KR20140016348A - 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 화합물의 스크린 분석법 - Google Patents

암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 화합물의 스크린 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히, 예를 들어, 세포군에서 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하기 위한 유용한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 세포군으로부터의 암 줄기 세포 (CSCs)와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여, CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 CSC의 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 고속 스크리닝으로 사용될 수 있다.

Description

암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 화합물의 스크린 분석법 {ASSAY FOR SCREENING COMPOUNDS THAT SELECTIVELY DECREASE THE NUMBER OF CANCER STEM CELLS}
본 발명은 특히, 예를 들어, 세포군에서 암 줄기 세포 (cancer stem cells)의 수를 선택적으로 감소시키는 제제 (agents)를 확인하기 위한 유용한 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2010년 3월 21일에 제작된, 1.12 KB의 파일 크기인, 서열 목록 텍스트 파일 "SeqListing0311192.txt"로서 여기에 동시에 제출된 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 참고문헌을 함유한다. 전술된 서열 목록은 이의 전체적인 내용을 참고문헌으로서 본 발명에 포함된다.
암은 조절되지 않는 세포 증식 (세포 proliferation), 비정상적 분화 (differentiation), 및 결함 있는 세포사멸 (apoptosis)을 특징으로 하는 질병의 그룹을 정의하는데 사용된 용어이다. 이들 신생물성 질병 (neoplastic disease)은 자연 (예를 들어, 바이러스 감염, 화학 발암물질 (carcinogen) 등)에서 다양한, 일반적인 초기 형질전환 (initial transforming) 사건을 모두 가질 수 있고, 소위 "성체 줄기 세포 (adult stem 세포)"인, 독특한 조직 세포에 영향을 미칠 수 있다. 이들 형질전환 사건은 종양 개시 및 암의 계층적 조직 (hierarchical organization)를 담당하는 "종양/암 줄기 세포 (CSC)"를 발생시키는 것으로 믿어진다. 그러나, 이러한 세포는 아직 명확하게 확인되지 않았거나 특화되지 않았다.
종양은 성장 능력, 모폴로지 및 마커 (marker) 발현이 다른 이종 세포군으로 이루어진다. 상기 암 줄기 세포 가설은, CSC에 부가하여, 종양이 이행 증폭 클론원성 (transit amplifying clonogens)의 작은 집단, 및 분화된 악성 (malignant) 세포의 큰 집단을 포함한다는 것을 사실로 가정한다 (Reya et al., 2008; Jordan et al., 2006; Dalerba et al., 2007; Vermeulen et al., 2008). 이들의 정상 줄기 세포의 대응부 (counterpart)와 같은, 암 줄기 세포는 분화된 클론원성의 자가-재생 및 생산을 결과하는, 미분화되고, 비대칭 세포 분열을 나타낼 수 있고, 따라서 종양 이질성 (tumor heterogeneity)에 기여한다. 부가적으로, CSC는 표준 화학요법 치료가 CSC 고갈 (depletion)은 아니지만, 종양 반응을 결과하는, 가장 빠르게 분열하는 세포의 박멸을 종종 결과하는 것을 통해, 이러한 치료에 내성이 있다고 주장해왔다 (Gupta et al., 2009; Sharma et al., 2010; Bao et al., 2006; Trumpp et al., 2008; Dean et al., 2005; Costello et al., 2000; Guzman et al., 2002). 이러한 모델은, 비록 대부분 암이 CSC를 생존시켜 재생하기 때문에 결국 재발될지라도, 표준 인간 암 화학치료법이 초기 종양 수축 (initial tumor shrinkage)을 종종 결과하는 이유를 설명한다. 따라서, 임상적인 관점으로부터, CSC의 동정 (identification) 및 분자 특성은 표적 치료를 포함하는, 암 진단, 예후 및 새로운 치료 접근법에 대한 근본적인 연관성을 갖는다.
고형 종양에 있어서, CSC는 세포 표면 면역 표현형 분석법 (immunophenotyping) 및 종양 개시 능력 (tumor initiating capacity)에 의해 확인될 수 있다는 것이 예전에 주장되어 왔다. 이들 추정 CSC 특정형질군 (subpopulation)은, 다른 것들 중에서, 유방암에서 CD44+/CD24-/ l0W 및 a6-인테그린 (integrin) 표현형 (Al-Hajj et al., 2003; Cariati et al., 2008; Fillmore et al., 2008; Ponti et al., 2005), 뇌종양에서 CD133+/Nestin+ 표현형 (Singh et al., 2004), 및 결장암에서 CD133+ 표현형 (Ricci-Vitiani et al., 2007; O'Brien et al., 2007)을 나타내는 것을 보여준다. 전립선암에 있어서, 높은 수준의 CD44를 발현하는 추정 CSC의 유사 특정형질군은 또한 기술되었다 (Collins et al., 2005; Patrawala et al., 2006; Li et al., 2008; Patrawala et al., 2007). 아마도 현장에서 직면하고 있는 가장 어려운 문제는 기술된 CSC 특정형질군이, 비대칭 세포 분열에 의해 분화된 자손 (progeny)을 발생할 수 있는 능력을 주로 "줄기세포성 (stemness)"으로 정의하는 고전적인 특성으로 항상 충족시키지 않는다는 것이다. 더구나, 전술된 표면 표현형 특정형질군의 존재는 동일한 조직병리학적 (histopathological) 진단을 갖는 환자로부터의 종양 조직 샘플에서 극적으로 다양한다. 몇몇 경우에 있어서, 이들 특정형질군은 상대적으로 드문 반면, 다른 경우에 있어서, 이들은 종양 덩어리의 큰 부분을 구성한다 (Quintana et al., 2008; Rosen et al., 2009; Chen et al., 2010; Shmelkov et al., 2008). 이러한 관측은 CSC의 일관된 동정의 복잡성을 강조한다.
줄기세포성과 같은 이들의 특징에 의해 CSC를 동정하는 것에 대한 일관성의 결핍은 지지할 수 없는 CSC를 표적으로 하는 제제에 대한 신뢰할만한 연구를 만들었다. 특히, 세포군에서 CSC의 퍼센트에 영향을 미치는 분화를 조절하거나 또는 다른 프로세스일 수 있는 제제의 동정은 실현 가능하지 않았다.
본 발명의 일 구현 예는 암 줄기 세포 (CSCs)의 수는 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하기 위한 방법이다. 상기 방법은:
a. 세포군으로부터의 CSC와 후보 제제 (candidate agent)를 접촉시키는 단계; 및
b. 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여 CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 CSC의 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 구현 예는 세포군에서 암 줄기 세포 (CSCs)의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법 (high throughput screening)이다. 본 스크리닝 방법은:
a. 세포군으로부터의 CSC와 후보 제제를 접촉시키는 단계;
b. 하기의 단계에 의해 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여, CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계:
i. 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를 비교하는 단계;
ii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 생존가능한 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
iii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 비-CSC 세포의 퍼센트를 결정하는 단계; 및
iv. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 분열 세포의 퍼센트를 결정하는 단계를 포함하고;
여기서 (1) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 생존력을 감소; (2) 세포 생존력의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소; (3) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 비-CSC 세포의 퍼센트를 증가; (4) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 분열을 감소; 또는 (5) 세포 분열의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제이다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 세포군에서 암 줄기 세포 (CSC)의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하기 위한 고속 스크리닝 방법이고, 여기서 상기 CSC는 표준 화학요법에 불응성 (refractory)이다. 이러한 스크리닝 방법은:
a. 세포군으로부터의 암 줄기 세포 (CSC)와 후보 제제를 접촉시키는 단계, 여기서 상기 CSC는 하기 특성을 가지며: HLA I- 및 HLA II-;
b. 하기의 단계에 의해 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여 CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계:
i. 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를, 유세포 분석을 이용하여, 비교하는 단계;
ii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 생존가능한 세포의 퍼센트를, 세포 생존력 분석을 이용하여, 결정하는 단계;
iii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 비-CSC 세포의 퍼센트를, 세포 분화 분석을 이용하여, 결정하는 단계; 및
iv. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 분열 세포의 퍼센트를, 세포 분열 분석을 이용하여, 결정하는 단계를 포함하고;
여기서 (1) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 생존력을 감소; (2) 세포 생존력의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소; (3) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 비-CSC 세포의 퍼센트를 증가; (4) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 분열을 감소; 또는 (5) 세포 분열의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제이다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 본 방법의 어떤 방법에 의해 확인된 CSC를 선택적으로 사멸시키기 위한 제제이다.
본 발명의 부가적인 구현 예는 약학 조성물이다. 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 및 본 발명의 제제를 포함한다.
본 특허 또는 출원 서류는 색상으로 나타낸 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색상 도면을 갖는 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요구시 및 필요한 비용과 함께 사무소에 의해 제공될 것이다.
도 1은 호르몬 비의존성 전립선암세포에서 도세탁셀 획득 내성 (Docetaxel acquired resistance)의 특징을 나타낸다. 도 1a는 모세포 (22RVI (좌측 패널 (left panel)) 및 DU145 (우측 패널 (right panel))) 도세탁셀의 복용량을 증가시켜 처리된 도세탁셀 획득 내성 세포 (22RVI-DR 및 DUI45-DR)에서 세포 생존력 분석 (MTs)의 결과를 나타낸다. 적색 선은 민감성 및 내성 세포에 대한 약물 (도세탁셀)의 IC50 농도를 나타낸다. 22RV1-DR 도세탁셀 IC50은 25nM로부터 10μΜ까지 증가되고 (400배 증가) 및 DU145-DR 도세탁셀 IC50은 5nM로부터 1μΜ까지 증가된다 (200배 증가). 도 1b의 좌측 패널은 모세포 (parental)에서 콜로니 (colony) 형성 분석의 정량적 분석법 (analysis) 및 24 시간동안 도세탁셀의 복용량을 증가시켜 처리된 도세탁셀 내성 세포를 나타낸다. 도 1b의 우측 패널은 도세탁셀 (22RV1 세포에 25nM 및 DU145 세포에 5nM)로 21일 동안 연속적으로 처리된 세포의 대표적인 콜로니 형성 분석을 나타낸다. 민감성 세포에 도세탁셀의 연속적 투여 후 관측된 콜로니는 없는 반면, 콜로니는 내성 세포에서 관측된다. 유사한 효과는 상기 약물에 24 시간 노출 후 관측된다. 도 1c는 아넥신 (annexin)-V에 의한 세포 사멸의 유세포 분석 평가의 결과 및 MSO (대조구) 및 도세탁셀에 노출된 세포의 프로피디움 요오다이드 (propidium iodide) 염색의 결과를 나타낸다. 도 1d는 나타낸 바와 같이 다양한 세포 타입의 PARP 절단의 웨스턴 블럿 분석법 (Western blot analysis)을 나타낸다. 도 1 (c) 및 (d)에 나타낸 결과는 획득된 도세탁셀 내성 표현형이 도세탁셀 세포사멸 반응의 결핍과 연관된 것을 입증한다.
도 2는 도세탁셀 내성 세포의 종양 개시 능력 및 표현형 특징을 나타낸다. 도 2a 좌측은 DU145 및 22RV1 세포에서 도세탁셀 내성을 획득하는 공정의 전사 발현 (transcript expression)에서 적어도 2 배 증가 (↑) 또는 감소 (↓)를 갖는 유전자의 벤 다이어그램 (Venn diagram)을 나타낸다. 오버랩핑 유전자 (Overlapping genes) = 247. 도 2a 우측은 상기 247 오버랩핑 유전자의 유전자 어휘 분류체계 (ontology) (GO)를 나타내는 히스토그램 (histogram)이다. 통계적 중요도 (statistical significance) (p≤ 0.01)를 갖는 카테고리는 제공된다. GO 카테고리는 약물에 대한 반응, 세포 증식, 및 세포 사멸에 대해 검은 별표 (*)로 표시된다. GO 카테고리는 발생 공정에 대해 적색 별표 (*)로 표시된다. 도 2b는 Cluster 및 Treeview를 사용하는 계층적 크러스팅 (hierarchical clustering)에 의해 조직된, 발생 유전자 (developmental genes)의 열 맵 (heat map)을 나타낸다. 적색 코딩 색상은 높은 수준의 발현을 나타내고, 녹색색 코딩은 낮은 수준의 발현을 나타낸다. 신호 값은 로그2 변환이다. 도 2c는 상피세포 분화 마커, 전립선 관련 마커, MHC계 I 항원, VVNT/β-카테닌 경로 단백질, NOTCH 신호 단백질 및 Hedgehog 신호 경로 단백질에 대해 매치된 모 세포 (parental) 및 도세탁셀 내성 세포의 세포 용해물 (lysate)의 단백질 정량 및 면역블럿 (immunoblotting)을 나타낸다. 도 2d는 다양한 전사 요인 (탈인산화된 β-카테닌 (dephosphorylated β-catenin), 절단된 NOTCH 2, GH1 및 Gli2)뿐만 아니라, CKs 및 HLA계 I 항원의 발현 및 아세포 위치 (subcellular localization)의 DU145 (2d) 및 22RV1 (2d con't) 모 세포 및 도세탁셀 내성 세포에서 면역형광법 분석을 나타낸다. 도세탁셀 내성 세포에서 발생 전사 요인의 핵 위치 (Nuclear localization)는 이들의 모 세포와 비교하여 나타낸다. CKs의 발현 결핍은 나타난다. 도 2e는 NOD/SCID 쥐 (mice)에 모 세포 및 도세탁셀 내성 세포의 주입 후 종양 개시 능력 및 종양 잠복성 (latencies)를 요약하는 표 및 종양 개시 능력을 나타내는 히스토그램을 제공한다. *은 p<0.001에 상응하고 **은 p <0.05에 상응한다. 도 2f는 CKs 및 HLA계 I 항원의 발현 및 아세포 위치의 DU145 및 22RV1 모세포 및 도세탁셀 내성 세포에서 면역형광법 분석을 나타낸다.
도 3은 모세포 도세탁셀 민감 세포에서 사이토케라틴 음성 특정형질군의 동정을 나타낸다. 도 3a 및 3b는 모세포 (22RVI 및 DUI45)에서 CK (18 및 19) 발현의 면역형광 분석법 및 유세포 분석을 나타낸다. (염색되지 않은) 대조구, CK18, CK19 및 CK18+19 염색 세포에 대한 컬럼 (1)에 나타낸 유세포 분석법의 그래프는 집단을 대표한다. 컬럼 (2)는 세 개의 독립적인 실험에서 C-세포의 정량을 나타낸다. 컬럼 (3)은 CK 18 (적색), CK19 (녹색) 및 CK18+19에 대한 면역형광법 염색을 나타낸다. 흰색 화살표는 두 개의 모세포주에서 CK 음성 세포를 나타낸다. 도 3c는 두 개의 초기 작업 가설: 도세탁셀에 의한 전이 (transition) 대 암 줄기 세포 농축 (enrichment)의 대표적인 개략도이다.
도 4는 CK19 구동 GFP 발현의 프로모터 (promoter)를 함유하는 혈장의 발생 및 검증 (validation)을 나타내고, 이러한 화학요법은 CK-음성/HLA-음성 표현형으로 암 줄기 세포를 농축한다. 도 4a는 발생된 CK19 프로모터-GFP 리포터 구조체 (reporter construct)의 개략적인 예시를 나타낸다. 인간 사이토케라틴 29 프로모터에 상응하는 1768 bp의 영역은 DU145 세포로부터 게놈 DNA를 사용하여 PCR에 의해 증폭된다. 프로모터 영역은 5' UTR 영역의 1142 bp, Exon 1에 속하는 480 bp 및 Intron 1에 속하는 146 bp를 포함한다. 상기 PCR 생산물은 pEGFPNl로 콜로니된다. 최종 구조체는 GFP 단백질 코딩 영역 상류의 CK19 프로모터를 가지며, 이것의 발현을 조절한다. 도 4b는 DU145 및 22RV1 모세포의 CKs (적색) 및 HLA계 I (녹색)에 대한 면역형광 공-염색법을 나타낸다. 머지 패널 (merge panel)에서 흰색 화살표는 CK-음성/HLA계 I-음성 표현형을 갖는 세포를 가리킨다. 대표적인 유세포 분석법은 두 개의 개별적 세포군을 나타낸다: CK-양성/HLA-양성 세포의 주요 군 및 CK-음성/HLA-음성 표현형을 갖는 더 작은 세포군. 도 4c는 혈장으로 안정하게 형질감염된 (transfected) 분류된 GFP+ 및 GFP- 세포의 PCR의 결과를 나타낸다. PCR은 GFP+ 및 GFP- DU145 분류된 세포에서 CK19 리포터 구조체의 안정한 융합 (integration)을 확인한다. GFP 서열의 절편은 리포터 혈장으로 안정하게 형질감염된 분류된 GFP+ 및 GFP- DU145 세포로부터 주형 (template)으로서 게놈 DNA를 사용하여 PCR 증폭된다. 음성 PCR 대조구로서, 형질감염되지 않은 모세포 DU145는 사용된다.
도 5는 화학요법이 CK19-음성, GFP 음성 표현형을 갖는 암 줄기 세포에 대해 농축시키는 것을 나타낸다. 도 5a는 작업 가설의 대표적인 개략도를 나타낸다. 도 5b는 나타낸 바와 같이 다양한 시간대에서 도세탁셀 (10 nM)로 처리된 안정하게 형질감염된 세포의 대표적인 일련의 사진을 나타낸다. 미분류된 DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포는 48시간 동안 도세탁셀 (10nM)로 처리되고, 이들의 거동을 연구하기 위해 타임-랩스 현미경 (time-lapse microscopy)에 의해 필름화된다. 대표적인 실험의 일련의 사진은 포함되며, 여기서 검은색 화살표는 GFP 발현 세포가 유사분열 정지 (mitotic arrest)후 죽어가기 시작하는 반면, 화학요법 하에서 세포 분열 및 생존을 진행하는 GFP-세포를 가리킨다. 도 5c는 도세탁셀 처리의 48 시간 후 생존하는 GFP- 및 GFP+ 세포의 퍼센트의 정량화 및 대표적인 유세포 분석법을 나타낸다. 페널 (c)로부터 세포는 10nM 도세탁셀 처리의 48 시간 후에 유세포 분석에 의해 GFP 발현에 대해 분석된다. 세 개의 독립적인 실험의 대표적인 그래프 및 정량화는 미처리된 세포 (대조구)와 비교하여, 세포 생존 치료 (treatment)의 GFP- 및 GFP+ 집단의 퍼센트에서 이동이 있다는 것을 나타낸다. 도 5d는 도세탁셀 (10 nM)로 연속적으로 처리된 분류된 GFP-/HLA- 및GFP+/HLA+ 세포의 정량화 및 대표적인 콜로니 형성 분석을 나타낸다. 약물의 부재 (대조구) 또는 약물로 연속 배양된 GFP/HLA 분류된 DU145-CK19프로모터-GFP 안정 세포 (GFP+/HLA+ 및 GFP-/HLA-)의 세 개의 독립적인 실험은 수행된다.
도 6은 암 줄기 세포 특성: 비대칭 세포 분열, 종양 개시 및 분화의 특징을 나타낸다. 도 6a는 비대칭 분열이 진행되는 GFP- (CK-음성/HLA계 I-음성) 세포를 묘사한 안정하게 형질감염된 세포의 대표적인 일련의 사진을 나타낸다. 미분류 및 미처리된 DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포는 24 시간 동안 타임-랩스 현미경에 의해 필름화된다. 대표적인 실험의 일련의 사진은 비대칭적으로 분열하고, GFP+ 딸 세포를 생성하는 GFP- (CK-음성) 세포를 나타낸다. 도 6b는 다른 시간대에서 GFP-음성 및 GFP-양성 분류된 세포로부터 유도된 세포의 GFP 집단의 정량화 및 대표적인 유세포 분석법을 나타낸다. DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포는 GFP 선별되고, GFP+ 및 GFP- 세포는 개별적으로 도말되고 (plated), 다른 시간 동안 성장된다. 배양된 세포의 세 개의 독립적인 실험의 정량화 및 대표적인 유세포 분석법 그래프는 다른 시간대 (1일, 2주, 4주)에서 GFP- 및 GFP+ 분류된 세포로부터 유도된다. 도 6c는 GFP-음성/CK-음성/HLA계 I-음성 세포로부터 발생된 종양 이종이식 (xenograft)에서 분화 마커 (GFP, CKs 및 HLA계 I)의 면역형광 분석법뿐만 아니라, 실험적 설계 및 결과를 대표하는 개략도를 나타낸다. 실험적 설계의 개략적인 대표도는 NOD/SCID 쥐에 GFP/HLA 분류된 DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포의 주사 및 최종 종양을 나타낸다. 각 분류된 세포군 (예를 들어, GFP-음성/HLA계 I-음성) 및 세포 희석 (10,100 및 1000 세포)에 대해 8 마리 쥐를 포함한 세 개의 독립적 실험은 수행된다. GFP-음성/CK-음성/HLA계 I-음성 세포로부터 발생된 이종이식 종양에서 분화 마커 (GFP, CKs 및 HLA계 I)의 대표적인 면역 형광 분석법은 나타낸다. 도 6d는 NOD/SCID 쥐에서 GFP+/HLA+ 및 GFP-/HLA-분류된 세포의 주입 후 종양 개시 능력의 정량화 및 종양 잠복성 (tumor latency)을 나타낸다. *은 p<0.001에 상응하고, **는 p <0.05에 상응한다. 바 (Bar)는 100 ㎛에 상응한다.
도 7은 인간 1차 (human primary) 및 전이성 전립성 암 조직 (metastatic prostate cancer tissues)에서 암 줄기 세포의 동정을 나타낸다. 도 7a는 두 명의 환자 (매치된 1차 및 전이성 암을 갖는 환자 1)로부터의 대표적인 조직 샘플에서 CK18 및 CK19 면역조직화학 발현을 나타낸다. 히스토그램은 개별적 환자로부터 1차 (n=6) 및 전이성 (n=20) 조직 샘플에서 CK-음성 및 양성 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 7b-7d는 CKs (CK18+19) 및 HLA계 I 항원 (도 7b)의 대표적인 면역형광계 공-발현 분석법, 전사 요인 (절단된 Notch-2, 활성 β-카테닌, Gli1 및 Gli2) (도 7c) 및 안드로겐 수용체 (androgen receptor) (AR) (도 7d)뿐만 아니라, 분석된 조직 샘플에서 CK-음성 및 양성 세포의 정량화를 나타낸다. 전사 요인의 핵 염색은 동정된 CK-음성/HLA-음성 종양 세포에 나타낸다. 바는 100 ㎛에 상응한다.
