞保留致瘤能力，而HLA I类阳性细胞则没有。此外，第二次注射来自从HLA-阳性细胞生成的异种移植物的分选的HLA阳性细胞不具有肿瘤起始能力。可能发生从HLA I类阳性细胞生成肿瘤，因为在细胞分选过程中可能污染HLA I类阴性细胞，尽管不能排除HLA I类阳性细胞可能具有在系列移植后不能被维持的低肿瘤起始能力。产生的异种移植肿瘤的组织学分析显示与其对应人原发性癌相似的形态特征(图9e)。因此，已经在除了前列腺癌以外的人上皮性肿瘤类型中鉴定到具有肿瘤起始能力的HLA-阴性群体。

最后，来自新鲜人组织样品的细胞的肿瘤起始能力既不与癌症患者的任何分析临床病理特征相关，也不与HLA-阴性细胞的百分比相关。具有侵袭性临床病理特征(例如，高分级、高肿瘤分期)的肿瘤或具有高HLA-阴性细胞数/百分比(例如1.5％)的肿瘤不具有显著更高的肿瘤起始能力。此外，没有观察到HLA-阴性细胞的百分比和肿瘤分期或肿瘤分级之间的关联。

实施例4

靶向人癌干细胞

基于鉴定的癌干细胞表现出Hedgehog和Notch通路激活的事实，进行关于这种通路的抑制是否可能损害癌干细胞动态平衡的测试。为了这个目的，利用环杷明(Cyclopamine)，其是在Smo水平起作用的植物衍生的hedgehog通路拮抗剂(Taipale等人, 2000; Karhadkar等人, 2004; Chen等人, 2002)。化合物E是阻断Notch受体的蛋白水解处理的高活性γ-分泌酶抑制剂(Seiffert等人, 2000)。对于体外实验，DBZ(具有确立的体内活性的高活性γ-分泌酶抑制剂)被用作下述体内实验中化合物E的替代物(van Es等人, 2005)。

将来自DU145和22RV1的CK-阴性/HLA-阴性癌干细胞群体暴露于各个别抑制剂没有诱导任何重要作用。然而，当一起施用两种试剂时，观察到细胞周期进程强大的抑制，细胞聚集在亚G1期，而该效果在分化(CK-阳性/HLA-阳性)细胞中是次要的(图10a)。因为地塞米松在体内实验中被用于降低γ-分泌酶抑制剂的肠道毒性(Real等人，2009)，所以分析地塞米松与上述提到的抑制剂的组合的体外效果。该分析显示，地塞米松没有改变Hedgehog和Notch抑制剂的细胞周期影响(数据未显示)。此外，这些药物的组合效果通过集落形成实验进一步验证，因为当组合Hedgehog和Notch抑制剂时，21天后没有形成的集落(图10b)。接下来，为了确定这些通路的抑制是否可能在体内影响癌干细胞的肿瘤起始能力，将10³ DU145和22RV1 CK-阴性/HLA-阴性细胞皮下注射到NOD/SCID小鼠中，并且用媒介物溶液(对照)、单独的地塞米松、药物的双组合(例如地塞米松加环杷明)或三组合(地塞米松加环杷明加DBZ)进行处理。用三组合处理的小鼠的DU145和22RV1异种移植物显示出肿瘤首次感知的显著性(p <0.05)延迟，分别为5.1周和3.8周，而这种肿瘤延迟在用单独的Hedgehog或Notch抑制剂处理的小鼠中不显著。(图10c)。

最后，在源自新鲜人前列腺癌组织的异种移植物中测试这些化合物的肿瘤起始抑制效果。将来自异种移植物＃5、＃9和＃12的10³ HLA-阴性分选细胞注射进NOD/SCID小鼠，并且用如上所述的相同时间表和Hedgehog和Notch抑制剂的组合进行处理。如先前在细胞系中观察到的，只有用Hedgehog和Notch抑制剂的组合处理显著(p<0.05)延迟肿瘤起始(图10d)。用药物的三组合处理的小鼠中的肿瘤异种移植物在18.3±3.1周、13.8±2.5周和20.1±3.3周后首次感知，相比之下，在其相应对照中为13.8±2.5周、10.3±1.5周和16.6±2.5周。

综上所述，这些结果显示，这些发育通路的抑制靶向癌干细胞，延缓了肿瘤起始。

已经假设了关于肿瘤起始的两种主要假说。预测每个肿瘤细胞可以生成全新肿瘤的“随机模型”；和提出肿瘤细胞以分层状态存在并且只有少数干细胞具有肿瘤起始潜能的“癌干细胞模型”。公开了人癌干细胞的鉴定和功能表征，其满足以下干性标准：1) 通过不对称细胞分裂的自我更新和分化， 2)肿瘤起始能力，3)阴性的组织相容性特征，和4)多药耐受表型。

胚胎干细胞还共享HLA-阴性表型。已经报道，人植入前胚胎是HLA I类和II类阴性的(Desoye等人，1988)。该现象排除了基于亲本抗原直到产生血液组织屏障(在这种情况下是胎盘)的表达的排斥。在癌干细胞的背景下，这种组织相容性阴性表型具有重要的临床意义，因为它解释了宿主突变容许性(host mutation permissiveness)，以及肿瘤扩散和转移能力(metastatogenic capabilities)，因为癌干细胞可能逃逸免疫监视。

