CN103687482A - 抗猪生殖与呼吸综合征病毒的动物 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活和/或CD163基因的至少一个等位基因已经失活。SIGLEC1基因的两个等位基因和/或CD163基因的两个等位基因失活的经基因修饰的猪抗猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。还提供了产生此类转基因猪的方法。
Description
政府支持
本发明是在由农业部授予的合同号(USDA/ARS)58-1940-8-868的政府支持下进行。政府具有本发明的某些权利。
序列表
本申请含有2012年5月15日生成的标题为“UMO11053.WOSEQ_ST25”的序列表，其据此通过引用整体并入。
技术领域
本发明通常涉及经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活和/或CD163基因的至少一个等位基因已经失活。还提供了产生此类转基因猪的方法。
发明背景
猪生殖与呼吸综合征病毒是猪经济上最重要的疾病之一。1987年在美国(Keffaber1989)和1990年在欧洲(Wensvoort等1991)首先检测到这种疾病。对原型PRRS病毒(PRRSV)VR-2332和雷垒斯塔德(Lelystad)(分别为美国和欧洲分离株)的分子分析已经表明，趋异进化菌株几乎同时出现在两个大洲，这可能是由于猪管理实践上的类似变化(Murtaugh等1995；Nelsen等1999)。自从其最初出现以来，这种病毒就在世界范围内传播，并且在美国猪群中已经检测到欧洲基因型的PRRSV(Ropp等2004)。PRRS的特征在于严重且有时致命的呼吸道疾病和生殖障碍，但是也使受感染猪易感染细菌性病原体以及其它病毒病原体(Benfield等1992)，并且是经济显著的猪呼吸系统疾病综合征(PRDC)的主要组成部分。急性感染期间PRRSV引起的最一致的病理损伤是间质性肺炎和轻度淋巴细胞性脑炎(Plagemann1996)。在特征为病毒血症和临床疾病的PRRSV感染的急性期后，许多猪完全恢复，然而在较长一段时间携带低水平病毒感染。这些“载体”猪受PRRSV持续感染并且间歇或连续地传播病毒，并且可能在直接或间接接触后感染未实验的猪。在实验条件下，受PRRSV持续感染也有良好的文档记录(Albina等1994；Allende等2000；Benfield等1998；Christopherhennings等1995；Sur等1996；Yoon等1993)。最显著的是，已经在感染157天后回收了传染性病毒(Wills等1997)。虽然也已经证实肺细胞和睾丸的上皮生殖细胞受感染(Sur等1996；Sur等1997)，但是组织巨噬细胞和单核细胞是急性和持续感染期间的主要靶细胞(Molitor等1997)。
PRRS的病原是为巢状病毒母(order Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae family)成员的被膜的正链RNA病毒。动脉炎病毒科的其它成员包括小鼠乳酸脱氢酶增高病毒(LDV)、马动脉炎病毒(EAV)和猿出血热病毒(SHFV)。对基因组序列数据的分析显示PRRSV菌株间的广泛多样性，但是也显示出非常保守的结构域(Andreyev等1997；Meng2000；Meng等1995)。PRRSV的基因组构成与其它动脉炎病毒的基因组构成类似，对于ORF1a复制酶蛋白而言基因组RNA起信使RNA作用(Plagemann1996)。ORF1a和1b包含约80％的病毒基因组并且编码RNA依赖性RNA聚合酶以及加工成其它非结构蛋白的多蛋白(Snijder和Meulenberg1998)。使用雷垒斯塔德病毒，已经确定ORF2-7编码病毒结构蛋白。ORF5(GP5)和M编码的蛋白(VanBreedam等2010b)在PRRSV诱导凋亡中起作用(Suarez等1996；Sur等1997)并且被认为是密切相关的乳酸脱氢酶增高病毒中的病毒吸附蛋白。PRRSV的较小包膜糖蛋白GP2a和GP4与CD163相互作用(Das等2010)。有数据表明，与SIGLEC1(唾液酸结合性Ig样凝集素1)结合是进入细胞所必需的，并且实际上对于病毒感染而言似乎需要与SIGLEC1和CD163双重结合(Van Gorp等2008)。
PRRSV致病原因(特别是在分子水平上)和动物流行病学的许多特征知之甚少，因此使得控制工作很困难。为了获得更好的理解，已经研发了PRRSV的传染性克隆(Nielsen等2003)。现今生产商常常用改良-活减毒菌株或灭活病毒疫苗为猪接种PRRSV疫苗。然而，由于菌株变异和免疫系统的刺激不足，当前的疫苗往往并未提供令人满意的保护。因为已经证明，在用PRRSV的同源菌株激发猪时先前接触可提供完全保护，所以保护性免疫反应是可能的(Lager等1999)。然而，从未对用异源菌株激发一致性证明保护性免疫。除担心可用PRRSV疫苗的功效外，有强有力的证据表明，如在实验感染猪后用毒性野外分离株所证明的那样(Rowland等1999)，目前使用的改良-活疫苗可继续存在于个别猪和猪群中并积累突变(Mengeling等1999)。此外，已经证实疫苗病毒是在接种公猪的精液中传播(Christopherhennings等1997)。作为接种疫苗的替代方案，一些专家正提倡生殖群中的“试验和去除”策略(Dee和Molitor1998)。这种策略的成功使用取决于去除受PRRSV急性或持续感染的所有猪，接着严格控制以防再引入病毒。与这种策略相关的困难和大部分费用是，对持续性PRRSV感染的致病原因知之甚少，因此没有可靠技术鉴定受持续感染的猪。
已经用单克隆抗体鉴定了PRRSV的假定细胞受体，纯化并测序(Vanderheijden等2003；Wissink等2003)并且命名为SIGLEC1。这种分子与唾液酸粘附素有相似性并且经证实介导PRRSV进入非易感细胞，但是表达这种受体的重组细胞系不能支持PRRSV的生产性复制(Vanderheijden等2003)。重要的是，已经证实感染肺泡巨噬细胞需要PRRSV表面存在的唾液酸分子。病毒与这种受体结合后，PRRSV的进入通过受体介导的胞吞作用发生(Nauwynck等1999)。通过实验确定唾液酸粘附素对PRRSV进入的关键作用，其中证明在感染克隆猪唾液酸粘附素的PK15细胞(不容许PRRSV复制的细胞系)中，而不是未感染的对照PK15细胞中病毒吸收(Vanderheijden等2003)。这同一组的进一步研究证明，PRRSV病毒粒子表面的唾液酸与唾液酸粘附素分子的相互作用对于PRRSV感染肺泡巨噬细胞是必需的(Delputte和Nauwynck2004)。相反的策略，即去除PRRSV表面的唾液酸或用唾液酸特异性凝集素预培养也导致感染中断(Delputte等2004；Delputte和Nauwynck2004；Van Breedam等2010b)。不依赖于对PRRSV进入的具体研究，已经使用定点诱变鉴定鼠唾液酸粘附素结合唾液酸所需的六个关键氨基酸残基(Vinson等1996)，其与猪唾液酸粘附素69％相同。重要的是，鼠唾液酸粘附素中鉴定的6个氨基酸在猪分子中也全部保守。
SIGLEC1是唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素家族的跨膜受体。最初将其描述为小鼠巨噬细胞的绵羊红细胞结合受体(Crocker和Gordon1986)。其在造血和淋巴组织中的巨噬细胞上表达。SIGLEC由含有唾液酸结合位点的N端V-集结构域组成，后面是数量可变的C2-集结构域，然后是跨膜结构域和胞质尾区。与SIGLEC相反，SIGLEC1在胞质尾区内没有基于酪氨酸的基序(Oetke等2006)。唾液酸结合位点映射到N端免疫球蛋白样V-集结构域(Nath等1995)。R116残基似乎是对于唾液酸结合而言重要氨基酸之一(Crocker等1999；Delputte等2007)。因此，完整的N端结构域对于PRRSV与SIGLEC1结合充分必要(Van Breedam等2010a)。报道了小鼠中SIGLEC1的敲除并且产生能活且能生殖，并且未显示出发育异常的小鼠(Oetke等2006)。然而，这些小鼠的B和T细胞群有微小变化并且免疫球蛋白M水平降低。
PRRSV的感染过程从与肺泡巨噬细胞表面的硫酸乙酰肝素首次结合开始。然后与唾液酸粘附素(SIGLEC1，也称为CD169或SN)发生稳固结合。然后通过网格蛋白介导的胞吞作用使病毒内在化。然后另一分子，CD163，促进核内体中的病毒脱壳(Van Breedam等2010a)。病毒基因组释放并感染细胞。
CD163具有17个外显子并且蛋白质由具有9个清道夫受体富半胱氨酸(SRCR)结构域的胞外区、跨膜片段和短胞质尾区构成。由单个基因的不同剪接产生几种不同的变异体(Ritter等1999a；Ritter等1999b)。大部分这种变异被认为是由胞质尾区的长度引起的。