도 8은 HLA계 I 분류된 세포의 콜론능력 용량 (clonability capacity)을 나타낸다. 세 개의 독립적 실험의 정량화 및 DU145 HLA계 I 분류된 세포의 대표적인 희석세포 (10, 100 및 1000 세포) 콜로니 형성 분석은 실행된다. HLA계 I-음성 분류된 세포는 HLA-계 I-양성 분류된 세포와 비교한 경우 통계상으로 상당히 더 높은 콜로니 형성을 나타낸다. *는 p<0.05에 상응한다.
도 9는 다른 신선한 인간 암 타입으로부터 HLA계 I-음성 상피 암 세포가 NOD/SCI D 쥐에서 종양 개시 능력을 갖는 것을 나타낸다. 도 9a는 HLA계 I-음성 및 양성 종양 세포의 대표적인 분류 다이아그램을 나타낸다. 도 9b는 인간 전립선암 HLA 분류된 세포의 희석 분석 후에 종양 개시 능력 및 종양 잠복성을 나타낸다. 그래프 및 상응하는 표는 NOD/SCID 쥐에서 신선한 인간 샘플 (1차 주입) 및 유도된 이종이식 (2차 주입)으로부터 직접적으로, 인간 전립선암 HLA 분류된 세포 (HLA- 및 HLA+) 및 미분류된 세포의 다른 희석 (10, 100 및 1000 주입된 세포)의 종양 잠복성 및 종양 개시 능력을 요약한다. 각 분류된 세포군 및 세포 희석에 대한 4마리 쥐는 상부 옆구리 (HLA-음성) 및 하부 옆구리 (HLA-양성)에서 두 번 주입된다. 도 9c는 102 HLA계 I-음성 (상) 및 HLA계 I-양성 (하) 세포로 주입된 NOD/SCID 쥐에 대표적인 종양 이종이식 형성을 나타낸다. 주입으로부터 증가하는 종양은 인간 1차 종양 및 1차 및 2차 주입으로부터 증가하는 이종이식 종양에서 수행된 조직학적 (histological) (H&E) 및 면역형광법 (CKs, 안드로겐 수용체 (AR), 및 전립선 특이 막 항원 (PSMA)) 연구에 의해 전립선암인 것으로 확인된다. 도 9d는 다른 인간 암 (대장, 폐, 유방, 및 방광암) HLA 분류된 세포의 희석 분석 후 종양 잠복성 및 종양 개시 능력을 나타내는 히스토그램이다. 다른 인간 암 타입으로부터 100 HLA 분류된 세포의 1차 및 2차 주입은 행해진다. 각각 분류된 세포군 및 세포 희석에 대한 4마리 쥐는 상부 옆구리 (HLA-음성) 및 하부 옆구리 (HLA-양성)에서 두 번 주입된다. 도 9e는 인간 1차 및 매치된 유도 이종이식의 조직학적 (H&E) 특징을 나타낸다. *는 p<0.001에 상응하고, **는 p ＜O.05에 상응하고 및 ***는 p>0.05에 상응한다. 바는 100 ㎛에 상응한다.
도 10은 확인된 암 줄기 세포에서 NOTCH 및 Hedgehog 경로 억제의 생체 내 및 생체 외에서의 효과를 나타낸다. 도 10a는 사이클로파민 (Cyclopamine) (C), 화합물-E (CE) 단독 또는 조합 (C+CE)에 대해 72 시간 동안 노출된 경우 모세포 (DU145 및 22RV1) HLA-음성 및 양성 분류된 종양 세포에서 관측된 서브-G1 효과의 정량화 및 대표적인 세포주기 분석법을 나타낸다. 도 10b는 도 10a에서와 같이 동일한 약물의 조합 및 덱사메타손 (Dexamethasone) (D)에 대해 연속적으로 노출된 경우, 모세포 (DU145 및 22RV1) 분류된 HLA-음성 및 양성 종양 세포의 정량화 및 대표적인 콜로니 형성 분석을 나타낸다. 도 10c는 비히클 용액 (대조구), 덱사메타손 (D), 사이클로파민 및 덱사케타손 (D+C), DBZ 및 덱사메타손 (D+DBZ) 또는 삼중 조합 (D+C+DBZ)에 노출된 NOD/SCID 쥐에 103 22RV1 및 DU145 HLA-음성 분류된 세포의 주입 후 잠복성 및 종양 개시 능력을 나타낸다. 각각 HLA 분류된 세포주 및 치료 (예를 들어, 사이클로파민)에 대한 8 마리 쥐를 포함하는 세 개의 독립적 실험은 수행된다. 도 10d는 도 10c에서와 같이 동일한 약물 및 농도에 노출된 NOD/SCID 쥐에 인간 전립선암 이종이식 #5, #9 및 #12로부터 103 HLA-음성 분류된 세포의 주입 후 잠복성 및 종양 개시 능력을 나타낸다. 상기 실험은 각각 전립선암 케이스 및 치료에 대한 8 마리 쥐가 포함된다. *은 p <0.05에 상응한다.
도 11은 음성 AR 표현형을 나타내는 사이토케라틴을 결핍한 종양 세포를 나타낸다.
도 12는 전립선암 세포에서 획득된 도세탁셀 내성의 가역성 (reversibility)을 나타낸다. 도 12a는 다양한 시간 (4, 8,및 12 주)동안 도세탁셀 내성 세포 (22RV1-DR 및 DU-145-DR) 및 약물 없이 배양된 도세탁셀 내성 세포에 세포 생존력 분석 (MTs)으로부터 퍼센트 세포 생존력의 정량화를 나타낸다. 적색 선은 획득된 내성 및 가역된 (reversed) 내성 세포에 대한 약물 (도세탁셀)의 IC50 농도를 나타낸다. 약물 없이 배양된 획득된 도세탁셀 내성 세포는 시간 종속 방식에서, 도세탁셀에 점진적으로 더욱 민감하게 된다. 약물 금단 (drug withdrawal)의 12주 후 22RV1-DR 도세탁셀 IC50은 10μΜ로부터 50nM로 감소되고, DU145-DR 도세탁셀 IC50은 1 μΜ로부터 25nM로 감소된다. 도 12b의 우측 패널은 24 시간동안 도세탁셀의 복용량을 증가시켜 처리된 약물 없이 배양된 도세탁셀 내성 세포 및 도세탁셀 내성 세포의 콜로니 형성 분석의 정량정 분석법을 나타낸다. 도 12b의 좌측 패널은 도세탁셀로 연속적으로 처리된 세포의 대표적인 콜로니 형성 분석을 나타낸다. 상기 결과는 도세탁셀로 처리된 경우, 가역된 내성 세포가 더 적은 콜로니를 형성하기 때문에 획득된 도세탁셀 내성의 가역성을 확인한다.
도 13은 DU145 및 22RV1 세포에서 분화된 세포 표현형에서 회복에 대해 연관된 도세탁셀 내성 가역성을 나타낸다. 도 13의 좌측 패널은 웨스턴 블럿 분석법을 나타내고, 도 13의 우측 패널은 모세포 민감 세포, 도세탁셀 획득 내성 세포 및 도세탁셀 가역 내성 세포에 상피 분화 마커의 발현 (CK18 및 CK19) 및 HLA계 I 항원의 히스토그램 단백질 정량화를 나타낸다. 가역된 내성 세포는 모세포 민감성 세포에서 관측된 것과 유사한 수준을 달성하는, 도세탁셀 획득 내성 세포보다 더 높은 단백질 발현 수준을 나타낸다.
도 14는 CK19 구동 GFP 발현의 프로모터를 함유하는 혈장의 발생 및 검증을 나타낸다. 도 14a는 pCK19-GFP 혈장으로 안정하게 형질감염된 DU145 모세포의 CK19 (적색) 및 GFP (녹색)에 대한 면역형광 염색을 나타낸다. 상기 머지 패널에서 흰색 화살표는 CK19 및 GFP의 발현 결핍 세포를 가리킨다. 유세포 분석 정량화는 내재성 (endogenous) CK 및 GFP의 공-발현이 있고, 따라서 이러한 안정 세포주에서 CK 발현의 판독으로서 GFP 발현의 사용을 검증하는 것을 확인한다. 도 14b는 pCK19-GFP 혈장으로 안정하게 형질감염된 DU145 모세포의 HLA계 I (적색) 및 GFP (녹색)에 대한 면역형광 염색을 나타낸다. 상기 머지 패널에 흰색 화살표는 HLA계 I 및 GFP의 발현 결핍 세포를 가리킨다. 유세포 분석 정량화는 GFP 및 HLA-계 I 항원의 공-발현을 확인한다. GFP 발현 세포는 HLA계 I-양성인 반면에, GFP를 발현하지 않는 세포는 역시 HLA계 I-음성이다.
도 15는 HLA계 I 분류된 세포의 종양 개시 능력을 나타낸다. 모세포 DU145 및 22RV1 세포는 HLA 마커 발현에 의해 분류된다. HLA-음성 및 HLA-양성 집단의 두 개의 다른 세포 희석 (10 및 100 세포)은 NOD/SCI D 쥐에 주입된다. 각각 분류된 세포주 및 세포 희석에 대해 8 마리의 쥐를 포함하는 세 개의 독립 실험은 수행된다. 상부 패널의 그래프 및 하부 패널의 상응하는 표는 이들 세 개의 독립적 실험의, 각각 종양 개시 능력 및 종양 잠복성을 요약한다. 모든 세포주에 있어서, 10 HLA-음성 분류된 세포의 주입만이 발암성 (tumourigenic) 능력을 나타내는 반면, 10 HLA-양성 세포는 종양을 형성하지 못한다. *는 p <O.0001에 상응한다.
도 16은 GFP-음성/HLA-음성 분류된 세포의 주입으로부터 발생된 종양 이종이식에서 GFP/HLA 특정형질군의 정량화를 나타낸다. 종양 이종이식에 세포의 GFP/HLA 특정형질군의 정량화 및 대표적인 유세포 분석법은 두 개의 개별적 세포군이 관측되는 것을 나타낸다: GFP-양성/HLA-양성 세포의 주요 집단 및 GFP-음성/HLA-음성 표현형을 갖는 더 작은 세포군.
표준 화학요법에 불응성을 갖는 CSC는 발견되었다. 비록 화학요법이 세포 분열을 포함하는, 특정한 종양 세포 특정형질군을 사멸할지라도, 이것은 확인된 CSC 집단을 고갈시키지는 못한다. 이것은 표준 화학요법이 초기 종양 수축을 종종 결과하지만, 대부분 암이 CSC를 생존시켜 재생하기 때문에 결국 재발하는 이유에 대한 설명을 제공한다. 본 발명에 정의된 바와 같이 CSC의 수를 감소시키거나 또는 근절시키는 제제를 확인하는 것이 암 치료분야를 진보시킬 것이다.
본 발명에 따른 방법은 여기서 확인된 CSC의 표현형 (phenotypical) 특성 및 기능적 항암제 저항성을 갖는 암 줄기 세포 ("CSCs")의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하기 위해 개발되었다. 본 발명의 체외 스크린은 상기 CSC의 생존 또는 성장을 감소시키거나 또는 CSC의 분화를 증가시킬 수 있는지를 확인하기 위한 후보 제제를 시험하기 위한 분석을 제공한다. 상기 분석의 실행은 후보 제제의 광범위한 다양성을 시험하는 것을 허용하고, 추정 CSC 억제 효과를 갖는 제제를 확인하는 것을 촉진시킨다.
따라서, 본 발명의 일 구현 예는 암 줄기 세포 (CSCs)의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하기 위한 방법이다.
상기 방법은:
a. 후보 제제로 세포군으로부터의 CSC를 접촉시키는 단계; 및 b. 상기 후보 제제와 접촉하지 않은 CSC와 비교하여 상기 후보 제제가 CSC의 생존 또는 성장을 감소시키거나 또는 CSC의 분화를 증가시키는지 아닌지를 결정하는 단계를 포함한다.
암 줄기 세포 ("CSC")는 HLA-인 암세포이다. 이러한 세포는 CD24-, CD133-, Notch+, Gli1+, Gli2+, 아교섬유산성단백질- (glial fibrillary acidic protein-) (GFAP-), Neurofil-, 및 사이토케라틴- (cytokeratin-) 중 적어도 하나인 것으로 더욱 한정된다. 더구나, 전술한 것 중 어떤 것 또는 모두의 조합은 또한 고려된다. 이러한 CSC는 Notch 및 Hedgehog 억제제에 민감하고, 광범위한 항암제 저항성을 가지며, 하기의 부가적인 특성 중 적어도 하나를 갖는 것에 의해 더욱 한정된다: 자가-재생 능력 (capability to self-renew), 비대칭 세포 분열 수행, 종양형성 (tumorigenic) 능력, 전이 (metastatic) 잠재성, 다-분화 특성. 더구나, 전술된 것 중 어떤 또는 모두의 조합은 또한 고려된다. CSC의 또 다른 특성은 예를 들어, 표 1에 기재되었다. HLA-과 함께 표 1에 확인된 특성 중 어떤 조합은 CSC 세포를 확인하는데 충분할 수 있다.
표 1은 상기 암 줄기 세포 표현형을 더욱 한정하는 다수의 바이오마커를 요약하였다. 이러한 표현형은 특정 호모박스 조절 인자 (homeobox regulatory factor) (예를 들어, Sox2, Sox4), 줄기 세포 마커 (예를 들어, Seal, Gata2, Gata3, Nestin), 전사 인자 (transcription factors) (예를 들어, Notch-2, Glil, Gli2, 핵 베타-카테닌 (nuclear beta-catenin)), 비대칭 세포 분열 (예를 들어, RMND5A) 및 다중약물 내성 (multidrug resistance)과 관련된 막 수송체 (membrane transporter) (예를 들어, MDRI/P-당단백질, MRPI, MRP2, MRP3, ABC3)와 같은, "배아 줄기 세포" 및 "조직/성체 줄기 세포"의 발달 경로 및 바이오마커의 발현을 포함할 수 있다. 주요 관련성에 있어서, 이들 CSC는 모든 HLA계 I 및 HLA계 II 분자를 포함하는, 조직적합성 (histocompatibility) 단백질의 발현의 결함을 일반적으로 갖고, 이것은 숙주 면역-감시 (immune-surveillance)의 회피에 기여하고, 따라서 전이성 확산에 중요하다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "HLA I-"는 주요 조직적합성 복합체 (histocompatibility complex (MHC))계 I 분자가 없는 것을 의미한다. 상기 MHC는 림프구 인식 (lymphocyte recognition) 및 항원 제시 (antigen presentation)를 담당하는 세포 표면상에 나타난 분자의 세트이다. 상기 MHC 계 I 분자는 세포독성 T-세포에 대한 항원으로 존재한다. MHC I 분자는 거의 모든 타입의 몸 세포 (body cells)에서 발견된다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "HLA II-"는 주요 조직적합성 복합체 (MHC)계II 분자가 없는 것을 의미한다. 상기 MHC계 II 분자는 헬퍼 (helper) T-세포에 대한 항원으로 존재한다. MHC II 분자는 또한 마이크로파지 (macrophages), 수지상 세포 (dendritic 세포) 및 B 세포에 오직 발견된다. "HLA-"는 바람직하게는 "HLA I-" 및 "HLA II-"를 의미한다.
암 세포의 집단으로부터 HLA- 세포를 확인하는 것은 상기 세포의 생존력 (viability)을 유지하고, 특정한 세포 표면 마커의, 예를 들어, 발현, 또는 비-발현에 기초한 세포를 동정하는 어떤 종래의 또는 알려진 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직하게는, 상기 동정은 실시 예에서 더욱 상세하게 개시된 바와 같이 형광-활성화된 (Fluorescence-activated) 세포 분류 (FACS) 분석에 의해 수행된다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "자가-재생의 능력"은 CSC가 미분화된 상태를 유지하는 동안 세포 분열의 다수의 사이클을 거치는 능력을 갖는 것을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "비대칭 세포 분열"은, 예를 들어, 하나의 세포가 CSC 표현형을 유지하는 동안, 다른 것들이, 예를 들어, 분화로 프로그램되는 것과 같은, 다른 특성을 갖는 두 개의 세포를 유도하는 세포 분열을 가질 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, "종양 형성 능력 (tumorigenic capacity)"은 예를 들어, 숙주 동물로 이식된 경우 종양을 발생하는 능력을 갖는, CSC와 같은 세포를 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, "전이 능력 (metastatic potential)"은, 예를 들어, 몸에서 제2 위치로 이동하는, 즉, 암전이능 (metastasize) 및 종양을 발생시키는, CSC와 같은, 세포의 능력을 의미한다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "다분화 특성"은 하나 이상의 세포 타입으로 분화하는 세포의 능력을 의미한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, "Notch 및 헷지호그 (hedgehog) 억제제에 대한 민감도"는 Notch 및 헷지호그 경로의 억제제에 의해 모듈화된, CSC와 같은, 세포를 의미한다. 이러한 억제제는 기술분야에서 알려져 있다. 예를 들어, K. Garber, JNCI, 99(17): 1284-1285 (2007) (Notch inhibitors) 및 Martinson et al., 미국특허 제7,695,965호 (hedgehog 억제제)를 참조.
본 발명에 사용된 바와 같은, "광범위한 항암제 저항성"은 암을 치료하기 위해 사용된 제제와 같은, 화학적 제제의 범위에 내성이 있는 CSC과 같은, 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용된 바와 같은, 암을 치료하기 위해 사용된 제제는 넓게 이해될 것이고, 어떤 알려진 화학요법 화합물, 조성물, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제제는 DNA 손상 약물 및/또는 유사분열 방지제 (anti-mitotic agent)일 수 있다. 또한 상기 제제의 제한 없는 예는 마이크로튜블린 (microtubulin) 억제제, 토포아이소머라제 (topoisomerase) 억제제, 빈브라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴 (vincristine), 비노렐빈 (vinorelbine), 파클릭탁실 (paclitaxel), 마이코잔트론 (mitoxantrone), 시스프라틴 (cisplatin), 도세탁셀, 콜키시네스 (colchicines) 유사체 (analogs), 하링토닌 (harringtonine), 호모하링토닌 (homoharringtonine), 캡토태신 (camptothecine), 캡토테신 (camptothecine) 유사체, 포도필오톡신 (podophyllotoxin), 및 이의 조합을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "세포군"은 다른 세포의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 상기 CSC는 예를 들어, 암 세포의 집단과 같은 세포 타입의 나머지로부터 분리되지 않아야한다.
본 발명에서 사용된 바와 같은, "암세포의 집단" 또는 "암/종양 세포의 집단"은 예를 들어, ATCC를 통해 쉽게 이용가능하고, 무한증식일 수도 있는 (예를 들어, 생체 외에서 무한하게 진행될 수 있는), 암/종양 세포주, 및 인간, 수의학적 동물, 또는 쥐, 랫트 등과 같은 연구 동물과 같은 대상으로부터 얻어진, 예를 들어, 비-무한 증식 암성 물질의 샘플 ("비-무한증식 샘플")을 포함하도록 광범위하게 해석되는 것이다. 상기 암성 물질은 예를 들어, 고형 종양, 혈액-계 종양, 또는 신경계 종양으로부터, 예를 들어, 생체 검사 (biopsy) 또는 다른 수술 절차로부터, 얻어진 세포 및/또는 조직 및/또는 유체일 수 있다. 상기 암성 물질의 소스의 비-제한적인 예는 또한 혈액, 혈장, 소변 (urine), 척수수액 (cerebrospinal fluid), 복수액 (ascites fluid), 복수암 (tumor ascites), 및 이의 조합을 포함한다.
따라서, 암 세포의 집단은 하기 실시 예에서 개시된 것을 포함하는, 잘 알려진 기술을 사용하여 세포 배양으로부터 암 세포를 수확하여 얻어질 수 있다. 부가적으로, 암 세포의 집단은 암 환자로부터 종양 샘플의 취득을 통해 얻어질 수 있다. 상기 암 세포의 집단은 1차 암세포 또는 전이성 암세포일 수 있다. 상기 암 세포는 예를 들어, 전립선암 세포, 방광 암 세포, 대장암 세포, 유방암 세포, 폐암 세포, 흑색종, 또는 육종인 다양한 조직 소스로부터 유도될 수 있다. 또한 본 발명의 범주 내에 있는 이러한 암의 비-제한적인 예는 백혈병, 림프종, 및 신경 교종을 포함한다.
본 발명에 따른 세포군은 또한 HLA I- 및 HLA II-인 세포에 대해 농축된 포유류 CSC 주 (line)일 수 있다. "포유류"는 인간, 쥐, 또는 예를 들어, 랫트와 같은, 다른 연구 포유류가 바람직하다. 본 발명에 사용된 바와 같은, "농축된"은 예를 들어, 암을 치료하기 위해 사용된 제제로, 미처리된 대조 세포주와 비교하여 증가된 CSC의 수를 갖는 암 세포주를 의미한다. 상기 증가된 CSC의 수는 일시적으로, 예를 들어, 약간의 CSC가 분화될 수 있거나, 또는 장기간 (longer duration)일 수 있다. 더구나, 이러한 세포주는 순수할 수도 있거나 또는 순수하지 않을 수도 있는데, 예를 들어, 실질적으로 HLA+ 세포가 없을 수도 있다.
전술된 바와 같이, CSC는 다음의 특성 중 적어도 하나를 가질 수 있다: CD24-, CD133-, Notch+, Gli1+, Gli2+, GFAP-, Neurofil-, 및 사이토케라틴- (cytokeratin-). 더구나, 전술된 어떤 것 또는 모두의 조합은 또한 고려된다. 상기 CSC은 또한 다음의 특징 중 적어도 하나를 더욱 가질 수 있다: 자가-재생의 능력, 비대칭 세포 분열을 수행, 종양형성 능력, 전이 능력, 다-분화특성, Notch 및 Hedgehog 억제제에 대한 민감도, 및 광범위한 항암제 저항성. 더구나, 전술한 것 중 어떤 것 또한 모두의 조합은 또한 고려된다.
이러한 구현 예의 하나의 관점에 있어서, 상기 CSC는 표준 화학요법에 불응성일 수 있다. 본 발명에서 사용된 바와 같이, "불응성"은 내성 (resistant)를 의미한다. 예를 들어, 암/종양 세포의 샘플은 화학요법에 내성을 갖는 대상의 암성 물질의 샘플로부터 유도될 수 있거나 또는 상기 CSC는 화학요법에 내성인 암 세포주로부터 얻어질 수 있다. 이러한 내성 암 세포주를 발생시키기 위한 방법은 기술분야에서 알려져 있고, 실시 예에서 더욱 상세하게 개시된다.
