ES2691618T3

ES2691618T3 - Animales resistentes al virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino

Info

Publication number: ES2691618T3
Application number: ES12785983.3T
Authority: ES
Inventors: Randall S. Prather; Kevin D. Wells; Kristin M. Whitworth
Original assignee: University of Missouri System
Current assignee: University of Missouri System
Priority date: 2011-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2018-11-28
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: EP2709445A4; CY1120890T1; AU2018256670A1; JP2022081637A; DK2709445T3; MX2013013427A; JP2014519323A; AU2017202540A1; AU2018256670B2; WO2012158828A1; CA3184311A1; CN105112450A; CN111593025A; BR112013029498A8; PL2709445T3; US11019809B2; JP2017158579A; CN103687482A; SI2709445T1; BR112013029498A2

Abstract

Un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado.

Description

DESCRIPCIÓN

Animales resistentes al virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino 5 CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, en general, a cerdos modificados genéticamente en los que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado y/o al menos un alelo de un gen CD 163 se ha inactivado. También se proporcionan métodos para la producción de dichos cerdos transgénicos.

10

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) es una de las enfermedades porcinas más importantes en términos económicos. Esta enfermedad se detectó por primera vez en Estados Unidos en 1987 (Keffaber 1989) y en 15 Europa en 1990 (Wensvoort et al. 1991). El análisis molecular de los virus de PRRS (PRRSV) prototípicos VR-2332 y Lelystad (aislados de Estados Unidos y Europa, respectivamente) sugiere que cepas evolucionadas divergentemente surgieron en los dos continentes de forma casi simultánea, posiblemente debido a cambios similares en las prácticas de manejo porcino (Murtaugh et al. 1995; Nelsen et al. 1999). Desde su aparición inicial, este virus se ha propagado a todo el mundo, y se ha detectado el PRRSV del genotipo europeo en piaras de cerdos 20 en Estados Unidos (Ropp et al. 2004). El PRRs se caracteriza por la enfermedad respiratoria grave y en ocasiones mortal y el fallo reproductivo, aunque también predispone a los cerdos infectados a patógenos bacterianos, así como a otros patógenos virales (Benfield et al. 1992), y es un componente fundamental del Complejo de Enfermedades Respiratorias Porcinas (PRDC). Las lesiones patológicas más consistentes causadas por el PRRSV durante la infección aguda son la neumonía intersticial y la encefalitis linfocítica leve (Plagemann 1996). Después de la fase 25 aguda de la infección por PRRSV, que típicamente está caracterizada por la viremia y la enfermedad clínica, muchos cerdos se recuperan por completo, si bien portan una infección viral de nivel bajo durante un periodo de tiempo extendido. Estos cerdos "portadores" están infectados persistentemente con PRRSV y diseminan el virus, ya sea de forma intermitente o continua, y pueden infectar a los cerdos no infectados tras el contacto directo o indirecto. En condiciones experimentales, la infección persistente con PRRSV se ha documentado bien (Albina et al. 1994; 30 Allende et al. 2000; Benfield et al. 1998; Christopherhennings et al. 1995; Sur et al. 1996; Yoon et al. 1993). De forma mucho más notable, se ha recuperado el virus infeccioso durante hasta 157 días después de la infección (Wills et al. 1997). Los macrófagos tisulares y los monocitos son las principales células diana durante la infección tanto aguda como persistente (Molitor et al. 1997), aunque también se ha demostrado la infección de los neumocitos y las células germinales epiteliales de los testículos (Sur et al. 1996; Sur et al. 1997).

35

El agente etiológico del PRRS es un virus de ARN de cadena positiva con envoltura que es miembro de la familia Arteriviridae, del orden Nidovirales. Otros miembros de la familia Arteriviridae incluyen el virus elevador de lactato deshidrogenasa (LDV) de ratones, el virus de la arteritis equina (EAV) y el virus de la fiebre hemorrágica del simio (SHFV). El análisis de los datos de la secuencia genómica revela una extensa diversidad entre las cepas de PRRSV, 40 aunque también dominios bien conservados (Andreyev et al. 1997; Meng 2000; Meng et al. 1995). La organización genómica del PRRSV es similar al de otros Arterivirus, donde el ARN genómico funciona como el ARN mensajero para las proteínas replicasa ORF1a (Plagemann 1996). ORF1a y 1b comprenden aproximadamente el 80 % del genoma viral y codifican la ARN polimerasa dependiente del ARN, así como las poliproteínas que se procesan para obtener otras proteínas no estructurales (Snijder y Meulenberg 1998). Usando el virus Lelystad, se ha determinado 45 que las ORF 2-7 codifican las proteínas estructurales virales. La proteína codificada por ORF 5 (GP5) y M (Van Breedam et al. 2010b) puede desempeñar una función en la inducción de la apoptosis por PRRSV (Suarez et al. 1996; Sur et al. 1997) y se cree que es la proteína de unión viral en el virus elevador de lactato deshidrogenasa que está estrechamente relacionado. Las glucoproteínas de membrana menores GP2a y GP4 del PRRSV interactúan con CD163 (Das et al. 2010). Hay datos que sugieren que la unión a SIGLEC1 (lectina de tipo Ig de unión a ácido 50 siálico 1) es necesaria para el ingreso a las células, y de hecho la unión dual tanto a SIGLEC1 como CD163 parece ser necesaria para la infección viral (Van Gorp et al. 2008).

Muchas características tanto de la patogénesis (especialmente a nivel molecular) como de la epizootiología del PRRSV se comprenden muy poco, dificultando de este modo los esfuerzos de control. Para lograr una mejor 55 comprensión, se han desarrollado clones infecciosos para el PRRSV (Nielsen et al. 2003). Hoy en día, los productores a menudo vacunan a los cerdos contra el PRRSV con cepas vivas atenuadas modificadas o vacunas de virus muertos. Sin embargo, las vacunas actuales no proporcionan una protección satisfactoria, debido a la variación de la cepa y a la estimulación inadecuada del sistema inmunitario. Es posible una respuesta inmunitaria protectora, dado que se ha demostrado que la exposición previa puede proporcionar una protección completa cuando se

estimula a los cerdos con una cepa homologa de PRRSV (Lager et al. 1999). Sin embargo, nunca se ha demostrado consistentemente la inmunidad protectora para el estímulo con cepas heterólogas. Además de las preocupaciones sobre la eficacia de las vacunas contra el PRRSV disponibles, existen pruebas contundentes de que la vacuna viva modificada que se usa actualmente puede persistir en cerdos individuales y piaras de cerdos y acumular mutaciones 5 (Mengeling et al. 1999), como se ha demostrado con aislados de campo virulentos tras la infección experimental de los cerdos (Rowland et al. 1999). Además, se ha demostrado que el virus de la vacuna se disemina en el semen de los cerdos vacunados (Christopherhennings et al. 1997). Como alternativa a la vacunación, algunos expertos proponen una estrategia de "prueba y retirada" en las piaras de reproducción (Dee y Molitor 1998). El uso exitoso de esta estrategia depende de la retirada de todos los cerdos infectados de forma aguda o persistente con PRRSV 10 seguida de controles estrictos para evitar la reintroducción del virus. La dificultad, y gran parte del coste, que se asocia a esta estrategia es que hay poco conocimiento sobre la patogénesis de la infección por PRRSV persistente y, por lo tanto, no hay técnicas fiables para identificar a los cerdos infectados de forma persistente.

Un presunto receptor celular para PRRSV se ha identificado mediante anticuerpos monoclonales, se ha purificado y 15 secuenciado (Vanderheijden et al. 2003; Wissink et al. 2003) y denominado SIGLEC 1. Esta molécula es similar a las sialoadhesinas y se demostró que media la entrada del PRRSV a las células no susceptibles, pero una línea celular recombinante que expresa este receptor no logró soportar la replicación productiva del PRRSV (Vanderheijden et al. 2003). Cabe destacar que se ha demostrado que las moléculas de ácido siálico presentes en la superficie del PRRSV son necesarias para la infección de los macrófagos alveolares. Después de la unión viral a este receptor, se 20 produce la entrada del PRRSV mediante endocitosis mediada por receptor (Nauwynck et al. 1999). La función fundamental de la sialoadhesina para la entrada del PRRSV se estableció mediante experimentos en los que la absorción viral se demostró en células PK15 (una línea celular no permisiva para la replicación del PRRSV) que se transfectaron con sialoadhesina porcina clonada, pero no en células PK15 de control no transfectadas (Vanderheijden et al. 2003). La investigación adicional por parte de este mismo grupo demostró que las 25 interacciones entre el ácido siálico en la superficie del virión del PRRSV y la molécula de sialoadhesina eran esenciales para la infección por PRRSV de los macrófagos alveolares (Delputte y Nauwynck 2004). Una estrategia inversa, es decir, eliminar el ácido siálico en la superficie del PRRSV o la preincubación con lectinas específicas del ácido siálico, también tuvo como resultado el bloqueo de la infección (Delputte et al. 2004; Delputte y Nauwynck 2004; Van Breedam et al. 2010b). Independientemente de la investigación específica sobre la entrada del PRRSV, 30 se ha utilizado mutagénesis de sitio dirigido para identificar seis residuos de aminoácidos fundamentales necesarios para la unión de la sialoadhesina murina al ácido siálico (Vinson et al. 1996), que es un 69 % idéntica a la sialoadhesina porcina. Cabe destacar que los seis aminoácidos identificados en la sialoadhesina murina también se conservan en la molécula porcina.

