BR112020021066A2

BR112020021066A2 - método para proteger um feto suíno da infecção com o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (prrsv)

Info

Publication number: BR112020021066A2
Application number: BR112020021066-8A
Authority: BR
Inventors: Randall S. Prather; Kevin D. Wells; Kristin M. Whitworth
Original assignee: The Curators Of The University Of Missouri
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2021-02-17
Also published as: JP2021526353A; PH12020551631A1; MX2020010925A; JP2023098940A; WO2019203807A1; AU2018419649A1; CA3096022A1; KR20210005074A

Abstract

''MÉTODO PARA PROTEGER UM FETO SUÍNO DA INFECÇÃO COM O VÍRUS DA SÍNDROME RESPIRATÓRIA E REPRODUTIVA SUÍNA(PRRSV)''. Métodos para proteger fetos suínos da infecção com o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV). Os métodos compreendem a reprodução de um animal suíno fêmea com um animal suíno macho. O animal suíno fêmea compreende sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163, em que as sequências cromossômicas modificadas reduzem a suscetibilidade do animal suíno fêmea à infecção por PRRSV, em comparação com a suscetibilidade à infecção por PRRSV de um animal suíno fêmea que não compreende quaisquer sequências cromossômicas modificadas nos alelos de seu gene CD163. O animal suíno macho compreende pelo menos um alelo CD163 de tipo selvagem.

Description

“MÉTODO PARA PROTEGER UM FETO SUÍNO DA INFECÇÃO COM O VÍRUS DA SÍNDROME RESPIRATÓRIA E REPRODUTIVA SUÍNA (PRRSV)” REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE

[001] A cópia oficial da listagem de sequências é apresentada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências formatada em ASCII com um arquivo denominado “SEQ LISTING 18054WO”, criado em 27 de março de 2018 e possuindo um tamanho de 175,5 kilobytes e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento formatado em ASCII é parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a métodos para proteger fetos suínos da infecção com o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS) é a doença mais importante economicamente dos suínos na América do Norte, Europa e Ásia, que custa aos produtores norte-americanos aproximadamente $600 milhões anualmente (Holtkamp et al., 2013). Síndromes de doenças clínicas causadas por infecção com vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) foram relatadas pela primeira vez nos Estados Unidos em 1987 (Keffaber, 1989) e mais tarde na Europa em 1990 (Wensvoort et al., 1991). A infecção com PRRSV resulta em doença respiratória, incluindo tosse e febre, falha reprodutiva durante o final da gestação e desempenho de crescimento reduzido. O vírus também participa de uma variedade de interações da síndrome da doença polimicrobiana, enquanto mantém uma infecção subclínica permanente (Rowland et al., 2012). As perdas são o resultado de doenças respiratórias em porcos jovens, baixo desempenho de crescimento, falha reprodutiva e infecção in utero (Keffaber, 1989).

[004] A forma reprodutiva da doença é responsável por cerca de 45% das perdas, resultado de abortos, fetos mortos e doenças respiratórias em recém-nascidos. Em sua forma mais grave, a PRRS reprodutiva pode resultar em 90% de mortalidade de fetos/ neonatos, juntamente com aumento da mortalidade das mães. A forma reprodutiva de PRRS ocorre após a infecção de suínos ou porcas prenhes por volta dos 90 dias do período de gestação de 114 dias (Christianson et al., 1993; Rowland, 2010). Após uma fase inicial de replicação nos macrófagos maternos, o vírus atravessa a placenta e começa a infectar os fetos de forma produtiva. O vírus infecta inicialmente apenas um pequeno número de fetos, seguido pela transmissão horizontal do vírus de feto para feto (Wilkinson et al., 2016). O mecanismo exato de como o vírus atravessa a placenta permanece desconhecido, mas pode ser semelhante ao macrófago “Cavalo de Tróia” infectado, previamente descrito para o vírus que eleva a lactato desidrogenase (LDV) (Cafruny, 1996). Ao contrário dos macrófagos alveolares em animais adultos, o principal local de replicação do PRRSV no feto é o timo (Rowland, 2003). Uma vez que o feto de porco se torna imunocompetente por volta dos 70 dias de gestação, a infecção por PRRSV ocorre em um ambiente imune fetal contendo células B e T funcionais (Rowland, 2003; Rowland, 2010).

[005] Porcos que sobrevivem à infecção in útero tornam-se fontes contínuas de vírus nas fases de produção a jusante, resultando em rebanhos infectados endemicamente (Rowland, et al., 2003). A forma mais grave da doença reprodutiva está associada a um grupo de isolados altamente virulentos referidos como PRRSV atípico (Halbur et al., 1997; Mengeling et al., 1998). Curiosamente, muitos dos isolados de PRRSV atípicos emergiram de fazendas vacinadas com PRRS (Key et al., 2001). Em 2006, um vírus atípico, denominado PRRSV de alta patogenicidade (HP-

PRRSV), apareceu na China e continua a dizimar as populações de suínos naquele país (Tian et al., 2007). Uma vez que o criadouro comercial padrão contém cerca de 5.000 porcas, um surto de PRRS reprodutivo de alta mortalidade pode ter um impacto devastador. Para garantir a sustentabilidade da produção de suínos e a segurança alimentar, soluções para o controle de PRRS reprodutivos continuam sendo uma prioridade. As vacinas têm sido incapazes de controlar a doença, em grande parte devido à diversidade genética dentro das proteínas estruturais do vírus (Shi et al., 2010). Na prática, medidas intensivas de biossegurança fornecem o único meio de proteger o rebanho reprodutivo.

[006] O vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) pertence à família Arterividae juntamente com o vírus que eleva a lactato desidrogenase murino, o vírus da febre hemorrágica símia e o vírus da arterite equina. Estruturalmente, os arterivírus se assemelham aos togavírus, mas semelhantes aos coronavírus, replicam-se por meio de um conjunto agrupado 3’-co-terminal de mRNAs subgenômicos, que possuem um líder comum e uma cauda poli-A. Os arterivírus compartilham propriedades importantes relacionadas à patogênese viral, incluindo um tropismo por macrófagos e a capacidade de causar doença grave e infecção persistente (Plagemann, 1996). As comparações moleculares entre os vírus norte- americanos e europeus colocam todos os isolados de PRRSV em um dos dois genótipos, Tipo 2 ou Tipo 1, respectivamente. Embora os dois genótipos possuam apenas cerca de 70% de identidade no nível de nucleotídeo (Nelsen et al., 1999), ambos compartilham um tropismo por células CD163-positivas, estabelecem infecções de longo prazo e produzem sinais clínicos semelhantes.

[007] A CD163 é uma proteína de membrana tipo 1 de 130 kDa composta por nove domínios de receptor scavenger rico em cisteína (SRCR)

e dois domínios espaçadores juntamente com um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática curta (Fabriek et al., 2005). CD163 suína contém 17 éxons que codificam para uma sequência sinal de peptídeo seguido por nove domínios de SRCR, dois domínios ligantes (também referidos como domínios de prolina serina treonina (PST), localizados após SRCR 6 e SRCR 9), e um domínio citoplasmático seguido por uma cauda citoplasmática curta.

A expressão de superfície de CD163 é restrita a células da linhagem monócito-macrófago. Além de funcionar como um receptor de vírus, a CD163 exibe várias funções importantes relacionadas à manutenção da homeostase normal. Por exemplo, após infecção ou dano ao tecido, a CD163 funciona como uma molécula necrófaga (scavenger), removendo complexos haptoglobina-hemoglobina do sangue (Kristiansen et al., 2001). Os produtos de degradação de heme resultantes regulam a resposta inflamatória associada (Fabriek et al., 2005). A eliminação de HbHp é uma função importante da CD163 e localiza-se no SRCR 3 (Madsen et al., 2004). Os metabólitos liberados por macrófagos após a degradação da HbHp incluem bilirrubina, CO e ferro livre. Uma função importante da CD163 é a prevenção da toxicidade oxidativa que resulta da hemoglobina livre (Kristiansen et al., 2001; Soares et al., 2009).

[008] Outras funções importantes de C163 incluem a adesão de eritroblastos (SRCR2), sendo um receptor TWEAK (indutor de apoptose fraco relacionado a fator de necrose tumoral) (SRCR1-4 e 6-9), sendo um receptor bacteriano (SRCR5), e sendo um receptor do vírus suíno africano (Sanchez- Torres et al. 2003). A CD163 também tem um papel potencial como um modulador imunológico (discutido em Van Gorp et al. 2010).

[009] A CD163 foi descrita pela primeira vez como um receptor para PRRSV por Calvert et al. (2007). A transfecção de linhagens celulares não permissivas com cDNAs de CD163 de uma variedade de espécies,

incluindo símios, humanos, caninos e camundongos, pode tornar as células permissivas à infecção por PRRSV (Calvert et al., 2007). Além de CD163, uma segunda proteína receptora, CD169 (também conhecida como sialoadesina ou SIGLEC1), foi identificada como sendo um receptor PRRSV primário envolvido na formação da interação inicial com o heterodímero de matriz GP5 (M), a principal proteína na superfície do vírion (Delputte et al., 2002). Neste modelo, a interação subsequente entre a CD163 e o heterotrímero GP2, 3, 4 em um compartimento endossômico medeia o desencapsulamento e a liberação do genoma viral no citoplasma (Van Breedam et al., 2010, Allende et al., 1999). Um modelo anterior que descreve a infecção por PRRSV de macrófagos alveolares identificou o SIGLEC1 (CD169) como o receptor viral primário na superfície dos macrófagos; no entanto, trabalhos anteriores usando o SIGLEC1 -/- porcos não mostraram nenhuma diferença na replicação do vírus em comparação com porcos do tipo selvagem (Prather et al., 2013). Estes resultados apoiaram estudos anteriores in vitro que mostram que as linhagens celulares resistentes a PRRSV sem CD169 e CD163 de superfície suportaram a replicação do vírus após a transfecção com um plasmídeo CD163 (Welch et al., 2010).

[010] Muitas características da patogênese do PRRSV (especialmente no nível molecular) e da epizootiologia são mal compreendidas, dificultando, assim, os esforços de controle. Atualmente, os produtores frequentemente vacinam suínos contra PRRSV com cepas vivas atenuadas modificadas ou vacinas de vírus mortos, entretanto, as vacinas atuais geralmente não fornecem proteção satisfatória. Isso se deve tanto à variação da cepa quanto à estimulação inadequada do sistema imunológico.

Além das preocupações sobre a eficácia das vacinas PRRSV disponíveis, há fortes evidências de que a vacina viva modificada atualmente em uso pode persistir em porcos individuais e rebanhos suínos e acumular mutações

(Mengeling et al. 1999), como foi demonstrado com isolados de campo virulentos após infecção experimental de porcos (Rowland et al., 1999). Além disso, foi demonstrado que o vírus da vacina é eliminado no sêmen de varrões vacinados (Christopher-Hennings et al., 1997). Como alternativa à vacinação, alguns técnicos defendem uma estratégia de “teste e remoção” em rebanhos reprodutores (Dee et al., 1998). O uso bem-sucedido desta estratégia depende da remoção de todos os porcos que estão infectados de forma aguda ou persistente com PRRSV, seguida de controles rígidos para prevenir a reintrodução do vírus. A dificuldade e grande parte das despesas associadas a essa estratégia é que pouco se sabe sobre a patogênese da infecção persistente por PRRSV e, portanto, não existem técnicas confiáveis para identificar porcos infectados de forma persistente.

[011] Como pode ser visto, existe uma necessidade no estado da técnica para o desenvolvimento de estratégias para induzir resistência a PRRSV em animais. Existe também uma necessidade particular de técnicas para proteger os fetos da infecção por PRRSV enquanto no útero e para prevenir a transmissão de PRRSV da mãe para o feto.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[012] É fornecido um método para proteger um feto suíno da infecção com o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (prrsv). O método compreende reproduzir um animal suíno fêmea com um animal suíno macho. O animal suíno fêmea compreende sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163, em que as sequências cromossômicas modificadas reduzem a suscetibilidade do animal suíno fêmea à infecção por PRRSV, em comparação com a suscetibilidade à infecção por PRRSV de um animal suíno fêmea que não compreende quaisquer sequências cromossômicas modificadas nos alelos de seu gene CD163. O animal suíno macho compreende pelo menos um alelo CD163 de tipo selvagem.

[013] Outros objetos e características serão em parte evidentes e em parte apontados a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[014] Figura 1. Vetores de direcionamento e CRISPRs usados para modificar a CD163. O painel A representa os éxons 7, 8 e 9 de tipo selvagem do gene CD163 que foi direcionado para modificação usando CRISPRs. O painel B mostra o vetor de direcionamento projetado para substituir o éxon 7 de porco (domínio de porco SRCR5 de CD163) com DNA que codifica SRCR8 humano de CD163L. Este vetor de direcionamento foi usado em transfecções com seleção de drogas por G418. Os iniciadores de PCR para o ensaio de longo alcance, braço esquerdo e braço direito são marcados com setas para 1230, 3752, 8791, 7765 e 7775. O painel C representa um vetor de direcionamento idêntico ao mostrado no painel B, mas em que o cassete Neo foi removido. Este vetor de direcionamento foi usado para direcionar CD163 em células que já eram resistentes à neomicina. Os iniciadores usados em ensaios de pequenas deleções são ilustrados com setas e marcados com GCD163F e GCD163R. O painel D enfatiza os éxons direcionados pelos CRISPRs. A localização dos CRISPRs 10, 131, 256 e 282 é representada pelas setas voltadas para baixo no éxon 7. Os números CRISPR representam o número de pares de bases da junção íntron-éxon do íntron 6 e éxon 7.

[015] Figura 2. Vetor de direcionamento e CRISPRs usados para modificar CD1D. O painel A representa os éxons 3, 4, 5, 6 e 7 de tipo selvagem do gene CD1D que foi direcionado para modificação por CRISPRs. O painel B mostra o vetor de direcionamento projetado para substituir o éxon 3 com marcador selecionável Neo. Este vetor de direcionamento foi usado em combinação com CRISPRs para modificar CD1D. Os iniciadores de PCR para o ensaio de longo alcance, braço esquerdo e braço direito são marcados com setas para 3991, 4363, 7373 e 12806. O painel C representa os éxons direcionados por CRISPRs. Os locais dos CRISPRs 4800, 5350, 5620 e 5626 são representados pelas setas voltadas para baixo no éxon 3. Os iniciadores usados em ensaios de pequenas deleções são ilustrados com setas e marcados com GCD1DF e GCD1DR.

[016] Figura 3. Geração de porcos knockout CD163 e CD1D por CRISPR/Cas9 e SCNT. A) Deleção direcionada de CD163 em células somáticas após a transfecção com CRISPR/Cas9 e DNA doador. Um genótipo de tipo selvagem (WT) resulta em uma banda de 6545 pares de bases (pb). As faixas 1- 6 representam seis colônias diferentes de uma única transfecção com CRISPR 10 com Cas9 e DNA doador contendo Neo. As faixas 1, 4 e 5 mostram uma grande deleção homozigótica de 1500-2000 pb. A faixa 2 representa uma deleção homozigótica menor. As faixas 3 e 6 representam um alelo WT e uma pequena deleção ou modificação bialélica de ambos os alelos. As modificações exatas de cada colônia foram determinadas apenas por sequenciamento para colônias usadas para SCNT. A banda fraca WT em algumas das faixas pode representar contaminação cruzada de fibroblastos fetais de uma colônia WT vizinha. NTC = sem controle de molde. B) Deleção direcionada de CD1D em células somáticas após a transfecção com CRISPR/Cas9 e DNA doador. Um genótipo WT resulta em uma banda de 8729 pb. As faixas 1-4 representam colônias com uma deleção de 500-2000 pb de CD1D. A faixa 4 parece ser uma colônia WT. NTC = sem controle de molde. C) Imagem de porco knockout CD163 produzida por SCNT durante o estudo. Este leitão macho contém uma deleção homozigótica de 1506 pb de CD163. D) Imagem de porcos CD1D produzidos durante o estudo. Esses leitões contêm uma deleção de 1653 pb de CD1D. E) Genótipo de duas ninhadas SCNT contendo a deleção de 1506 pb de CD163. As faixas 1-3 (ninhada 63) e as faixas 1-4 (ninhada 64) representam o genótipo de cada leitão de cada ninhada. Porca indica a fêmea receptora dos embriões de SCNT, e WT representa um controle WT. NTC = sem controle de molde. F) Genótipo de duas ninhadas SCNT contendo a deleção de 1653 pb de CD1D. As faixas 1-7 (ninhada 158) e as faixas 1-4 (ninhada 159) representam o genótipo de cada leitão.

[017] Figura 4. Efeito do sistema de CRISPR/Cas9 em embriões suínos. A) Frequência de formação de blastocisto após injeção de diferentes concentrações do sistema de CRISPR/Cas9 em zigotos. A toxicidade do sistema de CRISPR/Cas9 foi mais baixa a 10 ng/μl. B) O sistema de CRISPR/Cas9 pode interromper com sucesso a expressão de eGFP em blastocistos quando introduzido em zigotos. Ampliação original X4. C) Tipos de mutações no eGFP geradas usando o sistema de CRISPR/Cas9: genótipo WT (SEQ ID NO: 16), #1 (SEQ ID NO: 17), #2 (SEQ ID NO: 18) e #3 (SEQ ID NO: 19).

[018] Figura 5. Efeito do sistema de CRISPR/Cas9 no direcionamento de CD163 em embriões suínos. A) Exemplos de mutações geradas em CD163 pelo sistema de CRISPR/Cas9: genótipo WT (SEQ ID NO: 20), #1-1 (SEQ ID NO: 21), #1-4 (SEQ ID NO: 22), e #2-2 (SEQ ID NO: 23).

Todos os embriões examinados por sequenciamento de DNA apresentaram mutação na CD163 (18/18). CRISPR 131 está destacado em negrito. B) Leitura de sequenciamento de uma deleção homozigótica causada pelo sistema de CRISPR/Cas9. A imagem representa # 1-4 do painel A carregando uma deleção de 2 pb de CD163.

[019] Figura 6. Efeito do sistema de CRISPR/Cas9 quando introduzido com dois tipos de CRISPRs. A) Amplificação por PCR de CD163 em blastocistos injetados com CRISPR/Cas9 como zigotos. As faixas 1, 3, 6 e 12 mostram a deleção projetada entre dois CRISPRs diferentes. B) Amplificação por PCR de CD1D em blastocistos injetados com CRISPR/Cas9 como zigotos. CD1D teve menor frequência de deleção, conforme determinado por eletroforese em gel, quando comparado à CD163 (3/23); as faixas 1, 8 e 15 mostram deleções óbvias em CD1D. C) O sistema de CRISPR/Cas9 direcionou com sucesso dois genes quando o sistema foi fornecido com dois CRISPRs direcionando CD163 e eGFP. As modificações de CD163 e eGFP são mostradas: CD163 WT (SEQ ID NO: 24), CD163 #1 (SEQ ID NO: 25), CD163 #2 (SEQ ID NO: 26), CD163 #3 (SEQ ID NO: 27), eGFP WT (SEQ ID NO: 28), eGFP #1-1 (SEQ ID NO: 29), eGFP #1-2 (SEQ ID NO: 30), eGFP #2 (SEQ ID NO: 31), e eGFP #3 (SEQ ID NO: 32).

[020] Figura 7. Porcos knockout CD163 gerados pelo sistema de CRISPR/Cas9 injetados em zigotos. A) amplificação por PCR de CD163 dos porcos knockout; um sinal claro de deleção foi detectado nas ninhadas 67-2 e 67-4. B) Imagem de porcos knockout CD163 com um portador. Todos os animais são saudáveis e não apresentam sinais de anormalidades. C) Genótipo de porcos knockout CD163. A sequência do tipo selvagem (WT) é mostrada como SEQ ID NO: 33. Dois animais (das ninhadas 67-1 (SEQ ID NO: 34) e 67-3 (SEQ ID NO: 37)) são portadores de uma deleção ou inserção homozigótica em CD163. Os outros dois animais (das ninhadas 67-2 e 67-4) são portadores de uma modificação bialélica de CD163: #67-2 A1 (SEQ ID NO: 35), #67-2 A2 (SEQ ID NO: 36), #67-4 A1 (SEQ ID NO: 38), e #67-4 a2 (SEQ ID NO: 39). A deleção foi causada pela introdução de dois CRISPRs diferentes com o sistema Cas9.

Nenhum animal da injeção do zigoto para CD163 apresentou um genótipo em mosaico.

[021] Figura 8. Porcos knockout CD1D gerados pelo sistema de CRISPR/Cas9 injetado em zigotos. A) amplificação por PCR de CD1D de porcos knockout; 166-1 mostra um genótipo em mosaico para CD1D. 166-2, 166-3 e 166-4 não mostram uma mudança no tamanho do amplicon, mas o sequenciamento do amplicon revelou modificações. WT FF = fibroblastos fetais de tipo selvagem. B) A amplificação por PCR do ensaio de longo alcance mostrou uma deleção clara de um alelo nos leitões 166-1 e 166-2. C) Imagem de porcos knockout CD1D com portador. D) Dados de sequência de porcos knockout de CD1D; WT (SEQ ID NO: 40), #166-1.1 (SEQ ID NO: 41), #166-1.2 (SEQ ID NO: 42), #166-2 (SEQ ID NO: 43), #166-3.1 (SEQ ID NO: 44), #166-3.2 (SEQ ID NO: 45) e #166-4 (SEQ ID NO: 46). O códon de iniciação atg no éxon 3 é mostrado em negrito e também em letras minúsculas.

[022] Figura 9. Sinais clínicos durante a infecção aguda por PRRSV. Resultados da avaliação diária para a presença de sinais respiratórios e febre para CD163 +/+ (n = 6) e CD163 -/- (n = 3).

[023] Figura 10. Histopatologia pulmonar durante infecção aguda por PRRSV. Fotomicrografias representativas de tecidos corados com H e E de porcos knockout e de tipo selvagem. O painel esquerdo mostra edema e infiltração de células mononucleares. O painel direito de um porco knockout mostra a arquitetura pulmonar de um pulmão normal.

[024] Figura 11. Viremia nos vários genótipos. Observe que os dados de leitão CD163 -/- ficam ao longo do eixo X.

[025] Figura 12. Produção de anticorpos em porcos alelos nulos, de tipo selvagem e não caracterizados.

[026] Figura 13. Expressão da superfície celular de CD163 em porcos individuais. As linhas que aparecem em direção à direita nos painéis não caracterizado A, não caracterizado B e CD163 +/+, representam o anticorpo CD163, enquanto as linhas que aparecem em direção aos lados esquerdos desses painéis são os controles sem anticorpo (fundo). Observe que nos animais CD163 -/-, a coloração de CD163 se sobrepõe ao controle de fundo, e que a coloração de CD163 nos alelos não caracterizados está aproximadamente a meio caminho entre o nível de WT e o fundo (observe também que esta é uma escala logarítmica, portanto menos de ~ 10%).

[027] Figura 14. Nível de CD169 em macrófagos alveolares de três porcos representativos e o controle sem anticorpos (anti-CD169 marcado com FITC).

[028] Figura 15. Viremia nos vários genótipos. Observe que os dados do leitão de Δ43 aminoácidos estão ao longo do eixo X.

[029] Figura 16. Sequência genômica de éxons 7-10 de CD163 de tipo selvagem usada como uma sequência de referência (SEQ ID NO: 47). A sequência inclui 3000 pb a montante do éxon 7 até a última base do éxon 10. As regiões sublinhadas mostram as localizações dos éxons 7, 8, 9 e 10, respectivamente.

[030] Figura 17. Diagrama de modificações de CD163 ilustrando várias modificações cromossômicas de CD163, o produto de proteína previsto para cada modificação e a expressão relativa de macrófagos para cada modificação, conforme medido pelo nível de CD163 de superfície em macrófagos alveolares suínos (PAMs). As regiões pretas indicam íntrons e as regiões brancas indicam éxons. A região hachurada indica o mimetizador do éxon 11 de hCD163L1, o homólogo do éxon 7 suíno. A região cinza indica o íntron sintetizado com o construto PGK Neo.

[031] Figura 18. Diagrama da proteína de CD163 suína e sequência do gene. A) Domínios de SRCR da proteína de CD163 (ovais) e PST (quadrados) junto com os éxons do gene correspondentes. B) Comparação de SRCR 5 de CD163 suíno (SEQ ID NO: 120) com o homólogo SRCR 8 de CD163L1 humano (SEQ ID NO: 121).

[032] Figura 19. Resultados representativos para a expressão de superfície de CD163 e CD169 em PAMs de porcos de tipo selvagem e CD163- modificados. Os painéis A - e mostram resultados para as modificações de CD163 conforme ilustrado na Figura 17. Os dados agrupados para d7(1467) e d7(1280) são mostrados no painel D.

[033] Figura 20. Níveis de haptoglobina no soro em porcos do tipo selvagem e CD163-modificados.

[034] Figura 21. Permissividade relativa de PAMs de tipo selvagem e HL11m para infecção com isolados de PRRSV Tipo 2.

[035] Figura 22. Infecção de porcos CD163-modificados com isolados de PRRSV Tipo 1 e Tipo 2.

[036] Figura 23. Carga de vírus para porcos WT e CD163- modificados infectados com vírus Tipo 2.

[037] Figura 24. Resultados fetais após infecção materna com PRRSV. Os números à esquerda identificam cada parideira (“Nº Parideira”; consulte a Tabela 16 abaixo). Abaixo de cada número de parideira entre parênteses está o resultado para PRRS do PCR no soro, medido como modelos log10 por reação. “N” é negativo para ácido nucleico de PRRSV (Ct > 39). Os fetos são identificados por número e posição relativa dentro de cada corno uterino. Os asteriscos identificam as amostras de PCR fetal obtidas do fluido abdominal. O número abaixo de cada feto é o resultado de PRRS do PCR no soro fetal (log10 modelos por reação). O número dentro de cada círculo refere-se à presença de patologia anatômica: 1) feto normal; 2) feto pequeno; 3) alterações na placenta, como descolamento de placenta e/ ou necrose; 4) feto corado com mecônio; 5) o feto está morto e necrótico. As letras minúsculas identificam o genótipo dos fetos individuais (ver Tabela 16). Chave: a, A/ A; b, C/ A; c, B/ A; d, E/ A; e, B/ C; f, B/ D; g, D/ C; h, D/ D; i, E/ C; j, E/ D; ND não determinado porque o feto estava necrótico; nd, o genótipo não foi determinado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[038] A presente invenção é direcionada a métodos para proteger fetos suínos da infecção com vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRSV). Porcos com mutações inativadoras em ambos os alelos do gene CD163 são resistentes à infecção com PRRSV. Foi agora descoberto inesperadamente que fetos positivos para CD163 (por exemplo, fetos que têm um ou dois alelos de CD163 de tipo selvagem) podem ser protegidos da infecção por PRRSV enquanto no útero, desde que a mãe possua mutações inativadoras em ambos os alelos de seu gene CD163. Assim, por exemplo, mães com mutações inativadoras em ambos os alelos do gene CD163 podem ser acasaladas com machos possuindo dois alelos CD163 de tipo selvagem e os fetos heterozigotos resultantes serão protegidos da infecção por PRRSV.

DEFINIÇÕES

[039] Ao introduzir elementos da presente invenção ou a(s) forma(s) de realização preferida(s) da mesma, os artigos “um”, “uma”, “o”, “a” e “dito”, “dita” pretendem significar que há um ou mais dos elementos.

[040] O termo “e/ou” significa qualquer um dos itens, qualquer combinação dos itens ou todos os itens aos quais este termo está associado.

[041] O termo “reprodução”, tal como aqui utilizado, refere-se à união de gametas masculinos e femininos para que a fertilização ocorra. Tal união pode ser alcançada por acasalamento (cópula) ou por métodos artificiais in vitro ou in vivo. Tais métodos artificiais incluem, mas não estão limitados a inseminação artificial, inseminação artificial assistida por cirurgia, fertilização in vitro, injeção intracitoplasmática de esperma, perfuração de zona, cultura in vitro de oócitos fertilizados, transferência de ovário e divisão de ovário. O termo “reprodução”, tal como aqui utilizado, também inclui a transferência de um oócito fertilizado para o trato reprodutivo de uma fêmea.

[042] Os termos “compreendendo”, “incluindo” e “possuindo” destinam-se a ser inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais além dos elementos listados.

[043] O termo “CRISPR” significa “repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas”. Os sistemas de CRISPR incluem sistemas de CRISPR Tipo I, Tipo II e Tipo III.

[044] O termo “Cas” refere-se a “proteína associada a CRISPR”.

As proteínas Cas incluem, mas não estão limitadas a proteínas membros da família Cas9, proteínas membros da família Cas6 (por exemplo, Csy4 e Cas6) e proteínas membros da família Cas5.

[045] O termo “Cas9” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas9 de tipo selvagem (por exemplo, Cas9 de S. pyogenes). Sequências Cas9 ilustrativas são fornecidas por SEQ ID NOs. 1- 256 e 795-1346 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963. As SEQ ID NOs. 1-256 e 795-1346 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963 são aqui incorporados por referência. “Cas9” pode se referir a um polipeptídeo com no máximo cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas9 de tipo selvagem (por exemplo, de S. pyogenes). “Cas9” pode se referir ao tipo selvagem ou a uma forma modificada da proteína Cas9 que pode compreender uma alteração de aminoácido, tal como uma deleção, inserção, substituição, variante, mutação, fusão, quimera ou qualquer combinação dos mesmos.

[046] O termo “Cas5” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas5 ilustrativo de tipo selvagem (por exemplo, Cas5 de D. vulgaris). As sequências Cas5 ilustrativas são fornecidas na Figura 42 da Publicação da Patente U.S. nº 2016/0046963. A Figura 42 da

Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963 é aqui incorporada por referência.

“Cas5” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com no máximo cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas5 de tipo selvagem (por exemplo, um Cas5 de D. vulgaris). “Cas5” pode se referir ao tipo selvagem ou a uma forma modificada da proteína Cas5 que pode compreender uma alteração de aminoácido, tal como uma deleção, inserção, substituição, variante, mutação, fusão, quimera ou qualquer combinação dos mesmos.

