RU2644673C2 - Животные, устойчивые к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней - Google Patents
Животные, устойчивые к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней Download PDFInfo
- Publication number
- RU2644673C2 RU2644673C2 RU2013155677A RU2013155677A RU2644673C2 RU 2644673 C2 RU2644673 C2 RU 2644673C2 RU 2013155677 A RU2013155677 A RU 2013155677A RU 2013155677 A RU2013155677 A RU 2013155677A RU 2644673 C2 RU2644673 C2 RU 2644673C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gene
- genetically modified
- inactivated
- allele
- alleles
- Prior art date
Links
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 title abstract 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 18
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims abstract description 218
- 101150087379 CD163 gene Proteins 0.000 claims abstract description 91
- 108010009992 CD163 antigen Proteins 0.000 claims abstract description 82
- 101150098782 Siglec1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 64
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims abstract description 62
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 44
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 44
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 claims abstract description 24
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 67
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 31
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 28
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 26
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 26
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 21
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 19
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 15
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 11
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 claims description 10
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 10
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims description 9
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 claims description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 7
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 5
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 claims description 5
- 108091005725 scavenger receptor cysteine-rich superfamily Proteins 0.000 claims description 5
- 230000012173 estrus Effects 0.000 claims description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 4
- 230000035606 childbirth Effects 0.000 claims description 3
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 claims description 3
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims description 2
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract description 117
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 76
- 102100032855 Sialoadhesin Human genes 0.000 description 48
- 101000868472 Homo sapiens Sialoadhesin Proteins 0.000 description 32
- 108010029176 Sialic Acid Binding Ig-like Lectin 1 Proteins 0.000 description 31
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 27
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 21
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 13
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 12
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 11
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 11
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 102000000185 SRCR domains Human genes 0.000 description 9
- 108050008568 SRCR domains Proteins 0.000 description 9
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 9
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 4
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 4
- 108010047827 Sialic Acid Binding Immunoglobulin-like Lectins Proteins 0.000 description 4
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 4
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 4
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 4
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- VWAUPFMBXBWEQY-ANULTFPQSA-N Altrenogest Chemical compound C1CC(=O)C=C2CC[C@@H]([C@H]3[C@@](C)([C@](CC3)(O)CC=C)C=C3)C3=C21 VWAUPFMBXBWEQY-ANULTFPQSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 101000868474 Mus musculus Sialoadhesin Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 3
- 102000007073 Sialic Acid Binding Immunoglobulin-like Lectins Human genes 0.000 description 3
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 244000144980 herd Species 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 210000004508 polar body Anatomy 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000710803 Equine arteritis virus Species 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 2
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 2
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 2
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 101150001779 ORF1a gene Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 101150065831 SIGLEC13 gene Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101000868473 Sus scrofa Sialoadhesin Proteins 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 229940050570 regu-mate Drugs 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- IZAYCFBWPSFFJI-UHFFFAOYSA-N 1-methylsulfonylsulfanylethane Chemical compound CCSS(C)(=O)=O IZAYCFBWPSFFJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 5-[(3-carboxylato-4-nitrophenyl)disulfanyl]-2-nitrobenzoate Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)[O-])=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C([O-])=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 241001533413 Deltavirus Species 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 101150034914 GP2a gene Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 101710126256 Hydrolase in agr operon Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 101710197072 Lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- SPEFJYZGXZENAF-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-1-(2,4-dichlorophenyl)-6-methyl-4H-indeno[1,2-c]pyrazole-3-carboxamide Chemical compound C=1C(C)=CC=C(C2=3)C=1CC=3C(C(=O)NC1CCCCC1)=NN2C1=CC=C(Cl)C=C1Cl SPEFJYZGXZENAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N N-ethyl-succinimide Natural products CCN1C(=O)CCC1=O GHAZCVNUKKZTLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N N-ethylmaleimide Chemical compound CCN1C(=O)C=CC1=O HDFGOPSGAURCEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001292005 Nidovirales Species 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000255969 Pieris brassicae Species 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001516645 Simian hemorrhagic fever virus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010014401 TWEAK Receptor Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100028786 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 12A Human genes 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N aldehydo-D-glucose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000971 altrenogest Drugs 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-M bromoacetate Chemical compound [O-]C(=O)CBr KDPAWGWELVVRCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-M chloroacetate Chemical compound [O-]C(=O)CCl FOCAUTSVDIKZOP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940089960 chloroacetate Drugs 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006395 clathrin-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000280 densification Methods 0.000 description 1
- 230000009547 development abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 208000029570 hepatitis D virus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000056960 human SIGLEC1 Human genes 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 208000036658 level of immunoglobulin M Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 108091005446 macrophage receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000034217 membrane fusion Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011824 nuclear material Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000027758 ovulation cycle Effects 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVFZSVRSDNUCGG-UHFFFAOYSA-M p-mercuribenzoate Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=C([Hg])C=C1 FVFZSVRSDNUCGG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- SONNWYBIRXJNDC-VIFPVBQESA-N phenylephrine Chemical compound CNC[C@H](O)C1=CC=CC(O)=C1 SONNWYBIRXJNDC-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229960001802 phenylephrine Drugs 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 108010064607 phosphoglucokinase Proteins 0.000 description 1
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 1
- 210000004043 pneumocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000010837 receptor-mediated endocytosis Effects 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- ONSHWRYIJNFSRL-UHFFFAOYSA-M sodium;2-methylsulfanylsulfonylethanesulfonate Chemical compound [Na+].CSS(=O)(=O)CCS([O-])(=O)=O ONSHWRYIJNFSRL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 1
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- DZWJBKUVHJSHAR-UHFFFAOYSA-M trimethyl(2-methylsulfonylsulfanylethyl)azanium;bromide Chemical compound [Br-].C[N+](C)(C)CCSS(C)(=O)=O DZWJBKUVHJSHAR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 231100000925 very toxic Toxicity 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/108—Swine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к генетически модифицированной свинье, которая является резистентной к инфекции вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Указанная генетически модифицированная свинья содержит инактивирующую мутацию в обоих аллелях гена CD163. Такая инактивирующая мутация приводит к получению белка CD163, который не может связывать ВРРСС, то есть мутация изменяет активность CD163. Указанная генетически модифицированная свинья может дополнительно содержать инактивирующую мутацию в обоих аллелях гена SIGLEC1. Также предложены способы получения таких генетически модифицированных свиней. Настоящее изобретение позволяет получать генетически модифицированных свиней, резистентных к ВРРСС. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 пр., 2 табл.
Description
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ПОДДЕРЖКА
[0001] Данное изобретение было выполнено при поддержке Правительства согласно договору номер (USDA/ARS) 58-1940-8-868, представленной Департаментом Сельского Хозяйства. Правительство обладает определенными правами на изобретение.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] В данной заявке содержится Перечень Последовательностей, озаглавленный «UMO 11053. WO SEQ_ST25», созданный 15 мая 2012, который включен в данный документ во всей полноте посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Настоящее изобретение, в общем плане, относится к генетически модифицированной свинье, у которой по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован и/или был инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163. Также предложены способы получения таких трансгенных свиней.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Репродуктивно-Респираторный Синдром Свиней (РРСС) является одной из наиболее экономически значимых болезней свиней. Впервые это заболевание было выявлено в США в 1987 (Keffaber 1989), а в Европе - в 1990 (Wensvoort et al. 1991). Молекулярный анализ прототипных вирусов РРСС (ВРРСС) VR-2332 и Lelystad (американский и европейский изоляты, соответственно) позволил предположить, что на двух континентах почти одновременно появились два дивергентных штамма, вероятно, по причине похожих изменений в работе со свиньями (Murtaugh et al. 1995; Nelsen et al. 1999). После возникновения этот вирус распространился во всем мире и ВРРСС Европейского генотипа был выявлен в американских стадах свиней (Ropp et al. 2004). РРСС характеризуется тяжелой и иногда смертельной дыхательной недостаточностью и репродуктивной недостаточностью, а также предрасполагает инфицированных свиней к бактериальным патогенам, а также иным вирусным патогенам (Benfield et al. 1992), и является ключевым элементом экономически значимого Комплекса Респираторных Заболеваний Свиней (КРЗС). Наиболее постоянными патологическими повреждениями, вызываемыми ВРРСС при острой инфекции, являются интерстициальная пневмония и легкий лимфоцитарный энцефалит (Plagemann 1996). После острой фазы ВРРСС-инфекции, обычно характеризующейся виремией и клиническим заболеванием, множество свиней полностью выздоравливают, хотя и являются носителями вируса с низкой нагрузкой в течение длительного периода времени. Эти свиньи-носители постоянно инфицированы ВРРСС и периодически или постоянно выделяют вирус, поэтому могут инфицировать интактных свиней при прямом или косвенном контакте. Хроническая инфекция ВРРСС была хорошо задокументирована в экспериментальных условиях (Albina et al. 1994; Allende et al. 2000; Benfield et al. 1998; Christopherhennings et al. 1995; Sur et al. 1996; Yoon et al. 1993). В частности, инфекционный вирус обнаруживался до 157 суток после инфекции (Wills et al. 1997). Основными клетками-мишенями и при острой, и при хронической инфекции являются макрофаги и моноциты (Molitor et al. 1997), хотя было установлено, что также поражаются пневмоциты и стволовые клетки эпителия яичек (Sur et al. 1996; Suretal. 1997).
[0005] Этиологическим агентом РРСС является оболочечный вирус, содержащий РНК положительной полярности, принадлежащий к семейству Arteriviridae отряда Nidovirales. Другие члены семейства Arteriviridae включают вирус подъема уровня лактатдегидрогеназы (LDV) мышей, вирус артериита лошадей (EAV) и вирус геморрагической лихорадки обезьян (SHFV). Анализ данных о геномной последовательности выявил наличие большого разнообразия между штаммами ВРРСС, а также существование высококонсервативных доменов (Andreyev et al. 1997; Meng 2000; Meng et al. 1995). Организация генома ВРРСС аналогична с другими Артеривирусами, геномная РНК функционирует как информационная РНК для репликазных белков ORF1a (Plagemann 1996). ORF1a и 1b включают приблизительно 80% вирусного генома и кодируют РНК-зависимую РНК-полимеразу, а также полипротеины, которые подвергаются процессингу в неструктурные белки (Snijder, Meulenberg 1998). С помощью вируса Lelystad, было выявлено, что ORF 2-7 кодируют вирусные структурные белки. Белок, закодированный ORF 5 (GP5) и М (Van Breedam et al. 2010b) может играть роль в индуцировании апоптоза, вызываемого ВРРСС (Suarez et al. 1996; Sur et al. 1997) и, как предполагается, является белком прикрепления в близкородственном Вирусе подъема уровня лактатдегиддрогеназы. Малые оболочечные гликопротеины GP2a и GP4 ВРРСС взаимодействуют с CD163 (Das et al. 2010). Имеются данные, исходя из которых можно предположить, что связывание с SIGLEC1 (иммуноглобулиноподобный лектин 1, связывающий сиаловую кислоту) необходимо для проникновения в клетки и, фактически, для вирусной инфекции необходимо двойное связывание и с SIGLEC1, и с CD163 (Van Gorp et al. 2008).
[0006] Многие характеристики патогенеза (особенно на молекулярном уровне) и эпизоотиологии ВРРСС плохо установлены, поэтому попытки его контроля затруднительны. Чтобы лучше его изучить, были разработаны инфекционные клоны ВРРСС (Nielsen et al. 2003). В настоящее время производители часто вакцинируют свиней против ВРРСС вакцинами с модифицированными живыми ослабленными штаммами или с убитыми вирусами. Однако доступные в настоящее время вакцины часто не обеспечивают удовлетворительной защиты, зачастую по причине вариабельности вируса и недостаточной стимуляции иммунной системы. Защитный иммунный ответ возможен, поскольку было показано, что предшествующее воздействие может обеспечить полную защиту при нагрузке свиней гомологичным штаммом ВРРСС (Lager et al. 1999). Однако при нагрузке гетерологическими штаммами защитный иммунитет не был ни разу достоверно продемонстрирован. Помимо неудовлетворительной эффективности имеющихся вакцин против ВРРСС, имеются убедительные свидетельства в пользу того, что используемая модифицированная живая вакцина может персистировать в отдельных стадах свиней и накапливать мутации (Mengeling et al. 1999), как это было показано с вирулентными полевыми изолятами после экспериментального инфицирования свиней (Rowland et al. 1999). Помимо этого, было показано, что вирус из вакцины выделяется со спермой вакцинированных хряков (Christopherhermings et al. 1997). Вместо вакцинации, некоторые авторы выступают в пользу стратегии «проверки и удаления» в племенных стадах (Dee, Molitor 1998). Успешность применения этой стратегии зависит от удаления всех свиней и с острой, и с хронической инфекцией ВРРСС с последующим строгим контролем для профилактики повторного внедрения вируса. Сложность и большая часть издержек, связанных с этой стратегией, заключаются в том, что о патогенезе хронической ВРРСС-инфекции мало известно и поэтому нет надежных способов для идентификации хронически инфицированных свиней.