CD163有许多重要功能，包括用作触珠蛋白-血红蛋白清道夫受体。因为血红素基可能极具毒性，所以清除血液中的游离血红蛋白是CD163的重要功能(Kristiansen等2001)。CD163具有促进胞吞作用胞质尾区。这种尾区的突变导致触珠蛋白-血红蛋白复合物吸收减少(Nielsen等2006)。C163的其它功能包括成红细胞粘附(SRCR2)，为TWEAK受体(SRCR1-4和6-9)、细菌受体(SRCR5)、非洲猪病毒受体(Sanchez-Torres等2003)和作为免疫调节剂的潜在作用(在(Van Gorp等2010a)中有讨论)。
发明概述
一方面，本发明是一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活和/或CD163基因的至少一个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
本发明的另一方面是一种其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪，通过包括以下的方法产生：为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活SIGLEC1等位基因；和激活所述卵母细胞以产生胚胎。
本发明还涉及一种其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述经基因修饰的猪通过包括以下的方法产生：为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活CD163等位基因；和激活所述卵母细胞以产生胚胎。
另一方面，本发明是一种其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪，通过包括以下的方法产生：使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪与其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
本发明的另一方面是提供一种其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪，通过包括以下的方法产生：使其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪与其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
本发明还涉及其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述经基因修饰的猪通过三种方法的任一种产生。第一种此类方法包括使具有至少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪与具有至少一个失活CD163等位基因的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。这种方法进一步包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪相互交配以产生F2子代并且筛选所述F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
第二种此类方法包括使其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，使F1子代交配以产生F2子代，并且筛选F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
第三种此类方法包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与另一其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，并且筛选F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
本发明还涉及上述任一经基因修饰的猪的子代，其中：(1)SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活；(2)CD163基因的至少一个等位基因已经失活；(3)SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活；或(4)SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活。在其中CD163基因的一个或两个等位基因已经失活的此类子代中，失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
本发明还涉及一种产生其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法。所述方法包括为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活SIGLEC1等位基因；和激活所述卵母细胞以产生胚胎。
再一方面，本发明为一种产生其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。这种方法包括为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活CD163等位基因；和激活所述卵母细胞以产生胚胎。
本发明还涉及一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法。所述方法包括使具有至少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的母猪与具有至少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的公猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
本发明还涉及一种产生其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使PRRSV脱壳的CD163蛋白。这种方法包括使具有至少一个失活CD163等位基因的经基因修饰的母猪与具有至少一个失活CD163等位基因的经基因修饰的公猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
本发明的另一方面是一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。所述方法包括使具有至少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪与具有至少一个失活CD163等位基因的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，并且筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。所述方法进一步包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪相互交配以产生F2子代并且筛选F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
本发明还涉及另一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。这种方法包括使其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，使F1子代交配以产生F2子代，并且筛选F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
本发明还涉及又一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。所述方法包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与另一其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，并且筛选F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
在其它方面，本发明涉及通过以上任一方法产生的经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的一个或两个等位基因已经失活和/或其中CD163基因的一个或两个等位基因已经失活，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
其它目标和特征部分将显而易见而部分在下文中指出。
附图简述
图1描绘了唾液酸粘附素基因的构成和靶向载体设计。图1A和1B为示意图，显示人(图1A)和小鼠(图1B)唾液酸粘附素基因分别由21个外显子构成并且跨距约20kb。图1C示出了对外显子2的鼠突变分析(如图1C所示的外显子2的DNA序列为SEQ ID NO：7，并且如图1C所示的外显子2编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：8)。突变分析显示出使唾液酸粘附素与配体结合的6个氨基酸(用加方框/粗体文本示出)。图1D描绘了用于将SIGLEC1的外显子1的一部分和外显子2和3置换为终止密码子的靶向载体设计。载体还包括PGK启动子驱动的新霉素(neo)选择盒。