关于肿瘤起始能力，公开了只有鉴定的CK-阴性/HLA-阴性癌干细胞在体内生成肿瘤，而分化的CK-阳性/HLA-阳性子代缺乏这种特性。然而，似乎这些癌干细胞表现出不依赖于某些基质相互作用的遗传记忆，因为皮下注射赋予来源组织表型(tissue-of-origin phenotype)，而不需要原位移植，这种现象需要进行进一步研究。此外，由于其均匀表型，假设这些细胞是遗传稳定的，这是由它们的静止状态和不对称分裂促成的特性。这种遗传稳定性将允许鉴定“驱动者”突变，因为分子异质性基本上是肿瘤扩增和分化癌细胞群体的产物，并且可能对于肿瘤生成不是关键的。人肿瘤的一种新的分子分类可能源自在这些癌干细胞群中分析这种“驱动者”突变。

总之，人癌细胞系和组织样品中新定义的前列腺癌干细胞已经得到鉴定和表征。此外，这种细胞群体使用HLA-I类表面标志物分离，并且证明其肿瘤起始能力。此外，据观察，类似CSC群体也存在于人乳腺癌、结肠癌、肺癌和膀胱癌中，该事实为这些发现提供了进一步普遍性。这种人癌干细胞的发现在诊断和预测实验室测定中以及用于开发新的治疗策略中具有重要的临床意义。在这方面，用Notch和Hedgehog抑制剂处理在实验动物模型中减弱了肿瘤形成。

实施例5

材料与方法

抑制剂和药物

多西他赛、米托蒽醌、多柔比星、顺铂、长春瑞滨、紫杉醇、地塞米松、环杷明和化合物E从Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)获得。DBZ [(2S)-2-[2-(3,5-二氟苯基)-乙酰基氨基]-N-(5-甲基-6-氧代-6,7- 二氢-5H-二苯并[b,-d]氮杂-7-基)-丙酰胺]( (2S)-2-[2-(3,5-difluorophenyl)-acetylamino]-N-(5-methyl-6-oxo-6,7- dihydro-5H-dibenzo[b,-d]azepin-7-yl)-propionamide)从Syncom (Groningen, The Netherlands)获得。

获得的多西他赛耐受细胞的细胞培养、生成和表征

人激素非依赖性前列腺癌细胞系DU-145和22RV1从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，并保持在补充有不含抗生素的10％FBS的RPMI 1640培养基(Gibco, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)中。将细胞在37℃下在具有5% CO₂的潮湿气氛中生长。选择DU145和22RV1细胞，以生成前列腺癌多西他赛耐受模型。该选择基于以下事实，两种细胞系都是激素难治的，这是临床设置中用多西他赛治疗的状况，它们也表现出明显的激素难治性表型。尽管22RV1细胞仍然依赖雄激素受体信号传递并且表达前列腺特异性标志物(例如，PSMA、雄激素受体)，DU145却没有。因此，在这两种表型不同的细胞系中生成获得的多西他赛耐受性有助于研究参与获得多西他赛耐受性的分子过程的方法。通过剂量增加的方式用多西他赛培养细胞而选择多西他赛耐受的克隆DU-145-DR和22RV1-DR。初始培养在5 nM多西他赛。敏感克隆不再存在并且幸存的DU-145和22RV1细胞重新填充烧瓶后，将多西他赛的浓度增加至10 nM，随后增加至25 nM、50 nM、100 nM 和250 nM。将22RV1-DR细胞进一步暴露于500 nM多西他赛。暴露于每种渐增剂量的多西他赛之后，将剩余存活细胞维持在含有最后选择渐增剂量的多西他赛的培养基中。其中细胞暴露的最后药物选择浓度对于DU-145-DR为250 nM，并且对于22RV1-DR为500 nM，以便避免获得的多西他赛耐受表型的逆转。获得药物耐受性的过程对于DU-145-DR 花费9个月，对于22RV1-DR 花费6.5个月。平行地，将亲本DU-145和22RV1细胞以相同剂量增加方式暴露于DMSO(多西他赛的媒介物溶液)。

细胞暴露于渐增剂量的多西他赛，并且通过细胞活力、集落形成、膜联蛋白V和聚-(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割测定来表征和验证所获得的化学耐受性(图1a-d)。生成的多西他赛耐受(DR)的细胞表现出对DNA损伤药物(米托蒽醌、盐酸多柔比星和顺铂)以及其他抗有丝分裂剂(长春瑞滨和紫杉醇)的交叉耐受性，这与多药耐受性表型相一致(数据未显示)。还观察到，多西他赛化疗是可逆的(图12a和b)。从培养基中去除药物诱导了药物耐受性的显著下降。在没有药物的情况下培养多西他赛耐受细胞12周之后，细胞活力显著下降。对于DU145-DR细胞，多西他赛IC-50浓度从1μM下降至25 nM，并且在22RV1-DR细胞中，IC-50药物浓度从10μΜ下降至50nM(图12a)。去除药物后多西他赛耐受性的这种降低通过集落形成测定进行验证(图12b)。因此，为了维持多西他赛耐受表型，在最后药物选择浓度下继续培养细胞。

细胞活力和集落形成测定

细胞活力使用Cell titer 96 Aquos Non-Reactive Cell Proliferation Assay (MTS)试剂盒(Promega Corp., Madison, Wl)进行分析。将细胞以10⁴的密度接种于96孔培养皿中，24小时后去除培养基，并用新的单独的培养基(对照)或含有药物的培养基替代。72小时后，在微孔板分光光度计(Molecular Dynamics)上在450nm(测试波长)和620nm(参比波长)处测量颜色吸光度。通过将处理过的细胞的A 450 nm - A 620 nm除以对照细胞的A 450 nm - A 620 nm评估存活细胞的百分比。通过将10³个细胞铺板在35 mm培养皿中进行响应于药物处理的克隆形成生存测定。24小时后，细胞仍旧不处理(对照)或用药物处理。第二天，更换培养基，并且在没有任何药物或在连续暴露于药物的情况下将细胞保持在新鲜培养基中生长。对于这些连续暴露实验，每三天更换培养基加药物，直到出现药物耐受性细胞的克隆。然后将细胞用4％多聚甲醛/PBS固定，用结晶紫溶液染色，并且用肉眼计数形成的集落。