이러한 구현 예의 또 다른 관점에 있어서, 후보 제제는 화학제, 생물학제, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 생물학제는 예를 들어, 핵산, 폴리펩타드, 또는 다당류일 수 있다. "화학제"는 명백한 화학적 조성물 및 생물학제가 아닌 특징을 갖는 물질을 의미한다. 화학제의 비-제한적인 예는 작은 유기 화합물 및 작은 무기 화합물을 포함한다. 후보 제제의 비-제한적인 예는 본 발명의 실시 예에 개시된 바와 같은 Hedgehog 및 Notch 억제제를 포함한다.
이러한 구현 예의 부가적인 관점에 있어서, 상기 결정 단계는 또한 상기 후보 제제로 미처리된 세포군에서 CSC의 퍼센트와 후보 제제로 처리된 세포군에서 CSC의 퍼센트를 비교하는 단계를 포함하고, 여기서 미처리된 세포에서 CSC의 퍼센트와 비교하여 처리된 세포군에서 CSC의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제가 CSC의 수를 선택적으로 감소시키는 제제이다.
이러한 구현 예의 또 다른 관점에 있어서, 상기 결정 단계는 유세포 분석법, 세포 생존력 분석, 세포 분화 분석, 세포 분열 분석, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 절차를 수행하는 단계를 포함한다.
전술된 바와 같이, FACS과 같은, 유세포 분석은 비-CSC로부터 CSC을 분리 및/또는 확인하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 또한 세포 생존력, 분화, 또는 분열을 평가하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "세포 생존력" 분석은 죽은 세포로부터 살아있는 세포를 분리 및/또는 확인하는 분석법이다. 세포 생존력 분석의 비-제한적인 예는 실시 예에 개시되었다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "세포 분화" 분석은 예를 들어, 실시 예에 개시된 바와 같이, 예를 들어, 사이토케라틴 발현과 같은, 세포 분화 마커에 기초하여 분화된 세포 또는 비-분화된 세포를 확인 및/또는 분리하는 분석법이다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "세포 분열" 분석은 예를 들어, 실시 예에서 개시된 바와 같이, 세포-순환 분석법을 수행하여, 비-분열 세포로부터 분열 세포를 확인 및/또는 분리하는 분석법이다.
상기 구현 예의 또 다른 관점에 있어서, 상기 세포군은 CSC 및 성체 줄기 세포를 포함하고, 상기 제제는 성체 줄기 세포의 수를 실질적으로 감소시키지 않으면서 세포군에서 CSC의 수를 감소시킨다. 본 발명에서 사용된 바와 같은, "성체 줄기 세포"는 죽은 세포를 보충하고 손상된 조직을 재생시키기 위한 세포 분열에 의해 증식되는, 성인의 몸과 같이, 배아발생 후의 몸 전체적으로 발견된, 미분화된 세포를 의미한다. 상기 성체 줄기 세포는 몸에 대한 회복 시스템 (repair system)로서 제공된다. 따라서, 성체 줄기 세포의 수를 실질적으로 감소시키지 않는 제제는 몸의 정상 회복 시스템에 실질적으로 영향을 미치지 않을 것이다.
본 발명의 방법은 고속 스크린을 이용하여 수행될 수 있다. 고속 스크린은 CSC의 수를 감소시키는 잠재 화합물 또는 생물학제에 대해 스크린 능력을 최대화하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "고속 스크린" 또는 "고속 스크리닝 방법"은 많은 수의 제제, 예를 들어, 화합물들이, 예를 들어, CSC와 같은 표적 분자 또는 표적 세포에 대항하는 생물학적 활성에 대해 빠르고 및 병렬적으로 시험되는 공정으로 정의된다. 특정한 구현 예에 있어서, "많은 수의 제제, 예를 들어, 화합물들"은 예를 들어 100 이상 또는 300 이상 또는 500 이상 또는 1000 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 공정은 자동화 공정이다.
상기 구현 예의 또 다른 관점에 있어서, 상기 결정 단계는, 다음과 같은, 단계 i 및 단계 ii, iii, 및 iv 중 적어도 하나를 더욱 포함할 수 있다:
i. 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를 비교하는 단계;
ii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 생존가능한 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
iii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 비-CSC 세포의 퍼센트를 결정하는 단계; 및
iv. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 분열 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
여기서 (1) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 생존력을 감소; (2) 세포 생존력의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소; (3) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 비-CSC 세포의 퍼센트를 증가; (4) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 분열을 감소; 또는 (5) 세포 분열의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제이다.
바람직하게는, 상기 결정 단계는 유세포 분석법, 세포 생존력 분석, 세포 분화 분석, 세포 분열 분석, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 절차를 수행하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 세포군에서 암 줄기 세포 (CSCs)의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하기 위한 고속 스크리닝 방법이다. 상기 스크리닝 방법은:
a. 세포군으로부터의 암 줄기 세포 (CSCs)와 후보 제제를 접촉시키는 단계;
b. 하기의 단계에 의해 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여, CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 CSC의 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계:
i. 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를 비교하는 단계;
ii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 생존가능한 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
iii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 비-CSC 세포의 퍼센트를 결정하는 단계; 및
iv. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 분열 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
여기서 (1) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 생존력을 감소; (2) 세포 생존력의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소; (3) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 비-CSC 세포의 퍼센트를 증가; (4) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 분열을 감소; 또는 (5) 세포 분열의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제이다. 상기 CSC의 특성은 전술한 바와 같다.
본 구현 예의 단계 (i)은 바람직하게는 유세포 분석법에 의해 수행된다.
본 구현 예의 단계 (ii)는 바람직하게는 세포 생존력 분석에 의해 수행된다.
본 구현 예의 단계 (iii)은 바람직하게는 세포 분화 분석에 의해 수행된다.
본 구현 예의 단계 (iv)는 바람직하게는 세포 분열 분석에 의해 수행된다.
본 구현 예의 또 다른 관점에 있어서, 상기 후보 제제는 화학제, 생물학제, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 구현 예의 또 다른 관점에 있어서, 상기 CSC는 표준 화학요법에 불응성이다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 세포군에서 암 줄기 세포 (CSCs)의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하기 위해 고속 스크리닝 방법이고, 여기서 상기 CSC는 표준 화학 요법에 불응성이다. 상기 방법은:
a. 세포군으로부터의 암 줄기 세포 (CSC)와 후보 제제를 접촉시키는 단계, 여기서 상기 CSC는 하기 특성을 가지며: HLA I- 및 HLA II-;
b. 하기의 단계에 의해 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여 CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계를 포함하며:
i. 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를, 유세포 분석을 이용하여, 비교하는 단계;
ii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 생존가능한 세포의 퍼센트를, 세포 생존력 분석을 이용하여, 결정하는 단계;
iii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 비-CSC 세포의 퍼센트를, 세포 분화 분석을 이용하여, 결정하는 단계; 및
iv. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 분열 세포의 퍼센트를, 세포 분열 분석을 이용하여, 결정하는 단계;
여기서 (1) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 생존력을 감소; (2) 세포 생존력의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소; (3) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 비-CSC 세포의 퍼센트를 증가; (4) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 분열을 감소; 또는 (5) 세포 분열의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제이다. 상기 CSC의 특성은 또한 전술한 바와 같이, 정의될 수 있다.
본 구현 예의 하나의 관점에 있어서, 상기 후보 제제는 화학제, 생물학제, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 본 발명에 개시된 방법에 의해 확인된 CSC를 선택적으로 사멸시키는 제제이다.
본 발명의 또 다른 구현 예는 약학적으로 허용가능한 담체 및 상기에서 확인된 CSC를 선택적으로 사멸시키는 제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학적인 조성물이다.
본 발명에 사용된 바와 같은 약학적으로 허용가능한 염은 염산 (hydrochloric acid), 황산 (sulphuric acid), 아황산 (sulphurous acid) 또는 인산 (phosphoric acid)과 같은 생리학적으로 호환가능한 무기산 (mineral acid); 또는 메탄설폰산 (methanesulphonic acid), p-톨루엔설폰산 (p-toluenesulphonic acid), 아세트산 (acetic acid), 젖산 (lactic acid), 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid), 구연산 (citric acid), 푸마르산 (fumaric acid), 말레이산 (maleic acid), 타르타르산 (tartaric acid), 숙신산 (succinic acid) 또는 살리실산 (salicylic acid)과 같은 유기산으로 CSC를 선택적으로 사멸시키기 위한 제제의 염이다. 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 이러한 염에 관한 것이다. 산성 그룹이 존재하는 제제는 또한 염기로 염을 형성할 수 있다. 이러한 염의 예는 알칼리, 토-알칼리 및 예를 들어, Na--, K--, Ca-- 및 트리메틴암모늄염 (trimethylammonium salt)과 같은 암모늄염이다. 상기 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 또한 이러한 염에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 어떤 원하는 효과적인 방식으로 투여될 수 있다: 예를 들어, 경구 섭취 (oral ingestion), 또는 비경구적 (parenteral) 또는 눈에 대한 국소 투여를 위한 액적 (drop) 또는 연고 (ointment), 또는 복강내 (intraperitoneal), 피하 (subcutaneous), 국소 (topical), 피내 (intradermal), 흡입 (inhalation), 폐내 (intrapulmonary), 직장 (rectal), 질강 (vaginal), 설하 (sublingual), 근육내 (intramuscular), 정맥 (intravenous), 동맥내 (intraarterial), 척추내 (intrathecal), 또는 림프내 (intralymphatic)와 같은, 어떤 적절한 방식으로 다른 투여. 또한, 본 발명의 약학 조성물은 다른 치료와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 앤캡슐되거나 또는 만약 원한다면, 위 (gastric) 또는 다른 분비물 (secretion)에 대해 보호될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로-허용가능한 담체, 및 선택적으로, 하나 이상의 다른 화합물, 약물, 성분 및/또는 물질과의 혼합물에서, 하나 이상의 활성 성분, 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 확인된 하나 이상의 제제를 포함한다. 선택된 투여 경로와 관계없이, 본 발명의 제제/화합물은 기술분야에서 당업자에게 알려진 전통적인 방법에 의해 약학적으로-허용가능한 투여 형태로 제형화된다. 예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA.)을 참조.
약학적으로 허용가능한 담체는 기술분야에서 잘 알려져 있고 (예를 들어, Remington, The Science and Practice of Pharmacy (21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA.) 및 The National Formulary (American Pharmaceutical Association, Washington, D.C.), 참조), 당 (예를 들어, 락토오즈 (lactose), 수크로오즈 (sucrose), 만니톨 (mannitol), 및 솔비톨 (sorbitol)), 녹말 (starches), 셀룰로오즈 제제 (cellulose preparations), 인산 칼슘 (calcium phosphates) (예를 들어, 인산 디칼슘 (dicalcium phosphate), 인산 트리칼슘 (tricalcium phosphate) 및 수소 인산 칼슘 (calcium hydrogen phosphate)), 구연산 나트륨 (sodium citrate), 물, 수성 용액 (예를 들어, 실란, 염화 나트륨 주사액 (sodium chloride injection), 링거 (Ringer's) 주사액 (injection), 덱스트로스 (dextrose) 주사액, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사액, 락테이트 링거 주사액 (lactated Ringer's injection)), 알코올 (예를 들어, 에틸 알코올, 프로필 알코올, 및 벤질 알코올), 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜), 유기 에스테르 (예를 들어, 에틸 올레이트 (ethyl oleate) 및 트리글리세라이드), 생분해가능한 중합체 (biodegradable polymers) (예를 들어, 폴리락티드-폴리글리콜라이드 (polylactide-polyglycolide), 폴리(오르소에스테르 (poly(orthoesters)), 및 폴리(무수물) (poly(anhydrides)), 탄성 매트릭스 (elastomeric matrices), 리포좀 (liposomes), 미소구체 (microspheres), 오일 (예를 들어, 옥수수, 배아 (germ), 올리브, 캐스터 (castor), 참깨 (sesame), 목화씨 (cottonseed), 및 땅콩), 코코아 버터, 왁스 (예를 들어, 좌약 왁스 (suppository waxes)), 파라핀, 실리콘, 탈크 (talc), 살리실레이트 (silicylate), 등을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 사용된 각각의 약학적으로 허용가능한 담체는 대상에 해롭지 않고 제형의 다른 성분과 혼화성이 있는 의미에서 "허용가능한" 것이어야 한다. 선택된 복용 형태 및 의도된 투여 경로에 대해 적절한 담체는 기술 분야에 잘 알려져 있고, 선택된 복용 형태 및 투여 방법을 위한 허용가능한 담체는 당 업계의 통상의 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 선택적으로, 이러한 약학 조성물에서 통상적으로 사용된 부가 성분 및/또는 물질을 함유할 수 있다. 이러한 성분 및 물질은 기술분야에서 잘 알려져 있고, (1) 녹말, 락토오즈, 수크로오즈, 글루코오즈, 만니톨, 및 규산 (silicic acid)과 같은, 충진제 (filler) 또는 확장제 (extender); (2) 카르복시메틸셀룰로오즈 (carboxymethylcellulose), 알지네이트 (alginates), 젤라틴 (gelatin), 폴리비닐 피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone), 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈 (hydroxypropylmethyl cellulose), 수크로오즈 (sucrose) 및 아카시아 (acacia)와 같은, 바인더 (binder); (3) 글리세롤과 같은, 보습제 (humectant); (4) 아가-아가, 탄산 칼슘 (calcium carbonate), 감자 또는 타피오카 (tapioca) 녹말, 알긴산 (alginic acid), 특정 실리케이트 (certain silicates), 전분 글리콘산나트륨 (sodium starch glycolate), 가교된 소듐 카르복시메틸셀룰로오스 (sodium carboxymethyl cellulose) 및 탄산 나트륨 (sodium carbonate)과 같은, 붕해제 (disintegrating agents); (5) 파라핀과 같은, 용액 지연제 (solution retarding agents); (6) 4차 암모늄 화합물과 같은, 흡수 촉진제 (absorption accelerator); (7) 세틸 알코올 (cetyl alcohol) 및 글리세롤 모노스테아레이트 (glycerol monostearate)과 같은, 습윤제 (wetting agents); (8) 고령토 (kaolin) 및 벤토나이트 (bentonite clay)와 같은, 흡수제 (absorbents); (9) 탈크 (talc), 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 및 라우릴설페이트 나트륨 (sodium lauryl sulfate)와 같은 윤활제 (lubricants); (10) 에톡실화 이소스테아릴 알코올 (ethoxylated isostearyl alcohols), 폴리옥시에틸렌 솔비톨 (polyoxyethylene sorbitol) 및 솔비탄 에스테르 (sorbitan esters), 미결정 셀룰로오즈 (microcrystalline cellulose), 알루미늄 메타하이록사이드 (aluminum metahydroxide), 벤토나이트 (bentonite), 아가-아가 및 트라가칸트 (tragacanth)와 같은, 부유제 (suspending agents); (11) 완충제 (buffering agents); (12) 락토오즈, 밀크 당, 폴리에틸렌 글리콜, 동물 및 식물 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 코코아 버터, 녹말, 트라가칸트, 셀룰로오즈 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크, 살리실산염 (salicylate), 산화 아연 (zinc oxide), 수산화 알루미늄 (aluminum hydroxide), 규산 칼슘 (calcium silicates), 및 폴리아미드 분말과 같은, 부형제 (excipient); (13) 물 또는 다른 용매와 같은, 불활성 희석제 (inert diluent); (14) 방부제 (preservatives); (15) 표면-활성제 (surface-active agents); (16) 분산제 (dispersing agents); (17) 하이드록시프로필메틸 셀룰로오즈 (hydroxypropylmethyl cellulose), 다른 중합체 매트릭스, 생분해가능한 중합체, 리포좀 (liposomes), 미소구체, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴, 및 왁스와 같은, 조절-방출 (control-release) 또는 흡수-지연제 (absorption-delaying agents); (18) 불투명화제 (opacifying agents); (19) 보강제 (adjuvants); (20) 습윤제 (wetting agents); (21) 유화 및 부유제 (emulsifying and suspending agents); (22) 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 코틴시드, 땅콩, 옥수수, 배아 (germ), 올리브, 캐스터 (castor) 및 참기름 (sesame oils)), 글리세롤, 테트라하이드로푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 솔비탄의 지방산 에스테르와 같은, 용해보조제 (solubilizing agents) 및 유화제 (emulsifiers); (23) 클로로플루오로하이드로카본 (chlorofluorohydrocarbon)과 같은, 추진제 (propellants), 및 부탄 및 프로판과 같은, 휘발성 비치환된 탄화수소 (volatile unsubstituted hydrocarbons); (24) 항산화제 (antioxidants); (25) 당 및 염화 나트륨과 같은, 의도된 수용체 (recipient)의 혈액과 등장성 제형을 제공하는 제제; (26) 증점제 (thickening agents); (27) 레시틴과 같은, 코팅 물질; 및 (28) 감미료 (sweetening), 향료 (flavoring), 착색 (coloring), 향료 (perfuming) 및 방부제 (preservative agents)를 포함한다. 각각 이러한 성분 또는 물질은 대상에 유해하지 않고, 제형의 다른 성분과 호환할 수 있다는 의미에서 "허용가능" 해야 한다. 선택된 복용 형태 및 의도된 투여 경로에 대해 적절한 성분 및 물질은 기술분야에서 잘 알려져 있고, 선택된 복용 형태 및 투여 방법을 위한 허용가능한 성분 및 물질은 당 업계의 통상의 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
경구 투여를 위해 적절한 약학 조성물은 캡슐, 카세 (cachet), 알약, 정제, 분말, 입자, 수성 또는 비-수성 액체에서 용액 또는 현탁액, 수중유형 (oil-in-water) 또는 유중수형 (water-in-oil) 액상 유화, 엘릭시르 (elixir) 또는 시럽, 패스틸 (pastille), 볼루스 (bolus), 연약 (electuary) 또는 페이스트 (paste)의 형태일 수 있다. 이들 제형은 예를 들어, 종래의 팬-코팅 (pan-coating), 혼합, 입자화 또는 동결건조 (lyophilization) 공정의 수단으로, 기술분야에서 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
경구 투여용 고체 복용 형태 (캡슐, 정제, 알약, 당의정 (dragee), 분말, 입자 등)는 예를 들어, 약학적으로-허용가능한 하나 이상의 담체, 및 선택적으로 하나 이상의 충진제, 확장제, 바인더, 보습제, 붕해제, 용해 지연제, 흡수촉진제, 습윤제, 흡수제, 윤활제, 및/또는 착색제와 활성성분을 혼합시켜, 제조될 수 있다. 유사한 타입의 고체 조성물은 적절한 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충진 젤라틴 캡슐의 충진제로서 사용될 수 있다. 정제는 압축, 또는 몰딩, 선택적으로 하나 이상의 부성분 (accessory ingredient)에 의해 만들어질 수 있다. 압축된 정제는 적절한 바인더, 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제, 표면-활성 또는 분산제를 사용하여 제조될 수 있다. 성형 정제는 적절한 기계에서 성형시켜 만들어질 수 있다. 상기 정제, 및 당의정, 캡슐, 알약 및 입자와 같은, 다른 고형 복용 형태는, 선택적으로 약학적-제형 기술 분야에서 잘 알려진 장용 코팅 (enteric coatings) 및 다른 코팅과 같은, 코팅 및 쉘로 얻거나 또는 제조될 수 있다. 이들은 또한 그 내에서 상기 활성 성분의 서방성 또는 조절된 방출을 제공하도록 제형될 수 있다. 이들은 예를 들어, 박테리아-보유 필터 (bacteria-retaining filter)를 통한 필터에 의해 멸균될 수 있다. 이들 조성물은 또한 불투명화제를 선택적으로 함유할 수 있고, 상기 활성 성분이 단독, 또는 우선적으로, 위장관 (gastrointestinal tract)의 특정 부분에서, 선택적으로 지연된 방식으로, 방출되는 조성물일 수 있다. 상기 활성 성분은 또한 마이크로앤캡슐화된 형태 (microencapsulated form) 일 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 복용 형태는 약학적으로-허용가능한 에멀젼, 마이크로에멀젠, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 상기 액체 복용 형태는 기술 분야에서 통상적으로 사용된 적절한 불활성 희석제를 함유할 수 있다. 불활성 희석제외에, 상기 경구 조성물은 또한 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미료, 향신료, 착색, 향료 및 방부제와 같은 보강제를 또한 포함할 수 있다. 현탁액은 현탁화제를 함유할 수 있다.
직장 또는 질 내 투여를 위한 약학 조성물은 좌약제제로서 존재할 수 있고, 이것은 실온에서 고체이지만, 체온에서 액체여서, 따라서 직장 또는 질 내에서 용융되어 활성 화합물을 방출하는, 하나 이상의 적절한 무자극성 담체와 하나 이상의 활성 성분을 혼합시켜 제조될 수 있다. 질 내 투여하는데 적절한 약학 조성물은 적당하다고 기술분야에서 알려진 바와 같은, 상기 약학적으로-허용가능한 담체를 함유하는 페서리 (pessaries), 탐폰 (tampons), 크림 (creams), 젤 (gels), 페이스트 (pastes), 폼 (foams) 또는 스프레이 (spray) 제형을 포함한다.
국소 또는 경피 투여를 위한 복용 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치, 액적 및 흡입을 포함한다. 상기 활성 제제/화합물은 적절한 약학적으로-허용가능한 담체와 멸균 상태하에서 혼합될 수 있다. 상기 연고, 페이스트, 크림, 및 젤은 부형제를 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이는 부형제 및 추진제를 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 적절한 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로-허용가능한 멸균 등장 수성 또는 비-수성 용액, 분산액, 현탄액 또는 유액, 또는 사용하기 전에 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는, 멸균 분말과 조합한 하나 이상의 제제/화합물을 포함하고, 이것은 적절한 항산화제, 완충제, 의도된 레시펀트의 혈액으로 등장의 제형을 제공하는 용질, 또는 현탁화제 또는 증감제를 함유할 수 있다. 적당한 유동성 (fluidity)은, 예를 들어, 코팅 물질의 사용하여, 분산의 경우에 있어서 요구된 입자 크기를 유지하고, 계면활성제의 사용으로 유지될 수 있다. 이들 조성물은 또한 습윤제, 유화제, 및 분산제와 같은 적절한 보강제를 함유할 수 있다. 이것은 등장제를 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 부가하여, 주사가능한 약학적 형태의 지연된 흡수는 흡수를 지연하는 제제의 함유에 의해 제공될 수 있다.
몇몇 경우에 있어서, 약물의 효과를 지연하기 위하여 (예를 들어, 약학적 제형), 피하 또는 근육 주사로부터 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이것은 약한 물 용해도를 갖는 결정질 또는 무정질의 액상 현탁액의 사용에 의해 달성될 수 있다.