35 SIGLEC 1 es un receptor transmembrana de una familia de lectinas de tipo inmunoglobulina de unión a ácido siálico. Se describió en primer lugar como un receptor de unión a eritrocitos de oveja de los macrófagos de ratón (Crocker y Gordon 1986). Se expresa en los macrófagos en los tejidos hematopoyético y linfoide. Las SIGLEC consisten en un dominio del conjunto V N-terminal que contiene el sitio de unión a ácido siálico seguido de un número variable de dominios del conjunto C2, y después un dominio transmembrana y una cola citoplasmática. A diferencia de otras 40 SIGLEC, SIGLEC1 no tiene un motivo a base de tirosina en la cola citoplasmática (Oetke et al. 2006). El sitio de unión a ácido siálico se mapeó en el dominio de conjunto V de tipo inmunoglobulina N-terminal (Nath et al. 1995). El residuo R116 parece ser uno de los aminoácidos importantes para la unión al ácido siálico (Crocker et al. 1999; Delputte et al. 2007). Por lo tanto, un dominio N-terminal intacto es tanto necesario como suficiente para la unión del PRRSV a SIGLEC1 (Van Breedam et al. 2010a). Se informó de una inactivación de SIGLEC 1 en ratones y dio como 45 resultado ratones que eran viables y fértiles y que no mostraban anomalías de desarrollo (Oetke et al. 2006). Sin embargo, estos ratones tenían cambios sutiles en las poblaciones de linfocitos B y T y un nivel de inmunoglobulina M reducido.

El proceso de infección del PRRSV comienza con la unión inicial al heparán sulfato en la superficie del macrófago 50 alveolar. Después se produce la unión segura a la sialoadhesina (SIGLEC1, también denominada CD169 o SN). Después, el virus se internaliza mediante endocitosis mediada por claterina. Después, otra molécula, CD163, facilita la desenvoltura del virus en el endosoma (Van Breedam et al. 2010a). Se libera el genoma viral y se infecta la célula.

CD163 tiene 17 exones y la proteína está compuesta de una región extracelular con 9 dominios de receptores 55 depuradores ricos en cisteína (SRCR), un segmento transmembrana y una cola citoplasmática corta. El corte y empalme diferencial de un único gen da como resultado diversas variantes diferenciales (Ritter et al. 1999a; Ritter et al. 1999b). Gran parte de esta variación se debe a la longitud de la cola citoplasmática.

CD163 tiene una cantidad de funciones importantes, incluyendo actuar como un receptor depurador de

haptoglobina-hemoglobina. La eliminación de la hemoglobina libre en la sangre es una función importante de CD163, ya que el grupo hemo puede ser muy tóxica (Kristiansen et al. 2001). CD163 tiene una cola citoplasmática que facilita la endocitosis. La mutación de esta cola da como resultado la absorción reducida del complejo haptoglobina-hemoglobina (Nielsen et al. 2006). Otras funciones de C163 incluyen la adhesión de eritroblastos 5 (SRCR2), ser un receptor de TWEAK (SRCR1-4 y 6-9), un receptor bacteriano (SRCR5), un receptor del Virus Porcino Africano (Sanchez-Torres et al. 2003), y una función potencial como un modulador inmunitario (como se analiza en (Van Gorp et al. 2010a)).

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

10

En un aspecto, la presente invención es un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado y/o al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado, en donde la inactivación del alelo de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV).

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Otro aspecto de la presente invención es un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado, producido mediante un método que comprende enuclear un ovocito porcino; fusionar el ovocito con una célula de fibroblasto porcina donante, comprendiendo el genoma de la célula de fibroblasto al menos un alelo de SIGLEC1 inactivado; y activar el ovocito para producir un embrión.

20

La presente invención también se refiere a un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado, en donde la inactivación del alelo de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), producido mediante un método que comprende enuclear un ovocito porcino; fusionar el ovocito con una célula de fibroblasto 25 porcina donante, donde el genoma de la célula de fibroblasto comprende al menos un alelo de CD163 inactivado; y activar el ovocito para producir un embrión.

Puede producirse un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado por un método que comprende cruzar un cerdo macho modificado genéticamente en el que al menos un alelo del 30 gen SIGLEC1 se ha inactivado con un cerdo hembra modificado genéticamente donde al menos un alelo del gen SIGLEC1 se ha inactivado para producir la progenie F1, y cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 se han inactivado.

Puede producirse un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado 35 por un método que comprende cruzar un cerdo macho modificado genéticamente en el que al menos un alelo del gen CD163 se ha inactivado con un cerdo hembra modificado genéticamente donde al menos un alelo del gen CD163 se ha inactivado para producir la progenie F1, y cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

40 Un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en donde la inactivación del alelo de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), puede producirse por cualquiera de tres métodos. El primero de estos métodos comprende cruzar un cerdo modificado genéticamente que tenga al menos un alelo de SIGLEC1 inactivado con un cerdo modificado genéticamente que tenga al menos un 45 alelo de CD163 inactivado para producir la progenie F1, y cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que al menos un alelo del gen SIGLEC1 se ha inactivado y al menos un alelo del gen CD163 se ha inactivado. Este método comprende además cruzar los cerdos modificados genéticamente en los que al menos un alelo del gen SIGLEC1 se ha inactivado y al menos un alelo del gen CD163 se ha inactivado entre sí para producir la progenie F2 y cribar la progenie F2 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos 50 alelos del gen SIGLEC1 y ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

El segundo de dichos métodos comprende cruzar un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado con un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado para producir la progenie F1, cruzar la progenie F1 para producir la progenie F2, y cribar la 55 progenie F2 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 y ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

El tercero de estos métodos comprende cruzar un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado con otro cerdo modificado genéticamente

en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado para producir la progenie F1, y cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 y ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

5 La presente invención también se refiere a progenie de cualquiera de los cerdos modificados genéticamente descritos anteriormente, en la que: (1) al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado; (2) al menos donde al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado; (3) al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y al menos un alelo de un gen CD163 se han inactivado; o (4) ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado. En dicha progenie en la que uno o ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, la inactivación 10 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV).

La presente invención también se dirige a un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado. El método comprende enuclear un ovocito porcino; fusionar el 15 ovocito con una célula de fibroblasto porcina donante, comprendiendo el genoma de la célula de fibroblasto al menos un alelo de SIGLEC1 inactivado; y activar el ovocito para producir un embrión.

En aun otro aspecto, la presente invención es un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado, en el que la inactivación del alelo de CD163 da como 20 resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Este método comprende enuclear un ovocito porcino; fusionar el ovocito con una célula de fibroblasto porcina donante, comprendiendo el genoma de la célula de fibroblasto al menos un alelo de CD163 inactivado; y activar el ovocito para producir un embrión.

25 La presente divulgación también se dirige a un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado. El método comprende cruzar un cerdo hembra modificado genéticamente que tenga al menos un alelo de SIGLEC1 inactivado con un cerdo macho modificado genéticamente que tenga al menos un alelo de SIGLEC1 inactivado para producir la progenie F1, y cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 se han inactivado.

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La presente invención también está dirigida a un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en el que la inactivación del alelo de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver el PRRSV. Este método comprende cruzar un cerdo hembra modificado genéticamente que tenga al menos un alelo de CD163 inactivado con un cerdo macho 35 modificado genéticamente que tenga al menos un alelo de CD163 inactivado para producir la progenie F1, y cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

Otro aspecto de la presente divulgación es un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que 40 ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en donde la inactivación de los alelos de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). El método comprende cruzar un cerdo modificado genéticamente que tenga al menos un alelo de SIGLEC1 inactivado con un cerdo modificado genéticamente que tenga al menos un alelo de CD163 inactivado para producir la progenie F1, y cribar la progenie F1 para identificar 45 cerdos modificados genéticamente en los que al menos un alelo del gen SIGLEC1 se ha inactivado y al menos un alelo del gen CD163 se ha inactivado. El método comprende además cruzar los cerdos modificados genéticamente en los que al menos un alelo del gen SIGLEC1 se ha inactivado y al menos un alelo del gen CD163 se ha inactivado entre sí para producir la progenie F2 y cribar la progenie F2 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 y ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

50

La presente divulgación también se refiere a otro método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en donde la inactivación del gen CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Este método comprende cruzar un cerdo modificado genéticamente en 55 el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado con un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado para producir la progenie F1, cruzar la progenie F1 para producir la progenie F2, y cribar la progenie F2 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 y ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

La presente divulgación también está dirigida aún a otro método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en donde la inactivación del gen CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). El método comprende cruzar un cerdo modificado 5 genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado con otro cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado para producir la progenie F1, y cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 y ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

10

En otros aspectos, la presente invención se refiere a la progenie de cerdos modificados genéticamente producida mediante cualquiera de los métodos anteriores, en los que uno o ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado y/o en los que uno o ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en los que la inactivación de los alelos de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome 15 reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV).

Otros objetos y características resultarán en parte evidentes y en parte se indicarán en lo sucesivo en el presente documento.

20 BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa la organización del gen de sialoadhesina y el diseño del vector de direccionamiento. Las Figuras 1A y 1B son diagramas esquemáticos que muestran que los genes de sialoadhesina humanos (Figura 1A) y de ratón (Figura 1B) respectivamente están compuestos por 21 exones e incluyen 25 aproximadamente 20 kb. La Figura 1C muestra análisis mutacionales murinos del exón 2 (la secuencia de

ADN del exón 2 como se muestra en la Figura 1C es la SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos codificada por el exón 2 como se muestra en la Figura 1C es la SEQ ID NO: 8). El análisis mutacional reveló 6 aminoácidos que confirieron la unión de la sialoadhesina al ligando (que se muestran en el texto en recuadro/en negrita). La Figura 1D representa un diseño de vector de direccionamiento que se utilizó para 30 sustituir parte del exón 1 y los exones 2 y 3 de SIGLEC1 con codones de terminación. El vector también

incluía un casete de selección de neomicina (neo) impulsado por un promotor PGK.

La Figura 2 representa el diseño del vector de direccionamiento, la organización del gen de sialoadhesina, y la organización del gen de sialoadhesina alterado.