通过流式细胞术分析细胞凋亡

细胞(10⁵)仍旧不处理(对照)或用药物处理，持续72小时。合并贴壁细胞和分离的细胞，洗涤并根据制造商的说明使用膜联蛋白-V-FLUOS染色试剂盒(Roche, Nutley, NJ)用膜联蛋白-V-FITC和碘化丙啶标记。样品用FACscan流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, CA)获得并用CellQuest Pro软件(BD Biosciences)分析，以确定表现出膜联蛋白V染色的细胞的百分比。

细胞周期分析

细胞用药物处理72小时，收获，固定在70％乙醇中，并保存在4℃。分析前，将细胞用PBS洗涤，离心，并在室温下在含有0.1% Triton X、0.2 mg/ml RNAse和0.02 mg/ml碘化丙啶的染色溶液孵育30 min。DNA含量用FACscan流式细胞仪(BD Biosciences)获得，并使用CellQuest Pro软件(BD Biosciences)进行分析。

cDNA微阵列分析

分析22RV1、22RV1-DR、DU-145和DU-145-DR基因表达谱。根据制造商的方案通过Tryzol (Invitrogen)从每份样品分离总RNA，并且通过RNeasy小量试剂盒和无RNase的DNase盒(Qiagen Inc., Valencia, CA)进行纯化。所有样品的RNA质量通过RNA电泳和RNA LabChip分析(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)进行测试，以确保RNA完整性。制备样品用于根据制造商的说明使用Affymetrix Human U133 Plus 2.0阵列进行分析。将样品的基因表达水平均一化，并使用Microarray Suite、MicroDB和Data Mining工具软件(Affymetrix, Santa Clara, CA)进行分析。使用该软件包均一化并鉴定样品中22.215表达的绝对调用(存在、边际或不存在)(absolute call (present, marginal, or absent))和平均差异、和两份或三份样品之间基因表达的绝对调用差异、倍数变化和平均差异。使用多西他赛敏感和耐受样品之间的t检验进行基于对数均一化显示≥2倍变化的基因的平均表达平均差异的统计分析。从功能聚类分析排除没有标注或不容易分类的基因。

基因本体分析

与亲本敏感细胞相比在多西他赛耐受细胞中差异表达的基因生成通常失调的转录物的列表。该列表通过DAVID生物信息学资源(DAVID Bioinformatics Resources)进行评估，所述DAVID生物信息学资源是应用于基因本体(GO)类别(所述类别为生物过程、分子功能和细胞组分)的富集分析的基于网络的统计超几何测试。对最高层次水平上(≥5级)以统计学显著性(p<0.01)富集的GO类别进行考虑。

Western印迹分析

在样品缓冲液中制备全细胞提取物，并通过免疫印迹法进行分析。在使用标准程序的免疫印迹测定中使用针对聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP) (BD Pharmingen, San Jose, CA)、切割的PARP(BD Pharmingen)、细胞角蛋白19(Abcam)、细胞角蛋白18(Abcam, Cambridge, MA)、雄激素受体(Sigma-Aldrich)、前列腺特异性膜抗原(Abcam)、前列腺特异性抗原(Epitomics, Burlingame, CA)、泛HLA-I类(Abcam)、DKK1(Orbigen, BioCarta LLC, San Diego, CA)、激活的β-联蛋白(Millipore, Billerica, MA)、β-联蛋白(BD Transduction)、激活的Notch2 (Abcam)、PTCH (Abcam)、Gli1 (Santa Cruz Antibody, Santa Cruz, CA)、Gli2 (Abcam)和β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)的一抗。蛋白表达通过使用Quantity One软件(Bio-Rad, Hercules, CA)比较条带表达而进行定量。

免疫组织化学和免疫荧光分析

在前列腺癌细胞系和福尔马林固定石蜡包埋的人癌症和肿瘤异种移植物组织切片上进行免疫荧光分析。一抗包括细胞角蛋白19和18(Abcam)、泛HLA-I类(Abcam)、绿色荧光蛋白(Abcam)和以下转录因子的组合：活性β-联蛋白(Millipore)、激活的Notch2 (Abcam)、Gli1 (Santa Cruz)、Gli2 (Abcam) 和雄激素受体(DAKO, Fort Collins, CO)。使用的二抗是Alexa Fluor® 594 (Invitrogen)和Alexa Fluor® 488 (Invitrogen)。将前列腺癌细胞(10⁵)铺板在35 mm培养皿中，24小时后通过标准免疫荧光程序染色。将组织切片(5 μm)脱蜡，并进行标准的基于过氧化物酶的免疫组织化学和免疫荧光程序。通过评价肿瘤细胞而进行细胞角蛋白、HLA-I类抗原、转录因子和雄激素受体的表达的定量。在10倍高视野中确定阳性和阴性细胞的百分比。