图2描绘了靶向载体设计、唾液酸粘附素基因的构成和经改变的唾液酸粘附素基因的构成。
图3是显示为鉴定唾液酸粘附素基因的靶向的PCR筛选的凝胶照片。
图4是显示为鉴定野生型和靶向唾液酸粘附素等位基因同等存在的PCR筛选的凝胶照片。
图5描绘了含有9个胞外SRCR结构域、2个脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸(PST)富集结构域、跨膜区域和胞内胞质尾区的野生型CD163(左)的结构域构成。右侧描绘了经基因修饰的CD163。除SRCR结构域5已经被来自CD163配体(CD163L)的SRCR结构域8置换外，结构域构成仍然相同。
图6描绘了CD163靶向载体，其中所述载体的臂是与自然存在的或野生型CD163有相同序列的DNA部分，从而允许载体退火为细胞中已经存在的CD163。然后通过同源重组使位于CD163两臂之间经修饰的DNA插入细胞的DNA中。
定义
“敲除猪”是基因的一个或两个等位基因的功能已经(例如)通过部分或完全基因删除改变的经基因修饰的猪。如果敲除基因的一个等位基因，猪为该基因敲除的杂合子；如果敲除两个等位基因，猪为基因敲除的纯合子。
术语“供体细胞”指从中得到核或染色质材料，用于核转移的细胞。如本文其它地方所讨论，核转移可牵涉核或染色质的转移(只有当从供体细胞分离时)或包括此类核或染色质材料的整个供体细胞的转移。
术语“基因修饰”指基因序列(包括编码序列和非编码序列，例如内含子、启动子序列及5′和3′-非翻译序列)中改变基因表达或活性的一个或多个改变。此类修饰包括(例如)插入(例如，插入异源序列例如可选标记和/或终止信号)、删除、移码突变、无义突变、错义突变、点突变或其组合。
术语“受体细胞”指向其中引入供体细胞、供体细胞核或供体细胞染色质的细胞。在核转移之前适当地为受体细胞去核。受体细胞的实例包括卵母细胞、受精卵和两-细胞胚胎的细胞。
“小干扰RNA”(siRNA)指具有特异性干扰蛋白质表达的能力的双链RNA分子。siRNA长度通常从约10个至约30个核苷酸。siRNA分子的长度基于siRNA分子的反义链的长度。
优选实施方案描述
本发明涉及抗猪呼吸与生殖综合征病毒(PRRSV)感染的经基因修饰的猪。PRRSV感染性由三种特定进入介体产生：(1)与硫酸乙酰肝素的首次结合，(2)受唾液酸粘附素(SIGLEC1)结合/内在化，和(3)CD163使病毒内在化/脱壳。因此，防止PRRSV与SIGLEC1和/或PRRSV与CD163之间的相互作用导致PRRSV不能在宿主中建立感染。同样，本发明涉及其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活和/或其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。这些猪也可称为SIGLEC1和/或CD163的敲除猪。
本发明包括其中只有靶基因(SIGLEC1和/或CD163)的一个等位基因已经失活，而其它等位基因仍未受影响的猪。这些动物，本文称为“杂合子”或“半合子”动物，可用于育种法中以产生纯合子突变体。本发明还包括纯合子突变猪，其中通过相同或不同方法使靶基因的两个等位基因失活。相应地，本发明包括经基因修饰的猪，其中：(1)SIGLEC1基因的一个等位基因已经失活；(2)CD163基因的一个等位基因已经失活；(3)SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活；(4)CD163基因的两个等位基因已经失活；(5)SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的一个等位基因已经失活；(6)SIGLEC1基因的一个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活；(7)SIGLEC1基因的一个等位基因和CD163基因的一个等位基因已经失活；或(8)SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活。一般在这些情况的每一种下和本申请的上下文中，CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
为获得本发明的动物进行的基因打靶可通过破坏、去除、修饰或置换靶基因序列导致基因失活。基因失活的方法在本领域中众所周知。例如，可通过向靶基因中插入异源序列(例如可选标记和/或终止密码子)，删除基因的一部分或整个基因，修饰基因(例如通过移码突变、无义突变、错义突变、点突变、用另一核酸序列置换一部分或整个基因)或以上任何组合使靶基因失活。
根据靶向构造的设计，插入序列可置换基因中先前存在的序列或可添加到此类序列中。根据是期望完全敲除基因的功能还是期望维持一定水平降低的功能，可改变靶向构造的设计。在SIGLEC1的情况下，功能的完全敲除可取。通过举例的方法而非限制，可通过删除外显子1的一部分和所有外显子2和3，例如通过用新霉素可选盒置换外显子1的一部分和所有外显子2和3敲除SIGLEC1基因。在一些实施方案中，修饰也可包括在要突变的SIGLEC1基因的序列的任一侧添加LoxP位点。在一些情况下，靶向构造可含有在待插入序列侧面的loxP位点和CRE重组酶。在其它情况下，可使用两-载体系统，其中靶向构造包括在待插入序列侧面的loxP位点并且第二载体包括编码CRE重组酶的转基因。可将CRE重组酶的转基因置于组织特异性启动子的影响下，以致其表达使得SIGLEC1基因在特定细胞谱系中无功能。类似地，抗生素可选盒两侧可为loxP位点，以便后来可使用Cre重组酶将其删除。
在CD163的情况下，期望仅仅使其与PRRSV结合和/或脱壳相关的功能失活，而留下CD163的其它功能受最小影响或不受影响。虽然不受任何特定理论约束，但是由于CD163在血红蛋白-触珠蛋白复合物的结合和内在化中的作用，认为CD163完全敲除可能不能活或可能严重受损。相应地，通过破坏先前证实在PRRSV感染中起主导作用(Van Gorp等，2010)的CD163的第五个N端清道夫受体富半胱氨酸(SRCR)结构域，而留下其它结构域不受影响使CD163失活。可通过(例如)引入改变该结构域的结构的点突变或通过用另一结构域交换该结构域基因修饰SRCR结构域5。例如，因为已经证实该结构域“交换”使培养细胞中的相对PRRSV感染性降低至0％，所以可用来自CD163配体(CD163L)的SRCR结构域8置换SRCR结构域5(Van Gorp等2010)。
在其它方法中，靶基因的编码序列并未改变或改变最小，而靶向影响靶基因表达的序列，例如启动子序列。在任何情况下，为利于鉴定其中已经发生靶向的细胞，可选标记插入往往的可取的。若需要，稍后可通过(例如)Cre-Lox或类似系统去除此类标记或其它插入序列。
靶向基因修饰使用具有与靶基因(例如，SIGLEC1或CD163)或靶基因的侧翼区有同源性的区域的核酸构造，使得所述构造整合至基因组中通过改变基因的序列和/或通过改变基因的表达水平改变基因的表达。因此，为了改变基因，通常将靶向构造设计为含有三个主要区域：(i)与要靶向的基因座(例如，SIGLEC1或CD163基因或其侧翼序列)同源的第一区域，(ii)为特异性置换靶向基因座的一部分或插入靶向基因座的异源多核苷酸序列(例如，编码可选标记例如抗生素抗性蛋白)的第二区域，和(iii)和第一区域一样，与靶向基因座同源，但是通常与构造的第一区域不连续的第三区域。靶向构造与靶向野生型基因座之间的同源重组导致在靶向载体中表现出同源性的两个区域之间任一基因座序列的缺失，异源序列置换该序列或异源序列插入该序列(例如，编码可选标记的异源序列)。在实施例1中描述了进行此类靶向修饰的示例性构造和载体；然而，在本领域中已知可用于此类方法的其它载体并且可容易地适用于本发明。
为了促进同源重组，靶向载体的第一和第三区域(见上文)包括表现出与待靶向基因(或侧翼区)的大体序列同一性的序列。例如，靶向载体的第一和第三区域可具有与靶向基因或侧翼区至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。通常使用其中指定了缺省参数的
(基本局部比对搜索工具)或
2测量序列同一性(见，Altschul等，J.Mol.Biol.215：403-410，1990；Tatiana等，FEMS Microbiol.Lett.174：247-250，1999)。因此，与靶向基因座有至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或甚至约100％序列同一性的序列可用于本发明中以促进同源重组。
同源的两个区域(即，上述第一和第三区域)的总尺寸可为(例如)约2千碱基(kb)至约25kb(例如，约4kb至约20kb，约5kb至约15kb或约6kb至约10kb)。置换靶向基因座的一部分或插入靶向基因座的区域的尺寸(如上所述的第二区域)可为(例如)约0.5kb至约5kb(例如，约1kb至约4kb或约3至约4kb)。