[0007] Предполагаемый клеточный рецептор ВРРСС, который был идентифицирован при помощи моноклональных антител, очищен и секвенирован (Vanderheijden et al. 2003; Wissink et al. 2003), получил наименование SIGLEC1. Эта молекула обладает сходством с сиалоадгезинами и, как было показано, опосредует проникновение ВРРСС в невосприимчивые клетки, однако рекомбинантная клеточная линия, экспрессирующая этот рецептор, не смогла поддержать продуктивную репликацию ВРРСС (Vanderheijden et al. 2003). Существенно, что молекулы сиаловой кислоты, присутствующие на поверхности ВРРСС, как было показано, необходимы для инфицирования альвеолярных макрофагов. Следом за связыванием вируса с этим рецептором, происходит проникновение ВРРСС по механизму опосредованного рецептором эндоцитоза (Nauwynck et al. 1999). Ключевая роль сиалоадгезина при проникновении ВРРСС была установлена в экспериментах, в которых был продемонстрирован вирусный захват клетками РК15 (клеточная линия, не позволяющая репликацию ВРРСС), трансфицированными свиным сиалоадгезином, но не нетрансфицированными контрольными клетками РК15 (Vanderheijden et al. 2003). Дальнейшие исследования этой группой показали, что взаимодействия между сиаловой кислотой на поверхности вириона ВРРСС и молекулой сиалоадгезина были необходимы для инфицирования ВРРСС альвеолярных макрофагов (Delputte, Nauwynck 2004). Обратная стратегия, а именно, удаление сиаловой кислоты с поверхности ВРРСС или предварительное инкубирование со специфическими для сиаловой кислоты лектинами также привело к блокированию инфекции (Delputte et al. 2004; Delputte, Nauwynck 2004; Van Breedam et al. 2010b). Независимо от специфических исследований проникновения ВРРСС, использовался сайт-направленный мутагенез, чтобы идентифицировать шесть ключевых аминокислотных остатков, необходимых для связывания сиаловой кислоты с мышиным сиалоадгезином (Vinson et al. 1996), который на 69% идентичен свиному сиалоадгезину. Заслуживает внимания то, что шесть аминокислот, идентифицированных в мышином сиалоадгезине, сохранены и в свиной молекуле.
[0008] SIGLEC1 является трансмембранным рецептором семейства иммуноглобулиноподобных лектинов, связывающихся с сиаловой кислотой. Вначале он был описан как рецептор мышиных макрофагов, связывающий овечьи эритроциты (Crocker and Gordon 1986). Он экспрессируется макрофагами в гемопоэтической и лимфоидной тканях. SIGLEC-гены состоят из N-терминального домена из V-набора, содержащего сайт связывания сиаловой кислоты, последующего переменного количества доменов из С2-набора, трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста. В отличие от других SIGLEC, SIGLEC1 не имеет тирозинового мотива в цитоплазматическом хвосте (Oetke et al. 2006). Сайт связывания сиаловой кислоты был картирован в N-терминальном иммуноглобулиноподобном домене V-набора (Nath et al. 1995). Остаток R116, судя по всему, является одной из аминокислот, необходимых для связывания с сиаловой кислотой (Crocker et al. 1999; Delputte et al. 2007). Таким образом, интактный N-терминальный домен необходим и достаточен для связывания ВРРСС с SIGLEC1 (Van Breedam et al. 2010a). Сообщалось о SIGLEC 1-нокаутных мышах, которые были жизнеспособны, фертильны и без аномалий развития (Oetke et al. 2006). Однако у этих мышей наблюдались небольшие изменения популяций В- и Т-клеток и понижение уровня иммуноглобулина М.
[0009] Процесс инфекции ВРРСС начинается с первичного связывания с гепарансульфатом на поверхности альвеолярного макрофага. Затем происходит прочное связывание с сиалоадгезином (SIGLEC1, также обозначается CD169 или SN). Затем вирус интернализуется по клатрин-опосредованному эндоцитозу. Затем другая молекула - CD163, способствует обнажению вируса в эндосоме (Van Breedam et al. 2010a). Геном вируса высвобождается и происходит инфицирование клетки.
[0010] В CD163 имеется 17 экзонов, белок состоит из внеклеточной области с 9 цистеин-богатыми (SRCR) доменами фагоцитарных рецепторов, трансмембранного сегмента и короткого цитоплазматического хвоста. При различном сплайсинге одного гена получается несколько разных вариантов (Ritter et al. 1999а; Ritter et al. 1999b). В значительной степени это варьирование обусловлено длиной цитоплазматического хвоста.
[0011] CD163 выполняет ряд важных функций, включая действие в качестве фагоцитарного рецептора к гаптоглобину-гемоглобину. Элиминация свободного гемоглобина из крови является важной функцией CD163, поскольку группа гема может быть очень токсичной (Kristiansen et al. 2001). CD163 имеет цитоплазматический хвост, облегчающий эндоцитоз. Мутация этого хвоста приводит к снижению захвата комплекса гептоглобин-гемоглобин (Nielsen et al. 2006). Другие функции С163 включают адгезию эритробластов (SRCR2), работу в качестве рецептора TWEAK (SRCR 1-4 и 6-9), бактериального рецептора (SRCR5), рецептора вируса африканских свиней (Sanchez-Torres et al. 2003), а также возможную роль в качестве иммуномодулятора (обсуждалось в (Van Gorp et al. 2010a)).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0012] В одном аспекте, настоящее изобретение представляет собой генетически модифицированную свинью, у которой по меньшей мере инактивирован один аллель гена SIGLEC1 и/или инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
[0013] Другой аспект настоящего изобретения представлен генетически модифицированной свиньей, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, полученного по способу, включающему энуклеацию ооцита свиньи; слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере, один инактивированный аллель гена SIGLEC1; и активацию ооцита для получения эмбриона.
[0014] Настоящее изобретение также относится к генетически модифицированной свинье, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному к связыванию и/или обнажению вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), полученного по способу, включающему энуклеацию ооцита свиньи; слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере, один инактивированный аллель гена CD163; и активацию ооцита для получения эмбриона.
[0015] В другом аспекте, настоящее изобретение является генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1, полученного по способу, включающему спаривание самца генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с самкой генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1.
[0016] Другой аспект настоящего изобретения заключается в получении генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, полученного по способу, включающему спаривание самца генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере, один аллель гена CD163, с самкой генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена CD163.
[0017] Настоящее изобретение также относится к генетически модифицированной свинье, полученной по любому из трех способов, у которой инактивированы оба аллеля гена S1GLEC1 и оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Первый такой способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163. Этот способ дополнительно включает спаривание друг с другом генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена S1GLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением Р2-потомства, и скрининг Р2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163.
[0018] Второй такой способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена S1GLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, с получением F1-потомства, спаривание F1-потомства, чтобы получить Р2-потомство и скрининг Р2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.
[0019] Третий такой способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с другой генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.
[0020] Настоящее изобретение также относится к потомству любых описанных выше генетически модифицированных свиней, у которых: (1) по меньшей мере, один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован; (2) по меньшей мере, один аллель гена CD163 был инактивирован; (3) по меньшей мере, один аллель гена SIGLEC1 и один аллель гена CD163 были инактивированы; или (4) оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 были инактивированы. В таком потомстве, у которого один или оба аллеля гена CD163 были инактивированы, инактивация приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
[0021] Настоящее изобретение также направлено на способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован. Способ включает энуклеацию ооцита свиньи; слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере один инактивированный аллель гена SIGLEC1; и активацию ооцита для получения эмбриона.
[0022] В еще одном аспекте, настоящее изобретение является способом получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Этот способ включает энуклеацию ооцита свиньи; слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере один инактивированный аллель гена CD 163; и активацию ооцита для получения эмбриона.
[0023] Настоящее изобретение также направлено на способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой по меньшей мере оба аллеля гена SIGLEC1 были инактивированы. Способ включает спаривание самки генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с самцом генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1.
[0024] Настоящее изобретение также направлено на способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному к связыванию и/или обнажению ВРРСС. Этот способ включает спаривание самки генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с самцом генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD 163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена CD163.
[0025] В еще одном аспекте, настоящее изобретение является способом получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллелей CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена S1GLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена S1GLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163. Способ дополнительно включает спаривание друг с другом генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена S1GLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением Р2-потомства, и скрининг Р2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена S1GLEC1 и оба аллеля гена CD163.
[0026] Настоящее изобретение также относится к другому способу получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163, причем инактивация гена CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Этот способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, с получением F1-потомства, спаривание F1-потомства, чтобы получить Р2-потомство и скрининг F2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена СD163 инактивированы.
[0027] Настоящее изобретение также направлено на еще один способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC 1 и оба аллеля гена CD163, причем инактивация гена CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с другой генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.
[0028] В других аспектах, настоящее изобретение относится к потомству генетически модифицированной свиньи, полученному по любому из способов выше, у которого инактивированы один или оба аллеля гена SIGLEC1 и/или инактивированы один или оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллелей CD 163приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
[0029] Другие цели и характеристики будут частично понятны и частично отмечены ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0030] На Фигуре 1 показано строение гена сиалоадгезина и схема нацеленного вектора. Фигуры 1А и 1В являются схематическими диаграммами, показывающими, что гены человеческого (Фиг. 1А) и мышиного (Фиг. 1В) сиалоадгезина состоят из 21 экзона и простираются приблизительно на 20 кб. На Фигуре 1С представлен мутационный анализ экзона 2 (ДНК-последовательность экзона 2 показана на Фигуре 1С под SEQ ID NO: 7, а аминокислотная последовательность, кодируемая экзоном 2, показана на Фигуре 1С под SEQ ID NO: 8). Мутационный анализ выявил 6 аминокислот, придающих связывание сиалоадгезина с лигандом (выделены обведенным/жирным текстом). На Фигуре 1D представлена схема нацеленного вектора, используемого для замены части экзона 1 и экзонов 2 и 3 SIGLEC1 на стоп-кодоны. В вектор также включена неомициновая кассета селекции (neo), управляемая промотором ФГК.
[0031] На Фигуре 2 показаны схема нацеленного вектора, строение гена сиалоадгезина и строение измененного гена сиалоадгезина.
[0032] На Фигуре 3 представлена фотография геля, показывающая ПЦР-скрининг для идентификации гена сиалоадгезина.
[0033] На Фигуре 4 представлена фотография геля, показывающая ПЦР-скрининг для идентификации равных количеств аллелей сиалоадгезина дикого типа и целевого типа.
[0034] На Фигуре 5 представлена структурная организация CD163 дикого типа (слева), содержащего 9 внеклеточных SRCR-доменов, 2 богатых пролином, серином и треонином (PST) домена, трансмембранную область и внутриклеточный цитоплазматический хвост. Генетически модифицированный CD163 представлен справа. Структурная организация домена остается такой же, за исключением того, что SRCR-домен 5 был заменен на SRCR-домен 8 из лиганда CD163 (CD163L).
[0035] На Фигуре 6 представлен вектор нацеливания CD163, в котором плечи вектора являются участками ДНК с последовательностью, идентичной природному CD163 или дикого типа, что позволяет отжиг вектора с CD163, уже присутствующим в клетках. Модифицированная ДНК, которая находится между двумя плечами CD163 затем может быть внедрена в клетки ДНК посредством гомологической рекомбинации.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[0036] «Нокаутная свинья» представляет собой генетически модифицированную свинью, у которой было изменено функционирование одного или обоих аллелей гена, к примеру, путем частичной или полной делеции гена. Если один аллель гена нокаутирован, то свинья гетерозиготна по нокаутированному гену; если нокаутированы оба аллеля, то свинья гомозиготна по нокаутированному гену.
[0037] Термин «донорская клетка» обозначает клетку, от которой происходит ядро или материал хроматина, используемые для ядерной передачи. Как описано в других местах данного документа, ядерная передача может включать перенос ядра или хроматина, выделенных из донорской клетки, или перенос всей донорской клетки, включая ядро или материал хроматина.
[0038] Термин «генная модификация» обозначает одно или более изменений генной последовательности (включая кодирующие последовательности и некодирующие последовательности, такие как последовательности интронов, промоторов и 5' и 3'-нетранслируемые последовательности), которые изменяют экспрессию или активность гена. Такие модификации включают, к примеру, инсерции (например, гетерологических последовательностей, таких как селектируемые маркеры и/или сигналы останова), делеции, мутации сдвига рамки считывания, бессмысленные мутации, миссенс-мутации, точечные мутации или их комбинации.
[0039] Термин «реципиентная клетка» обозначает клетку, в которую вводится донорская клетка, ядро донорской клетки или хроматин донорской клетки. Реципиентные клетки перед ядерной передачей энуклеируются подходящим способом. Примеры реципиентных клеток включают ооциты, зиготы и клетки двухклеточных эмбрионов.
[0040] «Малые интерферирующие РНК» (миРНК) обозначают двухнитевые молекулы РНК, обладающие способностью специфически влиять на экспрессию белка. миРНК обычно имеют от приблизительно 10 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину. Длина молекулы миРНК основывается на длине антисмысловой цепи молекулы миРНК.
ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ
[0041] Настоящее изобретение направлено на генетически модифицированных свиней, резистентных к инфекции вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Инфекционная способность ВРРСС зависит от трех специфических медиаторов проникновения: (1) первоначальное связывание с гепарансульфатом, (2) связывание/интернализация сиалоадгезином (SIGLEC1), и (3) интернализация/обнажение вируса, оказываемые CD163. Таким образом, предотвращение взаимодействия между ВРРСС и SIGLEC1 и/или ВРРСС и CD163 приводит к невозможности ВРРСС инфицировать хозяина. В связи с этим, настоящее изобретение направлено на генетически модифицированную свинью, у которой по меньшей мере инактивирован один аллель гена SIGLEC1 и/или у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС). Эти свиньи также могут называться нокаутными по SIGLEC 1 и/или CD163 свиньями.
[0042] Изобретение включает свиней, у которых только один аллель целевого гена (SIGLEC 1 и/или CD163) был инактивирован, а другой остался неизменным. Эти животные, называемые в данном документе «гетерозиготными» или «гемизиготными» животными могут использоваться в подходах к разведению для получения гомозиготных мутантов. Также в изобретение включены гомозиготные мутантные свиньи, у которых инактивированы оба аллеля целевого гена по одному или разным способам. Соответственно, настоящее изобретение включает генетически модифицированных свиней, у которых: (1) один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован; (2) один аллель гена CD163 был инактивирован; (3) оба аллеля гена SIGLEC1 были инактивированы; (4) оба аллеля гена CD163 были инактивированы; (5) оба аллеля гена SIGLEC1 и один аллель гена CD163 были инактивированы; (6) один аллель гена SIGLEC 1 и оба аллеля гена CD163 были инактивированы; (7) один аллель гена SIGLEC1 и один аллель гена CD163 были инактивированы; или (8) оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 были инактивированы. В каждом из этих случаев и в общем контексте настоящей заявки, инактивация аллеля(ей) CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
[0043] Нацеливание на ген с целью получения животных по изобретению может привести к инактивации гена посредством разрушения, удаления, изменения или перемещения последовательностей целевого гена. Способы инактивации гена хорошо известны в данной области техники. К примеру, целевой ген может быть инактивирован внедрением гетерологической последовательности (такой как селектируемый маркер и/или стоп-кодон) в целевой ген, делецией части гена или всего гена, изменением гена (например, мутацией рамки считывания, бессмысленной мутацией, миссенс-мутацией, точечной мутацией, заменой части гена или всего гена на другую нуклеиновокислотную последовательность) или комбинацией любого из вышеперечисленного.
[0044] Внедренные последовательности могут заменить ранее существующие последовательности в гене или могут быть добавлены к таким последовательностям, в зависимости от схемы целевой конструкции. Схема целевых конструкций может быть изменена, в зависимости от того, необходимо ли полностью нокаутировать функцию гена или поддерживать сниженный уровень функционирования. В случае SIGLEC1, желателен полный нокаут функции. В качестве примера и, не ограничиваясь описанным, ген SIGLEC1 может быть нокаутирован делецией части экзона 1 и всех экзонов 2 и 3, к примеру, заменой части экзона 1 и всех экзонов 2 и 3 на неомицин-селектируемую кассету. В некоторых воплощениях модифицирование может также включать добавление LoxP-сайтов с любой стороны последовательности мутируемого гена SIGLEC1. В некоторых случаях нацеленная конструкция может содержать оба loxP-сайта, фланкирующие внедряемую последовательность и CRE-рекомбиназу. В других случаях может использоваться двухвекторная система, в которой нацеленная конструкция включает loxP-сайты, фланкирующие внедряемую последовательность, а второй вектор включает трансген, кодирующий CRE-рекомбиназу. Трансген для CRE-рекомбиназы может располагаться под влияние тканеспецифического промотора, так чтобы его экспрессия отображала ген SIGLEC1, который нефункционален в конкретных клеточных линиях. Аналогичным образом, антибиотик-селектируемая кассета может быть фланкирована loxP-сайтами так, чтобы она могла быть удалена на более позднем этапе при помощи Cre-рекомбиназы.
[0045] В случае CD163, желательно инактивировать только его функцию ВРРСС-связывания и/или его обнажения, оставляя другие функции CD163 минимально затронутыми или незатронутыми. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, считается, что полностью нокаутные по CD163 особи могут быть нежизнеспособными или серьезно скомпрометированными по причине роли, которую играет CD163 в связывании и интернализации комплексов гемоглобин-гаптоглобин. Соответственно, CD163 может быть деактивирован разрушением пятого N-терминального фагоцитарного богатого цистеином (SRCR) домена CD163, для которого было показано, что он играет роль в ВРРСС-инфекции (Van Gorp et al., 2010), оставляя остальные домены незатронутыми. SRCR домен 5 может быть генетически модифицирован, например, внедрением точечных мутаций, которые изменяют структуру этого домена или обменом этого домена на другой. К примеру, SRCR домен 5 может быть замещен на SRCR домен 8 из CD163 лиганда (CD163L), поскольку этот «обмен» домена, как было показано, снижает относительную инфекционность ВРРСС до 0% в культивированных клетках (Van Gorp et al 2010).
[0046] По другим подходам, кодирующие последовательности целевого гена не изменяются или изменяются минимально, а взамен нацеливание производится на последовательности, влияющие на экспрессию целевого гена, такие как промоторные последовательности. В любом случае, инсерция селектируемого маркера часто желательна для облегчения идентификации клеток, в которых произошло нацеливание. При необходимости, такие маркеры или иные внедренные последовательности могут быть позднее удалены, например, при помощи Cre-Lox или аналогичных систем.
[0047] При модифицировании целевого гена используются нуклеиновокислотные конструкции с участками гомологии с целевым геном (например, SIGLEC1 или CD163) или с фланкирующими областями целевого гена, так чтобы интегрирование конструкций в геном изменяло экспрессию гена, изменением последовательности гена и/или изменением уровней экспрессии гена. Таким образом, для изменения гена нацеленная конструкция обычно разрабатывается так, чтобы она включала три основные области: (i) первую область, которая гомологична целевому локусу, на который производится нацеливание (например, ген SIGLEC1 или CD163, либо их фланкирующая последовательность), (ii) вторую область, представляющую собой гетерологическую полиуклеотидную последовательность (например, кодирующую селектируемый маркер, такой как белок резистентности к антибиотику), которая специфически замещает часть локуса нацеливания или внедрена в локус нацеливания и (iii) третью область, которая, подобно первой области, гомологична локусу нацеливания, но обычно не смежна с первой областью конструкции. Гомологическая рекомбинация между нацеленной конструкцией и локусом нацеливания дикого типа приводит к делеции любых локусных последовательностей между двумя областями гомологии, отраженными в нацеленном векторе и замещению этой последовательности на гетерологическую последовательность (например, гетерологической последовательности, кодирующей селектируемый маркер) или внедрению ее внутрь той последовательности. Типичные конструкция и вектор для выполнения такого нацеленного модифицирования описаны в Примере 1; тем не менее, известны другие векторы, которые могут применяться по таким подходам, и которые с легкостью могут быть адаптированы для использования по изобретению.
[0048] Чтобы облегчить гомологическую рекомбинацию, первая и третья области нацеленных векторов (см. выше) включают последовательности, которые проявляют значительную идентичность последовательности с генами, на которые они нацелены (или фланкирующими областями). К примеру, первая и третья области нацеленных векторов могут иметь последовательности, которые по меньшей мере приблизительно на 80% по меньшей мере приблизительно на 90% по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 98% по меньшей мере приблизительно на 99% или приблизительно на 100% идентичны целевым генам или фланкирующим областям. Идентичность последовательности обычно измеряют при помощи BLAST® (Средство поиска основного локального выравнивания) или BLAST®2 с параметрами по умолчанию, указанными там (см. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990; Tatiana et al., FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250, 1999). Таким образом, последовательности, которые по меньшей мере приблизительно на 80% по меньшей мере приблизительно на 90% по меньшей мере приблизительно на 95% по меньшей мере приблизительно на 98%) по меньшей мере приблизительно на 99% или даже приблизительно на 100%) идентичны последовательностью локусам целевых генов могут использоваться по изобретению для облегчения гомологической рекомбинации.
[0049] Общий размер двух гомологических областей (т.е., первой и третьей областей, описанных выше) может составлять, к примеру, от приблизительно 2 килобаз (кб) до приблизительно 25 кб (например, от приблизительно 4 кб до приблизительно 20 кб, от приблизительно 5 кб до приблизительно 15 кб, или от приблизительно 6 кб до приблизительно 10 кб). Размер области, заменяющей часть целевого локуса или внедряемой в целевой локус (вторую область, описанную выше), может составлять, к примеру, от приблизительно 0,5 килобаз (кб) до приблизительно 5 кб (например, от приблизительно 1 кб до приблизительно 4 кб или от приблизительно 3 кб до приблизительно 4 кб).
[0050] Могут применяться различные способы доставки нацеленной конструкции. Для доставки нацеленной конструкции могут использоваться способы клеточной трансфекции, включая кальций-фосфатную, липофекцию, электропорацию и инъекцию ядра. Если ген является транскрипционно активным в используемом типе клетки, то может применяться стратегия беспромоторного селектируемого маркера, так, чтобы устойчивость к антибиотику формировалась только у клеток, претерпевших событие рекомбинации в транскрибируемой единице. Альтернативно, если ген транскрипционно неактивен в используемом типе клетки, то могут применяться промоторы, которые индуцируемы, тканеспецифичны или содержат изоляторы, такие как области присоединения матрицы (MAR).
[0051] Альтернативно, чтобы «заглушить» транскрипцию SIGLEC1, может применяться технология миРНК. Антисмысловая технология хорошо известна в данной области техники. Короче говоря, применяется нуклеотидная последовательность, содержащая от приблизительное до приблизительно 29 нуклеотидов, которая является комплементарной по отношению к смысловой последовательности иРНК SIGLEC1. Степень комплементарности обычно находится в пределах от приблизительно 70% до приблизительно 100%. Предпочтительно, комплементарность больше, чем приблизительно 80%, более предпочтительно, больше, чем приблизительно 90%, и еще более предпочтительно, больше, чем приблизительно 95%. Области иРНК SIGLEC1, которые пригодны для нацеливания миРНК, легко могут быть определены путем сравнения эффективности некоторых антисмысловых последовательностей, выполненных таким образом, чтобы быть комплементарными по отношению к различным областям иРНК SIGLEC1 для предотвращения продукции белка SIGLEC1. Такие эксперименты могут быть легко выполнены без необоснованного экспериментирования по любой из техник, известных в данной области техники.
[0052] Векторы, используемые для экспрессии миРНК, хорошо известны в данной области техники. Вектор может быть круговой или линейной ДНК любой длины, либо встраивающейся в геном хозяина, либо поддерживающей себя в эписомальной форме. В общем, кассеты экспрессии миРНК могут быть лигированы в вектор ДНК-трансфекции, такой как плазмида или лентивирусный, аденовирусный, альфавирусный, ретровирусный или иной вирусный вектор. Типичные вирусные векторные системы для млекопитающих включают аденовирусные векторы; векторы адено-ассоциированного вируса типа 1 («AAV-1») или адено-ассоциированного вируса типа 2 («AAV-2»); векторы гепатита дельта; живые, ослабленные дельта-вирусы; герпесвирусные векторы; альфавирусные векторы; или ретровирусные векторы (включая лентивирусные векторы).
[0053] Трансформация клеток млекопитающих может выполняться по стандартным методикам, известным в данной области техники. Может использоваться любая из хорошо известных процедур по внедрению чужеродных нуклеотидных последовательностей в клетки-хозяева, если они успешно встраивают в клетку-хозяина по меньшей мере миРНК-конструкцию. Эти процедуры включают использование вирусной трансдукции (к примеру, путем использования любого из вирусных векторов, указанных в предыдущем параграфе, например, ретровирусной инфекцией, необязательно, в присутствии полибрена для усиления эффективности инфекции), кальций-фосфатной трансфекции, электропорации, биолистической системы доставки частиц (т.е., генных пушек), липосом, микроинъекции и любого из других известных способов введения клонированной геномной ДНК, кДНК, синтетической ДНК или иного чужеродного генетического материала в клетку-хозяина. По настоящему изобретению, миРНК против SIGLEC1 вводится в донорскую фибробластную клетку свиньи, которую затем используют для получения трансгенно модифицированной свиньи по настоящему изобретению.
[0054] Трансгенные животные по изобретению могут быть получены с использованием следующей общей процедуры переноса ядра соматической клетки. Вкратце, геном соматической клетки свиньи (например, фетальный фибробласт) генетически модифицируют генным нацеливанием, как описано выше, чтобы получить донорскую клетку. Затем ядро такой генетически модифицированной донорской клетки (или донорскую клетка полностью, включая ядро) переносят в реципиентную клетку, к примеру, в энуклеированный ооцит. Донорская клетка может быть слита с энуклеированным ооцитом или донорское ядро донорской клетки само по себе может быть инъецировано в реципиентную клетку или инъецировано в перивителлиновое пространство рядом с мембраной ооцита.
[0055] Таким образом, после получения соматических клеток, в которых было произведено нацеливание на целевой ген (на один или оба аллеля, как описано выше), может быть выполнен ядерный перенос. Необязательно, генетически модифицированные донорские клетки могут быть криоконсервированы до ядерного переноса. Пригодные к использованию реципиентные клетки включают ооциты, оплодотворенные зиготы или клетки двуклеточных эмбрионов, все из которых могут быть или могут не быть энуклеированы.