그 다음, 상기 활성 제제/약물의 흡수 속도는 결정 크기 및 결정질 형태에 의존할 수 있는, 용해 속도에 의존한다. 선택적으로, 비경구적으로-투여된 제제/약물의 지연된 흡수는 오일 비히클에서 활성 제제/약물을 용해 또는 현탁시켜 달성될 수 있다. 주사가능한 데포 (depot) 형태는 생분해가능한 중합체에서 활성 성분의 마이크로앤캡슐 매트릭스를 형성하여 제조될 수 있다. 중합체에 대한 활성 성분의 비에 의존하여, 특정 중합체의 특성이 사용되고, 활성 성분 방출 속도가 조절될 수 있다. 데포 주사가능한 제형은 또한 몸 조직과 호환가능한 리포좀 또는 마이크로에멀젼에서 약물을 포획시켜 제조된다. 상기 주사가능한 물질은 예를 들어, 박테리아-보유 필터를 통한 여과로, 멸균될 수 있다.
제형은 단위-복용량 또는 다중-복용 밀봉된 용기, 예를 들어, 앰플 또는 바이알에 존재될 수 있고, 사용하기 바로 직전에, 멸균 액체 담체, 예를 들어, 주사를 위한 물의 첨가만을 요구하는 동결 건조 상태로 저장될 수 있다. 즉각적인 주사 용액 및 현탁액은 전술된 타입의 멸균 분말, 입자 및 정제로부터 제조될 수 있다.
부가적인 정의
본 발명에 사용된 전문용어는 특정 구현 예를 기술하고자 하는 목적을 위한 것이고, 제한을 의도하는 것은 아니다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같은, 단수는 문맥상 명확하게 구분되지 않는 한 복수를 포함한다.
본 발명에서 수적 범위의 인용에 대하여, 동일한 정확도를 갖는 사이에 있는 각 중간 수는 명시적으로 고려된다. 예를 들어, 6-9의 범위에 있어서, 수 7 및 8은 6 및 9에 부가하여 고려되고, 6.0-7.0의 범위에 있어서, 수 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6,9, 및 7.0은 명시적으로 고려된다.
핵산
본 발명에 사용된 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오타이드" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 서로 공유적으로 결합된 적어도 두 개의 뉴클레오타이드를 의미한다. 단일 가닥의 묘사는 또한 상보적인 가닥의 서열을 정의한다. 따라서, 핵산은 또한 묘사된 단일 가닥의 상보적인 가닥을 포함한다. 많은 핵산의 변이체 (variants)는 제공된 핵산으로 동일한 목적을 위하여 사용될 수 있다. 따라서, 핵산은 또한 실질적으로 동일한 핵산 및 이의 보체 (complements)를 포함한다. 단일 가닥은 엄격한 하이브리드화 (hybridization) 조건하에서 표적 서열로 하이브리드시킬 수 있는 프로브 (probe)를 제공한다. 따라서, 상기 핵산은 또한 엄격한 하이브리드화 조건하에서 하이브리드시킬 수 있는 프로브를 포함한다.
핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, 또는 이중 가닥 및 단일 가닥 서열 모두의 부분을 함유할 수 있다. 상기 핵산은 DNA, 게놈 및 cDNA 모두, RNA, 또는 하이브리드일 수 있고, 여기서 상기 핵산은 디옥시리보- (deoxyribo) 및 리보-뉴클레오타이드의 조합, 및 우라실, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 이노신, 크산틴 하이포크산틴 (xanthine hypoxanthine), 이소시토신, 및 이소구아닌을 포함하는 염기의 조합을 함유할 수 있다. 핵산은 단일 가닥 분자로서 합성 또는 합성 유전자를 이용하여 세포 (생체외 또는 생체내)에서 발현될 수 있다. 핵산은 화학 합성 방법 또는 재조합 방법에 의해 얻어질 수 있다.
상기 핵산은 또한 예를 들어, 미국 특허출원 제11/429,720호, 제11/384,049호, 제11/418,870호, 및 제11/429,720호, 및 공개된 국제 출원 제2005/116250호 및 제2006/126040호에, 기재된 바와 같이, mRNA, tRNA, shRNA, siRNA, Piwi-interacting RNA, pri-miRNA, pre-miRNA, miRNA, 또는 anti-miRNA와 같은 RNA일 수 있다.
siRNA 유전자-표적 (gene-targeting)은 일시적 siRNA가 세포로 전달되어 수행될 수 있고, (리포좀에서 앤캡슐화, 양이온성 지질, 콜레스테롤, 및/또는 축합 중합체와 복합, 전기천공 (electroporation), 또는 미세주입법 (microinjection)과 같은) 지질-매개된 형질감염 (lipid-mediated transfection)과 같은 고전적인 방법에 의해 달성된다. siRNA 유전자-표적은 또한 항체에 접합된 siRNA 또는 siRNA에 결합한 이중-가닥 RNA-결합 도메인 (DRBD)에 접합된 세포-침투 펩티드를 포함하는 융합 단백질과 복합된 siRNA의 투여에 의해 달성될 수 있다 (미국 공개특허 제2009/0093026호 참조).
상기 핵산은 또한 앱타머 (aptamer), 인트라머 (intramer), 또는 스피에겔머 (spiegelmer)일 수 있다. 상기 용어 "앱타머"는 특이 분자 표적에 결합한 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드 분자에 관한 것이다. 앱타머는, 큰 조합 라이브러리로부터 표적-특이 앱타머 서열을 선택하는, (예를 들어, 미국특허 제5,270,163호에서 개시된, SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)) 생체외 진화 공정으로부터 유도된다. 앱타머 조성물은 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유도체 또는 다른 뉴클레오타이드-유사 분자를 포함할 수 있다. 앱타머의 뉴클레오타이드 성분은 변형된 당 그룹 (예를 들어, 리보뉴클레오타이드의 2'-OH 그룹이 2'-F 또는 2'-NH2에 의해 대체될 수 있다)을 가질 수 있고, 이것은 원하는 특성, 예를 들어, 혈액 내에서 더 긴 수명 또는 뉴클레아제 (nucleases)에 대한 내성을 개선시킬 수 있다. 앱타머는 다른 분자, 예를 들어, 순환계 (circulatory system)로부터 앱타머의 소실 (clearance)을 느리게 하기 위한 고분자량 담체에 접합될 수 있다. 앱타머는 이들의 동족 리간드 (cognate ligand), 예를 들어, 가교제의 광-활성 (photo-activation)에 의해 특별하게 가교될 수 있다 (Brody, E. N. and L. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13).
상기 용어 "인트라머"는 생체내에서 발현된 앱타머에 관한 것이다. 예를 들어, 백시니아 비아러스-계 RNA 발현 (vaccinia virus-based RNA expression) 시스템은 백혈구의 세포질 (cytoplasm)에서 높은 수준으로 특이 RNA 앱타머를 발현하는데 사용된다 (Blind, M. et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3606-3610).
상기 용어 "스피어겔마"는 L-DNA, L-RNA, 또는 다른 좌선형 (left-handed) 뉴클레오타이드 유도체 또는 뉴클레오타이드-유사 분자를 포함하는 앱타머에 관한 것이다. 좌선형 뉴클레오타이드를 함유하는 앱타머는 자연적으로 발생하는 효소에 의한 분해에 내성이 있고, 이것은 우선형 (right-handed) 뉴클레오타이드를 함유하는 기질에 정상적으로 작용한다.
비록 포함될 수 있는 핵산 유사체 (analog)가 적어도 하나의 다른 결합 (linkage), 예를 들어, 포스포라미데이트 (phosphoramidate), 포스포티오에이트 (phosphorothioate), 포스포로디티오레이트 (phosphorodithioate), 또는 O-메틸포스포로아미다이트 (methylphosphoroamidite) 결합 (linkage) 및 펩티드 핵산 골격 및 결합 (linkage)을 포함할지라도, 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합 (phosphodiester bonds)을 함유할 것이다. 다른 유사체 핵산은 양성 골격; 미국 특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호에 기재된 것을 포함하는, 비-이온성 골격, 및 비-리보스 골격을 갖는 것을 포함한다. 하나 이상의 비-자연적으로 발생하는 또는 변형된 뉴클레오타이드를 함유하는 핵산은 또한 핵산의 정의 이내에 포함된다. 상기 변형된 뉴클레오타이드 유사체는 예를 들어 상기 핵산 분자의 5'-말단 및/또는 3'-말단에 위치될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체의 대표적인 예는 당- 또는 골격-변형 리보뉴클레오타이드로부터 선택될 수 있다. 그러나, 이것은 또한 핵산염기-변형 리보뉴클레오타이드 (ribonucleotides), 즉, 5-위치에 변형된 유리딘 (uridines) 또는 시티딘 (cytidines), 예를 들어, 5-(2-아미노)프로필 유리딘, 5-브로보 유리딘; 8-위치에 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어, 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오타이트, 예를 들어, 7-데아자-아데노신; O- 및 N-알킬화 뉴클레오타이드, 예를 들어, N6-아데노신과 같은 자연적으로 발생하는 핵산염기 대신에 비-자연적으로 발생하는 핵산염기를 함유하는, 리보뉴클레오타이드가 적절하다는 것에 주목되어야 할 것이다. 상기 2-OH-그룹은 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 CN으로부터 선택된 군에 의해 대체될 수 있고, 여기서 R은 d-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, CI, Br 또는 I이다. 변형된 뉴클레오타이드는 또한 Krutzfeldt et al., Nature (Oct. 30, 2005), Soutschek et al., Nature 432:173-178 (2004), 및 미국 공개특허 제20050107325호에서 개시된 바와 같은, 예를 들어, 하이드록시프롤리놀 결합 (hydroxyprolinol linkage)을 통하여 콜레스테롤과 접합된 뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 뉴클레오타이드 및 핵산은 또한 미국 공개특허 제 20020115080호에 개시된 바와 같은, 잠금 핵산 (locked nucleic acid) (LNA)을 포함할 수 있다. 부가적 변형된 뉴클레오타이드 및 핵산은 미국 공개특허 제20050182005호에 개시된다. 상기 리보오즈-포스페이트 골격의 변형은 다양한 이유로, 예를 들어, 생리적인 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해, 세포막을 가로지르는 확산을 증진시키기 위해 또는 바이오칩 상에 프로브로서 수행될 수 있다. 자연적으로 발생하는 핵산 및 유사체의 혼합은 만들어질 수 있고; 선택적으로 다른 핵산 유사체의 혼합물, 및 자연적으로 발생하는 핵산 및 유사체의 혼합물은 만들어질 수 있다.
펩티드, 폴리펩티드, 단백질
상기 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 본 발명에서 교환가능하게 사용된다. 본 발명에 있어서, 이들 용어는 아미노산의 결합된 서열을 의미하고, 이것은 자연의, 합성의, 또는 변형, 또는 자연의 및 합성의 조합일 수 있다. 상기 용어는 항체, 항체 모사체 (mimetics), 도메인 항체, 리포칼린 (lipocalin), 표적된 프로테아제 (targeted proteases), 및 폴리펩티드 모사체를 포함한다. 상기 용어는 또한 펩티드 또는 펩티드 절편에 대항하는 항체를 증가시키기 위해 의도된 펩티드 또는 펩티드 절편을 함유하는 백신을 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "항체"는 Fab, F(ab')2, Fd, 및 단일 사슬 항체, 디아보디 (diabodies), 이특이성 (bispecific) 항체, 및 이기능성 (bifunctional) 항체를 포함하는, 부류 IgG, IgM, IgA, IgD, 또는 IgE의 항체 또는 이의 절편 또는 유도체를 포함한다. 상기 항체는 원하는 에피토프 (epitope) 또는 이것으로부터 유도된 서열에 충분한 결합 특이성을 나타내는, 단일콜론 항체, 폴리콜론 항체, 친화 정제된 항체 (affinity purified antibody), 또는 이의 혼합물일 수 있다. 상기 항체는 또한 키메라 항체 (chimeric antibody)일 수 있다. 상기 항체는 기술분야에서 알려진 하나 이상의 화학물질, 펩티드, 또는 폴리펩티드 부분 (moieties)의 부착에 의해 유도될 수 있다. 상기 항체는 화학적 부분과 접합될 수 있다. 상기 항체는 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다. 이들 및 다른 항체는 미국 공개특허 제20070065447호에 개시되었다.
다른 항체-유사 분자는 또한 본 발명의 범주 내에 있다. 이러한 항체-유사 분자는, 예를 들어, (에타너셉트 (entanercept)와 같은) 수용체 트랩 (receptor trap), (예를 들어, Compound Therapeutics, Inc.사로부터의 어드넥틴 (adnectins), 피브로넥틴 (fibronectin)계 "추적가능한 (addressable)" 치료 결합 분자와 같은) 항체 모사체 , ((예를 들어, 아노바디; 예를 들어, Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 2004 Apr 15;64(8): 2853-7 참조와 같은) 자연적으로 발생하는 단일-도메인 항체의 가장 작은 기능성 절편인) 도메인 항체를 포함한다.
적절한 항체 모사체는 일반적으로 본 발명에 기술된 항체 및 항체 절편을 위한 대용물 (surrogate)로서 사용될 수 있다. 이러한 항체 모사체는 이점이 되는 특성에 관련될 수 있다 (예를 들어, 이들은 수용성, 단백질분해 (proteolysis)에 대한 내성, 및/또는 비면역원성 (nonimmunogenic)을 포함할 수 있다). 예를 들어, 단일콜론 항체의 2차 상보성-결정 영역 (complementarity-determining region) (CDR)을 모사하는 합성 베타-루프 구조를 포함하는 펩티드는 제안되고 발생된다. 예를 들어, Saragovi et al., Science. Aug. 16, 1991 ;253(5021):792-5 참조. 펩티드 항체 모사체는 또한 다중 CDR로부터 항원 접촉 잔기를 함유하는 펩티드 모사를 설계하기 위하여, "활성" 항원 인지 잔기, 분자 몰딩, 및 분자 운동 궤도 분석법 (molecular dynamics trajectory)을 결정하기 위해 펩티드 지도의 사용에 의해 생성된다. 예를 들어, Cassett et al., Biochem Biophys Res Commun. Jul. 18, 2003;307(1): 198-205 참조. 본 발명의 상황에 적용가능한, 관련된 원리, 방법의 부가적인 논의는, 예를 들어, Fassina, Immunomethods. October 1994;5(2):121-9에서 제공된다.
본 발명에 사용된 바와 같은, "펩티드"는 표적 프로테아제 (proteases)를 포함하고, 이것은 예를 들어, 미국 공개특허 제20060275823호에 개시된 바와 같이, 단백질합성-후 변형 (post-translational modification)의 기질-표적 억제 (substrate-targeted inhibition)를 가능하게 한다.
본 발명에 있어서, "펩티드"는 또한 안티칼린 (anticalin)을 포함한다. 알티칼린은 암 줄기 세포의 수를 감소시키는 제제를 위해 스크린될 수 있다. 안티칼린은 리포칼린 지지체 (lipocalin scaffold)에 기초로 제작된 리간드 (ligand)-결합 단백질이다 (Weiss, G. A. and H. B. Lowman (2000) Chem. Biol. 7:R177-R184; Skerra, A. (2001) J. Biotechnol. 74:257-275). 리포칼린의 단백질 구성 (protein architecture)은 8개의 반평형 베타-가닥을 갖는 베타-배럴 (beta-barrel)을 포함할 수 있고, 이것은 이의 개방 말단 (open end)에서 4개의 루프 (loop)를 지지한다. 이들 루프는 리포칼린의 천연의 리간드-결합 부위를 형성하고, 부위는 새로운 결합 특이성에 영향을 미치기 위해 아미노산 치환에 의해 생체 내에서 재-설계될 수 있다. 상기 아미노산 치환은 기술분야에서 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있고, 보존성 치환 (conservative substitution) (예를 들어, 결합특이성을 변형하지 않은 치환), 또는 다소, 적당하게 또는 상당하게 결합 특이성을 변형시킨 치환을 포함할 수 있다.
일반적으로, 폴리펩티드 모사체 ("펩티드모사체 (peptidomimetic)")는 폴리펩티드의 생물학적 활성은 모사하지만, 화학적 특성에서 펩티드가 아닌 분자이다. 반면, 특정 구현 예에 있어서, 펩티드모사체는 펩티드 결합 (즉, 아미노산들 사이의 아미노 결합)을 함유하지 않는 분자이고, 용어 펩티드모사체는 가성-펩티드 (pseudo-peptide), 세미-펩티드, 및 펩토이드 (peptoid)와 같이, 특성에서 완전하게 펩티드가 아닌 분자를 포함할 수 있다. 더욱 광범위한 정의에 의한, (예를 들어, 폴리펩티드의 부분이 구조 결핍 펩티드 결합에 의해 대체되는) 몇몇 펩티드모사체의 예는 하기에 기술된다. 특성에서 전체적으로 또는 부분적으로 비-펩티드인지 아닌지 간에, 본 발명에 따른 펩티드모사체는 폴리펩티드에서 활성 그룹의 3차원 배열을 유사하게 닯은 반응 화학적 부분의 공간 배열을 제공할 수 있다. 이러한 유사 활성-부위 기하학 (active-site geometry)의 결과에 따라, 상기 펩티드모사체는 폴리펩티드의 생물학적 활성과 유사한 생물학적 효과를 나타낼 수 있다.
폴리펩티드 자체라기보다는 제공된 폴리펩티드의 모사체를 사용하기 위한 여러 가지 잠재적 이점이 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 두 개의 원하지 않는 속성, 즉, 약한 생체이용률 (bioavailability) 및 짧은 활성지속성을 나타낼 수 있다. 펩티드모사체는 종종 경구 활성, 및 긴 활성 지속성을 갖기에 충분히 작다. 또한 펩티드모사체로 감소될 수 있는 폴리펩티드에 대한 안정성, 저장 및 면역반응성과 관련된 문제가 있다.
원하는 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드는 유사한 생물학적 활성을 갖는 펩티드모사체의 개발에 사용될 수 있다. 폴리펩티드로부터 펩티드모사체를 개발하는 기술은 알려져 있다. 펩티드 결합은 유사한 구조에 적응하는데 펩티드모사체를 허용하고, 따라서 원래의 폴리펩티드에 생물학적 활성을 허용하는 비-펩티드 결합에 의해 대체될 수 있다. 또한 변형은 또한 유사한 구조, 형태 또는 반응성의 다른 화학적 그룹으로 아미노산의 화학적 그룹을 대체하여 만들어질 수 있다. 펩티드모사체의 개발은 NMR 분광계 (spectroscopy), 결정화법 및/또는 컴퓨터-지원 분자 몰딩 (computer-aided molecular modeling)에 의해, 리간드에 결합하거나 결합하지 않는, 원래의 폴리펩티드의 3차원 구조를 결정하여 도움이 될 수 있다. 이들 기술은 원래의 폴리펩티드보다 더 높은 효능 (potency) 및/또는 더 높은 생체이용률 및/또는 더 높은 안정성의 신규 조성물의 개발을 돕는다 (Dean (1994), BioEssays, 16: 683-687; Cohen and Shatzmiller (1993), J. Mol. Graph., 11 : 166-173; Wiley and Rich (1993), Med. Res. Rev., 13: 327-384; Moore (1994), Trends Pharmacol. Sci., 15: 124-129; Hruby (1993), Biopolymers, 33: 1073-1082; Bugg et al. (1993), Sci. Am., 269: 92-98.
다당류 (Polysaccharides)
상기 용어 "다당류"는 글리코시딕 결합에 의해 서로 연결된 반복 단위 (단- 또는 이-당류)로 형성된, 중합체성 탄수화물 구조를 의미한다. 단- 또는 이-당류의 단위는 동일하거나 또는 다를 수 있다. 다당류의 비-제한적인 예는 녹말, 글리코겐, 셀룰로오즈 및 키틴을 포함한다.
작은 유기 또는 무기 분자
상기 문구 "작은 유기" 또는 "작은 무기" 분자는 생물학적 공정에 영향을 미치기 위해 작용할 수 있는 핵산, 다당류, 및 폴리펩티드 외에, 어떤 화학적 또는 다른 부분 (moiety)을 포함한다. 작은 분자는 현재까지 알려지고 사용된 다수의 치료학적 제제를 포함하거나, 또는 생물학적 기능에 대한 스크리닝의 목적을 위해 이러한 분자의 라이브러리에서 합성될 수 있다. 작은 분자는 크기에 의해 거대분자와 구분된다. 본 발명의 작은 분자는 일반적으로 약 5,000 daltons (Da) 미만, 바람직하게는 약 2,500 Da 미만, 더욱 바람직하게는 약 1 ,000 Da 미만, 가장 바람직하게는 약 500 Da 미만의 분자량을 갖는다.
본 발명에 사용된 바와 같은, 용어 "유기 화합물"은 핵산 및 폴리펩티드와 같은 거대분자 외에 어떤 탄소-계 화합물에 관한 것이다. 탄소에 부가하여, 유기 화합물은 칼슘, 염소, 불소, 구리, 수소, 철, 칼륨, 질소, 산소, 황 및 다른 원소를 함유할 수 있다. 유기 화합물은 방향족 또는 지방족 형태일 수 있다. 유기 화합물의 비-제한적인 예는 아세톤, 알코올, 아닐린, 탄화수소, 단-당류, 이-당류, 아미노산, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 지방, 레티노이드, 스테로이드, 프로테오글리칸 (proteoglycans), 케톤, 알데하이드, 포화, 불포화 및 고도불포화 지방, 오일 및 왁스, 알켄, 에스테르, 에테르, 티올, 설파이드, 환형 화합물, 헤테로환형 화합물, 이미다졸, 및 페놀을 포함한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 유기 화합물은 또한 질화된 유기 화합물 및 할로겐화된 (예를 들어, 염화된) 유기화합물을 포함한다. 작은 분자의 수집, 및 본 발명에 따라 확인된 작은 분자는 가속 질량 분석법 (accelerator mass spectrometry)과 같은 기술에 의해 특징화된다 (AMS; Turteltaub et al., Curr Pharm Des 2000 6:991-1007, Bioanalytical applications of accelerator mass spectrometry for pharmaceutical research; and Enjalbal et al., Mass Spectrom Rev 2000 19:139-61 , Mass spectrometry in combinatorial chemistry, 참조).
바람직한 작은 분자는 상대적으로 더 쉽고, 경제적으로 제작, 제형, 또는 제조된다. 바람직한 작은 분자는 다양한 저장 조건하에서 안정하다. 바람직한 작은 분자는 생물학적 활성이 있고, 개선된 약학적 특성을 갖는 분자를 형성하기 위해 거대분자에 밀접하게 관련하여 위치될 수 있다. 개선된 약학적 특성은 원하는 생물학적 활성에 이로운 순환시간, 분포, 대사, 변형, 배설, 분비, 제거 및 안정성에서의 변화를 포함한다. 개선된 약학적 특성은 독성학 및 화학 물질 (chemical entity)의 효과적 특징에서 변화를 포함한다.