La Figura 3 es una fotografía de un gel que muestra el cribado por PCR para identificar el direccionamiento 35 del gen de sialoadhesina.

La Figura 4 es una fotografía de un gel que muestra el cribado por PCR para identificar la presencia equitativa de alelos de sialoadhesina tanto de tipo salvaje como diana.

La Figura 5 ilustra la organización del dominio estructural de CD163 de tipo salvaje (a la izquierda) que contiene 9 dominios de SRCR extracelulares, 2 dominios ricos en prolina, serina y treonina (PST), una 40 región transmembrana y una cola citoplasmática intracelular. La CD 163 genéticamente modificada se

representa a la derecha. La organización del dominio estructural permanece igual, excepto que el dominio 5 de SRCR se ha reemplazado con el dominio 8 de SRCR del ligando de CD163 (CD163L).

La Figura 6 representa el vector de direccionamiento de CD163, en el que los brazos del vector son secciones de ADN que tienen una secuencia idéntica con la CD163 de origen natural o de tipo salvaje, 45 permitiendo así que el vector se hibride con la CD163 ya presente en las células. El ADN modificado que se

encuentra entre los dos brazos de CD163 puede insertarse entonces en el ADN de las células mediante recombinación homologa.

DEFINICIONES

50

Un "cerdo inactivado" es un cerdo modificado genéticamente en el que la función de uno o ambos alelos de un gen se han alterado, por ejemplo, mediante eliminación genética parcial o completa. Si se inactiva un alelo de un gen, el cerdo es heterocigoto para ese gen inactivado; si se inactivan ambos alelos, el cerdo es homocigoto para el gen inactivado.

55

El término "célula donante" se refiere a una célula a partir de la cual se deriva un núcleo o material de cromatina, para su uso en la transferencia nuclear. Como se analiza en otra parte en el presente documento, la transferencia nuclear puede implicar la transferencia de un núcleo o cromatina solo como aislado de una célula donante, o la transferencia de una célula donante completa, incluyendo tal núcleo o material de cromatina.

El término "modificación genética" se refiere a una o más alteraciones en una secuencia génica (incluyendo secuencias codificantes y secuencias no codificantes, tales como intrones, secuencias promotoras y secuencias 5' o 3' no traducidas) que alteran la expresión o actividad del gen. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, 5 inserciones (por ejemplo, de secuencias heterólogas, tales como marcadores seleccionables y/o señales de terminación), deleciones, mutaciones con desplazamiento del marco, mutaciones sin sentido, mutaciones con cambio de sentido, mutaciones puntuales, o combinaciones de las mismas.

El término "célula receptora" hace referencia a una célula en la que se introduce una célula donante, un núcleo de 10 célula donante o una cromatina de célula donante. Las células receptoras se enuclean de forma adecuada de forma previa a la transferencia nuclear. Los ejemplos de células receptoras incluyen ovocitos, cigotos y las células de embriones de dos células.

"ARN pequeño de interferencia" (ARNsi) hace referencia a moléculas de ARN bicatenario que tienen la capacidad de 15 interferir específicamente con la expresión de proteínas. Los ARNsi generalmente tienen una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleótidos. La longitud de la molécula de ARNsi se basa en la longitud de la cadena antisentido de la molécula de ARNsi.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

20

La presente invención está dirigida a cerdos modificados genéticamente que son resistentes a la infección por el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV). La infectividad del PRRSV es el resultado de tres mediadores de entrada específicos: (1) unión inicial con heparán sulfato, (2) unión/internalización por sialoadhesina (SIGLEC1), y (3) internalización/desenvoltura del virus por CD163. Por lo tanto, la prevención de la interacción entre 25 PRRSV y SIGLEC1 y/o PRRSV y CD163 da como resultado la incapacidad del PRRSV de establecer la infección en un huésped. Como tal, la presente invención está dirigida a cerdos modificados genéticamente, en los que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado y/o en los que al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado, en los que la inactivación del alelo de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). También puede hacerse referencia a 30 estos cerdos como cerdos inactivados para SIGLEC1 y/o CD163.

La invención incluye cerdos en los que solamente un alelo de un gen diana (SIGLEC1 y/o CD163) se ha inactivado, mientras que el otro alelo ha permanecido inalterado. Estos animales, a los que se hace referencia en el presente documento como animales "heterocigotos" o "hemicigotos", pueden usarse en estrategias de reproducción para 35 generar mutantes homocigotos. La invención también incluye cerdos mutantes homocigotos, en los que se inactivan ambos alelos de un gen diana, ya sea por estrategias iguales o distintas. Por consiguiente, la presente invención incluye cerdos modificados genéticamente en los que: (1) un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado; (2) un alelo de un gen CD163 se ha inactivado; (3) ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado; (4) ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado; (5) ambos alelos de un gen SIGLEC1 y un alelo de un gen CD163 se han inactivado; 40 (6) un alelo de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado; (7) un alelo de un gen SIGLEC1 y un alelo de un gen CD163 se han inactivado; o (8) ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado. En cada uno de estos casos y en el contexto de la presente solicitud generalmente, la inactivación del alelo o alelos de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV).

45

El direccionamiento de genes realizado para crear los animales de la invención puede dar como resultado la inactivación de genes mediante la alteración, supresión, modificación o reemplazo de secuencias de genes diana. Los métodos para la inactivación de genes se conocen en la técnica. Por ejemplo, un gen diana puede inactivarse mediante la inserción de una secuencia heteróloga (tal como un marcador seleccionable y/o un codón de 50 terminación) en un gen diana, la eliminación de una parte de un gen o del gen completo, la modificación de un gen (por ejemplo, mediante mutación con desplazamiento del marco, mutación sin sentido, mutación con cambio de sentido, mutación puntual, reemplazo de una parte o la totalidad de un gen con otra secuencia de ácidos nucleicos), o una combinación de cualquiera de las anteriores.

55 Las secuencias insertadas pueden remplazar a secuencias ya existentes en un gen o pueden añadirse a dichas secuencias, dependiendo del diseño de la construcción de direccionamiento. El diseño de las construcciones de direccionamiento puede modificarse, dependiendo de si se desea inactivar por completo la función de un gen o mantener cierto nivel de función. En el caso de SIGLEC1, se desea la inactivación total de la función. A modo de ejemplo no taxativo, el gen SIGLEC1 puede inactivarse mediante la eliminación de parte del exón 1 y la totalidad de

los exones 2 y 3, por ejemplo, mediante el reemplazo de parte del exón 1 y la totalidad de los exones 2 y 3 con un casete seleccionable de neomicina. En algunas realizaciones, la modificación también puede incluir la adición de sitios LoxP en cualquier lado de una secuencia de un gen SIGLEC1 que se mutará. En algunos casos, la construcción de direccionamiento puede contener tanto los sitios loxP que flanquean una secuencia a insertar como 5 la recombinasa CRE. En otros casos, puede usarse un sistema de dos vectores, en el que la construcción de direccionamiento incluye los sitios loxP que flanquean una secuencia a insertar y un segundo vector incluye un transgén que codifica la recombinasa CRE. El transgén para la recombinasa CRE puede ponerse bajo la influencia de un promotor específico de tejido, de modo que su expresión convierte el gen SIGLEC1 no funcional en linajes celulares específicos. De manera similar, el casete seleccionable de antibiótico puede estar flanqueado por sitios 10 loxP de manera que pueda eliminarse en una fase posterior usando la recombinasa Cre.

En el caso de CD163, se desea inactivar solamente su función relacionada con la unión y/o la desenvoltura del PRRSV, dejando las otras funciones de CD163 mínimamente modificadas o no modificadas. Sin quedar ligando a ninguna teoría en particular, se cree que una inactivación completa de CD163 puede no ser viable o podría verse 15 sumamente comprometida debido al papel de CD163 en la unión e internalización de los complejos de hemoglobina- haptoglobina. Por consiguiente, puede inactivarse CD163 mediante la alteración del dominio de receptores depuradores rico en cisteína N-terminal (SRCR) de CD163, que se demostró previamente que desempeña una función principal en la infección por PRRSV (Van Gorp et al., 2010), a la vez que no afecta los otros dominios. El dominio 5 de SRCR puede modificarse genéticamente, por ejemplo, mediante la introducción de mutaciones 20 puntuales que alteren la estructura de este dominio o mediante el cambio de este dominio por otro. Por ejemplo, el dominio 5 de SRCR puede reemplazarse con el dominio 8 de SRCR del Ligando CD163 (CD163L), dado que se ha demostrado que este "cambio" de dominio reduce la infectividad relativa del PRRSV al 0 % en las células cultivadas (Van Gorp et al 2010).

25 En otros enfoques, las secuencias codificantes de un gen diana no se alteran o se alteran mínimamente y, por el contrario, se dirigen las secuencias que influyen en la expresión de un gen diana, tal como las secuencias promotoras. En cualquier caso, a menudo se desea la inserción de marcadores seleccionables para facilitar la identificación de las células en las que ha ocurrido el direccionamiento. Si se desea, dichos marcadores u otras secuencias insertadas pueden eliminarse posteriormente, por ejemplo, sistemas Cre-Lox o similares.