生成细胞角蛋白19-绿色荧光蛋白(GFP)报道质粒

用如前所述(Tripathi等人, 2005)的特异性引物组(Fw 5'-AACGCATGCTTTGGGGGGATG- 3'(SEQ ID NO：1)和Rv 5'-TCCCCCTTTACTCGGCCCCCAC-3'(SEQ ID NO：2)) 通过PCR从DU145细胞基因组DNA扩增CK19基因启动子区域。PCR产物用Ase I和Hind III消化，并克隆到预先用相同酶消化的pEGFPNI载体(Clontech, Mountain View, CA)中。其结果是，将CMV启动子从初始载体去除，并且GFP表达在CK19启动子的控制之下。最终构建体通过消化和测序分析进行验证。DU145细胞使用Lipofectamine Plus 2000 (Invitrogen)以pCK19-GFP构建体转染。24小时后，培养基用新鲜培养基替换，并且在G418 (Invitrogen)存在的情况下选择稳定表达的细胞。通过直接显微镜和免疫荧光和还有通过使用特异性引物(Fw 5'-TTCCTGCGTTATCCCCTGATTC-3' (SEQ ID NO:3)和Rv 5'-GCTCCTCCGGCCCTTGCTCACCAT-3' (SEQ ID NO:4))PCR扩增GFP编码区来验证阳性克隆。

活细胞成像

延时视频显微镜(Time-lapse videomicroscopy)用来评价用pCK19-GFP启动子稳定转染的DU145细胞的不对称细胞分裂和多西他赛亚群敏感性。将6孔板中低汇合生长的细胞在37℃和50％湿度的培养室内部在5％CO₂气氛中置于该阶段。用Nikon Eclipse Ti倒置显微镜进行随机选择的GFP+和GFP- DU145细胞的无人看管的延时视频。NIS Elements AR (Nikon Inc., Melville, NY)软件用于收集和处理数据。使用10x物镜进行成像，并且对于GFP使用200-ms曝光时间每30分钟捕获图像，对于明场使用20-ms曝光时间每30分钟捕获图像。

通过流式细胞术分析细胞亚群

前列腺癌细胞亚群的流式细胞术分析根据标准程序进行。胞内CK19和CK18表达在以70％乙醇固定的单细胞悬液进行，而在新鲜细胞样品(不固定)中测定细胞表面HLA-I类和GFP的表达。使用针对CK19 (Abcam)、CK18 (Abcam)、HLA I类(Abcam)、与藻红蛋白缀合的HLA I类(Abcam)和GFP (Abcam)的一抗。当使用时，二抗对应于Alexa Fluor® 594 (Invitrogen)和Alexa Fluor® 488 (Invitrogen)。样品用FACscan流式细胞仪(BD Biosciences)获得，并使用CellQuest Pro软件(BD Biosciences)进行分析。每份样品测定最少10⁴个细胞。

小鼠程序

动物使用和护理严格遵守University of Columbia, Institutional Animal Care and Use Committee确立的制度指南。用从Jackson Laboratories 获得的5-6周龄小鼠(NOD.CB17-Prkdc^scid)作为受体进行异种移植实验。

人原发性和转移性前列腺癌组织样品

福尔马林固定石蜡包埋的人原发性和转移性前列腺癌组织样品由哥伦比亚大学癌症中心的肿瘤银行(the tumor bank of Columbia University Cancer Center)提供。所有样品根据知情同意和哥伦比亚大学医学中心机构审查委员会(the Columbia University Medical Center Institutional Review Board)的监督下采集。癌症组织切片通过评估苏木精和曙红(H＆E)染色的载片而进行选择。

来自前列腺细胞系和新鲜人样品的癌细胞的肿瘤起始能力

为了比较多西他赛敏感的亲本细胞和多西他赛耐受细胞的肿瘤起始能力，将在200μl培养基：基质胶(1:1)中的GFP阳性和GFP阴性分选的细胞或HLA-阳性和HLA-阴性分选的细胞、许多数量的细胞(例如10、10²、10³、10⁴)皮下注射到雄性小鼠中。根据标准程序分选前列腺癌细胞的GFP细胞亚群。对于HLA I类细胞分离，新鲜细胞的单一悬浮液用PBS + FBS 5%封闭，并且用与藻红蛋白直接缀合的HLA I类抗体(Abcam)染色。为了评价来自新鲜肿瘤组织样品的人癌细胞的肿瘤起始能力，通过机构审查委员会批准的方案从哥伦比亚大学医学中心(Columbia University medical Center)经受外科手术程序的患者获得肿瘤部分。处理四十八份原发性前列腺癌、10份原发性结肠癌、10份原发性肺癌、12份原发性乳腺癌和18份原发性膀胱癌。样本进行机械分离，并过滤，以获得单细胞悬液，并暴露于红细胞裂解缓冲液(Sigma- Aldrich)中以去除红血细胞。细胞用直接缀合的针对人CD45 (Abcam)、人CD31 (eBiosciences)和人HLA- I类(Abcam)的荧光抗体染色。对于异种移植肿瘤，使用针对小鼠CD45 (eBiosciences)、小鼠CD31 (Biolegend, San Diego, CA)和人HLA- I类(Abcam)的荧光缀合的一抗来选择活人癌细胞。将细胞悬浮于10 μg/ml DAPI中以标记死细胞，并且在FACSAria Cell Sorting System (BD Biosciences)上分选。将人前列腺癌HLA分选细胞(HLA I类阴性和HLA I类阳性)和未分选的细胞的不同稀释物(10、100和1,000个注射的细胞)和来自其他人癌症样品(初始注射)和衍生的异种移植物(二次注射)的100个HLA分选的细胞注射到NOD/SCID小鼠中。对于每种分选的细胞群体和细胞稀释物，注射四只小鼠。对于分选的细胞，在每只小鼠中进行四次注射，对于HLA I类阴性细胞，两只在上侧注射，并且对于HLA I类阳性细胞，两只在下侧注射。还将来自每份肿瘤样本的未分选的细胞注射到NOD/SCID小鼠中。进行来自从HLA I类阴性分选细胞生成的肿瘤和源自细胞的HLA I类阳性部分的很少观察到的肿瘤的HLA分选细胞的第二次注射。通过肿瘤发生率(肿瘤数/注射次数)和潜伏期(从注射到首次感知到肿瘤的时间)测量肿瘤起始。通过注射部位的触诊定期评价肿瘤形成。在肿瘤仅在一个注射部位变得可感知的情况下，将该肿瘤手术切除以允许继续评价其他注射部位。监测小鼠最长达36周。还在尸检后检查没有任何肿瘤负荷迹象的动物，以验证没有肿瘤发生。收获的肿瘤用福尔马林固定，当必要时制备石蜡切片用于H＆E染色和免疫荧光研究。