[0056] Реципиентные ооциты могут быть получены по способам, известным в данной области техники или же могут быть получены из коммерческих источников (например, BoMed Inc., Мэдисон, Висконсин). Ооцит может быть получен от «подсвинка», т.е. от нерожавшей самки свиньи, либо от «свиноматки», т.е. от рожавшей самки свиньи.
[0057] Соответственно, генетически модифицированная свинья, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, может быть получена посредством энуклеации ооцита свиньи; слияния ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере один инактивированный аллель гена SIGLEC1; и активации ооцита для получения эмбриона. Аналогичным образом, генетически модифицированная свинья, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному к связыванию и/или обнажению вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), может быть получена посредством энуклеации ооцита свиньи; слияния ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, содержащей в геноме фибробластной клетки по меньшей мере один инактивированный аллель гена CD163; и активации ооцита для получения эмбриона. Оба способа могут дополнительно включать этап переноса эмбриона в репродуктивный тракт суррогатной свиньи, отличающейся тем, что у суррогатной свиньи начался эструс, но не завершилась овуляция; и отличающейся тем, что беременность и роды в срок дают генетически модифицированную свинью, геном которой содержит по меньшей мере один инактивированный аллель SIGLEC1 и/или CD163. Настоящее изобретение также относится к потомству такой генетически модифицированной свиньи, у которого по меньшей мере инактивирован один аллель гена SIGLEC1 и/или у которого инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
[0058] Способы энуклеации ооцитов свиньи известны в данной области техники, и энуклеации можно добиться по любому из стандартных способов. К примеру, энуклеации ооцита можно добиться при помощи микропипетки в микроманипуляционной среде.
[0059] Введение окруженного мембраной ядра от донорской клетки свиньи в энуклеированный реципиентный ооцит с образованием ооцита, содержащего донорское ядро, может выполняться путем слияния мембраны окруженного мембраной ядра из донорской клетки млекопитающего с мембраной энуклеированного реципиентного ооцита млекопитающего с образованием ооцита, содержащего ядро донорской клетки млекопитающего. Альтернативно, такое введение может выполняться путем микроинъекции окруженного мембраной ядра из донорской клетки млекопитающего в энуклеированный реципиентный ооцит млекопитающего с образованием ооцита, содержащего ядро донорской клетки млекопитающего. К примеру, можно вводить донорскую клетку (или ядро) в пространство под блестящей оболочкой или в перивителлиновое пространство энуклеированного реципиентного ооцита и впоследствии выполнять слияние мембраны с получением ооцита, содержащего в цитоплазме донорское ядро. В способах, представленных в данном документе, можно использовать все варианты введения донорского ядерного материала в энуклеированный реципиентный ооцит млекопитающего, которые известны обычному специалисту в данной области техники.
[0060] К примеру, этап слияния может выполняться в среде для слияния. Альтернативно, для облегчения слияния могут применяться инактивированный вирус или фузогенный агент, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ). См., например, Graham (1969) Wistar Inst. Symp. Monogr. 9:19-33 и Mc Grath et al. (1983) Science 220:1300-1302 об использовании вирусов; Fisher et al. (1981) Tech. Cell. Physiol. 1:1-36 о химически индуцированном слиянии клеток; и Berg (1982) Bioelectrochem. Bioenerg. 9:223-228, а также Robl et al. (1987) J. Anim. Sci. 64:642-647 об электрическом индуцировании слияния клеток.
[0061] В US 6211429 В1, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки, описаны способы развития активированных ооцитов in vitro и in vivo. Термин «активированный» или «активация» обозначает способность неоплодотворенного ооцита развиваться до по меньшей мере пронуклеарного этапа или до последующих этапов, после обработки ооцит-модифицирующим агентом и восстанавливающим агентом. Говоря в общем, пронуклеарный этап достигается приблизительно через три-семь часов после такой обработки. Термин «ооцит-модифицирующий агент» обозначает агент, который может реагировать с субстратом на ооците или в нем, к примеру, с тиоловой (-SH) группой, которая может быть белковой тиоловой группой; эффект от этой реакции при последующей обработке ооцита восстанавливающим агентом по способам, представленным в US 6211429 В1, приводит к активации ооцитов млекопитающих.
[0062] При совместном использовании -SH или ооцит-модифицирующего агента, такого как тимеросал и -SH восстанавливающего агента, такого дитиотреитол, возможна полная активация ооцитов млекопитающих. Сочетание короткой обработки тимеросалом с только одним кальциевым переходом до обработки восстанавливающим агентом, таким как ДТТ, особенно эффективно для достижения активации. Тимеросал запускает серию Са2+ выбросов в ооцитах млекопитающих, которая с последующим инкубированием с восстанавливающим агентом, таким как ДТТ, может стимулировать образование пронуклеуса. Так, после вымывания тимеросала, добавляют ДТТ, чтобы обратить действие тимеросала с последующим вымыванием, чтобы позволить эмбриону продолжить развитие. Комбинированная обработка тимеросал/ДТТ также индуцирует экзоцитоз кортикальной гранулы, последующее уплотнение блестящей оболочки и развитие активированных ооцитов до этапа бластоцисты.
[0063] Помимо тимеросала, могут применяться другие ооцит-модифицирующие агенты, такие как трет-бутилгидропероксид; тиомочевина; фенилэфрин; N-алкилмалеимиды, такие как N-этилмалеимид; окисленный глутатион; альфа-галокислоты, такие как иодацетат, хлорацетат и бромацетат; иодацетамид; п-меркурибензоат; п-хлормеркурибензоат;
5,5'-дитиобис(2-нитробензойная кислота) (DTNB);
(2-триметиламмоний)этилметантиосульфонат (MTSET); и (2-сульфонатоэтил)метантиосульфонат (MTSES). Пригодные восстанавливающие агенты, такие как восстановители тиоловой (-SH) группы, помимо ДТТ, включают, но, не ограничиваясь перечисленным, дитиоэритритол (ДТЭ); бета-меркаптоэтанол; цистеин; восстановленный глутатитон; восстановленную тиомочевину; тиогликолят; и аскорбиновую кислоту.
[0064] Период времени, в течение которого ооциты контактируют с ооцит-модифицирующим агентом является периодом, эффективным для активации ооцитов при последующей обработке восстанавливающим агентом. Такой период времени может быть в пределах от приблизительно 5 минут до приблизительно 20 минут, предпочтительно от приблизительно 5 минут до приблизительно 15 минут, или, более предпочтительно, от приблизительно 5 минут до приблизительно 12 минут. Период времени, в течение которого ооциты контактируют с восстанавливающим агентом должен быть достаточно долгим, чтобы привести к активации ооцитов при предшествующей обработке ооцит-модифицирующим агентом. Такой период времени может быть в пределах от приблизительно 5 минут до приблизительно 1 часа, предпочтительно от приблизительно 10 минут до приблизительно 45 минут, более предпочтительно, от приблизительно 20 минут до приблизительно 40 минут, еще более предпочтительно, приблизительно 30 минут.
[0065] Контактирование энуклеированного ооцита с восстанавливающим агентом после контактирования с ооцит-модифицирующим агентом может происходить почти сразу же после или в течение периода времени в пределах от приблизительно 5 секунд до приблизительно 5 минут после воздействия ооцит-модифицирующего агента на ооцит. Ооцит, обработанный ооцит-модифицирующим агентом, может переноситься в среду, содержащую восстанавливающий агент, в отсутствие промежуточного промывочного этапа. Альтернативно, ооцит, обработанный ооцит-модифицирующим агентом, может промываться контрольной или содержащей восстанавливающий агент средой для почти полного удаления ооцит-модифицирующего агента перед культивированием ооцита в среде, содержащей восстанавливающий агент. В качестве другой альтернативы, восстанавливающий агент может добавляться непосредственно к ооциту, в то время как последний все еще находится в среде, содержащей ооцит-модифицирующий агент.
[0066] Альтернативно, активация ооцита также может достигаться при ряде химических обработок, не включающих кальций, например, ингибированием протеинкиназы (Mayes et al. (1995) Biol. Reprod. 53:270-275) или ингибированием синтеза белка (Nussbaum et al. (1995) Mol. Reprod. Dev. 41:70-75).
[0067] После активации ооцит обычно недолго культивируют in vitro. Затем полученный эмбрион переносят в суррогатную самку, и развитие эмбриона продолжается суррогатно. К примеру, эмбрионы могут культивироваться в течение приблизительно недели, а затем трансфицироваться хирургически или нехирургически в репродуктивный тракт суррогата. Эмбрионы могут трансфицироваться в фаллопиеву трубу через яичниковые бахромки суррогата. Альтернативно, эмбрионы могут трансфицироваться в фаллопиеву трубу при помощи катетера, проникающего через стенку фаллопиевой трубы. Другой способ переноса эмбрионов включает культивирование их до этапа бластоцисты с последующим введением в репродуктивный тракт суррогатной свиньи. Эти способы хорошо известны в данной области техники и могут с легкостью применяться для получения генетически модифицированных свиней по настоящему изобретению.
[0068] Дополнительные способы для получения генетически модифицированных свиней и других крупных животных известны в данной области техники и могут использоваться по настоящему изобретению (см., к примеру, US 2005/0120400 A1; Патент США Nо. 5995577; WO 95/16670; WO 96/07732; WO 97/00669; WO 97 00668; WO 2005/104835; Lai et al., Reproductive Biology and Endocrinology 1:82, 2003; Hao et al., Transgenic Res. 15:739-750, 2006; Li et al., Biology of Reproduction 75:226-230, 2006; Lai et al., Nature Biotechnology 24(4):435-436, 2006; Lai et al., Methods in Molecular Biology 254(2): 149-163, 2004; Lai et al., Cloning and Stem Cells 5(4):233-241, 2003; Park et al., Animal Biotechnology 12(2):173-181, 2001; Lai et al., Science 295:1089-1092, 2002; Park et al., Biology of Reproduction 65:1681-1685,2001; содержимое которых включено в данный документ посредством ссылки).
[0069] Другие способы, пригодные для получения генетически модифицированных свиней включают инъекцию или трансдукцию нуклеаз (нуклеазы с цинковыми пальцами или Tal-нуклеазы, которые были бы нацелены на интересующий ген) в соматические клетки, с последующим ядерным переносом соматической клетки и переносом эмбриона в суррогат. Помимо этого также может выполняться сперма-опосредованное или опосредованное внутрицитоплазматической инъекцией спермия (ICSI) генетическое модифицирование. Вкратце, при ICSI-опосредованном модифицировании, нацеленную конструкцию смешивают со спермием и инъецируют оба компонента в ооцит. При сперма-опосредованном модифицировании конструкцию смешивают со спермой и для того, чтобы суррогатная мать забеременела, применяют оплодотворение in vitro (IVF) или осеменение. Опытный специалист может с легкостью использовать эти способы для получения нокаутных свиней по настоящему изобретению. Хотя они и не развиваются полностью в свинью, эмбриональные стволовые клетки или индуцированные плюрипотентные клетки, по технологии, разработанной для мышей, могут быть генетически модифицированы и использоваться либо в качестве донорских клеток для переноса ядра соматической клетки, либо для получения химерных животных.
[0070] Как указывалось выше, настоящее изобретение также направлено на генетически модифицированную свинью, у которой (1) инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1, (2) инактивированы оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллелей CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), или (3) инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163. Генетически модифицированные свиньи, которые гомозиготны по инактивации гена, могут быть получены путем спаривания гетерозиготных по инактивации гена свиней и скринингом потомства для идентификации животных, гомозиготных по инактивации гена(ов). Настоящее изобретение также направлено на потомство такой генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы один или оба аллеля гена SIGLEC1 и/или инактивированы один или оба аллеля гена CD163, причем инактивация аллелей CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
[0071] Соответственно, настоящее изобретение направлено на способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1, посредством спаривания самки генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с самцом генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере один аллель SIGLEC1, с получением F1-потомства, и скринингом F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1. Аналогично, настоящее изобретение направлено на способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена CD163, посредством спаривания самки генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с самцом генетически модифицированной свиньи, у которого инактивирован по меньшей мере один аллель CD163, с получением F1-потомства, и скринингом F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена CD163.
[0072] По настоящему изобретению также предлагаются способы получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163. Один такой способ включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, с генетически модифицированной свиньей, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163 с получением F1-потомства; скрининг F1-потомства для идентификации генетически модифицированной свиньи, у которой инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 иинактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163; спаривание друг с другом генетически модифицированных свиней, у которых инактивирован по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1, и инактивирован по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением Р2-потомства, и скрининг Р2-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163.
[0073] Способы получения генетически модифицированной свиньи, у которой по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 был инактивирован и/или по меньшей мере один аллель гена CD163 был инактивирован, представлены в разделах выше. Скрининг потомства может выполняться так, как принято стандартно в данной области техники, например, использованием ПЦР или Саузерн-блоттингом.
[0074] Другой способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1, и инактивированы оба аллеля гена CD163, включает спаривание генетически модифицированной свиньи, гомозиготной по инактивации SIGLECI, с генетически модифицированной свиньи, гомозиготной по инактивации CD163, с получением F1-потомства, спаривание F1-потомства, чтобы получить Р2-потомство и скрининг Р2-потомства для выявления животных, гомозиготных и по инактивации SIGLEC1, и инактивации CD163.