하기 실시 예는 본 발명의 방법 및 조성물을 더욱 설명하기 위해 제공된다. 이들 실시 예는 오직 설명을 위한 것이지 어떤 방식으로도 본 발명의 범주를 제한하려는 의도는 없다.
실시 예
세포의 줄기세포성와 일치하는 발생 분자 신호를 나타내는 도세탁셀에 대한 전립선암 세포 내성
도세탁셀은 호르몬 불응성 전립선암을 갖는 환자에 대한 표준 요법으로서 현재 사용된 항-분열 제제 (anti-mitotic agent)이다 (Petrylak et al., 2004; Tannock et al.,2004). 그러나, 모든 환자는 궁극적으로 질병의 진행을 경험하고, 이러한 상황에서 상기 질병을 조절하는 다른 치료는 없다. 이러한 내성 현상의 임상적 타당성 때문에, 잘 형성된 전립선암 호르몬-의존성 세포주 DU145 및 22RV1을 사용하여 도세탁셀 내성의 생체내 모델은 이러한 사건을 담당하는 분자 변경을 특징화하도록 발생된다. (도 1a-d).
DU145 및 22RV1 세포는 도세탁셀의 복용량을 증가시켜 노출되고, 획득된 항암제 저항성은 세포 생존력, 콜로니 형성, 아넥신 V, 및 폴리-(ADP-리보오즈) 중합효소 (polymerase) (PARP) 절단 분석에 의해 확인되고 특징화된다. (도 1a-d). 발생된 도세탁셀 내성 (DR) 세포는, 다중 약물 내성 표현형과 일치하는, 다른 항-분열 제제 (비노렐빈 (Vinorelbine) 및 파실탁셀 (Paclitaxel))뿐만 아니라, DNA 손상 약물 (미토산트론 (Mitoxantrone), 독소루비신 (Doxorubicin) 및 시스프라틴 (Cisplatin))에 교차-내성을 나타낸다 (데이터에 나타내지 않음).
올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이 (oligonucleotide microarray)를 사용하는, 세포 발현 증식은 민감도 (DU145 및 22RV1-모세포) 및 획득된 내성 (DU145-DR 및 22RV1-DR) 전립선암 세포와 비교하여 수행된다. 전사 발현에서 적어도 2배 증가 또는 감소를 갖는 유전자는 또 다른 분석법을 위해 선택된다. 이러한 분석법은 247 유전자가 오버랩된, 각각의 DU145-DR 및 22RV1-DR 세포에서 1245 및 990 조절되지 않는 유전자를 개시한다 (도 2a 좌측). 이들 오버랩핑 유전자의 29.5%는 상향-조절되고, 70.5%는 하향-조절된다. 놀랍게도, 일반적으로 조절되지 않은 247 전사의 생물학적 공정의 유전자 어휘 분류체계 카테고리 평가는 세포 증식, 세포 사멸, 및 약물 반응 생물학적 공정에 대한 예상된 농축 외에, 개발 및 면역 탐색 카테고리가 상당하게 나타내는 것을 보여준다 (도 2a 우측). 전립선암 생물학 및 줄기세포성에서 유전자의 관련성은: a) 상피 분화 바이오마커-사이코케라틴 (CK18 및 19), 및 안드로겐 수용체 (AR), 전립선 특이 항원 (PSA) 및 전립선 특이 막 항원 (PSMA)과 같은 전립선 특이 마커; b) 면역-감시 항원 - 주요 조직적합성 복합체 계 I (MHC 계 I); 및 c) 줄기세포성 신호 경로 - VVnt/β-카테닌, Notch 및 Hedgehog를 포함하는 상향-또는 하향-조절된 것에서 발견된다. 선택된 유전자의 관련성은 하기 표 1 및 2에 나타내었다. 20 개의 전이성 전립선암 환자의 조직 샘플의 임상병리학적 및 표현형적 특성뿐만 아니라, 특정한 사이토구조적 유전자 및 신호 경로의 전사 수준은 하기 표 3에 요약된다.
[표 1]
Figure pct00001
[표 1 계속]
Figure pct00002
[표 2]
Figure pct00003
도세탁셀 내성 세포 (DU145-DR 및 22RV1-DR)에서 상향- 또는 하향-조절되어 발견된 유전자는 이들의 모세포 민감 세포 (DU145 및 22RV1)과 비교하여 표 2에 요약되었다. 대수 표준화 (logarithmic normalization)에 기초하여 >2배 변화를 나타내는, 유전자의 평균 발현 평균차의 통계적 분석법은, 매치된 민감도 및 내성 세포 사이의 t-시험을 사용하여 수행된다. 상피 분화, 전립선 특이 마커 및 면역-감시 마커에 포함된 유전자의 전사 수준에서 감소가 있다. 한편, 개발 전사 요인의 유전자 전사는 상향-조절된다.
[표 3]
Figure pct00004
웨스턴 블럿 (도 2c) 및 면역형광 분석 (도 2d 및 2f)에 의해 이들 유전자의 단백질 검증은 획득된 내성 세포가 상피 분화 단백질, 전립선 특이 바이오마커, 및 면역 감시 항원에서 감소를 갖고, 발생 신호 경로의 활성 (핵 발현) (도 2d)을 나타내는 것을 확인하였다. 활성 β-카테닌, Gli1 , Gli2 및 절단된 NOTCH-2는 도세탁셀 내성 세포를 주로 세포질의/막의 발현을 나타내는, 모세포 민감 세포와 비교한 경우, 핵 면역위치 (immunolocalization)뿐만 아니라 단백질 발현에서 상당한 증가를 보인다. 더구나, 이들 표현형은 역으로 획득된 내성 세포가 분화된 표현형을 회복한 이후로, 항암제 저항성 현상에 연계될 수 있는 것으로 확인된다 (도 13).
분화에 대한 연구와 관련하여, AR, PSA 및 PSMA을 포함하는, 전립선-관련 바이오마커뿐만 아니라, 상피 마커로서 사이토케라틴 (CKs)의 발현은 평가된다. CKs는 신호 전달 및 세포의 분화 공정에서 기능을 하는 동안에, 세포 통합성 (integrity)의 유지에서 역할하는, 인간 분화된 상피 세포에 대해 특이적일 수 있다는 것이 예전에 보고되었다 (Brulet et al., 1980; Lu et al, 1980; Oshima et al., 1981 ; Tesar et al., 2007). 저분자량 CKs (예를 들어, CK18, 및 CK19)는 관강 (luminal) 정상 인간 전립선 세포 및 전립선암에서 특이적으로 발현되고, 반면에, 고분자량 CKs (예를 들어, CK5 및 CK10)는 기초 정상 전립선 세포에서 확인되고, 암 세포군에서 드물게 관측된다 (Ali et al., 2008). 도세탁셀 내성 세포는 저분자량 CKs의 유전자 전사 및 단백질 발현 모두에서 상당한 감소를 나타낸다. DU145-DR 세포는 CKs 19 및 18 각각의 단백질 발현에서 6.25 및 16.6 배 감소를 나타낸다. 유사하게, 22RV-DR는 민감성 모세포와 비교 및 정량화한 경우, 이러한 CKs에서 14.3 및 6.7배 감소를 나타낸다. CK19 및 CK18의 면역형광 염색은 도세탁셀 내성 세포에서 이들의 감소된 발현을 확인하였다 (도 2). 더구나, 고분자량 CKs는 도세탁셀 내성을 획득하는 공정에서, 세포가 상피 분화 마커를 상실하는 것으로 나타나는, 이들의 상응하는 모세포 (데이터는 나타나지 않음)에서와 같이 상기 도세탁셀 내성 세포에서 감지될 수 없는 것으로 계속되고, 관강 (저분자량 CK)으로부터 기초-유사 (고분자량 CK) 표현형으로 이동을 진행하지 않는다. 더구나, AR, PSMA 및 PSA을 포함하는, 전립선-관련 분화 마커를 발현하는, 22RV1 세포는 도세탁셀에 노출된 경우 이러한 마커의 유전자 및 단백질 발현 수준의 극적인 감소를 나타낸다. 22RV1-DR 세포는 AR, PSMA 및 PSA의 단백질 발현에서 각각 16.6, 20.0 및 11.1 배 감소를 나타낸다. 이들 결과는 면역형광 분석법 (데이터 나타내지 않음)에 의해 더욱 확인된다.
면역 회피 (immune evasion)의 메커니즘에 관하여, 도세탁셀 내성 세포가 MHC 계 I 분자의 조절되지 않는 것을 나타내는 것을 확인하였다. 이것은 세포독성 T 임파구 (cytotoxic T lymphocytes) 및 이후에 종양 세포 용해작용에 효과적인 항원 제시 (presentation)을 위해 중요한, MHC 계 I 항원이, 유전자 전사 및 단백질 수준 모두에서 하향-조절되는 것으로 관측된다 (도 2). 유전자 발현 프로파일은 모든 MHC 계 I 항원 (A, B, C, E, F, G)에서 상당한 하향-조절을 나타내는데, 이것은 MHC 계 I 항원 A, B, C의 면역 블럿팅 및 면역형광 염색에 의해 단백질 수준에서 확인된다 (도 2). 따라서, 이들 세포는 숙주 면역계에 의해 감지되지 않는 것을 만드는, 면역 회피를 선호하는 표현형을 나타낸다.
줄기 세포 표현형 연구에 관하여, VVNT/β-카테닌, Notch 및 Hedgehog의 확인된 조절되지 않는 발현은 특징화된다. 이들 경로는 전구 (progenitor) 세포의 자가-재생 및 분화에 관련되어 있다 (Katoh et al., 2007; McDonald et al., 2006; van den Brink et al., 2004; Radtke et al., 2006; Leong et al., 2008; and Grigoryan et al., 2008). 상기 전립선에 있어서, 이들 신호 경로는 발생 패턴닝 (developmental patterning), 상피 재발생 (epithelial regeneration), 및 전립선암 종양발생원 (tumorigenesis)에 필수적인 역할을 한다 (Wang et al., 2006, Karhadkar et al., 2004). 도세탁셀 내성 세포는 VVNT/β-카테닌 신호 네트워크의 억제제로 잘 알려진, VVNT 억제제 Dickkopf-I (DKKI)의 유전자 전사 및 단백질 수준 모두에서, 상당한 감소를 나타낸다 (Fedi et al., 1999). DKK1 발현에서 이러한 감소는 탈-인산화 (de-phosphorylated) (활성) β-카테닌의 발현에서의 증가와 연관되고, 이것은 β-카테닌 신호의 주요 작동자 (effector)이다. 면역형광 분석은 모 도세탁셀 민감 세포가 부착 분자 (adhesion molecule)로서 이의 기능과 연관된, β-카테닌의 막 발현을 나타내고, 반면에 도세탁셀 내성 세포는 표준적인 (canonical) β-카테닌 신호 경로의 활성을 위해 필수적이라고 보고된, 이 단백질의 뚜렷한 핵 위치 (도 2)를 나타낸다 (Willert et al., 2006). 더구나, 도세탁셀 내성 세포는 또한 NOTCH 신호 네트워크에서 증가를 나타낸다. NOTCH2 유전자 전사 수준은 상기 내성 세포에서 상당히 증가되고, 상기 단백질의 핵 전이위치 (translocation)와 연관된 절단된 Notch2 단백질 발현에서 증가하는 것과 연결되고, 여기서 이것은 이의 전사적 활성에 영향을 미친다 (도 2). 최종적으로, 도세탁셀 내성 세포는 종양 유전자 (oncogene) 호모로그 전사 요인, Gli1 및 Gli2과 연관된 신경교종 (glioma) 및 Hedgehog 수용체 패치 (Patched)의 증가된 발현을 갖는다. 이들 발견은 Hedgehog 경로 활성에 관련된 상태인, 전술된 전사 요인의 핵 전이위치 (도 2) 및 증가된 단백질 발현과 관련된다. 놀랍게도, CD44 및 CD133과 같은, 다른 보고된 줄기 세포 표면 마커는 유전자 전사 및 단백질 수준 (데이터 나타내지 않음) 모두에서 분석된 바와 같이, 이러한 연구에서 상향-조절된 것으로 발견되지 않는다.
도세탁셀 내성 세포가 줄기세포성과 일치하는 표현형을 나타낸다는 사실에 기초하여, 이들 세포가 모세포보다 더 높은 종양 개시 능력을 나타내는지 아닌지는 시험된다. 102 및 103 도세탁셀 내성 세포 (22RV1-DR 및 DU145-DR)의 NOD/SCID 쥐에서 피하 주입은 이들의 모 민감성 세포보다 더 많은 종양을 상당하게 증가시킨다 (도 2e). 102 DU145-DR 및 22RV1-DR 세포의 주입은 수용체의 각각 83.3±7.8% 및 79.0±10.4%에 종양 형성을 유도하고; 반면에 모세포 DU145 및 22RV1 세포의 주입은 오직 38.8±15.2% 및 46.0±9.3% 각각에 종양 형성을 유도한다 (p<0.0001). 더구나, 비록 104 모세포 및 내성 세포가 주입된 경우, 종양 형성에서 차이점은 없을지라도, 종양 잠복성은 상기 내성 세포에 대해 상당하게 더 짧다. DU145 모세포에 대한 종양 잠복성은 내성 세포에 대해 59.2±4.9일 대 43.2±2.6일이다 (p<0.0001). 유사하게, 종양 잠복성은 내성 세포 (35.3±1.9일)와 비교하여 22RV1 세포 (54.9±1.5일)에 대해 상당히 더 길다 (p<0.0001). 따라서, 도세탁셀 내성 세포의 줄기세포성 분자 지표 (molecular signature)는 이들의 높은 종양 개시 능력에 의해 기능적으로 보강된다.
실시 예 2
전립선암 줄기-세포의 동정 및 특징화
생성된 도세탁셀 내성 세포의 줄기세포성 지표 및 더 높은 종양 개시 능력을 고려하여, 항암제 저항성 현상이 줄기세포성 특징을 갖는 내성 세포의 민감성의 전환 때문인지 아닌지, 또는 선택적으로 만약 화학요법이 미리-존재하는 전립선암 줄기 세포를 위해 선택될 수 있는지를 조사한다 (도 3c). DU145 및 22RV 도세탁셀 내성 세포가 일반적으로 CK19 및 CK18, 및 MHC 계 I항원의 하향-조절이 나타내기 때문에, CK-음성/HLA계 I-음성 표현형을 갖는 세포가 이미 상기 모 세포주에 존재하는지 아닌지를 결정한다. 면역형광 염색은 세포주 모두에서 작은 CK-음성/HLA계 I-음성 특정형질군의 존재를 나타내고, 이것은 유동세포 분석 (도 4b)에 의해 정량화된 경우, DU145 및 22RV1 모세포의 총 군의 2.19 ± 0.95% 및 3.58 ± 0.79%을 각각 나타낸다.
상기 확인된 CK-음성/HLA계 I-음성 종양 세포가 도세탁셀 노출에 생존할 수 있는지 어떤지를 연구하고, 따라서 획득된 항암제 저항성 현상을 담당한다. 이러한 목적을 위하여, DU145 모세포는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현 CK19 구동의 프로모터를 함유하는 혈장으로 안정하게 형질감염된다 (도 14a 및 14b). DU145 모세포는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현 CK19 구동의 프로모터를 함유하는 혈장으로 안정하게 형질감염된다 (도 6a). CK 9 및 GFP의 공-발현은 유세포 분석 및 면역형광에 의해 확인된다 (도 6b). CK19 발현된 세포는 GFP 양성 (GFP+)이고, 반면에 CK19 발현되지 않는 세포는 GFP 음성 (GFP-)이다. 더구나, CK19/GFP 음성 세포에서 프로모터 구조체의 안정한 삽입 (insertion)은 PCR에 의해 확인된다 (도 6C). 부가적으로, 이들 CK19/GFP 음성 세포가 유세포 분석 및 면역형광에 의해 모두 HLA 음성이라는 것을 입증하였다 (도 6d).
미분류된 DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포는 접종되고 도세탁셀 (10 nM)에 노출되고, 생물 사진 (live imaging)은 48 시간 이상의 기간 동안 수행된다. 최종 사진은 도세탁셀 노출이 치료하에서 분열 및 존재하는 유사분열 (mitosis)을 할 수 있는, GFP-음성 표현형으로 세포를 위해 선택되는 것을 나타내고, 반면 GFP-양성 세포는 유사분열 정지 (mitotic arrest) 후에 사멸된다 (도 5b). 유세포 분석은 도세탁셀 처리가 이들 각각 표현형을 기초로 생존하는 세포의 집단에서 의미 있는 이동이 결과되는 것을 나타낸다 (도 5c). GFP-양성 표현형을 나타내는 개시 세포가 총 집단의 87.5 ± 10.4%를 나타내는 동안, 처리 후 총 세포군의 오직 28.3 ± 10.6%만을 구성하는, 감소된 이러한 표현형이 관측된다 (p<0.001). 반대로, GFP-음성 표현형을 갖는 세포는 처리 후 총 집단의 6.4 ± 4.3%에서 73.1 ± 10.2%로 비례적으로 증가된다 (p＜O.001). GFP-음성/HLA계 I-음성 표현형을 갖는 종양 세포만이 도세탁셀에 연속적으로 노출된 경우 콜로니를 형성할 수 있기 때문에, DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포의 콜로니 형성 분석은 이들 결과가 확인된 GFP/HLA계 I 발현에 의해 분류된다 (도 5d). GFP-음성 표현형을 갖는 종양 세포만이 도세탁셀에 연속적으로 노출된 경우, 클론을 형성할 수 있디 때문에, 콜로니 형성 분석은 이들 결과를 확인한다 (도 5d). 따라서, 상기 결과는 표준 화학요법에 의해 남겨지고 종양 재발의 원인이 될 수 있는, 미분화된 표현형 (CK-음성/HLA계 I-음성)을 갖는 세포군의 존재를 강조한다.
이것은 또한 CK-음성/HLA계 I-음성/GFP-음성 표현형을 갖는 종양 세포의 특정형질군이 비대칭 세포 분열을 통해 분화시키기 위한 독특한 줄기 세포 특성을 갖는다는 것을 입증하였다. 미분류된 DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포를 접종하는 경우, 이것은 이러한 공정을 통한 GFP-음성 세포가 분화의 프로그램 (GFP-양성)으로 들어가는 딸세포를 일으키는 것을 관측하였고, GFP-음성 세포가 이것의 본래의 본성 (identity)을 유지하는 반면, 반대로, GFP-양성 표현형을 나타내는 세포는, 모든 딸세포가 동일한 특성을 소유하기 위해 연속하는 것을 의미하는, 대칭적으로 분열된다 (도 6a). 4주 동안 배양된 DU145-CK19 프로모터-GFP 안정한 GFP 분류된 세포의 유세포 분석은 4 주 후, GFP-음성 분류된 세포로부터 분화된 세포가 분화된 (GFP+) 세포에 의해 주로 구성되고, 반면 GFP-양성 분류된 세포로부터 성장된 세포는 분화된 표현형을 유지한다는 것을 나타낸다 (도 6b). 따라서 이러한 결과는 CK-음성/HLA계 I-음성 세포가 모 세포주 안에 종양 세포군의 소수로 나타나고, 반면 분화된 악성세포의 다수는 이러한 총 세포군의 주요 부분을 구성한다는 사실을 설명한다.
최종적으로, 세포의 확인된 특정형질군에서 종양 개시의 기능성 암 줄기 세포 특성은 설명된다. DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포는 GFP/HLA계 I 발현에 의해 분류되고, 세포의 얻어진 GFP 분류된 특정형질군은 면역 결핍 (immunodeficient) NOD/SCI D 쥐에게 피하 주사되고, GFP-음성/HLA계 I-음성 세포만이 종양 개시 능력을 나타낸다 (도 6c). GFP-음성 표현형을 갖는 10 개의 세포의 주입은 수용체의 63.0 ± 14.6%에서 종양이 생성되는 반면, 종양 형성이 GFP-양성 세포의 동일한 양을 주입한 후 관측되는 종양 형성은 없다 (도 6d).
DU145 CK-음성/HLA계 I-음성/GFP-음성 표현형 세포만이 종양 개시 능력을 나타낸다는 관측된 발견을 더욱 확인하기 위하여, 모 세포주 (DU145 및 22RV1)는 표면 마커 HLA계 I 항원의 발현을 기초로 분류되고, 이들의 종양 개시 능력은 시험된다 (도 13 및 15). GFP-음성 세포로 얻어진 결과와 유사하게, 오직 HLA 계 I-음성 세포만이 희석 분석 후 종양 개시 능력을 나타낸다. 10개의 HLA계 I-음성 DU145 및 22RV1 세포의 주입은 각각 수용체의 83.3±19.1% 및 100%에서 종양을 생산하고, 반면 HLA계 I-양성 표현형을 나타내는 10 개의 세포로 주입 198일 후 관측되는 종양 형성은 없다. 유사한 결과는 종양 이종이식 생성된 HLA계 I-음성으로부터 일련의 이식 후 얻어진다 (데이터를 나타내지 않음).
따라서, 종양 개시의 기능성 암 줄기 세포 특성은 CK-음성/HLA계 I-음성 표현형을 갖는 세포의 특정형질군에 대해 내재한 것이다. 더구나, 종양 개시 능력이 부여된 세포에 부가하여, HLA계 I-음성 세포는 또한 HLA계 I-양성 세포와 비교한 경우 통계적으로 상당히 더 높은 클론가능 (clonability) 능력을 나타낸다 (도 8). 가장 중요하지만, 놀랍지는 않은, 이종이식된 GFP-음성 세포로부터 생성된 종양은 분화된 (GFP-양성/CK-양성/HLA-양성) 표현형을 나타내고 (도 6c), 총 종양 군의 3.93±0.85%을 차지하는 GFP-음성/HLA-음성 세포의 작은 집단을 보유한다 (도 16).
생체 외 및 생체 내에 결과, 모두는 종양 개시 능력을 갖는 CK-음성/HLA계 I-음성 표현형을 갖는 세포군을 확인하고, 이것은 비대칭 세포 분열을 통해 분화된 세포를 갖는 진화하는 종양 (evolving tumor)이 압도적으로 분포된 전이 증폭 증식성 세포 (transit amplifying cologen)를 발생한다. 따라서, 전립선암 줄기 세포의 발견을 확인한다. 새롭게 생성된 도세탁셀 내성 세포의 종양 개시 능력 및 줄기 세포성 지표를 포함하는, 전술된 결과의 모두를 고려하여, 화학요법이 전립선암 줄기 세포의 농축을 유도한다는 가설이 있다 (도 9a). 도세탁셀 내성 세포가 CK19 및 CK18을 포함하는, 상피 분화 마커의 하향조절을 나타내기 때문에, 세포의 CK-음성 집단이 모 세포주에서 초기에 정량화된다. 유세포 분석법은 산재된 CK19 및 CK18 음성 특정형질군을 보유한 모 세포 모두에서 나타난다 (도 6a). 22RV1 세포는 3.4% CK9 및 4.7% CK18 음성 세포를 나타낸다. 유사하게 DU145 세포는 2.1 % CK19 및 2.3% CK18 음성 세포를 나타낸다. 더구나, 22RV1은 2.6%을 갖고, DU145는 CKs와 공-염색된 경우 1.3% CK 음성 세포를 갖는다. 따라서 면역 형광 염색은 CKs 모두와 공-발현되는 도미넌트 (dominant) 특정형질군 및 드문 CK 음성 특정형질군의 존재를 확인한다.
