KR102353109B1 - 상피성장인자-유사도메인 8 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 암줄기세포 마커 발현 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상피성장인자-유사도메인 8 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 암줄기세포 마커 발현 암질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암줄기세포 마커 발현에 의해 항암제 내성을 나타내고 전이를 유도하는 악성 난소암세포에서 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8)이 암줄기세포 마커가 발현된 악성암 세포의 성장, 전이 및 항암제 내성을 억제시키는 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제는 악성암 질환 치료제로 제공될 수 있다.

Description

상피성장인자-유사도메인 8 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 암줄기세포 마커 발현 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer stem cell marker expression cancer diseases comprising epidermal growth factor-like domain 8}

본 발명은 상피성장인자-유사도메인 8 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하며, 악성을 나타내는 암줄기세포 마커 발현 암질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상피성장인자-유사도메인(epidermal growth factor(EGF)-like domain; EGFL)계 분자들의 도메인은 종열중복(tandem repeat)의 형태로 존재하며 진화적으로 보존이 잘 되어 있는 단백질 도메인으로, 현재 총 10개 이상의 EGFL계 단백질이 알려져 있다. EGF-유사 도메인은 혈액응고(blood coagulation), 섬유소용해(fibrinolysis), 세포부착(cell adhesion), 신경 및 척추동물 발달(neural and vertebrate development)과 같이 세포 활성에 관련된 다수의 척추동물 단백질에서 확인된 바 있으나, 그 특성과 기능에 대한 연구는 매우 미비한 실정이다.

EGFL계 단백질 중 신경세포의 아형(subset of neurons) 뿐만 아니라 혈관내피세포(endothelial cells)에 의해 발현되는 EGFL7은 혈관내피세포에서 대한 화학주성인자로 작용하여 혈관내피세포의 부착성과 이동성을 조절하고, 혈관신생(angiogenesis)과 같은 혈관 발생에 관여하며 신경줄기세포(neural stem cells)의 증식(poliferation) 및 자가 재생산(self-renewal)을 조절하는데 관련있는 것으로 알려져 있다.

최근의 연구에 의하면, EGFL7이 다양한 종양에서 발현되거나 일부 종양에서 증가된 EGFL7의 발현이 종양혈관신생을 촉진하는데 관여할 것으로 추정되고 있다. 또한 EGFL7은 숙주 면역반응의 공격으로부터 암세포를 보호함으로써 간접적으로 종양의 성장을 촉진할 수 있다는 증거가 제시되었는데, 이는 EGFL7이 ICAM-1 및 VCAM-1과 같은 면역세포의 조직 내 침윤에 필수적인 혈관내피세포-백혈구 부착 분자의 발현을 감소시키는 작용에 기인한 것으로 보고되어 지며, EGFL7에 의한 ICAM 1 발현의 감소는 혈관내피세포의 손상 기전과도 관련되어 있을 것으로 여겨지고 있다. 그 외에도 EGFL7은 간암, 유방암, 대장암 및 폐암세포의 전이를 촉진하는 기능을 가진다는 사실도 밝혀졌다.

이렇듯이 EGFL7의 기능에 대해서는 어느 정도 연구가 이뤄지고 있는 반면, EGFL7의 paralogue로서 EGFL8 유전자가 최초로 발견된 이래로, EGFL8 유전자에 대한 연구가 전혀 이루어지지 않았으며 그에 따라, EGFL8의 기능적 역할에 대해서는 거의 알려진 바가 없다. 특히 피치 등은 EGFL7 및 EGFL8의 발현은 부분적으로 유사하지만 기능에 있어서 중복되지 않을 수 있다고 보고하였다. 따라서 EGFL7의 알려진 기능만으로 EGFL8의 기능을 유추할 수 없기 때문에 EGFL8의 기능을 이해하기 위해서는 이에 관한 연구가 필수적으로 요구된다.

한편, 종양에서 자가 재생 능력을 나타내는 세포가 확인되었으며, 이러한 세포를 암줄기세포(Cancer Stem Cells, CSCs)라 한다. 이러한 암줄기세포(CSCs)는 자가재생, 암 개시 및 종양의 유지 능력과 함께 약물저항성 및 전이가 나타내는 종양세포로 확인되었으며, 암줄기세포성 간암 세포에는 약물저항성을 비롯하여 방사선 치료 저항성을 나타내는 것으로 보고되었다(Adv Exp Med Biol. 2016;890:57-74.). 또한, 유방, 대장, 폐, 난소, 방광 및 두경부의 암줄기세포에서도 종양형성, 전이, 약물저항성 및 종양미세환경 면역억제가 나타나는 것으로 보고(Cancers (Basel). 2019 May 27;11(5))되어 짐에 따라, 암질환의 보다 효과적이고 우수한 치료 효과를 얻기위해서는 악성 종양을 유도하는 암줄기세포성 종양세포에 대한 치료방법 및 치료제에 대한 개발이 필요한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2017-0007606 (2017.01.19. 공개)

본 발명은 암줄기세포 마커 발현에 의해 악성화된 암질환을 진단하기 위한 바이오마커 조성물을 제공하며, 상피성장인자-유사도메인 8 (epidermal growth factor-like domain 8, EGFL8) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 조성물을 암줄기세포에 의해 악성화된 암질환의 예방 또는 치료제로 제공하고자 한다.

본 발명은 상피성장인자-유사도메인 8 (epidermal growth factor-like domain 8, EGFL8) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 암줄기세포 마커 발현 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명은 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 암세포 전이억제용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따르면 항암제 내성을 나타내고 전이를 유도하는 악성 난소암세포에서 암줄기세포 마커인 OCT4, Sox2, Nanog 및 KLF4의 발현이 확인되었으며, 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8)은 상기 암줄기세포 마커가 발현된 악성암 세포의 성장, 전이 및 항암제 내성을 억제시키는 효과를 나타내는 것으로 확인됨에 따라, 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제는 악성암 질환 치료제로 제공될 수 있다.