Notch和Hedgehog抑制剂的体外作用

Notch和Hedgehog抑制剂对HLA阴性和HLA-阳性分选细胞系的体外作用通过细胞周期和集落形成测定(如上所述)来分析。细胞暴露于媒介物溶液(对照)、地塞米松(1μΜ)、环杷明(1μΜ)、化合物E(1μΜ)和药物的双组合(例如地塞米松加环杷明)或三组合(地塞米松加环杷明加化合物E)。

Notch和Hedgehog抑制剂在肿瘤起始中的作用

为了分析这些发育通路的抑制是否可能影响癌干细胞在体内的肿瘤起始能力，将来自细胞系和人前列腺肿瘤异种移植物的10³ HLA-阴性分选细胞皮下接种到NOD/SCID小鼠中。小鼠用媒介物溶液(对照)、地塞米松(15 mg/kg/ip每天)、环杷明(50μg/ kg/sc每天)加地塞米松、DBZ(10μΜ/kg/ip每天)加地塞米松或3种药物的组合进行处理。地塞米松和环杷明连续施用；然而，DBZ每天施用(第1天到第15天，每4周)，以避免肠道毒性。对于体内细胞系研究，在用于处理组(例如，环杷明)的8只小鼠中进行三次独立实验，而对于人前列腺肿瘤，对于每个处理组包括8只小鼠。每天监控小鼠，直到形成肿瘤。如果动物显示任何痛苦的迹象或者如果它们失去了其初始体重的20％以上，则处死动物。收获生成的肿瘤，并且组织学验证。

化学耐受表型的表征

关于对分化的研究，评价作为上皮标志物的细胞角蛋白(CKs)以及前列腺相关的生物标志物包括AR、PSA和PSMA的表达。以前已报道CKs对于人分化的上皮细胞是特异性的，在细胞完整性的维持中发挥作用，同时也在信号转导和细胞分化过程中起作用。低分子量CKs(例如，CK18和CK19)在管腔正常人前列腺细胞和前列腺癌中特异性表达，而高分子量CKs(例如，CK5和CK10)在基底正常前列腺细胞中鉴定到，并且在癌细胞群体中很少观察到。在本发明的模型中，多西他赛耐受细胞在低分子量CKs的基因转录和蛋白表达中显示显著下降。DU145-DR细胞分别显示CKs 19和18的蛋白表达减少6.25倍和16.6倍。同样，当进行定量且与敏感的亲本细胞比较时，22RV1-DR显示这些CKs 减少14.3倍和6.7倍。CK19和CK18免疫荧光染色验证了其在多西他赛耐受细胞中表达下降(图2)。此外，高分子量CKs继续如同在其相应亲本细胞中一样在多西他赛耐受细胞中检测不到(数据未显示)，表明在获取多西他赛耐受性的过程中，细胞失去上皮分化标志物，并且不经历从管腔(低分子量CK)到基底样(高分子量CK)表型的转变。此外，当暴露于多西他赛时，表达前列腺相关分化标志物包括AR、PSMA和PSA的22RV1细胞显示出这些标志物的基因和蛋白表达水平的显著下降(图2)。22RV1-DR细胞分别显示AR、PSMA和PSA的蛋白表达下降16.6倍、20.0倍和11.1倍。免疫荧光分析进一步验证了这些结果(数据未显示)。

关于免疫逃避机制，发现，多西他赛耐受细胞显示MHC I类分子的失调。在这方面，我们组以前的工作已经报道了在人原发性和转移性癌中鉴定出MHC I类抗原阴性肿瘤细胞亚群(Cordon- Cardo等人, 1991)。在本研究中观察到，对于将抗原有效递呈至细胞毒性T淋巴细胞和随后肿瘤细胞裂解关键的MHC I类抗原在基因转录和蛋白水平两者中下调(图2)。基因表达谱分析揭示了所有MHC I类抗原(A、B、C、E、F、G)的显著下调，该事实在蛋白水平通过MHC I类抗原A、B、C的免疫印迹和免疫荧光染色得到验证(图2)。此外，多西他赛耐受的细胞显示已知NK配体诸如表9中显示的MICA/B、PVR和PVRL2的基因转录物水平的下调。因此，这些细胞表现出有利于免疫逃逸的表型，使它们无法被宿主免疫系统检测到。

与其亲本敏感细胞(DU145和22RV1)相比多西他赛耐受细胞(DU145-DR和22RV1-DR)中失调的自然杀伤(NK)配体基因表达总结在表9中。使用匹配的敏感和耐受细胞之间t检验进行基于对数均一化显示≥2倍变化的基因的平均表达平均差异的统计分析。大多数NK配体基因的转录水平有降低。