可使用各种类型的靶向构造递送方法。可使用细胞转染法，包括磷酸钙、脂质转染、电穿孔和注核，递送靶向构造。如果在正在使用的细胞类型中所述基因有转录活性，则可采用无启动子可选标记策略，以便将仅在在转录单元中有重组事件的细胞中发现抗生素抗性。可选地，如果在正在使用的细胞类型中所述基因无转录活性，可使用为诱导型、组织特异性或含有绝缘子例如基质结合区(MAR)的启动子。
可选地，siRNA技术可用于“沉默”SIGLEC1的转录产物。反义技术在本领域中众所周知。简言之，使用通常含有约19至约29个核苷酸，与SIGLEC1的有义mRNA序列互补的核苷酸序列。互补性程度范围通常从约70％到约100％。优选地，互补性大于约80％，更优选地大于约90％，并且甚至更优选地大于约95％。通过比较设计成与SIGLEC1mRNA的不同区域互补的几种反义序列防止SIGLEC1蛋白生成的效力，可容易地确定SIGLEC1mRNA适合用siRNA靶向的区域。可通过本领域的任何已知技术容易地进行此类实验，无需过度实验。
用于siRNA表达的载体在本领域中众所周知。载体可为整合至宿主基因组中或保持为附加体形式的任何环状或线性长度的DNA。一般而言，siRNA表达盒可连接至DNA转移载体中，例如质粒或慢病毒、腺病毒、甲病毒、逆转录病毒或其它病毒载体。示例性哺乳动物病毒载体系统包括腺病毒载体；腺相关1型(“AAV-1”)或腺相关2型(“AAV-2”)病毒载体；丁型肝炎载体；活减毒丁型病毒；疱疹病毒载体；甲病毒载体；或逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)。
可根据本领域已知的标准技术进行哺乳动物细胞的转化。任何众所周知的将外源核苷酸序列引入宿主细胞的过程均可使用，只要它们至少成功地将siRNA构造引入宿主细胞中。这些过程包括使用病毒转导(例如，通过使用前一段落中所列的任何病毒载体，例如通过逆转录病毒感染，任选在聚凝胺的存在下以增强感染效率)、磷酸钙转染、电穿孔、生物溶解颗粒递送系统(即，基因枪)、脂质体、显微注射和任何其它已知的将克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遗传物质引入宿主细胞中的方法。在本发明中，将针对SIGLEC1的siRNA引入供体猪成纤维细胞中，随后用于产生本发明的经转基因修饰的猪。
可使用下列通用的体细胞核转移过程获得本发明的转基因猪。简言之，通过如上所述的基因打靶基因修饰猪体细胞(例如，胎儿成纤维细胞)的基因组，以产生供体细胞。然后将此类经基因修饰的供体细胞的核(或整个供体细胞，包括核)转移到受体细胞，例如去核卵母细胞中。供体细胞可与去核卵母细胞融合，或可将供体核或供体细胞本身注入受体细胞中或注入与卵母细胞膜相邻的卵周隙。
因此，获得已经靶向靶基因(如上所述，一个或两个等位基因)的体细胞后，可进行核转移。任选地，在核转移之前可冷藏经基因修饰的供体细胞。可使用的受体细胞包括卵母细胞、已受精的受精卵或两-细胞胚胎的细胞，其全部可能已经去核或可能未去核。
受体卵母细胞可使用本领域已知的方法获得或可从商业来源(例如，BoMed Inc.，Madison，Wis.)购买。可从“小母猪”，从来没有后代的母猪或从“大母猪”，先前已经生产后代的母猪获得卵母细胞。
相应地，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪可通过为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活SIGLEC1等位基因；并激活所述卵母细胞以产生胚胎来产生。类似地，其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，可通过为猪卵母细胞去核；使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活CD163等位基因；并激活所述卵母细胞以产生胚胎来产生。两种方法可进一步包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道，其中所述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩所述胚胎产生其基因组包含至少一个失活SIGLEC1和/或CD163等位基因的经基因修饰的猪。本发明还涉及此类经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活和/或其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
本领域已知为猪卵母细胞去核的方法，并且可通过任何标准方法完成去核。例如，可在显微操作培养基中用微量移液管完成为卵母细胞去核。
可通过使来自供体哺乳动物细胞的膜结合核的膜与去核受体哺乳动物卵母细胞的膜融合在一起形成含有来自供体哺乳动物细胞的核的卵母细胞，进行来自供体猪细胞的膜结合核向去核受体猪卵母细胞的引入，以形成含有供体核的卵母细胞。可选地，此类引入可通过将来自哺乳动物供体细胞的膜结合核显微注射至去核受体哺乳动物卵母细胞中进行，以形成含有来自供体哺乳动物细胞的核的卵母细胞。例如，人们可将供体细胞(或核)引入透明带下方的间隙或引入去核、受体卵母细胞的卵周隙，并且随后进行膜融合以产生在其细胞质中含有供体核的卵母细胞。本领域普通技术人员已知的将供体核物质引入去核受体哺乳动物卵母细胞中的所有方式在本文公开的方法中均有用。
例如，可在融合培养基中进行融合步骤。可选地，可使用灭活病毒或融合剂例如聚乙二醇(PEG)促进融合。见，例如，Graham(1969)Wistar Inst.Symp.Monogr.9：19-33和McGrath等(1983)Science220：1300-1302中病毒的用途；Fisher等(1981)Tech.Cell.Physiol.1：1-36中化学诱导的细胞融合；和Berg(1982)Bioelectrochem.Bioenerg.9：223-228和Robl等(1987)J.Anim.Sci.64：642-647中电诱导的细胞融合。
其内容据此通过引用并入的US6,211,429B1描述了活化的卵母细胞体外和体内发育的方法。术语“活化的”或“活化”指用卵母细胞改性剂和还原剂处理后，未受精的卵母细胞至少发育至或超过原核期的能力。一般而言，在这样处理约三至七小时后达到原核期。术语“卵母细胞改性剂”指可与卵母细胞上或卵母细胞内的基质反应的试剂，例如硫醇(-SH)基，可为蛋白质硫醇基；当接着根据US6,211,429B1中公开的方法用还原剂处理卵母细胞时，该反应的作用导致哺乳动物卵母细胞活化。
联合使用-SH或卵母细胞改性剂(例如硫柳汞)和-SH还原剂(例如二硫苏糖醇)能够诱导哺乳动物卵母细胞完全活化。在用还原剂例如DTT处理之前用硫柳汞短期处理与仅仅一个钙瞬变的联合在实现活化中特别有效。硫柳汞在哺乳动物卵母细胞中引起一系列Ca2+峰，这样当接着用还原剂例如DTT培养时可刺激原核形成。因此，在洗掉硫柳汞后，再添加DTT以逆转硫柳汞的作用，接着将其洗掉以使胚胎继续发育。硫柳汞/DTT联合处理还诱导皮质颗粒胞吐作用，透明带随后硬化并且活化卵母细胞发育至胚泡期。
除硫柳汞外，可使用其它卵母细胞改性剂，例如叔丁基氢过氧化物；硫脲；苯肾上腺素；N-烷基马来酰亚胺例如N-乙基马来酰亚胺；氧化型谷胱甘肽；α-卤酸例如碘乙酸盐、氯乙酸盐和溴乙酸盐；碘乙酰胺；对汞苯甲酸；对氯汞苯甲酸；5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)；(2-三甲基铵)乙基甲硫磺酸酯(MTSET)；和(2-磺酰乙基)甲硫磺酸酯(MTSES)。除DTT外，有用的还原剂例如硫醇(-SH)基还原剂包括但不限于二硫赤藓糖醇(DTE)；β-巯基乙醇；半胱氨酸；还原型谷胱甘肽；还原型硫脲；巯基乙酸盐；和抗坏血酸。
卵母细胞与卵母细胞改性剂接触的时间周期是当接着用还原剂处理时引起卵母细胞活化有效的周期。此类时间周期可在约5分钟至约20分钟，优选约5分钟至约15分钟，或更优选5分钟至约12分钟范围内。当先用卵母细胞改性剂处理时，卵母细胞与还原剂接触的时间周期适当足够长以引起卵母细胞活化。此类时间周期可在约5分钟至约1小时，优选约10分钟至约45分钟，或更优选约20分钟至约40分钟范围内，并且还更优选为约30分钟。
在与卵母细胞改性剂接触后，去核卵母细胞与还原剂的接触可大体上立即发生，或可在卵母细胞暴露于卵母细胞改性剂后约5秒至约5分钟范围的时间间隔内发生。经卵母细胞改性剂处理的卵母细胞可转移到含有还原剂的培养基中，无需任何中间洗涤步骤。可选地，在含还原剂的培养基中培养卵母细胞之前，可于对照或含还原剂的培养基中洗涤经卵母细胞改性剂处理的卵母细胞以大体上去除卵母细胞改性剂。作为另一替代方案，可直接将还原剂添加到卵母细胞中，而后者仍存在于含卵母细胞改性剂的培养基中。
可选地，卵母细胞活化也可用不牵涉钙的许多其它化学处理实现，例如蛋白激酶抑制(Mayes等(1995)Biol.Reprod.53：270-275)，或抑制蛋白质合成(Nussbaum等(1995)Mol.Reprod.Dev.41：70-75)。