30

La modificación de genes dirigidos usa construcciones de ácido nucleico que tienen regiones de homología con un gen diana (por ejemplo, SIGLEC1 o CD163) o con las regiones flanqueantes de un gen diana, de modo que la integración de la construcción en el genoma altere la expresión del gen, ya sea cambiando la secuencia del gen y/o alterando los niveles de expresión del gen. Por lo tanto, para alterar un gen, se suele diseñar una construcción de 35 direccionamiento para contener tres regiones principales: (i) una primera región que es homologa al locus a direccionar (por ejemplo, el gen SIGLEC1 o CD163, o una secuencia flanqueante del mismo), (ii) una segunda región que es una secuencia de polinucleótidos heteróloga (por ejemplo, que codifica un marcador seleccionable, tal como una proteína de resistencia a antibióticos) que ha de reemplazar específicamente una parte del locus dirigido o se inserta en el locus dirigido, y (iii) una tercera región que, como la primera región, es homologa al locus dirigido, 40 pero típicamente no es contigua a la primera región de la construcción. La recombinación homologa entre la construcción de direccionamiento y el locus de tipo salvaje diana da como resultado la eliminación de cualquier secuencia del locus entre las dos regiones de homología representadas en el vector de direccionamiento y el reemplazo de dicha secuencia con, o la inserción de dicha secuencia de, una secuencia heteróloga (por ejemplo, una secuencia heteróloga que codifica un marcador seleccionable). Un ejemplo de construcción y vector para llevar 45 a cabo dicha modificación dirigida se describe en el Ejemplo 1; sin embargo, en la técnica se conocen otros vectores que pueden usarse en dichas estrategias y pueden adaptarse fácilmente para su uso en la invención.

Para facilitar la recombinación homologa, la primera y la tercera región de los vectores de direccionamiento (véase anteriormente) incluyen secuencias que presentan una identidad de secuencia sustancial con los genes a dirigir (o 50 las regiones flanqueantes). Por ejemplo, la primera y la tercera regiones de los vectores de direccionamiento pueden tener secuencias que sean al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 %, o aproximadamente un 100 % idénticas a los genes o regiones flanqueantes diana. La identidad de secuencia generalmente se mide usando BLAST® (Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico) o BLAST® 2 con 55 los parámetros por defecto especificados en el mismo (véase, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250, 1999). Por lo tanto, las secuencias que tienen al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 %, al menos aproximadamente un 98 %, al menos aproximadamente un 99 % o incluso aproximadamente un 100 % de identidad de secuencia con los locus de los genes diana pueden usarse en la invención para facilitar la recombinación homologa.

El tamaño total de las dos regiones de homología (es decir, la primera y la tercera región descritas anteriormente) puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 2 kilobases (kb) a aproximadamente 25 kb (por ejemplo, de aproximadamente 4 kb a aproximadamente 20 kb, de aproximadamente 5 kb a aproximadamente 15 kb, o de 5 aproximadamente 6 kb a aproximadamente 10 kb). El tamaño de la región que reemplaza una parte del locus diana o que se inserta en el locus diana (la segunda región según lo descrito anteriormente) puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0,5 kb a aproximadamente 5 kb (por ejemplo, de aproximadamente 1 kb a aproximadamente 4 kb o de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 kb).

10 Pueden utilizarse diversos tipos de métodos de administración de construcciones de direccionamiento. Pueden utilizarse métodos de transfección celular, incluyendo fosfato de calcio, lipofección, electroporación e inyección nuclear para administrar la construcción de direccionamiento. Si el gen es transcripcionalmente activo en el tipo de célula que se está usando, entonces puede emplearse una estrategia de marcador seleccionable sin promotor, de manera que se encontrará resistencia a los antibióticos únicamente en las células que experimentaron un evento de 15 recombinación dentro de una unidad transcrita. Como alternativa, si el gen es transcripcionalmente inactivo en el tipo de célula que se está usando, pueden usarse promotores que son inducibles, específicos de tejidos o que contienen aislantes, tal como regiones de unión a la matriz (MAR).

Como alternativa, se puede usar tecnología de ARNsi para "silenciar" la transcripción de SIGLEC1. La tecnología 20 antisentido es conocida en la técnica. Brevemente, se utiliza una secuencia de nucleótidos que contiene en general de aproximadamente 19 a aproximadamente 29 nucleótidos que es complementaria a la secuencia sentido de ARNm de SIGLEC1. El grado de complementariedad está generalmente en el intervalo de aproximadamente el 70 % a aproximadamente el 100 %. Preferiblemente, la complementariedad es mayor de aproximadamente el 80 %, más preferiblemente mayor de aproximadamente el 90 % e incluso más preferiblemente mayor de aproximadamente 95 25 %. Las regiones de ARNm de SIGLEC1 que son adecuadas para el direccionamiento de ARNsi pueden determinarse fácilmente por medio de la comparación de la eficacia de varias secuencias antisentido diseñadas para ser complementarias a diferentes regiones del ARNm de SIGLEC1 en la prevención de la producción de la proteína SIGLEC1. Dichos experimentos pueden realizarse fácilmente sin experimentación innecesaria, por medio de cualquier procedimiento conocido en la técnica.

30

Los vectores utilizados para la expresión de ARNsi son conocidos en la técnica. El vector puede ser de cualquier longitud circular o lineal de ADN que se integra en el genoma huésped o se mantiene en forma episomal. En general, los casetes de expresión de ARNsi pueden ligarse en un vector de transferencia de ADN, tal como un plásmido, o un vector lentiviral, adenoviral, alfaviral, retroviral u otro vector viral. Los ejemplos de sistemas de 35 vectores virales mamíferos incluyen vectores adenovirales; vectores virales adenoasociados tipo 1 ("AAV-1") o adeno-asociados tipo 2 ("AAV-2"); vectores delta de hepatitis; virus delta atenuados vivos; vectores virales del herpes; vectores alfavirales; o vectores retrovirales (incluyendo vectores lentivirales).

La transformación de células mamíferas puede llevarse a cabo de acuerdo con procedimientos estándar conocidos 40 en la técnica. Puede utilizarse cualquiera de los procedimientos conocidos para introducir secuencias de nucleótidos externas en células huésped, siempre que introduzcan de manera exitosa al menos la construcción de ARNsi en la célula huésped. Estos procedimientos incluyen el uso de transducción viral (por ejemplo, mediante el uso de cualquiera de los vectores virales listados en el párrafo anterior, por ejemplo, mediante infección retroviral,

opcionalmente en presencia de polibreno para mejorar la eficiencia de infección), transfección de fosfato de calcio,

45 electroporación, sistemas de administración de partículas biolísticas (es decir, pistolas génicas), liposomas, microinyección y cualquiera de los métodos conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético externo en una célula huésped. En la presente invención, el ARNsi dirigido contra SIGLEC1

se introduce en una célula de fibroblasto porcina donante, que se usa posteriormente para producir un cerdo

modificado transgénicamente de la presente invención.

50

Los animales transgénicos de la invención pueden producirse usando el siguiente procedimiento general de transferencia nuclear de células somáticas. Brevemente, el genoma de una célula porcina somática (por ejemplo, un fibroblasto fetal) se modifica genéticamente mediante direccionamiento de genes como se describe anteriormente, para crear una célula donante. El núcleo de tal célula donante modificada genéticamente (o la célula donante entera, 55 incluyendo el núcleo) se transfiere entonces a una célula receptora, por ejemplo, un ovocito enucleado. La célula donante puede fusionarse con un ovocito enucleado, o se puede inyectar el núcleo donante o la célula donante en si en la célula receptora, o se puede inyectar en el espacio perivitelino, adyacente a la membrana del ovocito.

Por lo tanto, tras obtener las células somáticas en las que se ha ubicado un gen diana (uno o ambos alelos, como se

describió anteriormente), se puede llevar a cabo la transferencia nuclear. Opcionalmente, las células donantes modificadas genéticamente pueden criopreservarse antes de la transferencia nuclear. Las células receptoras que pueden utilizarse incluyen ovocitos, cigotos fertilizados, o células de embriones bicelulares, todas las cuales pueden haber sido o no enucleadas.

5

Los ovocitos receptores pueden obtenerse usando métodos que son conocidos en la técnica o pueden adquirirse en fuentes comerciales (por ejemplo, BoMed Inc., Madison, Wis.). El ovocito puede obtenerse de una "cerda primeriza", un cerdo hembra que no haya tenido crías o de un cerdo hembra que haya producido cría previamente.

10 Por consiguiente, un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado puede producirse mediante la enucleación de un ovocito porcino; fusionar el ovocito con una célula de fibroblasto porcina donante, comprendiendo el genoma de la célula de fibroblasto al menos un alelo de SIGLEC1 inactivado; y activar el ovocito para producir un embrión. De manera similar, un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado, en el que la inactivación del alelo de CD163 da como 15 resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) puede producirse mediante la enucleación de un ovocito porcino; fusionar el ovocito con una célula de fibroblasto porcina donante, donde el genoma de la célula de fibroblasto comprende al menos un alelo inactivado de CD163; y activar el ovocito para producir un embrión. Ambos métodos pueden incluir además una etapa de transferencia del embrión a un tracto reproductivo de un cerdo sustituto, en el que el cerdo sustituto ha iniciado el 20 celo pero no ha completado aún la ovulación; y en donde la gestación y el parto a término del embrión produce un cerdo modificado genéticamente cuyo genoma comprende al menos un alelo de SIGLEC1 y/o CD163 inactivado. La presente invención también se refiere a la progenie de dichos cerdos modificados genéticamente, en los que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado y/o en los que al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado, en los que la inactivación del alelo de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede 25 unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV).

Los métodos para enuclear los ovocitos porcinos se conocen en la técnica y la enucleación puede lograrse mediante cualquiera de los métodos estándar. Por ejemplo, la enucleación de un ovocito puede lograrse con una micropipeta en un medio de micromanipulación.