表9

自然杀伤(NK)细胞配体的基因转录水平

注：NS=不显著。

关于干细胞表型的研究，表征了WNT/β-联蛋白的鉴定的失调表达，Notch和Hedgehog已经牵涉于祖细胞的自我更新和分化(Katoh等人, 2007; McDonald等人, 2006; van den Brink等人, 2004; Radtke等人, 2006; Leong等人, 2008; 和Grigoryan等人, 2008)。在前列腺中，已经报道这些信号传递通路在发育模式形成、上皮再生和前列腺癌肿瘤发生中发挥重要作用(Wang等人, 2006; Karhadkar等人, 2004)。多西他赛耐受细胞在Dickkopf-1(DKK1)(WNT/β-联蛋白信号传递网络的众所周知的抑制剂)的基因转录物和蛋白水平两者中显示显著下降。DKK1表达的这种下降与去磷酸化(活性)的β-联蛋白(其是WNT信号传递中的主要关键效应物)的表达增加相关。免疫荧光分析表明，亲本多西他赛敏感细胞表现出β-联蛋白的膜表达(这与其作为粘附分子起作用相关)，而多西他赛耐受细胞显示该蛋白的显著核定位(图2)，据报道对于经典WNT信号传递通路的激活是必要的。此外，多西他赛耐受细胞也表现出NOTCH信号传递网络的增加。NOTCH2基因转录物水平在耐受细胞中显著增加，并且与经切割的Notch2蛋白表达的增加相关，这与蛋白的核易位相关，在核中，其发挥其转录活性(图2)。最后，多西他赛耐受细胞的Hedgehog受体Patched和胶质瘤相关癌基因同系物转录因子Gli1和Gli2的表达增加。这些发现与上述转录因子的蛋白表达增加和核易位相关(图2)，这种情况已经与Hedgehog通路的激活相关。令人惊讶的是，其他报道的干细胞表面标志物，诸如CD44和CD133，在该模型中如在基因转录和蛋白水平两者中分析的均未发现上调(数据未显示)。

此外，据观察，DU145-DR和22RV1-DR细胞两者的耐受现象的逆转与分化标志物的表达增加相关联。多西他赛逆转的耐受细胞(培养12周，无药物)显示当与多西他赛获得的耐受细胞相比，低分子量细胞角蛋白(CK19和CK18)和HLA-I类的蛋白表达水平更高，达到与亲本敏感细胞中观察到的那些类似的水平(图13)。

上皮分化报道模型的生成和表征

DU145亲本细胞用含有驱动绿色荧光蛋白(GFP)表达的CK19启动子的质粒稳定转染(图14a)。 DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞中CK19和GFP的共表达通过免疫荧光来验证(图14a)。流式细胞术定量显示了两种不同的细胞群体，大多数细胞对于GFP和CK19两者均为阳性(94.3±3.8％)，离散群体的细胞对于两种标志物均为阴性(5.6±4.1％)。对于这两个主要群体外的几个散布细胞进行观察，这可能代表细胞从一个区室向另一个区室转化。此外，CK19/GFP阴性细胞中启动子构建体的稳定插入通过PCR验证(图4c)。进一步表征DU145-CK19启动子-GFP稳定细胞中HLA-I类的表达(图14b)。并不令人惊讶，表达GFP的细胞也是HLA-阳性的(91.6±5.5％)，并且不表达GFP的细胞表现出HLA-阴性表型(7.0±4.95)。因此，这些结果验证了利用GFP作为上皮分化的报道分子，并且进一步证明，如前图4b中所示，缺乏分化标志物(CK19/GFP)和HLA I类抗原的细胞亚群的存在。

对HLA-I类分选细胞系的肿瘤起始研究

为了进一步验证HLA-I类表达可用作鉴定具有肿瘤起始的癌干细胞功能特性的细胞表面标志物，亲本细胞系DU145和22RV1针对HLA-I类进行分选，并且在NOD/SCID小鼠中测试其肿瘤起始能力(图15)。与用DU145-CK19启动子-GFP稳定的GFP阴性细胞获得的结果类似，只有HLA I类阴性细胞在稀释测定后表现出肿瘤起始能力。注射10个HLA I类阴性DU145和22RV1细胞分别在83.3±19.1％和100％受体中产生肿瘤，而在用表现出HLA I类阳性表型的10个细胞注射198天后没有观察到肿瘤形成。值得注意的是，来自22RV1和DU145的HLA-I类阴性细胞的肿瘤起始能力和肿瘤潜伏期不同，尽管这些差异没有达到统计学显著性。致瘤细胞系之间的差异可以由以下事实进行解释：其他分子通路可能在小鼠中人细胞的移植和生长中发挥作用。来自HLA I类阴性生成的肿瘤异种移植物的系列移植后观察到类似结果(数据未显示)。

对HLA-I类分选细胞系的克隆性研究

为了解决来自DU145和22RV1亲本细胞系的HLA I类分选细胞的克隆性能力，进行稀释集落形成测定。HLA I类阴性细胞表现出比HLA I类阳性细胞统计学显著更高的克隆性。具体而言，当分别铺板10、100和1000个细胞时，来自DU145的HLA I类阴性分选细胞生成31.6±7.5％、17.1±3.6％和22.0±4.9％的集落。相比之下，当铺板10、100和1000个细胞时，HLA I类阳性细胞生成5.0±8.3％、8.0±3.3％和5.5±1.5％的集落(图8)。用22RV1 HLA I类分选的亲本细胞观察到了类似结果(数据未显示)。