活化后，通常在体外短期培养卵母细胞。然后将所得胚胎转入雌性代孕体，并且胚胎的发育在代孕体内进行。例如，可培养胚胎约一周，然后手术或非手术转移到代孕体的生殖道。可通过代孕体的卵巢伞将胚胎转入输卵管。可选地，可使用穿过输卵管壁的导管将胚胎转入代孕体的输卵管。转移胚胎的另一种方式牵涉培养胚胎直至胚泡期，接着引入代孕猪的生殖道内。这些方法在本领域众所周知，并且可容易地应用于产生本发明经基因修饰的猪。
另外的产生经基因修饰的猪和其它大型动物的方法在本领域已知并且也用于本发明中(见，例如，US2005/0120400A1；美国专利No.5,995,577；WO95/16670；WO96/07732；WO97/00669；WO9700668；WO2005/104835；Lai等，Reproductive Biology andEndocrinology1：82，2003；Hao等，Transgenic Res.15：739-750，2006；Li等，Biology of Reproduction75：226-230，2006；Lai等，NatureBiotechnology24(4)：435-436，2006；Lai等，Methods in MolecularBiology254(2)：149-163，2004；Lai等，Cloning and Stem Cells5(4)：233-241，2003；Park等，Animal Biotechnology12(2)：173-181，2001；Lai等，Science295：1089-1092，2002；Park等，Biology ofReproduction65：1681-1685，2001；其各自的内容通过引用并入本文)。
产生经基因修饰的猪的其它可行方法包括向体细胞内注射或转导核酸酶(锌指核酸酶或将靶向目标基因的Tal核酸酶)，接着是体细胞核转移和向代孕体转移胚胎。另外，也可采用精子或胞质内精子注射(ICSI)介导的基因修饰。简言之，在ICSI介导的修饰中，靶向构造与精子混合，并将二者注入卵母细胞中。在精子介导的修饰中，所述构造与精子混合，并使用体外受精(IVF)或授精使代孕体受孕。技术人员可容易地将这些方法调节为生产本发明的敲除猪。虽然对猪而言未充分研发，但是正如已经对小鼠研发一样，胚胎干细胞技术或诱导型多能细胞可经基因修饰并且用作体细胞核转移的供体或用于生产嵌合体动物。
正如上面提到的，本发明还涉及经基因修饰的猪，其中(1)SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活，(2)CD163基因的两个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，或(3)SIGLEC1的两个等位基因和CD163的两个等位基因已经失活。可通过使基因失活杂合子猪交配，并筛选子代以鉴定为基因失活纯合子的动物来产生为基因失活纯合子的经基因修饰的猪。本发明还涉及此类经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的一个或两个等位基因已经失活和/或CD163基因的一个或两个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
相应地，本发明涉及通过使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母猪与其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪交配以产生F1子代；并且筛选F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪来产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法。类似地，本发明涉及通过使其中CD163的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的母猪与其中CD163的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的公猪交配以产生F1子代；并且筛选F1子代以鉴定其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪来产生其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法。
本发明还提供了产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法。一种这样的方法包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代；筛选F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪；使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪相互交配以产生F2子代；并且筛选F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
在前面部分中公开了产生其中SIGLEC1的至少一个等位基因和/或CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法。正如本领域中标准的那样，例如可通过PCR或DNA印迹法进行子代的筛选。
产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的另一种方法包括使SIGLEC1失活纯合的经基因修饰的猪与CD163失活纯合的经基因修饰的猪交配以产生F1子代，使F1子代交配以产生F2子代，并且筛选F2子代以鉴定SIGLEC1和CD163失活纯合的动物。
产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的又一种方法包括使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的另一经基因修饰的猪交配以产生F1子代；并且筛选F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
本发明还涉及通过以上任何方法产生的经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的一个或两个等位基因已经失活和/或其中CD163基因的一个或两个等位基因已经失活，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
除可通过牵涉杂合动物的育种方法获得外，也可使用以下方法获得纯合突变动物，其中通过同源重组使在一个等位基因中包括突变的细胞(例如，胎儿成纤维细胞)，例如从使用以上总结的方法产生的动物获得的细胞经受基因打靶以实现对其余等位基因的修饰。然后所得供体细胞可用作经修饰核的来源以核转移至受体细胞，例如去核卵母细胞内，导致形成当植入代孕雌性中时，发育成纯合突变动物的纯合突变胚胎。其中SIGLEC1和/或cD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪也可通过以下产生：将锌指核酸酶或Tal核酸酶(其可同时靶向基因的两个等位基因)注射或转导至体细胞中，接着是体细胞核转移(SCNT)和向代孕体转移胚胎以产生此类猪。本发明还涉及此类经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的一个或两个等位基因已经失活和/或其中CD163基因的一个或两个等位基因已经失活，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
已经详细描述了本发明，显而易见的是在不背离所附权利要求中定义的本发明范围的前体下，修改和变化是可能的。
实施例
为进一步说明本发明提供了下列非限制性实施例。
实施例1
SIGLEC1基因的修饰
用于切除唾液酸粘附素基因的方法利用同源重组去除蛋白质编码外显子并且在唾液酸粘附素基因的其余编码序列中引入提前终止。猪唾液酸粘附素基因(SIGLEC1，NCBI参考序列NM_214346)由5,193个碱基的mRNA转录产物编码210-kDa蛋白质(Vanderheijden等2003)。使用来自唾液酸粘附素基因周围区域的猪基因组序列(基因库登记号CU467609)生成寡核苷酸以通过高保真PCR[AccuTaq(Invitrogen)]扩增基因组片段以生成靶向构造。一个片段(“上臂”)包括第一编码外显子和翻译起点上游的3304bp。第二(“下臂”)片段长度为4753bp并且包括第三编码外显子下游内含子的但部分并延伸到第6个内含子中(包括第4、5和6个编码外显子)。基于和小鼠及人唾液酸粘附素基因组序列的比较，预计猪唾液酸粘附素基因由21个外显子构成(图1A、1B)。在猪、小鼠和人之间外显子2保守。外显子2的氨基酸比对显示，小鼠唾液酸粘附素中已知与唾液酸结合活性相关的六种氨基酸在猪唾液酸粘附素中保守(图1C)。最初的靶向策略集中于在唾液酸粘附素中产生改变，以致预期不会由突变基因获得功能蛋白。其它失活策略可包括靶向修饰唾液酸粘附素基因的外显子2中选定的残基或以预计会妨碍PRRS病毒结合的方式改变免疫球蛋白结构域(可能通过改变其顺序或通过将其取代为来自其它物种的同等结构域)。另外的修饰可包括使新霉素盒或其中一个免疫球蛋白样结构域两侧为loxP位点以在需要时允许诱导型或组织特异性去除。