[0075] Еще один способ получения генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163, включает спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с другой генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы по меньшей мере один аллель гена SIGLEC1 и по меньшей мере один аллель гена CD163, с получением F1-потомства, и скрининг F1-потомства для выявления генетически модифицированных свиней, у которых оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD165 инактивированы.
[0076] Настоящее изобретение также относится к потомству генетически модифицированной свиньи, полученному по любому из способов выше, у которого инактивированы один или оба аллеля гена SIGLEC1 и/или инактивированы один или оба аллеля гена CD163, причем инактивация гена CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
[0077] Помимо того, что гомозиготных мутантных животных можно получать по подходам разведения, в которых используются гетерозиготные животные, их также можно получать по подходу, в котором клетка (например, фетальный фибробласт) с мутацией в одном аллеле, такая как клетка, выделенная от животного, полученного по способам, описанным выше, подвергается генному нацеливанию посредством гомологической рекомбинации, чтобы достичь модифицирования оставшегося аллеля. Затем полученная донорская клетка может использоваться в качестве источника модифицированного ядра для ядерного переноса в реципиентную клетку, такую как энуклеированный ооцит, приводя к образованию гомозиготного мутантного эмбриона, который при имплантации в суррогатную самку, развивается в гомозиготное мутантное животное. Генетически модифицированная свинья, у которой оба аллеля гена(ов) SIGLEC1 и/или СD163 были инактивированы, также может быть получена посредством инъекции или трансфекции цинк-пальцевых нуклеаз или Tal-нуклеаз (которые могут нацеливаться на оба аллеля гена одновременно) в соматических клетках, с последующим переносом ядра соматической клетки (ПЯСК) и переносом эмбриона суррогатной матери для получения такой свиньи. Настоящее изобретение также относится к потомству такой генетически модифицированной свиньи, у которого инактивированы один или оба аллеля гена SIGLEC1 и/или инактивированы один или оба аллеля гена CD163, причем инактивация гена CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
[0078] После детального описания изобретения будет очевидно, что возможны его модификации и варианты без отступания от охвата изобретения, определенного в прилагаемой формуле изобретения.
ПРИМЕРЫ
[0100] Следующие неограничивающие примеры представлены для дальнейшей демонстрации настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
[0101] Модифицирование гена SIGLEC1
[0102] В подходе, используемом для усечения гена сиалоадгезина, применялась гомологическая рекомбинация для удалеения экзонов, кодирующих белок и введения преждевременных остановов в оставшейся кодирующей последовательности гена сиалоадгезина. Ген сиалоадгезина свиньи (SIGLEC1, референсная последовательность NCBI NM_214346) кодирует 210 кДа белок с транскрипта иРНК в 5193 баз (Vanderheijden et al. 2003). Последовательность генома свиньи в районе гена сиалоадгезина (Номер доступа в Genbank CU 467609) использовалась для получения олигонуклеотидов для усиления фрагментов генома при помощи высокоточной ПЦР [AccuTaq (Invitrogen)] для получения нацеленной конструкции. Один фрагмент («верхнее плечо») включал первый кодирующий экзон и 3304 пар оснований вверх от начала трансляции. Второй («нижнее плечо») фрагмент имел длину 4753 пар оснований и включал большинство интронов вниз после третьего кодирующего экзона, вплоть до 6-го интрона (включая 4-й, 5-й и 6-й кодирующие экзоны). Исходя из сравнения с геномными последовательностями мышиного и человеческого сиалоадгезина, прогнозировалось, что ген сиалоадгезина свиньи состоит из 21 экзона (Фиг. 1А, 1В). Экзон 2 консервативен для свиньи, мыши и человека. Аминокислотное выравнивание экзона 2 выявило, что шесть аминокислот мышиного сиалоадгезина, для которых известно, что они ассоциированы с активностью в связывании сиаловой кислоты, сохранены в свинном сиалоадгезине (Фиг. 1С). Стратегия изначального нацеливания фокусировалась на создании изменений в гене сиалоадгезина так, чтобы из мутантного гена не ожидалось получения функционального белка. Другие стратегии инактивации могут включать нацеленную модификацию выбранных остатков в экзоне 2 гена сиалоадгезина или изменение доменов иммуноглобулина так, чтобы избежать связывания вируса РРСС (возможно, изменением их порядка или замещением их на похожие домены от других видов). Дополнительные модификации могут включать фланкирование неомициновой кассеты или одного иммуноглобулин-подобных доменов сайтами loxP чтобы при желании позволить индуцируемое или тканеспецифическое извлечение.
[0103] При нарушении текущего гена, часть экзона 1 и экзоны 2 и 3 полностью заменялись неомиционовой кассетой селекции с использованием вектора заместительного типа (Фиг. 1D) (Mansour et al. 1988). В плазмидной конструкции промотор фосфоглицеролкиназы (ФГК) использовался для управления экспрессией неомициновой кассеты, чтобы позволить положительную селекцию трансфицированных колоний.
[0104] Подготовка Донорской Клетки
[0105] Первичная клеточная линия мужских фетальных фибробластов 35 суток беременности была выделена от приобретенных крупных белых свиней (Ландрас). Клетки были культивированы и выращены в течение 48 часов до 80%-й конфлюэтности в среде Игла модификации Дульбекко (DMEM), содержащей 5 мМ глутамина, натрия бикарбонат (3,7 г/л), пенициллин-стрептомицин и 1 г/л d-глюкозы с добавкой 15% фетальной телячьей сыворотки Hyclone, 10 мкг/мл гентамицина и 2,5 нг/мл главного фактора роста фибробластов (Sigma). За четыре часа до трансфекции среду удаляли и заменяли на свежую. Фибробластные клетки были промыты 10 мл фосфатного солевого буферного раствора (DPBS; Invitrogen) и помещены в колбу вместимостью 75 см с 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА (Invitrogen). Клетки были ресуспендированы в DMEM и собраны путем центрифугирования при 600 xg в течение 10 минут. Клетки были промыты Opti-MEM (Invitrogen) и вновь центрифугированы при 600 xg в течение 10 минут. Для ресуспендирования осадка использовались цитосоли (75% цитосолей [120 мМ KCl, 0,15 мМ CaCl2, 10 мМ K2НРO4; рН 7,6, 5 мМ MgCl2]) и 25% Opti-Mem (van den Hoff et al. 1992). Клетки были подсчитаны в гемоцитометре и их концентрация была доведена до 1×106 клеток на мл. Электропорацию клеток выполняли с 4 мкг однонитевой нацеленной ДНК (получали тепловой денатурацией) в 200 мкл трансфекционной среды, состоящей из 1x106 клеток/мл. Клетки были подвергнуты элетропорации в электрической ячеке-манипуляторе ВТХ ЕСМ 2001 с тремя импульсами 250 В длительностью по 1 мс. Электропорированные клетки были разбавлены DMEM/FBS/ФРФ при 10000 клеток на 13 см чашку. Электропорированные клетки культивировались в течение ночи без селективного давления. На следующий день среду заменяли питательной средой, содержащей G418 (0,6 мг/мл). Спустя 10 дней селекции, были выделены G418-резистентные колонии, которые были перенесены в 24-луночные планшеты для экспансии. После выращивания в 24-луночных планшетах, клетки были разделены (~половину использовали для выделения геномной ДНК) в 6-луночные планшеты. Для определения успешности нацеливания на ген сиалоадгезина использовали ПЦР. В реакции использовались олигонуклеотиды, которые отжигались в фосфоглюкокиназной (ФГК) кассете (включающей Neo), спаренной с теми, которые отжигались с геномной ДНК в сиалоадгезиновом локусе, расположенном за пределами целевых плеч (см. Фиг. 2). Таким образом, было выявлено успешное нацеливание на оба «плеча». Был идентифицирован нацеленный клон фибробластов (4-18) и некоторые из клеток культуры использовались для ядерного переноса (см. ниже), а остальные были заморожены для последующего применения. Для дополнительного подтверждения успешности нацеливания, выполнялась проверка гомологической рекомбинации способом Саузерн-блоттинга.
[0106] Сбор ооцитов и созревание In Vitro(WM)
[0107] Ооциты свиней были приобретены у ART Inc (Мэдисон, Висконсин) и доведены до зрелости по инструкциям поставщика. Спустя 42-44 ч созревания in vitro, ооциты были отделены от кумулюсных клеток путем осторожного перемешивания в 0,5 мг/мл гиалуронидазе. После удаления кумулюсных клеток, выбирались ооциты с хорошей морфологией и видимым полярным тельцем (метафаза II), которые содержались в микроманипуляционной среде при 38,5°C до ядерного переноса.
[0108] Перенос ядра соматической клетки. Слияние/Активация Комплексных Ооцитов после Ядерного Переноcа, и Развитие в Культуре In Vitro
[0109] Под микроскопом бескумулюсный ооцит захватывали в удерживающую микропипетку в каплях микроманипуляционной среды с добавкой 7,5 мкг/мл цитохалазина В и покрытых минеральным маслом. Блестящую оболочку протыкали тонкой стеклянной инъекционной микропипеткой рядом с первым полярным тельцем, и первое полярное тельце с расположенной рядом цитоплазмой, содержащей хромосомы метафазы II, втягивали в пипетку, пипетку вытаскивали и содержимое выливали. Выбирали одну округлую и яркую донорскую клетку с гладкой поверхностью, которую переносили в перивителлиновое пространство рядом с мембраной ооцита (Lai et al. 2006; Lai et al. 2002).
[0110] Комплекс ядерного переноса (ооцит + фибробласт) сливали в среде для слияния с низким содержанием кальция (0,3 М маннитола, 0,1 мМ СаС12⋅2Н2O,0,1 мМ MgCl2⋅6H2O и 0,5 мМ HEPES). Затем слитые ооциты подвергали активации путем обработки 200 мкМ тимеросала в течение 10 минут в темноте, с последующим ополаскиванием и обработкой 8 мМ дитиотреитола (ДТТ) в течение 30 минут; затем ооциты вновь ополаскивались для удаления ДТТ (Machaty and Prather 2001; Machaty et al. 1997). После сливания/активации ооциты были промыты трижды средой для свиных зигот 3 (PZM3) с добавкой 4 мг/мл БСА (Im et al. 2004), и культивировались при 38,5°C в увлажненной атмосфере с 5% О2, 90% N2 и 5% СО2 в течение 30 минут. Успешно слитые комплексы культивировались 15-21 часов до хирургического переноса эмбриона в суррогат.
[0111] Подготовка Суррогата. Перенос Эмбриона. Диагностика Беременности и Роды
[0112] Суррогатные подсвинки были синхронизированы путем введения 18-20 мг REGU-MATE (0,22% раствор альтреногеста) (Intervet, Миллсборо, Делавер), который подмешивали в корм в течение 14 дней по схеме, в зависимости от этапа эстрального цикла. После последнего введения REGU-MATE (105 часов), внутримышечно вводили 1000 единиц чХГ, чтобы вызвать эструс. В суррогатный пул также включали других суррогатов, которые естественным образом подходили по циклу к соответствующей дате. Использовались суррогаты, у которых отмечался день начала (день 0) эструса или первый день после него (Lai et al. 2002). Суррогаты подготавливались асептически и производился каудально-вентральный разрез для обнажения репродуктивного тракта. Эмбрионы помещались в одну фаллопиеву трубу через бахромки яичника. Суррогатные матери проверялись на беременность путем ультразвукового исследования приблизительно на 30 сутки, а затем еще раз спустя неделю беременности. Свиньи обычно рожают на 114 сутки беременности.
[0113] После трансфекции и скрининга фибробластных клеток, были отобраны кандидатные донорские клетки, которые использовались для переноса ядра соматической клетки (ПЯСК). Шестьсот шестьдесят шесть ПЯСК-эмбрионов были перенесены двум суррогатным матерям. Одна принесла 6 нормальных поросят мужского пола на 115 сутки беременности, у другой суррогатной матери выполнили кесарево сечение на 117 сутки беременности, получив два нормальных поросенка мужского пола, как показано в Таблице 1.
[0114] На фигуре 2 показано строение гена сиалоадгезина (SIGLEC1), нацеленного вектора и ожидаемый после рекомбинации генотип. На верхней вкладке Фигуры 2 показана нацеленная конструкция, применявшаяся для гомологической рекомбинации. Как описано выше, «верхний» фрагмент ДНК, использовавшийся для создания нацеленной конструкции, содержал ~3,5 кб вверх от экзона 1 и включал часть экзона 1 (после стартового кодона). «Нижний» фрагмент ДНК начинался в пределах интрона 3 и включал экзоны 4, 5, 6 и часть экзона 7. Большая часть экзона 1 и экзоны 2 и 3 полностью были замещены на неомициновую (neo) кассету; тимидинкиназная (ТК) кассета была введена сразу же после нижнего плеча при необходимости для использования в качестве маркера отрицательной селекции. На нижней вкладке Фигуры 2 показан мутантный ген сиалоадгезина после гомологической рекомбинации. Стрелками показаны олигонуклеотиды сайтов связывания, использованные для ПЦР-скрининга нацеленных клеточных линий и клонированных свиней. Нацеливание верхнего и нижнего плеча выполнялось путем олигонуклеотидного отжига, как показано стрелками, обозначающими праймеры «верхний, нацеленный на сиало C» и «обратный ФГК поли A» (SEQ ID NO: 1 и 3), «прямой промотор ФГК» и «7Rw1» (SEQ ID NO: 4 и 6), соответственно. Олигонуклеотидные последовательности перечислены в Таблице 2 ниже. При дополнительной проверке ПЦР использовались олигонуклеотиды, которые фланкировали район усечения/кассету Neo (праймеры «Экзон 1 конец ck» и «Интрон 3 ck обратный» (SEQ ID NO: 2 и 5, соответственно)). Продукта поврежденного аллеля и аллеля дикого типа отличались по длине приблизительно на 500 пар оснований.