도 1은 난소암 세포에서 EGFL8 단백질의 발현 및 세포 증식에서 EGFL8 넉다운의 효과를 확인한 결과로, 도 1A는 사람 난소암 세포주에서 EGFL8의 단백질 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 분석 결과이며, 도 1B는 비형질주입된 대조군, 스크럼블 대조군 및 EGFL8 siRNA 형질주입된 A2780 세포에서 EGFL8 siRNA의 형질주입 효율을 확인한 웨스턴블롯 분석 결과이며, 도 1C는 EGFL8 siRNA 또는 음성 대조군으로 형질주입된 A2780 세포의 세포 성장을 확인하기 위한 WST-1 분석 결과이며, 도 1D는 EGFL8 siRNA의 형질주입에 의한 A2780 세포의 콜로니 형성능을 확인한 결과로, 결과값은 독립된 실험 3회의 평균 ± SD로 나타내었다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus the control).
도 2는 A2780 세포의 세포사멸에 있어서, EGFL8 넉다운의 영향을 확인한 결과로, 도 2A는 EGFL8 siRNA 형질주입 및 비형질주입된 A2780 세포에서 Annexin V/PI 염색을 이용한 유세포 분석을 통하여 세포사멸 효과를 확인한 결과로, EGFL8 넉다운은 세포 사멸을 감소시킨 것을 확인한 결과이며, 도 2B는 EGFL8 siRNA 형질주입 및 비형질주입된 A2780 세포에서 세포사멸 조절 단백질의 발현을 확인한 웨스턴 블롯 분석결과로, EGFL8 넉다운은 A2780 세포에서 Bcl-2를 현저하게 상향조절시킨 반면, Bax를 하향조절시킨 결과이며, 막대 그래프는 β-액틴 단백질로 단백질 발현의 밀도 정량을 나타낸 것으로, 결과값은 독립된 실험 3회의 평균 ± SD로 나타내었다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus the control).
도 3은 A2780 세포의 이동 및 침습에서 EGFL8 침묵의 영향을 확인한 결과로, 도 3A는 EGFL8 siRNA 형질주입되거나 비형질주입된 A2780 세포의 이동을 확인하기 위해 상처 치유 분석을 수행한 결과로, EGFL8 하향조절은 A2780 세포의 이동능력이 유의하게 향상된 것을 확인하였으며, 도 3B는 트랜스웰 침습 분석결과로, EGFL8 넉다운 후 A2780 세포의 이동 가능성이 유의하게 증가된 것을 확인한 결과이며, EGFL8 넉다운은 A2780 세포의 침습 능력을 현저하게 증가시킨 것을 확인한 결과이다. 결과값은 독립된 실험 3회의 평균 ± SD로 나타내었다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.0001 versus the control).
도 4는 EMT 및 MMP의 발현에 있어 EGFL8의 영향을 확인한 결과로, 도 4A는 EGFL8 siRNA 형질주입되거나 비형질주입된 A2780 세포에서 주요 EMT 마커의 mRNA 수준을 확인한 RT-PCR 분석 결과로, EGFL8 넉다운은 중심 EMT 마커의 발현이 상향조절된 것을 확인한 결과이며, 도 4B는 EGFL8 siRNA 형질주입되거나 비형질주입된 A2780 세포에서 비멘틴 염색의 공초점 현미경 분석 결과로, EGFL8 넉다운은 비멘틴 발현을 현저하게 상향 조절시킨 것을 확인한 결과이며, 도 4C는 EGFL8 siRNA 형질주입되거나 비형질주입된 A2780 세포에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 확인한 RT-PCR 분석 결과로, EGFL8 넉다운 A2780 세포에서 MMP-2 및 MMP-9 발현이 상향조절된 것을 확인한 결과로, 막대 그래프는 GAPDH mRNA로 mRNA 발현의 밀도 정량을 나타낸 것으로, 결과값은 독립된 실험 3회의 평균 ± SD로 나타내었다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus the control).
도 5는 A2780 세포에서 CSC 마커의 발현에 대한 EGFL8 넉다운의 영향을 확인한 결과로, 도 5A는 EGFL8 siRNA 형질주입되거나 비형질주입된 A2780 세포에서 Sox2, Nanog, Oct4 및 KLF4의 상향조절된 발현을 확인한 RT-PCR 분석 결과로, EGFL8 넉다운은 CSC 마커의 발현을 현저하게 상향조절시킨 것을 확인한 결과이며, 도 5B는 EGFL8 siRNA 형질주입되거나 비형질주입된 A2780 세포에서 ALDH1A1 발현을 확인 유세포 분석 결과로, EGFL8 siRNA-형질주입된 A2780 세포에서 ALDH1A1 발현이 유의하게 상향조절된 것을 확인한 결과이다. 막대 그래프는 GAPDH mRNA로 mRNA 발현의 밀도 정량을 나타낸 것이며, 결과값은 독립된 실험 3회의 평균 ± SD를 나타내었다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus the control).
도 6은 A2780 세포에서 CSC 마커의 발현에 대한 EGFL8 넉다운의 영향을 확인한 결과로, 도 6A는 EGFL8 siRNA 형질주입되거나 비형질주입된 A2780 세포에서 24시간 약물 처리 후 세포 생존도를 확인한 결과로, 위상차 현미경 영상 및 WST-1 분석을 통하여 EGFL8 넉다운된 A2780 세포에서 화학요법 저항성이 나타난 것을 확인한 결과이며, 도 6B는 EGFL8 siRNA 형질주입되거나 비형질주입된 A2780 세포에서 화학요법 저항성과 관련된 유전자의 mRNA 수준을 확인한 RT-PCR 분석 결과로, EGFL8 siRNA 형질주입된 A2780 세포에서 MDR1 및 MRP1의 발현이 현저하게 증가된 것이 확인되었다. 막대 그래프는 GAPDH mRNA로 mRNA 발현의 밀도 정량을 나타낸 것이며, 결과값은 독립된 실험 3회의 평균 ± SD를 나타내었다 (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 versus the control).
도 7 내지 도 15는 다양한 종류의 암세포에 EGFL8 단백질을 처리하여 EGFL8에 의한 암세포의 성장능 조절 효과를 측정하기 위해 WST-1 분석으로 확인한 결과로, 도 7은 사람 위암세포인 NCI-N87에 100, 300 및 500 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 24 및 48시간 동안 처리한 실험군 및 150 ng/ml EGFL8 단백질을 3, 6 및 12 시간 동안 처리한 실험군에서 EGFL8에 의한 사람 위암세포에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 사람 대장암세포인 HCT-15에 100, 300 및 500 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리한 후 EGFL8에 의한 사람 대장암세포에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 마우스 흑색종세포인 B16-F10에 100, 300 및 500 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리한 후 EGFL8에 의한 마우스 흑색종세포에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 10은 사람 유방암세포인 MCF-7에 100, 300 및 500 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리한 실험군 및 150 ng/ml EGFL8 단백질을 3, 6 및 12 시간 동안 처리한 실험군에서 EGFL8에 의한 사람 유방암세포에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 사람 난소암세포인 R182에 10, 50, 150 및 500 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 2시간 동안 처리한 후 EGFL8에 의한 사람 난소암세포에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 마우스 B세포림프종 세포인 A20에 100 및 150 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리한 후 EGFL8에 의한 마우스 B세포림프종 세포에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 사람 간암세포인 HepG2에 100 및 150 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리한 후 EGFL8에 의한 사람 간암세포에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 사람 비소세포폐암인 NCI-H1703에 100, 300 및 500 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리한 후 EGFL8에 의한 사람 비소세포폐암에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 사람 전립선암세포인 DU-145에 100 ng/ml EGFL8 단백질을 6 및 24시간 동안 처리한 후 EGFL8에 의한 사람 전립선암세포에 대한 성장 조절 효과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 사람 난소암세포인 R182에 50 및 300 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 1시간 동안 처리하고 사람 난소암세포에 대한 세포사멸 유도 효과를 측정하기 위해 DAPI 염색으로 핵분절화의 정도를 확인한 결과이다.
도 17은 사람 난소암세포인 R182에 50, 150 및 300 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 1시간 동안 처리하고 EGFL8 단백질의 사람 난소암세포 사멸 유도 효과에 대한 기전을 규명하기 위해 세포사멸 과정에서 매우 중요한 역할을 수행하는 카스파제-3의 발현을 웨스턴 블롯(western blot) 법으로 확인한 결과이다.
도 18은 사람 난소암세포인 R182에 50, 150, 300, 500 및 1000 ng/ml 농도의 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리하고 EGFL8 단백질에 의한 사람 난소암세포(R182) 이동 조절 효과를 확인하기 위해 상처치유분석법(wound healing assay)을 수행한 결과이다.
도 19는 암세포의 이동을 촉진하는 것으로 알려진 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) 100 ng/ml이 처리된 사람 난소암세포인 R182에 300 및 500 ng/ml EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리하고 EGFL8 단백질의 세포이동 조절 효과를 확인하기 위해 상처치유분석법(wound healing assay)을 수행한 결과이다.
도 20은 EL4 T세포림프종 세포를 접종하여 종양을 유도시킨 생쥐에 200 ng/mouse의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 정맥내(i.v.) 주사한 후 종양에 대한 EGFL8의 생체내 효과(in vivo effect)를 확인한 결과로, 도 20A는 헤마톡실린(hematoxylin)-에오신(eosin) 염색 결과이며, 도 20B는 헤마톡실린 염색을 통하여 대조군과 EGFL8 투여군의 종양조직의 형태학적 특징을 비교한 결과이다.
도 21은 EL4 T세포림프종 세포를 접종하여 종양을 유도시킨 생쥐에 200 ng/mouse의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 정맥내(i.v.) 주사한 후 종양에 대한 EGFL8의 생체내 효과(in vivo effect)를 면역조직화학염색을 통하여 대조군과 EGFL8 투여군의 종양조직에서 제2형 주조직적합복합체 분자를 발현하는 세포의 분포 특성을 비교한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 상피성장인자-유사도메인 8 (epidermal growth factor-like domain 8, EGFL8) (GenBank Accession No. BC052591.1) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 암줄기세포 마커 발현 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 암줄기세포 마커는 OCT4 (GenBank Accession No. NM_002701.4), Sox2 (GenBank Accession No. NM_003106.2), Nanog (GenBank Accession No. NM_NM_024865.2) 및 KLF4 (GenBank Accession No. NM_NM__004235.4)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되며, 상기 마커는 암세포의 악성화를 유도하는 것일 수 있다.

상기 활성화제는 EGFL8 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시켜 암세포의 세포사멸을 증가시키고, 암세포의 전이, 약물저항성 및 암줄기세포 마커의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

보다 상세하게는 상기 활성화제는 EGFL8 유전자 또는 단백질의 전체 또는 일부 서열을 포함하여 EGFL8 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로서, cDNA, mRNA, 발현벡터, 플라스미드 DNA, 앱타머, 재조합 단백질, 항체, 펩티드(peptides), 폴리펩티드(polypeptides), 백신(vaccines), 호르몬(hormones), 효소(enzymes), 리보자임(ribozyme), 사이토카인(cytokines) 및 케모카인(chemokines)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있다.

상기 암질환은 난소암, 유방암, 위암, 대장암, 직장암, 폐암, 간암, 전립선암, 신장암, 췌장암, 갑상선암, 자궁암, 방광암, 다형성아교모세포종 피부암, 흑색종, 갑상선암, 두경부암, 후두암, 수모세포종, 인후두암, 구강암, 타액선암, 식도암, 골육종, 혀암, 담도암, 신경아교종, 뼈암, 원인불명원발암, B세포림프종, T세포림프종, 백혈병(leukemia) 및 다발골수종(multiple myeloma)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명은 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 항암제 내성 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 항암제는 시스플라틴(Cisplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 시스플라틴(Cisplatin), 카르보플라틴(Carboplatin), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 비노렐빈(Vinorelbine), 카바지탁셀(Cabazitaxel) 및 파클리탁셀(Paclitaxel)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 EGFL8은 MDR1 및 MRP1의 발현을 억제시켜 암세포의 항암제 내성을 저해하는 것일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 상기 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8) 또는 이의 활성화제를 유효성분으로 함유하는 암세포 전이억제용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 EGFL8은 상피 중간엽 이행관련 유전자인 snail, slug, twist, vimentim과 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 저해시켜 암세포 전이를 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 "전이 (metastasis)"는 암세포가 하나의 장기 또는 그 부분에서 다른 장기나 장기 주변부로 퍼지는 것을 말하며, 주로 악성 암세포들이 전이하는 능력을 가진다. 암세포들은 1차 암으로부터 빠져나와 임파계 혹은 혈관계로 침투해 들어가서 순환하여 신체의 다른 부위의 정상 조직에서 성장한다. 암전이는 악성 암의 전형적인 특징으로 이러한 암에 의한 사망 원인의 90%를 차지하고 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실험예>

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 세포 배양

난소암 세포주 중에서 A2780 세포를 European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, UK)에서 얻었으며, CAOV3, SKOV3 및 OVCAR3 세포를 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다.