在当前基因破坏中，通过使用置换型载体(图1D)将外显子1的一部分和所有外显子2和3置换为新霉素可选盒(Mansour等1988)。在质粒构造中，使用磷酸甘油激酶(PGK)启动子驱动新霉素盒的表达以允许对转染克隆的阳性选择。
供体细胞制备
从妊娠第35天开始，从大型商用白色猪(Landrace)分离雄性胎儿成纤维细胞原代细胞系。于含有5mM谷氨酰胺、碳酸氢钠(3.7g/L)、青霉素-链霉素和1g/L d-葡萄糖并且补充了15％Hyclone胎牛血清、10μg/ml庆大霉素和2.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(Sigma)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbeco′s Modified Eagles Medium)(DMEM)培养细胞并使其生长48小时至80％汇合。转染前四小时去除培养基并更换为新鲜培养基。用10ml磷酸盐缓冲盐水(DPBS；Invitrogen)洗涤成纤维细胞并且用1ml的0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)卸入75cm2烧瓶中。使细胞重新悬浮于DMEM中并通过在600×g下离心10分钟收集细胞。用Opti-MEM(Invitrogen)洗涤细胞并且在600×g下再离心10分钟。使用Cytosalts(75％cytosalts[120mM KCl、0.15mM CaCl2、10mM K2HPO4；pH7.6，5mM MgCl2])和25％Opti-Mem使团块重新悬浮(van den Hoff等1992)。用血球计为细胞计数并调节为1×106个细胞/ml。用4μg的单链靶向DNA(通过热变性获得)在200μl由1×106个细胞/ml组成的转染培养基中进行细胞的电穿孔。于BTX ECM2001电细胞操作器中，使用三个250V的1毫秒脉冲电穿孔细胞。按10,000个细胞/13cm板将经电穿孔的细胞稀释于DMEM/FBS/FGF中。培养经电穿孔的细胞过夜，无选择压力。第二天，将培养基更换为含G418(0.6mg/ml)的培养基。10天的选择后，分离G418抗性菌落并转移至24孔板以便扩增。在24孔板中生长之后，将细胞分为6孔板(～一半用于基因组DNA分离)。使用PCR确定唾液酸粘附素基因的靶向是否成功。反应使用在磷酸葡萄糖激酶(PGK)盒(其包括Neo)中退火的寡核苷酸，与在超出靶向臂区域的唾液酸粘附素基因座中退火为基因组DNA的寡核苷酸配对(见图2)。以这种方式评估两条“臂”的成功靶向。鉴定靶向成纤维细胞克隆(4-18)并且使用培养的一些细胞进行核转移(见下文)，而其它的冷冻供将来使用。对同源重组的DNA印迹检验用于提供对成功靶向的追加确认。
卵母细胞的收集和体外成熟(IVM)
ART Inc(Madison，WI)从购买猪卵母细胞并根据供应商的说明使其成熟。体外成熟42-44h后，通过在0.5mg/ml透明质酸酶中轻轻搅拌剥去卵母细胞的卵丘细胞。去除卵丘细胞后，选择形态良好且极体可见的卵母细胞(中期II)并在38.5℃下保存于显微操作培养基直至核转移。
体细胞核转移、核转移复合卵母细胞的融合/活化及体外发育培
养
在显微镜下，用贮藏微量移液管将无卵丘的卵母细胞贮藏于补充了7.5μg/mL细胞松弛素B并覆盖着矿物油的显微操作介质液滴中。细玻璃注射微量吸液管穿过透明带接近第一极体，并且将第一极体和可能含有中期-II的染色体的相邻细胞质吸入移液管中，抽回移液管并丢弃内含物。选择表面光滑的单个、圆形且光亮的供体细胞并转入与卵母细胞膜相邻的卵周隙(Lai等2006；Lai等2002)。
核转移复合物(卵母细胞+成纤维细胞)于具有低钙浓度的融合培养基(0.3M甘露糖醇、0.1mM CaCl2·2H2O、0.1mM MgCl2·6H2O和0.5mM HEPES)中融合。然后通过用200μM硫柳汞在黑暗中处理10分钟活化融合卵母细胞，接着冲洗并用8mM二硫苏糖醇(DTT)处理30分钟；然后再次冲洗卵母细胞以去除DTT(Machaty和Prather2001；Machaty等1997)。融合/活化后，用补充了4mg/mL的BSA(Im等2004)的猪受精卵培养基3(PZM3)洗涤卵母细胞三次，并且在38.5℃下于5％O2、90％N2和5％CO2的增湿氛围中培养30分钟。培养那些已经成功融合的复合物15-21小时直至向代孕体手术转移胚胎。
代孕体制备、胚胎转移、妊娠诊断和分娩
通过使用取决于动情周期阶段的方案施用18-20mg混入饲料中的REGU-MATE(烯丙孕素0.22％溶液)(Intervet，Millsboro，DE)14天同步化代孕小母猪。最后一次REGU-MATE处理(105小时)后，给与IM注射1000个单位的hCG以诱导发情。在适当日期已经自然循环的其它代孕体也包括在代孕体库中。使用发情旺期之日(第0天)或发情旺期后第一天的代孕体(Lai等2002)。无菌制备代孕体并且尾腹切开以暴露出生殖道。通过卵巢伞将胚胎转入一个输卵管。在大约第30天通过腹部超声检查检查代孕体妊娠，然后在整个妊娠期每周检查一次。猪的分娩通常在妊娠114天。
转染和筛选胎儿成纤维细胞后，鉴定候选供体细胞并用于体细胞核转移(SCNT)。向两个代孕体转移六百六十六个SCNT胚胎。一个代孕体在妊娠第115天分娩6只正常小公猪，并且在妊娠第117天对另一代孕体进行剖腹产，产生两只正常小公猪，如表1所示。
表1.使用S/GLEC1+/-雄性供体细胞的胚胎转移结果
| 日期 | 代孕体 | 基因型 | 转移# | 结果 |
| 9/23/2010 | O963 | SIGLEC1+/-♂ | 388 | 1/16/2011出生的6只小公猪 |
| 9/24/2010 | O962 | SIGLEC1+/-♂ | 278 | 1/18/2011剖腹产的2只小公猪 |
图2示出了唾液酸粘附素(SIGLEC1)基因的构成、靶向载体和预期重组基因型。图2的上图示出了用于同源重组的靶向构造。如上所述，用于产生靶向构造的“上”DNA片段含有在外显子1上游的～3.5kb并且包括外显子1的一部分(起始密码子之后)。“下”DNA片段在内含子3中开始并且包括外显子4、5、6及外显子7的一部分。外显子1的大部分和所有外显子2和3经新霉素(neo)盒取代，胸苷激酶(TK)盒在下臂的下游即可用，必要时用作阴性可选标记。图2的下图说明了同源重组后的突变唾液酸粘附素基因。箭头表示用于基于PCR的靶细胞系和克隆猪筛选的寡核苷酸结合位点。如分别表示引物“靶向C的上部sialo”和“反向PGK聚A”(SEQ ID NO：1和3)及“正向PGK启动子”和“7Rw1”(SEQ ID NO：4和6)的箭头所示，通过寡核苷酸退火进行上下臂的靶向。以下表2中列出了寡核苷酸序列。另一次检查PCR利用在切除区域/Neo盒侧面的寡核苷酸(引物“外显子1末端ck”和“反向内含子3ck”(分别为SEQ ID NO：2和5))。在破坏的等位基因和野生型等位基因之间产物尺寸有约500bp差异。
表2.项目中使用的引物名称和序列
| 靶向C的上部sialo | ggaacaggctgagccaataa(SEQ ID NO：1) |
| 外显子1末端ck | gcattcctaggcacagc(SEQ ID NO：2) |
| 反向PGK聚A | ggttctaagtactgtggtttcc(SEQ ID NO：3) |
| 正向PGK启动子 | agaggccacttgtgtagcgc(SEQ ID NO：4) |
| 反向内含子3ck | ctccttgccatgtccag(SEQ ID NO：5) |
| 7Rw1 | caggtaccaggaaaaacgggt(SEQ ID NO：6) |
基于图2的下图中从左至右箭头的位置为表2中的引物分配序列ID号。因此，图2的下图中最左边的箭头示出了“靶向C的上部sialo”引物(SEQ ID NO：1)的位置，向右的下一个箭头示出了“外显子1末端ck”引物(SEQ ID NO：2)的位置，向其右边的下一个箭头示出了“反向PGK聚A”引物(SEQ ID NO：3)的位置等等。
SIGLEC1失活的筛选
从小猪中分离基因组DNA并用于确认靶向事件。通过使用PCR，用在Neo盒中退火，与退火为超出靶向构造中所含区域的SIGLEC1基因组DNA的寡核苷酸配对的寡核苷酸确定SIGLEC1基因的成功靶向。在图3的上图中，通过使用‘反向PGK聚A’和‘靶向C的上部sialo’寡核苷酸(分别为SEQ ID NO：3和1；图2中有说明)检查受‘上’臂的靶向。产生预期尺寸(～4500bp)的产物。在下图中，通过使用‘正向PGK启动子’和‘7Rw1’寡核苷酸(分别为SEQ ID NO：4和6；图2中有说明)检确定受‘下’臂的成功靶向。产生预期尺寸(～5000bp)的产物。‘下臂质粒’对照是含有具有代表外显子3的大部分和外显子7的大部分的唾液酸粘附素基因片段的Neo盒的局部构造。7Rw1寡核苷酸能够退火为质粒中存在的外显子7序列，并且连同正向PGK启动子寡核苷酸一起，能够产生与将由成功靶向事件产生的产物相同的产物。两个图说明了对从由4-18个靶向胎儿成纤维细胞系生成的八个小猪克隆提取的基因组DNA进行的靶向PCR反应。