人组织中前列腺癌干细胞的鉴定

转移的(n=20)和匹配的原发性(n=6)人前列腺癌组织的免疫组织化学研究揭示，所有样本含有CK-阴性(CK18和CK19)肿瘤细胞的散布亚群，分别占原发性和转移性病变中所有肿瘤细胞的0.05％至0.3％和0.4％至1.8％(图7a)。然后进行基于免疫荧光的双染法以评价CK表达和目标标志物之间的关联。在该分析中，一致性地观察到，CK表达与HLA I类表达显著相关(p<0.0001)。更具体地，观察到，CK阴性肿瘤群体在97.8±0.7％细胞中不表达HLA-I类抗原， 然而所有(100％)CK-阳性细胞表现出阳性的HLA I类抗原表型(图4b)。鉴定了表现出HLA I类阳性表型的CK-阴性细胞的小群体，这可能代表经历从HLA I类阴性/CK-阴性表型向分化表型的转化的肿瘤细胞。此外，一致地发现CK-阴性/HLA-阴性肿瘤细胞当与分化的CK-阳性/HLA-阳性细胞相比时发育转录因子的核表达(激活)的显著(p<0.0001)增加。CK-阴性/HLA-阴性细胞在63.9±22.6％细胞中表现出去磷酸化β-联蛋白的核表达，在72.8±15.1％细胞中表现出切割的Notch2的核表达，在67.5±17.3％细胞中表现出Gli1的核表达，和在67±17.3％细胞中表现出Gli2的核表达，而CK-阳性/HLA-阳性细胞仅在5.8±11.9％细胞中表达细胞核去磷酸化的β-联蛋白，在6.7±7.9％细胞中表达切割的Notch2，在1.2±7.9％细胞中表达Gli1，在1.5±10.6％细胞中表达Gli2(图7c)。此外，还观察到CK-阴性/HLA-I类阴性肿瘤细胞不显示核AR的表达，而CK-阳性/HLA-I类阳性细胞在71.8±14.3％细胞中表现出核AR(图7d)。因此，前列腺癌干细胞不表现出阳性AR表型的事实表明这些细胞可能不依赖于功能性AR信号传递，这可以解释这些细胞如何负责观察到的激素治疗后的复发。总而言之，这些结果验证了人前列腺癌组织样品中前列腺癌干细胞亚群的存在和鉴定其的能力。

统计分析

实验数据表示为平均值±SD。通过Student’s t检验进行统计分析。当p≤0.05时，值被认为是统计学显著的。

实施例6

体外高通量测定

基于上述公开的CSCs的功能性化疗耐受和表型特征，设计体外高通量测定以筛选靶向该CSC群体的化合物，以确定CSCs是否被选择性地杀死或分化。该测定的实施允许测试各种各样的药物并且促进鉴定具有假定CSC抑制作用的化合物。

体外高通量测定由以下组成：将上述CSCs接种到96孔板中。然后将细胞暴露于目标候选试剂，例如药物，并且在所需时间点(例如，24小时，72小时等)获得读出值。读出值在于比较通过流式细胞术分析获得的处理相比于未处理群体中表达CSC表型(例如，缺乏HLA，CD24等)的细胞的百分比。平行地，还进行比较处理和未处理的细胞之间活(“存活”)细胞的百分比的细胞活力测定。结果解释如下：靶向CSC群体的候选试剂，例如，药物，应当抑制缺乏CSCs的化疗耐受细胞的生长或杀死缺乏CSCs的化疗耐受细胞。使用该测定可能获得四种可能结果：结果1，CSCs百分比降低且细胞活力降低；结果2，CSC降低而细胞活力不降低，结果3，CSC群体增加且细胞活力降低；和结果4，CSC百分比和细胞活力都不降低。结果1可以解释为CSC群体已经被候选试剂，例如，药物所靶向。结果2可以解释为CSC群体已经分化。结果3可以解释为肿瘤细胞而非CSC群体已经被候选试剂，例如，药物所靶向。结果4可以解释为候选试剂，例如，药物在CSC或肿瘤分化细胞中没有产生任何效果。

产生CSC耗尽(结果1)或CSC分化(结果2)的候选试剂，例如，药物将被考虑用于进一步实验和借助标准体外和体内测定进行表征。简而言之，目的在于确认和验证早期筛选结果的这些测定包括：a) 在体外 – 基于其对应表型(例如，流式细胞术和免疫组织化学分析)的细胞凋亡方法(例如，膜联蛋白V)、集落形成和分化研究；和b) 在体内 - 在免疫缺陷小鼠中的稀释肿瘤起始测定。

使用上述Notch和Hedgehog抑制剂验证该高通量筛选。

在本申请中引用的所有文献通过引用并入本文，如同其在本文中完全记载。

尽管本文中已经描述了本发明的说明性实施方案，但应该理解，本发明不限于所述的那些，并且不背离本发明的范围或精神的情况下，本领域技术人员可以进行各种其他改变或修改。

Claims (24)

1.用于鉴定选择性降低癌干细胞(CSCs)数量的试剂的方法，其包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触；并且

b. 确定所述候选试剂是否相对于没有与所述候选试剂接触的CSC降低所述CSC的生存或生长或增强所述CSC的分化。

2.权利要求1的方法，其中所述CSC进一步具有以下特性：CD24^-、CD133^-、Notch⁺、Gli1⁺、Gli2⁺、细胞角蛋白^-、神经丝^-和胶质原纤维酸性蛋白^- (GFAP^-)。