악성 난소 복수로부터 유래된 항암요법 저항성 사람 EOC 세포주 R182 세포는 Dr. J. Shah (Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, New York, NY, USA)에 의해 제공되었다.

상기 모든 세포주는 10% 태아소혈청 (FBS, Welgene, Daegu, Korea) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco/Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)이 포함된 RPMI 1640 (Hyclone, Chicago, IL, USA) 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO₂ 조건하에서 배양되었으며, 3일마다 신선한 배지로 교체되었다.

사람 위암세포주(human gastric cancer cell, NCI-N87), 사람 유방암세포주(human breast cancer cell, MCF-7), 사람 비소세포폐암주(human non-small cell lung cancer cell, NCI-H1703), 사람 대장암세포주(human colon cancer cell, HCT-15), 마우스 대장암세포주(mouse colon cancer cell, CT-26), 사람 간암세포주(human liver cancer cell, HepG2), 마우스B세포림프종세포주(mouse B cell lymphoma cell, A20) 마우스T세포림프종세포주(mouse T cell lymphoma cell, EL4) 및 마우스흑색종세포주(mouse melanoma cell, B16-F10)는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, 사람 전립선암세포주(human prostate cancer cell, DU-145)는 한국세포주은행에서 구입하여 사용하였다.

NCI-N87, NCI-H1703, DU-145 및 A20 세포주는 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Invitrogen), 100 IU/ ml 페니실린(penicillin; Gibco, Invitrogen) 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin; Gibco, Invitrogen)이 포함된 RPMI-1640 배지 (HyClone, Logan, UT, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에 배양 및 유지하였다.

또한 HepG2, CT-26, EL4 및 B16-F10 세포주는 10%(v/v) 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, Invitrogen), 100 IU/ ml 페니실린(penicillin; Gibco, Invitrogen) 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신(streptomycin; Gibco, Invitrogen)이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, HyClone, Logan, UT, USA)을 사용하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에 배양 및 유지하였으며, 2-3일에 한 번씩 신선한 배양액으로 교환하였다.

2. siRNA 형질주입 (siRNA transfection)

생체 외 형질주입 시약 iN-fect™ (iNtRON, Sungnam, Korea)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 EGFL8을 형질주입하였다.

Bioneer (Daejeon, Korea)에서 dTdT가 돌출되어 있는 21 bp siRNA 이중가닥 및 음성 대조군 siRNA를 합성하였다. EGFL8 siRNA 염기서열은 다음과 같다:

(1) Sense sequence : 5′-GGAUCUUUCAAAGAGAGUU-3′

(2) Antisense sequence : 5′-AACUCUCUUUGAAAGAUCC-3′

넉다운 24시간 전에 A2780 세포를 5 ×10⁸ cells/well 밀도로 6 웰 플레이트에 접종하였으며, 무혈청 RPMI 1640 (Hyclone)를 이용하여 세포에 100 pmol siRNA를 형질주입하였다. 비형질주입된 세포를 대조군으로 사용하였으며, siRNA 형질주입 효율을 확인하기 위해, 웨스턴블롯으로 EGFL8 수준을 확인하였다.

3. 세포증식 확인

0.25% 트립신 (Gibco/Thermo Fisher Scientific)으로 형질주입된 A2780 세포 및 대조군 A2780 세포를 떼어내었다.

약 1×10⁴ 세포를 포함하는 총 100 μL의 단일세포 현탁액을 96-웰 플레이트의 웰에 각각 첨가하고, 10% 혈청이 포함된 완전 배지로 배양하였다.

24, 48 및 72 시간 포인트마다 세포 배양 후 배양 플레이트를 수거하고 colorimetric WST-1 conversion assay (Daeil Lab Service, Seoul, Korea)를 이용하여 세포 증식을 확인하였다.

먼저, PBS로 세척 후 WST-1 시약 (10 μl)을 각 웰에 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다.

대사 활성 세포 내 탈수소효소와 WST-1간의 반응으로 생성된 포르마잔 염색의 흡광도를 제조사의 설명서에 따라, microplate reader (Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 측정하고, 백분율 세포 생존도를 계산하였다.

또한, 정해진 시간마다 위상차 현미경하에서 세포형태를 확인하였으며, 모든 실험은 최소 3번 수행되었다.

4. 콜로니 형성 분석 (Colony Forming Assay)

형질주입된 세포 및 대조군 A2780 세포 (200 cells/well)를 6-웰 플레이트에 분주하고 10일간 배양하였다. 실온에서 콜로니를 100% 메탄올로 20분간 고정시키고 PBS로 세척하였다. 이후 콜로니를 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액 (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo, USA)로 5분간 염색하였다.

PBS 세척 후 하룻밤동안 세포를 건조시킨 후 콜로니를 계수하여 집락 형성 단위 (colony forming units, CFUs)수를 확인하였다. 각 실험은 3회 반복되었다.

5. 상처치유 분석 (Wound healing assay)

형질주입 및 대조군 A2780 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고, 세포가 완전히 합류된 후 긁게(scratcher, SPL Life Sciences, Pocheon, Korea)를 이용하여 세포를 긁어내었다. 각 세포군에 3개의 상처를 만든 후 PBS로 세척하여 세포 파편을 제거하고 분리된 세포가 재부착되는 것을 방지하였다. 이후, 0, 24, 48, 72 및 96 시간의 상처 부위를 위상차 현미경으로 이미지화 하였다.

6. 침윤 분석 (Invasion Assay)

24-웰 transwell chamber (8.0 μm pore size, SPL Life Sciences)를 이용하여 세포 침윤 분석을 수행하였다.

먼저, 5×10⁴ 세포를 무혈청 배지에 현탁시켜 상층에 걸려있는 챔버에 분주하고 하층 챔버에는 10% FBS가 포함된 배양 배지를 포함시켰다.

24시간 후 상층 챔버의 막을 고정하고 0.5% 크리스탈 바이올렛 용액 (Sigma-Aldrich)으로 염색하였다. 상층 챔버에서 면봉으로 침윤되지 않은 세포를 제거하고 막의 하부 표면에 부착된 침윤 세포의 수를 위상차 현미경을 이용하여 임의의 5부위에서 계수하였다. 모든 실험은 최소 3번 수행되었다.

7. RNA 추출 및 역전사 중합효소 연쇄반응

전체 RNA를 TRIzol 시약 (Favorgen Biotech Corp, Pingtung, Taiwan)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 분리하였다. 분리 후 균질물을 얼음에 저장된 빈 RNase-free 팔콘튜브에 옮겼다.

균질물을 클로로포름 (400 μl)으로 추출하고, 이소프로판올 (400 μl)로 침강시킨 후 에탄올로 세척하고 증류수 30 μl로 재현탁시켰다.

RNA 정량 및 정성은 Nanodrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 260 및 280 nm 흡광도로 확인하여 1.9 이상의 흡광도 비율 (260/280)을 나타내는 시료를 사용하였다.

0.5 μg 올리고 (dT) 12-18 프라이머 (Promega, Madison, WI, USA), 50 mM Tris-HCl (pH 8.3), 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 40 mM dithiothreitol, 0.5 mM deoxynucleotide triphosphate mixture (Promega), 10 U RNase inhibitor (Promega) 및 200 U Moloney murine leukemia virus (MMLV) 역전사효소 (Promega)가 포함된 증류수 20 μl를 이용하여 전체 RNA 1 μg로부터 역전사시켜 단일 가닥 cDNA를 합성하였다. 37℃에서 60분간 배양한 후 70℃로 5분간 가열하여 반응을 중단시켰다.

유전자 특이적 프라이머를 이용한 PCR 증폭을 위한 주형으로 획득된 cDNA를 사용하였으며, 프라이머 염기서열은 표 1과 같다.

cDNA의 PCR 증폭은 2 μl cDNA solution, 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1% Triton X-100, 0.2mM deoxynucleotide triphosphate mixture (Promega), 0.5 pmol of each primer 및 5 U Taq DNA polymerase (Promega)이 포함된 최종 20 μl 부피의 시료를 이용하여 automated thermal cycler (Astec, Osaka, Japan)에서 수행되었다.

PCR 반응 후, 증폭된 산물을 2% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하고 StaySafe™ Nucleic Acid Gel Stain (Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan)으로 염색하여 자외선 하에서 촬영하여 분석하였다.

PCR 산물의 상대적 밴드 강도를 image analysis software (ImageJ, version 1.52a, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 측정하고, 결과는 동일한 cDNA 시료로부터 증폭된 세포유지 유전자 (housekeeping gene) 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH) mRNA에 대한 비율로 나타내었다.

8. 웨스턴 블롯 분석

단백질 발현 수준을 확인하기 위해, 형질주입된 세포 및 대조군 A2780 세포를 얼음 같이 차가운 인산완충용액 (phosphate buffer saline, PBS)로 2번 세척하고 세포를 수확한 후 단백질 분해효소 억제제 칵테일 (0.1 mM phenyl methane sulfonyl fluoride, 5 mg/ml aprotinin, 5 mg/ml pepstatin A, and 1 mg/ml chymostatin, Cell Signaling Technology, Denver, MA, USA)이 포함된 얼음 같이 차가운 RIPA 용해 버퍼 [150 mM sodium chloride, 1% triton X-100, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), and 50 mM Tris-HCl, pH7.5, GenDEPOT, Barker, TX, USA]와 함께 30분간 얼음위에서 인큐베이트하였다.