Праймерам из Таблицы 2 были присвоены идентификационные номера последовательностей исходя из положения стрелок в нижней части Фигуры 2 слева направо. Таким образом, самая левая стрелка в нижней части Фигуры 2 указывает положение праймера«верхний, нацеленный на сиало C» (SEQ ID NO: 1), следующая стрелка справа указывает положение праймера «Экзон 1 конец ck» (SEQ ID NO: 2), следующая стрелка справа от той указывает положение праймера «обратная ФГК поли A» (SEQ ID NO: 3), и так далее.
[0115] Скрининг на предмет инактивации SIGLEC1
[0116] Геномная ДНК была выделена от поросят и использовалась для подтверждения событий нацеливания. Успешность нацеливания на ген SIGLEC1 подтверждалась при помощи ПЦР с олигонуклеотидами, которые отжигались с кассетой Neo, спаренными с нуклеотидами, которые отжигались с геномной ДНК SIGLEC1, находившейся за областью, содержавшейся в нацеленной конструкции. На верхней вкладке Фигуры 3, нацеливание «верхнего» плеча изучалось при помощи олигонуклеотидов «обратная ФГК поли A» и «верхний нацеленный на сиало C» (SEQ ID NOs. 3 и 1, соответственно; показано на Фигуре 2). Был получен продукт ожидаемого размера (~4500 пар оснований). На нижней вкладке показано, что успешность нацеливания «нижнего» плеча определяли при помощи нуклеотидов «прямой промотор ФГК» и «7Rw1» (SEQ ID NOs: 4 и 6, соответственно; показано на Фигуре 2). Был получен продукт ожидаемого размера (~5000 пар оснований). Контрольное «нижнее плечо плазмиды» представляло собой частичную конструкцию, включающую кассету Neo с фрагментом гена сиалоадгезина, содержащим большую часть интрона 3 и большую часть экзона 7. Олигонуклеотид 7Rw1 был способен к отжигу с последовательностью экзона 7, присутствующей в плазмиде, и вместе с олигонуклеотидом прямого промотора ФГК, он был способен образовывать продукт, идентичный тому, который бы получался при успешном нацеливании. На обеих вкладках показаны реакции ПЦР нацеливания, выполненные на геномной ДНК, экстрагированной из восьми клонов поросят, полученных от линии нацеленных фетальных фибробластов 4-18.
[0117] Детектирование аллелей сиалоадгезина дикого и нацеленного типа выполнялось с использованием ПЦР с олигонуклеотидами, которые отжигались с ДНК, фланкирующей нацеленную область гена сиалоадгезина. Использовались олигонуклеотиды «Экзон 1 конец ck» и «Интрон 3 ck обратный» (SEQ ID NO: 2 и 5, соответственно; показано на Фигуре 2). Полученные продукты имели ~2400 пар оснований для аллеля дикого типа и ~2900 пар оснований для нацеленного аллеля. На Фигуре 4, вкладке слева (Фиг. 4А) показаны тестовые реакции, выполненные с геномной ДНК дикого типа, нацеленной плазмидой, использовавшейся для трансфекций, геномной ДНК (4-18) из успешно нацеленного клона фибробластов (обращают на себя внимание две полосы) и геномная ДНК (4-3) из ненацеленного клона фибробластов. На вкладке справа (Фиг. 4В) показана реакция, выполненная на геномной ДНК, экстрагированной из восьми клонов поросят, полученных от линии нацеленных фетальных фибробластов 4-18. В каждой полосе отмечалось два продукта ПЦР с ожидаемыми размерами, в то время как ДНК дикого типа и шаблонные нацеленные плазмиды давали только по одной линии. Таким образом, все поросята, полученные посредством ПЯСК, были гетерозиготны по предполагаемой мутации, а именно SIGLEC +/-.
[0118] Получение Гомозиготных Животных
[0119] Самцы генетически модифицированных свиней, идентифицированные как гетерозиготные по инактивации SIGLEC1, использовались как родительские особи (поколение F0), и спаривались с самками дикого типа для получения самцов и самок с одним инактивированным аллелем SIGLEC1 (F1). Самцы F1 затем спаривались с самками F1 для получения Р2-потомства с двумя инактивированными аллелями SIGLEC1. Такие животные могут быть идентифицированы после рождения посредством ПЦР, описанной выше и направленной на SIGLEC1 или, иначе, Саузерн-блоттингом.
ПРИМЕР 2
[0120] Получение Конструкции, Нацеленной на CD163
[0121] Как было установлено, делеция цитоплазматического домена CD163 приводит к неспособности ВРРСС к инфицированию; аналогично действует делеция или модификация SRCR домена 5. Поскольку некоторые из SRCR доменов CD163 обладают важными функциями для выживания животного, например, для удаления гемоглобина, модифицирование гена при условии сохранения других функций является хорошей стратегией для получения свиней, резистентных к ВРРСС. Предшествующие исследования также показали, что замена домена SRCR5 на домен CD163L 8 также блокирует инфекционную способность (Van Gorp et al. 2010b). Таким образом, нацеленная конструкция может быть сконструирована так, как показано на Фигуре 6, с заменой SRCR5 в CD163 на SRCR-домен CD163L.
[0122] После изготовления нацеленной конструкции, генетически модифицированная свинья, гетерозиготная по инактивации CD163, причем инактивация аллеля CD163 приводит к белку CD163, неспособному связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС), может быть получена по способам, которые в общих чертах аналогичны описанным в Примере 1. Вначале нацеленный вектор вводят в донорскую клетку, в которой он может рекомбинировать с эндогенным геном CD163. Затем отбираются донорские клетки с этой специфической модификацией, которые используются для переноса ядра соматической клетки с получением генетически модифицированного эмбриона. Затем эмбрион переносят суррогатной матери для вынашивания. После идентификации у трансгенной свиньи инактивированного аллеля CD163 посредством ПЦР или Саузерн-блоттинга, животных доращивают до половозрелости и используют для естественного размножения с передачей гена потомству.
[0123] ЛИТЕРАТУРА
[0124] Albina Е, Madec F, Cariolet R, Torrison J. 1994. Immune Response and Persistence of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Infected Pigs and Farm Units. Veterinary Record 134(22):567-573.
[0125] Allende R, Laegreid WW, Kutish GF, Galeota JA, Wills RW, Osorio FA. 2000. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: Description of persistence in individual pigs upon experimental infection. Journal of Virology 74(22): 10834-10837.
[0126] Andreyev VG, Wesley RD, Mengeling WL, Vorwald AC, Lager KM. 1997. Genetic Variation and Phylogenetic Relationships of 22 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (Prrsv) Field Strains Based on Sequence Analysis of Open Reading Frame 5. Archives of Virology 142(5):993-1001.
[0127] Benfield DA, Nelson E, Collins JE, Harris L, Goyal SM, Robison D, Christianson WT, Morrison RB, Gorcyca D, Chladek D. 1992. Characterization of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus (isolate ATCC VR-2332). Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 4:127-133.
[0128] Benfield DA, Nelson J, Rossow KD, Rowland RR, Lawson SR, Steffen M, Collins M. 1998. Pathogenesis and persistence of PRRS. Proceedings, Allen D. Leman Swine Conference: 169-171.
[0129] Christopherhennings J, Nelson EA, Hines RJ, Nelson JK, Swenson SL, Zimmerman JJ, Chase CCL, Yaeger MJ, Benfield DA. 1995. Persistence of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus in Serum and Semen of Adult Boars. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 7(4):456-464.
[0130] Christopherhennings J, Nelson EA, Nelson JK, Benfield DA. 1997. Effects of a Modified-Live Virus Vaccine against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome in Boars. American Journal of Veterinary Research 58(1):40-45.
[0131] Crocker PR, Gordon S. 1986. Properties and distribution of a lectin-like hemagglutinin differentially expressed by murine stromal tissue macrophages. J Exp Med 164(6):1862-1875.
[0132] Crocker PR, Vinson M, Kelm S, Drickamer K. 1999. Molecular analysis of sialoside binding to sialoadhesin by NMR and site-directed mutagenesis. Biochemical Journal 341 (Part 2):355-361.
[0133] Das PB, Dinh PX, Ansari IH, de Lima M, Osorio FA, Pattnaik AK. 2010. The minor envelope glycoproteins GP2a and GP4 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus interact with the receptor CD163. J Virol 84(4):1731-1740.
[0134] Dee SA, Molitor TW. 1998. Elimination of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Using a Test and Removal Process. Veterinary Record 143(17):474-476.
[0135] Delputte PL, Meerts P, Costers S, Nauwynck HJ. 2004. Effect of virus-specific antibodies on attachment, internalization and infection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in primary macrophages. Vet Immunol Immunopathol 102(3): 179-188.
[0136] Delputte PL, Nauwynck HJ. 2004. Porcine arterivirus infection of alveolar macrophages is mediated by sialic acid on the virus. Journal of Virology 78(15):8094-8101.
[0137] Delputte PL, Van Breedam W, Delrue I, Oetke C, Crocker PR, Nauwynck HJ. 2007. Porcine arterivirus attachment to the macrophage-specific receptor sialoadhesin is dependent on the sialic acid-binding activity of the N-terminal immunoglobulin domain of sialoadhesin. J Virol 81(17):9546-9550.
[0138] Im G-S, Lai L, Liu Z, Hao Y, Prather RS. 2004. In vitro development of preimplantation porcine nuclear transfer embryos cultured in different media and gas atmospheres.
Theriogenology 61:1125-1135.
[0139] Keffaber KK. 1989. Reproductive failure of unknown etiology. American Association of Swine Practitioners Newsletter 1:1-9.
[0140] Kristiansen M, Graversen JH, Jacobsen C, Sonne O, Hoffman HJ, Law SK, Moestrup SK. 2001. Identification of the haemoglobin scavenger receptor. Nature 409(6817):198-201.
[0141] Lager KM, Mengeling WL, Brockmeier SL. 1999. Evaluation of protective immunity in gilts inoculated with the NADC-8 isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and challenge-exposed with an antigenically distinct PRRSV isolate. American Journal of Veterinary Research 60(8):1022-1027.
[0142] Lai L, Kang JX, Li R, Wang J, Witt W, Yong HY, Hao Y, Wax D, Murphy CN, Rieke A, Samuel M, Linville ML, Korte SW, Evans R, Starzl ТЕ, Prather RS, Dai Y. 2006. Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids. Nature Biotechnology 24:435-437.
[0143] Lai LX, Kolber-Simonds D, Park KW, Cheong HT, Greenstein JL, Im GS, Samuel M, Bonk A, Rieke A, Day BN, Murphy CN, Carter DB, Hawley RJ, Prather RS. 2002. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science 295(5557):1089-1092.
[0144] Machaty Z, Prather RS. 2001. Complete activation of mammalian oocytes. US Patent Issued April 17: #6,211,429.
[0145] Machaty Z, Wang WH, Day BN, Prather RS. 1997. Complete Activation of Porcine Oocytes Induced by the Sulfhydryl Reagent, Thimerosal. Biology of Reproduction 57(5):1123-1127.
[0146] Mansour SL, Thomas ICR, Capecchi MR. 1988. Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non- selectable genes. Nature 336:348-352.
[0147] Meng XJ. 2000. Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implications for current vaccine efficacy and future vaccine development [Review], Veterinary Microbiology 74(4):309-329.
[0148] Meng XJ, Paul PS, Halbur PG, Morozov I. 1995. Sequence Comparison of Open Reading Frames 2 to 5 of Low and High Virulence United States Isolates of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus. Journal of General Virology 76(Part 12):3181-3188.
[0149] Mengeling WL, Vorwald AC, Lager KM, Clouser DF, Wesley RD. 1999. Identification and clinical assessment of suspected vaccine-related field strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. American Journal of Veterinary Research 60(3):334-340.
[0150] Molitor TW, Bautista EM, Choi CS. 1997. Immunity to Prrsv - Double-Edged Sword. Veterinary Microbiology 55(l-4):265-276.
[0151] Murtaugh MP, Elam MR, Kakach LT. 1995. Comparison of the Structural Protein Coding Sequences of the Vr-2332 and Lelystad Virus Strains of the Prrs Virus. Archives of Virology 140(8):1451-1460.
[0152] Nath D, van der Merwe PA, Kelm S, Bradfield P, Crocker PR. 1995. The amino-terminal immunoglobulin-like domain of sialoadhesin contains the sialic acid binding site. Comparison with CD22. J Biol Chem 270(44):26184-26191.
[0153] Nauwynck HJ, Duan X, Favoreel HW, Van Oostveldt P, Pensaert MB. 1999. Entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages via receptor-mediated endocytosis. Journal of General Virology 80(Part 2):297-305.