실시 예 3
인간 전립선암 종양 샘플에서 암 줄기 세포의 동정 (확인)
전술된 관점에 있어서, 상기 확인된 전립선암 줄기 세포군이 인간 전립선암 조직 샘플에 존재하는지의 여부를 조사한다. 전이 (metastases) (n=20) 및 매치된 1차 (n=6) 인간 전립선암 조직의 면역 조직 화학적 (Immunohistochemical) 연구는 CK-음성 종양 세포의 산재된 특정형질군을 보여준다 (도 7a). 이들 세포는 또한 HLA계 I 항원에 대해 음성이고 (도 7b), 주요 발생 전사 요인의 활성을 나타내며 (도 7c) 및 생체 외 연구에서 미리 관측된 줄기 세포성 지표에 상응하는 전립선-관련된 분화 마커의 발현이 결핍된다 (도 7d).
분석된 모든 인간 전립선암 종은 1차 및 전이 장애에서 각각 모든 종양세포의 0.05% 내지 0.3% 및 0.4% 내지 1.8%을 차지하는, CK-음성 (CK18 및 CK19) 종양 세포의 산재된 특정형질군을 함유한다. 다음, 면역형광-계 이중 염색은 CK 발현 및 관심의 마커 사이에 관계를 평가하기 위해 수행된다. 이러한 분석에 있어서, CK 발현은 HLA계 I 발현에 상당히 관계되어 있다는 것을 관측하였다 (p＜O.0001). 더욱 특별하게는, CK-음성 종양 집단이 상기 세포의 97.8 ± 0.7%에 HLA계 I 항원이 발현하지 않는다는 것을 관측하였다. 그럼에도 불구하고, CK-양성 세포의 모두 (100%)는 양성 HLA계 I 항원 표현형을 나타낸다 (도 7b). 더구나, CK-음성/HLA-음성 종양 세포가 분화된 CK-양성/HLA-양성 세포와 비교된 경우 발생 전사 요인의 핵산 발현 (활성)의 상당한 증가 (p<0.0001)를 갖는다는 것을 확인하였다. CK-음성/HLA-음성 세포는 세포의 63.9 ± 22.6%에서 탈-인산화된 β-카테닌, 72.8 ± 15.1%에서 절단된 Notch2, 67.5 ± 17.3%에서 Gli1, 및 67 ± 17.3%에서 Gli2의 핵 발현을 나타내는 반면, CK-양성/HLA-양성 세포는 세포의 5.8 ± 11.9%만이 탈-인산환된 β-카테닌, 6.7 ± 7.9%에서 절단된 Notch2, 1.2 ± 7.9%에서 Gli1 및 1.5 ± 10.6%에서 Gli2로 발현된다 (도 7c). 더구나, CK-음성/HLA계 I-음성 종양 세포가 핵 AR의 발현이 없는 것을 나타내는 반면, CK-양성/HLA-양성 세포는 세포의 71.8 ± 14.3%로 핵 AR을 나타내는 것이 관측된다 (도 7d). 따라서 전립선암 줄기 세포가 양성 AR 표현형을 나타내지 않는다는 사실이 이들 세포가 기능적 AR 신호에 의존할 수 없다는 것을 제안하고, 이것은 어떻게 이들 세포가, 미래의 연구에 추구해야될 주제인, 호르몬-치료 후 관측된 재발을 담당할 수 있는지를 설명할 것이다. 종합하면, 이들 결과는 인간 전립선암 조직 샘플에서 전립선암 줄기 세포의 특정형질군을 확인하기 위한 능력 및 존재를 확인한다.
암 줄기 세포군이 1차 및 전이성 전립선암 모두에서 확인된 것은, 일련의 실험이 신선한 인간 종양 샘플로부터 이러한 세포군의 종양 형성 능력을 조사하는 것에 목표를 두어 설계되는 것을 제공한다. 이러한 표현형을 갖는 전립선암 세포가 종양 개시의 원인이 되는지의 여부를 평가하기 위하여, 1차 전립선암을 위한 방사선 전립선 절제 수술을 수행한 환자 48명으로부터 종양은 얻어진다 (표 4). 세포는 세포 표면 마커 HLA계 I의 발현에 기초한 유세포 분석에 의해 추출된다 (도 9a). 이러한 분석법은 모든 1차 전립선암 샘플이 총 집단의 98.9 ± 0.35% (98.7%-99.5% 범위)의 중간을 차지하는 HLA계 I-양성 세포에 의해 주로 구성된다는 것을 나타내는 반면, 세포 중간 1.2 ± 0.65% (0.5%-1.5%범위)의 작은 퍼센트는, 보고된 면역조직화학적 발견에 동의하는 결과인, HLA계 I-음성 표현형을 나타낸다. 다음, 마트리겔 (Matrigel)과 혼합된 HLA계 I-음성, HLA계 I-양성 및 미분류된 세포의 동일한 수 (10,102, 및 103)은 NOD/SCID 쥐에 주입된다. 전체적으로, 48 개 종양이식 종양의 4 (8.3%)는 35 주의 중간 이후 시간 후 초기 전립선암 세포의 주입으로 발생다 (21.0-45.3 범위). 20.8 주 (9.3-39.6 범위) 및 HLA-음성 세포만이 HLA-양성 세포와 비교된 경우, 일련의 이식에 따른 이들의 종양 형성 잠재성을 유지할 수 있다 (도 9b 및 하기 표 5).
[표 4]
48 주입된 신선한 인간 1차 전립선 종양에서 HLA-음성 세포의 퍼센트 및 임상-병리학적 특징
Figure pct00005
표 5는 초기 전립선암 조직으로부터 10, 100 및 1000 HLA계 I 분류된 및 미분류된 세포가 주입된 경우, 종양 발생 (tumour incidence) (종양/주입) 및 몇 주동안 (평균± SD) 종양 잠복에 의해 측정된 종양 개시 능력을 요약하였다. 각 분류된 세포군 및 세포 희석에 대해 4마리 쥐는 상부 옆구리 (HLA-음성) 및 하부 옆구리 (HLA-양성)에서 두 번 주입된다. 각 종양 견본으로부터 미분류된 세포는 또한 주입된다.
[표 5]
Figure pct00006
103개 세포의 1차 주입 후, HLA-양성 세포와 비교된 경우 (12.5±17.6%), 의미 있는 더 높은 종양 개시 능력이 HLA-음성 분류된 세포로부터 있고, 상기 HLA-음성 이종이식에서 더 낮은 종양 잠복성에 연관된다는 사실 (14.2±4.5 대 24.6±3.1 주)이라는 것을 관측하였다. 더군다나, 102 및 103 세포로 추가 희석이 HLA-음성 세포만이 종양 개시 능력을 부여된다는 것을 밝혀냈다. 이들 관측은 102 및 103 분류된 세포의 주입이 세포의 HLA-음성 특정형질군에 한정되는 종양 발생을 입증하기 위하여 계속되는 2차 이식 실험에 의해 확인된다 (도 9b). HLA-양성 세포는 종양 개시 능력을 보유하기 않기 때문에, HLA-양성 세포로부터 드물게 생성된 이종이식으로부터 HLA 분류된 세포의 2차 주입은 이러한 결과로 확인된다. 조직학적 및 면역-조직화학적 분석은 HLA-음성 분류된 세포로부터 유도된 종양이 상피 및 전립선 연관 마커 (CK 및 AR)뿐만 아니라, 이들의 종양 세포의 대다수에서 HLA계 I 항원의 발현을 나타내는, 원래의 1차 인간 종양의 표현형을 충실하게 재생된다는 것을 밝혔다 (도 9c). 따라서 이들 결과는 HLA-음성 집단이 NOD/SCID 쥐에서 전립선암 이종이식을 시작할 수 있고, 및 대부분 인간 암의 표현형 이종혼교성 (heterogeneity) 구별 및 분자를 재생할 수 있는 세포에 농축된다는 것을 나타낸다.
더구나, HLA-음성 종양 세포가 NOD/SCID 쥐에 연속적으로 주입된 경우 종양 개시의 원인이 되는, 장, 유방, 폐, 및 방광 암종 (carcinoma)를 포함하는, 신선한 인간 고형 신생물 (neoplasm)의 다양성으로부터 추출되기 때문에, 이것은 보편적인 현상으로 보인다 (도 9d, 및 하기 표 6). 전체적으로, 장 10분의 4 (40%), 폐 10분의 2 (20%), 유방 12분의 2 (16.6%) 및 방광 18분의 2 (11.1%) 이종이식 종양은 신선한 인간 종양 샘플의 주입으로부터 발생한다. 다른 1차 고형 종양 타입의 특징은 하기 표 7에 나타내었다. 다른 고형 암 조직 타입으로부터 HLA 분류된 세포의 종양 잠복성 및 종양 개시 능력은 하기 표 8에 나타내었다.
[표 6]
Figure pct00007
[표 7]
1차 고형 종양 타입의 특징
Figure pct00008
[표 8]
다른 고형 암 조직 타입으로부터 HLA 분류된 세포의 종양 개시 능력 및 종양 잠재성
Figure pct00009
표 8은 다른 1차 종양 조직 타입으로부터 100 개의 HLA계 I 분류된 세포가 주입된 경우, 종양 발생 (종양/주입) 및 몇 주 동안 종양 지연 (평균± SD)에 의해 측정된 종양 개시 능력을 요약하였다. 각 분류된 세포군 및 세포 희석에 대해 4마리 쥐는 상부 옆구리 (HLA-음성) 및 하부 옆구리 (HLA-양성)에서 두 번 주입된다.
1차 주입 후, 102 HLA-음성 세포의 종양 개시 능력은 HLA-양성 분류된 세포와 비교된 경우 상당히 더 높다. 더욱 중요하게는, 일련의 이식을 수반하는, HLA-음성 세포만이 종양 형성 능력을 보유하는 반면, HLA계 I-양성 세포는 그렇지 못하다. 더구나, HLA-양성 세포로부터 생성된 이종이식으로부터 분류된 HLA-양성 세포의 2차 주입은 종양 개시 능력을 보유하지 않는다. 세포 분류 동안 HLA계 I-음성 세포의 오염의 가능성 때문에, 비록 HLA계 I-양성 세포가 일련의 이식 후 유지될 수 없는 낮은 종양 개시 능력을 가질 수 있다는 것을 제외할 수 없다고 하더라도, HLA계 I-양성 세포로부터 종양의 생성은 일어날 수 있다. 발생 이종이식 종양의 조직학적 분석법은 이들의 상응하는 인간 1차 암보다 유사한 모폴로지 특성을 나타낸다 (도 9e). 따라서, 종양 개시 능력을 갖는 HLA-음성군은 전립선암에 부가하여, 인간 상피 종양 타입에서 확인되었다.
최종적으로, 신선한 인간 조직 샘플로부터 세포의 종양 개시 능력은 암 환자의 임상-병리학적의 어떤 분석과도 관련되지 않고, HLA-음성 세포의 퍼센트와도 관련되지 않는다. 공격적인 임상-병리학적 특성을 갖는 종양 (예를 들어, 고 등급, 높은 종양 단계) 또는 HLA-음성 세포의 높은 수/퍼센트를 갖는 종양은 의미 있게 더 높은 종양 개시 능력을 소유하지 않는다. 더구나, HLA-음성 세포의 퍼센트 및 종양 단계 또는 종양 등급 사이에서 관측되는 연관성은 없다.
실시 예 4
인간 암 줄기 세포를 표적화
상기 확인된 암 줄기 세포가 Hedgehog 및 Notch 경로 활성을 나타낸다는 사실을 근거로, 시험은 이러한 경로의 억제가 암 줄기 세포 항상성 (homeostasis)을 손상시킬 수 있는 지의 여부를 알기 위해 수행된다. 이러한 목적을 위하여, Smo의 수준에서 작용하는, 식물 유도된 Hedgehog 경로 길항제 (antagonist)인, 사이클로파민은 사용된다 (Taipale et al., 2000; Karhadkar et al., 2004; Chen et al., 2002). 화합물 E는 Notch 수용체의 단백질 분해 공정을 억제하는 높은 활성 감마-세크리테아지 억제제 (gamma-secretase inhibitor)이다 (Seiffert et al., 2000). 생체 외 실험을 위하여, 생체 내 활성에서 설정된 높은 활성 감마-세크리테아제 억제제인, DBZ는 하기에 설명된 생체 내 실험에서 화합물 E의 대체물로서 사용된다 (van Es et al., 2005).
DU145 및 22RV1로부터 각각 개별적 억제제로 CK-음성/HLA-음성 암 줄기 세포군의 노출은 어떤 주요 효과를 유도하지 않는다. 그러나, 두 제제가 함께 투여된 경우, 서브-G-1에서 세포의 축척을 갖는 세포주기 진행에서 로버스트 (robust) 억제가 관측되지만, 이러한 효과는 분화된 (CK-양성/HLA-양성) 세포 (도 10a)에서 소수이다. 덱사케타손은 생체 내 실험에서 감마-세크레타제의 거트 독성 (gut toxicity)을 감소시키기 위해 사용되기 때문에, 전술된 억제제와 조합에서 덱사메타손의 생체 외 효과는 분석된다 (Real et al., 2009). 이러한 분석은 덱사메타손이 Hedgehog 및 Notch 억제제의 세포주기 효과를 변화하지 못하는 것을 나타낸다 (데이터는 나타내지 않음). 더구나, Hedgehog 및 Notch 억제제가 조합된 경우 21일 후 형성된 콜로니가 없기 때문에, 이들 약물의 조합된 효과는 또한 콜로니 형성 분석에 의해 확인된다 (도 10b). 다음, 이들 경로의 억제가 생체 내에서 암 줄기 세포의 종양 개시 능력에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위하여, 103 DU145 및 22RV1 CK-음성/HLA-음성 세포가 NOD/SCI D 쥐에서 피하 주입되고, 비히클 용액 (대조구), 덱사메타손 단독, 이중 조합 (예를 들어, 덱사메타손 및 사이클로파민) 또는 상기 약물의 삼중 조합 (덱사메타손 및 사이클로파민 및 DBZ)으로 처리된다. 삼중 조합으로 처리된 쥐는 DU145 이종이식에서 5.1 주 및 22RV1 이종이식에서 3.8 주의 종양 1차 촉진가능성 (palpability)에서 상당한 지연 (p<0.05)을 나타내는 반면, 이러한 종양 지연은 Hedgehog 또는 Notch 억제제 단독으로 처리된 쥐에서는 의미 있게 나타나지 않는다 (도 10c).
최종적으로, 이들 화합물의 종양 개시 억제 효과는 인간 전립선암 조직으로부터 유도된 이종이식에서 시험된다. 이종이식 #5, #9 및 #12로부터 103개의 HLA-음성 분류된 세포는 NOD/SCI D 쥐에 주입되고, 전술한 바와 같이, 동일한 스케줄 및 Hedgehog 및 Notch 억제제의 조합으로 처리된다. 상기 세포주에서 전에 관측된 바와 같이, 오직 Hedgehog 및 Notch 억제제로 조합 처리는 종양 개시를 의미 있게 (p<0.05) 지연시킨다 (도 10d). 약물의 삼중 조합으로 처리된 쥐에서 종양 이종이식은 이들의 상응하는 대조구에서 13.8±2.5, 10.3±1.5 및 16.6±2.5 주와 비교하여, 18.3±3.1, 13.8±2.5 및 20.1 ±3.3 주 후에 1차 손으로 만져 본다.
종합하면, 이들 결과는 이들 발생 경로의 억제가 종양 개시를 지연하는 암 줄기 세포군을 표적으로 한다는 것을 나타낸다.
종양 개시와 연관된 두 개의 주요 가설이 추정된다. 모든 신생물성 세포가 완전한 새로운 종양을 생성할 수 있다고 예측하는 "통계적 모델 (stochastic model)"; 및 종양 세포가 적층 상태 (hierarchical state), 및 몇몇 줄기 세포가 종양 개시 잠재력을 보유한다는 제안을 하는 "암 줄기 세포 모델"이 있다. 인간 암 줄기 세포의 동정 및 기능적 특성은 개시되고, 이것은 다음의 줄기세포성 기준 (criteria)을 충족시킨다; 1) 자가-재생 및 비대칭 세포 분열을 통한 분화, 2) 종양 개시 능력, 3) 음성 조직적합성 지표, 및 4) 다중약물 내성 표현형.
HLA-음성 표현형은 또한 배아 줄기 세포에 의해 공유된다. 이것은 인간 전-이식 (implantation) 배아가 HLA계 I 및 계 II 음성이라고 보고되었다 (Desoye et al., 1988). 이러한 현상은 돼지태반 (placenta)인 상황에 있어서, 혈액-조직 배리어 (blood-tissue barrier)가 발생할 때까지, 모세포 항원의 발현을 기초한 거부 (rejection)를 방해한다. 암 줄기 세포의 상황에 있어서, 암 줄기 세포가 면역-감시 (immune-surveillance)를 벗어날 수 있기 때문에, 종양 퍼짐 및 전이성 (metastatogenic) 능력뿐만 아니라, 숙주 변이 허용을 설명하기 때문에, 이러한 조직적합성은 주요 임상 결과 (implications)를 갖는다.
종양 개시 능력에 관하여, 확인된 CK-음성/HLA-음성 암 줄기 세포만이 생체내에서 종양을 생성하지만, 분화된, CK-양성/HLA-양성 자손은 이러한 특성이 결핍된다는 것이 개시되었다. 그러나, 피하 주입이 또 다른 조사가 필요한 현상인, 동소 이식 (orthotopic implantation)에 대한 필요없이 조직의 기원 (tissue-of-origin) 표현형을 수여하기 때문에, 이들 암 줄기 세포는 특정한 기질 (stroma) 상호작용의 유전적 기억 독립성을 나타내는 것으로 나타났다. 더구나, 이들의 동종 표현형 때문에, 이들 세포가 유전적으로 안정하고, 이들의 정지 상태 및 비대칭 분열에 의해 촉진된 특성이라고 가정된다. 분자 이종 (heterogeneity)이 필수적으로 종양 확장 및 분화된 암 세포군의 생산물일 수 것이고, 아마도 종양형성에 대한 중요하지 않기 때문에, 이들 유전적 안정성은 "드라이버 (driver)" 돌연변이의 확인을 위해 허용될 것이다. 인간 종양의 새로운 분자 분류는 아마도 이들 암 줄기 세포군에서 이러한 "드라이버" 돌연변이의 분석으로부터 유도될 수 있다.
종합하면, 인간 암 세포주 및 조직 샘플에서 새롭게 정의된 전립선암 줄기 세포는 확인되고 특징화된다. 더구나, 이들 세포군은 HLA계 I 표면 마커를 사용하여 분리되고, 이의 종양 개시 능력은 입증되었다. 또한, 유사한 CSC 집단은 또한 인간 유방, 장, 폐 및 방광 암종에서 존재한다는 것이 관측되었고, 이는 이러한 발견에 추가 보편성을 제공한다. 이러한 인간 암 줄기 세포의 발견은 새로운 치료적 전략의 개발뿐만 아니라, 진단 및 예측하는 실험실 분석에서 중요한 임상적 의미를 갖는다. 이러한 상황에 있어서, Notch 및 Hedgehog 억제제로 처리는 실험적 동물 모델에서 종양 형성을 약화시킨다.
실시 예 5
물질 및 방법
억제제 및 약물
도세탁셀, 미토산트론 (Mitoxantrone), 독서루비신 (Doxorubicin), 시스프라틴 (Cisplatin), 비노렐빈 (Vinorelbine), 파실탁셀 (Paclitaxel), 덱사메타손 (Dexamethasone), 사이클로파민 (Cyclopamine) 및 화합물 E는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 얻는다. DBZ [(2S)-2-[2-(3,5-디플루오로페닐)-아세틸아미노]-N-(5-메틸-6-옥소-6,7-디하이드로-5H-디벤조[b,-d]아제핀-7-일)-프로피오나미드]는 Syncom (Groningen, The Netherlands)에서 얻는다.
획득된 도세탁셀 내성 세포의 세포 배양, 생성 및 특성
인간 호르몬-독립 전립선암 세포주, DU-145 및 22RV1은, American Type Culture Collection (ATCC)로부터 얻어지고, 항체 없이 10% FBS로 보충되는 RPMI 1640 배지 (Gibco, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)에서 유지된다. 세포는 5% C02를 갖는 습도 분위기에 37℃에서 성장된다. DU145 및 22RV1 세포는 전립선암 도세탁셀 내성 모델을 생성하기 위하여 선별된다. 이러한 선별은 임상적 설정에서 도세탁셀로 처리된 상태인, 양쪽 세포주가 호르몬-불응성이고, 이들은 또한 구분되는 호르몬-불응성 표현형을 나타내는 사실에 근거를 둔다. 22RV1 세포는 안드로겐 수용체 신호에 의존하고, 전립선 특이 마커 (예를 들어, PSMA, 안드로겐 수용체)를 발현하는 반면, DU145는 그렇지 않다. 따라서, 이들 두 개의 표현형적으로 구분되는 세포주에서 획득된 도세탁셀 내성의 발생은 도세탁셀 내성의 획득에서 포함된 분자 공정을 연구하기 위한 접근을 촉진시킨다. 도세탁셀 내성 콜로니, DU-145-DR 및 22RV1-DR은 복용량-단계적 방식 (dose-escalation manner)에서 도세탁셀로 세포를 배양하여 선별된다. 초기 배양은 5 nM 도세탁셀에서 이다. 민감성 콜로니가 더 이상 존재하지 않고, 생존하는 DU-145 및 22RV1 세포가 플라스크에 재분포된 후, 도세탁셀의 농도는 10 nM로 증가되고, 이어서 25 nM, 50 nM, 100 nM 및 250 nM로 증가된다. 22RV1-DR 세포는 500 nM 도세탁셀에 더욱 노출된다. 도세탁셀의 복용량을 증가시킨 각각에 노출한 후, 나머지 생존 세포는 도세탁셀의 최종 선택 증가 복용량을 함유하는 배양 배지에서 유지된다. 상기 세포가 노출된 마지막 약물 선택 농도는 획득된 도세탁셀 내성 표현형의 가역성을 피하기 위하여, DU-145-DR에 대해 250 nM 및 22RV1-DR에 대해 500 nM이다. 획득된 약물 내성의 공정은 DU-145-DR에 대해 9 개월 및 22RV1-DR에 대해 6.5 개월이 소요된다. 평행하게, 모 DU-145 및 22RV1 세포는 동일한 복용량-단계식 방식에서 DMSO (도세탁셀의 비히클 용액)에 노출된다.