용해 버퍼에 인큐베이트하는 동안, 세포 용해물을 10분 간격으로 보텍스(vortex)한 후 4℃에서 30분 동안 원심분리하였다.

원심분리 후 전체 세포 추출물에서 상층액을 수집하였다.

BCA (bicinchoninic acid) 단백질 분석을 이용하여 단백질 농도를 확인하였다. 각 시료를 동량의 단백질 농도로 Laemmli 샘플 완충액 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)과 혼합하고 30 μg/lane으로 로딩한 후 12% (v/v) SDS-폴리아크릴아미드 겔 (PAGE)에서 전기영동시키고, semi-dry transfer(Bio-Rad)를 통하여 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)에 블로팅하였다.

막을 3% 소혈청 알부민 (BSA)이 포함된 TBS (Tris-buffered saline)와 0.1% Tween 20과 함께 실온에서 1시간 동안 블로킹하였다. 막을 세척하고 EGFL8 (Abcam, Cambridge, UK), Bax (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) 및 Bcl-2 (Santa Cruz Biotechnology) 1차 항체와 4℃에서 하룻밤동안 배양하였다.

이후 실온에서 항-래빗 및 항-마우스 2차 항체(Cell Signaling Technology)와 1시간 동안 배양하고 세척한 후 enhanced chemiluminescence (ECL) kit (Amersham Biosciences)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 단백질을 시각화하였다. 이미지를 Amersham Imager 680 (Amersham Biosciences)로 캡쳐하고 ImageJ software (version 1.52a, National Institute of Health)으로 정량하였다.

9. 유세포 분석 (Flow cytometry)

A2780 세포에서 siRNA-매개 EGFL8 침묵 효과를 확인하기 위해 FACS (Fluorescence-activated cell sorting)을 이용하였다. 단일 세포 현탄액에서 세포를 분산시키기 위해, 형질주입 및 대조군 A2780 세포를 수집하고 원심분리하였다.

PBS로 최소 2번 세포 세척 후 재현탁된 세포를 각각 FACS 튜브 (1 × 10⁵)에 첨가하고 0.1% BSA 및 0.1% sodium azide in Hanks' balanced salt solution (HBSS, Gibco/Thermo Fisher Scientific)이 포함된 세척 완충액으로 세척하였다.

세포사렴 유도 능력을 확인하기 위해, Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 20분간 실온의 암조건에서 세포를 염색시켰다.

줄기세포 군집 검출의 경우, 1% BSA 및 0.1% sodium azide가 포함된 HBSS를 염색 완충액으로 내광조건 하에서 200 rpm 회전 진탕기로 4℃에서 45분간 교반시키면서 ALDH1A1 (human aldehyde dehydrogenase 1 family member A1, Cell Signaling Technology)에 대한 피코에리트린 (PE) 결합된 래빗 단일클론항체 (mAb)를 사용하여 세포 표면 마커에 대한 세포 면역염색을 수행하였다.

이 후 세포를 세척 완충액으로 2회 세척하고, 재현탁시켰다. FACS Canto-Ⅱ flow cytometer (BD Bioscience)를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다.

모든 실험에서 사멸세포 및 잔해를 제거하기 위해 적절한 비염색 세포를 사용하여 각각 샘플에 대한 전방산란 및 측면산란을 조절하였다.

지정된 채널로부터 신호 출력을 조정하기 위해 자동형광 신호를 제거하고, 게이트된 세포 집단을 수집하도록 감도를 조정하였다.

FlowJo 10.3.0 (Tree Star, Ashland, OR, USA)를 이용하여 유세포 분석 결과를 얻었다.

10. 공초점 레이저 스캔 현미경

공초점 레이저 스캔 현미경 분석을 위해, 형질주입 및 대조군 A2780 세포를 12 웰의 바닥에 배치된 커버슬립에 부착시켰다.

세포를 0.1 M 인산 완충액에 포함된 차가운 4% 파라포름알데하이드로 20분간 고정시켰다. 고정액을 제거하고 차가운 PBS로 5분동안 3회 세척한 후 0.1% 트리톤 X-100이 포함된 PBS로 5분간 투과시켰다.

차가운 PBS로 세척 후, 1시간 동안 실온에서 2% BSA (Sigma-Aldrich)로 배양하였다. 초과 용액을 제거한 후 시료를 하룻밤동안 4℃에서 마우스 항-비멘틴 (vimentin) mAb (Santa Cruz Biotechnology)와 배양하고 차가운 PBS로 세척한 후 1시간 동안 실온에서 항-마우스 이차 항체(Invitrogen, Waltham, MA, USA)와 배양하였다. 세척 후 DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)이 포함된 Vectashield®를 이용하여 유리 슬라이드 위에 커버슬립을 올려놓고 공초점 레이저 스캔 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포 형광을 확인하였다.

11. 화학요법 민감성 확인(Chemotherapeutic sensitivity assay)

형질주입 및 대조군 A2780 세포를 96웰 플레이트에 2× 10⁴ cells/well의 밀도로 분주하였다. 24시간 배양 후 세포에 시스플라틴 (20 μM, Tocris Bioscience, Bristol, UK) 및 도세탁셀 (200 nM, Tocris Bioscience)을 무혈청 배지를 이용하여 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존도를 확인하기 위해, 상기 기재된 방법으로 WST-1 분석을 수행하였으며, 모든 실험은 3배수로 3회 반복하였다.

12. 재조합 EGFL8 단백질 제조

사람 재조합 EGFL8 단백질은 Abnova (H00080864-P01, Taipei, Taiwan)로 부터 구입하여 사용하였으며, 생쥐 재조합 EGFL8 단백질은 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

12-1. 화학 물질 및 재조합 미생물

클로닝을 위한 대부분의 효소 및 시약은 Life Technologies 사(Grand Island, NY, USA) 및 New England Biolabs 사(Ipswich, MA, USA)로부터 구입하였다.

대장균 BL-21 (DE3) 균주 및 pET28a 벡터(vector)는 Novagen/VWR International 사(Radnor, PA, USA)로부터, 그리고 RNA 정제 키트(RNA purification kit), Ni-NTA 컬럼(column) 및 플라스미드 DNA 분리 키트(Plasmid DNA isolation kit)는 Qiagen 사(Valencia, CA, USA)로부터 구입하였다. 그 외 D-티오갈락토피라노시드(D-thiogalactopyranoside, IPTG, Roche, Meylan, France), 브래드포드 단백질 분석 키트(Bradford protein assay kit, Bio-Rad, Hercules, CA, USA), PVDF 멤브레인(polyvinylidene fluoride membrane, Immobilon-P, Millipore, Billerica, MA, USA) 및 브릴리언트 블루 R-염색 용액(Brilliant Blue R-staining solution, Elpis Biotech, Daejeon, South Korea)을 구입하여 사용하였으며, 기타 나머지 화합물들은 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.

12-2. 생쥐 EGFL8 유전자 클로닝

생쥐 EGFL8 유전자(NM_152922.3)의 코딩 서열을 분리하기 위해, 총 cDNA(0.8 kb)를 분리 및 PCR 증폭하여 pcDNA3.1(Life Technologies)로 클로닝하였다. 이때 PCR 증폭은 표 2의 서열번호 1 및 2로 표시되는 EGFL8 전방향 및 역방향 프라이머를 사용하였으며, PCR 증폭을 통하여 개시(start) 및 종결(stop) 코돈(codon) 위치에 Nco1 및 Xho1 제한효소 인식서열이 생성되도록 하였다.

각각의 프라이머 10 ng와 0.1 mM dNTP 및 5U Pfu DNA 중합효소를 함유한 최종 반응액 50 μl를 94℃에서 30초간 변성시킨 후 94℃, 30초; 60℃, 30초; 및 72℃, 1분의 반응을 25 사이클(cycles)로 수행한 후, 72℃에서 2분간 최종 반응으로 중합반응을 완료시킨 후 증폭 산물을 겔로 분석 후 Nco1 및 Xho1 제한효소 절단을 수행하였다.

그 후 결과 산물을 아가로스겔 전기영동으로 분리한 후 QIAquick 겔 추출 키트(QIAquick gel extraction kit)로 정제하고 C-말단 His-Tag/트롬빈/T7-Tag 배열 및 선택적 C-말단 His-Tag 서열(C-terminal His-Tag/thrombin/T7-Tag configuration plus an optional C-terminal His-Tag sequence)을 갖는 pET28a 벡터에 삽입하였다. NovaBlue 숙주세포(5x10⁶ 세포)를 상기 삽입된 벡터로 형질전환시킨 후 70 μg/ml 카나마이신(kanamycin)이 포함된 LB (Luria broth) 아가로스 플레이트 상에서 배양시킨 후 선별하였다. 이후 양성 클론(positive clone)으로부터 플라스미드 DNA를 분리시켜 1.5% 아가로스겔로 분석하였으며, 두 양성 클론을 증폭시켜 클로닝된 플라스미드 DNA인 pET28a-EGFL8을 수득하였다.