[047] O termo “Cas6” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas6 ilustrativo de tipo selvagem (por exemplo, um Cas6 de T. thermophilus). Sequências Cas6 ilustrativas são fornecidas na Figura 41 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963. A Figura 41 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963 é aqui incorporada por referência. “Cas6” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com no máximo cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas6 de tipo selvagem (por exemplo, de T. thermophilus). “Cas6” pode se referir ao tipo selvagem ou a uma forma modificada da proteína Cas6 que pode compreender uma alteração de aminoácido, tal como uma deleção, inserção, substituição, variante, mutação, fusão, quimera ou qualquer combinação dos mesmos.

[048] Os termos “CRISPR/Cas9” ou “sistema de CRISPR/Cas9” referem-se a um sistema de nuclease programável para engenharia genética que inclui uma proteína Cas9, ou seu derivado, e um ou mais RNAs não codificantes que podem fornecer a função de um RNA CRISPR (crRNA) e RNA transativador (tracrRNA) para o Cas9. O crRNA e o tracrRNA podem ser usados individualmente ou podem ser combinados para produzir um “RNA guia” (gRNA). O crRNA ou gRNA fornecem uma sequência que é complementar ao alvo genômico.

[049] As referências aqui a uma deleção em uma sequência de nucleotídeos do nucleotídeo x ao nucleotídeo y significam que todos os nucleotídeos no intervalo foram deletados, incluindo x e y. Assim, por exemplo, a frase “uma deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a SEQ ID NO: 47” significa que cada um dos nucleotídeos 3.317 a 3.147 foram excluídos, incluindo os nucleotídeos

3.317 e 3.147.

[050] “Resistência” de um animal a uma doença é uma característica de um animal, em que o animal evita os sintomas da doença que são o resultado de interações patógeno-animal, tais como interações entre um animal suíno e PRRSV. Ou seja, os patógenos são impedidos de causar doenças em animais e os sintomas de doenças associados ou, alternativamente, uma redução da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos ou redução de sintomas clínicos. Um técnico no assunto apreciará que os métodos aqui revelados podem ser usados com outras composições e métodos disponíveis na técnica para proteger animais do ataque de patógenos.

[051] Conforme usado neste documento, “edição de gene”, “gene editado”, “geneticamente editado” e “efetores de edição de gene” referem-se ao uso de tecnologia teleguiada com nucleases de ocorrência natural ou artificialmente projetadas, também referidas como “tesouras moleculares”, “endonucleases teleguiadas” ou “endonucleases de direcionamento”. As nucleases criam quebras cromossômicas de fita dupla (DSBs) específicas em locais desejados no genoma, que em alguns casos aproveita os mecanismos endógenos da célula para reparar a quebra induzida por processos naturais de recombinação homóloga (HR) e/ou união de extremidades não homólogas (NHEJ). Os efetores de edição de genes incluem Nucleases Dedo de zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras Semelhantes a Ativador de Transcrição (TALENs), sistemas de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) (por exemplo, o sistema de CRISPR/Cas9) e meganucleases (por exemplo, meganucleases re-projetadas como endonucleases teleguiadas). Os termos também incluem o uso de procedimentos e técnicas transgênicas, incluindo, por exemplo, quando a alteração é uma deleção ou inserção relativamente pequena (normalmente menos de 20 nt) e/ou não introduz DNA de uma espécie estranha. O termo também abrange animais de prole, tais como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada a partir do animal de gene editado inicial.

[052] Os termos “engenharia genômica”, “engenharia genética”, “projetado geneticamente”, “alterado geneticamente”, “alteração genética”, “modificação do genoma”, “modificação genômica” e “modificado genomicamente” podem referir-se à alteração do genoma por deleção, inserção, mutação ou substituição de sequências de ácido nucleico específicas.

A alteração pode ser específica de gene ou localização. A engenharia genômica pode usar nucleases para cortar um ácido nucleico, gerando assim um sítio para a alteração. A engenharia de ácido nucleico não genômico também é contemplada. Uma proteína contendo um domínio de nuclease pode ligar e clivar um ácido nucleico alvo formando um complexo com um ácido nucleico direcionado ao ácido nucleico. Em um exemplo, a clivagem pode introduzir quebras de fita dupla no ácido nucleico alvo. Um ácido nucleico pode ser reparado, por exemplo, por máquinas endógenas de união de extremidades não homólogas (NHEJ). Em outro exemplo, um pedaço de ácido nucleico pode ser inserido. Modificações de ácidos nucleicos direcionados a ácidos nucleicos e polipeptídeos sítio-direcionados podem introduzir novas funções a serem utilizadas para a engenharia genômica.

[053] Conforme usado aqui, “tecnologia de DNA teleguiada”, “tecnologia teleguiada” e “endonuclease teleguiada” incluem quaisquer mecanismos que permitem que uma molécula especificada seja direcionada para uma sequência de DNA especificada, incluindo proteínas Dedo de Zinco (ZF), meganucleases Efetoras Semelhantes a Ativador de Transcrição (TALEs) e sistemas de CRISPR (por exemplo, o sistema de CRISPR/Cas9).

[054] Os termos “resistência aumentada” e “susceptibilidade reduzida” aqui significam, mas não estão limitados a uma redução estatisticamente significativa da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos ou sintomas clínicos que estão associados à infecção por patógenos. Por exemplo, “resistência aumentada” ou “susceptibilidade reduzida” pode se referir a uma redução estatisticamente significativa da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos ou sintomas clínicos que estão associados à infecção por PRRSV em um animal compreendendo uma sequência cromossômica modificada em uma proteína do gene CD163 em comparação com um animal de controle que possui uma sequência cromossômica não modificada. O termo “redução estatisticamente significativa de sintomas clínicos” significa, mas não está limitado a que a frequência na incidência de pelo menos um sintoma clínico no grupo modificado de indivíduos é de pelo menos 10%, de preferência pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30%, ainda mais preferencialmente pelo menos 50% e ainda mais preferencialmente pelo menos 70% menor do que no grupo de controle não modificado após o desafio com o agente infeccioso.

[055] Inativação (“knockout”) significa a interrupção da estrutura ou mecanismo regulador de um gene. Inativações podem ser geradas por meio de recombinação homóloga de vetores de direcionamento, vetores de substituição ou vetores hit-and-run ou inserção aleatória de um vetor de armadilha de gene, resultando em perda completa, parcial ou condicional da função do gene.

[056] Conforme usado neste documento, o termo “mutação” inclui alterações na sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo, tais como, por exemplo, um gene ou sequência de DNA codificante (CDS), em comparação com a sequência de tipo selvagem. O termo inclui, sem limitação, substituições, inserções, deslocamentos (frameshifts), deleções, inversões, translocações, duplicações, mutações de sítio splice-doador, mutações pontuais e semelhantes.

[057] Aqui, “redução da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos” ou “redução dos sintomas clínicos” significa, mas não está limitado a, reduzir o número de indivíduos infectados em um grupo, reduzir ou eliminar o número de indivíduos exibindo sinais clínicos de infecção, ou reduzir a gravidade de quaisquer sinais clínicos que estão presentes em um ou mais indivíduos, em comparação com a infecção de tipo selvagem. Por exemplo, esses termos abrangem quaisquer sinais clínicos de infecção, patologia pulmonar, viremia, produção de anticorpos, redução da carga de patógenos, liberação de patógenos, redução na transmissão de patógenos ou redução de qualquer sinal clínico sintomático de PRRSV. De preferência, estes sinais clínicos são reduzidos em um ou mais animais da invenção em pelo menos 10% em comparação com indivíduos que não têm uma modificação no gene CD163 e que são infectados. Mais preferencialmente, os sinais clínicos são reduzidos em indivíduos da invenção em pelo menos 20%, preferencialmente em pelo menos 30%, mais preferencialmente em pelo menos 40%, e ainda mais preferencialmente em pelo menos 50%.

[058] Um “domínio de ligação a DNA TALE” ou “TALE” é um polipeptídeo que compreende um ou mais domínios/ unidades de repetição TALE. Os domínios de repetição estão envolvidos na ligação do TALE à sua sequência de DNA alvo cognata. Uma única “unidade de repetição” (também referida como uma “repetição”) tem tipicamente 33-35 aminoácidos de comprimento e exibe pelo menos alguma homologia de sequência com outras sequências de repetição TALE dentro de uma proteína TALE de ocorrência natural. Os domínios de ligação TALE e dedo de zinco e podem ser “projetados” para se ligarem a uma sequência de nucleotídeos predeterminada, por exemplo, por meio de engenharia (alterando um ou mais aminoácidos) da região de hélice de reconhecimento de proteínas TALE ou dedo de zinco de ocorrência natural. Portanto, as proteínas de ligação a DNA projetadas (dedos de zinco ou TALEs) são proteínas que não ocorrem naturalmente. Exemplos não limitativos de métodos para a engenharia de proteínas de ligação a DNA são projeto e seleção. Uma proteína de ligação a DNA projetada é uma proteína que não ocorre na natureza, cujo projeto/ composição resulta principalmente de critérios racionais. Os critérios racionais para o projeto incluem a aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processamento de informações em um banco de dados que armazena informações de projetos de ZFP e/ou TALE existentes e dados de ligação. Ver, por exemplo, Patente U.S. nº 6.140.081; 6.453.242; e 6.534.261; ver também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496 e Publicação U.S. nº 20110301073.

[059] Uma “proteína de ligação a DNA de dedo de zinco” (ou domínio de ligação) é uma proteína, ou um domínio dentro de uma proteína maior, que se liga ao DNA de uma maneira sequência-específica através de um ou mais dedos de zinco, que são regiões de sequência de aminoácidos dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon zinco. O termo proteína de ligação a DNA de dedo de zinco é frequentemente abreviado como proteína dedo de zinco ou ZFP.

[060] Uma proteína dedo de zinco “selecionada” ou TALE é uma proteína não encontrada na natureza, cuja produção resulta principalmente de um processo empírico, tal como exibição de fago, armadilha de interação ou seleção híbrida. Ver, por exemplo, Patente U.S. nº 5.789.538; Patente U.S. nº

5.925.523; Patente U.S. nº 6.007.988; Patente U.S. nº 6.013.453; Patente U.S.

nº 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970, WO 01/88197, WO 02/099084 e Publicação U.S. nº

20110301073.

[061] Vários outros termos são definidos a seguir.

[062] Métodos para proteger os fetos suínos da infecção por PRRSV.

[063] É fornecido um método para proteger um feto suíno da infecção com o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (prrsv). O método compreende cruzar um animal suíno fêmea com um animal suíno macho. O animal suíno fêmea compreende sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163, em que as sequências cromossômicas modificadas reduzem a suscetibilidade do animal suíno fêmea à infecção por PRRSV, em comparação com a suscetibilidade à infecção por PRRSV de um animal suíno fêmea que não compreende quaisquer sequências cromossômicas modificadas nos alelos de seu gene CD163. O animal suíno macho compreende pelo menos um alelo CD163 de tipo selvagem.

[064] Nos métodos descritos neste documento, as sequências cromossômicas modificadas podem ser sequências que são alteradas de forma que a função da proteína de CD163 no que se refere à infecção por PRRSV seja prejudicada, reduzida ou eliminada. Assim, os animais suínos fêmeas usados nos métodos descritos neste documento podem ser referidos como um animal inativado “knock-out”.

[065] O animal suíno macho pode compreender dois alelos CD163 de tipo selvagem.

[066] O termo “alelo CD163 de tipo selvagem”, tal como aqui utilizado, significa que a sequência do alelo CD163 é uma sequência encontrada na natureza, ou que a sequência do alelo CD163 contém uma ou mais mutações (por exemplo, inserções, deleções ou substituições) que não prejudicam substancialmente a atividade de CD163. Assim, os alelos CD163 de tipo selvagem podem conter polimorfismos e/ ou mutações, desde que esses polimorfismos ou mutações não prejudiquem substancialmente a atividade do CD163.

[067] Usando os métodos aqui descritos, os fetos serão protegidos de ambos os vírus PRRSV Tipo 1 e Tipo 2, incluindo vários isolados de PRRSV Tipo 1 e Tipo 2.

[068] Assim, nos métodos descritos neste documento, as sequências cromossômicas modificadas podem reduzir a suscetibilidade do animal suíno fêmea a um vírus PRRSV Tipo 1, um PRRSV Tipo 2 ou a ambos os vírus PRRSV Tipo 1 e Tipo 2.

[069] As sequências cromossômicas modificadas podem reduzir a suscetibilidade do animal suíno fêmea a um isolado de PRRSV selecionado a partir do grupo que consiste em NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13- 15, Lelystad, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ e combinações dos mesmos.

[070] O animal suíno fêmea pode compreender um animal suíno fêmea geneticamente editado.

[071] O animal suíno fêmea geneticamente editado pode ser um animal que foi editado usando uma endonuclease teleguiada (homing endonuclease). A endonuclease teleguiada pode ser uma endonuclease de ocorrência natural, mas é de preferência uma endonuclease teleguiada de ocorrência não natural projetada racionalmente que tem uma sequência de reconhecimento de DNA que foi projetada de forma que a endonuclease tem como alvo uma sequência cromossômica no gene que codifica uma proteína de CD163.

[072] Assim, a endonuclease teleguiada pode ser uma endonuclease teleguiada projetada. A endonuclease teleguiada pode compreender, por exemplo, um sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR), uma Nuclease Efetora Semelhante a Ativador de Transcrição (TALEN), uma Nuclease Dedo de zinco (ZFN), uma proteína de fusão recombinase, uma meganuclease ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[073] A nuclease teleguiada compreende de forma preferencial um sistema de CRISPR. Exemplos de sistemas de CRISPR que podem ser usados para criar animais suínos fêmeas para uso nos métodos descritos neste documento incluem, mas não estão limitados a CRISPR/ Cas9, CRISPR/ Cas5 e CRISPR/ Cas6. O uso de sistemas de CRISPR para gerar animais geneticamente editados é discutido mais adiante.

[074] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o animal suíno fêmea pode compreender a mesma sequência cromossômica modificada em ambos os alelos do gene CD163.

[075] De forma alternativa, o animal suíno fêmea pode compreender uma primeira sequência cromossômica modificada em um primeiro alelo do gene CD163 e uma segunda sequência cromossômica modificada em um segundo alelo do gene CD163, a primeira e a segunda sequência cromossômica modificada sendo diferente uma da outra.

[076] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, cada alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea pode compreender uma inserção, uma deleção ou uma combinação das mesmas.

[077] Por exemplo, pelo menos um alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea pode compreender uma deleção.

[078] Pelo menos um alelo do gene CD163 pode compreender uma deleção na estrutura.

[079] Pelo menos um alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea pode compreender uma inserção.

[080] Nos métodos descritos neste documento, as sequências cromossômicas modificadas de forma preferencial fazem com que a produção ou atividade da proteína de CD163 seja reduzida, em comparação com a produção ou atividade da proteína de CD163 em um animal suíno fêmea que não possui as sequências cromossômicas modificadas.

[081] De preferência, as sequências cromossômicas modificadas resultam na produção de proteína de CD163 substancialmente não funcional pelo animal suíno fêmea. Por “proteína de CD163 substancialmente não funcional”, entende-se que o nível de proteína de CD163 no animal, prole ou célula é indetectável ou, se detectável, é pelo menos cerca de 90% menor, de preferência pelo menos cerca de 95% menor, de forma mais preferencial pelo menos cerca de 98%, menor, e ainda de forma mais preferencial pelo menos cerca de 99% menor que o nível observado em um animal, prole ou célula que não compreende as sequências cromossômicas modificadas.

[082] Por exemplo, em qualquer um dos métodos aqui descritos, o animal suíno fêmea não produz a proteína de CD163.

[083] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, cada alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea pode compreender uma modificação no exon 7, uma modificação no exon 8, uma modificação em um intron que é contíguo com o exon 7 ou exon 8, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[084] Por exemplo, um ou ambos os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma modificação no exon 7 do gene

CD163.

[085] A modificação no exon 7 pode compreender uma deleção.

[086] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, em que um alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea compreende uma deleção, a deleção pode compreender uma deleção na estrutura.

[087] A modificação no exon 7 pode compreender uma inserção.

[088] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, as sequências cromossômicas modificadas em um ou ambos os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem resultar em uma codificação incorreta.

[089] Quando uma sequência cromossômica modificada resulta em uma codificação incorreta em um alelo do gene CD163, a codificação incorreta pode resultar em um códon de parada prematuro a jusante da codificação incorreta no alelo do gene CD163.

[090] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: uma deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com uma deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no mesmo alelo; uma deleção de 124 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 123 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.146 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e 3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 130 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.159 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 132 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo

3.161 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1506 pares de bases do nucleotídeo 1.525 ao nucleotídeo 3.030 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1373 pares de bases do nucleotídeo 2.724 ao nucleotídeo 4.096 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 28 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113; uma deleção de 1720 pares de bases do nucleotídeo 2.440 ao nucleotídeo 4.160 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de

452 pares de bases do nucleotídeo 3.015 ao nucleotídeo 3.466 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; e combinações de qualquer uma das mesmas.

[091] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo

3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[092] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no mesmo alelo.

[093] Quando a modificação compreende a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no mesmo alelo, a inserção de 2 pares de bases pode compreender o dinucleotídeo AG.

[094] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 124 pares de bases do nucleotídeo

3.024 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[095] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 123 pares de bases do nucleotídeo

3.024 ao nucleotídeo 3.146 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[096] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos

3.147 e 3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[097] Quando a modificação compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e 3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, a inserção de 1 par de bases pode compreender um único resíduo de adenina.

[098] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 130 pares de bases do nucleotídeo

3.030 ao nucleotídeo 3.159 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[099] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 132 pares de bases do nucleotídeo

3.030 ao nucleotídeo 3.161 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0100] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 1506 pares de bases do nucleotídeo

1.525 ao nucleotídeo 3.030 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0101] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo

3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0102] Quando a modificação compreende a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, a inserção de 7 pares de bases pode compreender a sequência TACTACT (SEQ ID NO: 115).

[0103] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo

2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0104] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 1373 pares de bases do nucleotídeo

2.724 ao nucleotídeo 4.096 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0105] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo

2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0106] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47.

[0107] Quando a modificação compreende a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, a inserção de 12 pares de bases pode compreender a sequência TGTGGAGAATTC (SEQ ID NO: 116).

[0108] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 28 pares de bases do nucleotídeo

3.145 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0109] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo

3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0110] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo

3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113.

[0111] Quando a modificação compreende a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, a inserção de 11 pares de bases pode compreender a sequência AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).

[0112] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 1720 pares de bases do nucleotídeo

2.440 ao nucleotídeo 4.160 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0113] Pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender a deleção de 452 pares de bases do nucleotídeo

3.015 ao nucleotídeo 3.466 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0114] Por exemplo, pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo

3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no mesmo alelo; a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; a deleção de

1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída pela inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113; e combinações de qualquer um dos mesmos.

[0115] O gene CD163 no animal suíno fêmea pode compreender qualquer combinação das sequências cromossômicas modificadas aqui descritas.

[0116] Por exemplo, o animal suíno fêmea pode compreender a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em um alelo do gene CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163.

[0117] O animal suíno fêmea pode compreender a deleção de

1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída pela inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163.

[0118] O animal suíno fêmea pode compreender a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em um alelo do gene CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene CD163.

[0119] O animal suíno fêmea pode compreender a deleção de

1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída pela inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene CD163.

[0120] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma sequência cromossômica com pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

[0121] Os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma sequência cromossômica tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

[0122] Os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma sequência cromossômica tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

[0123] Os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma sequência cromossômica tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

[0124] Os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma sequência cromossômica tendo pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

[0125] Os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma sequência cromossômica tendo pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

[0126] Os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma sequência cromossômica tendo pelo menos 99,9% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

[0127] Os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea podem compreender uma sequência cromossômica com 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

[0128] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, o animal suíno fêmea pode compreender uma sequência cromossômica que compreende a SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 ou 119 em um ou ambos os alelos do gene CD163.

[0129] Por exemplo, o animal suíno fêmea pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99, 102, 103 ou 113 em um ou ambos os alelos do gene CD163.

[0130] Os alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea podem compreender qualquer combinação de sequências cromossômicas compreendendo a SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 ou 119. Assim, o animal suíno fêmea pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 ou 119 em um alelo do gene CD163 e uma sequência cromossômica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 ou 119 no outro alelo do gene CD163.

[0131] Por exemplo, o animal suíno fêmea pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99 em um alelo do gene CD163, e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 103 no outro alelo do gene CD163.

[0132] O animal suíno fêmea pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 113 em um alelo do gene CD163, e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99 no outro alelo do gene CD163.

[0133] O animal suíno fêmea pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99 em um alelo do gene CD163 e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 102 no outro alelo do gene CD163.

[0134] O animal suíno fêmea pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 113 em um alelo do gene CD163, e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 102 no outro alelo do gene CD163.

[0135] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, a reprodução irá produzir um ou mais fetos que compreendem uma sequência cromossômica modificada em um único alelo do gene CD163. Uma vez que o animal suíno fêmea usada nos métodos descritos neste documento compreende sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163, cruzar o animal suíno fêmea com um animal suíno macho compreendendo pelo menos um alelo CD163 de tipo selvagem produzirá fetos que herdaram um alelo CD163 que compreende a sequência cromossômica modificada do animal suíno fêmea e um alelo CD163 de tipo selvagem do animal suíno macho.

Assim, a reprodução irá produzir fetos que são heterozigotos para a sequência cromossômica CD163 modificada. Quando o animal macho compreende dois alelos CD163 de tipo selvagem, todos os fetos produzidos como resultado da reprodução serão heterozigotos para a sequência cromossômica CD163 modificada.

[0136] Os fetos produzidos pela reprodução terão susceptibilidade reduzida à infecção por PRRSV enquanto no útero, em comparação com os fetos no útero em um animal suíno fêmea de tipo selvagem.

[0137] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, a reprodução pode compreender o acasalamento (cópula) do animal suíno fêmea com o animal suíno macho.

[0138] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento, a reprodução pode compreender a inseminação artificial do animal fêmea com esperma obtido do animal macho.

[0139] Em qualquer um dos métodos aqui descritos, a reprodução pode compreender a transferência de um oócito fertilizado para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea.

[0140] Em métodos em que a reprodução compreende a transferência de um oócito fertilizado para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea, o oócito fertilizado pode ser gerado por fertilização in vitro do oócito com esperma obtido do animal suíno macho.

[0141] A fertilização in vitro pode compreender injeção intracitoplasmática de um oócito com esperma obtido de um animal suíno macho.

[0142] Quando a reprodução compreende a transferência de um oócito fertilizado para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea, o oócito pode ser um oócito derivado do animal suíno fêmea, de forma que o oócito compreende sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163. De forma alternativa, o oócito pode ser um oócito derivado de um animal suíno fêmea diferente compreendendo sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163, em que as sequências cromossômicas modificadas reduzem a suscetibilidade do animal à infecção por PRRSV, em comparação com a suscetibilidade à infecção por PRRSV de um animal suíno fêmea que não compreende nenhuma sequência cromossômica modificada nos alelos de seu gene CD163. Assim, por exemplo, qualquer oócito tendo sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163 (por exemplo, inativantes de ambos os alelos do gene C163) pode ser usado.

[0143] No entanto, onde a reprodução compreende a transferência de um oócito fertilizado para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea, o oócito não precisa compreender nenhuma sequência cromossômica modificada nos alelos de seu gene CD163. Um oócito contendo dois alelos de CD163 de tipo selvagem pode ser usado. O oócito contendo dois alelos CD163 de tipo selvagem pode ser fertilizado com esperma obtido de um animal suíno macho, em que o esperma compreende dois alelos de CD163 de tipo selvagem, para criar um oócito fertilizado contendo dois alelos de CD163 de tipo selvagem. Se tal oócito fertilizado (contendo dois alelos CD163 de tipo selvagem) for transferido para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea compreendendo as sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163, o feto resultante será protegido da infecção por PRRSV.

[0144] De forma alternativa, onde a reprodução compreende a transferência de um oócito fertilizado para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea, o oócito fertilizado pode compreender uma sequência cromossômica modificada em um único alelo de seu gene CD163. Tais oócitos fertilizados também produzirão fetos que são protegidos da infecção por PRRSV após a transferência do oócito fertilizado para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea compreendendo as sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163.

[0145] Assim, onde a reprodução compreende a transferência de um oócito fertilizado para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea, o oócito fertilizado pode compreender sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163 (por exemplo, inativantes de ambos os alelos de seu gene CD163), pode compreender uma sequência cromossômica modificada em apenas um alelo de seu gene CD163 ou pode compreender apenas alelos CD163 de tipo selvagem.

MARCADORES DE AFINIDADE

[0146] Um “marcador de afinidade” pode ser um marcador de afinidade de peptídeo ou um marcador de afinidade de ácido nucleico. O termo “marcador de afinidade” se refere, de modo geral, a uma sequência de proteína ou ácido nucleico que pode ser ligada a uma molécula (por exemplo, ligada por uma pequena molécula, proteína ou ligação covalente). Um marcador de afinidade pode ser uma sequência não nativa. Um marcador de afinidade de peptídeo pode compreender um peptídeo. Um marcador de afinidade de peptídeo pode ser aquele que é capaz de fazer parte de um sistema de divisão (por exemplo, dois fragmentos de peptídeo inativos podem se combinar em trans para formar um marcador de afinidade ativo). Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode compreender um ácido nucleico. Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode ser uma sequência que pode se ligar seletivamente a uma sequência de ácido nucleico conhecida (por exemplo, através de hibridização). Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode ser uma sequência que pode se ligar seletivamente a uma proteína. Um marcador de afinidade pode ser fundido a uma proteína nativa. Um marcador de afinidade pode ser fundido a uma sequência de nucleotídeos.

[0147] Às vezes, um, dois ou uma pluralidade de marcadores de afinidade podem ser fundidos a uma proteína nativa ou sequência de nucleotídeos. Um marcador de afinidade pode ser introduzido em um ácido nucleico direcionado a ácido nucleico usando métodos de transcrição in vitro ou in vivo. Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem incluir, por exemplo, um marcador químico, uma sequência de ligação da proteína de ligação a RNA, uma sequência de ligação da proteína de ligação a DNA, uma sequência hibridizável a um polinucleotídeo marcado por afinidade, um aptâmero de RNA sintético ou um aptâmero de DNA sintético. Exemplos de marcadores de afinidade de ácido nucleico químicos podem incluir, mas não estão limitados a ribo-nucleotrifosfatos contendo biotina, corantes fluorescentes e digoxeginin. Exemplos de marcadores de afinidade de ácido nucleico de ligação a proteína podem incluir, mas não estão limitados à sequência de ligação MS2, a sequência de ligação U1A, sequências de proteína de ligação haste-alça, a sequência boxB, a sequência eIF4A ou qualquer sequência reconhecida por uma proteína de ligação ao RNA. Exemplos de oligonucleotídeos marcados por afinidade de ácido nucleico podem incluir, mas não estão limitados a oligonucleotídeos biotinilados, oligonucleotídeos 2, 4- dinitrofenil, oligonucleotídeos com fluoresceína e oligonucleotídeos conjugados com amina primária.

[0148] Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode ser um aptâmero de RNA. Aptâmeros podem incluir aptâmeros que se ligam a teofilina, estreptavidina, dextrano B512, adenosina, guanosina, guanina/ xantina, 7-metil- GTP, aptâmeros de aminoácidos, como aptâmeros que se ligam a arginina, citrulina, valina, triptofano, cianocobalamina, N-metilmesoporfirina IX, flavina, NAD e aptâmeros antibióticos, tais como aptâmeros que se ligam a tobramicina, neomicina, lividomicina, canamicina, estreptomicina, viomicina e cloranfenicol.

[0149] Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode compreender uma sequência de RNA que pode ser ligada por um polipeptídeo sítio-direcionado. O polipeptídeo sítio-direcionado pode ser condicionalmente enzimaticamente inativo. A sequência de RNA pode compreender uma sequência que pode ser ligada por um membro dos sistemas de CRISPR Tipo I, Tipo II e/ou Tipo III. A sequência de RNA pode ser ligada por uma proteína membro da família RAMP. A sequência de RNA pode ser ligada por uma proteína membro da família Cas9, uma proteína membro da família Cas6 (por exemplo, Csy4, Cas6). A sequência de RNA pode ser ligada por uma proteína membro da família Cas5 (por exemplo, Cas5). Por exemplo, Csy4 pode se ligar a uma sequência de grampo de RNA específica com alta afinidade (Kd ~ 50 pM) e pode clivar o RNA em um sítio 3’ para o grampo.

[0150] Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode compreender uma sequência de DNA que pode ser ligada por um polipeptídeo sítio-direcionado. O polipeptídeo sítio-direcionado pode ser condicionalmente enzimaticamente inativo. A sequência de DNA pode compreender uma sequência que pode ser ligada por um membro dos sistemas de CRISPR Tipo I, Tipo II e/ou Tipo III. A sequência de DNA pode ser ligada por uma proteína Argonauta. A sequência de DNA pode ser ligada por uma proteína contendo um domínio dedo de zinco, um domínio TALE ou qualquer outro domínio de ligação a DNA.

[0151] Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ribozima. Ribozimas adequadas podem incluir peptidil transferase 23 SrRNA, RnaseP, íntrons do Grupo I, íntrons do Grupo II, ribozima de ramificação GIR1, Leadzyme, ribozimas de grampo, ribozimas cabeça de martelo, ribozimas HDV, ribozimas CPEB3, ribozimas VS, ribozima glmS, ribozima CoTC e ribozimas sintéticas.

[0152] Os marcadores de afinidade de peptídeo podem compreender marcadores que podem ser usados para rastreamento ou purificação (por exemplo, uma proteína fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato; um marcador His, (por exemplo, um marcador 6XHis); um marcador de hemaglutinina (HA); um marcador FLAG; um marcador Myc; um marcador GST; um marcador MBP; um marcador de proteína de ligação à quitina; um marcador de calmodulina; um marcador V5; um marcador de ligação à estreptavidina; e semelhantes).

[0153] Ambos os marcadores de afinidade de ácido nucleico e peptídeo podem compreender marcadores de moléculas pequenas, tais como biotina ou digitoxina, e marcadores de marcas fluorescentes, tais como por exemplo, fluorosceína, rodamina, corantes Alexa fluor, corante Cianina3, corante Cianina5.