세포는 도세탁셀의 증가되는 복용량에 노출되고, 획득된 항암제 저항성은 세포 생존력, 콜로니 형성, 아네신 (annexin) V, 및 폴리-(ADP-리보스) 중합효소 (PARP) 절단 분석에 의해 특징화되고 확인된다 (도 1a-d). 발생된 도세탁셀 내성 (DR) 세포는 다중약물 내성 표현형과 일치하는, 다른 항-분열 제제 (anti-mitotic agent) (비노렐빈 및 파실탁셀)뿐만 아니라, DNA 손상 약물 (미토산트론, 독소루비신 및 시스플라틴)에 교차 내성 (cross-resistance)을 나타낸다 (데이터에 나타내지 않음). 도세탁셀 항암제 저항성은 가역성으로 관측된다 (도 12a 및 b). 배양 배지로부터 약물의 제거는 약물 내성에서 상당한 감소를 유도한다. 약물 없이 도세탁셀 내성 세포를 12 주 배양한 후, 세포 생존력은 상당하게 감소된다. DU145-DR에 대한 도세탁셀 IC-50 농도는 1 μΜ에서 25 nM로 감소되고, 22RV1-DR세포에서 IC-50 약물 농도는 10μΜ에서 50nM로 감소된다 (도 12a). 약물 제거 후 도세탁셀 내성에서 이러한 감소는 콜로니 형성 분석에 의해 확인된다 (도 12b). 따라서, 도세탁셀 내성 표현형을 유지하기 위하여, 세포는 마지막 약물 선택 농도하에서 연속적으로 배양된다.
세포 생존력 및 콜로니 형성 분석
세포 생존력은 세포 적정 96 수성 비-반응성 세포 증식 분석 (MTS) 기기 (Promega Corp., Madison, Wl)를 사용하여 분석된다. 세포는 96-웰 배양 접시에 104의 밀도로 접종되고, 24 시간 후 배지는 제거되고 새로운 배지 단독 (대조구) 또는 약물 함유 배지로 대체된다. 72시간 후, 색상 흡광도 (color absorbance)는 450 nm (시험파장) 및 620 nm (기준 파장)에서 마이크로플레이트 분광계 (Molecular Dynamics)에서 측정된다. 생존 세포의 퍼센트는 A 450 nm - A 620 nm의 대조구 세포로 A 450 nm - A 620 nm의 처리된 세포를 나누어 평가된다. 약물 처리에 반응하는 증식성 세포 생존 분석은 35 mm 배양 접시에서 103 세포를 도말하여 수행된다. 24 시간 후, 세포는 약물로 미처리된 (대조구) 또는 처리되어 방치된다. 다음날, 배지는 대체하고, 세포는 어떤 약물도 없는 신선한 배지에서 또는 약물에 연속적으로 노출된 상태하에서 성장을 유지시킨다. 이러한 계속적인 노출 실험을 위하여, 배지와 약물은 약물-내성 세포의 콜로니가 나타날 때까지 3일 마다 교체된다. 세포는 그 다음 PBS에 4% 파라포름알데하이드로 고정되고, 결정 바이올렛 용액으로 염색되며, 형성된 콜로니는 시각적으로 카운트된다.
유세포 분석에 의한 세포 사멸의 분석법
세포 (105)는 72시간 동안 약물로 처리되거나 또는 미처리되어 (대조구) 방치된다. 점착 및 탈착된 세포는 수집되고 (pooled), 세척되며, 제조자의 설명에 따라 아네신-V-플로스 염색 기기 (FLUOS Staining Kit) (Roche, Nutley, NJ)를 사용하여 아네신-V-FITC 및 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide)로 표지된다. 샘플은 FACscan Flow Cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA)로 획득되고, 아네신 V 염색을 나타내는 세포의 퍼센트를 결정하기 위하여 CellQuest Pro software (BD Biosciences)로 분석된다.
세포주기 분석법
세포는 72 시간 동안 약물로 처리되고, 70% 에탄올에서 수확하고 고정되며, 4℃에서 저장된다. 분석 전에, 세포는 PBS로 세척되고, 원심분리되며, 0.1% 트리톤 X, 0.2 mg/ml RNAse 및 0.02 mg/ml 프로피디움 요오드화물을 함유하는 염색 용액에서 실온으로 30분 동안 배양된다. DNA 함량은 FACscan Flow Cytometer (BD Biosciences)로 획득되고, CellQuest Pro software (BD Biosciences)로 분석된다.
cDNA 마이크로어레이 (microarray) 분석법
22RV1 , 22RV1-DR, DU-145 및 DU-145-DR 유전자 발현 프로파일은 분석된다. 각 샘플로부터 총 RNA는 트리졸 (Tryzol) (Invitrogen)에 의해 분리되고, 제조자의 프로토콜에 따라 RNeasy 미니 기기 및 RNase-free DNase 세트 (Qiagen Inc., Valencia, CA)에 의해 정제된다. 모든 샘플의 RNA 양은 RNA 통합 (integrity)을 보장하기 위하여 RNA 전기영동 및 RNA LabChip 분석법 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)에 의해 시험된다. 샘플은 제조자의 설명에 따라 Affymetrix Human U133 Plus 2.0 어레이로 분석을 위해 준비된다. 샘플의 유전자 발현 수준은 표준화되고, Microarray Suite, MicroDB, 및 Data Mining 툴 소프트웨어 (Affymetrix, Santa Clara, CA)로 분석된다. 샘플에서 22.215 발현의 절대 콜 (absolute call) (존재, 약간 있는 또는 없는) 및 평균 차이, 및 두 개 또는 세 개 샘플 사이의 유전자 발현의 평균 차이, 절대 콜 차이, 배수 변화 (fold change)는 이러한 소프트웨어 팩키지를 사용하여 확인되고, 표준화된다. 대수 표준화에 기초한 >2-배 변화를 나타내는, 유전자의 평균 발현 평균 차이의 통계적 분석은 도세탁셀 민감도 및 내성 샘플 사이의 ｔ시험을 사용하여 수행된다. 주석을 달지 않거나 또는 쉽게 분류되지 않은 유전자는 기능적 클러스터링 (clustering) 분석으로부터 배제된다.
유전자 어휘 분류체계 (Gene ontology) 분석
도세탁셀 내성 세포에서 차등을 두어 발현된 유전자는 일반적으로 재조절된 전사의 목록에서 발생된 모 민감성 세포와 비교된다. 이러한 목록은 DAVID Bioinformatics Resources에 의해 평가되고, 웹-기초 통계적 초기하 시험 (hypergeometric test)은 생물학적 공정, 분자 기능, 및 세포 성분인, 유전자 어휘 분류체계 (GO) 카테고리의 농축 분석을 위해 적용된다. 통계적 중요도 (p<0.01)에 가장 높은 계층적 수준 (≥ 수준 5)에 농축된 GO 카테고리는 고려되었다.
웨스턴 블럿 (Western Blot) 분석
전체 세포 추출물은 샘플 버퍼에 준비되고 면역블럿팅에 의해 분석된다. 폴리 (ADP-리보스) 중합효소 (PARP) (BD Pharmingen, San Jose, CA), 절단된 PARP (BD Pharmingen), 사이토케라틴 19 (Abeam), 사이토케라틴 18 (Abeam, Cambridge, MA), 안드로겐 수용체 (Sigma-Aldrich), 전립선 특이 막 항원 (Abeam), 전립선 특이 항원 (Epitomics, Burlingame, CA), pan-HLA계 I (Abeam), DKK1 (Orbigen, BioCarta LLC, San Diego, CA), 활성된 β-카테닌 (Millipore, Billerica, MA), β-카테닌 (BD Transduction), 활성된 Notch2 (Abeam), PTCH (Abeam), Gli1 (Santa Cruz Antibody, Santa Cruz, CA), Gli2 (Abeam), 및 β-액틴 (Sigma-Aldrich)에 대항하는 1차 항체는 표준 절차를 사용하여 면역블럿 분석에서 사용된다. 단백질 발현은 Quantity One software (Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 밴드 발현을 비교하여 정량화된다.
면역조직화학법 및 면역형광법 분석
면역형광법 분석은 인간 암 및 종양 이종이식으로부터 포르말린 고정된 파라핀-포매된 조직 (paraffin-embedded tissue) 섹션 및 전립선암 세포주에서 수행된다. 1차 항체는 사이토케라틴 19 및 18 (Abeam)의 조합, pan-HLA계 I (Abeam), 녹색 형광 단백질 (Abeam) 및 하기 전사 요인 (transcription factors): 활성 β-카테닌 (Millipore), 활성된 Notch2 (Abeam), Gli1 (Santa Cruz), GH2 (Abeam) 및 안드로겐 수용체 (DAKO, Fort Collins, CO0)를 포함한다. 사용된 2차 항체는 Alexa Fluor® 594 (Invitrogen) 및 Alexa Fluor® 488 (Invitrogen)이다. 전립선암 세포 (105)는 35 mm 배양 접시에서 도말되고, 24 시간 후 표준 면역 형광 절차에 의해 염색된다. 조직 섹션 (5 ㎛)는 탈파라핀화되고, 표준 퍼옥시다아제계 면역조직화학법 및 면역형광 절차를 거친다. 사이토케라틴, HLA계 I 항원, 전사 요인 및 안드로겐 수용체의 발현의 정량화는 종양 세포를 평가하여 수행된다. 양성 및 음성 세포의 퍼센트는 10 고출력 장 (high power fields)에서 결정된다.
사이토케라틴 19-녹색 형광 단백질 (GFP) 수용체 플라스미드 (plasmid)의 발생
CK19 유전자 프로모터 영역은 이미 전술한 바와 같이 특이 프라이머 세트 (specific primer sets) (Fw 5'-AACGCATGCTTTGGGGGGATG-3' (SEQ ID NO: 1) 및 Rv 5'-TCCCCCTTTACTCGGCCCCCAC-3' (SEQ ID NO: 2))로 PCR시켜 DU145 세포 게놈 DNA로부터 증폭된다 (Tripathi et al., 2005). 상기 PCR 생산물은 Ase I 및 Hind III로 소화되고, 동일 효소로 이전에 소화된 pEGFPNI 벡터 (Clontech, Mountain View, CA)에 클론된다. 그 결과, CMV 프로모터는 원래의 벡터로부터 제거되고, GFP 발현은 CK19 프로모터의 조절하에 있다. 최종 구조체는 소화 및 서열 분석법에 의해 확인되고, DU145 세포는 Lipofectamine Plus 2000 (Invitrogen)를 사용하여 pCK19-GFP 구조체로 형질전환된다. 24 시간 후, 배지는 신선한 배지로 대체되고, 안정한 발현 세포는 G418 (Invitrogen) 존재에서 선택된다. 양성 콜론은 직접 현미경 및 면역형광법에 의해 확인되고, 또한 특이 프라이머 (Fw 5'-TTCCTGCGTTATCCCCTGATTC-3' (SEQ ID NO: 3) 및 Rv 5'-GCTCCTCCGGCCCTTGCTCACCAT-3' (SEQ ID NO: 4))을 사용하여 GFP 암호화 부위의 PCR 증폭에 의해 확인된다.
살아있는 세포 사진
타임-랩스 비디오현미경 (videomicroscopy)은 pCK19-GFP 프로모터로 안정하게 형질감염된 DU145 세포의 도세탁셀 특정형질군 민감도 및 비대칭 세포 분열을 평가하기 위해 사용된다. 낮은 컨플루언스 (confluence)에서 6-웰 플레이트에서 성장하는 세포는 37℃, 50% 습도, 및 5% C02 분위기에서 배양 챔버 내부의 스테이지 (stage)에 위치된다. 임의로 선택된 GFP+ 및 GFP- DU145 세포의 수반되지 않는 타임-랩스 영상물은 Nikon Eclipse T/도립 현미경 (inverted microscope)으로 수행된다. NIS Elements AR (Nikon Inc., Melville, NY) 소프트웨어는 데이터를 수집하고 가공하기 위해 사용된다. 사진은 10x 대물을 사용하여 수행되고, 사진은 GFP에 대해 200-ms 노출 시간 및 매 30분 마다 명시야 (bright field)에 대해 20-ms를 사용하여 획득한다.
유세포 분석에 의한 세포의 특정형질군의 분석
전립선암 세포의 특정형질군의 유세포 분석은 표준 절차를 따라 수행된다. 세포내 CK19 및 CK18 발현은 70% 에탄올로 고정된 단일-세포 현탁액에서 수행되는 반면, 세포 표면 HLA계 I 및 GFP의 발현은 신선한 세포 샘플 (고정 없이)에서 결정된다. CK19 (Abeam), CK18 (Abeam), HLA계 I (Abeam), 피코에리트린 (phycoerythrin) (Abeam) 및 GFP (Abeam)에 접합된 HLA계 I에 대항하는 1차 항원은 사용된다. 사용된 경우, 2차 항체는 Alexa Fluor® 594 (Invitrogen) 및 Alexa Fluor® 488 (Invitrogen)에 상응한다. 샘플은 FACscan Flow Cytometer (BD Biosciences)로 획득되고, CellQuest Pro software (BD Biosciences)로 분석된다. 104 세포의 최소 값은 샘플당 측정된다.
쥐 절차 (Mice procedures)
사용 및 관리하는 동물은 University of Columbia, Institutional Animal Care and Use Committee에 의해 설립된 규정에 따라 엄격하게 관리된다. 이종이식 실험은 수용체로서 Jackson Laboratories로부터 얻어진 5-6주 된 쥐 (NOD.CB17-Prkdcscld)로 수행된다.
인간 1차 및 전이성 전립선암 조직 샘플
포르말린-고정된 파라핀-포매된 인간 초기 및 전이성 전립성 암 조직 샘플은 Columbia University Cancer Center의 종양 은행에서 제공받는다. 모든 샘플은 정보 동의 및 Columbia University Medical Center Institutional Review Board의 감시 하에 수집된다. 암을 갖는 조직 부위는 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색된 슬라이드를 검토하여 선별된다.
전립선 세포주 및 신선한 인간 샘플로부터 암 세포의 종양 개시 능력
도세탁셀 민감성 모세포 및 도세탁셀 내성 세포의 종양 개시 능력을 비교하기 위하여, GFP 양성 및 GFP 음성 분류된 세포, 또는 HLA-양성 및 HLA-음성 분류된 세포, 다양한 수의 세포 (예를 들어, 10, 102, 103, 104)는 수컷 쥐에 200 ㎕의 배지:마트리겔 (1:1)를 피하주입된다. 전립선암 세포의 GFP 세포 특정형질군은 표준 절차에 따라 분류된다. HLA계 I 세포 분리를 위하여, PBS + FBS 5%로 차단되고, HLA계 I 항체로 염색된 신선한 세포의 단일 현탁액은 피코에리트린 (phycoerythrin) (Abeam)에 직접적으로 접합된다. 신선한 종양 조직 샘플로부터 인간 암 세포의 종양 개시 능력을 평가하기 위하여, 종양의 부분은 Institutional Review Board 접근 프로토콜을 통해 Columbia University medical Center에서 수술 절차를 수행한 환자로부터 얻어진다. 48명의 1차 전립선암, 10명의 1차 대장암, 10명의 1차 폐암, 12명의 1차 유방암, 및 18명의 1차 방광암은 처리된다. 표본 (Specimen)은 기계적으로 분리되고 단일-세포 현탁액을 얻기 위해 여과되며, 적혈구 세포를 제거하기 위해 적색 세포 완충용액 (lysis buffer) (Sigma-Aldrich)에 노출된다. 세포는 인간 CD45 (Abeam), 인간 CD31 (eBiosciences) 및 인간 HLA-계 I (Abeam)에 직접적으로 접합된 형광 항체로 염색된다. 이종이식 종양을 위하여, 쥐 CD45 (eBiosciences), 쥐 CD31 (Biolegend, San Diego, CA) 및 인간 HLA-계 I (Abeam)에 1차 형광 접합된 항체는 살아있는 인간 암세포를 선별하기 위해 사용된다. 세포는 죽은 세포를 표지하기 위하여 10 pg/ml DAPI에서 현탁되고, FACSAria 세포 분류 시스템 (BD Biosciences)에서 분류된다. 인간 전립선암 HLA 분류된 세포 (HLA계 I-음성 및 HLA계 I-약성) 및 미분류된 세포의 다른 희석 (10,100 및 1,000 주입된 세포), 및 다른 인간 암 샘플 (1차 주입) 및 유도된 이종이식 (2차 주입)으로부터 100 HLA 분류된 세포는 NOD/SCI D 쥐에 주입된다. 각 분류된 세포군 및 세포 희석에 대한 네 마리의 쥐는 주입되었다. 네 개의 주입은 HLA계 I-음성 세포에 대해 상부 옆구리에 두 개, 및 HLA계 I-양성 세포에 대해 하부 옆구리에 두 개로, 분류된 세포에 대해 각 쥐에서 수행된다. 각 종양 표본으로부터 미분류된 세포는 NOD/SCID 쥐에 또한 주입된다. HLA 분류된 세포의 2차 주입은 HLA계 I-음성 분류된 세포로부터 발생된 종양으로부터 수행되고, 드물게 관측된 종양은 세포의 HLA계 I-양성 분획으로부터 기원이 된다. 종양 개시는 종양 발생 (종양의 수/주입의 수) 및 잠복 (주입에서 1차 종양 촉진가능성까지의 시간)에 의해 측정된다. 종양 형성은 주입 부위의 촉진 (palpation)에 의해 규칙적으로 평가된다. 오직 하나의 주입 부위에서 촉진될 수 있는 종양의 경우에 있어서, 종양은 다른 주입 부위의 계속적 평가를 허용하도록 외과적으로 제거된다. 쥐는 36 주까지 모니터된다. 종양 부하 (tumor burden)의 표시가 없는 동물은 또한 종양 발생이 없다는 것을 확인하기 위해 검시하여 조사된다. 수확된 종양은 포르말린에 고정되고, 필요한 경우 H&E 염색 및 면역 형광법 연구를 위해 파라핀 섹션이 만들어진다.
Notch 및 Hedgehog 억제제의 생체 내 효과
HLA-음성 및 HLA-양성 분류된 세포주에 Notch 및 Hedgehog 억제제의 생체외 효과는 (전술된) 세포 주기 및 콜로니 형석 분석에 의해 분석된다. 세포는 비히클 용액 (대조구), 덱사메타손 (1 μΜ), 사이클로파민 (1 μΜ), 화합물 E (1 μΜ) 및 약물의 이중 (예를 들어, 덱사메타손 및 사이클로파민) 또는 삼중 (덱사메타손 및 사이클로파민 및 화합물 E)의 조합에 노출된다.
종양 개시에서 Notch 및 Hedgehog 억제제의 효과
이들 발생 경로의 억제가 생체 내에서 암 줄기 세포의 종양 개시 능력에 영향을 미치는 지의 여부를 분석하기 위하여, 세포주 및 인간 전립선 종양 이종이식으로부터 103 HLA-음성 분류된 세포는 NOD/SCID 쥐에 피하에 접종된다. 쥐는 비히클 용액 (대조구), 덱사메타손 (15 mg/kg/ip. 매일), 사이클로파민 (50 g/kg/sc 매일) 및 덱사메타손, DBZ (10 μΜ/kg/ip.매일) 및 덱사메타손 또는 3개 약물의 조합으로 처리된다. 덱사메타손 및 사이클로파민은 연속적으로 투여되지만; DBZ는 거트 독성 (gut toxicity)을 피하기 위하여 (4주 마다 1 내지 15일) 매일 투여된다. 생체 내에서 세포주 연구를 위하여, 치료 아암 (treatment arm) (예를 들어, 사이클로파민)을 위해 8 마리 쥐에서 세 개의 독립적 실험은 수행되고, 인간 전립선 종양을 위하여 8 마리 쥐는 각 치료 아암을 위해 포함된다. 쥐는 종양이 형성될 때까지 매일 관찰된다. 동물은 만약 손상의 어떤 증거를 보이거나 또는 만약 이들의 원래 체중의 20% 이상을 잃는다면 희생된다. 생성된 종양은 수확되고 조직학적으로 확인된다.
화학-내성 표현형의 특징화 (Characterization of the chemo-resistant phenotype )
분화에 대한 연구에 관하여, AR, PSA 및 PSMA을 포함하는, 전립선-관련된 바이오마커뿐만 아니라, 상피 마커로서 사이토케라틴 (CKs)의 발현은 평가된다. CKs는 세포 내 통합의 유지에서 역할을 수행하면서, 신호 전달 및 세포 내 분화 공정에서 기능을 하는, 인간 분화된 상피 세포를 위해 특이적인 것으로 이전에 보고되었다. 저분자량 CKs (예를 들어, CK18, 및 CK19)는 관강 정상 인간 전립선 세포 및 전립선암에서 특별하게 발현하지만, 고분자량 CKs (예를 들어, CK5 및 CK10)는 기초의 정상 전립선 세포에서 확인되고 암 세포군에서 드물게 관측된다. 본 발명의 모델에 있어서, 도세탁셀 내성 세포는 저분자량 CKs의 유전자 전사 및 단백질 발현 모두에서 상당한 감소를 나타낸다. DU145-DR 세포는 각각 CKs 19 및 18의 단백질 발현에서 6.25 및 16.6 배 감소를 나타낸다. 유사하게, 22RV1-DR는 민감성 모세포와 비교하고 정량화된 경우, 이러한 CKs에서 14.3 및 6.7 배 감소를 나타낸다. CK19 및 CK18의 면역 형광법 염색은 도세탁셀 내성 세포에서 이들의 감소된 발현을 확인한다 (도 2). 더구나, 고분자량 CKs는, 도세탁셀 내성을 획득하는 공정에 있어서, 세포가 상피 분화 마커를 잃고, 관강 (저분자량 CK)에서 기초-유사 (고분자량 CK) 표현형으로 이동을 수행하지 않는 것이 나타나는, 이들의 상응하는 모세포 (데이터는 나타내지 않음)에서와 같은 도세탁셀 내성 세포에서 검출되지 않는 것이 계속된다. 더군다나, AR, PSMA 및 PSA를 포함하는, 전립선-관련된 분화 마커를 발현하는, 22RV1 세포는, 도세탁셀에 노출된 경우 이러한 마커의 단백질 발현 수준 및 유전자의 극적인 감소를 나타낸다 (도 2). 22RV1-DR 세포는 AR, PSMA 및 PSA의 단백질 발현에서 각각 16.6, 20.0 및 11.1 배 감소를 나타낸다. 이들 결과는 또한 면역 형광 분석법에 의해 확인된다 (데이터는 나타내지 않음).