通过使用PCR，用退火为在唾液酸粘附素基因靶向区域侧面的DNA的寡核苷酸进行野生型和靶向唾液酸粘附素等位基因的检测。使用‘外显子1末端ck’和‘反向内含子3ck’寡核苷酸(分别为SEQID NO：2和5；图2中有说明)。对于野生型等位基因而言生成的产物为～2400bp而对于靶向等位基因而言为～2900bp。图4中，左边的图(图4A)说明了对野生型基因组DNA、用于转染的靶向质粒、来自成功靶向的成纤维细胞克隆(注意两条条带)的基因组DNA(4-18)和来自非靶向成纤维细胞克隆的基因组DNA(4-3)进行的试验反应。右边的图(图4B)说明了对从由4-18个靶向胎儿成纤维细胞系生成的八个小猪克隆提取的基因组DNA进行的反应。每条带上有两种预期尺寸的PCR产物，而野生型DNA和靶向质粒模板仅有一条条带。因此，SCNT产生的所有小猪均为预期突变的杂合子，即SIGLEC+/-。
纯合子动物的产生
鉴定为SIGLEC1失活杂合子的经基因修饰的公猪用作雄性祖先(F0代)，并且与野生型雌性交配以产生有一个失活SIGLEC1等位基因的雄性和雌性动物(F1)。然后F1雄性与F1雌性交配以产生有两个SIGLEC1等位基因均失活的F2子代。出生后可通过以上对SIGLEC1描述的PCR或可选地通过DNA印迹法鉴定此类动物。
实施例2
CD163靶向构造的生成
正如已经确定的那样，与删除或修饰SRCR结构域5一样，删除CD163的胞质结构域消除了PRRSV的感染性。因为CD163的一些SRCR结构域对动物的存活具有重要功能，例如血红蛋白去除，以致这些其它功能保持完整的基因修饰代表了产生抗PRRSV的猪的可靠策略。先前的研究已经表明，用CD163L结构域8置换SRCR5结构域也阻断了感染性(Van Gorp等2010b)。因此，可如图6所示设计靶向构造以将CD163的SRCR5交换为SRCR结构域CD163L。
一旦获得靶向构造，就可通过通常与实施例1中描述的方法相同的方法产生为失活CD163杂合子的经基因修饰的猪，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。首先，将靶向载体插入供体细胞中，其中靶向载体可与内源CD163基因结合。然后选择经这种特定修饰的供体细胞并用于体细胞核转移以产生经基因修饰的胚胎。然后将胚胎转移至代孕体进行足月妊娠。通过PCR或DNA印迹法鉴定有失活CD163等位基因的转基因猪后，允许这些动物达到性成熟，然后用于自然交配以将基因传播给胎儿或后代。
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介绍本发明或其优选实施方案的要素时，冠词“一个(a)”、“一种(an)”、“所述(the)”和“所述(said)”旨在指有一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”旨在为包容性并且指可能有除所列要素外的附加要素。
鉴于上述情况，可见实现了本发明的几个目标并且获得了其它有利结果。
因为在不背离本发明范围的前体下可对以上产物和方法做各种变化，意图是应将以上描述中所含和附图所示的所有问题均解释为说明性而非限制意义。
Claims (49)
1.一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活。
2.一种经基因修饰的猪，其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的经基因修饰的猪，其中CD163基因的两个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
5.一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活，并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活。
6.一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活，通过包括以下的方法产生：
为猪卵母细胞去核；
使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活的SIGLEC1等位基因；和
激活所述卵母细胞以产生胚胎。
7.根据权利要求6所述经基因修饰的猪，通过进一步包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道的方法产生，其中所述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩所述胚胎产生其基因组包含至少一个失活的SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪。
8.一种经基因修饰的猪，其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述经基因修饰的猪通过包括以下的方法产生：
为猪卵母细胞去核；
使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活的CD163等位基因；和
激活所述卵母细胞以产生胚胎。
9.根据权利要求8所述的经基因修饰的猪，通过进一步包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道的方法产生，其中所述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩产生其基因组包含至少一个失活的CD163等位基因的经基因修饰的猪。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的经基因修饰的猪，其中已经通过部分或完全删除使所述至少一个等位基因失活。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的经基因修饰的猪，其中已经使用Cre-lox重组系统使所述至少一个等位基因失活。
12.根据权利要求1、3-7、10和11中任一项所述的经基因修饰的猪，其中已经通过删除外显子1的一部分和所有外显子2和3使所述SIGLEC1等位基因失活。
13.根据权利要求2-5和8-11中任一项所述的经基因修饰的猪，其中已经通过用CD163L的清道夫受体富半胱氨酸(SRCR)结构域8置换外显子7使CD163等位基因失活。
14.根据权利要求6-13中任一项所述的经基因修饰的猪，其中所述去核在显微操作培养基中用微量移液管进行。
15.根据权利要求6-14中任一项所述的经基因修饰的猪，其中所述融合在融合培养基中进行。
16.根据权利要求6-15中任一项所述的经基因修饰的猪，其中激活所述卵母细胞包括在硫柳汞(thimerosal)的存在下培养所述卵母细胞。
17.根据权利要求7和9-16中任一项所述的经基因修饰的猪，其中所述转移包括通过代孕体的卵巢伞将所述胚胎转入输卵管。
18.一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活，通过包括以下的方法产生：
使根据权利要求1、6和7中任一项所述的经基因修饰的公猪与根据权利要求1、6和7中任一项所述的经基因修饰的母猪交配以产生F1子代；并且
筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
19.一种经基因修饰的猪，其中CD163基因的两个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述经基因修饰的猪通过包括以下的方法产生：
使根据权利要求2、8和9中任一项所述的经基因修饰的公猪与根据权利要求2、8或9中任一项所述的经基因修饰的母猪交配以产生F1子代；
筛选所述F1子代以鉴定其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
20.一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述经基因修饰的猪通过包括以下的方法产生：
使根据权利要求1、6或7所述的经基因修饰的母猪与根据权利要求2、8或9所述的经基因修饰的公猪交配或使根据权利要求1、6或7所述的经基因修饰的公猪与根据权利要求2、8或9所述的经基因修饰的母猪交配以产生F1子代；
筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪；
使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪相互交配以产生F2子代；并且
筛选所述F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