[0154] Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem estar localizados em 5’ em relação a um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico direcionado a ácido nucleico). Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem estar localizados em 3’ em relação a um ácido nucleico. Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem estar localizados em 5’ e 3’ em relação a um ácido nucleico. Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem estar localizados dentro de um ácido nucleico. Os marcadores de afinidade de peptídeo podem estar localizados no N-terminal em relação a uma sequência de polipeptídeo. Os marcadores de afinidade de peptídeo podem estar localizados no C-terminal em relação a uma sequência de polipeptídeo.

Os marcadores de afinidade de peptídeo podem estar localizados no N- terminal e no C-terminal em relação a uma sequência polipeptídica. Uma pluralidade de marcadores de afinidade pode ser fundida a um ácido nucleico e/ou uma sequência de peptídeo.

AGENTES DE CAPTURA

[0155] Conforme usado neste documento, “agente de captura” pode, de modo geral, se referir a um agente que pode purificar um polipeptídeo e/ou um ácido nucleico. Um agente de captura pode ser uma molécula ou material biologicamente ativo (por exemplo, qualquer substância biológica encontrada na natureza ou sintética, e inclui, mas não está limitada a células, vírus, partículas subcelulares, proteínas, incluindo mais especificamente anticorpos, imunoglobulinas, antígenos, lipoproteínas, glicoproteínas, peptídeos, polipeptídeos, complexos de proteínas, complexos de (estrepto)avidina-biotina, ligantes, receptores ou pequenas moléculas, aptâmeros, ácidos nucleicos, DNA, RNA, ácidos nucleicos peptídicos, oligossacarídeos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, metabólitos celulares, haptenos, substâncias farmacologicamente ativas, alcalóides, esteróides, vitaminas, aminoácidos e açúcares). Em algumas formas de realização, o agente de captura pode compreender um marcador de afinidade. Em algumas formas de realização, um agente de captura pode se ligar preferencialmente a um polipeptídeo alvo ou ácido nucleico de interesse. Os agentes de captura podem flutuar livremente em uma mistura. Os agentes de captura podem ser ligados a uma partícula (por exemplo, uma conta, uma microconta, uma nanopartícula). Os agentes de captura podem ser ligados a uma superfície sólida ou semi-sólida. Em alguns casos, os agentes de captura são irreversivelmente ligados a um alvo. Em outros casos, os agentes de captura são reversivelmente ligados a um alvo (por exemplo, se um alvo pode ser eluído, ou pelo uso de um produto químico, tal como o imidazol).

POLIPEPTÍDEOS DE LIGAÇÃO A DNA

[0156] A integração sítio-específica pode ser realizada usando fatores que são capazes de reconhecer e se ligar a sequências de nucleotídeos particulares, por exemplo, no genoma de um organismo hospedeiro. Por exemplo, muitas proteínas compreendem domínios polipeptídicos que são capazes de reconhecer e se ligar ao DNA de uma maneira sítio-específica.

Uma sequência de DNA que é reconhecida por um polipeptídeo de ligação a DNA pode ser referida como uma sequência “alvo”. Domínios polipeptídicos que são capazes de reconhecer e se ligar ao DNA de uma maneira sítio- específica geralmente dobram-se corretamente e funcionam independentemente para se ligar ao DNA de uma maneira sítio-específica, mesmo quando expressos em um polipeptídeo diferente da proteína a partir da qual o domínio foi originalmente isolado. Da mesma forma, as sequências alvo para reconhecimento e ligação por polipeptídeos de ligação a DNA são, de modo geral, capazes de ser reconhecidas e ligadas por tais polipeptídeos, mesmo quando presentes em grandes estruturas de DNA (por exemplo, um cromossomo), particularmente quando o sítio onde a sequência alvo está localizada é um conhecido por ser acessível a proteínas celulares solúveis (por exemplo, um gene).

[0157] Embora os polipeptídeos de ligação a DNA identificados a partir de proteínas que existem na natureza normalmente se ligam a uma sequência de nucleotídeos discreta ou motivo (por exemplo, uma sequência de reconhecimento consenso), existem métodos que são conhecidos na técnica para modificar muitos desses polipeptídeos de ligação a DNA para reconhecer uma sequência de nucleotídeos ou motivo diferente. Os polipeptídeos de ligação a DNA incluem, por exemplo e sem limitação: domínios de ligação a

DNA dedo de zinco; zíperes de leucina; domínios de ligação a DNA UPA; GAL4; TAL; LexA; repressores Tet; LacI; e receptores de hormônios esteróides.

[0158] Por exemplo, o polipeptídeo de ligação a DNA pode ser um dedo de zinco. Motivos dedo de zinco individuais podem ser projetados para direcionar e ligar especificamente a qualquer um de uma grande variedade de sítios de DNA. Os polipeptídeos dedo de zinco Cys2His2 canônico (bem como Cys3His não canônico) se ligam ao DNA inserindo uma α-hélice no sulco principal da dupla hélice de DNA alvo. O reconhecimento do DNA por um dedo de zinco é modular; cada dedo contata principalmente três pares de bases consecutivos no alvo e alguns resíduos-chave no polipeptídeo medeiam o reconhecimento. Ao incluir múltiplos domínios de ligação a DNA dedo de zinco em uma endonuclease de direcionamento, a especificidade de ligação a DNA da endonuclease de direcionamento pode ser ainda aumentada (e, portanto, a especificidade de quaisquer efeitos reguladores de gene conferidos desse modo também pode ser aumentada). Ver, por exemplo, Urnov et al. (2005) Nature 435: 646-51. Assim, um ou mais polipeptídeos de ligação a DNA dedo de zinco podem ser projetados e utilizados de modo que uma endonuclease de direcionamento introduzida em uma célula hospedeira interaja com uma sequência de DNA que é única dentro do genoma da célula hospedeira.

[0159] De preferência, a proteína dedo de zinco é de ocorrência não natural, em que é projetada para se ligar a um sítio alvo de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al.

(2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol.

19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416; Patente U.S. nº 6.453.242;

6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317;

7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; e Publicação de Patente U.S. nº 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

[0160] Um domínio de ligação dedo de zinco projetado pode ter uma nova especificidade de ligação, em comparação com uma proteína dedo de zinco de ocorrência natural. Os métodos de engenharia incluem, mas não estão limitados a, projeto racional e vários tipos de seleção. O projeto racional inclui, por exemplo, o uso de bancos de dados que compreendem sequências de nucleotídeos tripletos (ou quadrupletos) e sequências de aminoácidos dedo de zinco individuais, em que cada sequência de nucleotídeo tripleto ou quadrupleto está associada a uma ou mais sequências de aminoácidos de dedos de zinco que se ligam à sequência tripleto ou quadrupleto particular. Ver, por exemplo, Patente U.S. nº 6.453.242 e 6.534.261.

[0161] Métodos de seleção exemplificativos, incluindo exibição de fago e sistemas de dois híbridos, são revelados na Patente U.S. nº 5.789.538;

5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; e

6.242.568; bem como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2.338.237. Além disso, o aumento da especificidade de ligação para domínios de ligação dedo de zinco foi descrito, por exemplo, em WO 02/077227.

[0162] Além disso, conforme revelado nestas e em outras referências, os domínios de dedo de zinco e/ou proteínas dedo de zinco com múltiplos dedos podem ser ligados entre si usando quaisquer sequências de ligantes adequados, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Ver, também, Patente U.S. nº 6.479.626; 6.903.185; e

7.153.949 para sequências ligantes exemplificativas de 6 ou mais aminoácidos de comprimento. As proteínas aqui descritas podem incluir qualquer combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína.

[0163] Seleção de sítios alvo: ZFPs e métodos para projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos que as codificam) são conhecidos pelos técnicos no assunto e descritos em detalhes na Patente US nº 6.140.0815; 789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988;

6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970, WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.

[0164] Além disso, conforme revelado nestas e outras referências, os domínios de dedo de zinco e/ou proteínas dedo de zinco com múltiplos dedos podem ser ligados entre si usando quaisquer sequências de ligantes adequados, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Ver, também, Patente U.S. nº 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949 para sequências ligantes exemplificativas de 6 ou mais aminoácidos de comprimento. As proteínas aqui descritas podem incluir qualquer combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína.

[0165] Quando um animal suíno fêmea para uso nos métodos, conforme descrito neste documento, foi geneticamente editado usando uma nuclease dedo de zinco, o animal fêmea pode ser criado usando um processo que compreende introduzir, em um embrião ou célula, pelo menos uma molécula de RNA que codifica uma nuclease dedo de zinco direcionada e, opcionalmente, pelo menos um polinucleotídeo acessório. O método compreende ainda a incubação do embrião ou célula para permitir a expressão da nuclease dedo de zinco, em que uma quebra de fita dupla introduzida na sequência cromossômica direcionada pela nuclease dedo de zinco é reparada por um processo de reparo de DNA de união de extremidades não homólogas propenso a erros ou um processo de reparo de DNA dirigido por homologia. O método de edição de sequências cromossômicas que codificam uma proteína associada ao desenvolvimento da linha germinativa usando a tecnologia de nuclease dedo de zinco direcionada é rápido, preciso e altamente eficiente.

[0166] Alternativamente, o polipeptídeo de ligação a DNA é um domínio de ligação a DNA de GAL4. A GAL4 é um transativador modular em Saccharomyces cerevisiae, mas também opera como um transativador em muitos outros organismos. Ver, por exemplo, Sadowski et al. (1988) Nature 335: 563-4. Neste sistema regulatório, a expressão de genes que codificam enzimas da via metabólica da galactose em S. cerevisiae é estritamente regulada pela fonte de carbono disponível. Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51: 458-76. O controle transcripcional dessas enzimas metabólicas é mediado pela interação entre a proteína reguladora positiva, GAL4, e uma sequência de DNA simétrica de 17 pb à qual GAL4 se liga especificamente (a sequência de ativação a montante (UAS)).

[0167] A GAL4 nativa consiste em 881 resíduos de aminoácidos, com um peso molecular de 99 kDa. A GAL4 compreende domínios funcionalmente autônomos, as atividades combinadas dos quais são responsáveis pela atividade de GAL4 in vivo. Ma e Ptashne (1987) Cell 48: 847-53); Brent e Ptashne (1985) Cell 43 (3 Pt 2): 729-36. Os 65 aminoácidos N- terminais de GAL4 compreendem o domínio de ligação a DNA de GAL4.

Keegan et al. (1986) Science 231: 699-704; Johnston (1987) Nature 328: 353-

5. A ligação sequência-específica requer a presença de um cátion bivalente coordenado por seis resíduos Cys presentes no domínio de ligação ao DNA. O domínio contendo cátions coordenados interage com e reconhece um tripleto CCG conservado em cada extremidade do UAS de 17 pb por meio de contatos diretos com o sulco principal da hélice de DNA. Marmorstein et al. (1992) Nature 356: 408-14. A função de ligação a DNA da proteína posiciona os domínios de ativação transcripcional C-terminal na vizinhança do promotor, de modo que os domínios de ativação podem dirigir a transcrição.

[0168] Polipeptídeos de ligação a DNA adicionais que podem ser usados incluem, por exemplo e sem limitação, uma sequência de ligação de um gene induzível por AVRBS3; uma sequência de ligação consenso de um gene induzível por AVRBS3 ou sequência de ligação sintética projetada a partir dele (por exemplo, domínio de ligação a DNA UPA); TAL; LexA (ver, por exemplo, Brent & Ptashne (1985), supra); LacR (ver, por exemplo, Labow et al.

(1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-56; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 88 (12): 5072-6); um receptor de hormônio esteróide (Elliston et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 11517-121); o repressor Tet (Patente U.S. nº 6.271.341) e um repressor Tet mutado que se liga a uma sequência de operador tet na presença, mas não na ausência, de tetraciclina (Tc); o domínio de ligação a DNA de NF-kappaB; e componentes do sistema regulatório descrito em Wang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (17): 8180-4, que utiliza uma fusão de GAL4, um receptor de hormônio, e VP16.

[0169] O domínio de ligação a DNA de uma ou mais das nucleases usadas nos métodos e composições aqui descritos pode compreender um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL de ocorrência natural ou projetado (de ocorrência não natural). Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. nº 2011/0301073.

[0170] Alternativamente, a nuclease pode compreender um sistema de CRISPR. Por exemplo, a nuclease pode compreender um sistema de CRISPR/Cas.

[0171] O sistema (associado ao CRISPR) evoluiu em bactérias e arqueas como um sistema imunológico adaptativo para se defender contra o ataque viral. Após a exposição a um vírus, segmentos curtos de DNA viral são integrados no locus CRISPR. O RNA é transcrito a partir de uma porção do locus CRISPR que inclui a sequência viral. Esse RNA, que contém a sequência complementar ao genoma viral, medeia o direcionamento de uma proteína Cas (por exemplo, proteína Cas9) para a sequência no genoma viral. A proteína Cas cliva e, assim, silencia o alvo viral. Recentemente, o sistema de CRISPR/

Cas foi adaptado para edição de genoma em células eucarióticas. A introdução de quebras de fita dupla (DSBs) sítio-específicas permite a alteração da sequência alvo por meio de um dos dois mecanismos de reparo de DNA endógeno - união de extremidades não homólogas (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR). O sistema de CRISPR/ Cas também tem sido usado para a regulação gênica, incluindo repressão e ativação da transcrição sem alterar a sequência alvo. A regulação gênica direcionada com base no sistema de CRISPR/ Cas pode, por exemplo, usar um Cas9 enzimaticamente inativo (também conhecido como Cas9 cataliticamente morto).

[0172] Os sistemas de CRISPR/ Cas incluem um locus CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas), que codifica componentes de RNA do sistema, e um locus Cas (associado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565- 1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al.,

2006. Biol. Diret 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60). Os loci CRISPR em hospedeiros microbianos contêm uma combinação de genes Cas, bem como elementos de RNA não codificantes capazes de programar a especificidade da clivagem de ácido nucleico mediada por CRISPR.

[0173] O CRISPR Tipo II é um dos sistemas mais bem caracterizados e realiza quebra de fita dupla de DNA direcionada na natureza em quatro etapas sequenciais. Primeiro, dois RNAs não codificantes, a matriz de pré-crRNA e tracrRNA, são transcritos a partir do locus CRISPR. Em segundo lugar, o tracrRNA hibridiza para as regiões de repetição do pré-crRNA e medeia o processamento de pré-crRNA em crRNAs maduros contendo sequências espaçadoras individuais. Terceiro, o complexo crRNA: tracrRNA maduro direciona Cas9 para o DNA alvo via emparelhamento de bases Watson-Crick entre o espaçador no crRNA e o protoespaçador no DNA alvo próximo ao motivo adjacente do protoespaçador (PAM), um requisito adicional para o reconhecimento do alvo. Finalmente, Cas9 medeia a clivagem do DNA alvo para criar uma quebra de fita dupla dentro do protoespaçador.

[0174] Para uso do sistema de CRISPR/ Cas para criar inserções e deleções direcionadas, os dois RNAs não codificantes (crRNA e o TracrRNA) podem ser substituídos por um único RNA referido como um RNA guia (gRNA).

A atividade do sistema de CRISPR/ Cas compreende três etapas: (i) inserção de sequências de DNA exógenas na matriz CRISPR para evitar ataques futuros, em um processo denominado “adaptação”, (ii) expressão das proteínas relevantes, bem como expressão e processamento da matriz, seguido por (iii) interferência mediada por RNA com o ácido nucleico estranho. Na célula bacteriana, várias proteínas Cas estão envolvidas com a função natural do sistema de CRISPR/ Cas e desempenham papéis em funções como a inserção do DNA estranho, etc.

[0175] A proteína Cas pode ser um “derivado funcional” de uma proteína Cas de ocorrência natural. Um “derivado funcional” de um polipeptídeo de sequência nativa é um composto com uma propriedade biológica qualitativa em comum com um polipeptídeo de sequência nativa. “Derivados funcionais” incluem, mas não estão limitados a fragmentos de uma sequência nativa e derivados de um polipeptídeo de sequência nativa e seus fragmentos, desde que tenham uma atividade biológica em comum com um polipeptídeo de sequência nativa correspondente. Uma atividade biológica aqui contemplada é a capacidade do derivado funcional de hidrolisar um substrato de DNA em fragmentos. O termo “derivado” abrange ambas as variantes de sequência de aminoácidos de polipeptídeo, modificações covalentes e fusões dos mesmos.

Derivados adequados de um polipeptídeo Cas ou um fragmento do mesmo incluem, mas não estão limitados a mutantes, fusões, modificações covalentes da proteína Cas ou um fragmento da mesma. A proteína Cas, que inclui a proteína Cas ou um fragmento da mesma, bem como derivados da proteína

Cas ou um fragmento dos mesmos, pode ser obtida a partir de uma célula ou sintetizada quimicamente ou por uma combinação desses dois procedimentos.

A célula pode ser uma célula que produz naturalmente a proteína Cas, ou uma célula que produz naturalmente a proteína Cas e é geneticamente modificada para produzir a proteína Cas endógena em um nível de expressão mais alto ou para produzir uma proteína Cas a partir de um ácido nucleico introduzido exogenamente, cujo ácido nucleico codifica uma Cas que é a mesma ou diferente da Cas endógena. Em alguns casos, a célula não produz naturalmente a proteína Cas e é geneticamente modificada para produzir uma proteína Cas.

[0176] Quando um animal suíno fêmea para uso nos métodos, conforme descrito neste documento, foi geneticamente editado usando um sistema de CRISPR, um sistema de CRISPR/Cas9 pode ser usado para gerar o animal suíno fêmea. Para usar Cas9 para editar sequências genômicas, a proteína pode ser entregue diretamente a uma célula. Alternativamente, um mRNA que codifica Cas9 pode ser entregue a uma célula, ou um gene que fornece a expressão de um mRNA que codifica Cas9 pode ser entregue a uma célula. Além disso, tanto o crRNA específico do alvo quanto um tracrRNA podem ser entregues diretamente a uma célula ou o(s) gRNA(s) específico(s) do alvo podem ser a uma célula (esses RNAs podem ser alternativamente produzidos por um gene construído para expressar esses RNAs). A seleção de sítios alvo e projetada de crRNA/ gRNA são bem conhecidos na técnica. Uma discussão sobre construção e clonagem de gRNAs pode ser encontrada em http://www.genome-engineering.org/crispr/wp- content/uploads/2014/05/CRISPR-Reagent-Description-Rev20140509.pdf.

[0177] Um polipeptídeo de ligação a DNA pode reconhecer especificamente e se ligar a uma sequência de nucleotídeos alvo compreendida dentro de um ácido nucleico genômico de um organismo hospedeiro. Qualquer número de instâncias discretas da sequência de nucleotídeos alvo pode ser encontrado no genoma do hospedeiro em alguns exemplos. A sequência de nucleotídeos alvo pode ser rara dentro do genoma do organismo (por exemplo, menos do que cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1 cópia(s) da sequência alvo podem existir no genoma). Por exemplo, a sequência de nucleotídeos alvo pode estar localizada em um único sítio dentro do genoma do organismo. As sequências de nucleotídeos alvo podem ser, por exemplo e sem limitação, dispersas aleatoriamente ao longo do genoma em relação umas às outras; localizadas em diferentes grupos de ligação no genoma; localizadas no mesmo grupo de ligação; localizadas em cromossomos diferentes; localizadas no mesmo cromossomo; localizadas no genoma em sítios que são expressos sob condições semelhantes no organismo (por exemplo, sob o controle do mesmo, ou de fatores reguladores substancialmente funcionalmente idênticos); e localizadas próximas umas das outras no genoma (por exemplo, as sequências alvo podem estar compreendidas em ácidos nucleicos integrados como concatemers em loci genômicos).

ENDONUCLEASES DE DIRECIONAMENTO

[0178] Um polipeptídeo de ligação a DNA que reconhece especificamente e se liga a uma sequência de nucleotídeo alvo pode estar compreendido dentro de um polipeptídeo quimérico, de modo a conferir ligação específica à sequência alvo sobre o polipeptídeo quimérico. Em exemplos, tal polipeptídeo quimérico pode compreender, por exemplo e sem limitação, polipeptídeos de nuclease, recombinase e/ou ligase, como esses polipeptídeos são descritos acima. Polipeptídeos quiméricos compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA e um polipeptídeo de nuclease, recombinase e/ou ligase também podem compreender outros motivos polipeptídicos funcionais e/ou domínios, tais como, por exemplo e sem limitação: uma sequência espaçadora posicionada entre os polipeptídeos funcionais na proteína quimérica; um peptídeo líder; um peptídeo que direciona a proteína de fusão a uma organela (por exemplo, o núcleo); polipeptídeos que são clivados por uma enzima celular; marcadores de peptídeos (por exemplo, Myc, His, etc.); e outras sequências de aminoácidos que não interferem com a função do polipeptídeo quimérico.

[0179] Polipeptídeos funcionais (por exemplo, polipeptídeos de ligação a DNA e polipeptídeos de nuclease) em um polipeptídeo quimérico podem ser operativamente ligados. Os polipeptídeos funcionais de um polipeptídeo quimérico podem ser operativamente ligados pela sua expressão a partir de um único polinucleotídeo que codifica pelo menos os polipeptídeos funcionais ligados uns aos outros na estrutura, de modo a criar um gene quimérico que codifica uma proteína quimérica. Alternativamente, os polipeptídeos funcionais de um polipeptídeo quimérico podem ser operativamente ligados por outros meios, tais como por reticulação de polipeptídeos expressos independentemente.

[0180] Um polipeptídeo de ligação a DNA, ou RNA guia que reconhece especificamente e se liga a uma sequência de nucleotídeo alvo pode estar compreendido dentro de uma proteína isolada natural (ou mutante da mesma), em que a proteína isolada natural, ou mutante da mesma, também compreende um polipeptídeo de nuclease (e também pode compreender um polipeptídeo de recombinase e/ou ligase). Exemplos de tais proteínas isoladas incluem TALENs, recombinases (por exemplo, Cre, Hin, Tre e FLP recombinase), CRISPR/Cas9 guiada por RNA e meganucleases.

[0181] Tal como aqui utilizado, o termo “endonuclease de direcionamento” refere-se a proteínas isoladas naturais ou projetadas e mutantes das mesmas que compreendem um polipeptídeo de ligação a DNA ou RNA guia e um polipeptídeo de nuclease, bem como polipeptídeos quiméricos compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA ou RNA guia e uma nuclease. Qualquer endonuclease de direcionamento compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA ou RNA guia que especificamente reconhece e se liga a uma sequência de nucleotídeos alvo compreendida dentro de um locus CD163 (por exemplo, porque a sequência alvo está compreendida dentro da sequência nativa no locus, ou porque a sequência alvo foi introduzida no locus, por exemplo, por recombinação) pode ser usada.

[0182] Alguns exemplos de polipeptídeos quiméricos adequados incluem, sem limitação, combinações dos seguintes polipeptídeos: polipeptídeos de ligação a DNA dedo de zinco; um polipeptídeo de nuclease FokI; domínios TALE; zíperes de leucina; motivos de ligação a DNA do fator de transcrição; e domínios de reconhecimento e/ou clivagem de DNA isolados de, por exemplo e sem limitação, um TALEN, uma recombinase (por exemplo, recombinases Cre, Hin, RecA, Tre e FLP), CRISPR/Cas9 guiado por RNA, uma meganuclease; e outros conhecidos dos técnicos no assunto. Exemplos particulares incluem uma proteína quimérica compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA sítio-específico e um polipeptídeo de nuclease. Os polipeptídeos quiméricos podem ser projetados por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto para alterar a sequência de reconhecimento de um polipeptídeo de ligação a DNA compreendido no polipeptídeo quimérico, de modo a direcionar o polipeptídeo quimérico para uma sequência de nucleotídeos particular de interesse.

[0183] O polipeptídeo quimérico pode compreender um domínio de ligação a DNA (por exemplo, dedo de zinco, domínio efetor de TAL, etc.) e um domínio de nuclease (clivagem). O domínio de clivagem pode ser heterólogo ao domínio de ligação a DNA, por exemplo, um domínio de ligação a DNA dedo de zinco e um domínio de clivagem de uma nuclease ou um domínio de ligação a DNA TALEN e um domínio de clivagem, ou domínio de ligação a DNA de meganuclease e domínio de clivagem de uma nuclease diferente. Os domínios de clivagem heterólogos podem ser obtidos a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. Endonucleases exemplificativas das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitadas a endonucleases de restrição e endonucleases teleguiadas. Ver, por exemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass.; e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388. Enzimas adicionais que clivam o DNA são conhecidas (por exemplo, 51 Nuclease; nuclease de feijão mungo; DNAse I pancreática; nuclease microcócica; endonuclease de levedura HO; ver também Linn et al. (Eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem e meios-domínios de clivagem.

[0184] Da mesma forma, um meio-domínio de clivagem pode ser derivado de qualquer nuclease ou porção da mesma, conforme estabelecido acima, que requer dimerização para atividade de clivagem. Em geral, duas proteínas de fusão são necessárias para a clivagem se as proteínas de fusão compreenderem meios-domínios de clivagem. Alternativamente, pode ser usada uma única proteína compreendendo dois meios-domínios de clivagem.

Os dois meios-domínios de clivagem podem ser derivados da mesma endonuclease (ou fragmentos funcionais das mesmas), ou cada meio-domínio de clivagem pode ser derivado de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais das mesmas). Além disso, os sítios alvo para as duas proteínas de fusão estão preferencialmente dispostos, um em relação ao outro, de modo que a ligação das duas proteínas de fusão aos seus respectivos sítios alvo coloque os meios-domínios de clivagem em uma orientação espacial entre si que permite que os meio-domínios de clivagem formem um domínio de clivagem funcional, por exemplo, por dimerização. Assim, as bordas próximas dos sítios alvo podem ser separadas por 5-8 nucleotídeos ou por 15-18 nucleotídeos. No entanto, qualquer número inteiro de nucleotídeos, ou pares de nucleotídeos, pode intervir entre dois sítios alvo (por exemplo, de 2 a 50 pares de nucleotídeos ou mais). Em geral, o sítio de clivagem fica entre os sítios alvo.

[0185] Endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação sequência-específica ao DNA (em um sítio de reconhecimento) e clivagem de DNA em ou próximo ao sítio de ligação, por exemplo, de tal modo que um ou mais sequências exógenas (doadores/ transgenes) são integradas em ou próximo aos sítios de ligação (alvo). Certas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) clivam o DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima Fok I do Tipo IIS catalisa a clivagem de fita dupla de DNA, em 9 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento na outra. Ver, por exemplo, Patente U.S. nº 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4275-4279; Li et al.

(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 91: 883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31.978-

31.982. Assim, as proteínas de fusão podem compreender o domínio de clivagem (ou meio-domínio de clivagem) de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco, que podem ou não ser projetados.

[0186] Uma enzima de restrição do Tipo IIS exemplificativa, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fok I. Esta enzima particular é ativa como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10.570-10.575. Por conseguinte, para os fins da presente invenção, a porção da enzima Fok I usada nas proteínas de fusão reveladas é considerada um meio-domínio de clivagem. Assim, para clivagem de fita dupla direcionada e/ ou substituição direcionada de sequências celulares usando fusões de dedo de zinco-Fok I, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um meio- domínio de clivagem FokI, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma única molécula de polipeptídeo contendo um domínio de ligação a DNA e dois meios-domínios de clivagem Fok I também pode ser usada.

[0187] Um domínio de clivagem ou meio-domínio de clivagem pode ser qualquer porção de uma proteína que retém a atividade de clivagem ou que retém a capacidade de multimerizar (por exemplo, dimerizar) para formar um domínio de clivagem funcional.

[0188] Enzimas de restrição do Tipo IIS exemplificativas são descritas na Publicação de Patente U.S. nº 2007/0134796. Enzimas de restrição adicionais também contêm domínios de ligação e clivagem separáveis, e estes são contemplados pela presente invenção. Ver, por exemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 418-420.

[0189] O domínio de clivagem pode compreender um ou mais meios-domínios de clivagem projetados (também referidos como mutantes de domínio de dimerização) que minimizam ou evitam a homodimerização, como descrito, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. nº 2005/0064474; 2006/0188987 e 2008/0131962.

[0190] Alternativamente, as nucleases podem ser montadas in vivo no sítio alvo de ácido nucleico usando a chamada tecnologia de “enzima dividida” (ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. nº 20090068164). Os componentes de tais enzimas divididas podem ser expressos em construtos de expressão separados ou podem ser ligados em um quadro aberto de leitura onde os componentes individuais são separados, por exemplo, por um peptídeo 2A autoclivável ou sequência IRES. Os componentes podem ser domínios de ligação de dedo de zinco individuais ou domínios de um domínio de ligação de ácido nucleico de meganuclease.

NUCLEASES DEDO DE ZINCO

[0191] Um polipeptídeo quimérico pode compreender uma nuclease dedo de zinco (ZFN) projetada sob medida que pode ser projetada para entregar uma quebra de DNA de fita dupla sítio-específica direcionada na qual um ácido nucleico exógeno, ou DNA doador, pode ser integrado (ver publicação de patente US 2010/0257638). As ZFNs são polipeptídeos quiméricos contendo um domínio de clivagem não específico de uma endonuclease de restrição (por exemplo, FokI) e um polipeptídeo de domínio de ligação a DNA de dedo de zinco. Ver, por exemplo, Huang et al. (1996) J.

Protein Chem. 15: 481-9; Kim et al. (1997a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3616-20; Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-60; Kim et al.

(1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-7; Kim et al. (1997b) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 94: 12875-9; Kim et al. (1997c) Gene 203: 43-9; Kim et al.

(1998) Biol. Chem. 379: 489-95; Nahon e Raveh (1998) Nucleic Acids Res.

26: 1233-9; Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 674-81. As ZFNs podem compreender domínios de ligação a DNA dedo de zinco não canônicos (consulte a publicação de patente US 2008/0182332). A endonuclease de restrição FokI deve dimerizar através do domínio de nuclease, a fim de clivar o DNA e introduzir uma quebra de fita dupla.

Consequentemente, as ZFNs contendo um domínio de nuclease de tal endonuclease também requerem dimerização do domínio de nuclease a fim de clivar o DNA alvo. Mani et al. (2005) Biochem. Biophys. Res. Comum. 334: 1191-7; Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 3361-9. A dimerização da ZFN pode ser facilitada por dois sítios de ligação a DNA adjacentes e opostamente orientados. Id.