면역 회피 (immune evasion)의 메카니즘에 관하여, 도세탁셀 내성 세포가 MHC계 I 분자의 탈조절 (deregulation)을 나타내는 것이 확인되었다. 이러한 상황에 있어서, 이들 그룹으로부터 이전의 작업은 이미 인간 1차 및 전이성 암종에서 MHC계 I 항원 음성 종양 세포 특정형질군의 확인은 보고되었다 (Cordon-Cardo, et al., 1991). 본 연구에 있어서, 세포독성 T 임파구 (lymphocytes) 및 이후 종양 세포 용해에 효과적인 항원 제시를 위해 중요한, MHC계 I 항원은, 유전자 전사 및 단백질 수준 모두에서 하향-조절된다는 것을 확인하였다 (도 2). 유전자 발현 프로파일은 MHC계 I 항원 A, B, C의 면역형광 염색 및 면역블럿팅에 의해 단백질 수준을 확인된 사실로, 모든 MHC계 I 항원 (A, B, C, E, F, G)에서 의미 있는 하향-조절을 알아냈다 (도 2). 더구나, 도세탁셀 내성 세포는, 표 9에 나타낸 바와 같은, MICA/B, PVR, 및 PVRL2와 같은 공지의 NK 리간드의 유전자 전사 수준에서 하향-조절을 나타낸다. 따라서, 이들 세포는 숙주 면역계에 의해 검출되지 않도록 만든, 면역 회피에 이로운 표현형을 나타낸다.
이들의 모 민감성 세포 (DU145 및 22RV1)와 비교된 경우 도세탁셀 내성 세포 (DU145-DR 및 22RV1-DR)에서 탈조절된 천연의 킬러 (NK) 리간드는 표 9에 요약되었다. 대수 표준화 (logarithmic normalization)에 기초하여 > 2 배 변화를 나타내는, 유전자의 평균 발현 평균 분화의 통계적 분석은 매치된 민감도 및 내성 세포 사이에 t-시험을 사용하여 행해진다. 대부분 NK 리간드 유전자의 전사 수준에서 감소가 있다.
[표 9]
천연 킬러 (NK) 세포 리간드의 유전자 전사 수준
Figure pct00010
줄기 세포 표현형의 연구에 관하여, VVNT/β-카테닌의 확인된 탈조절된 발현은, 전구 (progenitor) 세포의 자가-재생 및 분화에서 관련된 것으로 나타나는, Notch 및 Hedgehog를 특징화된다 (Katoh et al., 2007; McDonald et al., 2006; van den Brink et al., 2004; Radtke et at., 2006; Leong et al., 2008; and Grigoryan et al., 2008). 상기 전립선에 있어서, 이들 신호 경로는 발생 패턴, 상피 재생 (epithelial regeneration) 및 전립선암 종양발생원에서 필수적인 역할을 하는 것으로 보고된다 (Wang et al., 2006; Karhadkar et al., 2004). 도세탁셀 내성 세포는 VVNT/β-카테닌 신호 네트워크의 잘 알려진 억제제인, Dickkopf-1 (DKK1)의 유전자 전사 및 단백질 수준 모두에서 상당한 감소를 나타낸다. DKK1 발현에서 이러한 감소는 β-카테닌 신호의 주요 키 작동자인, 탈-인산화된 (활성) β-카테닌의 발현에서 증가시키는 것에 연관된다. 면역형광법 분석은 모 도세탁셀 민감성 세포가 부착 분자로서 이의 기능과 연관된, β-카테닌의 막 발현을 나타내는 것을 증명하는 반면, 도세탁셀 내성 세포는 정규 β-카테닌 신호 경로의 활성을 위해 필수적이라고 보고된, 이러한 단백질의 뚜렷한 핵 위치를 나타낸다 (도 2). 더구나, 도세탁셀 내성 세포는 또한 NOTCH 신호 네트워크에서 증가를 나타낸다. NOTCH2 유전자 전사 수준은 상기 내성 세포에서 상당하게 증가되고, 이의 전사적 활성에 영향을 미치는, 단백질의 핵 전위 (translocation)와 관련된 절단된 Notch2 단백질 발현에서 증가하는 것에 연관된다 (도 2). 마지막으로, 도세탁셀 내성 세포는 Hedgehog 수용체 Patched의 증가된 발현을 갖고, 신경교종 (glioma)은 종양 유전자 호모로그 전사 요인, Gli1 및 Gli2과 관련된다. 이들 발견은 Hedgehog 경로 활성에 관련된 조건인, 전술된 전사 요인의 핵 전위 및 증가된 단백질 발현과 관련된다 (도 2). 놀랍게도, CD44 및 CD133과 같은, 다른 보고된 줄기 세포 표면 마커는, 유전자 전사 및 단백질 수준 모두에서 분석된 바와 같이 (데이터는 나타내지 않음), 상기 모델에서 상향-조절된 것으로 확인되지 않았다.
더구나, 이것은 DU145-DR 및 22RV1-DR 세포 모두에 대한 내성 현상의 가역성이 분화 마커의 발현에서 증가와 연관된다는 것이 관측되었다. (12 주 동안 약물 없이 배양된) 도세탁셀 가역된 내성 세포는 모 민감성 세포에서 관측된 것과 유사한 수준을 달성하는, 도세탁셀 획득된 내성 세포와 비교된 경우 저분자량 사이토케라틴 (CK19 및 CK18) 및 HLA-계 I의 더 높은 단백질 발현 수준을 나타낸다 (도 13).
상피 분화 리포터 모델 (reporter model)의 발생 및 특징화
DU145 모 세포는 녹색 형광 단백질 (GFP)의 발현을 구동하는 CK19의 프로모터를 함유하는 플라스미드로 안정하게 형질감염된다 (도 14a). DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포에서 CK19 및 GFP의 공-발현은 면역 형광법에 의해 확인된다 (도 14a). 유세포 분석 정량화는 GFP 및 CK19 모두에 대해 다수의 세포 양성 (94.3±3.8%), 및 마커 모두에 대해 개별 세포군 음성 (5.6±4.1%)인, 세포의 두 개의 개별 집단을 나타낸다. 이들 두 개의 주요 집단 외부에 약간 산재된 세포는 한 구획 (compartment)에서 다른 구획으로 전이하는 세포가 존재할 수 있다는 것이 관측되었다. 더구나, CK19/GFP 음성 세포에서 프로모터 구조체의 안정한 삽입은 PCR에 의해 확인된다 (도 4c). DU145-CK19 프로모터-GFP 안정 세포에서 HLA계 I의 발현은 또한 특징화된다 (도 14b). 놀랍지 않은 사실은, GFP를 발현하는 세포는 또한 HLA-양성 (91.6±5.5%)이고, GFP를 발현하지 않는 세포는 HLA-음성 표현형 (7.0±4.95)을 나타낸다. 따라서 이들 결과는 상피 분화의 리포터로서 GFP의 사용을 유효하게 하고, 또한 도 4b에서 이전에 나타낸 바와 같이, 분화 마커 (CK19/GFP) 및 HLA계 I 항원이 결핍된 세포의 특정형질군의 존재를 입증한다.
HLA계 I 분류된 세포주에 종양 개시 연구
HLA-계 I 발현이 종양 개시의 암 줄기 세포 기능적 특징을 갖는 세포를 확인하는 세포 표면 마커로서 사용될 수 있는 것을 부가 확인하기 위하여, 모 세포주 DU145 및 22RV1은 HLA-계 I을 위해 분류되고, 이들의 종양 개시 능력은 NOD/SCID 쥐에서 시험된다 (도 15). DU145-CK19 프로모터-GFP 안정한 GFP-음성 세포로 얻는 결과와 유사하게, 오직 음성 세포는 희석 분석 후 종양 개시 능력을 나타낸다. 10 HLA계 I-음성 DU145 및 22RV1 세포의 주입은 각각의 수용체의 83.3±19.1 % 및 100%에서 종양을 생산하는 반면, 종양 형성은 HLA계 I-양성 표현형을 나타내는 10개의 세포로 주입 198일 후 관측되지 않는다. 특히, 비록 이들 차이는 통계적 중요도에 도달하지 않을지라도, 22RV1 및 DU145로부터 HLA계 I-음성 세포의 종양 개시 능력 및 종양 잠복성은 다르다. 종양발생성 세포주 사이에 차이점은 다른 분자 경로가 쥐에서 인간 세포의 성장 및 착생 (engraftment)에서 역할을 할 수 있다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 유사한 결과는 HLA계 I-음성 발생된 종양 이종이식으로부터 일련의 이식 (transplantation) 후 얻어진다 (데이터에 나타내지 않음).
HLA계 I 분류된 세포주에 클론가능성 (Clonability) 연구
DU145 및 22RV1 모세포로부터 HLA계 I 분류된 세포의 클론가능성 능력을 설명하기 위하여, 희석 콜로니 형성 분석은 수행된다. HLA계 I-음성 세포는 HLA계 I-양성 세포보다 통계적으로 상당히 더 높은 클론가능성을 나타낸다. 특별하게는, DU145로부터 HLA계 I-음성 분류된 세포는 10, 100 및 1000 세포가 도말된 경우, 각각 31.6±7.5%, 17.1 ±3.6% 및 22.0±4.9%에서 콜로니가 발생된다. 반대로, HLA계 I-양성 세포는 10, 100 및 1000 세포가 도말된 경우 5.0±8.3%, 8.0±3.3% 및 5.5±1.5%에서 콜로니를 발생한다 (도 8). 유사한 결과는 22RV1 HLA계 I 분류된 모 세포로 관측된다 (데이터 나타내지 않음).
인간 조직에서 전립선암 줄기 세포의 확인
전이성 (n=20) 및 매치된 1차 (n=6) 인간 전립선암 조직의 면역조직화학 연구는 각각 1차 및 전이성 병소 (lesion)에서 모든 종양 세포의 0.05% 내지 0.3% 및 0.4% 내지 1.8%을 차지하는, 모든 표본이 CK-음성 (CK18 및 CK19) 종양 세포의 산재된 특정형질군을 함유한다는 것을 밝혔다 (도 7a). 면역형광법-계 이중 염색은 그 다음 CK 발현 및 관심의 마커 사이에 관련성을 평가하기 위하여 수행된다. 이러한 분석법에 있어서, CK 발현은 HLA계 I 발현과 상당히 연관된다는 것이 일관성 있게 관측된다 (p<0.0001). 더욱 특별하게는, CK-음성 종양 집단이 세포의 97.8 ± 0.7%에서 HLA계 I 항원이 발현되지 않는 반면, CK-양성 세포의 전부 (100%)는 양성 HLA계 I 항원 표현형을 나타내는 것으로 관측된다 (도 4b). HLA계 I-양성 표현형을 나타내는 CK-음성 세포의 작은 집단은 확인되고, 이것은 HLA계 I-음성/CK-음성 표현형으로부터 분화된 표현형으로 전이를 수행하는 종양 세포를 나타낼 수 있다. 더구나, CK-음성/HLA-음성 종양 세포가 분화된 CK-양성/HLA-양성 세포와 비교된 경우, 발생 전사 요인의 핵산 발현 (활성)의 상당한 증가 (p<0.0001)를 가지는 것이 지속적으로 발견된다. CK-음성/HLA-음성 세포는 세포의 63.9 ± 22.6%에서 핵 탈-인산화된 β-카테닌, 72.8 ± 15.1%에서 Notch2, 67.5 ± 17.3%에서 GN1 및 67 ± 17.3%에서 Gli2의 발현이 나타나는 반면, CK-양성/HLA-양성 세포는 세포의 5.8 ± 11.9% 만이 핵 탈-인산화된β-카테닌, 6.7 ± 7.9%에서 절단된 Notch2, 1.2 ± 7.9%에서 Gli1, 및 1.5 ± 10.6%에서 Gli2가 발현된다 (도 7 c). 더구나, CK-음성/HLA계 I-음성 종양 세포가 핵 AR의 발현이 없는 것으로 나타나는 반면, CK-양성/HLA-양성 세포는 세포의 71.8 ± 14.3%에서 핵 AR을 나타내는 것으로 관측된다 (도 7d). 따라서, 전립선암 줄기 세포는 이들 세포가 기능적 AR 신호에 의존하지 않을 수 있다는 것을 의미하는 양성 AR 표현형을 나타내지 않는다는 사실이, 이들 세포가 어떻게 호르몬-치료 후 관측된 재발을 담당하는 지를 설명할 것이다. 종합하면, 이들 결과는 인간 전립선암 조직 샘플에서 전립선암 줄기 세포의 특정형질군을 확인하는 이들의 존재 및 능력을 입증하였다.
통계적 분석
실험적 데이터는 평균 ± SD로서 표시된다. 학생의 t-시험에 의한 통계적 분석법은 수행된다. 값은 p< 0.05로 통계적으로 중요하게 고려된다.
실시 예 6
생체 외 고속 분석
전술된 기능적 항암제 저항성 및 CSC의 표현형 특징에 기초하여, 생체 내에서 고속 분석은 이러한 CSC 집단을 표적화하는 화합물을 스크린하도록 설계되고, CSC가 선택적으로 사멸하거나 또는 분화되는지의 여부를 결정하도록 설계된다. 이러한 분석의 완성은 약물의 넓은 다양성의 시험을 허용하고, 추정 CSC 억제 효과를 갖는 화합물의 동정을 촉진시킨다.
생체 외에서 고속 분석은 96 웰 플레이트로 전술된 CSC의 접종으로 이루어진다. 세포는 그 다음 상기 후보 제제, 예를 들어, 관심의 약물에 노출되고, 리드아웃 (readouts)은 원하는 시간대 (예를 들어, 24 시간, 72 시간 등)에서 얻어진다. 리드아웃은 유세포 분석법에 의해 처리된 대 미처리된 집단에서 CSC 표현형 (예를 들어, HLA의 결핍, CD24 등)을 발현하는 세포의 퍼센트를 비교하여 이루어진다. 평행하게, 세포 생존력 분석은, 처리된 세포와 미처리된 세포 사이에 생존 가능한 ("생존하는") 세포의 퍼센트와 비교하여, 또한 수행된다. 결과는 다음과 같이 해석된다: 후보 제제, 예를 들어, CSC 집단이 CSCs을 결핍하는 성장 또는 사멸 항암제 저항성 세포를 억제할 수 있는 것을 표적으로 하는 약물. 네 가지 가능한 결과는 이러한 분석으로 얻어질 수 있다: 성과 1, 세포 생존력에서 감소를 갖는 CSC의 퍼센트에서 감소; 성과 2, 세포 생존력에서 감소 없이 CSC에서 감소; 성과 3, 세포 생존력에서 감소하는 CSC 집단에서 감소; 및 성과 4, CSC의 퍼센트에서나 또는 세포 생존력에서의 감소 없음. 성과 1은 CSC 집단이 후보 제제, 예를 들어, 약물에 위해 표적화되는 것으로 해석될 수 있다. 성과 2는 CSC 집단이 분화되는 것으로 해석될 수 있다. 성과 3은 CSC 집단이 아닌, 신생물성 세포가 후보 제제, 예를 들어, 약물에 의해 표적화되는 것으로 해석될 수 있다. 성과 4는 CSC 또는 신생물성 분화된 세포에서, 후보 제제, 예를 들어, 약물에 의해 생산된 효과는 없다는 것으로 해석될 수 있다.
후보 제제, 예를 들어, CSC 고갈 (성과 1) 또는 CSC 분화 (성과 2)를 생산하는 약물은 생체 외 및 생체 내 분석에서 표준의 수단에 의해 부가 실험 및 특징을 위해 고려될 것이다. 간단하게, 초기 스크린 결과를 확인하고 유효화하는 것을 돕는 이들 분석은, a) 생체 외에서 - 사멸방법 (apoptotic method) (예를 들어, 아넥신 V), 콜로니 형성, 및 이들의 상응하는 표현형에 기초한 분화 연구 (예를 들어, 유세포 분석 및 면역조직 화학적 분석); 및 b) 생체 내에서 - 면역저하된 쥐 (immunocompromised mice)에서 희석 종양 개시 분석을 포함한다.
이러한 고속 스크린은 전술된 Notch 및 Hedgehog 억제제를 사용하여 유효화된다.
본 출원에서 인용된 모든 문헌은 본 발명에 그 전체적인 내용이 참고문헌으로 포함된다.
비록 본 발명의 예시적인 구현 예가 기술되었을 지라도, 본 발명은 기술한 것에 제한된 것은 아니고, 다양한 다른 변화 또는 변형이 본 발명의 범주 또는 사상을 벗어나지 않고 기술 분야에서 당업자에게 의해 만들어질 수 있다고 이해될 것이다.
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Claims (24)

  1. a. 세포군으로부터의 암 줄기 세포 (CSCs)와 후보 제제를 접촉시키는 단계; 및
    b. 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여 CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 CSC의 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계를 포함하는 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 CSC는 하기 특성을 더욱 갖는 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법: CD24-, CD133-, Notch+, Gli1+, Gli2+, 사이토케라틴-, Neurofil-, 및 아교섬유산성단백질- (GFAP-).
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 CSC는 하기 특성을 더욱 갖는 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법: 자가-재생 능력, 비대칭 세포 분열 수행, 종양형성 능력, 전이 잠재성, 다-분화 특성, 광범위한 항암제 저항성, 및 Notch 및 Hedgehog 억제제에 대한 민감도.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 CSCs는 표준 화학요법에 불응성인 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 후보 제제는 화학제, 생물학제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 결정 단계는 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를 비교하는 단계를 더욱 포함하며, 여기서 미처리된 세포에서 CSCs의 퍼센트와 비교하여 처리된 세포군에서 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제인 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 결정 단계는 유세포 분석법, 세포 생존력 분석, 세포 분화 분석, 세포 분열 분석, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 절차를 수행하는 단계를 포함하는 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 세포군은 CSCs 및 생체 줄기 세포 및 생체 줄기 세포의 수를 실질적으로 감소시키지 않으면서 상기 세포군에서 CSCs의 수를 감소시키는 제제를 포함하는 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 방법은 고속 스크린인 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 결정 단계는 단계 i 및 단계 ii, iii, 및 iv 중 적어도 하나를 더욱 포함하는 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법:
    i. 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를 비교하는 단계;
    ii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 생존가능한 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
    iii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 비-CSC 세포의 퍼센트를 결정하는 단계; 및
    iv. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 분열 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
    여기서 (1) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 생존력을 감소; (2) 세포 생존력의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소; (3) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 비-CSC 세포의 퍼센트를 증가; (4) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 분열을 감소; 또는 (5) 세포 분열의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제인 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 결정 단계는 유세포 분석법, 세포 생존력 분석, 세포 분화 분석, 세포 분열 분석, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 절차를 수행하는 단계를 포함하는 암 줄기 세포의 수를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 방법.
  12. a. 세포군으로부터의 암 줄기 세포 (CSCs)와 후보 제제를 접촉시키는 단계;
    b. 하기의 단계에 의해 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여, CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 CSC의 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계:
    i. 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를 비교하는 단계;
    ii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 생존가능한 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
    iii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 비-CSC 세포의 퍼센트를 결정하는 단계; 및
    iv. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 분열 세포의 퍼센트를 결정하는 단계;
    여기서 (1) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 생존력을 감소; (2) 세포 생존력의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소; (3) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 비-CSC 세포의 퍼센트를 증가; (4) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 분열을 감소; 또는 (5) 세포 분열의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제인 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 CSC는 하기 특성을 더욱 갖는 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법: CD24-, CD133-, Notch+, Gli1+, Gli2+, 사이토케라틴-, Neurofil-, 및 아교섬유산성단백질- (GFAP-).
  14. 청구항 12 또는 13에 있어서,
    상기 CSC는 하기 특성을 더욱 갖는 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법: 자가-재생 능력, 비대칭 세포 분열 수행, 종양형성 능력, 전이 잠재성, 다-분화 특성, 광범위한 항암제 저항성, 및 Notch 및 Hedgehog 억제제에 대한 민감도.
  15. 청구항 12에 있어서,
    단계 (i)는 유세포 분석법에 의해 수행되는 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  16. 청구항 12에 있어서,
    단계 (ii)는 세포 생존력 분석에 의해 수행되는 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  17. 청구항 12에 있어서,
    단계 (iii)은 세포 분화 분석에 의해 수행되는 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  18. 청구항 12에 있어서,
    단계 (iv)는 세포 분열 분석에 의해 수행되는 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  19. 청구항 12에 있어서,
    상기 후보 제제는 화학제, 생물학제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  20. 청구항 12에 있어서,
    상기 CSCs는 표준 화학요법에 불응성인 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  21. a. 세포군으로부터의 암 줄기 세포 (CSC)와 후보 제제를 접촉시키는 단계, 여기서 상기 CSC는 하기 특성을 가지며: HLA I- 및 HLA II-;
    b. 하기의 단계에 의해 상기 후보 제제가 상기 후보 제제와 접촉하지 않는 CSC와 비교하여 CSC의 생존 또는 성장을 감소시키는지 또는 분화를 증가시키는지를 결정하는 단계:
    i. 상기 후보 제제로 처리되지 않는 세포군에서의 CSCs의 퍼센트와 상기 후보 제제로 처리된 세포군에서의 CSCs의 퍼센트를, 유세포 분석을 이용하여, 비교하는 단계;
    ii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 생존가능한 세포의 퍼센트를, 세포 생존력 분석을 이용하여, 결정하는 단계;
    iii. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 비-CSC 세포의 퍼센트를, 세포 분화 분석을 이용하여, 결정하는 단계; 및
    iv. 상기 처리된 및 미처리된 세포군에서 분열 세포의 퍼센트를, 세포 분열 분석을 이용하여, 결정하는 단계;
    여기서 (1) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 생존력을 감소; (2) 세포 생존력의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소; (3) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 비-CSC 세포의 퍼센트를 증가; (4) 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키고 세포 분열을 감소; 또는 (5) 세포 분열의 감소 없이 상기 CSCs의 퍼센트를 감소시키는 후보 제제는 CSCs의 수를 선택적으로 감소시키는 제제인 세포군에서 표준 화학요법에 불응성인 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  22. 청구항 12에 있어서,
    상기 후보 제제는 화학제, 생물학제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 세포군에서 암 줄기 세포의 퍼센트를 선택적으로 감소시키는 제제를 확인하는 고속 스크린 방법.
  23. 청구항 1, 12 또는 21 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 CSCs를 선택적으로 사멸하기 위한 제제.
  24. 약학적으로 허용가능한 담체 및 청구항 23의 제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 조성물.
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