3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述CSC进一步具有以下特性：自我更新的能力、经历不对称细胞分裂、具有致瘤能力、具有转移潜能、具有多向分化特性、广泛的化学耐受性、和对Notch和Hedgehog抑制剂的敏感性。

4.权利要求1的方法，其中所述CSC是标准化疗难治的。

5.权利要求1的方法，其中所述候选试剂选自化学剂、生物剂和其组合。

6.权利要求1的方法，其中所述确定步骤包括将用所述候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用所述候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较，其中与未经处理的细胞中的CSCs百分比相比降低经处理的细胞群体中CSCs百分比的候选试剂是选择性降低CSCs数量的试剂。

7.权利要求1的方法，其中所述确定步骤包括实施选自以下的程序：流式细胞术分析、细胞活力测定、细胞分化测定、细胞分裂测定以及它们的组合。

8.权利要求1的方法，其中所述细胞群体包含CSCs和成体干细胞，并且所述试剂降低细胞群体中CSCs的数量，而基本上不降低成体干细胞的数量。

9.权利要求1的方法，所述方法是高通量筛选。

10.权利要求1的方法，其中所述确定步骤进一步包括步骤i和步骤ii、iii和iv中的至少一个：

i. 将用所述候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用所述候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较；

ii. 确定处理和未处理的细胞群体中活细胞的百分比，

iii. 确定处理和未处理的细胞群体中非CSC细胞的百分比；并且

iv. 确定处理和未处理的细胞群体中分裂细胞的百分比，

其中，(1)降低CSCs的百分比和降低细胞活力；(2)降低CSCs的百分比而不降低细胞活力；(3) 降低CSCs的百分比且增加非CSCs的百分比； (4) 降低CSCs的百分比和降低细胞分裂；或(5) 降低CSCs的百分比而不降低细胞分裂的候选试剂是选择性降低CSCs数量的试剂。

11.权利要求10的方法，其中所述确定步骤包括实施选自以下的程序：流式细胞术分析、细胞活力测定、细胞分化测定、细胞分裂测定以及它们的组合。

12.用于鉴定选择性降低细胞群体中癌干细胞(CSCs)百分比的试剂的高通量筛选方法，其包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触；

b. 通过以下确定所述候选试剂是否相对于没有与所述候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化：

i. 将用所述候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用所述候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较；

ii. 确定处理和未处理的细胞群体中活细胞的百分比；

iii. 确定处理和未处理的细胞群体中非CSC细胞的百分比；并且

iv. 确定处理和未处理的细胞群体中分裂细胞的百分比；

其中，(1)降低CSCs的百分比和降低细胞活力；(2)降低CSCs的百分比而不降低细胞活力；(3) 降低CSCs的百分比且增加非CSCs的百分比；(4) 降低CSCs的百分比和降低细胞分裂；或(5) 降低CSCs的百分比而不降低细胞分裂的候选试剂是选择性降低CSCs的百分比的试剂。

13.权利要求12的方法，其中所述CSC进一步具有以下特性：CD24^-、CD133^-、Notch⁺、Gli1⁺、Gli2⁺、细胞角蛋白^-、神经丝^-和GFAP^-。

14.权利要求12或13中任一项的方法，其中所述CSC进一步具有以下特性：自我更新的能力、经历不对称细胞分裂、具有致瘤能力、具有转移潜能、具有多向分化特性、广泛的化学耐受性、和对Notch和Hedgehog抑制剂的敏感性。

15.权利要求12的方法，其中步骤(i)通过流式细胞术分析来实施。

16.权利要求12的方法，其中步骤(ii)通过细胞活力测定来实施。

17.权利要求12的方法，其中步骤(iii)通过细胞分化测定来实施。

18.权利要求12的方法，其中步骤(iv)通过细胞分裂测定来实施。

19.权利要求12的方法，其中所述候选试剂选自化学剂、生物剂和其组合。

20.权利要求12的方法，其中所述CSCs是标准化疗难治的。

21.用于鉴定选择性降低细胞群体中癌干细胞(CSCs)百分比的试剂的高通量筛选方法，其中所述CSCs是标准化疗难治的，所述方法包括：

a. 将来自细胞群体的CSC与候选试剂接触，其中所述CSC具有以下特性：HLA I^-和HLA II^-；

b. 通过以下确定所述候选试剂是否相对于没有与所述候选试剂接触的CSC降低CSC的生存或生长或增强CSC的分化：

i. 使用流式细胞术将用所述候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比与没有用所述候选试剂处理的细胞群体中CSCs的百分比进行比较；

ii. 使用细胞活力测定确定处理和未处理的细胞群体中活细胞的百分比；

iii. 使用细胞分化测定确定处理和未处理的细胞群体中非CSC细胞的百分比；并且

iv. 使用细胞分裂测定确定处理和未处理的细胞群体中分裂细胞的百分比；

其中，(1)降低CSCs的百分比和降低细胞活力；(2)降低CSCs的百分比而不降低细胞活力；(3) 降低CSCs的百分比且增加非CSCs的百分比； (4) 降低CSCs的百分比和降低细胞分裂；或(5) 降低CSCs的百分比而不降低细胞分裂的候选试剂是选择性降低CSCs的百分比的试剂。

22.权利要求21的方法，其中所述候选试剂选自化学剂、生物剂和其组合。

23.通过权利要求1、12或21中任一项的方法鉴定的用于选择性杀死CSCs的试剂。

24.药物组合物，其包含药学可接受的载体和权利要求23的试剂或其药学可接受的盐。

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