유전자	서열번호	프라이머 서열
mouse EGFL8	1	5'-TTT CAA AGA GAG TTT GGG AGT G-3'
	2	5'-CAC CAC GTG TGT CTG TGG TA-3'

12-3. 생쥐 재조합 EGFL8 단백질의 발현 및 분리

BL21(DE3) 세포를 상기 클로닝된 플라스미드 DNA인 pET28a-EGFL8로 형질전환시킨 후 10 μg/ml 카나마이신이 포함된 LB 배지 50 ml에 접종하고 37℃ 온도조건으로 220 rpm 회전 테이블에서 하룻밤 동안 배양시켰다. 다음날 아침에 이를 신선한 LB 배지 1 리터에 접종시키고, 2시간 동안 배양한 후 0.2 mM IPTG를 첨가하고 4시간 동안 추가로 배양시켜 EGFL8 단백질의 발현을 촉진시킨 후 배양된 대장균 세포를 6000 rpm에서 8 내지 10 분 원심분리하여 수득하였다. 수득된 세포 펠렛은 정제 전까지 -80℃에 동결보존하였다.

단백질 정제를 위해서 상기 수득된 펠렛을 60 ml의 세포용해 버퍼(lysis buffer)(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA)에 재현탁시키고 0.5% 트리톤 X-100(Triton X-100), 0.1 mM PMSF (phenylmethane sulphonyl fluoride) 및 1 mM DTT (dithiothreitol)를 첨가한 후 펄스(Pulse) 50%, 진폭(Ampl) 30초로 총 5분간 초음파 분해를 수행하고 이후 12000 rpm에서 15분간 원심분리하였다.

그 후 상등액을 제거하고 펠렛을 용해 버퍼에 재현탁한 후 트리톤 X-100, PMSF 및 DTT 혼합액에 10 mM MgCl2, 0.01 mg/ml DNase 및 0.1 mg/ml 리소좀(lysozyme)을 첨가한 용액을 사용하는 것을 제외하고 이후 공정을 반복하였다.

펠렛 혼합물을 20분간 실온에서 반응시킨 후 상기 방법과 같이 초음파 분해 및 원심분리를 수행하였으며, 상등액을 제거한 후 남은 펠렛을 60 ml 용해 버퍼에 재현탁한 후 PMSF 및 DTT를 첨가하고 상기 방법과 같이 초음파분해, 원심분리 및 상등액 제거를 수행하고 남은 펠렛을 8 M 우레아 용액(100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM 글리신(Glycine)) 40 ml에 재현탁시켰다.

이를 실온에서 1시간 동안 천천히 교반시켜 단백질을 완전히 용해시킨 후 짧은 원심분리를 통해 불용성 단백질들을 제거하여 단백질을 수득하였다. 수득 농도는 Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)을 통해 분석하였으며, 재조합 단백질의 생물학적 활성을 회복시키기 위해, 1 내지 2 mg/ml 농도의 단백질을 2 리터의 투석 버퍼(dialysis buffers: 20 mM Tris-HCl-pH 8.0, 150 mM NaCl 및 0.1 mM DTT 함유)가 담긴 투석 백(dialysis bag)을 이용하여 4℃에서 12 내지 15 시간 동안 반복 투석하였다. 이때, 세 번째 투석 버퍼로는 DTT를 제외시킨 동일 버퍼를 사용하였다.

12-4. Ni-NTA 컬럼을 이용한 생쥐 재조합 EGFL8 단백질 정제

상기 생쥐 재조합 EGFL8 단백질은 정제를 위해 원래의 시그널 펩타이드 대신 Gly(2)-His(6) C-말단 표지를 가지므로 다음과 같이 정제하였다. Ni-NTA 컬럼을 증류수로 세척한 후 6×Ni-NTA 세척 버퍼[washing buffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8.0; 300 mM NaCl; 20 mM 이미다졸(imidazole)]를 로딩(loading)하였다. 상기 투석된 단백질 혼합물을 Ni-NTA 컬럼(column)에 넣어 천천히 통과시킨 후, 컬럼에 결합된 EGFL8 단백질을 6×Ni-NTA 용리 버퍼(elution buffer: 50 mM NaH2PO4, pH 8.0; 300 mM NaCl; 250 mM 이미다졸)로 용리시켜 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열의 단백질을 수득하였다. 용리된 단백질은 SDS-PAGE를 통해 농도를 확인하였다.

12-5. 생쥐 재조합 EGFL8 단백질 확인

상기 방법으로 제조된 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 10% SDS-PAGE에 로딩하여 쿠마시 블루 염색 및 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿을 통한 생쥐 재조합 EGFL8 단백질 확인

단백질 농도는 브래드포드 단백질 분석 키트(Bradford protein assay kit)를 이용하여 측정하였다. 이후, 단백질 시료들을 SDS-PAGE 상에 분리하고 브릴리언트 블루 R-염색 용액(Brilliant Blue R-staining solution)으로 염색한 후 단백질들을 PVDF 멤브레인에 상에 전기적으로 이동시켰다. 상기 멤브레인을 5% 탈지우유를 함유한 TBS-T(0.1% 트윈 20 함유 TBS)에 담가 블럭킹(blocking)을 수행한 후 다클론 EGFL8 1차 항체(polyclonal EGFL8 primary antibody, Sigma-Aldrich 사)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고 세척 후 2차 HRP-표지 항-생쥐 IgG 항체(1:10000)와 실온에서 1시간 반응시켰다. ECL 키트(Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 면역반응성을 확인 후 이미지를 현상하여 LAS-3000 imaging system(Fujifilm, Tokyo, Japan)을 통해 정량분석 하였다.

그 결과, 30.09 kDa의 단일 단백질 밴드를 확인하였으며, 이를 통하여 생쥐 재조합 EGFL8 단백질이 성공적으로 합성되어 정제되었음을 확인할 수 있었다.

단백질 중량 분광분석 생쥐 재조합 EGFL8 단백질 확인

상기 합성된 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 10% SDS-PAGE에 로딩(loading)한 후 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색을 수행하고 단백질 밴드를 잘라내어 0.5 ml의 증류수가 담긴 마이크로 튜브(microcentrifuge tubes)에 넣은 후 트립신(trypsin) 처리를 통해 겔(gel)을 용해시켰다.

상기 방법으로 준비된 시료로 MALDI-TOF-MS/MS 분석을 수행하였다.

그 결과, 정제된 EGFL8 단백질의 중량은 30.09 kDa으로서 이론적 수치와 동일한 것을 확인하였다.

<실시예 1> 난소암 세포 주에서 EGFL8 발현 확인

난소암 (Ovarian cancer, OC) 세포에서 EGFL8 발현 확인을 위해, 웨스턴 블롯을 수행하여 A2780, SKOV3, OVCAR3, CAOV3 및 R182 난소암 세포에서 EGFL8 단백질 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 1과 같이 5 종류의 난소암 세포주 모두에서 EGFL8의 발현이 명확하게 확인되었으며, 다른 세포주와 비교하여 A2780 및 SKOV3 세포에서 현저하게 높은 발현 수준이 확인됨에 따라, 후속연구를 위해 A2780 세포를 선택하였다.

<실시예 2> EGFL8 siRNA 형질주입을 통한 EGFL8 발현 억제 효과 확인

난소암 세포에서 EGFL8의 역할을 확인하기 위해, EGFL8 siRNA를 A2780 세포에 형질주입하여 EGFL8을 넉다운시켰다.

그 결과, 도 1B와 같이 대조군 세포 및 scrambled EGFL8 siRNA이 형질주입된 세포와 비교하여 EGFL8 siRNA 형질주입된 A2780 세포에서 EGFL8의 단백질 발현이 효과적으로 하향발현된 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> EGFL8 넉다운에 의한 세포 증식 및 콜로니 형성 증가 확인

A2780 세포에서 세포 성장에 대한 EGFL8의 영향을 확인하기 위해, EGFL8 형질주입된 세포에서 WST-1 및 콜로니 형성 분석을 수행하였다.

WST-1 분석결과, 도 1C와 같이 EGFL8 넉다운은 A2780 세포의 증식을 현저하게 향상시켰으며, 도 1D와 같이 EGFL8 siRNA는 A2780 세포 콜로니의 수를 매우 촉진시켰다.

상기 결과들로부터 EGFL8은 난소암 세포 증식 및 콜로니 형성의 발달에 필수적인 조절인자임이 제안될 수 있다.

<실시예 4> EGFL8 넉다운에 의한 난소암 세포 세포사멸 감소 확인

유세포 분석 결과, 도 2A와 같이 대조군과 비교하여 EGFL8 siRNA 형질주입된 A2780 세포에서 EGFL8 하향조절은 유의하게 세포사멸을 감소시킨 것을 확인할 수 있었다. 또한, 웨스턴 블롯 분석 결과, 도 2B와 같이 EGFL8 siRNA가 형질주입된 A2780 세포에서 유의하게 높은 Bcl-2와 낮은 Bax 단백질 발현 효과가 확인되었다.

상기 결과로부터 EGFL8은 난소암 세포 세포사멸을 유도하는 데 중요한 역할을 하는 것이 확인되었다.

<실시예 5> EGFL8 넉다운에 의한 난소암 세포의 전이 가능성 확인

난소암 세포의 세포 전이에 대한 EGFL8의 영향을 확인하기 위해, A2780 세포를 이용하여 상처 회복 및 transwell invasion assays를 수행하여 세포들의 이동 및 침습 능력을 확인하였다.

그 결과, 도 3A와 같이 상처 회복 분석 결과에서 EGFL8의 발현 억제는 A2780 세포의 이동 능력을 현저하게 촉진시키는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 세포 이동성 분석 결과 도 3B와 같이 EGFL8 siRNA 형질주입된 A2780 세포의 침습 세포 수가 비 형질주입된 대조군과 비교하여 유의하게 증가한 것으로 나타났다.