[0192] Um método para a integração sítio-específica de um ácido nucleico exógeno em pelo menos um locus CD163 de um hospedeiro pode compreender introduzir, em uma célula do hospedeiro, uma ZFN, em que a ZFN reconhece e se liga a uma sequência de nucleotídeos alvo, em que a sequência de nucleotídeos alvo está compreendida em pelo menos um locus CD163 do hospedeiro. Em certos exemplos, a sequência de nucleotídeos alvo não está compreendida no genoma do hospedeiro em qualquer outra posição além do pelo menos um locus CD163. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação a DNA da ZFN pode ser projetado para reconhecer e se ligar a uma sequência de nucleotídeos alvo identificada no pelo menos um locus CD163 (por exemplo, por sequenciamento do locus CD163). Um método para a integração sítio-específica de um ácido nucleico exógeno em pelo menos um locus de desempenho CD163 de um hospedeiro que compreende a introdução, em uma célula do hospedeiro, de uma ZFN, também pode compreender a introdução, na célula, de um ácido nucleico exógeno, em que a recombinação do ácido nucleico exógeno em um ácido nucleico do hospedeiro compreendendo pelo menos um locus CD163 é facilitada pelo reconhecimento sítio-específico e ligação da ZFN à sequência alvo (e subsequente clivagem do ácido nucleico compreendendo o locus CD163).

ÁCIDOS NUCLEICOS EXÓGENOS OPCIONAIS PARA INTEGRAÇÃO EM UM LOCUS CD163

[0193] Ácidos nucleicos exógenos para integração em um locus CD163 incluem: um ácido nucleico exógeno para integração sítio-específica em pelo menos um locus CD163, por exemplo e sem limitação, um ORF; um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma endonuclease de direcionamento; e um vetor compreendendo pelo menos um de cada ou ambos os anteriores. Assim, ácidos nucleicos particulares incluem sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo, sequências de nucleotídeos estruturais e/ou sítios de ligação e reconhecimento de polipeptídeo de ligação a DNA.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO EXÓGENO OPCIONAIS PARA INTEGRAÇÃO SÍTIO- ESPECÍFICA

[0194] Como observado acima, a inserção de uma sequência exógena (também chamada de “sequência doadora” ou “doador” ou “transgene”) é fornecida, por exemplo, para a expressão de um polipeptídeo, correção de um gene mutante ou para expressão aumentada de um gene de tipo selvagem. Será facilmente evidente que a sequência doadora tipicamente não é idêntica à sequência genômica onde é colocada. Uma sequência doadora pode conter uma sequência não homóloga flanqueada por duas regiões de homologia para permitir o reparo dirigido por homologia (HDR) eficiente no local de interesse. Além disso, as sequências doadoras podem compreender uma molécula de vetor contendo sequências que não são homólogas à região de interesse na cromatina celular. Uma molécula doadora pode conter várias regiões descontínuas de homologia com a cromatina celular. Por exemplo, para a inserção direcionada de sequências normalmente não presentes em uma região de interesse, as referidas sequências podem estar presentes em uma molécula de ácido nucleico doadora e flanqueada por regiões de homologia para sequenciar na região de interesse.

[0195] O polinucleotídeo doador pode ser DNA ou RNA, de fita simples ou de fita dupla e pode ser introduzido em uma célula na forma linear ou circular. Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. nº 2010/0047805, 2011/0281361, 2011/0207221 e 2013/0326645. Se introduzida na forma linear, as extremidades da sequência doadora podem ser protegidas (por exemplo, da degradação exonucleolítica) por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. Por exemplo, um ou mais resíduos de didesoxinucleotídeos são adicionados ao terminal 3’ de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos autocomplementares são ligados a uma ou ambas as extremidades. Ver, por exemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272: 886-889. Métodos adicionais para proteger polinucleotídeos exógenos da degradação incluem, mas não estão limitados a adição de grupo(s) amino terminal e o uso de ligações internucleotídicas modificadas, tais como, por exemplo, fosforotioatos, fosforamidatos e resíduos de O-metil ribose ou desoxirribose.

[0196] Um polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor com sequências adicionais, tais como, por exemplo, origens de replicação, promotores e genes que codificam resistência a antibióticos. Além disso, os polinucleotídeos doadores podem ser introduzidos como ácido nucleico puro, como ácido nucleico complexado com um agente tal como um lipossoma ou poloxâmero, ou podem ser entregues por vírus (por exemplo, adenovírus, AAV, herpesvírus, retrovírus, lentivírus e lentivírus defeituoso da integrasse (IDLV)).

[0197] O doador é, de modo geral, integrado de modo que sua expressão seja conduzida pelo promotor endógeno no sítio de integração, ou seja, o promotor que conduz a expressão do gene endógeno no qual o doador está integrado (por exemplo, CD163). No entanto, será evidente que o doador pode compreender um promotor e/ou potencializador, por exemplo um promotor constitutivo ou um promotor induzível ou específico de tecido.

[0198] Além disso, embora não sejam necessárias para a expressão, as sequências exógenas também podem incluir sequências regulatórias da transcrição ou tradução, por exemplo, promotores, potencializadores, isoladores, sítios de entrada do ribossomo interno, sequências que codificam os peptídeos 2A e/ou sinais de poliadenilação.

[0199] Os ácidos nucleicos exógenos que podem ser integrados de uma maneira sítio-específica em pelo menos um locus CD163, de modo a modificar o locus CD163 incluem, por exemplo e sem limitação, os ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse; ácidos nucleicos compreendendo um gene agronômico; ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de RNAi; ou ácidos nucleicos que interrompem o gene CD163.

[0200] Um ácido nucleico exógeno pode ser integrado em um locus CD163, de modo a modificar o locus CD163, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse, de modo que a sequência de nucleotídeos é expressa no hospedeiro a partir do locus CD163. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de interesse (por exemplo, uma proteína estranha) é expresso a partir de uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de interesse em quantidades comerciais. Em tais exemplos, o polipeptídeo de interesse pode ser extraído da célula hospedeira, tecido ou biomassa.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE COMPREENDEM UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICA UMA ENDONUCLEASE DE DIRECIONAMENTO

[0201] Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma endonuclease de direcionamento pode ser projetada por manipulação (por exemplo, ligação) de sequências de nucleotídeos nativas que codificam polipeptídeos compreendidos na endonuclease de direcionamento. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos de um gene que codifica uma proteína compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA pode ser inspecionada para identificar a sequência de nucleotídeos do gene que corresponde ao polipeptídeo de ligação a DNA, e essa sequência de nucleotídeos pode ser usada como um elemento de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma endonuclease de direcionamento compreendendo o polipeptídeo de ligação a DNA. Alternativamente, a sequência de aminoácidos de uma endonuclease de direcionamento pode ser usada para deduzir uma sequência de nucleotídeos que codifica a endonuclease de direcionamento, por exemplo, de acordo com a degenerescência do código genético.

[0202] Em moléculas de ácido nucleico exemplificativas compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma endonuclease de direcionamento, o último códon de uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de nuclease e o primeiro códon de uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação a DNA podem ser separados por qualquer número de tripletos de nucleotídeos, por exemplo, sem codificação para um íntron ou um “STOP”. Da mesma forma, o último códon de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação a DNA e o primeiro códon de uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de nuclease podem ser separados por qualquer número de tripletos de nucleotídeos. O último códon (ou seja, o mais 3’ na sequência de ácido nucleico) de uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de nuclease e uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação a DNA, podem ser fundidos no registro de fase com o primeiro códon de um outra sequência de codificação de polinucleotídeo diretamente contígua a ela, ou separada dela por não mais do que uma curta sequência de peptídeo, tal como aquela codificada por um ligante de nucleotídeo sintético (por exemplo, um ligante de nucleotídeo que pode ter sido usado para conseguir a fusão).

Exemplos de tais sequências polinucleotídicas adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, marcadores, peptídeos de direcionamento e sítios de clivagem enzimática. Da mesma forma, o primeiro códon do mais 5’ (na sequência de ácido nucleico) da primeira e segunda sequências polinucleotídicas pode ser fundido no registro de fase com o último códon de uma sequência de codificação de polinucleotídeo adicional diretamente contígua a ela, ou separada dela por não mais do que uma curta sequência de peptídeo.

[0203] Uma sequência que separa sequências polinucleotídicas que codificam polipeptídeos funcionais em uma endonuclease de direcionamento (por exemplo, um polipeptídeo de ligação a DNA e um polipeptídeo de nuclease) pode, por exemplo, consistir em qualquer sequência, de modo que a sequência de aminoácidos codificada não é susceptível de significativamente alterar a tradução da endonuclease de direcionamento.

Devido à natureza autônoma de polipeptídeos de nuclease conhecidos e polipeptídeos de ligação a DNA conhecidos, as sequências intervenientes não irão interferir com as respectivas funções dessas estruturas.

OUTROS MÉTODOS DE INATIVAÇÃO (KNOCKOUT)

[0204] Várias outras técnicas conhecidas na técnica podem ser usadas para inativar genes para fazer animais knockout e/ou para introduzir construtos de ácido nucleico em animais para produzir animais fundadores e para fazer linhagens de animais, em que o construto de inativação ou ácido nucleico está integrado no genoma. Tais técnicas incluem, sem limitação, microinjeção pronuclear (Patente US nº 4.873.191), transferência de genes mediada por retrovírus em linhas germinativas (Van der Putten et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-1652), direcionamento de genes em células-tronco embrionárias (Thompson et al. (1989) Cell 56, 313-321), eletroporação de embriões (Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814), transferência de genes mediada por espermatozóide (Lavitrano et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 14230-14235; Lavitrano et al. (2006) Reprod.

Fert. Develop. 18, 19-23), e transformação in vitro de células somáticas, tais como células de cúmulos ou mamárias, ou células-tronco adultas, fetais ou embrionárias, seguido por transplante nuclear (Wilmut et al. (1997) Nature 385, 810-813; e Wakayama et al. (1998) Nature 394, 369-374). Microinjeção pronuclear, transferência de genes mediada por espermatozóide e transferência nuclear de células somáticas são técnicas particularmente úteis.

Um animal que é genomicamente modificado é um animal em que todas as suas células têm a modificação, incluindo suas células da linha germinativa.

Quando são usados métodos que produzem um animal que é mosaico em sua modificação, os animais podem ser consanguíneos e a progênie que é genomicamente modificada pode ser selecionada. A clonagem, por exemplo, pode ser usada para fazer um animal mosaico se suas células forem modificadas no estado de blastocisto, ou a modificação genômica pode ocorrer quando uma única célula é modificada. Animais que são modificados para não amadurecerem sexualmente podem ser homozigotos ou heterozigotos para a modificação, dependendo da abordagem específica que é usada. Se um determinado gene for inativado por uma modificação de inativação, a homozigosidade normalmente seria necessária. Se um determinado gene for inativado por uma interferência de RNA ou estratégia negativa dominante, a heterozigosidade é frequentemente adequada.

[0205] Normalmente, na microinjeção de embrião/ zigoto, um construto de ácido nucleico ou mRNA é introduzido em um óvulo fertilizado; um ou dois óvulos fertilizados com células são usados como a estrutura nuclear que contém o material genético da cabeça do espermatozóide e o óvulo é visível dentro do protoplasma. Óvulos fertilizados em estágio pronuclear podem ser obtidos in vitro ou in vivo (isto é, recuperados cirurgicamente do oviduto de animais doadores). Óvulos fertilizados in vitro podem ser produzidos da seguinte forma. Por exemplo, ovários suínos podem ser coletados em um matadouro e mantidos a 22-28 °C durante o transporte. Os ovários podem ser lavados e isolados para aspiração folicular, e folículos variando de 4-8 mm podem ser aspirados para tubos cônicos de centrífuga de 50 mL usando agulhas de calibre 18 e sob vácuo. O fluido folicular e os oócitos aspirados podem ser enxaguados através de pré-filtros com TL-HEPES comercial (Minitube, Verona, Wis.). Oócitos rodeados por uma massa de cúmulos compacta podem ser selecionados e colocados no MEIO DE MATURAÇÃO DE OÓCITOS TCM-199 (Minitube, Verona, Wis.) suplementado com 0,1 mg/ml de cisteína, 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico, 10% de fluido folicular suíno, 50 µM de 2-mercaptoetanol, 0,5 mg/ml de cAMP, 10 IU/ml cada de gonadotrofina de soro de égua grávida (PMSG) e gonadotrofina coriônica humana (hCG) por aproximadamente 22 horas em ar umidificado a 38,7 °C e 5% de CO2. Posteriormente, os oócitos podem ser movidos para meio de maturação TCM-199 fresco, que não conterá cAMP, PMSG ou hCG e incubados por mais 22 horas. Oócitos maduros podem ser retirados de suas células de cúmulos por vórtex em hialuronidase a 0,1% por 1 minuto.

[0206] Para suínos, oócitos maduros podem ser fertilizados em 500 µl de sistema de meio Minitube PORCPRO IVF (Minitube, Verona, Wis.) em placas de fertilização de 5 poços Minitube. Na preparação para a fertilização in vitro (IVF), o sêmen de varrão recém-coletado ou congelado pode ser lavado e ressuspenso em meio de PORCPRO IVF até 400.000 espermatozóides. As concentrações de espermatozóide podem ser analisadas por análise de sêmen assistida por computador (SPERMVISION, Minitube, Verona, Wis.). A inseminação final in vitro pode ser realizada em um volume de 10 µl a uma concentração final de aproximadamente 40 espermatozóides móveis/ oócito, dependendo do varrão. Todos os oócitos fertilizantes podem ser incubados a 38,7 °C em atmosfera de 5,0% de CO 2 por seis horas. Seis horas após a inseminação, os presumíveis zigotos podem ser lavados duas vezes em NCSU-23 e transferidos para 0,5 ml do mesmo meio. Este sistema pode produzir 20-30% de blastocistos rotineiramente na maioria dos varrões com uma taxa de inseminação polispérmica de 10-30%.

[0207] Construtos de ácido nucleico linearizado ou mRNA podem ser injetados em um dos pronúcleos ou no citoplasma. Em seguida, os óvulos injetados podem ser transferidos para uma fêmea receptora (por exemplo, nos ovidutos de uma fêmea receptora) e deixados se desenvolver na fêmea receptora para produzir os animais transgênicos ou com edição genética. Em particular, embriões fertilizados in vitro podem ser centrifugados a 15.000 x g por 5 minutos para sedimentar lipídios permitindo a visualização do pró-núcleo.

Os embriões podem ser injetados usando um injetor Eppendorf FEMTOJET e podem ser cultivados até a formação de blastocisto. As taxas de clivagem do embrião e formação e qualidade de blastocisto podem ser registradas.

[0208] Os embriões podem ser transferidos cirurgicamente para o útero de receptores assíncronos. Normalmente, 100-200 (por exemplo, 150- 200) embriões podem ser depositados na junção ampola-istmo do oviduto usando um cateter TOMCAT® de 5,5 polegadas. Após a cirurgia, o exame de ultrassom em tempo real da gravidez pode ser realizado.

[0209] Na transferência nuclear de células somáticas, uma célula transgênica ou editada geneticamente, tal como um blastômero embrionário, fibroblasto fetal, fibroblasto de orelha de adulto ou célula da granulosa que inclui um construto de ácido nucleico descrito acima, pode ser introduzida em um oócito enucleado para estabelecer uma célula combinada. Os oócitos podem ser enucleados por dissecção parcial da zona perto do corpo polar e, em seguida, pressionando o citoplasma na área de dissecção. Normalmente, uma pipeta de injeção com uma ponta chanfrada afiada é usada para injetar a célula transgênica ou editada geneticamente em um oócito enucleado interrompido na meiose 2. Em algumas convenções, oócitos interrompidos na meiose-2 são denominados ovos. Depois de produzir um embrião suíno ou bovino (por exemplo, por fusão e ativação do oócito), o embrião é transferido para os ovidutos de uma fêmea receptora, cerca de 20 a 24 horas após a ativação. Ver, por exemplo, Cibelli et al. (1998) Science 280, 1256-1258 e patente U.S. nº 6.548.741, 7.547.816, 7.989.657 ou 6.211.429. Para porcos, as fêmeas receptoras podem ser verificadas quanto à gravidez aproximadamente 20-21 dias após a transferência dos embriões.

[0210] Técnicas de reprodução padrão podem ser usadas para criar animais que são homozigotos para o gene inativado dos animais fundadores heterozigotos iniciais. A homozigosidade pode não ser necessária, no entanto. Os porcos geneticamente editados aqui descritos podem ser cruzados com outros porcos de interesse.

[0211] Uma vez que os animais geneticamente editados foram gerados, a inativação de um ácido nucleico endógeno pode ser avaliada usando técnicas padrão. A triagem inicial pode ser realizada por análise de Southern blot para determinar se a inativação ocorreu ou não. Para uma descrição da análise de Southern, consulte as seções 9.37-9.52 de Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Press, Plainview; N.Y. As técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) também podem ser utilizadas na triagem inicial. A PCR refere-se a um procedimento ou técnica em que os ácidos nucleicos alvo são amplificados. De modo geral, a informação de sequência das extremidades da região de interesse ou além é empregada para projetar iniciadores de oligonucleotídeos que são idênticos ou semelhantes em sequência às fitas opostas do molde a ser amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas de DNA, bem como RNA, incluindo sequências de DNA genômico total ou RNA celular total. Os iniciadores têm tipicamente 14 a 40 nucleotídeos de comprimento, mas podem variar de 10 nucleotídeos a centenas de nucleotídeos de comprimento. A PCR é descrita em, por exemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. Dieffenbach e Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. Os ácidos nucleicos também podem ser amplificados por reação em cadeia da ligase, amplificação por deslocamento de fita, replicação de sequência auto-sustentada ou amplificação baseada em sequência de ácido nucleico. Ver, por exemplo, Lewis (1992) Genetic Engineering News 12,1; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874; e Weiss (1991) Science 254: 1292. No estágio de blastocisto, os embriões podem ser processados individualmente para análise por PCR, hibridização Southern e PCR splinkerette (ver, por exemplo, Dupuy et al. Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99: 4495).

RNAS DE INTERFERÊNCIA

[0212] Uma variedade de sistemas de RNA de interferência (RNAi) são conhecidos. O RNA de fita dupla (dsRNA) induz a degradação sequência-específica de transcritos de genes homólogos. O complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) metaboliza o dsRNA em pequenos RNAs de interferência de 21-23 nucleotídeos (siRNAs). O RISC contém uma RNAse de fita dupla (dsRNAse, por exemplo, Dicer) e ssRNAse (por exemplo, Argonaut 2 ou Ago2). O RISC utiliza fita antisenso como um guia para encontrar um alvo clivável. Ambos siRNAs e microRNAs (miRNAs) são conhecidos. Um método de inativar um gene em um animal geneticamente editado compreende induzir a interferência de RNA contra um gene alvo e/ou ácido nucleico de modo que a expressão do gene alvo e/ou ácido nucleico seja reduzida.

[0213] Por exemplo, a sequência de ácido nucleico exógena pode induzir interferência de RNA contra um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. Por exemplo, pequeno RNA de interferência de fita dupla (siRNA) ou pequeno RNA de grampo (shRNA) homólogo a um DNA alvo pode ser usado para reduzir a expressão desse DNA. Os construtos para siRNA podem ser produzidos conforme descrito, por exemplo, em Fire et al. (1998) Nature 391: 806; Romano e Masino (1992) Mol. Microbiol. 6: 3343; Cogoni et al. (1996)

EMBO J. 15: 3153; Cogoni e Masino (1999) Nature 399: 166; Misquitta e Paterson (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1451; e Kennerdell e Carthew (1998) Cell 95: 1017. Construtos para shRNA podem ser produzidos conforme descrito por McIntyre e Fanning (2006) BMC Biotechnology 6: 1. Em geral, os shRNAs são transcritos como uma molécula de RNA de fita simples contendo regiões complementares, que podem recombinar em baixa temperatura (anneal) e formar grampos curtos.

[0214] A probabilidade de encontrar um único siRNA ou miRNA funcional individual direcionado a um gene específico é alta. A previsibilidade de uma sequência específica de siRNA, por exemplo, é de cerca de 50%, mas uma série de RNAs de interferência podem ser feitos com boa confiança de que pelo menos um deles será eficaz.

[0215] Células in vitro, células in vivo ou um animal geneticamente editado, tal como um animal de reprodução, que expressam um RNAi direcionado contra um gene que codifica CD163 podem ser usados. O RNAi pode ser, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em siRNA, shRNA, dsRNA, RISC e miRNA.

SISTEMAS INDUZÍVEIS

[0216] Um sistema induzível pode ser usado para inativar um gene CD163. Vários sistemas induzíveis são conhecidos que permitem o controle espacial e temporal da inativação de um gene. Vários provaram ser funcionais in vivo em animais suínos.

[0217] Um exemplo de um sistema induzível é o sistema promotor tetraciclina (tet)-on, que pode ser usado para regular a transcrição do ácido nucleico. Neste sistema, um repressor Tet mutado (TetR) é fundido ao domínio de ativação da proteína transativadora VP 16 do vírus herpes simplex para criar um ativador transcripcional controlado por tetraciclina (tTA), que é regulado por tet ou doxiciclina (dox). Na ausência de antibiótico, a transcrição é mínima,

enquanto na presença de tet ou dox, a transcrição é induzida. Os sistemas induzíveis alternativos incluem os sistemas de ecdisona ou rapamicina. A ecdisona é um hormônio da muda de inseto cuja produção é controlada por um heterodímero do receptor da ecdisona e o produto do gene ultraspiracle (USP).

A expressão é induzida por tratamento com ecdisona ou um análogo da ecdisona, como muristerona A. O agente que é administrado ao animal para desencadear o sistema induzível é referido como um agente de indução.

[0218] O sistema induzível por tetraciclina e o sistema de recombinase Cre/loxP (constitutivo ou induzível) estão entre os sistemas induzíveis mais comumente usados. O sistema induzível por tetraciclina envolve um transativador controlado por tetraciclina (tTA)/ tTA reverso (rtTA).

Um método para usar esses sistemas in vivo envolve a geração de duas linhagens de animais geneticamente editados. Uma linhagem animal expressa o ativador (tTA, rtTA ou Cre recombinase) sob o controle de um promotor selecionado. Outra linhagem de animais expressa o aceptor, no qual a expressão do gene de interesse (ou do gene a ser alterado) está sob o controle da sequência alvo para os transativadores tTA/rtTA (ou é flanqueada por sequências loxP). Cruzar os dois animais fornece controle da expressão do gene.

[0219] Os sistemas reguladores dependentes de tetraciclina (sistemas tet) dependem de dois componentes, ou seja, um transativador controlado por tetraciclina (tTA ou rtTA) e um promotor dependente de tTA/ rtTA que controla a expressão de um cDNA a jusante, em uma forma dependente de tetraciclina. Na ausência de tetraciclina ou seus derivados (como a doxiciclina), o tTA se liga às sequências tetO, permitindo a ativação transcripcional do promotor dependente de tTA. No entanto, na presença de doxiciclina, o tTA não pode interagir com seu alvo e a transcrição não ocorre. O sistema tet que usa tTA é denominado tet-OFF, porque a tetraciclina ou doxiciclina permite a regulação negativa da transcrição. A administração de tetraciclina ou seus derivados permite o controle temporal da expressão do transgene in vivo. O rtTA é uma variante do tTA que não é funcional na ausência de doxiciclina, mas requer a presença do ligante para transativação.

Este sistema tet é, portanto, denominado tet-ON. Os sistemas tet foram usados in vivo para a expressão induzível de vários transgenes, codificando, por exemplo, genes repórter, oncogenes ou proteínas envolvidas em uma cascata de sinalização.

[0220] O sistema Cre/lox usa a recombinase Cre, que catalisa a recombinação sítio-específica por cruzamento entre duas sequências de reconhecimento Cre distantes, isto é, sítios loxP. Uma sequência de DNA introduzida entre as duas sequências loxP (denominado DNA floxed) é excisada por recombinação mediada por Cre. O controle da expressão de Cre em um animal transgênico e/ou com edição genética, usando o controle espacial (com um promotor tecido- ou célula-específico) ou o controle temporal (com um sistema induzível), resulta no controle da excisão de DNA entre os dois sítios loxP. Uma aplicação é para a inativação condicional de genes (knockout condicional). Outra abordagem é para a superexpressão de proteínas, em que um códon de terminação floxed é inserido entre a sequência do promotor e o DNA de interesse. Animais geneticamente editados não expressam o transgene até que Cre seja expresso, levando à excisão do códon de terminação floxed. Esse sistema foi aplicado à oncogênese tecido- específica e à expressão controlada do receptor de antígeno em linfócitos B.

Também foram desenvolvidas recombinases Cre induzíveis. A recombinase Cre induzível é ativada apenas pela administração de um ligante exógeno. As recombinases Cre induzíveis são proteínas de fusão contendo a recombinase Cre original e um domínio de ligação ao ligante específico. A atividade funcional da recombinase Cre é dependente de um ligante externo que é capaz de se ligar a este domínio específico na proteína de fusão.

[0221] Células in vitro, células in vivo ou um animal geneticamente editado, tal como um animal de reprodução que compreende um gene CD163 sob controle de um sistema induzível, podem ser usados. A modificação cromossômica de um animal pode ser genômica ou em mosaico. O sistema induzível pode ser, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em Tet-On, Tet-Off, Cre-lox e Hif1 alfa.

VETORES E ÁCIDOS NUCLÉICOS

[0222] Uma variedade de ácidos nucleicos pode ser introduzida nas células para fins de inativação, para inativação de um gene, para obter a expressão de um gene ou para outros fins. Tal como aqui utilizado, o termo ácido nucleico inclui DNA, RNA e análogos de ácido nucleico e ácidos nucleicos que são de fita dupla ou fita simples (isto é, uma fita simples senso ou uma antisenso). Os análogos de ácido nucleico podem ser modificados na fração de base, fração de açúcar ou estrutura de fosfato para melhorar, por exemplo, a estabilidade, hibridização ou solubilidade do ácido nucleico. As modificações na fração de base incluem desoxiuridina para desoxitimidina e 5- metil-2'-desoxicitidina e 5-bromo-2'-doxicitidina para desoxicitidina. As modificações da fração de açúcar incluem a modificação da hidroxila 2’ do açúcar ribose para formar açúcares 2’-O-metila ou 2’-O-alila. A estrutura de fosfato de desoxirribose pode ser modificada para produzir ácidos nucleicos de morfolino, em que cada fração de base está ligada a um anel de morfolino de seis membros ou ácidos nucleicos de peptídeo, em que a estrutura de desoxifosfato é substituída por uma estrutura de pseudopeptídeo e as quatro bases são retidas. Ver, Summerton e Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7 (3): 187; e Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4: 5. Além disso, a estrutura de desoxifosfato pode ser substituída com, por exemplo, uma estrutura de fosforotioato ou fosforoditioato, uma estrutura fosforoamidita ou uma de alquilfosfotriéster.

[0223] A sequência de ácido nucleico alvo pode ser operacionalmente ligada a uma região regulatória, tal como um promotor. As regiões regulatórias podem ser regiões regulatórias suínas ou podem ser de outras espécies. Tal como aqui utilizado, operacionalmente ligado refere-se ao posicionamento de uma região regulatória em relação a uma sequência de ácido nucleico de modo a permitir ou facilitar a transcrição do ácido nucleico alvo.

[0224] Qualquer tipo de promotor pode ser operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico alvo. Exemplos de promotores incluem, sem limitação, promotores tecido-específicos, promotores constitutivos, promotores induzíveis e promotores responsivos ou não responsivos a um estímulo particular. Os promotores tecido-específicos adequados podem resultar na expressão preferencial de um transcrito de ácido nucleico em células beta e incluem, por exemplo, o promotor de insulina humana. Outros promotores tecido-específicos podem resultar em expressão preferencial em, por exemplo, hepatócitos ou tecido cardíaco e podem incluir os promotores da albumina ou da cadeia pesada da alfa-miosina, respectivamente. Um promotor que facilita a expressão de uma molécula de ácido nucleico sem tecido significativo ou especificidade temporal, pode ser usado (ou seja, um promotor constitutivo). Por exemplo, um promotor de beta- actina, tal como o promotor do gene de beta-actina de frango, promotor de ubiquitina, promotor de miniCAGs, promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou promotor de 3-fosfoglicerato quinase (PGK) pode ser usado, assim como promotores virais, tais como o promotor da timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-TK), o promotor do SV40 ou um promotor do citomegalovírus (CMV). Por exemplo, uma fusão do promotor do gene da beta actina de frango e o potencializador de CMV pode ser usada como um promotor. Ver, por exemplo, Xu et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 563; e Kiwaki et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 821.

[0225] Regiões regulatórias adicionais que podem ser úteis em construtos de ácido nucleico incluem, mas não estão limitados a sequências de poliadenilação, sequências de controle de tradução (por exemplo, um segmento de entrada de ribossomo interno, IRES), potencializadores, elementos induzíveis ou íntrons. Tais regiões regulatórias podem não ser necessárias, embora possam aumentar a expressão afetando a transcrição, estabilidade do mRNA, eficiência de tradução ou semelhantes. Essas regiões regulatórias podem ser incluídas em um construto de ácido nucleico conforme desejado para obter a expressão ideal dos ácidos nucleicos na(s) célula(s).

Expressão suficiente, no entanto, às vezes pode ser obtida sem esses elementos adicionais.

[0226] Um construto de ácido nucleico pode ser usado que codifica peptídeos sinal ou marcadores selecionáveis. Os peptídeos sinal podem ser usados de modo que um polipeptídeo codificado seja direcionado para um local celular específico (por exemplo, a superfície da célula). Exemplos não limitativos de marcadores selecionáveis incluem puromicina, ganciclovir, adenosina desaminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase (neo, G418, APH), dihidrofolato redutase (DHFR), higromicina-B-fosfotransferase, timidina quinase (TK), e xantina-guanina fosforibosiltransferase (XGPRT). Esses marcadores são úteis para selecionar transformantes estáveis em cultura.

Outros marcadores selecionáveis incluem polipeptídeos fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde ou proteína fluorescente amarela.

[0227] Uma sequência que codifica um marcador selecionável pode ser flanqueada por sequências de reconhecimento para uma recombinase, como, por exemplo, Cre ou Flp. Por exemplo, o marcador selecionável pode ser flanqueado por sítios de reconhecimento loxP (sítios de reconhecimento de 34 pb reconhecidos pela recombinase Cre) ou sítios de reconhecimento FRT de modo que o marcador selecionável possa ser excisado do construto. Ver, Orban, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89: 6861, para uma revisão da tecnologia Cre/lox, e Brand e Dymecki, Dev. Cell (2004) 6: 7.