[0154] Nelsen CJ, Murtaugh MP, Faaberg KS. 1999. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: Divergent evolution on two continents. Journal of Virology 73(1):270-280.
[0155] Nielsen HS, Liu G, Nielsen J, Oleksiewicz MB, Botner A, Storgaard T, Faaberg KS. 2003. Generation of an infectious clone of VR-2332, a highly virulent North American type isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of Virology 77(6):3702- 3711.
[0156] Nielsen MJ, Madsen M, Moller HJ, Moestrup SK. 2006. The macrophage scavenger receptor CD163: endocytic properties of cytoplasmic tail variants. J Leukoc Biol 79(4):837-845.
[0157] Oetke C, Vinson MC, Jones C, Crocker PR. 2006. Sialoadhesin-deficient mice exhibit subtle changes in B- and T-cell populations and reduced immunoglobulin M levels. Mol Cell Biol 26(4):1549-1557.
[0158] Plagemann PGW. 1996. Lactate dehydrogenase-elevating virus and related viruses. In Fields Virology, 3rd Ed, Fields, В et al., ed: 1105-1120.
[0159] Ritter M, Buechler C, Langmann T, Orso E, Klucken J, Schmitz G. 1999a. The scavenger receptor CD163: regulation, promoter structure and genomic organization. Pathobiology 67(5-6):257-261.
[0160] Ritter M, Buechler C, Langmann T, Schmitz G. 1999b. Genomic organization and chromosomal localization of the human CD163 (M1 30) gene: a member of the scavenger receptor cysteine-rich superfamily. Biochem Biophys Res Commun 260(2):466-474.
[0161] Ropp SL, Wees СЕМ, Fang Y, Nelson EA, Rossow KD, Bien M, Arndt B, Preszler S, Steen P, Christopher-Hennings J, Collins JE, Benfield DA, Faaberg KS. 2004. Characterization of emerging European-like porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the United States. Journal of Virology 78(7):3684-3703.
[0162] Rowland RR, Steffen M, Ackerman T, Benfield DA. 1999. The evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: quasispecies and emergence of a virus subpopulation during infection of pigs with VR-2332. Virology 259:262-266.
[0163] Sanchez-Torres C, Gomez-Puertas P, Gomez-del-Moral M, Alonso F, Escribano JM, Ezquerra A, Dominguez J. 2003. Expression of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever infection. Arch Virol 148(12):2307-2323.
[0164] Snijder EJ, Meulenberg JJM. 1998. THE MOLECULAR BIOLOGY OF ARTERIVIRUSES [Review], Journal of General Virology 79(Part 5):961-979.
[0165] Suarez P, Diazguerra M, Prieto C, Esteban M, Castro JM, Nieto A, Ortin J. 1996. Open Reading Frame 5 of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus as a Cause of Virus-Induced Apoptosis. Journal of Virology 70(5):2876-2882.
[0166] Sur JH, Cooper VL, Galeota JA, Hesse RA, Doster AR, Osorio FA. 1996. In Vivo Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Rna by in Situ Hybridization at Different Times Postinfection. Journal of Clinical Microbiology 34(9):2280-2286.
[0167] Sur JH, Doster AR, Christian JS, Galeota JA, Wills RW, Zimmerman JJ, Osorio FA. 1997. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Replicates in Testicular Germ Cells, Alters Spermatogenesis, and Induces Germ Cell Death by Apoptosis. Journal of Virology 71(12):9170-9179.
[0168] Van Breedam W, Delputte PL, Van Gorp H, Misinzo G, Vanderheijden N, Duan X, Nauwynck HJ. 2010a. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus entry into the porcine macrophage. J Gen Virol 91(Pt 7):1659-1667.
[0169] Van Breedam W, Van Gorp H, Zhang JQ, Crocker PR, Delputte PL, Nauwynck HJ. 2010b. The M/GP(5) glycoprotein complex of porcine reproductive and respiratory syndrome virus binds the sialoadhesin receptor in a sialic acid-dependent manner. PLoS Pathog 6(1):e1000730.
[0170] van den Hoff MJ, Moorman AF, Lamers WH. 1992. Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival. Nucleic Acids Res 20(11):2902.
[0171] Van Gorp H, Delputte PL, Nauwynck HJ. 2010a. Scavenger receptor CD163, a Jack-of-all-trades and potential target for cell-directed therapy. Mol Immunol 47(7-8):1650-1660.
[0172] Van Gorp H, Van Breedam W, Delputte PL, Nauwynck HJ. 2008. Sialoadhesin and CD163 join forces during entry of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Gen Virol 89(Pt 12):2943-2953.
[0173] Van Gorp H, Van Breedam W, Van Doorsselaere J, Delputte PL, Nauwynck HJ. 2010b. Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Virol 84(6):3101-3105.
[0174] Vanderheijden N, Delputte PL, Favoreel HW, Vandekerckhove J, Van Damme J, van Woensel PA, Nauwynck HJ. 2003. Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages. Journal of Virology 77(15):8207-8215.
[0175] Vinson M, Vandermerwe PA, Kelm S, May A, Jones EY, Crocker PR. 1996. Characterization of the Sialic Acid-Binding Site in Sialoadhesin by Site-Directed Mutagenesis. Journal of Biological Chemistry 271(16):9267-9272.
[0176] Welch SKW, Calvert JG. 2010. A brief review of CD163 and its role in PRRSV infection. Virus Research 154:98-103.
[0177] Wensvoort G, Terpstra C, Pol JMA, ter Laak EA, Bloemrad M, de Kluyer EP, Kragten C, van Buiten L, den Besten A, Wagenaar F, Broekhuijsen JM, Moonen PLJM, Zetstra T, de Boer EA, Tibben HJ, de Jong MF, van't Veld P, Groenland GJR, van Gennep JA, Voets MTH, Verheijden JHM, Braamskamp J. 1991. Mystery swine disease in The Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Veterinary Quarterly 13:121-130.
[0178] Wills RW, Zimmerman JJ, Yoon KJ, McGinley MJ, Hill HT, Piatt KB, Christopherhennings J, Nelson EA. 1997. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus - a Persistent Infection. Veterinary Microbiology 55(1-4):231-240.
[0179] Wissink EHJ, van Wijk HAR, Pol JMA, Godeke GJ, van Rijn PA, Rottier PJM, Meulenberg JJM. 2003. Identification of porcine alveolar macrophage glycoproteins involved in infection of porcine respiratory and reproductive syndrome virus. Archives of Virology 148(1):177-187.
[0180] Yoon IL, Joo HS, Christianson WE, Morrison RB, Dial GD. 1993. Persistent and contact infection in nursery pigs experimentally infected with PRRS virus. Swine Health and Production 1:5-8.
[0181] При введении элементов настоящего изобретения или его предпочтительного(ых) воплощения(й), существительные в единственном числе и слово «упомянутый» обозначают, что подразумеваются один или больше элементов. Термины «содержащий», «включающий» и «имеющий» имеют включающий характер и подразумевается, что могут быть дополнительные элементы, отличные от перечисленных элементов.
[0182] В свете сказанного выше, будет понятно, что достигнут ряд целей изобретения и иные заслуживающие внимания результаты.
[0183] Поскольку в указанные выше продукты и способы могут быть внесены различные изменения без отступления от охвата изобретения, подразумевается, что все сведения в описании выше и в сопроводительных чертежах должны интерпретироваться как демонстративные, а не ограничительные.
Соответствие Исправленных Пунктов Пунктам в РСТ-заявке
Claims (40)
1. Генетически модифицированная свинья, содержащая инактивирующую мутацию в обоих аллелях гена CD163, где указанная свинья является резистентной к инфекции вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
2. Генетически модифицированная свинья по п. 1, где указанная инактивирующая мутация в аллеле гена CD163 приводит к получению белка CD163, который не может связывать и/или обнажать ВРРСС.
3. Генетически модифицированная свинья по п. 1, где указанные мутации включают инсерции, частичные делеции, полные делеции, мутации со сдвигом рамки считывания, бессмысленные мутации, миссенс-мутации, точечные мутации или их комбинацию.
4. Генетически модифицированная свинья по п. 1, где указанные мутации включают частичные делеции, полные делеции или их комбинацию.
5. Генетически модифицированная свинья по п. 1, где указанная мутация изменяет экспрессию или активность CD163.
6. Генетически модифицированная свинья по п. 1 или 2, где аллель CD163 был инактивирован путем замены экзона 7 на богатый цистеином домен 8 фагоцитарного рецептора (SRCR) из CD163L.
7. Генетически модифицированная свинья по любому из пп. 1-5, где указанная свинья дополнительно содержит инактивирующую мутацию, по меньшей мере, в одном аллеле гена SlGLECl.
8. Генетически модифицированная свинья по любому из пп. 1-5, где указанная свинья дополнительно содержит инактивирующую мутацию в обоих аллелях гена SIGLEC1.
9. Способ получения генетически модифицированной свиньи, содержащей инактивирующие мутации в обоих аллелях гена CD163, где указанная свинья является резистентной к инфекции ВРРСС, где способ включает:
энуклеацию ооцита свиньи;
слияние ооцита с фибробластной клеткой донорской свиньи, где геном фибробластной клетки содержит по меньшей мере, один инактивированный аллель CD163;
активацию ооцита для получения эмбриона;
перенос эмбриона в репродуктивный тракт суррогатной свиньи, у которой начался эструс, но не завершилась овуляция; и при этом беременность и роды в срок дают генетически модифицированную свинью, геном которой содержит, по меньшей мере, один инактивированный аллель CD163;
спаривание самки генетически модифицированной свиньи, геном которой содержит, по меньшей мере, один инактивированный аллель CD163, с самцом генетически модифицированной свиньи, геном которого содержит, по меньшей мере, один инактивированный аллель CD163, для получения F1-потомства;
скрининг F1-потомства для идентификации генетически модифицированной свиньи, у которой оба аллеля гена CD163 были инактивированы.
10. Способ по п. 9, где указанные мутации включают инсерции, частичные делеции, полные делеции, мутации со сдвигом рамки считывания, бессмысленные мутации, миссенс-мутации, точечные мутации или их комбинацию.
11. Способ по п. 9, где указанные мутации включают частичные делеции, полные делеции или их комбинацию.
12. Способ по п. 9, где указанная мутация изменяет экспрессию или активность CD163.
13. Способ по п. 9, где указанные аллели были инактивированы посредством использования рекомбинационной системы Cre-lox.
14. Способ по п. 9, где аллель CD163 инактивирован путем замены экзона 7 на богатый цистеином домен 8 фагоцитарного рецептора (SRCR) из CD163L.
15. Способ по любому из пп. 9-14, где энуклеацию выполняют в микроманипуляционной среде при помощи микропипетки.
16. Способ по любому из пп. 9-14, где слияние выполняют в среде для слияния.
17. Способ по любому из пп. 9-14, где активация ооцита включает инкубирование ооцита в присутствии тимеросала.
18. Способ по любому из пп. 9-14, где перенос включает перенос эмбриона в фаллопиеву трубу через яичниковые бахромки суррогатной матери.
19. Способ получения генетически модифицированной свиньи, которая является резистентной к инфекции ВРРСС, у которой оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы, где способ включает:
спаривание самки генетически модифицированной свиньи, содержащей инактивирующую мутацию, по меньшей мере, в одном аллеле гена SIGLEC1, с самцом генетически модифицированной свиньи, содержащим инактивирующую мутацию, по меньшей мере, в одном аллеле гена CD163, или спаривание самца генетически модифицированной свиньи, содержащего инактивирующую мутацию, по меньшей мере, в одном аллеле гена SIGLEC1, с самкой генетически модифицированной свиньи, содержащей инактивирующую мутацию, по меньшей мере, в одном аллеле гена CD163, для получения F1-потомства;
скрининг F1-потомства для идентификации генетически модифицированной свиньи, у которой, по меньшей мере, один аллель гена SIGLEC1 инактивирован и, по меньшей мере, один аллель гена CD163 инактивирован;
спаривание генетически модифицированных свиней, у которых, по меньшей мере, один аллель гена SIGLEC1 инактивирован и, по меньшей мере, один аллель гена CD163 инактивирован, друг с другом для получения F2-потомства; и
скрининг F2-потомства для идентификации генетически модифицированной свиньи, у которой оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.
20. Способ получения генетически модифицированной свиньи, которая является резистентной к инфекции ВРРСС, у которой оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы, где способ включает:
спаривание самки генетически модифицированной свиньи, содержащей инактивирующие мутации в обоих аллелях гена SIGLEC1, с самцом генетически модифицированной свиньи, содержащим инактивирующие мутации в обоих аллелях гена CD 163, или спаривание самца генетически модифицированной свиньи, содержащего инактивирующие мутации в обоих аллелях гена SIGLEC1, с самкой генетически модифицированной свиньи, содержащей инактивирующие мутации в обоих аллелях гена
CD163, для получения F1-потомства;
спаривание F1-потомства для получения F2-потомства; и
скрининг F2-потомства для идентификации генетически модифицированной свиньи, у которой оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.