상기 결과들로부터 EGFL8은 난소암 세포의 세포 내 전이에 있어 중요한 역할을 하는 것이 확인되었다.

<실시예 6> EGFL8 넉다운이 상피-중간엽 이행(EMT) 및 MMP (matrix metallopeptidases)의 발현에 미치는 영향 확인

많은 연구에서 EMT는 종양 성장, 진행, 침습, 분산, 전이 및 약물 저항성에서 중추적인 역할을 하는 것으로 보고되었다 (Burk et al., 2008; Xiao et al., 2010; James et al., 2018).

MMP는 세포외 기질 (ECM) 재형성의 엄격한 조절과 관련된 단백질 분해 효소의 가장 중요한 패밀리 중 하나로, 형태형성, 신생혈관, 상처 회복, 조직 수선 및 전이와 같은 다양한 생리학적 또는 병리학적 진행과정과 연관되어 있으며 (Yamamoto et al., 2013; Fukushima et al., 2018; Fabian et al., 2019), MMPs, MMP-2 및 MMP-9은 ECM 및 기저막 분해를 통한 암 침습 및 전이와 가장 연관성이 있다 (McCawley et al., 2001; Liu et al., 2016).

난소암의 악성 작용 및 종양 진행에 있어서, EGFL8 중요한 역할을 하는 분자 메커니즘을 확인하기 위해, 공초점 현미경 및 RT-PCR 분석을 수행하여 EGFL8이 EMT 및 MMP의 발현을 억제할 수 있는지 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 4A 및 도 4B와 같이 EGFL8 넉다운은 A2780 세포에서 주요 EMT 전사 인자인 Snail, Slug 및 Twist의 발현뿐만 아니라 중요한 EMT 마커인 비멘틴(vimentin)의 발현을 유의하게 상향조절하였다.

또한, 도 4C와 같이 EGFL8은 대조군 세포와 비교하여 EGFL8 siRNA이 형질주입된 세포에서 주요 조직 재형성 프로테아제인 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 현저하게 증가시켰다.

상기 결과로부터 EGFL8는 A2780 세포의 EMT 및 전이를 지연시키는데 결정적으로 참여할 수 있을 것으로 제안될 수 있다.

<실시예 7> 줄기세포 마커 발현에 대한 EGFL8 넉다운의 영향 확인

암 줄기세포성에 있어서, EGFL8의 역할을 확인하기 위해, A2780 세포에서 암 줄기세포성 유전자의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 5A와 같이 주요 줄기세포성 유전자 (Sox2, Oct4, Nanog, 및 KLF4)의 발현이 대조군 세포와 비교하여 EGFL8 siRNA 형질 주입된 세포에서 강력하게 증가된 것이 확인되었다. 또한, 유세포 분석결과 도 5B와 같이 EGFL8 하향조절은 대조군 세포보다 EGFL8 siRNA 형질 주입된 세포에서 난소암 줄기 세포의 기능성 마커인 ALDH1A1의 발현을 강력하게 증가시켰다.

상기 결과로부터 EGFL8은 난소암 줄기 세포의 조절에 중요한 역할을 하는 것이 확인되었다.

<실시예 8> EGFL8 넉다운에 의한 항암제 내성 증가 효과 확인

A2780 세포에서 시스플라틴 및 도세탁셀 약물 저항성에 대한 EGFL8 넉다운의 영향을 확인하였다.

세포 이미징 및 WST-1 분석을 수행하여 세포독성 평가를 수행한 결과, 도 6A와 같이 A2780 세포에서 EGFL8의 넉다운은 시스플라틴 및 도세탁셀에 대한 내성을 유의하게 증가시켰다.

또한, 유전자 발현 분석 결과, 도 6B와 같이 대조군 세포와 비교하여 EGFL8이 억제된 세포에서 ABCB-1 (ATP binding cassette subfamily B member 1) 또는 P-gp (P-glycoprotein)으로 알려진 다제약물내성 1 (MDR1) 및 ABCC1 (ATP-binding cassette sub-family C member 1)으로 알려진 다제약물 내성 관련 단백질 1 (MRP1)의 발현을 대조군과 비교하여 유의하게 증가되었다.

상기 결과로부터 시스플라틴 및 도세탁셀에 대한 난소암 화학요법 내성 완화를 위해서는 EGFL8의 필수적인 역할을 하는 것이 확인되었다.

<실시예 9> 생쥐 재조합 EGFL8 단백질에 의한 암세포의 세포성장능 분석

세포성장능분석은 통상적인 방법[H.W. Lee 등, Regul. Pept. (2008), 147, 72-81]에 따라 다음과 같이 수행하였다. 상기 참조예 1에 개시된 다양한 암세포를 96-웰 미세플레이트에서 10% FBS 함유 세포배양액 0.1 ml와 함께 5×10⁴ 세포/웰 농도로 세포를 분주한 후 24시간 동안 배양시킨 후 FBS가 없는 조건에서 12-16 시간 동안 추가 배양하였다. 배양된 세포에 10 내지 500 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 처리한 후 생쥐 재조합 EGFL8 단백질의 암세포 성장 조절 효과를 WST-1 assay 법(EZ-Cytox Cell Viability Assay kit, Daeillab Service, Seoul, Korea)으로 측정하였다.

측정을 위해, WST-1 시약 10 μl를 각각의 웰에 첨가한 후 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 습식(humidified) 배양기내에서 30분-4시간 동안 배양하였다. 그 후 미세플레이트 리더(microplate reader, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하여 백분율 성장률을 확인하였다.

그 결과, 사람 위암세포 NCI-N87의 세포 성장률을 측정한 결과인 도 7을 참고하면, 24시간 동안 처리한 경우 100 ng/ml에서 89.7%, 300 ng/ml에서 80.4%(P < 0.05), 500 ng/ml에서는 68.6% (P < 0.01) 용량-의존적 저해 효과(dose-dependent inhibitory effect)를 나타내었으며, 48시간 처리의 경우 100 ng/ml에서 88.7% (P < 0.01), 300 ng/ml에서 73.9% (P < 0.05), 500 ng/ml에서는 59.81% (P < 0.01)로 역시 용량-의존적 저해 효과(dose-dependent inhibitory effect)를 나타내었다.

상기 결과로부터 EGFL8이 사람 위암세포인 NCI-N87 세포의 성장을 유의하게 저해시키는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 EGFL8이 사람 위암세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용할 수 있음을 확인하였다.

또한 도 8과 같이 사람 대장암세포인 HCT-15에 24시간 동안 100, 300 및 500 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 처리하여 세포 성장률을 측정한 결과를 참고하면, 100 ng/ml에서 72.9% (P < 0.001), 300 ng/ml에서 71.8% (P < 0.001) 그리고 500 ng/ml에서는 66.4% (P < 0.001)로 용량-의존적 저해 효과(dose-dependent inhibitory effect)를 나타내었다.

상기 결과로부터 사용된 모든 농도의 EGFL8이 사람 대장암세포(HCT-15)의 성장을 매우 강하게 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 EGFL8은 사용된 모든 농도(100, 300 및 500 ng/ml)에서 기존의 항암제로 잘 알려져 있는 Paclitaxel (5 μM, 83.5%) 보다 더 강한 세포성장 저해 효과를 확인하였으며 이를 통하여, EGFL8이 사람 대장암세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용한다는 사실을 확인하였다.

도 9와 같이 마우스 흑색종세포인 B16-F10 세포에 100, 300 및 500 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리한 후 B16-F10 세포의 세포성장률을 측정한 결과를 참고하면, 100 ng/ml에서 66.4% (P < 0.01), 300 ng/ml에서 59.0% (P < 0.05) 그리고 500 ng/ml에서는 60.4% (P < 0.01)로 용량-의존적 저해 효과(dose-dependent inhibitory effect)를 나타내었다.

상기 결과로부터 사용된 모든 농도의 EGFL8이 마우스 흑색종세포인 B16-F10의 성장을 매우 강하게 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 특히 EGFL8은 사용된 모든 농도(100, 300 및 500 ng/ml)에서 기존의 항암제로 잘 알려져 있는 Paclitaxel (5 μM, 83.5%) 보다 더 강한 세포성장 저해 효과를 확인하였으며 이를 통하여, EGFL8이 흑색종 세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용한다는 사실을 확인할 수 있었다.

도 10과 같이 사람 유방암 세포인 MCF-7 세포에서 100, 300 및 500 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리하여 사람 유방암 세포의 세포 성장률을 측정한 결과를 참고하면, 100 ng/ml에서 92.8%, 300 ng/ml에서 90.3% (P < 0.05) 그리고 500 ng/ml에서는 84.8% (P < 0.05)로 용량-의존적 저해 효과(dose-dependent inhibitory effect)를 나타내었다. 또한 150 ng/ml의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 3, 6 또는 12시간 동안 처리하여 세포 성장률을 측정한 결과, 3시간째에는 98.0%, 6시간째에는 85.4% (P < 0.01), 그리고 12시간째에는 85.5% (P < 0.05)로 시간-의존적 저해 효과(time-dependent inhibitory effect)를 나타내었다.

상기 결과로부터 EGFL8이 사람 유방암세포 MCF-7의 성장을 유의하게 저해시키는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 EGFL8이 사람 유방암세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용한다는 사실을 확인하였다.