Um transposon contendo um transgene ativável por Cre- ou Flp interrompido por um gene marcador selecionável também pode ser usado para obter animais com expressão condicional de um transgene. Por exemplo, um promotor que direciona a expressão do marcador/ transgene pode ser ubíquo ou tecido-específico, o que resultaria na expressão ubíqua ou tecido-específica do marcador em animais F0 (por exemplo, porcos). A ativação específica de tecido do transgene pode ser realizada, por exemplo, cruzando um porco que expressa de forma ubíqua um transgene interrompido por marcador para um porco que expressa Cre ou Flp de uma maneira tecido-específica, ou cruzando um porco que expressa um transgene interrompido por marcador de uma maneira tecido-específica para um porco que expressa de forma ubíqua a recombinase Cre ou Flp. A expressão controlada do transgene ou excisão controlada do marcador permite a expressão do transgene.

[0228] O ácido nucleico exógeno pode codificar um polipeptídeo.

Uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo pode incluir uma sequência de marcador que codifica um “marcador” projetado para facilitar a manipulação subsequente do polipeptídeo codificado (por exemplo, para facilitar a localização ou detecção). As sequências de marcador podem ser inseridas na sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, de modo que o marcador codificado esteja localizado no terminal carboxila ou amino do polipeptídeo. Exemplos não limitativos de marcadores codificados incluem glutationa S-transferase (GST) e marcador FLAGTM (Kodak, New Haven, Conn.).

[0229] Construtos de ácido nucleico podem ser metilados usando uma SssI CpG metilase (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). Em geral, o construto de ácido nucleico pode ser incubado com S-adenosilmetionina e SssI CpG-metilase em tampão a 37 °C. A hipermetilação pode ser confirmada pela incubação do construto com uma unidade de endonuclease HinP1I por 1 hora a 37 °C e ensaio por eletroforese em gel de agarose.

[0230] Os construtos de ácido nucleico podem ser introduzidos em células animais embrionárias, fetais ou adultas de qualquer tipo, incluindo, por exemplo, células germinativas, tais como um oócito ou um óvulo, uma célula progenitora, uma célula-tronco adulta ou embrionária, uma célula germinativa primordial, uma célula de rim, tal como uma célula PK-15, uma célula de ilhota, uma célula beta, uma célula do fígado ou um fibroblasto, como um fibroblasto dérmico, usando uma variedade de técnicas. Exemplos não limitantes de técnicas incluem o uso de sistemas de transposon, vírus recombinantes que podem infectar células, ou lipossomas ou outros métodos não virais, tais como eletroporação, microinjeção ou precipitação com fosfato de cálcio, que são capazes de entregar ácidos nucleicos às células.

[0231] Em sistemas de transposon, a unidade transcripcional de um construto de ácido nucleico, isto é, a região regulatória operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico exógena, é flanqueada por uma repetição invertida de um transposon. Vários sistemas de transposon, incluindo, por exemplo, Sleeping Beauty (ver, patente U.S. 6.613.752 e publicação U.S. nº 2005/0003542); Frog Prince (Miskey et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 6873); Tol2 (Kawakami (2007) Genome Biology 8 (Suppl.1): S7; Minos (Pavlopoulos et al. (2007) Genome Biology 8 (Suppl.1): S2); Hsmar1 (Miskey et al. (2007)) Mol Cell Biol. 27: 4589); e Passport foram desenvolvidos para introduzir ácidos nucléicos em células, incluindo células de camundongos, humanos e porcos. O transposon de Sleeping Beauty é particularmente útil. Uma transposase pode ser distribuída como uma proteína, codificada no mesmo construto de ácido nucleico que o ácido nucleico exógeno, pode ser introduzida em um construto de ácido nucleico separado ou fornecida como um mRNA (por exemplo, um mRNA transcrito in vitro e coberto).

[0232] Elementos isolantes também podem ser incluídos em um construto de ácido nucleico para manter a expressão do ácido nucleico exógeno e para inibir a transcrição indesejada de genes hospedeiros. Ver, por exemplo, Publicação U.S. 2004/0203158. Normalmente, um elemento isolante flanqueia cada lado da unidade transcripcional e é interno à repetição invertida do transposon. Exemplos não limitativos de elementos isolantes incluem os elementos isolantes do tipo região de fixação da matriz (MAR) e elementos isolantes do tipo borda. Ver, por exemplo, patente U.S. nº

6.395.549, 5.731.178, 6.100.448 e 5.610.053, e publicação U.S. nº 2004/0203158.

[0233] Os ácidos nucleicos podem ser incorporados em vetores.

Um vetor é um termo amplo que inclui qualquer segmento de DNA específico projetado para se mover de um transportador para um DNA alvo. Um vetor pode ser referido como um vetor de expressão ou um sistema de vetor, que é um conjunto de componentes necessários para realizar a inserção de DNA em um genoma ou outra sequência de DNA direcionada, como um epissoma, plasmídeo ou mesmo um segmento de DNA de vírus/ fago. Sistemas de vetores, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus, vírus adeno- associados e vírus de fago integrantes) e vetores não virais (por exemplo, transposons) usados para entrega de genes em animais têm dois componentes básicos: 1) um vetor composto de DNA (ou RNA que é reversamente transcrito em um cDNA) e 2) uma transposase, recombinase ou outra enzima integrase que reconhece o vetor e uma sequência alvo de DNA e insere o vetor na sequência de DNA alvo. Os vetores mais frequentemente contêm um ou mais cassetes de expressão que compreendem uma ou mais sequências de controle de expressão, em que uma sequência de controle de expressão é uma sequência de DNA que controla e regula a transcrição e/ou tradução de outra sequência de DNA ou mRNA, respectivamente.

[0234] Muitos tipos diferentes de vetores são conhecidos. Por exemplo, plasmídeos e vetores virais, por exemplo, vetores retrovirais, são conhecidos. Os plasmídeos de expressão de mamíferos têm tipicamente uma origem de replicação, um promotor adequado e potencializador opcional, sítios de ligação ao ribossomo necessários, um sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceitadores de splice, sequências de terminação transcripcional e sequências não transcritas de flanqueamento 5’. Exemplos de vetores incluem: plasmídeos (que também podem ser um transportador de outro tipo de vetor), adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), lentivírus (por exemplo, HIV-1 modificado, SIV ou FIV), retrovírus (por exemplo, ASV, ALV ou MoMLV) e transposons (por exemplo, Sleeping Beauty, elementos P, Tol-2, Frog Prince, piggyBac).

[0235] Tal como aqui utilizado, o termo ácido nucleico refere-se a RNA e DNA, incluindo, por exemplo, cDNA, DNA genômico, DNA sintético (por exemplo, sintetizado quimicamente), bem como ácidos nucleicos de ocorrência natural e quimicamente modificados, por exemplo, bases sintéticas ou estruturas alternativas. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita dupla ou fita simples (isto é, uma fita simples senso ou uma antisenso).

[0236] Tendo descrito a invenção em detalhes, será evidente que modificações e variações são possíveis sem se afastar do escopo da invenção definido nas reivindicações anexas.

EXEMPLOS

[0237] Os seguintes exemplos não limitativos são fornecidos para ilustrar ainda mais a presente invenção.

EXEMPLO 1: USO DO SISTEMA DE CRISPR/CAS9 PARA PRODUZIR PORCOS

GENETICAMENTE MODIFICADOS A PARTIR DE OÓCITOS E EMBRIÕES DERIVADOS IN VITRO

[0238] Relatórios recentes que descrevem endonucleases teleguiadas, tais como Nuclease Dedo de Zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição (TALENs) e componentes no sistema agrupado repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR)/ (Cas9) associado a CRISPR, sugerem que a engenharia genética (GE) em porcos pode agora ser mais eficiente.

Endonucleases teleguiadas direcionadas podem induzir quebras de fita dupla (DSBs) em locais específicos no genoma e causar mutações aleatórias por meio de união de extremidades não homólogas (NHEJ) ou estimulação de recombinação homóloga (HR) se o DNA doador for fornecido. A modificação direcionada do genoma por meio de HR pode ser alcançada com endonucleases teleguiadas se o DNA doador for fornecido junto com a nuclease direcionada. Após a introdução de modificações específicas nas células somáticas, essas células foram usadas para produzir porcos GE para vários fins via SCNT. Assim, as endonucleases teleguiadas são uma ferramenta útil na geração de porcos GE. Entre as diferentes endonucleases teleguiadas, o sistema de CRISPR/Cas9, adaptado de procariotos onde é usado como um mecanismo de defesa, parece ser uma abordagem eficaz. Na natureza, o sistema Cas9 requer três componentes, um RNA (~ 20 bases) que contém uma região que é complementar à sequência alvo (RNA cis-reprimido [crRNA]), um RNA que contém uma região que é complementar ao crRNA (crRNA transativador [tracrRNA]), e Cas9, o componente de proteína enzimática neste complexo. Um único RNA guia (gRNA) pode ser construído para servir aos papéis do crRNA e tracrRNA emparelhados com base. O complexo gRNA/ proteína pode varrer o genoma e catalisar uma DSB em regiões que são complementares ao crRNA/ gRNA. Ao contrário de outras nucleases projetadas, apenas um oligômero curto precisa ser projetado para construir os reagentes necessários para direcionar um gene de interesse, enquanto uma série de etapas de clonagem são necessárias para montar ZFNs e TALENs.

[0239] Ao contrário dos métodos padrão atuais para a interrupção de gene, o uso de nucleases projetadas oferece a oportunidade de usar zigotos como material de partida para GE. Os métodos padrão para a interrupção de gene em animais de reprodução envolvem HR em células de cultura e subsequente reconstrução de embriões por transferência nuclear de células somáticas (SCNT). Como os animais clonados produzidos por meio ds SCNT às vezes mostram sinais de defeitos de desenvolvimento, a progênie dos fundadores de SCNT/GE é normalmente usada para pesquisas para evitar a confusão de anomalias do SCNT e fenótipo que poderiam ocorrer se os animais fundadores fossem usados para experimentos. Considerando o período de gestação mais longo e os custos de alojamento mais elevados dos porcos em comparação com os roedores, há benefícios de tempo e custo na redução da necessidade de reprodução. Um relatório recente demonstrou que a injeção direta de ZFNs e TALENs em zigotos suínos poderia interromper um gene endógeno e produzir leitões com as mutações desejadas. No entanto, apenas cerca de 10% dos leitões apresentaram modificação bialélica do gene alvo, e alguns apresentaram genótipos em mosaico. Um artigo recente demonstrou que o sistema de CRISPR/Cas9 pôde induzir mutações em embriões em desenvolvimento e produzir porcos GE com uma eficiência mais alta do que ZFNs ou TALENs. No entanto, porcos GE produzidos a partir do sistema de CRISPR/Cas9 também possuíam genótipos em mosaico. Além disso, todos os estudos acima mencionados usaram zigotos derivados in vivo para os experimentos, que requerem trabalho intensivo e numerosas porcas para obter um número suficiente de zigotos.

[0240] O presente exemplo descreve uma abordagem eficiente para usar o sistema de CRISPR/Cas9 na geração de porcos GE por meio de injeção de zigotos derivados in vitro e modificação de células somáticas seguida por SCNT. Dois genes endógenos (CD163 e CD1D) e um transgene (eGFP) foram direcionados, e apenas oócitos ou zigotos derivados in vitro foram usados para injeções de SCNT ou RNA, respectivamente. O CD163 parece ser necessário para a infecção produtiva pelo vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos, um vírus conhecido por causar uma perda econômica significativa para a indústria suína. CD1D é considerada uma proteína do complexo principal de histocompatibilidade não clássica e está envolvida na apresentação de antígenos lipídicos para células T natural killer invariantes. Porcos deficientes nesses genes foram projetados para serem modelos para a agricultura e a biomedicina. O transgene eGFP foi usado como um alvo para experimentos preliminares de prova de conceito e otimizações de métodos.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0241] Produto químico e reagentes. Salvo indicação em contrário, todos os produtos químicos usados neste estudo foram adquiridos da Sigma.

PROJETO DE GRNAS PARA CONSTRUIR CRISPRS ESPECÍFICOS

[0242] Os RNAs guia foram projetados para regiões dentro do éxon 7 de CD163 que eram exclusivas para o CD163 de tipo selvagem e não estavam presentes no vetor de direcionamento de troca de domínio (descrito abaixo), de modo que o CRISPR resultaria em DSB dentro do CD163 de tipo selvagem, mas não no vetor de direcionamento de troca de domínio. Havia apenas quatro locais em que o vetor de direcionamento introduziria um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) que alteraria um motivo adjacente do protoespaçador (PAM) de S. pyogenes (Spy). Todos os quatro alvos foram selecionados, incluindo: (SEQ ID NO: 1) GGAAACCCAGGCTGGTTGGAgGG (CRISPR 10), (SEQ ID NO: 2) GGAACTACAGTGCGGCACTGtGG (CRISPR 131), (SEQ ID NO: 3) CAGTAGCACCCCGCCCTGACgGG (CRISPR 256) e (SEQ ID NO: 4) TGTAGCCACAGCAGGGACGTcGG (CRISPR 282).

[0243] O PAM pode ser identificado pela fonte em negrito em cada gRNA.

[0244] Para mutações CD1D, a busca por alvos CRISPR foi arbitrariamente limitada à fita de codificação dentro dos primeiros 1000 pb da transcrição primária. No entanto, RepeatMasker [26] (biblioteca de repetição “Pig”) identificou um elemento repetitivo começando na base 943 da transcrição primária. A busca por alvos CRISPR foi então limitada aos primeiros 942 pb da transcrição primária. A busca foi ainda limitada aos primeiros 873 pb da transcrição primária, uma vez que o último Spy PAM está localizado na base

873. O primeiro alvo (CRISPR 4800) foi selecionado porque se sobrepôs ao códon de iniciação localizado na base 42 na transcrição primária (CCAGCCTCGCCCAGCGACATgGG (SEQ ID NO: 5)). Dois alvos adicionais (CRISPRs 5620 e 5626) foram selecionados porque eram os mais distais à primeira seleção dentro da região selecionada arbitrariamente (CTTTCATTTATCTGAACTCAgGG (SEQ ID NO: 6)) e TTATCTGAACTCAGGGTCCCcGG (SEQ ID NO: 7)). Esses alvos se sobrepõem. Em relação ao códon de iniciação, os Spy PAMs mais proximais estavam localizados em uma sequência simples que continha uma sequência extensivamente homopolimérica determinada por avaliação visual. O quarto alvo (CRISPR 5350) foi selecionado porque, em relação à seleção do primeiro alvo, era o alvo mais proximal que não continha regiões homopoliméricas extensas (CAGCTGCAGCATATATTTAAgGG (SEQ ID NO: 8)). A especificidade dos crRNAs projetados foi confirmada pela pesquisa de sequências suínas semelhantes no GenBank. Os oligonucleotídeos (Tabela 2) foram recombinados em baixa temperatura e clonados no vetor p330X que contém dois cassetes de expressão, um Cas9 de S. pyogenes otimizado para códons humanos (hSpy) e o RNA guia quimérico. O P330X foi digerido com BbsI (New England Biolabs) seguindo o protocolo do laboratório Zhang (http://www.addgene.org/crispr/zhang/).

[0245] Para atingir eGFP, dois gRNAs específicos direcionados à sequência de codificação de eGFP foram projetados dentro dos primeiros 60 pb do códon de iniciação de eGFP. Ambos gRNA eGFP1 e eGFP2 estavam na fita antisenso e eGFP1 direcionava diretamente o códon de iniciação. A sequência de gRNA de eGFP1 era CTCCTCGCCCTTGCTCACCAtGG (SEQ ID NO: 9) e a sequência de gRNA de eGFP2 era GACCAGGATGGGCACCACCCcGG (SEQ ID NO: 10).

TABELA 1. CRRNAS PROJETADOS

[0246] O Iniciador 1 e o Iniciador 2 foram recombinados em baixa temperatura seguindo o protocolo de Zhang. Iniciador Sequência (5’ - 3’) SEQ ID NO. CD163 10 1 CACCGGAAACCCAGGCTGGTTGGA 48 CD163 10 2 AAACTCCAACCAGCCTGGGTTTCC 49 CD163 131 1 CACCGGAACTACAGTGCGGCACTG 50 CD163 131 2 AAACCAGTGCCGCACTGTAGTTCC 51 CD163 256 1 CACCGCAGTAGCACCCCGCCCTGAC 52 CD163 256 2 AAACGTCAGGGCGGGGTGCTACTGC 53 CD163 282 1 CACCGTGTAGCCACAGCAGGGACGT 54 CD163 282 2 AAACACGTCCCTGCTGTGGCTACAC 55 CD1D 4800 1 CACCGCCAGCCTCGCCCAGCGACAT 56 CD1D 4800 2 AAACATGTCGCTGGGCGAGGCTGGC 57 CD1D 5350 1 CACCGCAGCTGCAGCATATATTTAA 58 CD1D 5350 2 AAACTTAAATATATGCTGCAGCTGC 59 CD1D 5620 1 CACCGCTTTCATTTATCTGAACTCA 60 CD1D 5620 2 AAACTGAGTTCAGATAAATGAAAGC 61 CD1D 5626 1 CACCGTTATCTGAACTCAGGGTCCC 62 CD1D 5626 2 AAACGGGACCCTGAGTTCAGATAAC 63

Iniciador Sequência (5’ - 3’) SEQ ID NO. eGFP 1 1 CACCGCTCCTCGCCCTTGCTCACCA 64 eGFP 1 2 AAACTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC 65 eGFP 2 1 CACCGGACCAGGATGGGCACCACCC 66 eGFP 2 2 AAACGGGTGGTGCCCATCCTGGTCC 67 SÍNTESE DE DNA DOADOR PARA OS GENES CD163 E CD1D

[0247] Tanto o CD163 como o CD1D suínos foram amplificados por PCR a partir de DNA isolado dos fibroblastos fetais que seriam usados para transfecções posteriores para garantir uma correspondência isogênica entre o vetor de direcionamento e a linhagem celular transfectada. Resumidamente, LA taq (Clontech) usando o iniciador direto CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT (SEQ ID NO: 11) e o iniciador reverso TATTTCTCTCACATGGCCAGTC (SEQ ID NO: 12) foram usados para amplificar um fragmento de 9538 pb de CD163.

O fragmento foi validado por sequência de DNA e usado para construir o vetor de direcionamento de troca de domínio (Figura 1). Este vetor incluiu 33 mutações pontuais dentro do éxon 7 de modo que codificasse a mesma sequência de aminoácidos que o CD163L humano do éxon 11. O éxon de substituição tinha 315 pb. Além disso, o íntron subsequente foi substituído com um íntron B de miostatina modificado que alojava um gene marcador selecionável que poderia ser removido com recombinase Cre (Cre) e havia demonstrado anteriormente splicing normal ao abrigar o sítio loxP retido (Wells, resultados não publicados). O braço longo do construto tinha 3469 pb e incluía o éxon de DS de troca de domínio. O braço curto tinha 1578 pb e incluía os éxons 7 e 8 (Figura 1, painel B). Este plasmídeo foi usado para tentar substituir a região codificadora do éxon 7 nos primeiros experimentos de transfecção e permitiu a seleção de eventos de direcionamento através do marcador selecionável (G418). Se o direcionamento ocorresse, o marcador poderia ser deletado pela recombinase Cre. O vetor de direcionamento CD163 DS foi então modificado para uso com linhagens celulares que já continham um gene

SIGLEC1 interrompido com Neo que não podia ser deletado por Cre. Neste vetor de direcionamento, o cassete Neo, loxP e íntron B de miostatina, foram removidos e apenas o éxon DS permaneceu com o braço longo e curto WT (Figura 1, painel C).

[0248] A sequência genômica para CD1D suíno foi amplificada com LA taq usando o iniciador direto CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT (SEQ ID NO: 13) e o iniciador reverso GACTGGCCATGTGAGAGAAATA (SEQ ID NO: 14), resultando em um fragmento de 8729 pb. O fragmento foi sequenciado por DNA e usado para construir o vetor de direcionamento mostrado na Figura 2. O cassete Neo está sob o controle de um promotor de fosfoglicerol quinase (PGK) e flanqueado com sequências loxP, que foram introduzidas para seleção. O braço longo do construto tinha 4832 pb e o braço curto tinha 3563 pb, e incluía os éxons 6 e 7. Se a HR bem-sucedida ocorresse, os éxons 3, 4 e 5 seriam removidos e substituídos com o cassete Neo. Se o reparo do NHEJ ocorresse incorretamente, então o éxon 3 seria interrompido.

COLETA DE FIBROBLASTOS FETAIS

[0249] Tecido fetal suíno foi coletado no dia 35 de gestação para criar linhagens celulares. Duas linhagens celulares de fibroblastos fetais masculinos e femininos de tipo selvagem (WT) foram estabelecidas a partir de um grande cruzamento doméstico branco. Fibroblastos fetais masculinos e femininos que foram previamente modificados para conter um cassete Neo (genética SIGLEC1 -/-) também foram usados nesses estudos. Fibroblastos fetais foram coletados conforme descrito com pequenas modificações; tecido picado de cada feto foi digerido em 20 ml de meio de digestão (meio Eagle modificado por Dulbecco [DMEM] contendo L-glutamina e 1 g/l de D-glicose [Cellgro] suplementado com 200 unidades/ml de colagenase e 25 unidades Kunitz/ ml DNAseI) durante 5 horas a 38,5 °C. Após a digestão, as células de fibroblastos fetais foram lavadas e cultivadas com DMEM, 15% de soro fetal bovino (FBS) e 40 µg/ml de gentamicina. Após cultura de um dia para outro, as células foram tripsinizadas e congeladas a -80 °C em alíquotas em FBS com 10% de dimetilsulfóxido e armazenadas em nitrogênio líquido.

TRANSFECÇÃO CELULAR E GENOTIPAGEM

[0250] As condições de transfecção foram essencialmente conforme relatado anteriormente. O DNA doador foi sempre usado em uma quantidade constante de 1 µg com quantidades variáveis de plasmídeo CRISPR/Cas9 (listado abaixo). O DNA doador foi linearizado com MLUI (CD163) (NEB) ou AFLII (CD1D) (NEB) antes da transfecção. O sexo das linhagens celulares estabelecidas foi determinado por PCR, conforme descrito anteriormente, antes da transfecção. Ambas as linhagens celulares masculinas e femininas foram transfectadas e os dados de modificação do genoma foram analisados em conjunto entre as transfecções. Linhagens celulares de fibroblastos fetais com número de passagem semelhante (2-4) foram cultivadas por 2 dias e crescidas até 75%-85% de confluência em DMEM contendo L- glutamina e 1 g/l D-glicose (Cellgro) suplementado com 15% de FBS, 2,5 ng/ml de fator de crescimento de fibroblasto básico e 10 mg/ ml de gentamicina. As células de fibroblastos foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Life Technologies) e tripsinizadas. Assim que as células se destacaram, as células foram enxaguadas com um meio de eletroporação (75% de citosais [KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4 10 mM, pH 7,6, MgCl2 5 Mm]) e 25% de Opti-MEM (LifeTechnologies). A concentração celular foi quantificada por meio de um hemocitômetro. As células foram peletizadas a 600 x g durante 5 minutos e ressuspensas a uma concentração de 1 x 10 6 em meio de eletroporação. Cada eletroporação usou 200 µl de células em cubetas de lacuna de 2 mm com três (1 mseg) pulsos de onda quadrada administrados através de um BTX ECM 2001 a 250 V. Após a eletroporação, as células foram ressuspensas em DMEM descrito acima. Para a seleção, 600 µg/ml de G418 (Life Technologies) foram adicionados 24 horas após a transfecção e o meio foi trocado no Dia 7. As colônias foram coletadas no Dia 14 após a transfecção.

Fibroblastos fetais foram colocados em placas a 10.000 células/ placa se a seleção de G418 foi usada e a 50 células/ placa se nenhuma seleção de G418 foi usada. Colônias de fibroblasto fetal foram coletadas aplicando cilindros de clonagem autoclavados de 10 mm vedados ao redor de cada colônia por graxa autoclavada a vácuo. As colônias foram enxaguadas com PBS e colhidas via tripsina; então ressuspensas em meio de cultura DMEM. Uma parte (1/3) da colônia ressuspensa foi transferida para uma placa de PCR de 96 poços, e as células restantes (2/3) foram cultivadas em um poço de uma placa de 24 poços. Os péletes celulares foram ressuspensos em 6 µl de tampão de lise (Tris 40 mM, pH 8,9, 0,9% de Triton X-100, 0,4 mg/ml de proteinase K [NEB]), incubados a 65 °C por 30 minutos para lise celular, seguido por 85 °C por 10 minutos para inativar a proteinase K.

TRIAGEM DE PCR PARA DS E GRANDES E PEQUENAS DELEÇÕES

[0251] Detecção de reparo dirigido por HR. PCRs de longo alcance foram usadas para identificar mutações em CD163 ou CD1D. Três ensaios de PCR diferentes foram usados para identificar eventos de HR: amplificação por PCR de regiões abrangendo desde as sequências de CD163 ou CD1D no DNA doador até as sequências endógenas de CD163 ou CD1D no lado direito ou esquerdo e uma PCR de longo alcance que amplificou grandes regiões de CD163 ou CD1D abrangendo os DNAs doadores projetados. Um aumento no tamanho de um produto de PCR, seja 1,8 kb (CD1D) ou 3,5 kb (CD163), decorrente da adição de sequências de Neo exógenas, foi considerado evidência de reparo dirigido por HR dos genes. Todas as condições de PCR incluíram uma desnaturação inicial de 95 °C por 2 minutos seguida de 33 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 50 °C e 7-10 minutos a 68 °C. LA taq foi usado para todos os ensaios seguindo as recomendações dos fabricantes. Os iniciadores são mostrados na Tabela 2.

TABELA 2. INICIADORES USADOS PARA IDENTIFICAR O REPARO DIRIGIDO POR HR DE CD163 E CD1D Iniciador Sequência (5’ - 3’) SEQ ID NO. Iniciador de Ensaio de Longo 68 Alcance CD163 1230F TTGTTGGAAGGCTCACTGTCCTTG Iniciador de Ensaio de Longo 69 Alcance CD163 7775 R ACAACTAAGGTGGGGCAAAG Iniciador de Ensaio de Braço 70 Esquerdo CD163 1230 F TTGTTGGAAGGCTCACTGTCCTTG Iniciador de Ensaio de Braço 71 Esquerdo CD163 8491 R GGAGCTCAACATTCTTGGGTCCT Iniciador de Ensaio de Braço 72 Direito CD163 3752 F GGCAAAATTTTCATGCTGAGGTG Iniciador de Ensaio de Braço 73 Direito CD163 7765 R GCACATCACTTCGGGTTACAGTG Iniciador de Ensaio de Longo 74 Alcance CD1D F 3991 F CCCAAGTATCTTCAGTTCTGCAG Iniciador de Ensaio de Longo 75 Alcance CD1D R 12806 R TACAGGTAGGAGAGCCTGTTTTG Iniciador de Ensaio de Braço 76 Esquerdo CD1D F 3991 F CCCAAGTATCTTCAGTTCTGCAG Iniciador de Ensaio de Braço 77 Esquerdo CD1D 7373 R CTCAAAAGGATGTAAACCCTGGA Iniciador de Ensaio de Braço 78 Direito CD1D 4363 F TGTTGATGTGGTTTGTTTGCCC Iniciador de Ensaio de Braço 79 Direito CD1D 12806 R TACAGGTAGGAGAGCCTGTTTTG

[0252] Ensaio de pequenas deleções (NHEJ). Pequenas deleções foram determinadas por amplificação por PCR de CD163 ou CD1D flanqueando um sítio de corte projetado introduzido pelo sistema de CRISPR/Cas9. O tamanho dos amplicons foi de 435 pb e 1244 pb para CD163 e CD1D, respectivamente. Os lisados de embriões e fibroblastos fetais foram amplificados por PCR com LA taq. As condições de PCR dos ensaios foram uma desnaturação inicial de 95 °C durante 2 minutos seguida por 33 ciclos de

30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 56 °C e 1 minuto a 72 °C. Para a genotipagem das células transfectadas, inserções e deleções (INDELs) foram identificadas separando os amplicons de PCR por eletroforese em gel de agarose. Para a genotipagem de embriões, os produtos de PCR resultantes foram subsequentemente sequenciados por DNA para identificar pequenas deleções usando iniciadores diretos usados na PCR. As informações do iniciador são mostradas na Tabela 3.

TABELA 3. INICIADORES USADOS PARA IDENTIFICAR MUTAÇÕES POR MEIO DE NHEJ EM CD163 E CD1D Iniciador Sequência (5’ - 3’) SEQ ID NO. GCD163F GGAGGTCTAGAATCGGCTAAGCC 80 GCD163R GGCTACATGTCCCGTCAGGG 81 GCD1DF GCAGGCCACTAGGCAGATGAA 82 GCD1DR GAGCTGACACCCAAGAAGTTCCT 83 eGFP1 GGCTCTAGAGCCTCTGCTAACC 84 eGFP2 GGACTTGAAGAAGTCGTGCTGC 85 TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULAS SOMÁTICAS (SCNT)

[0253] Para produzir embriões de SCNT, foram usados oócitos derivados de porcas (ART, Inc.) ou oócitos derivados de leitoa de um matadouro local. Os oócitos derivados de porca foram transportados de um dia para outro em meio de maturação (TCM-199 com Hepes 2,9 mM, 5 µg/ml de insulina, 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico [EGF], 0,5µg/ml de hormônio folículo-estimulante de suíno [p-FSH], piruvato 0,91 mM, cisteína 0,5 mM, fluido folicular suíno a 10% e 25 ng/ml de gentamicina) e transferidos para meio fresco após 24 horas. Após 40-42 horas de maturação, as células de cúmulos foram removidas dos oócitos por vórtex na presença de hialuronidase a 0,1%. Os oócitos derivados de leitoas foram maturados conforme descrito abaixo para fertilização in vitro (IVF). Durante a manipulação, os oócitos foram colocados no meio de manipulação (TCM-199 [Life Technologies] com NaHCO3 0,6 mM, Hepes 2,9 mM, NaCl 30 mM, 10 ng/ml de gentamicina e 3 mg/ml de BSA, com osmolaridade de 305 mOsm) suplementado com 7,0 µg/ml de citocalasina B. O corpo polar juntamente com uma porção do citoplasma adjacente, presumivelmente contendo a placa metafásica II, foi removido e uma célula doadora foi colocada no espaço perivitelino usando um capilar de vidro fino. Os embriões reconstruídos foram então fundidos em um meio de fusão (manitol 0,3 M, CaCl2 0,1 mM, MgCl2 0,1 mM e Hepes 0,5 mM) com dois pulsos de CC (intervalo de 1 segundo) a 1,2 kV/cm por 30 segundos usando um BTX Eletro Cell Manipulator (Harvard Apparatus). Após a fusão, os embriões fundidos foram totalmente ativados com timerosal 200 μM por 10 minutos no escuro e ditiotreitol 8 mM por 30 minutos. Os embriões foram então incubados em meio de zigoto suíno modificado PZM3-MU1 com Scriptaid 0,5 μM (S7817; Sigma-Aldrich), um inibidor de histona desacetilase, por 14-16 horas, conforme descrito anteriormente.