21.一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述经基因修饰的猪通过包括以下的方法产生：
使根据权利要求3或18所述的经基因修饰的母猪与根据权利要求4或19所述的经基因修饰的公猪交配或使根据权利要求3或18所述的经基因修饰的公猪与根据权利要求4或19所述的经基因修饰的母猪交配以产生F1子代；
使所述F1子代交配以产生F2子代；并且
筛选所述F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
22.一种经基因修饰的猪，其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述经基因修饰的猪通过包括以下的方法产生：
使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与另一其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代；并且
筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
23.根据权利要求18或19所述的经基因修饰的猪，其中所述筛选包括使用聚合酶链反应(PCR)或DNA印迹(Southern blot)。
24.根据权利要求6-23中任一项所述的经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活。
25.根据权利要求6-23中任一项所述的经基因修饰的猪的子代，其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
26.根据权利要求6-23中任一项所述的经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
27.根据权利要求6-23中任一项所述经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
28.一种产生其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，所述方法包括：
为猪卵母细胞去核；
使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活SIGLEC1等位基因；和
激活所述卵母细胞以产生胚胎。
29.根据权利要求28所述的方法，进一步包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道，其中所述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩产生其基因组包含至少一个失活SIGLEC1等位基因的经基因修饰的猪。
30.一种产生其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述方法包括：
为猪卵母细胞去核；
使所述卵母细胞与供体猪成纤维细胞融合，所述成纤维细胞的基因组包含至少一个失活CD163等位基因；和
激活所述卵母细胞以产生胚胎。
31.根据权利要求30所述的方法，进一步包括将所述胚胎转入代孕猪的生殖道，其中所述代孕猪已经开始发情但尚未完成排卵；并且其中妊娠和足月分娩产生其基因组包含至少一个失活CD163等位基因的经基因修饰的猪。
32.一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，所述方法包括：
使通过根据权利要求28或29所述的方法产生的经基因修饰的母猪与通过根据权利要求28或29所述的方法产生的经基因修饰的公猪交配以产生F1子代；
筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
33.一种产生其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述方法包括：
使通过根据权利要求30或31所述的方法产生的经基因修饰的母猪与通过根据权利要求30或31所述的方法产生的经基因修饰的公猪交配以产生F1子代；
筛选所述F1子代以鉴定其中CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
34.根据权利要求28-33中任一项所述的方法，其中已经通过部分或完全删除使所述至少一个等位基因失活。
35.根据权利要求28-34中任一项所述的方法，其中已经使用Cre-lox重组系统使所述至少一个等位基因失活。
36.根据权利要求28、29、32、34和35中任一项所述的方法，其中已经通过删除外显子1的一部分和所有外显子2和3使所述SIGLEC1等位基因失活。
37.根据权利要求30、31和33-35中任一项所述的方法，其中已经通过用CD163L的清道夫受体富半胱氨酸(SRCR)结构域8置换外显子7使CD163等位基因失活。
38.根据权利要求28-37中任一项所述的方法，其中所述去核在显微操作培养基中用微量移液管进行。
39.根据权利要求28-38中任一项所述的方法，其中所述融合在融合培养基中进行。
40.根据权利要求28-39中任一项所述的方法，其中激活所述卵母细胞包括在硫柳汞的存在下培养所述卵母细胞。
41.根据权利要求29和31-40中任一项所述的方法，其中所述转移包括通过代孕体的卵巢伞将所述胚胎转入输卵管。
42.一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述方法包括：
使根据权利要求1、6或7所述经基因修饰的母猪与根据权利要求2、8或9所述经基因修饰的公猪交配或使根据权利要求1、6或7所述经基因修饰的公猪与根据权利要求2、8或9所述经基因修饰的母猪交配以产生F1子代；
筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪；
使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活并且CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪相互交配以产生F2子代；并且
筛选所述F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
43.一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述方法包括：
使根据权利要求3或18所述经基因修饰的母猪与根据权利要求4或19所述经基因修饰的公猪交配或使根据权利要求3或18所述经基因修饰的公猪与根据权利要求4或19所述经基因修饰的母猪交配以产生F1子代；
使所述F1子代交配以产生F2子代；并且
筛选所述F2子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
44.一种产生其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪的方法，其中CD163基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白，所述方法包括：
使其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪与另一其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活的经基因修饰的猪交配以产生F1子代；并且
筛选所述F1子代以鉴定其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活的经基因修饰的猪。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中所述筛选包括使用聚合酶链反应(PCR)或DNA印迹。
46.通过根据权利要求28-45中任一项所述的方法产生的经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因已经失活。
47.通过根据权利要求28-45中任一项所述的方法产生的经基因修饰的猪的子代，其中CD163基因的至少一个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
48.通过根据权利要求28-45中任一项所述的方法产生的经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的至少一个等位基因和CD163基因的至少一个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
49.通过根据权利要求28-45中任一项所述的方法产生的经基因修饰的猪的子代，其中SIGLEC1基因的两个等位基因和CD163基因的两个等位基因已经失活，其中CD163等位基因的失活产生不能结合和/或使猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)脱壳的CD163蛋白。
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