30

La introducción de un núcleo unido a la membrana desde una célula porcina donante a un ovocito porcino receptor enucleado para formar un ovocito que contenga el núcleo donante puede realizarse fusionando la membrana del núcleo unido a la membrana de la célula de mamífero donante con la membrana del ovocito de mamífero receptor enucleado para formar un ovocito que contenga el núcleo de la célula de mamífero donante. Como alternativa, dicha 35 introducción puede realizarse microinyectando el núcleo unido a la membrana de la célula donante de mamífero al ovocito de mamífero receptor enucleado para formar un ovocito que contenga el núcleo de la célula de mamífero donante. Por ejemplo, se puede introducir una célula (o núcleo) donante en el espacio debajo de la zona pelúcida o en el espacio perivitelino del ovocito receptor enucleado, y después realizar la fusión de la membrana para producir un ovocito que contenga el núcleo donante dentro de su citoplasma. Todos los medios para introducir el material 40 nuclear donante en un ovocito de mamífero receptor enucleado conocidos por los expertos en la técnica son útiles en los métodos divulgados en el presente documento.

Por ejemplo, la etapa de fusión puede realizarse en un medio de fusión. Como alternativa, puede usarse un virus inactivado o un agente fusogénico tal como polietilenglicol (PEG) para promover la fusión. Véase, por ejemplo, 45 Graham (1969) Wistar Inst. Symp. Monogr. 9: 19-33, y McGrath et al. (1983) Science 220: 1300-1302 para el uso de virus; Fisher et al. (1981) Tech. Cell. Physiol. 1:1-36 para la fusión celular inducida químicamente; y Berg (1982) Bioelectrochem. Bioenerg. 9:223- 228, y Robl et al. (1987) J. Anim. Sci. 64:642-647 para la fusión celular inducida eléctricamente.

50 El documento US 6.211.429 B1 describe métodos para el desarrollo in vitro e in vivo de ovocitos activados. El término "activado" o "activación" se refiere a la capacidad de un ovocito no fertilizado de desarrollarse hasta al menos la fase pronuclear, o más allá, después del tratamiento con un agente modificador de ovocitos y un agente reductor. En términos generales, la fase pronuclear se logra alrededor de tres a siete horas después de dicho tratamiento. El término "agente modificador de ovocitos" se refiere a un agente que puede reaccionar con un sustrato 55 sobre o en un ovocito, por ejemplo, un grupo tiol (-SH), que puede ser un grupo tiol de proteínas; el efecto de dicha reacción, cuando va seguida del tratamiento del ovocito con un agente reductor de acuerdo con los métodos divulgados en el documento US 6.211.429 B1, da como resultado la activación de los ovocitos de mamíferos.

El uso combinado de un agente modificador de -SH o de ovocitos tal como timerosal y un agente reductor de -SH tal

como ditiotreitol puede inducir la activación completa de los ovocitos de mamífero. La combinación de un tratamiento corto con timerosal con un único transitorio de calcio antes del tratamiento con un agente reductor tal como DTT es particularmente eficaz para lograr la activación. El timerosal desencadena una serie de picos de Ca2+ en los ovocitos de mamífero que, cuando va seguido de una incubación con un agente reductor tal como DTT, puede estimular la 5 formación pronuclear. Por lo tanto, después de que se elimine por lavado el timerosal, se añade entonces DTT para revertir las acciones del timerosal, seguido de su eliminación por lavado para permitir que el embrión continúe su desarrollo. El tratamiento combinado de timerosal/DTT también induce la exocitosis de los gránulos corticales, el posterior endurecimiento de la zona pelúcida y el desarrollo de los ovocitos activados a la fase de blastocistos.

10 Además del timerosal, pueden usarse otros agentes modificadores del ovocito, tales como hidroperóxido de t-butilo; tiourea; fenilefrina; N-aquilmaleimidas tales como N-etilmaleimida; glutatión oxidado; alfa-haloácidos tales como yodoacetato, cloroacetato y bromoacetato; yodoacetamida; p-mercuribenzoato; p-cloromercuribenzoato; 5,5'- ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB); (2-trimetilamonio)etilmetanotiosulfonato (MTSET); y (2- sulfonatoetil)metanotiosulfonato (MTSES). Los agentes reductores útiles, tales como los agentes reductores grupo 15 tiol (-SH), además de DTT, incluyen, pero sin limitación, ditioeritritol (DTE); beta-mercaptoetanol; cisteína; glutationa reducida; tiourea reducida; tioglicolato; y ácido ascórbico.

El periodo de tiempo durante el cual los ovocitos están en contacto con el agente modificador de ovocitos es un periodo eficaz para dar como resultado la activación de los ovocitos cuando va seguido del tratamiento con un 20 agente reductor. Dicho periodo de tiempo puede estar en el intervalo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 20 minutos, preferiblemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 15 minutos, o más preferiblemente de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 12 minutos. El periodo de tiempo durante el cual los ovocitos están en contacto con el agente reductor es lo suficientemente largo para dar como resultado la activación de los ovocitos cuando va precedido por el tratamiento con un agente modificador de ovocitos. Dicho 25 periodo de tiempo puede estar en el intervalo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 1 hora, preferiblemente de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 45 minutes, más preferiblemente de aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 40 minutes, y aún más preferiblemente aproximadamente 30 minutos.

30 El contacto del ovocito enucleado con el agente reductor después del contacto con el agente modificador de ovocitos puede ocurrir sustancialmente de forma inmediata o puede ocurrir dentro de un intervalo de tiempo en el intervalo de aproximadamente 5 segundos a aproximadamente 5 minutos después de la exposición del ovocito al agente modificador de ovocitos. El ovocito tratado con agente modificador de ovocitos puede transferirse a un medio que contenga el agente reductor sin ninguna etapa de lavado intermedia. Como alternativa, el ovocito tratado con agente 35 modificador de ovocitos puede lavarse en medio de control o que contenga agente reductor para eliminar sustancialmente el agente modificador de ovocitos antes de cultivar el ovocito en medio que contenga agente reductor. Como otra alternativa, el agente reductor puede añadirse directamente al ovocito mientras que este último todavía está presente en medio que contenga agente modificador de ovocitos.

40 Como alternativa, la activación del ovocito también puede lograrse con varios tratamientos químicos diferentes que no implican calcio, por ejemplo, inhibición de proteínas cinasas (Mayes et al. (1995) Biol. Reprod. 53:270-275), o inhibición de la síntesis de proteínas (Nussbaum et al. (1995) Mol. Reprod. Dev. 41:70-75).

Después de la activación, el ovocito generalmente se cultiva durante un breve periodo in vitro. Después, el embrión 45 resultante se transfiere a una hembra sustituta y el desarrollo del embrión procede en la sustituta. Por ejemplo, los embriones pueden cultivarse durante aproximadamente una semana y después transferirse quirúrgicamente o no quirúrgicamente al tracto reproductivo de una sustituta. Los embriones pueden transferirse a un oviducto mediante una fimbria del ovario de la sustituta. Como alternativa, los embriones pueden transferirse a un oviducto de una sustituta usando un catéter que penetra la pared del oviducto. Otra forma de transferir embriones implica cultivarlos 50 hasta la etapa de blastocistos, seguido de la introducción al tracto reproductivo de una cerda sustituta. Estos métodos son conocidos en la técnica y pueden aplicarse fácilmente para la producción de los cerdos modificados genéticamente de la presente invención.

También se conocen en la técnica métodos adicionales para crear cerdos y otros animales grandes modificados 55 genéticamente y también pueden usarse en la presente invención (véanse, por ejemplo, el documento US 2005/0120400 A1; la Pat. de Estados Unidos N.° 5.995.577; los documentos WO 95/16670; WO 96/07732; WO 97/00669; WO 97 00668; WO 2005/104835; Lai et al., Reproductive Biology and Endocrinology 1 :82, 2003; Hao et al., Transgenic Res. 15:739-750, 2006; Li et al., Biology of Reproduction 75:226-230, 2006; Lai et al., Nature Biotechnology 24(4):435-436, 2006; Lai et al., Methods in Molecular Biology 254(2):149-163, 2004; Lai et al., Cloning

and Stem Cells 5(4):233-241, 2003; Park et al., Animal Biotechnology 12(2):173-181, 2001; Lai et al., Science 295:1089-1092, 2002; Park et al., Biology of Reproduction 65:1681-1685, 2001).

Otros métodos posibles para producir cerdos modificados genéticamente incluyen la inyección o transfección de 5 nucleasas (nucleasas con dedos de cinc o nucleasas Tal que estarían dirigidas al gen de interés) en células somáticas, seguido de la transferencia nuclear celular somática y la transferencia del embrión a una sustituta. Además, también puede utilizarse la modificación genética mediada por esperma o por inyección de esperma intracitoplásmico (ICSI). Brevemente, en la modificación mediada por ICSI, se mezcla una construcción de direccionamiento con el esperma, y ambos se inyectan en un ovocito. En la modificación mediada por esperma, la 10 construcción se mezcla con el esperma y se utiliza inseminación o fertilización in vitro (IVF) para impregnar una sustituta. Un experto en la técnica puede ajustar fácilmente estos métodos de producción de cerdos genomanipulados de la presente invención. Aunque no se ha desarrollo completamente para los cerdos, la tecnología de células madre embrionarias o las células pluripotentes inducidas, como se ha producido para los ratones, pueden modificarse genéticamente y utilizarse ya sea como células donantes para la transferencia nuclear 15 celular somática o para la producción de animales quiméricos.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención también está dirigida a cerdos modificados genéticamente en los que (1) ambos alelos del gen SIGLEC1 se han inactivado, (2) ambos alelos de los genes CD163 se han inactivado, en los que la inactivación de los alelos de CD163 da como resultado una proteína CD163 20 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV), o (3) ambos alelos de SIGLEC1 y ambos alelos de CD163 se han inactivado. Los cerdos modificados genéticamente que son homocigotos para la activación génica pueden producirse mediante el cruce de porcinos heterocigotos para la inactivación génica y el cribado de la progenie para identificar animales que son homocigotos para la inactivación del gen o los genes. La presente invención también está dirigida a la progenie de dichos cerdos modificados 25 genéticamente, en los que uno o ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado y/o en los que uno o ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en los que la inactivación de los alelos de CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV).