FERTILIZAÇÃO IN VITRO (IVF)

[0254] Para IVF, ovários de leitoas pré-púberes foram obtidos de um matadouro (Farmland Foods Inc.). Oócitos imaturos foram aspirados de folículos de tamanho médio (3-6 mm) usando uma agulha hipodérmica de calibre 18 acoplada a uma seringa de 10ml. Oócitos com citoplasma uniformemente escuro e células de cúmulos circundantes intactas foram então selecionados para maturação. Cerca de 50 complexos de oócitos de cúmulos foram colocados em um poço contendo 500µl de meio de maturação, TCM-199 (Invitrogen) com glicose 3,05 mM, piruvato de sódio 0,91 mM, cisteína 0,57 mM, 10 ng/ml de EGF, 0,5 µg/ml de hormônio luteinizante (LH), 0,5 µg/ml de FSH, 10 ng/ml de gentamicina (APP Pharm) e álcool polivinílico a 0,1% por 42 a 44 horas a 38,5 °C, 5% de CO2, em ar umidificado. No final da maturação, as células de cúmulos circundantes foram removidas dos oócitos por vórtex durante 3 minutos na presença de hialuronidase a 0,1%. Em seguida, os oócitos maturados in vitro foram colocados em gotículas de 50µl de meio IVF

(meio tamponado com Tris modificado contendo NaCl 113,1 mM, KCl 3 mM, CaCl2 7,5 mM, glicose 11 mM, Tris 20 mM, cafeína 2 mM, piruvato de sódio 5 mM e 2 mg/ml de albumina sérica bovina [BSA]) em grupos de 25 a 30 oócitos.

Um pélete de sêmen congelado de 100 µl foi descongelado em 3 ml de Dulbecco PBS suplementado com BSA a 0,1%. Tanto o sêmen WT congelado quanto o sêmen eGFP fresco foi lavado em Percoll a 60% por 20 minutos a 650 3 g e em meio tamponado com Tris modificado por 10 minutos por centrifugação. Em alguns casos, o sêmen recém-coletado heterozigoto para um transgene eGFP descrito anteriormente foi lavado três vezes em PBS. O pélete de sêmen foi então ressuspenso com meio IVF a 0,5 x 10 6 células/ml.

Cinquenta microlitros da suspensão de sêmen foram introduzidos nas gotículas com oócitos. Os gametas foram co-incubados por 5 horas a 38,5 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 em ar. Após a fertilização, os embriões foram incubados em PZM3-MU1 a 38,5 °C e 5% de CO2 em ar.

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO

[0255] Os embriões gerados para produzir porcos GE CD163 ou CD1D foram transferidos para portadoras no Dia 1 (SCNT) ou 6 (zigoto injetado) após o primeiro estro permanente. Para a transferência do Dia 6, os zigotos foram cultivados por cinco dias adicionais em PZM3-MU1 na presença de 10 ng/ml de ps48 (Stemgent, Inc.). Os embriões foram transferidos cirurgicamente para a junção ampular-ístérmica do oviduto da portadora.

SÍNTESE IN VITRO DE RNA PARA SISTEMA DE CRISPR/CAS9

[0256] O DNA molde para a transcrição in vitro foi amplificado usando PCR (Tabela 4). O plasmídeo CRISPR/Cas9 usado para experimentos de transfecção de células serviu como molde para o PCR. A fim de expressar o Cas9 nos zigotos, o kit mMESSAGE mMACHINE Ultra (Ambion) foi usado para produzir mRNA de Cas9. Em seguida, um sinal poli A foi adicionado ao mRNA Cas9 usando um kit de resíduo Poly (A) (Ambion). Os RNAs guia CRISPR foram produzidos por MEGAshortscript (Ambion). A qualidade dos RNAs sintetizados foi visualizada em um gel de agarose a 1,5% e, em seguida, diluídos para uma concentração final de 10 ng/μl (ambos gRNA e Cas9) e distribuídos em alíquotas de 3 μl.

TABELA 4. INICIADORES USADOS PARA AMPLIFICAR MOLDES PARA TRANSCRIÇÃO IN

VITRO Iniciadores Sequência (5’ - 3’) SEQ ID NO. Cas9 F: TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC 86 R: GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC 87 eGFP 1 F: TTAATACGACTCACTATAGGCTCCTCGCCCTTGCTCACCA 88 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 89 CD163 10 F: TTAATACGACTCACTATAGGAAACCCAGGCTGGTTGGA 90 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 91 CD163 131 F: TTAATACGACTCACTATAGGAACTACAGTGCGGCACTG 92 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 93 CD1D 4800 F: TTAATACGACTCACTATAGGCCAGCCTCGCCCAGCGACAT 94 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 95 CD1D 5350 F: TTAATACGACTCACTATAGGCAGCTGCAGCATATATTTAA 96 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 97 MICROINJEÇÃO DO SISTEMA DE CRISPR/CAS9 PROJETADO EM ZIGOTOS

[0257] O RNA mensageiro que codifica para Cas9 e gRNA foi injetado no citoplasma de oócitos fertilizados 14 horas após a fertilização (zigotos presumíveis) usando um microinjetor FemtoJet (Eppendorf). A microinjeção foi realizada em meio de manipulação na platina aquecida de um microscópio invertido Nikon (Nikon Corporation; Tóquio, Japão). Os zigotos injetados foram então transferidos para o PZM3-MU1 com 10 ng/ml de ps48 até uso posterior.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[0258] O número de colônias com um genoma modificado foi classificado como 1, e as colônias sem uma modificação do genoma foram classificadas como 0. As diferenças foram determinadas usando PROC GLM (SAS) com um valor P de 0,05 sendo considerado como significativo. As médias foram calculadas como médias de quadrados mínimos. Os dados são apresentados como médias numéricas ± SEM.

RESULTADOS INATIVAÇÃO MEDIADA POR CRISPR/CAS9 DE CD163 E CD1D EM CÉLULAS

SOMÁTICAS

[0259] A eficiência de quatro plasmídeos CRISPRs diferentes (guias 10, 131, 256 e 282) direcionados a CD163 foi testada a uma quantidade de 2 µg/µl de DNA doador (Tabela 5). CRISPR 282 resultou em formação de colônias significativamente mais média do que os tratamentos CRISPR 10 e 256 (P < 0,05). A partir do ensaio de PCR de longo alcance descrito acima, grandes deleções foram encontradas variando de 503 pb a tanto quanto 1506 pb em vez de um DS a HR como foi originalmente planejado (Figura 3, painel A). Isso não era esperado porque relatórios anteriores com outros sistemas de edição de DNA mostraram deleções muito menores de 6-333 pb usando ZFN em porcos. CRISPR 10 e uma mistura de todos os quatro CRISPRs resultou em um maior número de colônias com um genoma modificado do que CRISPR 256 e 282 (Tabela 5, P < 0,002). A transfecção com CRISPR 10 e um plasmídeo contendo Neo, mas sem homologia com CD163, resultou em nenhuma colônia apresentando a grande deleção. Curiosamente, uma deleção monoalélica também foi detectada quando o DNA doador foi introduzido sem qualquer CRISPR. Este ensaio provavelmente representa uma subestimação da taxa de mutação porque quaisquer pequenas deleções potenciais por sequenciamento que não puderam ser detectadas em um gel de agarose nas células somáticas transfectadas não foram triadas.

TABELA 5. EFICIÊNCIA DE QUATRO PLASMÍDEOS CRISPR DIFERENTES (GUIAS 10, 131, 256 E 282) DIRECIONADOS A CD163.

[0260] Quatro CRISPRs diferentes foram testados em uma quantidade de 2 μg a 1 μg de DNA doador (mostrado na Figura 1).

Percentual Nº Nº médio Nº total Nº de Colônia de colônias total de Tratamento * de colônias com com um Reps de colônias/ colônias NHEJ HR genoma placas placa † modificado † 10+DNA doador 76 102 0,75bc 11 1‡ 15,79a 4 131+DNA doador 102 51 2,00ab 11 0 10,78ab 3 256+DNA doador 43 49 0,88c 2 0 4,65bc 3 282+DNA doador 109 46 2,37a 3 0 2,75bc 3 Mistura de 111 55 2,02ab 20 0 18,02a 3 4+DNA doador DNA doador 48 52 0,92bc 1 0 2,08bc 3 10 + Neo (sem 26 20 1,3n/a 0 0 0,00c 1 CD163)

[0261] * A mistura de 4 + DNA doador representa uma mistura igual de 0,5 μg de cada CRISPR com 1 μg de DNA doador. O tratamento com DNA doador serviu como o controle sem CRISPR e o tratamento com 10 + Neo ilustra que as grandes deleções observadas nos tratamentos com CRISPR estavam presentes apenas quando o DNA doador CD163 também estava presente.

[0262] † ANOVA foi realizada comparando o número médio de colônias/ placa para estimar a toxicidade CRISPR e na porcentagem de colônias com um genoma modificado. Os valores de P foram 0,025 e 0,0002, respectivamente. n/a = Não houve replicatas para este tratamento, portanto, nenhuma análise estatística foi realizada.

[0263] ‡ A única colônia com HR representa um evento parcial de HR.

[0264] a-c Letras sobrescritas indicam uma diferença significativa entre os tratamentos para o número médio de colônias/ placa e porcentagem de colônias com um genoma modificado (P <0,05).

[0265] O objetivo inicial era obter um evento de direcionamento de troca de domínio (DS) por HR para CD163, mas os CRISPRs não aumentaram a eficiência de direcionamento de CD163. Deve-se notar que várias combinações deste vetor de direcionamento foram usadas para modificar CD163 por HR por transfecções tradicionais e resultou em 0 eventos de direcionamento após a triagem de 3399 colônias (Whitworth e Prather, resultados não publicados). Dois porcos foram obtidos com um DS completo resultante de HR que continha todas as 33 mutações que foram tentadas a serem introduzidas por transfecção com CRISPR 10 e o vetor de direcionamento de DS como DNA doador.

[0266] Em seguida, a eficiência de mutações induzidas por CRISPR/Cas9 sem seleção de droga foi testada; a linhagem celular de fibroblasto fetal usada neste estudo já tinha uma integração do cassete Neo resistente e uma inativação de SIGLEC1. Também foi testado se a razão de CRISPR/Cas9 e DNA doador aumentaria a modificação do genoma ou resultaria em um efeito tóxico em uma concentração elevada. O CRISPR 131 foi selecionado para este ensaio porque, no experimento anterior, resultou em um alto número de colônias totais e um aumento na porcentagem de colônias possuindo um genoma modificado. Quantidades crescentes de DNA CRISPR 131 de 3:1 a 20:1 não tiveram um efeito significativo na capacidade de sobrevivência do fibroblasto fetal. A porcentagem de colônias com um genoma modificado por NHEJ não foi significativamente diferente entre as várias concentrações de CRISPR, mas teve o maior número de NHEJ em uma razão de 10:1 (Tabela 6, P = 0,33). Mesmo na razão mais alta de DNA CRISPR para DNA doador (20:1), HR não foi observado.

TABELA 6. EFICIÊNCIA DE MUTAÇÕES INDUZIDAS POR CRISPR/CAS9 SEM SELEÇÃO DE DROGAS.

[0267] Quatro razões diferentes de DNA doador para DNA de CRISPR 131 foram comparadas em uma linhagem celular previamente modificada sem o uso da seleção G418.

Razão Número Número Percentual Percentual Número Número Colônia de DNA médio de de de de de de com Reps doador: colônias colônias colônias colônias Placas colônias HR CRISPR / placas NHEJ com NHEJ com HR 1:0 30 79 2,6 1 1,3a 0 0,0 2 1:3 30 84 2,8 1 1,2a 0 0,0 2 1:5 27 76 2,8 2 2,6a 0 0,0 2 1:10 32 63 2,0 5 7,9a 0 0,0 2 1:20 35 77 2,2 3 3,9a 0 0,0 2

[0268] a Diferença significativa entre os tratamentos para o percentual de colônias com reparo de NHEJ (P > 0,05).

[0269] b Não houve diferença significativa no número de colônias modificadas pelo genoma com o aumento da concentração de CRISPR (P > 0,33).

[0270] Com base neste experimento, a interrupção direcionada de CD1D em células somáticas foi tentada. Quatro CRISPRs diferentes foram projetados e testados em células masculinas e femininas. As modificações de CD1D puderam ser detectadas a partir de três dos CRISPRs aplicados, mas o uso de CRISPR 5350 não resultou na modificação de CD1D com uma deleção grande o suficiente para se detectar por eletroforese em gel de agarose (Tabela 7). Curiosamente, nenhuma alteração genética foi obtida por meio de HR, embora o DNA doador tenha sido fornecido. No entanto, grandes deleções semelhantes aos experimentos de inativação de CD163 foram observadas (Figura 3, painel B). Nenhuma modificação direcionada de CD1D com uma grande deleção foi detectada quando CRISPR/Cas9 não foi usado com o DNA doador. A modificação de CD1D a partir de direcionamento guiado por CRISPR/Cas9 foi 4/121 e 3/28 em colônias de células masculinas e femininas,

respectivamente. Apenas INDELs detectáveis por eletroforese em gel de agarose foram incluídos nos dados de transfecção.

TABELA 7. QUATRO CRISPRS DIFERENTES FORAM TESTADOS EM UMA QUANTIDADE DE 2 ΜG A 1 ΜG DE DNA DOADOR (MOSTRADO NA FIGURA 2).

[0271] O tratamento de DNA doador serviu como o controle sem CRISPR.

Número total Sexo Tratamento de colônias INDEL Eficiência (%) Masculino 4800 +DNA doador 29 2 6,9 Masculino 5350+DNA doador 20 0 0 Masculino 5620+DNA doador 43 1 2,33 Masculino 5626+DNA doador 29 2 6,9 Masculino DNA doador 28 0 0 Feminino 4800 +DNA doador 2 0 0 Feminino 5350+DNA doador 8 0 0 Feminino 5620+DNA doador 10 0 0 Feminino 5626+DNA doador 8 3 37,5 Feminino DNA doador 7 0 0 PRODUÇÃO DE PORCOS CD163 E CD1D POR MEIO DE SCNT USANDO CÉLULAS GE

[0272] As células que apresentam modificação de CD163 ou CD1D foram usadas para SCNT para produzir porcos knockout CD163 e CD1D (Figura 3). Sete transferências de embriões (CD163 Tabela 8), seis transferências de embriões (CD163-sem Neo) e cinco transferências de embriões (CD1D) em leitoas receptoras foram realizadas com embriões de SCNT de fibroblastos fetais masculinos e femininos transfectados com sistemas de CRISPR/Cas9. Seis (CD163), duas (CD163-sem Neo) e quatro (CD1D) (Tabela 9) das leitoas receptoras permaneceram grávidas o termo, resultando em taxas de gravidez de 85,7%, 33,3% e 80%, respectivamente.

Das receptoras de CD163, cinco deram à luz leitões saudáveis por cesariana.

Uma (O044) pariu naturalmente. O tamanho da ninhada variou de um a oito.

Quatro porcos foram sacrificados por causa da deficiência de desenvolvimento após o nascimento. Um leitão foi sacrificado devido a uma grave fenda palatina. Todos os leitões restantes parecem saudáveis (Figura 3, painel C).

Duas ninhadas de leitões machos resultantes de fibroblastos fetais transfectados com CRISPR 10 e DNA doador descrito na Figura 3, o painel B tinha uma deleção de 30 pb no éxon 7 adjacente a CRISPR 10 e uma deleção adicional de 1476 pb do íntron anterior, removendo assim a junção íntron 6/ éxon 7 de CD163 (Figura 3, painel E). Os genótipos e as traduções previstas estão resumidos na Tabela 10. Um leitão macho e uma ninhada fêmea (4 leitões) foram obtidos a partir da transfecção CD163-sem Neo de células SIGLEC1 previamente modificadas. Todos os cinco leitões foram inativos duplos para SIGLEC1 e CD163. O leitão macho teve uma modificação bialélica de CD163 com uma deleção de 28 pb no éxon 7 em um alelo e uma deleção de 1387 pb no outro alelo que incluía uma deleção parcial do éxon 7 e deleção completa do éxon 8 e do íntron anterior, removendo assim a junção íntron éxon. Os leitões fêmeas tinham uma mutação bialélica de CD163, incluindo uma deleção de 1382 pb com uma inserção de 11 pb em um alelo e uma deleção de 1720 pb de CD163 no outro alelo. Um resumo das modificações de CD163 e as traduções previstas pode ser encontrado na Tabela 10. Um resumo das modificações CD1D e traduções previstas por modificação CRISPR pode ser encontrado na Tabela 11. Resumidamente, nasceram uma ninhada de fêmeas e duas ninhadas de machos, resultando em 13 leitões. Um leitão morreu imediatamente após o nascimento. Doze dos 13 leitões continham uma deleção bialélica ou homozigótica de CD1D (Figura 3, painel F). Um leitão era WT.

TABELA 8. DADOS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES PARA CD163. Identifi # Fonte Dia cação Embriões de do Linhagem* Sexo Resultado do Leitão do Transferi Oócito Est porco dos † ro CD163 CRISPR 4 leitões vivos (2 sacrificados O047 Masculino 240 ART 2 NT após o nascimento) CD163 CRISPR 3 leitões vivos (todos O015 Masculino 267 ART 1 NT saudáveis) 7 leitões vivos (1 nascido CD163 CRISPR O044 Masculino 206 ART 1 morto, 1 sacrificado após o

NT nascimento) CD163 CRISPR 1 leitão macho (sacrificado no O053 Masculino 224 ART 2 NT dia 13) CD163 CRISPR O08 Masculino 226 ART 1 0 leitões

NT CD163 CRISPR 8 leitões vivos (1 sacrificado O094 Feminino 193 MU 2 NT devido a FTT) CD163 CRISPR 9 leitões vivos (2 sacrificados O086 Feminino 213 MU 1 NT no dia 0, 2 devido a FTT) CD163 injetado Masculino/ 50 O082 com CRISPR MU 5 0 leitões Feminino Blástico 10/131 CD163 injetado 46 O083 com CRISPR Masculino MU 5 4 leitões vivos Blástico 10/131 CD163 CRISPR O99 Masculino 156 ART 1 1 leitão vivo, 1 leitão morto NT-sem Neo CD163 CRISPR O128 Masculino 196 ART 2 0 leitões NT-sem Neo CD163 CRISPR O100 Masculino 261 MU 3 0 leitões NT-sem Neo CD163 CRISPR Masculino/ O134 181 MU 1 0 leitões NT-sem Neo Feminino CD163 CRISPR 200889 Feminino 202 ART 1 4 leitões vivos NT-sem Neo CD163 CRISPR O135 Feminino 169 ART 2 0 leitões NT-sem Neo

[0273] * A linhagem CD163 CRISPR NT representa embriões criados por NT com uma linhagem de fibroblasto fetal modificada por transfecção. Os embriões injetados com CRISPR eram embriões IVF injetados no estágio celular 1 com RNA guia de CD163 com RNA CAS9. A linhagem fetal CD163 CRISPR NT-sem Neo representa embriões criados por NT com um fibroblasto fetal previamente modificado que já era uma linhagem Neo resistente modificada por transfecção sem o uso de um marcador selecionável.

[0274] † MU refere-se a oócitos de leitoas que foram aspirados e maturados na Universidade de Missouri, conforme descrito na seção de IVF dos Materiais e Métodos. ART refere-se a oócitos de porcas que foram comprados e maturados conforme descrito na seção SCNT dos Materiais e Métodos.

TABELA 9. DADOS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES PARA CD1D.

Identificação # Embriões Fonte de Dia do Linhagem * Sexo Resultado do porco Transferidos Oócito † Estro CD1D 200888 Masculino 201 ART 2 7 leitões vivos

CRISPR NT CD1D O61 Masculino 239 ART 0 4 leitões vivos

CRISPR NT CD1D O164 Feminino 199 MU 2 0 leitões

CRISPR NT CD1D O156 Feminino 204 MU 2 0 leitões

CRISPR NT CD1D 4 leitões Masculino/ O165 injetado 55 Blástico MU 6 (1 fêmea, 3 Feminino 4800/5350 machos) CD1D Masculino/ O127 injetado 55 Blástico MU 6 0 leitões Feminino 4800/5350 CD1D O121 Feminino 212 ART 1 2 leitões vivos

CRISPR NT

[0275] * A linhagem CD1D CRISPR NT representa embriões criados por NT com uma linhagem de fibroblasto fetal modificada por transfecção. Os embriões injetados com CRISPR eram embriões IVF injetados no estágio celular 1 com RNA guia de CD1D com RNA CAS9.

[0276] † MU refere-se a oócitos de leitoas que foram aspirados e maturados na Universidade de Missouri, conforme descrito na seção de IVF dos Materiais e Métodos. ART refere-se a oócitos de porcas que foram comprados e maturados conforme descrito na seção SCNT dos Materiais e Métodos.

TABELA 10. GENÓTIPO E PREDIÇÃO TRANSLACIONAL PARA PORCOS CD163-

MODIFICADOS

[0277] Alguns porcos contêm um tipo de modificação bialélica, mas têm apenas um alelo descrito e outro alelo modificado que não foi amplificado por PCR. Mecanismo de Em referência a SEQ ID NO: Nº de leitões Tradução de Tamanho de SEQ ID NO† terminação prematuro Descrição Códon de proteína* Ninhada INDELs reparo Tipo 47 63 7 NHEJ Bialélico Deleção de Deleção de 30 KO ou Não Deleção de nt 98 e 1506 pb pb no éxon 7 Δ422- 1.525 ao nt CD163 64 527 3.030 Outro alelo Não caracterizado, não amplificável 65 3 NHEJ Bialélico Inserção de Inserção no KO Sim Inserção entre 99 7 pb éxon 7 (491) nt 3.148 e

3.149 a 65 2 NHEJ Bialélico Deleção de Deleção parcial KO Sim ** ** 503 pb do éxon 7 e 8 (491) Não Outro alelo caracterizado 65 2 NHEJ Bialélico Deleção de Deleção Δ422- Não Deleção de nt 100 CD163 1280 pb completa dos 631 2.818 ao nt éxons 7 e 8 4.097 101 Não Deleção de Deleção Δ422- Deleção de nt CD163 1373 pb completa dos 631 2.724 ao nt éxons 7 e 8 4.096 66 1 NHEJ Homozigoto Inserção de Inserção da ** ** 2015 pb estrutura do vetor de direcionamento no éxon 7 67- 1 NHEJ Bialélico Deleção de Deleção no éxon KO Sim Deleção de nt 102 1 11 pb 7 (485) 3.137 ao nt

3.147 Inserção de 103 2 pb, Inserção no Inserção de 2 deleção de éxon 7 pb entre nt 377 pb no 3.149 e nt íntron 6 3.150 b com uma deleção de 377 pb de nt

2.573 ao nt

2.949

Mecanismo de Em referência a SEQ ID NO: Nº de leitões Tradução de Tamanho de SEQ ID NO† terminação prematuro Descrição Códon de proteína* Ninhada INDELs reparo Tipo 47 67- 1 NHEJ Bialélico Deleção de Deleção no éxon KO Sim Deleção de nt 104 2 124 pb 7 (464) 3.024 ao nt

3.147 Δ429- 105 CD163 Deleção de Deleção no éxon 470 Não Deleção de nt 123 pb 7 3.024 ao nt

3.146 67- 1 NHEJ Bialélico Inserção de Inserção no KO Sim Inserção entre 106 3 1 pb éxon 7 (489) nt 3.147 e

3.148c Outro aleloNão caracterizado, não amplificável 67- 1 NHEJ Bialélico Deleção de Deleção no éxon KO Sim Deleção de nt 107 4 130 pb 7 (462) 3.030 ao nt

3.159 Δ430- 108 CD163 Deleção de Deleção no éxon 474 Não Deleção de nt 132 pb 7 3.030 ao nt

3.161 68 6 NHEJ Bialélico Deleção de Deleção Δ422- Não Deleção de nt 109 CD163 e 1467 pb completa dos 631 2.431 ao nt 69 éxons 7 e 8 3.897 Outro aleloNão caracterizado, não amplificável 68 2 NHEJ Bialélico Deleção de Deleção no éxon CD163Δ435- Não Deleção de nt 110 e 129 pb, 7 478 488 ao nt 2.417 69 deleção de no éxon 6, a 1930 pb no sequência íntron 6 deletada é substituída com uma inserção de 12 pb d Não começando em Outro alelo caracterizado, nt 488 e uma não amplificável deleção adicional de 129 pb de nt

3.044 ao nt

3.172

Mecanismo de Em referência a SEQ ID NO: Nº de leitões Tradução de Tamanho de SEQ ID NO† terminação prematuro Descrição Códon de proteína* Ninhada INDELs reparo Tipo 47 65 3 WT Porcos do tipo SEQ ID NO: 47 47 e selvagem 69 criados a partir de uma colônia mista 70 2 NHEJ Em Deleção de Deleção no éxon KO Sim Deleção de nt 111 SIGLEC1-/- 28 pb 7 (528) 3.145 ao nt Bialélico 3.172 KO 112 Deleção de Deleção parcial Não Deleção de nt 1387 pb no éxon 7 e todo 3.145 ao nt o éxon 8 4.531 73 4 NHEJ Em Deleção de Deleção parcial KO Não Deleção de nt 113 SIGLEC1-/- 1382 pb no éxon 7 e todo 3.113 ao nt Bialélico + Inserção o éxon 8 4.494, de 11 pb sequência deletada 114 substituída Δ422- com uma CD163 Deleção de Deleção 631 inserção de 11 1720 pb completa dos pbe começando éxons 7 e 8 em nt 3.113 Deleção de nt

2.440 ao nt

4.160 * KO, knockout ** Não incluído porque os leitões foram sacrificados.

† SEQ ID NOs nesta coluna referem-se às SEQ ID NOs para as sequências que mostram os INDELs em relação à SEQ ID NO: 47. a A sequência inserida foi TACTACT (SEQ ID NO: 115) b A sequência inserida foi AG. c A sequência inserida era um único resíduo de adenina (A). d A sequência inserida foi TGTGGAGAATTC (SEQ ID NO: 116). e A sequência inserida foi AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).

TABELA 11. GENÓTIPO E PREDIÇÃO TRANSLACIONAL PARA PORCOS CD1D-

MODIFICADOS Nú Meca Trad Nin mer nismo ução had o de de Tipo Tamanho de INDEL Descrição de a leitõ repar prote es o ína 158, Homo 11 NHEJ Deleção de 1653 pb Deleção do éxon 3, 4 e 5 KO* 159 zigoto Homo 167 2 NHEJ Deleção de 1265 pb Deleção do éxon 5 e 72 pb do éxon 6 KO zigoto 166- Bialéli Remoção do códon de iniciação no 1 NHEJ Deleção de 24 pb KO 1 co éxon 3 Interrupção do códon de iniciação no Deleção de 27 pb éxon 3 Deleção de 362 pb + 5 Deleção do éxon 3 pb Inserção de 6 pb + 166- Bialéli Adição de 6 pb antes do códon de CD1 1 NHEJ incompatibilidade de 2 2 co iniciação no éxon 3 Dko/+ pb Remoção do códon de iniciação no Deleção de 1598 pb éxon 3 e deleção dos éxons 4,5 166- Bialéli Adição de G/T no éxon 3 antes do CD1 1 NHEJ Inserção de 1 pb 3 co códon de iniciação no éxon 3 D+/+ 166- Homo Adição de A no éxon 3 antes do CD1 1 NHEJ Inserção de 1 pb 4 zigoto códon de iniciação no éxon 3 D+/+ * KO, knockout EFICIÊNCIA DO SISTEMA DE CRISPR/CAS9 EM ZIGOTOS SUÍNOS

[0278] Com base na interrupção direcionada de CD163 e CD1D em células somáticas usando o sistema de CRISPR/Cas9, esta abordagem foi aplicada à embriogênese suína. Em primeiro lugar, a eficácia do sistema de CRISPR/Cas9 em embriões em desenvolvimento foi testada. O sistema de CRISPR/Cas9 direcionado a eGFP foi introduzido em zigotos fertilizados com sêmen de um varrão heterozigoto para o transgene eGFP. Após a injeção, embriões subsequentes expressando eGFP foram monitorados. Várias concentrações do sistema de CRISPR/Cas9 foram testadas e a citotoxicidade do sistema de CRISPR/Cas9 entregue foi observada (Figura 4, painel A); o desenvolvimento embrionário após a injeção de CRISPR/Cas9 foi menor em comparação com o controle. No entanto, todas as concentrações de

CRISPR/Cas9 que foram examinadas foram eficazes na geração de modificação de eGFP porque nenhum embrião com expressão de eGFP foi encontrado no grupo injetado com CRISPR/Cas9 (Figura 4, painel B); dos embriões de controle não injetados 67,7% eram verdes, indicando expressão de eGFP. Quando os blastocistos individuais foram genotipados, foi possível identificar pequenas mutações perto dos sítios de ligação CRISPR (Figura 4, painel C). Com base na toxicidade e eficácia, 10 ng/μl de gRNA e mRNA de Cas9 foram usados para os seguintes experimentos.