도 11과 같이 사람 난소암 세포인 R182 세포에 10, 50, 150 및 500 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 2시간 동안 처리하여 R182 세포의 세포 성장률을 측정한 결과를 참고하면, 50 ng/ml에서 90.4% (P < 0.05), 150 ng/ml에서 67.7% (P < 0.01) 그리고 500 ng/ml에서는 61.1% (P < 0.01)로 용량-의존적 저해 효과(dose-dependent inhibitory effect)를 나타내었다.

특히, 50 ng/ml 이상의 농도에서 EGFL8이 사람 난소암세포의 성장을 유의하게 저해한다는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 결과로부터 EGFL8이 사람 난소암세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용한다는 사실을 확인하였다.

도 12와 같이 마우스 B세포 림프종 세포인 A20 세포에 100 및 150 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리하고 A20 세포의 세포 성장률을 측정한 결과를 참고하면, 24시간째에는 100 ng/ml에서 92.7% 그리고 150 ng/ml에서는 84.8% (P < 0.05)로 나타났다.

상기 결과로부터 EGFL8이 마우스 B세포림프종세포(A20)의 성장을 유의하게 저해한다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 EGFL8이 마우스 B세포림프종세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용한다는 사실을 확인하였다.

도 13과 같이 사람 간암세포인 HepG2 세포에 100 및 150 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리하고 HepG2 세포의 세포 성장률을 측정한 결과를 참고하면, 24시간째에는 100 ng/ml에서 84.9% (P < 0.05) 그리고 150 ng/ml에서는 80.3% (P < 0.01)로 용량-의존적 저해 효과(dose-dependent inhibitory effect)를 나타내었다.

상기 결과로부터 따라서 EGFL8이 사람 간암세포의 성장을 유의하게 저해한다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 EGFL8이 사람 간암세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용한다는 사실을 확인하였다.

도 14와 같이 사람 비소세포폐암 세포인 NCI-H1703 세포에 100, 300, 및 500 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 24시간 동안 처리하고 NCI-H1703 세포의 세포 성장률을 측정한 결과를 참고하면, 24시간째에는 100 ng/ml에서 89.2% (P < 0.01), 300 ng/ml에서 89.4% (P < 0.05) 그리고 500 ng/ml에서는 88.2% (P < 0.01)로 용량-의존적 저해 효과(dose-dependent inhibitory effect)를 나타내었다.

상기 결과로부터 EGFL8이 사람 비소세포폐암 세포의 성장을 유의하게 저해한다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 EGFL8이 사람 폐암세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용한다는 사실을 확인하였다.

도 15와 같이 전립선암 세포인 DU-145 세포에 100 ng/ml 농도의 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 6 및 24시간 동안 처리하고 NCI-H1703 세포의 세포 성장률을 측정한 결과를 참고하면, 대조군과 비교하여 6시간 처리군에서는 88.2%, 24시간 처리군에서는 81.8% (P < 0.05)로 감소되었다.

특히, EGFL8은 24시간 처리군에서 기존의 항암제로 잘 알려져 있는 Paclitaxel (1 μM, 97.8%) 보다 더 강한 세포성장 저해 효과를 나타내었다.

상기 결과로부터 EGFL8이 사람 전립선암세포(DU-145)의 성장을 유의하게 저해한다는 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여 EGFL8이 사람 전립선암세포의 성장에 효과적인 억제인자로 작용한다는 사실을 확인하였다.

<실시예 11> EGFL8에 의한 세포사멸 효과 확인

1. 핵 형태관찰을 통한 세포자멸사(apoptosis) 분석

EGFL8 단백질에 의한 암세포의 세포사멸 유도 효과를 측정하기 위해 DAPI 염색을 수행하여 핵분절화 정도를 확인하였다.

먼저, 사람 난소암세포인 R182 세포에 50 및 300 ng/ml 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 1시간 동안 처리하여 배양하였다. 상기 방법으로 배양된 세포를 인산염완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)으로 각 5분간 3회 세척한 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde, PFA) 용액으로 10분간 고정하였다. 고정 후 트리스완충생리식염수(tris-buffered saline, TBS)으로 각 5분간 3회 세척하고 0.3% 트리톤-x(triton-x) 100 용액으로 실온에서 10분간 배양한 다음 TBS로 각 5분간 3회 세척하였다. 그 후 5% 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA) 용액으로 1시간 동안 처리한 후 1: 1,000 배로 희석한 DAPI (Vector Lab, Inc. Burlingame, CA, USA) 용액으로 10분간 핵을 염색하고 10분간 1회 PBS로 세척하였다. 엔텔란(entellan, Merck, Darmstadt, Germany)을 이용하여 덮개유리(cover glass)를 씌워 봉입한 후 형광현미경(fluorescence microscope; Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.

그 결과 도 16과 같이 EGFL8 단백질의 농도 의존적으로 증가된 사람 난소암세포의 세포사멸을 확인되었다.

상기 결과로부터 EGFL8이 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 성장억제인자로 작용하는 것을 확인하였다.

2. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)

EGFL8 단백질에 의한 암세포 사멸 유도에 대한 기전을 확인하기 위해, 세포사멸 과정에서 매우 중요한 역할을 수행하는 카스파제-3(caspase-3)의 발현을 웨스턴 블롯 법을 수행하여 분석하였다.

먼저, 사람 난소암 세포인 R182세포에 50, 150, 또는 300 ng/ml 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 1시간 동안 처리하여 배양하였다. 그 후 단백질분해효소 저해제 혼합물(protease inhibitor mixture; Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA)이 포함된 단백질 추출 용액(Intron, Seoul, Korea)을 사용하여, 배양 세포로부터 총 단백질을 추출하였다.

추출된 단백질의 농도를 브래드포드 단백질 분석 키트(Bradford protein assay kit; Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정한 후, 동량의 단백질 시료들을 SDS(sodium dodecyl sulfate)-폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gels) 상에서 분리하여 PVDF 멤브레인(polyvinylidene fluoride membrane; Immobilon-P; Millipore, Billerica, MA, USA) 상으로 전기적블럿팅(electroblotting)을 수행하였다.

블럿팅된 멤브레인을 5% 탈지우유(skim milk) 및 0.1% 트윈(tween) 20이 포함된 트리스완충생리식염수(Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20, TBS-T; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7.4)로 블록킹(blocking)하였으며, 1차 항체인 항-분열된 카스파제-3(cleaved caspase-3) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)과 항-베타 액틴(Cambridge Science Park, UK) 항체를 3% BSA를 포함하는 TBS로 1:500 혹은 1:1,000 배로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다.

상기 1차 항체 반응 후 0.1% 트윈 20 함유 TBS-T로 각 분간 3회 세척하고, 2차 항체인 1:10,000 배로 희석한 HRP-표지(horseradish peroxidase-conjugated) 항-토끼 면역글로불린G (anti-rabbit IgG, Santa Cruz Biotechnology) 항체로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 멤브레인의 면역반응성(immunoreactivity)을 ECL 기질 키트(enhanced chemiluminescent substrate kit; Pierce, Rockford, IL, USA)를 통해 확인한 후 분석 이미지를 포착하여 LAS-3000 이미징 시스템(LAS-3000 imaging system; Fujifilm, Tokyo, Japan)을 통해 정량분석을 수행하였다.

그 결과, 도 17과 같이 EGFL8 단백질에 의해 사람 난소암세포(R182)에서 caspase-3의 발현 증가가 확인되었으며, 이를 통하여 EGFL8이 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 성장에 억제인자로 작용한다는 것을 확인하였다.

<실시예 12> EGFL8에 의한 세포이동 조절 효과 확인

상처 치유 분석법(wound healing assay)을 이용한 세포이동 측정(cell migration assay)을 수행하였다.

사람 난소암세포인 R182를 10% 태아소혈청(FBS)가 포함된 RPMI-1640 배지 2 ml이 담겨있는 6-웰 미세플레이트에 3×105 세포/웰 농도로 분주한 후 24시간 동안 배양시킨 후 FBS가 없는 조건에서 12-16 시간 동안 추가로 배양하였다.

세포가 합류(confluent)상태에 도달한 것을 확인한 후 마이크로피펫용 옐로우 팁(yellow tip)의 끝부분으로 배양용기 바닥의 중앙을 일직선으로 긁고 나서 PBS로 세척을 하였다. 배양된 세포에 생쥐 재조합 EGFL8 단백질 0, 50, 150, 300, 500 및 1,000 ng/ml을 24시간 동안 처리한 후 위상차현미경(phase-contrast microscope, Olympus)에 부착된 디지털카메라를 이용하여 상처치유가 일어나고 있는 부분을 촬영하였다.

그 결과 도 18과 같이, EGFL8 단백질 농도 증가에 따라 사람 난소암세포인 R182 세포의 이동이 저해되는 것을 확인하였으며, 이를 통하여 EGFL8이 암세포의 이동을 억제함으로써 암세포의 이동, 침습 및 전이에 대한 억제인자로 작용할 수 있음이 확인되었다.

또한 세포이동측정의 양성대조군(positive control)으로 이용하기 위해, 암세포의 이동을 촉진하는 물질로 알려진 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; Sigma, Saint Louis, MO, USA)를 100 ng/ml 농도로 R182 세포에 처리하고 이와 동시에 PMA를 처리한 세포에 생쥐 재조합 EGFL8 단백질 0, 300 및 500 ng/ml을 24시간 동안 처리한 후 위상차현미경(phase-contrast microscope, Olympus)에 부착된 디지털카메라를 이용하여 상처치유가 일어나고 있는 부분을 촬영하였다.