21. Способ получения генетически модифицированной свиньи, которая является резистентной к инфекции ВРРСС, у которой оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы, где способ включает:
спаривание генетически модифицированной свиньи, у которой инактивированы, по меньшей мере, один аллель гена SIGLEC1 и, по меньшей мере, один аллель гена CD163, с другой генетически модифицированной свиньей, у которой инактивированы, по меньшей мере, один аллель гена SIGLEC1 и, по меньшей мере, один аллель гена CD163, с получением F1-потомства; и
скрининг F1-потомства для идентификации генетически модифицированной свиньи, у которой оба аллеля гена SIGLEC1 и оба аллеля гена CD163 инактивированы.
22. Способ по любому из пп. 19-21, отличающийся тем, что при скрининге используются полимеразная цепная реакция (ПЦР) или Саузерн-блот.
23. Способ по любому из пп. 9-14 и 19-21, где указанная свинья является резистентной к инфекции вирусом репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
24. Способ по любому из пп. 9-14 и 12-21, где указанная инактивирующая мутация в аллеле гена CD163 приводит к получению белка CD163, который не может связывать и/или обнажать вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (ВРРСС).
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161519076P | 2011-05-16 | 2011-05-16 | |
US61/519,076 | 2011-05-16 | ||
PCT/US2012/038193 WO2012158828A1 (en) | 2011-05-16 | 2012-05-16 | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus resistant animals |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013155677A RU2013155677A (ru) | 2015-06-27 |
RU2644673C2 true RU2644673C2 (ru) | 2018-02-13 |
Family
ID=47177326
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013155677A RU2644673C2 (ru) | 2011-05-16 | 2012-05-16 | Животные, устойчивые к вирусу репродуктивно-респираторного синдрома свиней |
Country Status (21)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US9820475B2 (ru) |
EP (2) | EP2709445B1 (ru) |
JP (5) | JP2014519323A (ru) |
KR (5) | KR102428306B1 (ru) |
CN (3) | CN111593025A (ru) |
AU (5) | AU2012255744A1 (ru) |
BR (1) | BR112013029498A8 (ru) |
CA (2) | CA3184311A1 (ru) |
CY (1) | CY1120890T1 (ru) |
DK (1) | DK2709445T3 (ru) |
ES (1) | ES2691618T3 (ru) |
HK (1) | HK1215282A1 (ru) |
HR (1) | HRP20181729T1 (ru) |
HU (1) | HUE039793T2 (ru) |
LT (1) | LT2709445T (ru) |
MX (1) | MX357421B (ru) |
PL (1) | PL2709445T3 (ru) |
PT (1) | PT2709445T (ru) |
RU (1) | RU2644673C2 (ru) |
SI (1) | SI2709445T1 (ru) |
WO (1) | WO2012158828A1 (ru) |
Families Citing this family (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HUE039793T2 (hu) | 2011-05-16 | 2019-02-28 | Univ Missouri | Sertés reproduktív és légzési szindróma vírus rezisztens állatok |
GB201313235D0 (en) * | 2013-07-24 | 2013-09-04 | Univ Edinburgh | Antiviral Compositions Methods and Animals |
US20150275231A1 (en) * | 2014-03-31 | 2015-10-01 | Mice With Horns, Llc | Method of Preventing or Reducing Virus Transmission in Animals |
CN104593422A (zh) * | 2015-01-08 | 2015-05-06 | 中国农业大学 | 一种抗蓝耳病克隆猪的制备方法 |
US11246299B2 (en) * | 2015-03-04 | 2022-02-15 | Pormedtec Co., Ltd. | Disease model pig exhibiting stable phenotype, and production method thereof |
US10827730B2 (en) * | 2015-08-06 | 2020-11-10 | The Curators Of The University Of Missouri | Pathogen-resistant animals having modified CD163 genes |
CA2993435A1 (en) * | 2015-08-06 | 2017-02-09 | The Curators Of The University Of Missouri | Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes |
GB201617559D0 (en) | 2016-10-17 | 2016-11-30 | University Court Of The University Of Edinburgh The | Swine comprising modified cd163 and associated methods |
CN107937345B (zh) * | 2017-11-16 | 2019-01-29 | 山东蓝思种业股份有限公司 | 一种制备同时敲除cd163基因和cd13基因的猪成纤维细胞的方法 |
US11160260B2 (en) * | 2018-04-17 | 2021-11-02 | The Curators Of The University Of Missouri | Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
BR112020021066A2 (pt) * | 2018-04-17 | 2021-02-17 | The Curators Of The University Of Missouri | método para proteger um feto suíno da infecção com o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (prrsv) |
WO2019210175A1 (en) * | 2018-04-27 | 2019-10-31 | The Curators Of The University Of Missouri | Pathogen-resistant animals having modified aminopeptidase n (anpep) genes |
CN109197780A (zh) * | 2018-11-26 | 2019-01-15 | 湖北天牧畜禽有限公司 | 一种减少仔猪生病的养殖方法 |
EP4009780A4 (en) * | 2019-08-06 | 2023-08-30 | Nzeno Limited | DONOR PIGS FOR XENOTRANSPLANTATION |
KR20230006827A (ko) | 2020-05-05 | 2023-01-11 | 제너스 피엘씨 | Cd163의 표적 불활화를 통한 돼지 종의 건강 개선 방법 |
CA3207080A1 (en) * | 2021-01-05 | 2022-07-14 | Etsuko Miyagi | Biomarker for determining fertility, and determining method using same |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110016543A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in inflammation |
US20110016546A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Porcine genome editing with zinc finger nucleases |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995016670A1 (en) | 1993-12-16 | 1995-06-22 | The Procter & Gamble Company | Process for making sulfonated fatty acid alkyl ester surfactant |
GB9417831D0 (en) | 1994-09-05 | 1994-10-26 | Biotech & Biolog Scien Res | Biological manipulation |
DE69630221T2 (de) | 1995-06-22 | 2004-07-15 | Minnesota Mining And Mfg. Co., Saint Paul | Stabile alkoholisch-wässrige zusammensetzung |
US5683993A (en) | 1995-06-22 | 1997-11-04 | Ciba Vision Corporation | Compositions and methods for stabilizing polymers |
GB9517780D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
GB9517779D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
JPH09298981A (ja) * | 1996-05-16 | 1997-11-25 | Y S New Technol Kenkyusho:Kk | トランスジェニックブタ |
US5945577A (en) | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
US5995577A (en) | 1997-02-10 | 1999-11-30 | General Electric Company | Optimized steam vent locations for a nuclear fuel bundle |
AU7979098A (en) | 1997-06-18 | 1999-01-04 | Curators Of The University Of Missouri, The | Complete activation of mammalian oocytes |
US6740490B2 (en) | 2001-01-29 | 2004-05-25 | Kansas State University Research Foundation | Identification and applications of porcine reproductive and respiratory syndrome virus host susceptibility factor(s) for improved swine breeding |
JP2005514016A (ja) | 2001-12-21 | 2005-05-19 | ザ キュレイターズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミズーリ | ノックアウトブタ及びその製造方法 |
US8106251B2 (en) * | 2002-08-21 | 2012-01-31 | Revivicor, Inc. | Tissue products derived from porcine animals lacking any expression of functional alpha 1,3 galactosyltransferase |
US7420099B2 (en) | 2004-04-22 | 2008-09-02 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Transgenic animals and uses thereof |
WO2008093166A2 (en) * | 2006-05-11 | 2008-08-07 | Ghent University | Sialoadhesin-related compositions and methods |
WO2008109237A2 (en) | 2007-02-13 | 2008-09-12 | Washington State University Research Foundation | Macrophage cell-lines for propagation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus |
EP2132321A1 (en) | 2007-03-07 | 2009-12-16 | Aarhus Universitet | Pig model for psoriasis |
US8912386B2 (en) | 2007-03-28 | 2014-12-16 | University Of Iowa Research Foundation | Transgenic pig model of cystic fibrosis |
WO2009024239A2 (en) * | 2007-07-27 | 2009-02-26 | Ghent University | Permissive cells and uses thereof |
KR20120050485A (ko) | 2009-08-14 | 2012-05-18 | 레비비코르 인코포레이션 | 당뇨병 치료를 위한 복수 형질전환 돼지 |
HUE039793T2 (hu) * | 2011-05-16 | 2019-02-28 | Univ Missouri | Sertés reproduktív és légzési szindróma vírus rezisztens állatok |
US10827730B2 (en) | 2015-08-06 | 2020-11-10 | The Curators Of The University Of Missouri | Pathogen-resistant animals having modified CD163 genes |
-
2012
- 2012-05-16 HU HUE12785983A patent/HUE039793T2/hu unknown
- 2012-05-16 CN CN202010588447.0A patent/CN111593025A/zh active Pending
- 2012-05-16 KR KR1020207015089A patent/KR102428306B1/ko active IP Right Grant
- 2012-05-16 DK DK12785983.3T patent/DK2709445T3/en active
- 2012-05-16 PT PT12785983T patent/PT2709445T/pt unknown
- 2012-05-16 KR KR1020237029748A patent/KR102627319B1/ko active IP Right Grant
- 2012-05-16 AU AU2012255744A patent/AU2012255744A1/en not_active Abandoned
- 2012-05-16 KR KR1020227026347A patent/KR102574897B1/ko active IP Right Grant
- 2012-05-16 BR BR112013029498A patent/BR112013029498A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2012-05-16 EP EP12785983.3A patent/EP2709445B1/en active Active
- 2012-05-16 WO PCT/US2012/038193 patent/WO2012158828A1/en active Application Filing
- 2012-05-16 SI SI201231423T patent/SI2709445T1/sl unknown
- 2012-05-16 PL PL12785983T patent/PL2709445T3/pl unknown
- 2012-05-16 CA CA3184311A patent/CA3184311A1/en active Pending
- 2012-05-16 CA CA2836288A patent/CA2836288A1/en active Pending
- 2012-05-16 CN CN201510463471.0A patent/CN105112450A/zh active Pending
- 2012-05-16 ES ES12785983.3T patent/ES2691618T3/es active Active
- 2012-05-16 KR KR1020247001725A patent/KR20240014587A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-05-16 JP JP2014511498A patent/JP2014519323A/ja active Pending
- 2012-05-16 KR KR1020137033359A patent/KR20140034229A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-05-16 LT LTEP12785983.3T patent/LT2709445T/lt unknown
- 2012-05-16 MX MX2013013427A patent/MX357421B/es active IP Right Grant
- 2012-05-16 EP EP18189039.3A patent/EP3420813A1/en active Pending
- 2012-05-16 CN CN201280023487.4A patent/CN103687482A/zh active Pending
- 2012-05-16 RU RU2013155677A patent/RU2644673C2/ru active
- 2012-05-16 US US14/117,943 patent/US9820475B2/en active Active
-
2016
- 2016-03-21 HK HK16103259.2A patent/HK1215282A1/zh unknown
-
2017
- 2017-04-19 AU AU2017202540A patent/AU2017202540B2/en active Active
- 2017-05-09 JP JP2017092768A patent/JP6970525B2/ja active Active
- 2017-10-13 US US15/783,417 patent/US10080353B2/en active Active
-
2018
- 2018-08-24 US US16/111,631 patent/US10405526B2/en active Active
- 2018-10-22 HR HRP20181729TT patent/HRP20181729T1/hr unknown
- 2018-11-02 AU AU2018256670A patent/AU2018256670B2/en active Active
- 2018-11-07 CY CY181101169T patent/CY1120890T1/el unknown
-
2019
- 2019-07-04 JP JP2019125475A patent/JP2019193660A/ja not_active Withdrawn
- 2019-08-30 US US16/556,878 patent/US11019809B2/en active Active
-
2020
- 2020-12-24 AU AU2020294305A patent/AU2020294305A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-04-28 US US17/242,963 patent/US20210259219A1/en active Pending
-
2022
- 2022-03-16 JP JP2022041628A patent/JP2022081637A/ja not_active Withdrawn
-
2023
- 2023-08-22 AU AU2023219858A patent/AU2023219858A1/en active Pending
-
2024
- 2024-03-06 JP JP2024033472A patent/JP2024069309A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20110016543A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in inflammation |
US20110016546A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Porcine genome editing with zinc finger nucleases |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
VAN GORP H. et al., Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, J. Virol., 2010, 84(6), pp.3101-3105. * |
VAN GORP H. et al., Sialoadhesin and CD163 join forces during entry of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, J. Gen. Virol., 2008, 89, pp.2943-2953. * |
VANDERHEIJDEN N. et al., Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages, J.Virol., 2003, Aug, 77(15), pp.8207-8215. * |
VANDERHEIJDEN N. et al., Involvement of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages, J.Virol., 2003, Aug, 77(15), pp.8207-8215. VAN GORP H. et al., Sialoadhesin and CD163 join forces during entry of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, J. Gen. Virol., 2008, 89, pp.2943-2953. VAN GORP H. et al., Identification of the CD163 protein domains involved in infection of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus, J. Virol., 2010, 84(6), pp.3101-3105. РЫБЧИН В.Н., Основы генетической инженерии, Санкт-Петербург, Издательство СПбГТУ, 2002, с.411-418. * |
РЫБЧИН В.Н., Основы генетической инженерии, Санкт-Петербург, Издательство СПбГТУ, 2002, с.411-418. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11019809B2 (en) | Porcine reproductive and respiratory syndrome virus resistant animals | |
US20240122164A1 (en) | Pathogen-resistant animals having modified cd163 genes |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HC9A | Changing information about inventors |