30 La presente divulgación está dirigida a un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado mediante el cruce de un cerdo hembra modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado con un cerdo macho modificado genéticamente en el que al menos un alelo de SIGLEC1 se ha inactivado para producir la progenie F1; y el cribado de la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 se 35 han inactivado. De forma similar, la presente divulgación está dirigida a un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado mediante el cruce de un cerdo hembra modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado con un cerdo macho modificado genéticamente en el que al menos un alelo de CD163 se ha inactivado para producir la progenie F1; y el cribado de la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos 40 alelos del gen CD163 se han inactivado.

La presente divulgación también proporciona métodos para producir un cerdo modificado genéticamente en los que ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado. Uno de dichos métodos comprende cruzar un cerdo modificado genéticamente donde al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha 45 inactivado con un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado para producir la progenie F1; cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado y al menos un alelo del gen CD163 se ha inactivado; cruzar el cerdo modificado genéticamente donde al menos un alelo del gen SIGLEC1 se ha inactivado y al menos un alelo del gen CD163 se ha inactivado entre sí para producir la progenie F2; y cribar la progenie F2 para identificar cerdos 50 modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 y ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

Se divulgan métodos para producir cerdos modificados genéticamente en los que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y/o al menos un alelo de un gen CD163 se han inactivado. El cribado de la progenie puede realizarse 55 como es de costumbre en la técnica, por ejemplo, usando PCR o transferencia Southern.

Otro método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado comprende cruzar un cerdo modificado genéticamente homocigoto para la inactivación de SIGLEC1 con un cerdo modificado genéticamente homocigoto para la inactivación de CD163 para

producir la progenie F1, cruzar la progenie F1 para generar progenie F2, y cribar la progenie F2 para identificar los animales homocigotos para la inactivación de SIGLEC1 y CD163.

Aun otro método para producir un cerdo genéticamente modificado en l que ambos alelos de un gen SIGLEC1 y 5 ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado comprende cruzar un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y al menos un alelo de un gen CD163 se han inactivado con otro cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y al menos un alelo de un gen CD163 se han inactivado para producir la progenie F1; y cribar la progenie F1 para identificar cerdos modificados genéticamente en los que ambos alelos del gen SIGLEC1 y ambos alelos del gen CD163 se han inactivado.

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La presente invención también se refiere a progenie de cerdos modificados genéticamente producida usando cualquiera de los métodos anteriores, en los que uno o ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado y/o en los que uno o ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en los que la inactivación del gen CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio 15 porcino (PRRSV).

Además de poder obtenerse mediante estrategias de emparejamiento que involucran animales heterocigotos, los animales mutantes homocigotos también pueden obtenerse usando un enfoque en el que una célula (por ejemplo, un fibroblasto fetal) que incluye una mutación en un alelo, tal como una célula obtenida de un animal producido 20 usando el método resumido anteriormente, que se somete al direccionamiento génico mediante la recombinación homologa para lograr la modificación del alelo restante. Después, la célula donante resultante puede usarse como fuente de un núcleo modificado para la transferencia nuclear a una célula receptora, tal como un ovocito enucleado, causando la formación de un embrión mutante homocigoto que, cuando se implanta en una hembra sustituía, se desarrolla convirtiéndose en un animal mutante homocigoto. Los cerdos modificados genéticamente en los que 25 ambos alelos del gen SIGLEC1 y/o cD163 se han inactivado también pueden producirse mediante la inyección o la transducción de nucleasas de dedos de cinc o nucleasas Tal (que pueden dirigirse a ambos alelos de un gen a la misma vez) en células somáticas seguido de la transferencia nuclear celular somática (SCNT) y la transferencia del embrión a una sustituta para producir dichos cerdos. La presente invención también se refiere a la progenie de dichos cerdos modificados genéticamente, en los que uno o ambos alelos de un gen SIGLEC1 se han inactivado y/o 30 en los que uno o ambos alelos de un gen CD163 se han inactivado, en los que la inactivación del gen CD163 da como resultado una proteína CD163 que no puede unirse y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV).

Ejemplos

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Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar adicionalmente la presente invención.

EJEMPLO 1

40 Modificación del gen SIGLEC1

El enfoque usado para separar el gen de sialoadhesina emplea la recombinación homologa para eliminar los exones codificantes de proteínas e introducir terminaciones prematuras en la secuencia codificante restante del gen de sialoadhesina. El gen de sialoadhesina porcino (SIGLEC1, secuencia de referencia del NCBI NM_214346) codifica 45 una proteína de 210 kDa de un transcrito de ARNm de 5193 bases (Vanderheijden et al. 2003). La secuencia genómica porcina de la región que rodea el gen de sialoadhesina (n.° de acceso de Genbank CU467609) se usó para generar oligonucleótidos para amplificar los fragmentos genómicos mediante PCR de alta fidelidad [AccuTaq (Invitrogen)] para la generación de una construcción de direccionamiento. Un fragmento (el "brazo superior") incluía el primer exón codificante y los 3304 pb aguas arriba del sitio de inicio de la traducción. El segundo fragmento 50 ("brazo inferior") tenía una longitud de 4753 pb e incluía la mayor parte del intrón aguas abajo del tercer exón codificante y se extendía hacia el 6° intrón (incluyendo el 4°, 5° y 6° exones codificantes). En base a las comparaciones con las secuencias genómicas de sialoadhesina de ratón y de ser humano, se predijo que el gen de sialoadhesina porcina estaba compuesto de 21 exones (Figura 1A, 1B). El exón 2 se conserva entre cerdos, ratones y seres humanos. Un alineamiento de aminoácidos del exón 2 reveló que los seis aminoácidos en la sialoadhesina 55 de ratón que se sabía estaban asociados a la actividad de unión al ácido siálico se conservaban en la sialoadhesina de cerdo (Figura 1C). La estrategia de direccionamiento inicial se centró en crear alteraciones en el gen de sialoadhesina de modo que no se esperaba obtener ninguna proteína funcional del gen mutado. Otras estrategias de inactivación podrían incluir la modificación dirigida de residuos seleccionados en el exón 2 del gen de sialoadhesina o la alteración de los dominios de inmunoglobulina de maneras que se predice impiden la unión del virus de PRRS

(posiblemente cambiando su orden o mediante su sustitución por dominios comparables de otras especies). Modificaciones adicionales pueden incluir flanquear el casete de neomicina o uno de los dominios de tipo inmunoglobulina con sitios loxP para permitir la eliminación inducible o especifica de tejidos si se desea.

5 En la supresión génica actual, parte del exón 1 y todos los exones 2 y 3 fueron reemplazados con un casete seleccionable de neomicina usando un vector de reemplazo (Figura 1D) (Mansour et al. 1988). En la construcción del plásmido, el promotor de la fosfoglicerol cinasa (PGK) se usó para impulsar la expresión del casete de neomicina para permitir la selección positiva de las colonias transfectadas.

10 Preparación de células donantes

Una línea celular primaria de fibroblastos fetales de macho, del día 35 de gestación, se aisló de cerdos blancos grandes comerciales (Landrace). Las células se cultivaron y se dejaron crecer durante 48 hasta un 80 % de confluencia en medio Eagle modificado de Dulbeco (DMEM) que contenía glutamina 5 mM, bicarbonato de sodio 15 (3,7 g/l), penicilina-estreptomicina y 1 g/l de d-glucosa, y complementado con suero fetal bovino de Hyclone al 15 %, 10 pg/ml de gentamicina y 2,5 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (Sigma). Se eliminó el medio y se reemplazó con medio nuevo cuatro horas antes de la transfección. Las células de fibroblastos se lavaron con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS; Invitrogen) y se retiraron del matraz de 75 cm2 con 1 ml de tripsina-EDTA al 0,05 % (Invitrogen). Las células se resuspendieron en DMEM y se recogieron por centrifugación a 20 600 x g durante 10 minutos. Las células se lavaron con Opti-MEM (Invitrogen) y se volvieron a centrifugar a 600 x g durante 10 minutos. Se usaron citosales (citosales al 75 % [KCl 120 mM, CaCb 0,15 mM, K2HPO4 10 mM; pH 7,6, MgCl2 5 mM]) y Opti-Mem al 25 % para resuspender el sedimento (van den Hoff et al. 1992). Las células se contaron con un hemocitómetro y se ajustaron a 1 x 106 células por ml. La electroporación de las células se realizó con 4 pg de ADN de direccionamiento monocatenario (obtenido mediante desnaturalización térmica) en 200 pl de medio de 25 transfección que consistía en 1 x 106 células/ml. Las células se sometieron a electroporación en un manipulador de células eléctrico BTX ECM 2001 usando tres pulsos de 1 ms de 250 V. Las células electroporadas se diluyeron en DMEM/FBS/FGF a 10.000 células por placa de 13 cm. Las células electroporadas se cultivaron durante una noche sin presión selectiva. Al día siguiente, el medio se reemplazó con medio de cultivo que contenía G418 (0,6 mg/ml). Después de 10 días de selección, las colonias resistentes a G418 se aislaron y se transfirieron a placas de 24 30 pocillos para la expansión. Después del cultivo en las placas de 24 pocillos, las células de separaron (se usó aproximadamente la mitad para el aislamiento de ADN genómico) en placas de 6 pocillos. Se usó PCR para determinar si el direccionamiento del gen de sialoadhesina fue un éxito. Para la reacción se usaron oligonucleótidos que se hibridaron en el casete de fosfoglucocinasa (PGK) (que incluye Neo) emparejados con los que se hibridaron al ADN genómico en el locus de sialoadhesina que estaba más allá de la región de los brazos de direccionamiento 35 (véase la Figura 2). De esta manera se evaluó el direccionamiento exitoso de ambos "brazos". Se identificó un clon de fibroblasto diana (4-18) y algunas de las células en el cultivo se usaron para la transferencia nuclear (véase a continuación) mientras que otras se congelaron para su uso posterior. Se usó verificación por transferencia Southern de recombinación homologa para proporcionar una confirmación adicional del direccionamiento exitoso.