그 결과 도 19와 같이, EGFL8 단백질 농도의 증가에 따라 PMA(100 ng/ml)로 유도된 사람 난소암세포 R182의 이동이 저해가 나타났다.

상기 결과들로부터 EGFL8이 암세포의 이동을 억제함으로써 암세포의 이동, 침습 및 전이에 대한 억제인자로 작용한다는 사실이 확인되었다.

<실시예 13> T 세포 림프종 동물모델에서 EGFL8에 의한 암치료 효과 확인

1. T 세포 림프종 동물모델 및 조직절편 제작

6주령의 생쥐(C57BL/6, 중앙실험동물, 한국)에 2 x 10⁵ 개의 생쥐 T 세포 림프종(EL4, American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA) 세포를 옆구리에 피하 주사하여 17일 동안 암을 유발하여 T 세포 림프종 동물모델을 제작하였다. T세포림프종 동물모델을 대조군, EGFL8 투여군으로 나누고 EGFL8 투여군에는 생쥐 재조합 EGFL8 단백질(200 ng/mouse)을 5일 간격으로 2회 정맥주사 방법으로 투여하였다. 마지막으로 생쥐 재조합 EGFL8 단백질을 투여하고 5일 후에 각 실험군의 동물을 희생시켜 T세포림프종 종양 조직을 채취하고, 적당한 크기로 절제하여 OCT compound로 표면을 싸서 액체 질소를 이용하여 급속히 냉동시켰다.

냉동조직절편기(Cryostat, Leica CM3050S, Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)를 이용하여 6 μm 두께의 조직절편을 만들어 슬라이드 글라스(slide glass)에 부착한 후 -20℃의 아세톤(acetone)으로 20분 동안 고정시키고 공기 중에서 건조시켜 조직절편 슬라이드를 제작하였다.

2. 조직 화학염색(histochemical stain)을 이용한 생쥐 재조합 EGFL8 단백질에 의한 암세포 사멸 효과 측정

헤마톡실린(hematoxylin)-에오신(eosin) 표준 염색방법을 이용하여 대조군과 실험군의 T 세포 림프종 조직을 비교하였다. 조직절편 슬라이드를 헤마톡실린에 3분 동안 정치하고 10분 동안 수돗물에 담근 후, 에오신에 3분 동안 정치하여 탈수과정을 거친 후 봉입제 및 덮개유리를 이용하여 봉입하였다. 또한 사멸되는 세포에서 핵의 형태를 더 뚜렷하게 관찰하기 위해 헤마톡실린 염색을 실시하였다. 그 후 광학현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 표본을 관찰하였다.

그 결과, 도 20A 및 도 20B와 같이 대조군의 일부 지역은 암세포의 초기 세포자멸사(early apoptosis)에 의한 세포사멸이 진행되고 있었지만, 대부분의 지역에서 암세포는 파괴 등 특별한 세포의 형태변화를 나타내지 않았다.

반면, 생쥐 재조합 EGFL8 단백질이 투여된 실험군의 일부 지역에서 암세포의 초기 세포자멸사(early apoptosis)에 의한 세포사멸이 관찰되었지만, 대부분의 지역에서 후기 세포자멸사(late apoptosis) 및 괴사(necrosis)에 의한 암세포들의 파괴되어 가는 형태가 확인되었으며, 상기 결과로부터 EGFL8이 생체내에서 암세포의 세포 사멸을 유도함으로써 항암치료효과를 나타낼 수 있음이 확인되었다.

3. 면역조직화학염색(immunohistochemical stain)을 이용한 생쥐 재조합 EGFL-8 단백질에 의한 면역반응 측정

종양 조직 슬라이드를 PBS로 3회 세척한 후 0.3% H₂O₂ 용액에 20분간 담가두어 조직내의 비특이효소를 제거하였다. 이어서 2% BSA (bovine serum albumin)으로 1시간 동안 처리하여 비특이결합을 방지하였다. 1차 항체인 흰쥐 항-생쥐 제2형 주조직적합복합체 분자(rat anti-mouse MHC class II; Ia)를 1:1로 희석시켜 16시간 동안 4℃에서 반응시키고 PBS로 씻어낸 후 비오틴이 결합된 항-흰쥐 면역글로불린 (biotibiotinylated anti-rat IgG)로 실온에서 1시간 동안 반응을 시켰다. 그 후 각 5분간 3회 PBS로 세척한 후 ABC(avidin-biotin-peroxidase complex, Vector Lab.) 용액으로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 5분간 3회 PBS로 세척한 후 DAB (diaminobenzidine) 용액에 넣어 항원항체반응을 가시화시킨 후 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조염색(counter staining)하고 에탄올(ethanol) 및 자일렌(xylene)을 거쳐 덮개유리를 씌워 영구봉입제(permount)로 봉입하였다. 광학현미경 (Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 표본을 관찰하였다.

그 결과 도 21과 같이 대조군에서는 드물게 제2형 주조직적합복합체 분자를 발현하는 세포들이 관찰되었으나, EGFL8이 투여된 실험군에서는 대조군에 보다 많은 수의 제2형 주조직적합복합체 분자를 발현하는 항원제공세포들이 분포하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 EGFL8이 생체내에서 암세포에 대한 효과적인 종양면역을 유도함으로써 항암치료효과를 나타낼 수 있음이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer stem cell marker expression cancer diseases comprising epidermal growth factor-like domain 8 <130> ADP-2019-0632 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse EGFL8 primer <400> 1 tttcaaagag agtttgggag tg 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse EGFL8 primer <400> 2 caccacgtgt gtctgtggta 20 <210> 3 <211> 293 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFL8 <400> 3 Met Gly Leu Trp Ala Glu Leu Cys Ile Ser Leu Arg Gly Leu Ser Phe 1 5 10 15 Phe Leu Val Leu Met Thr Gly Glu Gly Thr Arg Gly Gly Ser Phe Lys 20 25 30 Glu Ser Leu Gly Val Cys Ser Lys Gln Thr Leu Leu Val Pro Leu Arg 35 40 45 Tyr Asn Glu Ser Tyr Ser Gln Pro Val Tyr Lys Pro Tyr Leu Thr Leu 50 55 60 Cys Ala Gly Arg Arg Ile Cys Ser Thr Tyr Arg Thr Thr Tyr Arg Val 65 70 75 80 Ala Trp Arg Glu Val Arg Arg Glu Val Pro Gln Thr His Val Val Cys 85 90 95 Cys Gln Gly Trp Lys Lys Pro His Pro Gly Ala Leu Thr Cys Asp Ala 100 105 110 Ile Cys Ser Lys Pro Cys Leu Asn Gly Gly Val Cys Thr Gly Pro Asp 115 120 125 Arg Cys Glu Cys Ala Pro Gly Trp Gly Gly Lys His Cys His Val Asp 130 135 140 Val Asp Glu Cys Arg Ala Ser Leu Thr Leu Cys Ser His Gly Cys Leu 145 150 155 160 Asn Thr Leu Gly Ser Phe Leu Cys Ser Cys Pro His Pro Leu Val Leu 165 170 175 Gly Leu Asp Gly Arg Thr Cys Ala Gly Gly Pro Pro Glu Ser Pro Thr 180 185 190 Ser Ala Ser Ile Leu Ser Val Ala Val Arg Glu Ala Asp Ser Glu Glu 195 200 205 Glu Arg Ala Leu Arg Trp Glu Val Ala Glu Leu Arg Gly Arg Leu Glu 210 215 220 Lys Leu Glu Gln Trp Ala Thr Gln Ala Gly Ala Trp Val Arg Ala Val 225 230 235 240 Leu Pro Met Pro Pro Glu Glu Leu Arg Pro Glu Gln Val Ala Glu Leu 245 250 255 Trp Gly Arg Gly Asp Arg Ile Glu Ser Leu Ser Asp Gln Val Leu Leu 260 265 270 Leu Glu Glu Arg Leu Gly Ala Cys Ala Cys Glu Asp Asn Ser Leu Gly 275 280 285 Pro Ser Leu Arg Gly 290

Claims (10)

1. 상피성장인자-유사도메인 8 (epidermal growth factor-like domain 8, EGFL8)을 유효성분으로 함유하며, OCT4, Sox2, Nanog 및 KLF4로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 암줄기세포 마커가 발현된 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 암줄기세포 마커는 암세포의 악성화를 유도하는 것을 특징으로 하는 암줄기세포 마커가 발현된 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8)을 유효성분으로 함유하며, OCT4, Sox2, Nanog 및 KLF4로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 암줄기세포 마커가 발현된 항암제 내성 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 항암제는 시스플라틴(Cisplatin) 및 도세탁셀(Docetaxel)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항암제 내성 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
8. 청구항 6에 있어서, 상기 EGFL8은 MDR1 및 MRP1의 발현을 억제시켜 암세포의 항암제 내성을 저해하는 것을 특징으로 하는 항암제 내성 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
9. 상피성장인자-유사도메인 8 (EGFL8)을 유효성분으로 함유하며, OCT4, Sox2, Nanog 및 KLF4로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 암줄기세포 마커가 발현된 난소암세포 전이억제용 약학조성물.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 EGFL8은 snail, slug, twist, vimentim, MMP-2 및 MMP-9의 발현을 저해시켜 암세포 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 암줄기세포 마커가 발현된 난소암세포 전이억제용 약학조성물.

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