[0279] Quando os componentes de CRISPR/Cas9 projetados para direcionar o CD163 foram introduzidos em zigotos presumíveis, a edição direcionada dos genes nos blastocistos subsequentes foi observada. Quando blastocistos individuais foram genotipados para mutação de CD163, mutações específicas foram encontradas em todos os embriões (100% de eficiência de GE). Mais importante, embora os embriões pudessem ser encontrados com modificações homozigóticas ou bialélicas (8/18 e 3/18, respectivamente) (Figura 5), genótipos em mosaico (modificações monoalélicas) também foram detectados (4/18 embriões). Alguns embriões (8/10) do grupo foram injetados com 2 ng/μl de Cas9 e 10 ng/μl de CRISPR e nenhuma diferença foi encontrada na eficiência da mutagênese. Em seguida, com base nos resultados in vitro, dois CRISPRs representando diferentes gRNA foram introduzidos para interromper CD163 ou CD1D durante a embriogênese para induzir uma deleção específica dos genes alvo. Como resultado, foi possível induzir com sucesso uma deleção projetada de CD163 e CD1D introduzindo dois guias. Uma deleção projetada é definida como uma deleção que remove a sequência genômica entre os dois guias introduzidos. Entre os embriões que receberam dois CRISPRs direcionados a CD163, todos, exceto um embrião, resultaram em uma modificação direcionada de CD163. Além disso, descobriu- se que 5/13 embriões tinham uma deleção projetada em CD163 (Figura 6,

painel A) e 10/13 embriões pareciam ter modificação de CD163 de forma homozigótica ou bialélica. O direcionamento de CD1D com dois CRISPRs também foi eficaz porque todos os embriões (23/23) mostraram uma modificação de CD1D. No entanto, a deleção projetada de CD1D só pode ser encontrada em dois embriões (2/23) (Figura 6, painel B). Cinco dos vinte e três embriões possuindo genótipos em mosaico também foram encontrados, mas o restante dos embriões tinha modificação homozigótica ou bialélica de CD1D.

Finalmente, foi testado se vários genes podem ser direcionados pelo sistema de CRISPR/Cas9 dentro do mesmo embrião. Para este propósito, o direcionamento de CD163 e eGFP foi realizado nos zigotos que foram fertilizados com sêmen heterozigoto eGFP. Quando os blastocistos dos embriões injetados foram genotipados para CD163 e eGFP, descobriu-se que CD163 e eGFP foram direcionados com sucesso durante a embriogênese. Os resultados de sequenciamento demonstraram que vários genes podem ser direcionados pela introdução de vários CRISPRs com Cas9 (Figura 6, painel C).

PRODUÇÃO DE MUTANTES CD163 E CD1D A PARTIR DE ZIGOTOS INJETADOS COM CRISPR/CAS9

[0280] Com base no sucesso do estudo in vitro anterior, alguns zigotos injetados com CRISPR/Cas9 foram produzidos e 46-55 blastocistos foram transferidos por receptor (porque este número se mostrou eficaz na produção de porcos a partir de embriões derivados in vitro). Quatro transferências de embriões foram realizadas, duas de cada para CD163 e CD1D, e uma gravidez para cada modificação foi obtida. Quatro leitões saudáveis foram produzidos com modificações no CD163 (Tabela 8). Todos os leitões, ninhada 67 da porca receptora ID O083, apresentaram modificação homozigótica ou bialélica de CD163 (Figura 7). Dois leitões mostraram a deleção projetada de CD163 pelos dois CRISPRs entregues. Todos os leitões eram saudáveis. Para CD1D, uma gravidez também produziu quatro leitões (ninhada 166 da porca receptora de identificação O165): uma fêmea e três machos (Tabela 9). Um leitão (166-1) carregava uma mutação em mosaico de CD1D, incluindo uma deleção de 362 pb que removeu completamente o éxon 3 que contém o códon de iniciação (Figura 8). Um leitão continha uma inserção de 6 pb com uma incompatibilidade de 2 pb em um alelo com uma grande deleção no outro alelo. Dois leitões adicionais tiveram uma inserção bialélica de um único pb. Não foram detectadas mutações em mosaico para CD163.

DISCUSSÃO

[0281] Um aumento na eficiência da produção de porcos GE pode ter um amplo impacto ao fornecer mais porcos GE para a agricultura e biomedicina. Os dados descritos acima mostram que, usando o sistema de CRISPR/Cas9, porcos GE com mutações específicas podem ser produzidos com alta eficiência. O sistema de CRISPR/Cas9 foi aplicado com sucesso para editar genes em células somáticas e em embriões pré-implantação.

[0282] Quando o sistema de CRISPR/Cas9 foi introduzido em células somáticas, ele induziu com sucesso a interrupção direcionada dos genes alvo por NHEJ, mas não aumentou a capacidade de direcionamento por HR. A eficiência de direcionamento de CRISPR/Cas9 individual em células somáticas foi variável, o que indicou que o projeto do guia pode afetar a eficiência de direcionamento. Especificamente, não foi possível encontrar a modificação direcionada de CD1D quando CRISPR 5350 e Cas9 foram introduzidos em células somáticas. Isso sugere que pode ser benéfico projetar vários gRNAs e validar suas eficiências antes de produzir porcos. A razão para a falta de reparo dirigido por HR com a presença de DNA doador ainda não está clara. Após a triagem de 886 colônias (CD163 e CD1D) transfectadas com CRISPR e DNA doador, apenas uma colônia apresentou evidência de um evento parcial de HR. Os resultados demonstraram que o sistema de

CRISPR/Cas9 funcionou com DNA doador introduzido para causar grandes deleções inesperadas nos genes alvo, mas não aumentou a eficiência de HR para esses dois vetores de direcionamento específicos. No entanto, um mecanismo específico para a observação de grande deleção não é conhecido.

Relatórios anteriores de nosso grupo sugeriram que um DNA doador pode ser usado efetivamente com um ZFN para induzir o reparo dirigido por HR. Da mesma forma, um aumento na eficiência de direcionamento foi observado quando o DNA doador foi usado com o sistema de CRISPR/Cas9, mas o reparo dirigido por HR completo não foi observado. Em um estudo anterior usando ZFN, foi observado que a modificação direcionada pode ocorrer por meio de uma combinação de HR e NHEJ porque uma recombinação parcial foi encontrada do DNA doador introduzido após DSBs induzidas pelo ZFN. Uma explicação pode ser que as vias de HR e NHEJ não são independentes, mas podem agir juntas para completar o processo de reparo após DSBs induzidas por endonucleases teleguiadas. Concentrações mais altas de CRISPRs podem melhorar a eficiência de direcionamento em células somáticas, embora nenhuma diferença estatística tenha sido encontrada nesses resultados experimentais. Isso pode sugerir que CRISPR é um fator limitante no sistema de CRISPR/Cas9, mas é necessária uma validação adicional. As células direcionadas foram usadas com sucesso para produzir porcos GE por meio de SCNT, indicando que a aplicação de CRISPR/Cas9 não afeta a capacidade das células de serem clonadas. Alguns leitões foram sacrificados por causa de problemas de saúde; no entanto, isso não é incomum em leitões derivados de SCNT.

[0283] Quando o sistema de CRISPR/Cas9 foi introduzido em embriões em desenvolvimento por injeção de zigoto, quase 100% dos embriões e porcos continham um INDEL no gene alvo, demonstrando que a tecnologia é muito eficaz durante a embriogênese. A eficiência observada durante este estudo supera as frequências relatadas em outros estudos utilizando endonucleases teleguiadas durante a embriogênese.

Uma diminuição no número de embriões atingindo o estágio de blastocisto sugeriu que a concentração de CRISPR/Cas9 introduzida neste estudo pode ser tóxica para embriões.

Otimização adicional do sistema de entrega pode aumentar a capacidade de sobrevivência dos embriões e, assim, melhorar a eficiência geral do processo.

A taxa de mutagênese de quase 100% observada aqui foi diferente de um relatório anterior em inativação mediada por CRISPR/Cas9 em porcos; no entanto, a diferença de eficiência entre os estudos pode ser uma combinação do guia e do alvo selecionados.

No presente estudo,

concentrações mais baixas de CRISPR/Cas9 (10 ng/μl cada) foram eficazes na geração de mutações em embriões em desenvolvimento e na produção de porcos GE.

A concentração é inferior à relatada anteriormente em zigotos suínos (125 ng/μl de Cas9 e 12,5 ng/μl de CRISPR). A concentração mais baixa de componentes CRISPR/Cas9 poderia ser benéfica para embriões em desenvolvimento porque a introdução de quantidades excessivas de ácido nucleico em embriões em desenvolvimento pode ser tóxica.

Alguns genótipos em mosaico foram observados em embriões injetados com CRISPR/Cas9 a partir dos ensaios in vitro; no entanto, apenas um leitão produzido por meio da abordagem tinha um genótipo em mosaico.

Potencialmente, uma injeção com componentes de CRISPR/Cas9 pode ser mais eficaz do que a introdução de outras endonucleases teleguiadas porque o genótipo em mosaico foi considerado um obstáculo principal de uso do sistema de CRISPR/Cas9 em zigotos.

Outro benefício de usar o sistema de CRISPR/Cas9 demonstrado pelos presentes resultados é que nenhum porco knockout para CD163 produzido a partir de zigotos derivados de IVF injetados com sistema de CRISPR/Cas9 foi perdido, enquanto alguns leitões resultantes de SCNT foram sacrificados após alguns dias.

Isso sugere que a tecnologia poderia não apenas contornar a necessidade do SCNT na geração de porcos knockout, mas poderia também superar os problemas de saúde comuns associados ao SCNT. Agora que a injeção de mRNA CRISPR/Cas9 em zigotos foi otimizada, os experimentos futuros incluirão também a co-injeção de DNA doador.

[0284] O presente estudo demonstra que a introdução de dois CRISPRs com Cas9 em zigotos pode induzir deleções cromossômicas em embriões em desenvolvimento e produzir porcos com uma deleção pretendida, isto é, deleção específica entre os dois guias CRISPR. Essa deleção projetada pode ser benéfica porque é possível especificar o tamanho da deleção em vez de depender de eventos aleatórios causados por NHEJ. Especificamente, se houver inserção/ deleção de nucleotídeos em um múltiplo de três causado por uma endonuclease teleguiada, a mutação pode resultar em uma mutação hipomórfica porque nenhuma mudança de quadro ocorreria. No entanto, com a introdução de dois CRISPRs, é possível causar deleções maiores que terão uma chance maior de gerar proteínas não funcionais. Curiosamente, os CD1D CRISPRs foram projetados em uma área maior no genoma do que o CD163; havia uma distância de 124 pb entre CD163 CRISPR 10 e 131 enquanto havia uma distância de 550 pb entre CRISPR 4800 e 5350 para CD1D. A distância maior entre os CRISPRs não foi muito eficaz em gerar uma deleção, conforme mostrado no estudo. No entanto, como o presente estudo incluiu apenas um número limitado de observações e há necessidade de considerar a eficácia dos CRISPRs individuais, o que não é abordado aqui, é necessário estudo adicional para verificar a relação entre a distância entre os CRISPRs e a probabilidade de causar as deleções pretendidas.

[0285] O sistema de CRISPR/Cas9 também foi eficaz no direcionamento de dois genes simultaneamente dentro do mesmo embrião com a única etapa extra sendo a introdução de um CRISPR adicional com crRNA.

Isso ilustra a facilidade de interromper genes múltiplos em comparação com outras endonucleases teleguiadas. Esses resultados sugerem que essa tecnologia pode ser usada para direcionar agrupamentos de genes ou famílias de genes que podem ter um efeito compensatório, sendo difícil determinar o papel de genes individuais, a menos que todos os genes sejam interrompidos.

Os resultados demonstram que a tecnologia CRISPR/Cas9 pode ser aplicada na geração de porcos GE, aumentando a eficiência do direcionamento de genes em células somáticas e por injeção direta de zigoto.

EXEMPLO 2: RESISTÊNCIA AUMENTADA A PRRSV EM SUÍNOS COM UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM GENE QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA DE CD163

[0286] O Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva dos Suínos (PRRSV) devastou a indústria suína no último quarto de século. A especulação sobre o modo de entrada viral incluiu SIGLEC1 e CD163. Embora o inativante de SIGLEC1 não tenha afetado a resposta a um desafio viral, é mostrado no presente exemplo que os animais CD163 nulos não apresentam sinais clínicos de infecção, patologia pulmonar, viremia ou produção de anticorpos que são todas marcas de infecção por PRRSV. Não apenas um mediador de entrada de PRRSV foi confirmado; mas se animais criados de forma semelhante pudessem entrar no suprimento de alimentos, então uma estratégia para prevenir perdas econômicas significativas e sofrimento animal foi descrita.

MATERIAIS E MÉTODOS GENOTIPAGEM

[0287] A genotipagem foi baseada no sequenciamento de DNA e sequenciamento de mRNA. O genótipo do macho tinha uma deleção de 11 pb em um alelo que, quando traduzido, previu 45 aminoácidos no domínio 5, resultando em um códon de terminação prematuro no aminoácido 64. no outro alelo, houve uma adição de 2 pb no éxon 7 e deleção de 377 pb no íntron antes do éxon 7 que, quando traduzido, previu os primeiros 49 aminoácidos do domínio 5, resultando em um códon de terminação prematuro no aminoácido

85. Uma porca teve uma adição de 7 pb em um alelo que, quando traduzido, previu os primeiros 48 aminoácidos do domínio 5, resultando em um códon de terminação prematuro no aminoácido 70. O outro alelo era não caracterizado (A), uma vez que não havia banda do éxon 7 por PCR ou PCR de longo alcance de 6,3 kb. As outras 3 porcas eram clones e tinham uma deleção de 129 pb no éxon 7 que se prevê que resulte na deleção de 43 aminoácidos do domínio 5. O outro alelo era não caracterizado (B).

O CRESCIMENTO DE PRRSV EM CULTURA E A PRODUÇÃO DE INÓCULO DE VÍRUS

PARA A INFECÇÃO DE PORCOS ESTÃO COBERTOS PELO PEDIDO APROVADO DO IBC 973

[0288] Uma cepa tipo de PRRSV, isolado NVSL 97-7895 (GenBank #AF325691 2001-02-11), foi cultivada conforme descrito no protocolo aprovado de IBC 973. Este isolado de laboratório foi usado em estudos experimentais por cerca de 20 anos (Ladinig et al., 2015). Um segundo isolado foi usado para o segundo ensaio, KS06-72109, conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013).

INFECÇÃO DE PORCOS COM PRRSV

[0289] Um protocolo de infecção padronizado para PRRSV foi usado para a infecção de porcos. Leitões com três semanas de idade foram inoculados com aproximadamente 104 TCID50 de vírus PRRS que foi administrado por vias intramuscular (IM) e intranasal (IN). Os porcos foram monitorados diariamente e os que apresentavam sintomas de doença foram tratados de acordo com as recomendações dos veterinários CMG. Porcos que apresentam grande aflição e estão em perigo de sucumbir à infecção são sacrificados humanamente e as amostras são coletadas. A equipe e os veterinários desconheciam o status genético dos porcos para eliminar a tendência na avaliação ou no tratamento. PRRSV está presente nos fluidos corporais durante a infecção; portanto, amostras de sangue foram coletadas e armazenadas a -80 °C até serem medidas para determinar a quantidade ou o grau de viremia em cada porco. No final do experimento, os porcos foram pesados e sacrificados humanamente, e os tecidos coletados e fixados em formalina tamponada a 10%, embebidos em parafina e processados para histopatologia por um patologista certificado.

PONTUAÇÃO DE FENÓTIPO DOS PORCOS DESAFIADOS

[0290] O fenótipo dos porcos foi cegamente pontuado diariamente como segue: Qual é a atitude do porco? Pontuação de atitude: 0: BAR, 1: QAR, 2: Ligeiramente deprimido, 3: Deprimido, 4: Moribundo. Qual é a condição corporal do porco? Pontuação de condição corporal: 1: Emaciado, 2: Magro, 3: Ideal, 4: Gordo, 5: Gordura excessiva/ Obeso. Qual é a temperatura retal do porco? Temperatura corporal normal de 101,6-103,6 °F (febre considerada ≥ 104 °F). Existe alguma manqueira (grau)? Qual membro? Avalie os membros quanto a inchaço nas articulações e lesões no casco (verifique a parte inferior e as laterais do casco). Pontuação de manqueira: 1: sem manqueira, 2: ligeiramente irregular ao caminhar, parece rígido em algumas articulações, mas sem manqueira, 3: manqueira leve, claudicação leve ao caminhar, 4: manqueira moderada, claudicação óbvia incluindo dedo tocando o coxo, 5: manqueira severa, sem sustentação de peso no membro, precisa de incentivo para ficar de pé/ andar. Existe alguma dificuldade respiratória (grau)? Existe respiração com a boca aberta? Existe alguma secreção nasal (cor da secreção, quantidade de secreção: leve/ moderada/ grave)? Você notou o animal tossindo? Existe alguma secreção ocular? Pontuação respiratória: 0: Normal, 1: dispnéia e/ou taquipnéia leve quando estressado (quando manuseado), 2: dispnéia e/ou taquipnéia leve quando em repouso, 3: dispnéia e/ou taquipnéia moderada quando estressado (quando manuseado), 4: dispnéia e/ou taquipnéia moderada quando em repouso, 5: dispnéia e/ou taquipnéia grave quando estressado (quando manuseado), 6: dispnéia e/ou taquipnéia grave quando em repouso. Há evidência de diarreia (grau) ou vômito? Existe sangue ou muco? Pontuação de diarreia: 0: sem fezes notadas, 1: fezes normais, 2: fezes moles, mas formadas (consistência de iogurte macio, cria torta de vaca), 3: diarreia líquida de coloração castanha/ marrom-claro com material fecal particulado, 4: diarreia líquida de coloração castanha/ marrom-claro sem material fecal particulado, 5: diarreia líquida com aparência semelhante à água.

[0291] Este sistema de pontuação foi desenvolvido pela Dra.

Megan Niederwerder na KSU e é baseado nas seguintes publicações (Halbur et al., 1995; Merck; Miao et al., 2009; Patience e Thacker, 1989; Winckler e Willen, 2001) Pontuações e temperaturas foram analisadas usando ANOVA separada com base nos genótipos como tratamentos.

MEDIÇÃO DE VIREMIA DE PRRSV

[0292] A viremia foi determinada por meio de duas abordagens. A titulação do vírus foi realizada adicionando diluições em série 1:10 de soro a células MARC-145 confluentes em uma placa de 96 poços. O soro foi diluído em meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 8% de soro fetal bovino, penicilina, estreptomicina e anfotericina B conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013). As células foram examinadas após 4 dias de incubação para a presença de um efeito citopático usando microscópio. A maior diluição mostrando um efeito citopático foi pontuada como o ponto final da titulação. O RNA total foi isolado do soro usando o kit de isolamento de RNA viral MagMAX-96 da Life Technologies para medir o ácido nucleico viral. A reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa foi realizada usando o kit EZ-PRRSV MPX 4.0 da Tetracore em um sistema de PCR em tempo real CFX-96 (Bio-Rad) de acordo com as instruções do fabricante. Cada reação (25 µl) continha RNA de 5,8 µl de soro. A curva padrão foi construída preparando diluições em série de um controle de RNA fornecido no kit (Tetracore). O número de moldes por PCR é relatado.

COLORAÇÃO DE SIGLEC1 E CD163 DE CÉLULAS PAM

[0293] Macrófagos alveolares suínos (PAMs) foram coletados por excisão dos pulmões e preenchendo-os com ~ 100 ml de solução salina tamponada com fosfato fria. Depois de recuperar as células de lavagem com solução salina tamponada com fosfato, foram peletizadas e ressuspensas em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato fria e armazenadas em gelo.

Aproximadamente 107 PAMs foram incubados em 5 ml dos vários anticorpos (anti-CD169 suíno (clone 3B11/ 11; AbD Serotec); anti-CD163 suíno (clone 2A10/ 11; AbD Serotec)) diluído em solução salina tamponada com fosfato com 5% de soro fetal bovino e azida sódica a 0,1% por 30 minutos em gelo. As células foram lavadas e ressuspensas em 1/100 de diluição de IgG de cabra anti-camundongo conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Life Technologies) diluído em tampão de coloração e incubado por 30 minutos em gelo. Pelo menos 104 células foram analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCalibur e software Cell Quest (Becton Dickinson).

MEDIÇÃO DE IG ESPECÍFICA DE PRRSV

[0294] Para medir a Ig específica de PRRSV, a proteína N de PRRSV recombinante foi expressa em bactérias (Trible et al., 2012) e conjugada com contas magnéticas Luminex usando um kit (Luminex Corporation). As contas acopladas à proteína N foram diluídas em solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra para 2.500 contas/ 50µl e colocadas nos poços de uma placa de poliestireno de fundo redondo de 96 poços. O soro foi diluído 1:400 em solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra e 50µl foram adicionados em poços em duplicata e incubados durante 30 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Em seguida, a placa foi lavada (3X) com solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra e foi adicionado 50µl de anticorpo secundário de cabra anti-suíno purificado por afinidade conjugado com biotina-SP (IgG, Jackson ImmunoResearch) ou IgM de cabra anti-suíno purificado por afinidade marcado com biotina (KPL) diluído para 2 µg/ml em solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra. As placas foram lavadas (3X) após 30 minutos de incubação e, em seguida, foram adicionados 50µl de ficoeritrina conjugada com estreptavidina (2 µg/ml (Moss, Inc.) em solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra). As placas foram lavadas 30 minutos mais tarde e as microesferas foram ressuspensas em 100 µl de solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra e analisadas usando o software MAGPIX e o Luminex xPONENT 4.2. A intensidade média de fluorescência (MFI) é relatada.

RESULTADOS

[0295] Mutações em CD163 foram criadas usando a tecnologia CRISPR/Cas9 conforme descrito acima no Exemplo 1. Vários animais fundadores foram produzidos a partir da injeção de zigoto e da transferência nuclear de células somáticas. Alguns desses fundadores foram cruzados criando progênie para estudo. Um único macho fundador foi cruzado com fêmeas com dois genótipos. O macho fundador (67-1) possuía uma deleção de 11 pb no éxon 7 em um alelo e uma adição de 2 pb no éxon 7 (e deleção de 377 pb no íntron anterior) do outro alelo e foi previsto para ser um animal nulo (CD163-/-). Uma fêmea fundadora (65-1) tinha uma adição de 7 pb no éxon 7 em um alelo e um alelo correspondente não caracterizado e, portanto, previu- se que era heterozigótica para o knockout (CD163-/?). Um segundo genótipo feminino fundador (3 animais que eram clones) continha um alelo ainda não caracterizado e um alelo com uma deleção de 129 pb no éxon 7. Prevê-se que essa deleção resulte em uma deleção de 43 aminoácidos no domínio 5. Os cruzamentos entre estes os animais resultaram em todos os leitões herdando um alelo nulo do varrão e a deleção de 43 aminoácidos ou um dos alelos não caracterizados das porcas. Além dos leitões de tipo selvagem que serviram como controles positivos para o desafio viral, isso produziu 4 genótipos adicionais (Tabela 12).

TABELA 12. GENÓTIPOS TESTADOS QUANTO À RESISTÊNCIA AO DESAFIO DE PRRSV (CEPAS NVSL E KS06) Alelos Resistência ao Desafio de PRRSV Medida por Viremia Paterno Materno NVSL KS06 Nulo Nulo Resistente N/A Nulo Δ43 Aminoácidos N/A Resistente Nulo Não caracterizado A Susceptível N/A Nulo Não caracterizado B Susceptível Susceptível Tipo Tipo selvagem Susceptível Susceptível selvagem

[0296] No desmame, leitões geneticamente editados e leitões de tipo selvagem de mesma idade foram transportados para a Universidade Estadual do Kansas para um desafio de PRRSV. Um desafio de PRRSV foi realizado conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013). Os leitões, com três semanas de idade, foram trazidos para a instalação de desafio e mantidos como um único grupo. Todos os experimentos foram iniciados após a aprovação dos comitês institucionais de uso de animais e biossegurança. Após a aclimatação, os porcos foram desafiados com um isolado de PRRSV, NVSL 97-7895 (Ladinig et al., 2015), propagado em células MARC-145 (Kim et al., 1993). Os porcos foram desafiados com aproximadamente 10 5 TCID50 de vírus.

Metade do inóculo foi administrado por via intramuscular e o restante administrado por via intranasal. Todos os porcos infectados foram mantidos como um único grupo, o que permitiu a exposição contínua do vírus de companheiros de cercado infectados. Amostras de sangue foram coletadas em vários dias até 35 dias após a infecção e no término, dia 35. Os porcos foram necropsiados e os tecidos fixados em formalina tamponada a 10%, embebidos em parafina e processados para histopatologia. Os sinais clínicos associados a PRRSV registados durante o curso da infecção incluíram dificuldade respiratória, inapetência, letargia e febre. Os resultados para sinais clínicos ao longo do período de estudo estão resumidos na Figura 9. Como esperado, os porcos do tipo selvagem de Tipo Selvagem (CD163 +/+) mostraram sinais precoces de infecção por PRRSV, que atingiu o pico entre os dias 5 e 14 e persistiu no grupo durante o restante do estudo. A percentagem de porcos febris atingiu o pico por volta do dia 10. Em contraste, os leitões Nulo (CD163 - /-) não mostraram evidência de sinais clínicos durante todo o período do estudo. Os sinais respiratórios durante a infecção aguda por PRRSV se refletem em alterações histopatológicas significativas no pulmão (Tabela 9). A infecção dos porcos de tipo selvagem mostrou histopatologia consistente com PRRS incluindo edema intersticial com a infiltração de células mononucleares (Figura 10). Em contraste, não houve evidência de alterações pulmonares nos porcos Nulo (CD163 -/-). O tamanho da amostra para os vários genótipos é pequeno; no entanto, as pontuações médias foram 3,85 (n = 7) para o tipo selvagem, 1,75 (n = 4) para o não caracterizado A, 1,33 (n = 3) para o não caracterizado B e 0 (n = 3) e para o nulo (CD163 -/-).

TABELA 13. AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA DO PULMÃO Porco Genótipo Descrição Pontuação 41 Tipo selvagem 100% de congestão. Áreas multifocais de 3 edema. Infiltração de número moderado de linfócitos e macrófagos 42 Tipo selvagem 100% de congestão. Áreas multifocais de 3 edema. Infiltração de número moderado de linfócitos e macrófagos 47 Tipo selvagem 75% de infiltração multifocal com células 2 mononucleares e edema leve 50 Tipo selvagem 75% de infiltração multifocal de células 3 mononucleares dentro de espaços alveolares e ao redor de pequenos vasos

Porco Genótipo Descrição Pontuação sanguíneos edema perivascular 51 Tipo selvagem 25% de atelectasia com infiltração 1 moderada de células mononucleares 52 Tipo selvagem 10% dos espaços alveolares colapsaram 1 com infiltração de um pequeno número de células mononucleares 56 Tipo selvagem 100% de infiltração intersticial difusa 4 moderada de células mononucleares. Septos interalveolares moderadamente espessados por hemorragia e edema.

45 Não caracterizado A 75% dos infiltrados multifocais de células 3 mononucleares, especialmente ao redor dos brônquios, vasos sanguíneos, espaços subpleurais e septos interalveolares.

49 Não caracterizado A 75% de infiltração multifocal moderada a 2 grande de células mononucleares. Alguns vasos com edema leve.

53 Não caracterizado A 10% de infiltração multifocal pequena de 1 células mononucleares 57 Não caracterizado A 15% de infiltração de células 1 mononucleares 46 Não caracterizado B Pneumonia intersticial moderada 2 48 Não caracterizado B Edema perivascular e infiltração de células 2 mononucleares em torno de vasos de pequeno e médio porte e em torno de septos interalveolares 54 Não caracterizado B Sem alterações 0 40 Nulo Sem alterações 0 43 Nulo Sem alterações 0 55 Nulo Sem alterações 0

[0297] Os sinais clínicos de pico correlacionaram com os níveis de PRRSV no sangue. A medição do ácido nucleico viral foi realizada pelo isolamento do RNA total do soro seguido pela amplificação do RNA de PRRSV usando um teste de PCR de PRRSV em tempo real com transcriptase reversa comercial (Tetracore, Rockville, MD). Uma curva padrão foi gerada pela preparação de diluições em série de um controle de RNA de PRRSV, fornecido no kit de RT-PCR e os resultados foram padronizados como os moldes de número por 50 µl de reação de PCR. O isolado de PRRSV seguiu o curso para viremia de PRRSV nos porcos CD163+/+ de tipo selvagem (Figura 11). A viremia foi aparente no dia quatro, atingiu um pico no dia 11 e diminuiu até o final do estudo. Em contraste, o RNA viral não foi detectado nos porcos CD163- /- em qualquer momento durante o período de estudo. Consistente com a viremia, a produção de anticorpos pelos porcos de alelos nulos e não caracterizados foi detectável por 14 e aumentou até o dia 28. Não houve produção de anticorpos nos animais nulos (Figura 12). Juntos, esses dados mostram que porcos de tipo selvagem suportam a replicação de PRRSV com a produção de sinais clínicos consistentes com PRRS. Em contraste, os porcos knockout não produziram viremia nem sinais clínicos, embora os porcos tenham sido inoculados e constantemente expostos a companheiros de cercado infectados.

[0298] No final do estudo, macrófagos alveolares suínos foram removidos por lavagem pulmonar e corados para a expressão de superfície de SIGLEC1 (CD169, clone 3B11/11) e CD163 (clone 2A10/11), conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013). Níveis relativamente altos de expressão de CD163 foram detectados em animais CD163 +/+ de tipo selvagem (Figura 13).

Em contraste, os porcos CD163 -/- mostraram apenas níveis de fundo de coloração anti-CD163, confirmando assim o fenótipo knockout. Os níveis de expressão para outro marcador de macrófago CD169 foram semelhantes para porcos de tipo selvagem e knockout (Figura 14). Outros marcadores de superfície de macrófagos, incluindo MHC II e CD172 foram os mesmos para ambos os genótipos (dados não mostrados).

[0299] Embora o tamanho da amostra fosse pequeno, os porcos do tipo selvagem tenderam a ganhar menos peso ao longo do experimento (ganho médio diário de 0,81 kg ± 0,33, n = 7) em relação aos porcos dos outros três genótipos (não caracterizado A 1,32 kg ± 0,17, n = 4; não caracterizado B 1,20 kg ± 0,16, n = 3; nulo 1,21 kg ± 0,16, n = 3).