40 Recolección de ovocitos y maduración in vitro (IVM)

Se adquirieron ovocitos porcinos de ART Inc. (Madison, WI) y se maduraron de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de 42-44 h de maduración in vitro, los ovocitos se separaron de sus células del cúmulo mediante agitación vorticial leve en 0,5 mg/ml de hialuronidasa. Después de retirar las células del cúmulo, los 45 ovocitos con buena morfología y un cuerpo polar visible (metafase II) se seleccionaron y se conservaron en medio de micromanipulación a 38,5 °C hasta la transferencia nuclear.

Transferencia nuclear celular somática, fusión/activación de complejos de ovocitos de transferencia nuclear y cultivo de desarrollo in vitro 50

Bajo un microscopio, se sostuvo un ovocito libre de cúmulos con una micropipeta de sujeción en gotas de medio de micromanipulación complementado con 7,5 pg/ml de citocalasina B y cubierto con aceite mineral. La zona pelúcida se penetró con una micropipeta de inyección de vidrio fina cerca del primer cuerpo polar, y el primer cuerpo polar y el citoplasma adyacente, que presuntamente contenía los cromosomas de metafase II, se aspiró en la pipeta, se retiró 55 la pipeta y se descartó el contenido. Se seleccionó una célula donante simple, redonda e intensa con una superficie lisa y se transfirió al espacio perivitelino adyacente a la membrana del ovocito (Lai et al. 2006; Lai et al. 2002).

El complejo de transferencia nuclear (ovocito + fibroblasto) se fusionó en medio de fusión con una baja concentración de calcio (manitol 0,3 M, CaCb2H2O 0,1 mM, MgCb6H2O 0,1 mM y HEPES 0,5 mM). Después se

activaron los ovocitos mediante tratamiento con timerosal 200 pM durante 10 minutos en la oscuridad, seguido de aclarado y tratamiento con ditiotreitol (DTT) 8 mM durante 30 minutos; después, los ovocitos se aclararon de nuevo para eliminar el DTT (Machaty y Prather 2001; Machaty et al. 1997). Después de la fusión/activación, los ovocitos se lavaron tres veces con medio cigoto porcino 3 (PZM3) complementado con 4 mg/ml de BSA (Im et al. 2004) y se 5 cultivaron a 38,5 °C en una atmósfera humidificada de O2 al 5 %, N2 al 90 % y CO2 al 5 % durante 30 min. Los complejos que se fusionaron con éxito se cultivaron durante 15-21 horas hasta la transferencia quirúrgica del embrión a una sustituta.

Preparación de la sustituta, transferencia del embrión, diagnóstico de embarazo y parto

10

Las cerdas primerizas sustitutas se sincronizaron administrándoles 18-20 mg de REGU-MATE (solución de altrenogest al 0,22 %) (Intervet, Millsboro, DE) mezclado en el alimento durante 14 días utilizando un esquema dependiente de la etapa del ciclo estral. Después del último tratamiento con REGU-MATE (105 horas), se administró una inyección IM de 1000 unidades de hCG para inducir el estro. Otras sustitutas cuyo ciclo se dio naturalmente en 15 la fecha adecuada también se incluyeron en el grupo de sustitutas. Se utilizaron las sustitutas el día del estro (día 0) o en el primer día después de este (Lai et al. 2002). Las sustitutas se prepararon asépticamente y se realizó una incisión ventral caudal para dejar expuesto el tracto reproductivo. Los embriones se transfirieron a un oviducto a través de la fimbria ovárica. Se les realizó un examen de ultrasonido abdominal a las sustitutas aproximadamente el día 30 para comprobar su embarazo, y luego se controlaron una vez por semana durante la gestación. El parto en 20 los cerdos generalmente es a los 114 días de gestación.

Después de la transfección y el cribado de las células de fibroblastos fetales, se identificaron células donantes candidatas y se usaron para la transferencia nuclear celular somática (SCNT). Se transfirieron seiscientos sesenta y seis embriones SCNT a dos sustitutas. Una parió 6 cerditos macho normales el día 115 de gestación, y a la otra 25 cerda sustituta se le realizó una cesárea el día 117 de gestación que dio como resultado dos cerditos macho normales, como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Resultados de la transferencia de embriones a partir del uso de células donantes macho SIGLEC1 +/-.

Fecha: Sustituta Genotipo N.° transferido Resultados

23/9/2010: O963 SIGLEC1+1' 8 388 6 cerditos macho normales nacidos el 16/1/2011

24/09/2010: O962 SIGLEC1+/- 8 278 2 cerditos macho normales de parto por cesárea el 18/1/2011

30 La Figura 2 muestra la organización del gen de sialoadhesina (SIGLEC1), el vector de direccionamiento y el genotipo recombinado previsto. El panel superior de la Figura 2 muestra la construcción de direccionamiento usada para la recombinación homologa. Como se ha descrito anteriormente, el fragmento de ADN "superior" usado para crear la construcción de direccionamiento contenía ~3,5 kb aguas arriba del exón 1 e incluía parte del exón 1 (después del codón de inicio). El fragmento de ADN "inferior" comenzaba dentro del intrón 3 e incluía los exones 4, 35 5, 6 y parte del exón 7. La mayor parte del exón 1 y la totalidad de los exones 2 y 3 se sustituyeron con un casete de neomicina (neo); un casete de timidina cinasa (TK) estaba disponible inmediatamente aguas abajo del brazo inferior para su uso como un marcador seleccionable negativo de ser necesario. El panel inferior de la Figura 2 ilustra el gen de sialoadhesina mutado después de la recombinación homologa. Las flechas representan los sitios de unión a oligonucleótidos usados para el análisis basado en PCR de las líneas celulares diana y los cerdos clonados. El 40 direccionamiento de los brazos superiores e inferiores se realizó mediante hibridación de oligonucleótidos como muestran las flechas que representan cebadores "C de direccionamiento de sialo superior" y "inverso de PGK poliA" (SEQ ID NOs: 1 y 3) y "directo de promotor de PGK" y "7Rwl" (SEQ ID NOs: 4 y 6), respectivamente. Las secuencias de oligonucleótidos se enumeran en la Tabla 2 a continuación. Una pCr de control adicional empleó los oligonucleótidos que flanqueaban la región separada/casete Neo (cebadores "ck terminal del Exón 1" e "inverso de 45 ck del Intrón 3" (SEQ ID NOs: 2 y 5, respectivamente)). Hay una diferencia de aproximadamente 500 pb de tamaño del producto entre el alelo alterado y el alelo de tipo salvaje.

Tabla 2. Nombres de cebadores y secuencias usadas en el proyecto.

C de direccionamiento de sialo superior: ggaacaggctgagccaataa (SEQ ID NO: 1)

ck terminal del Exón 1: gcattcctaggcacagc (SEQ ID NO: 2)

inverso de PGK poliA: ggttctaagtactgtggtttcc (SEQ ID NO: 3)

directo de promotor PGK: agaggccacttgtgtagcgc (SEQ ID NO: 4)

Inverso de ck del Intrón 3: ctccttgccatgtccag (SEQ ID NO. 5)

7Rw1: caggtaccaggaaaaacgggt (SEQ ID NO: 6)

A los cebadores de la Tabla 2 se les asignaron números de identificación de secuencia basándose en la posición de las flechas en el panel inferior de la Figura 2 que van de izquierda a derecha. Por lo tanto, la flecha que está más a la izquierda en el panel inferior de la Figura 2 muestra la ubicación del cebador "C de direccionamiento de sialo 5 superior" (SEQ ID NO: 1), la siguiente flecha hacia la derecha muestra la ubicación del cebador "ck terminal del Exón 1" (SEQ ID NO: 2), la siguiente flecha hacia la derecha de ésta muestra la ubicación del cebador "inverso de PGK poliA" (SEQ ID NO: 3), etc.

Cribado para la inactivación de SIGLEC1

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Se aisló el ADN genómico de los cerditos y se usó para confirmar los eventos de direccionamiento. El direccionamiento exitoso del gen SIGLEC1 se determinó usando PCR con oligonucleótidos que se hibridaron dentro del casete Neo emparejados con oligonucleótidos que se hibridaron al ADN genómico de SIGLEC1 que estaba más allá de la región contenida dentro de la construcción de direccionamiento. En el panel superior de la Figura 3, el 15 direccionamiento del brazo "superior" se examinó usando los oligonucleótidos "inverso de PGK poliA" y "C de direccionamiento de sialo superior" (SEQ ID NOs. 3 y 1, respectivamente; que se ilustran en la Figura 2). Se produjo un producto del tamaño previsto (~4500 pb). En el panel inferior, se determinó el direccionamiento exitoso del brazo "inferior" usando los oligonucleótidos "directo de PGK" y "7Rwl" (SEQ ID NOs: 4 y 6, respectivamente; que se ilustran en la Figura 2). Se produjo un producto del tamaño previsto (~5000 pb). El control del "plásmido del brazo 20 inferior" fue una construcción parcial que contenía el casete Neo con un fragmento del gen de sialoadhesina que representaba la mayor parte del intrón 3 y la mayor parte del exón 7. El oligonucleótido 7Rwl fue capaz de hibridarse a la secuencia del exón 7 presente en el plásmido, y junto con el oligonucleótido directo promotor de PGK fue capaz de producir un producto que era idéntico al que se produciría a partir de un evento de direccionamiento exitoso. Ambos paneles ilustran las reacciones de PCR de direccionamiento realizadas sobre el ADN genómico extraído de 25 ocho clones de cerdito generados a partir de la línea de fibroblastos fetales diana 4-18.

La detección de alelos de sialoadhesina de tipo salvaje y objetivo se realizó usando PCR con oligonucleótidos que se hibridaron con el ADN que flanquea la región diana del gen de sialoadhesina. Se utilizaron los oligonucleótidos "ck terminal del Exón 1" e "inverso de ck del Intrón 3" (SEQ ID NO: 2 y 5, respectivamente; que se ilustran en la 30 Figura 2). Los productos generados eran de ~2400 pb para el alelo de tipo salvaje y ~2900 pb para el alelo diana. En la Figura 4 el panel de la izquierda (Figura 4A) ilustra reacciones de prueba realizadas en ADN genómico de tipo salvaje, el plásmido de direccionamiento usado para transfecciones, aDn genómico (4-18) de un clon de fibroblasto dirigido con éxito (se han de apreciar las dos bandas) y ADN genómico (4-3) a partir de un clon de fibroblasto no dirigido. El panel en la derecha (Figura 4B) ilustra la reacción realizada en ADN genómico extraído de ocho clones 35 de cerdito generados a partir de la línea de fibroblastos fetales 4-18 diana. Hubo dos productos de PCR de los tamaños esperados en cada carril, mientras que las plantillas de plásmidos de direccionamiento y ADN de tipo salvaje solo tuvieron una banda. Por lo tanto, todos los cerditos producidos mediante SCNT eran heterocigotos para la mutación pretendida, es decir, SIGLEC+/-.

40 Producción de animales homocigotos

Los cerdos macho modificados genéticamente, que se identificaron como heterocigotos para la inactivación de SIGLEC1 se usaron como machos fundadores (generación F0), y se cruzaron con hembras de tipo salvaje para producir animales macho y hembra que tenían un alelo de SIGLEci inactivado (F1). Los machos F1 se cruzaron 45 entonces con las hembras F1 para producir la progenie F2, que tiene ambos alelos de SIGLEC1 inactivados. Dichos animales pueden identificarse después del nacimiento mediante la PCR descrita anteriormente para verificar la presencia de SIGLEC1 o, como alternativa, mediante análisis de transferencia Southern.

EJEMPLO 2 50

Generación de una construcción de direccionamiento a CD163

Como ya se ha establecido, la deleción del dominio citoplasmático de CD163 elimina la infectividad de PRRSV, así como lo hace la deleción o modificación del dominio 5 de SRCR. Dado que algunos de los dominios SRCR de 55 CD163 tienen funciones importantes para la supervivencia del animal, por ejemplo, eliminación de hemoglobulina, la modificación del gen, de manera que dichas funciones permanezcan intactas, representa una estrategia sólida para crear cerdos que son resistentes al PRRSV. La investigación previa también ha sugerido que el reemplazo del

dominio de SRCR5 con el dominio 8 de CD163L también bloquea la infectividad (Van Gorp et al. 2010b). Por lo tanto, una construcción de direccionamiento puede diseñarse como se muestra en la Figura 6 para cambiar el dominio SRCR5 de CD163 por el dominio SRCR de CD163L.

5 Una vez que la construcción de direccionamiento se elabora, los cerdos modificados genéticamente que son heterocigotos para CD163 inactivado, en donde la inactivación del gen de CD163 da como resultado una proteína CD 163 que no se puede unir y/o desenvolver un virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) que puede producirse por medio de métodos que son en general los mismos que los descritos en el Ejemplo 1. Primero, se inserta un vector de direccionamiento en una célula donante, donde se puede recombinar con el gen endógeno 10 de CD163. Las células donantes con esta modificación específica entonces se seleccionan y se usan para la transferencia nuclear de células somáticas para crear un embrión genéticamente modificado. El embrión entonces se transfiere a una sustituta durante el periodo de gestación. Después de identificar el cerdo transgénico con un alelo de CD163 inactivado, ya sea por PCR o análisis de transferencia Southern, se permite que estos animales alcancen la madurez sexual, y luego se usan para cruzarse de manera natural para transmitir los genes a los fetos o las crías. 15

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Sanchez-Torres C, Gomez-Puertas P, Gomez-del-Moral M, Alonso F, Escribano JM, Ezquerra A, Dominguez J. 2003. Expression of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with

Claims

REIVINDICACIONES

I. Un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado.

5 2. Un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado.
3. El cerdo modificado genéticamente de la reivindicación 1 o 2, en el que ambos alelos de un gen

SIGLEC1 se han inactivado.

10 4. El cerdo modificado genéticamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que ambos

alelos de un gen CD163 se han inactivado.
5. Un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado, y al menos un alelo de un gen CD163 se ha inactivado.

15
6. Un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen SIGLEC1 se ha inactivado, comprendiendo el método:

enuclear un ovocito de cerdo;

20 fusionar el ovocito con una célula de fibroblasto porcina donante, comprendiendo el genoma de la célula de

fibroblasto al menos un alelo de SIGLEC1 inactivado; y activar el ovocito para producir un embrión.
7. Un método para producir un cerdo modificado genéticamente en el que al menos un alelo de un gen 25 CD163 se ha inactivado, comprendiendo el método:

enuclear un ovocito de cerdo;

fusionar el ovocito con una célula de fibroblasto porcina donante, comprendiendo el genoma de la célula de fibroblasto al menos un alelo de CD163 inactivado; y 30 activar el ovocito para producir un embrión.
8. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que:

el al menos un alelo se ha inactivado por eliminación parcial o completa;

35 el al menos un alelo se ha inactivado usando un sistema de recombinación Cre-lox; y/o

el alelo de SIGLEC1 se ha inactivado por la eliminación de parte del exón 1 y la totalidad de los exones 2 y 3.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6, 7, y 8, en el que:

40

la enucleación se realiza con una micropipeta en un medio de micromanipulación; la fusión se realiza en un medio de fusión; y/o

la activación del ovocito comprende incubar el ovocito en presencia de timerosal.

45 10. Progenie de un cerdo modificado genéticamente producido por el método de una cualquiera de las

reivindicaciones 6, 7, 8, y 9, en la que, en dicha progenie, al menos un alelo de un gen SIGLEC1 está inactivado; al menos un alelo de un gen CD163 está inactivado; al menos un alelo de un gen SIGLEC1 y al menos un alelo de un gen CD163 están inactivados; o ambos alelos de un gen SIGLEC1 y ambos alelos de un gen CD163 están inactivados.

50

II. Progenie de un cerdo modificado genéticamente producido por el método de la reivindicación 7, en la que al menos un alelo de un gen CD163 está inactivado en dicha progenie.
12. El cerdo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el al menos un alelo se ha inactivado 55 por eliminación parcial.
13. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que el al menos un alelo se ha inactivado por eliminación parcial.
14. El cerdo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el al menos un alelo se ha inactivado por eliminación completa.
15. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que el al menos un alelo se ha inactivado por eliminación 5 completa.
16. El cerdo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el al menos un alelo se ha inactivado usando sistema de recombinación Cre-lox.

10 17. El cerdo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 5, en el que el alelo de SIGLEC1 se ha

inactivado por la eliminación de parte del exón 1 y la totalidad de los exones 2 y 3.

imagen1

{]—Q-Dü

FIG. 1

Organización del gen de sialoadhesina y diseño del vector de direccionamiento

/ kh

Humano

B) —LHHJ—lHj

LHl—LHHJ—DíHHJiHHj—LHHHJ—

Ratón

Gln Thr Thr Trp Gly Val

Ser Ser Pro Lys Asn Val Gln Gly Leu Ser Gly Ser tcc agt ccc aag aat gtg cag ggc ttg tcg gga tcc

ge cag acc aca tgg ggt gtc

Cys Leu Leu lie Pro Cys lie

Phe Ser Tyr Pro Ala Asp Val Pro Val Ser Asn Gly ttc age tac cct gee gat gtc cea gtg tcc aat ggc

tgc ctg etc att ccc tgc ate

lie Thr Ala

lie

ate

Asp Tyr Ser Gly Lys Arg Gln Val Val lie His Ser gac tac tcg ggc aag cgg cag gtg gta ate cae tea

Trp

tgg

Tyr

tac

Tyr

ate aca gee

tat

Gly Asp Pro Lys Leu Val Asp

Lys Arg Phe Arg Gly Arg Ala Glu Leu Met Gly Asn aag cgt ttc agg ggt cga gct gaa ctg atg ggg aac

ggg gac ccc aag ctg gtg gac

Met Asp His Lys Val Cys Asn

Leu Leu Leu Lys Asp Leu Lys Pro Glu Asp Ser Gly ctg ttg etc aaa gac ttg aag cct gaa gac tet ggc

atg gac cae aag gtg tgc aac

Thr Tyr

Phe

Phe

lie Ser Asp Ser Asn ate agt gat age aac

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A:

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ij pnv n mcq i...n n n

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FIG. 2

Organización del gen de sialoadhesina y diseño del vector de direccionamiento.

ro

CD

4 5 6

ñ»~i—Q-0—D-

TK

Construcción de direccionamiento de "inactivación"

1 2 3 4 5 6 *7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 cialnaHhPcina Ha tinn

IHHPMH]—□—°“'°adhesinade,ipo

4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Hp cialnarlhpaina

ñmJMH]—0—D—tHJO—DtHHBOO—OOfl-O- 22£”l“dh“,n*

FIG. 3

Cribado por PCR para identificar el direccionamiento del gen de sialoadhesina.

imagen2

Plásmido del "brazo inferior'

imagen3

FIG. 4

Cribado por PCR para identificar la presencia equivalente de alelos de

sialoadhesina tanto de tipo salvaje como diana.

Clones de cerdo

imagen4

FIG. 6

00

o

Brazo largo pSRCR5

Intrón de CD163 Codificante

3469 Pb hSRCR8

PGK

Loxl

Brazo corto

imagen5

Lox2