[0300] Em um segundo ensaio, 6 do tipo selvagem, 6 Δ43 aminoácidos e 6 porcos com um alelo não caracterizado (B) foram desafiados conforme descrito acima, exceto KS06-72109 que foi usado para inocular os leitões. Semelhante aos dados de NVSL, os leitões não caracterizados B e de tipo selvagem desenvolveram viremia. No entanto, nos porcos de Δ43 aminoácidos o KS06 não resultou em viremia (Figura 15; Tabela 7).

IMPLICAÇÕES E CONCLUSÕES

[0301] A doença mais clinicamente relevante para a indústria suína é a PRRS. Embora os programas de vacinação tenham sido bem- sucedidos em prevenir ou melhorar a maioria dos patógenos suínos, o PRRSV provou ser um desafio maior. Aqui o CD163 é identificado como um mediador de entrada para esta cepa viral. O varrão fundador foi criado por injeção de CRISPR/Cas9 em zigotos (Whitworth et al., 2014) e, portanto, não há transgene. Além disso, um dos alelos da porca (também criado usando CRISPR/Cas9) não contém um transgene. Assim, o leitão #40 carrega uma adição de 7 pb em um alelo e uma deleção de 11 pb no outro alelo, mas nenhum transgene. Esses alelos de resistência a vírus de CD163 representam pequenas edições do genoma, considerando que o genoma suíno tem cerca de 2,8 bilhões de pb (Groenen et al., 2012). Se animais criados de forma semelhante fossem introduzidos no suprimento de alimentos, perdas econômicas significativas poderiam ser evitadas.

EXEMPLO 3: RESISTÊNCIA AUMENTADA AO VÍRUS PRRS E GENÓTIPO 1 REPRODUTIVO SUÍNO EM SUÍNOS COM DOMÍNIO 5 DE SRCR DE CD163 SUBSTITUÍDO COM DOMÍNIO 8 DE SRCR DE HOMOLOGIA SEMELHANTE A CD163 HUMANO

[0302] O CD163 é considerado o principal receptor para o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV). Neste estudo, os porcos foram geneticamente editados (GE) para possuírem um dos seguintes genótipos: knockout completo (KO) de CD163, deleções no domínio 5 do receptor scavenger rico em cisteína (SRCR) de CD163 ou substituição (troca de domínio) do domínio 5 de SRCR com um éxon sintetizado que codifica um homólogo do domínio 8 de SRCR semelhante a CD163 humano (hCD163L1).

A imunofenotipagem de macrófagos alveolares suínos (PAMs) mostrou que os porcos com KO ou deleções de domínio 5 de SRCR não expressaram CD163 e os PAMs não suportaram infecção por PRRSV. Os PAMs de porcos que possuíam o homólogo de domínio 8 hCD163L1 expressaram CD163 e suportaram a replicação de vírus de genótipo Tipo 2, mas não Tipo 1. A infecção de porcos CD163-modificados com vírus representativos de Tipo 1 e Tipo 2 produziu resultados semelhantes. Embora os vírus Tipo 1 e Tipo 2 sejam considerados geneticamente e fenotipicamente semelhantes em vários níveis, incluindo o requisito de CD163 como um receptor, os resultados demonstram uma diferença distinta entre os genótipos de PRRSV no reconhecimento da molécula de CD163.

MATERIAIS E MÉTODOS MODIFICAÇÕES GENÔMICAS DO GENE CD163 SUÍNO

[0303] Experimentos envolvendo animais e vírus foram realizados de acordo com o Guia da Federação das Sociedades de Ciência Animal para o Cuidado e Uso de Animais Agrícolas em Pesquisa e Ensino, o Ato de Bem- Estar Animal do USDA e Regulamentos de Bem-Estar Animal, e foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Biossegurança e Comitês

Institucionais de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Estadual do Kansas e da Universidade de Missouri. As mutações em CD163 usadas neste estudo foram criadas usando a tecnologia CRISPR/Cas9 conforme descrito acima nos exemplos anteriores. As mutações são diagramadas na Figura 17. A região genômica diagramada, mostrada na Figura 17, cobre a sequência do íntron 6 ao íntron 8 do gene CD163 suíno. Os íntrons e éxons diagramados na Figura 17 não estão em escala. O produto proteico previsto é ilustrado à direita de cada estrutura genômica. A expressão relativa de macrófagos, medida pelo nível de CD163 de superfície em PAMs, é mostrada na extremidade direita da Figura 17. As regiões pretas indicam íntrons; as regiões brancas indicam éxons; a região hachurada indica o mimetizador do éxon 11 de hCD163L1, o homólogo do éxon 7 suíno; e a região cinza indica um íntron sintetizado com o construto PGK Neo como mostrado na Figura 17

[0304] O construto do gene CD163 KO-d7 (11) mostrado na Figura 17 possui uma deleção de 11 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo

3.137 ao nucleotídeo 3.147. O construto do gene CD163 KO-i7 (2), possui uma inserção de 2 pares de bases no éxon 7 entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150, bem como uma deleção de 377 pares de bases no íntron a montante do éxon 7, do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949. Prevê-se que essas edições causem mutações de deslocamentos e códons de terminação prematuros, resultando na tradução apenas parcial de SRCR 5 e do fenótipo KO. Três outras mutações produziram deleções no éxon 7. A primeira, d7(129), tem uma deleção de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo

3.172. O construto d7(129) também tem uma deleção do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 no éxon 6, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pb. Os outros dois construtos de deleção, d7(1467) e d7(1280), têm deleções completas dos éxons 7 e 8, conforme ilustrado na Figura 17. O d7(1467) tem uma deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 e o d7(1280) tem uma deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097. Para esses construtos de deleção, os outros éxons de CD163 permaneceram intactos.

[0305] O último construto mostrado na Figura 17, HL11m, foi produzido usando um evento de direcionamento que deletou o éxon 7 e o substituiu com um éxon sintetizado que codificou um homólogo de SRCR 8 da proteína 1 semelhante a CD163 humana (domínio 8 de hCD163L1 é codificado pelo éxon 11 de hCD163L1). A sequência de peptídeo SRCR 8 foi criada fazendo alterações de 33 nucleotídeos na sequência do éxon 7 suíno. Um cassete de neomicina foi incluído no éxon sintetizado para permitir a triagem para a modificação. a SEQ ID NO: 118 fornece a sequência de nucleotídeos para o construto HL11m na região correspondente à mesma região na sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0306] Um diagrama da proteína e do gene CD163 suíno é fornecido Figura 18. Os domínios da proteína de CD163 SCRC (ovais) e PST (quadrados) juntamente com os éxons do gene correspondentes são mostrados no painel A da Figura 18. Uma comparação de sequência de peptídeos para SRCR 5 de CD163 suíno (SEQ ID NO: 120) e homólogo de SRCR 8 de CD163 humano (SEQ ID NO: 121) é apresentada no painel B da Figura 18. A figura é baseada nos números de acesso do GenBank AJ311716 (porco CD163) e GQ397482 (hCD163-L1).

VÍRUS

[0307] O painel de vírus usado neste exemplo está listado na Tabela 14. Os isolados foram propagados e titulados em células MARC-145 (Kim et al., 1993). Para titulação, cada vírus foi diluído em série 1:10 em MEM suplementado com 7% de FBS, Pen-Strep (80 unidades/ml e 80μg/ml, respectivamente), 3μg/ml de FUNGIZONA (anfotericina B) e HEPES 25 mM. As amostras diluídas foram adicionadas em quadruplicatas às células MARC-145 confluentes em uma placa de 96 poços para um volume final de 200 μl por poço e incubadas por quatro dias a 37 °C em 5% de CO 2. O ponto final da titulação foi identificado como o último poço com efeito citopático (CPE). A dose infecciosa de 50% da cultura de tecidos (TCID50/ml) foi calculada usando um método como descrito anteriormente (Reed e Muench 1938).

TABELA 14. ISOLADOS DE PRRSV. Vírus Genótipo Ano isolado Nº GenBank NVSL 97-7895 2 1997 AY545985 KS06-72109 2 2006 KM252867 P129 2 1995 AF494042 VR2332 2 1992 AY150564 CO90 2 2010 KM035799 AZ25 2 2010 KM035800 MLV-ResPRRS 2 NA* AF066183 KS62-06274 2 2006 KM035798 KS483 (SD23983) 2 1992 JX258843 CO84 2 2010 KM035802 SD13-15 1 2013 NA Lelystad 1 1991 M96262 03-1059 1 2003 NA 03-1060 1 2003 NA SD01-08 1 2001 DQ489311 4353PZ 1 2003 NA * NA, não disponível

INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS ALVEOLARES

[0308] A preparação e a infecção de macrófagos foram realizadas conforme descrito anteriormente (Gaudreault, et al., 2009 e Patton, et al., 2008). Os pulmões foram removidos dos porcos sacrificados e lavados vertendo 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) fria na traqueia. As traqueias foram pinçadas e os pulmões massageados suavemente. O conteúdo alveolar foi vertido em tubos de centrífuga de 50 ml e armazenado em gelo. Macrófagos alveolares suínos (PAMs) foram sedimentados por centrifugação a 1200 x g por 10 minutos a 4 °C. Os péletes foram ressuspensos e lavados uma vez em PBS estéril frio. Os péletes celulares foram ressuspensos em meio de congelamento contendo 45% de RPMI 1640, 45% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenados em nitrogênio líquido até o uso. As células congeladas foram descongeladas em gelo, contadas e ajustadas para 5x105 células/ml em meio (RPMI 1640 suplementado com FBS a 10%, PenStrep e FUNGIZONA; RPMI- FBS). Aproximadamente 103 PAMs por poço foram adicionados a placas de 96 poços e incubados de um dia para outro a 37 °C em 5% de CO2. As células foram lavadas suavemente para remover as células não aderentes. Diluições em série de 1:10 de vírus foram adicionadas a poços em triplicata. Após incubação de um dia para outro, as células foram lavadas com PBS e fixadas por 10 minutos com acetona a 80%. Após a secagem, os poços foram corados com mAb SDOW-17 específico da proteína N de PRRSV (Rural Technologies Inc.) diluído 1:1000 em PBS com gelatina de peixe a 1% (PBS-FG; Sigma Aldrich). Após uma incubação de 30 minutos a 37 °C, as células foram lavadas com PBS e coradas com IgG anti-camundongo marcado com ALEXA FLUOR 488 (Thermofisher Scientific) diluído 1:200 em PBS-FG. As placas foram incubadas por 30 minutos no escuro a 37 °C, lavadas com PBS e visualizadas em um microscópio de fluorescência. A dose infecciosa de 50% da cultura de tecidos (TCID50)/ml foi calculada de acordo com um método como descrito anteriormente (Reed e Muench 1938).

MEDIÇÃO DA EXPRESSÃO DE SUPERFÍCIE DE CD169 E CD163 EM PAMS

[0309] A coloração para a expressão de superfície de CD169 e CD163 foi realizada conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013).

Aproximadamente 1X106 PAMs foram colocados em tubos de citometria de fluxo de poliestireno (FACS) de 12 mm x 75 mm e incubados por 15 minutos à temperatura ambiente em 1 ml de PBS com 10% de soro normal de camundongo para bloquear os receptores Fc. As células foram peletizadas por centrifugação e ressuspensas em 5 μl de mAb de camundongo anti-CD169 suíno conjugado com FITC (clone 3B11/11; AbD Serotec) e 5 μl de mAb de camundongo anti-CD163 suíno conjugado com PE (Clone: 2A10/11, AbD Serotec). Após 30 minutos de incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS contendo albumina sérica bovina a 1% (fração BSA V; Hyclone) e imediatamente analisadas em um citômetro de fluxo BD LSR Fortessa (BD Biosciences) com software FCS Express 5 (De Novo Software). Um mínimo de

10.000 células foi analisado para cada amostra.

MEDIÇÃO DE VIREMIA DE PRRS

[0310] O RNA foi isolado de 50 μl de soro usando o kit de isolamento de viral MagMAX 96 da Ambion (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA de PRRSV foi quantificado usando reagentes alvo-específicos EZ-PRRSV MPX 4.0 de RT-PCR em tempo real (Tetracore) realizados de acordo com as instruções do fabricante. Cada placa continha padrões de quantificação Tetracore e conjuntos de controle projetados para uso com os reagentes de RT-PCR. A PCR foi realizada em um sistema de detecção de PCR em tempo real CFX96 Touch (Bio-Rad) em um formato de 96 poços usando os parâmetros de ciclagem recomendados. Os resultados do ensaio de PCR foram relatados como log10 do número de cópias do RNA de PRRSV por 50 μl de volume de reação, que se aproxima do número de cópias por ml de soro. A área sob a curva (AUC) para viremia ao longo do tempo foi calculada usando GraphPad Prism versão 6.00 para Windows.

MEDIÇÃO DE ANTICORPO DE PRRSV

[0311] O imunoensaio fluorescente de microesferas (FMIA) para a detecção de anticorpos contra a proteína do nucleocapsídeo (N) de PRRSV foi realizado conforme descrito anteriormente (Stephenson et al., 2015). A proteína N de PRRSV recombinante foi acoplada a contas de microesferas de poliestireno Luminex MAGPLEX carboxiladas de acordo com as instruções do fabricante. Para FMIA, aproximadamente 2500 contas revestidas com antígeno, suspensas em 50μL de PBS com 10% de soro de cabra (PBS-GS), foram colocadas em cada poço de uma placa de fundo redondo de poliestireno de 96 poços. Os soros foram diluídos 1:400 em PBS-GS e 50 μl foram adicionados a cada poço. A placa foi envolvida em papel alumínio e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. A placa foi colocada em um ímã e as contas foram lavadas três vezes com 190µl de PBS- GS. Para a detecção de IgG, 50 µl de anticorpo secundário de cabra anti-suíno purificado por afinidade conjugado com biotina-SP (IgG, Jackson ImmunoResearch) foram diluídos para 2 µg/ml em PBS-GS e 100 µl adicionado a cada poço. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos e lavada três vezes seguida da adição de 50 µl de ficoeritrina conjugada com estreptavidina (2 µg/ml em PBS-GS; SAPE). Após 30 minutos, as microesferas foram lavadas, ressuspensas em 100 µl de PBS-GS e analisadas usando um instrumento MAGPIX (LUMINEX) e software LUMINEX xPONENT 4.2. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi calculada em um mínimo de 100 contas de microesferas.

MEDIÇÃO DE HAPTOGLOBINA (HP)

[0312] A quantidade de Hp no soro foi medida usando um kit Hp ELISA específico para suíno (Genway Biotech Inc.) e as etapas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Amostras de soro foram diluídas 1:10.000 em solução diluente 1X e pipetadas em duplicata em uma placa de ELISA de 96 poços anti-porco pré-revestida, incubada em temperatura ambiente por 15 minutos, depois lavada três vezes. O conjugado anti-Hp- peroxidase de rábano silvestre (HRP) foi adicionado a cada poço e incubado no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos. A placa foi lavada e 100 µl de solução de substrato de cromogênio foram adicionados a cada poço. Após a incubação no escuro por 10 minutos, 100 µl de solução de parada foram adicionados a cada poço. A placa foi lida a 450 nm em um leitor de microplacas baseado em filtro Fluostar Omega (BMG Labtech).

RESULTADOS P ROPRIEDADES FENOTÍPICAS DE PAMS DE P ORCOS CD163-MODIFICADOS

[0313] As propriedades de dispersão frontal e lateral das células no material de lavagem pulmonar foram utilizadas para a passagem na subpopulação mononuclear de células. Resultados de coloração de CD169 e CD163 representativos para as diferentes modificações cromossômicas mostradas na Figura 17 são apresentados na Figura 19.

No exemplo representativo apresentado no painel A da Figura 19, mais de 91% dos PAMs dos porcos WT foram positivos para CD169 e CD163. Os resultados de 12 porcos WT usados neste estudo mostraram uma média de 85 +/- 8% de células duplo-positivo. Conforme mostrado no painel B da Figura 19, os PAMs dos porcos CD163 KO não mostraram evidências de CD163, mas mantiveram os níveis de CD169 de superfície normais.

Embora tenha sido previsto que os polipeptídeos CD163 derivados dos genótipos de deleção d7(1467) e d7(1280) devam produzir polipeptídeos CD163 modificados ancorados à superfície PAM, os resultados de imunocoloração não mostraram expressão de superfície de CD163 (ver Figura 19, painel D). Uma vez que o MAb 2A10 reconhece um epítopo localizado nos primeiros três domínios de SRCR, a ausência de detecção não foi o resultado da deleção de um epítopo imunorreativo. O genótipo d7(129) foi previsto como possuindo uma deleção de 43 aminoácidos no SRCR 5 (ver Figura 17). No exemplo apresentado no painel C da Figura 19, apenas 2,4% das células caíram no quadrante duplo-positivo. A análise de PAMs de nove porcos d7(129) usados neste estudo mostrou porcentagens de células duplo-positivo variando de 0% a 3,6% (média = 0,9%). A expressão de superfície de CD169 permaneceu semelhante a

PAMs WT. Para o propósito deste estudo, porcos possuindo os genótipos KO, d7(1467), d7(1280) e d7(129) foram todos categorizados como possuindo um fenótipo CD163-nulo.

[0314] A modificação CD163 contendo a sequência de peptídeo de domínio 8 hCD163L1 HL11m, mostrou expressão dupla de CD163+ e CD169 + em PAMs (painel e da Figura 19). No entanto, em todos os porcos HL11m analisados neste estudo, a expressão de superfície de CD163 foi significativamente reduzida em comparação com os PAMs WT.

Os níveis de CD163 caíram em um continuum de expressão, variando de CD163 não detectável a porcos possuindo níveis moderados de CD163. No exemplo mostrado no painel e da Figura 19, aproximadamente 60% das células estavam no quadrante duplo-positivo, enquanto 40% das células coraram apenas para CD169. A análise de PAMs de um total de 24 porcos HL11m mostrou que 38 +/- 12% das células PAM eram positivas apenas para CD169 e 54 +/- 14% eram duplo-positivo (CD169 + CD163+).

NÍVEIS CIRCULANTES DE HAPTOGLOBINA EM PORCOS WT E CD163-

MODIFICADOS

[0315] Como uma molécula de eliminação, CD163 é responsável por remover complexos de HbHp do sangue (Fabriek, et al., 2005; Kristiansen et al., 2001; e Madsen et al., 2004). O nível de Hp no soro fornece um método conveniente para determinar as propriedades funcionais gerais de macrófagos que expressam CD163. Os níveis de Hp no soro de porcos WT, HL11m e CD163-nulo foram medidos com três a quatro semanas de idade, imediatamente antes da infecção com PRRSV. Os resultados, apresentados na Figura 20, mostraram que os soros de porcos WT tinham as menores quantidades de Hb (média A450 = 23 +/- 0,18, n = 10). A média e o desvio padrão para cada grupo foram WT, 0,23 +/- 0,18, n = 10; HL11m, 1,63 +/- 0,8, n = 11; e 2,06 +/- 0,57, n = 9, para o grupo nulo.

O grupo nulo era composto por genótipos que não expressavam CD163 (porcos com fenótipo de CD163 nulo). As medições de Hp foram feitas em uma única placa de ELISA. Os grupos com a mesma letra não foram significativamente diferentes (p > 0,05, ANOVA unilateral de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunnett). O valor médio de A450 para porcos WT foi significativamente diferente daquele dos porcos HL11m e CD163-nulo (p < 0,05). Embora o valor médio de A450 tenha sido menor para o grupo HL11m em comparação com o grupo CD163-nulo (A450 = 1,6 +/- 0,8 versus 2,1 +/- 0,6), a diferença não foi estatisticamente significativa. Uma vez que a interação entre HbHp e CD163 ocorre por meio de SRCR 3 (Madsen et al., 2004), o aumento de Hp circulante em porcos HL11m em comparação com porcos WT provavelmente não foi uma consequência de uma afinidade reduzida de CD163 para Hb/Hp, mas o resultado de números reduzidos de macrófagos CD163 + juntamente com expressão de CD163 reduzida nos macrófagos restantes (ver painel e da Figura 19).

INFECÇÃO DE PAMS COM VÍRUS TIPO 1 E TIPO 2

[0316] A permissividade dos porcos CD163-modificados para PRRSV foi avaliada inicialmente infectando células de PAM in vitro com um painel de seis isolados de PRRSV Tipo 1 e nove Tipo 2 (ver Tabela 14 para a lista de vírus). Os vírus no painel representam diferentes genótipos, bem como diferenças nas sequências de nucleotídeos e peptídeos, patogênese e anos de isolamento. Os dados apresentados na Tabela 15 mostram os resultados de experimentos usando PAMs de três porcos para cada grupo de genótipo CD163. Os vírus listados correspondem aos isolados de PRRSV listados na Tabela 14. Os resultados são mostrados como média +/- desvio padrão da porcentagem de PAMs infectados. Os PAMs CD163-nulo eram de porcos que expressam o alelo d7(129) (ver Figuras 17 e 19 para construtos do gene CD163 e expressão de CD163 em PAMs, respectivamente).

TABELA 15. INFECÇÃO DE PAMS DE PORCOS DO TIPO SELVAGEM E GE COM

DIFERENTES ISOLADOS DE PRRSV Genótipo/ Fenótipo (%de infecção) Tipo 1 WT (%) HL11m Nulo 13-15 56 +/- 9 0 0 Lelystad 62 +/- 15 0 0 03-1059 50 +/- 18 0 0 03-1060 61 +/- 12 0 0 01-08 64 +/- 20 0 0 4353-PZ 62 +/- 15 0 0 Tipo 2 WT (%) HL11m Nulo NVSL 97 59 +/- 15 8 +/- 08 0 KS-06 56 +/- 20 12 +/- 09 0 P129 64 +/- 11 8 +/- 06 0 VR2332 54 +/- 05 6 +/- 03 0 CO 10-90 43 +/- 18 8 +/- 08 0 CO 10-84 51 +/- 22 7 +/- 04 0 MLV-ResP 55 +/- 12 3 +/- 01 0 KS62 49 +/- 03 10 +/- 11 0 KS483 55 +/- 23 6 +/- 03 0

[0317] Como esperado, os PAMs WT foram infectados por todos os vírus. Em contraste, os porcos com fenótipo CD163-nulo foram negativos para infecção por todos os vírus. Uma diferença marcante foi observada na resposta de PAMs dos porcos HL11m. Nenhum dos vírus Tipo 1 foi capaz de infectar os PAMs HL11m; ao passo que todos os vírus no painel Tipo 2 infectaram os PAMs HL11m, embora em porcentagens muito menores em comparação com os PAMs WT.

[0318] A permissividade também foi avaliada pela comparação de pontos finais de titulação de vírus entre PAMs WT e HL11m para os mesmos vírus Tipo 2. Os resultados são mostrados para dois porcos WT e dois HL11m (Figura 21). Os valores log10TCID50 foram calculados com base na infecção de culturas de macrófagos com a mesma amostra de vírus. Os resultados da infecção representam dois porcos diferentes de cada genótipo. Os vírus usados para infecção estão listados na Tabela 14. Os valores log10TCID50 para PAMs de porcos HL11m foram 1-3 logs mais baixos em comparação com PAMs WT infectados com o mesmo vírus. A única exceção foi a infecção com uma cepa de vacina de vírus vivo modificado. Quando tomados em conjunto, os resultados sugerem que os PAMs de porcos HL11m possuem uma susceptibilidade ou permissividade reduzida à infecção com vírus Tipo 2.

INFECÇÃO DE PORCOS CD163-MODIFICADOS COM VÍRUS TIPO 1 E TIPO 2

[0319] Porcos WT (círculos), HL11m (quadrados) e CD163-nulo (triângulos) foram infectados com vírus Tipo 1 representativo (SD13-15) (Figura 22, painel A, gráfico da esquerda) e Tipo 2 (NVSL 97-7895) (Figura 22, painel A, gráfico da direita). Os porcos de fenótipo nulo foram derivados dos alelos KO e d(1567) (ver Figura 17). Porcos dos três genótipos inoculados com o mesmo vírus foram misturados em um cercado, o que permitiu a exposição contínua de porcos CD163-modificados ao vírus expelido de companheiros de cercado WT.

O número de porcos infectados com o vírus Tipo 1 representativo foi: WT (n = 4), HL11m (n = 5) e Nulo (n = 3); e vírus Tipo 2: WT (n = 4), HL11m (n = 4) e Nulo (n = 3). Como mostrado na Figura 22, os porcos CD163-nulo infectados com o vírus Tipo 1 ou Tipo 2 foram negativos para viremia em todos os instantes e não seroconverteram. Como esperado, os porcos WT foram infectados produtivamente, possuindo níveis médios de viremia de aproximadamente 106 moldes por 50 μl de reação de PCR em 7 dias após a infecção para ambos os vírus. Aos 14 dias, todos os porcos WT tinham seroconvertido (ver Figura 22, painel B). Consistente com os resultados da infecção de PAM (Tabela 15), os cinco porcos HL11m infectados com o vírus Tipo 1 não mostraram evidência de viremia ou anticorpo PRRSV. Todos os porcos HL11m infectados com o isolado Tipo 2, NVSL, suportaram infecção e seroconverteram (Figura 22, painel B). A presença de uma permissão reduzida dos porcos HL11m não foi clara. A viremia média para três dos quatro porcos

HL11m foi semelhante à dos porcos WT. No entanto, para um porco HL11m, #101 (quadrados abertos na Figura 22, gráfico à direita do painel A), a viremia foi muito reduzida em comparação com os outros porcos no grupo de genótipo HL11m. Uma explicação para a redução logarítmica de 3 a 4 na viremia para o Porco #101 não foi clara, mas sugeriu que alguns porcos HL11m podem ser menos permissivos para PRRSV, uma observação que apoia os resultados de infecção PAM in vitro (Tabela 15). Uma vez que todos os porcos foram inoculados com a mesma quantidade de vírus e permaneceram misturados com os porcos WT, a viremia mais baixa no Porco #101 não foi o resultado de receber uma quantidade menor de vírus ou menos exposição ao vírus. A citometria de fluxo de macrófagos mostrou que a expressão de CD163 para o Porco #101 foi comparável à de outros porcos HL11m (dados não mostrados).

Não houve diferença na sequência na sequência mimetizadora do éxon 11.

[0320] Ensaios de infecção de vírus adicionais foram realizados usando dois vírus, NVSL 97-7895 e KS06-72109. Os resultados são mostrados na Figura 23. Os porcos foram acompanhados por 35 dias após a infecção e os dados relatados como a área sob a curva (AUC) para medições de viremia feitas a 3, 7, 11, 14, 21, 28 e 35 dias após a infecção. Como mostrado na Figura 23, para NVSL, o valor médio de AUC para os sete porcos WT infectados com NVSL foi 168 +/- 8 contra 165 +/- 15 para os sete porcos HL11m. Para KS06, os valores médios de AUC para os seis porcos WT e seis HL11m foram 156 +/- 9 e 163 +/- 13, respectivamente. Para ambos os vírus, não houve diferença estatisticamente significativa entre os porcos WT e HL11m (p > 0,05). Quando tomados em conjunto, os resultados mostraram que os porcos HL11m não suportaram a infecção com PRRSV Tipo 1, mas mantiveram a permissividade para infecção com vírus Tipo 2. Embora tenha havido uma redução na permissividade de PRRSV de PAMs de porcos HL11m infectados in vitro com os isolados do Tipo 2, essa diferença não se traduziu para o porco. Para os resultados mostrados na Figura 23, a carga de vírus foi determinada calculando a área sob a curva (AUC) para cada porco ao longo de um período de infecção de 35 dias. O cálculo da AUC foi realizado usando medições de viremia de PCR log10 tomadas em 0, 4, 7, 10, 14, 21, 28 e 35 dias após a infecção. As linhas horizontais mostram a média e o desvio padrão.

Legenda: WT = porcos do tipo selvagem, HL11 = porcos com genótipo HL11m; Nulo = genótipo CD163-nulo.

DISCUSSÃO

[0321] A CD163 é uma proteína de superfície de macrófago importante para eliminar o excesso de Hb do sangue e modular a inflamação em resposta a danos nos tecidos. Ela também funciona como um receptor de vírus. A CD163 participa de respostas pró- e antiinflamatórias (Van Gorp et al., 2010). Os macrófagos positivos para CD163 são colocados dentro do grupo de macrófagos M2 alternativamente ativados, que são geralmente descritos como altamente fagocíticos e antiinflamatórios. Os macrófagos M2 participam da limpeza e do reparo após dano mecânico do tecido ou infecção (Stein et al., 1992). Em uma capacidade antiinflamatória, a expressão de CD163 é regulada positivamente por proteínas antiinflamatórias, como a IL-10 (Sulahian, et al., 2002). Durante a inflamação, a CD163 diminui a inflamação reduzindo a oxidação por meio da remoção do heme circulante do sangue. Produtos de degradação do heme, tais como bilverdina, bilirrubina e monóxido de carbono, são moléculas antiinflamatórias potentes (Soares e Bach, 2009 e Jeney et al., 2002). Em uma capacidade pró-inflamatória, a reticulação de CD163 na superfície do macrófago por anticorpo anti-CD163 ou bactérias resulta na liberação localizada de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6, GM-CSF, TNFα e IL-1β (Van den Heuvel et al., 1999 e Fabriek et al., 2009).

[0322] Os porcos GE que carecem de CD163 não suportam a replicação de um isolado de PRRSV Tipo 2 (Whitworth et al., 2016). Neste estudo, os ensaios de infecção in vitro demonstram a resistência de macrófagos de fenótipo CD163 nulo a um extenso painel de isolados de PRRSV Tipo 1 e Tipo 2, estendendo ainda mais a resistência para incluir potencialmente todos os isolados de PRRSV (Tabela 15). A resistência dos macrófagos do fenótipo CD163-nulo aos vírus Tipo 1 e Tipo 2 foi confirmada in vivo (Figura 22 e Figura 23). Com base nesses resultados, a contribuição de outros receptores de PRRSV previamente descritos na literatura (Zhang e Yoo, 2015) pode ser descartada. Por exemplo, Shanmukhappa et al. (2007) mostraram que células BHK não permissivas transfectadas com um plasmídeo CD151 adquiriram a capacidade de suportar a replicação de PRRSV, e a incubação com um anticorpo policlonal anti-CD151 mostrou reduzir significativamente a infecção de células MARC-145. Além disso, uma linhagem celular de símio, SJPL, originalmente desenvolvida para uso na propagação de vírus da gripe suína, mostrou anteriormente suportar a replicação de PRRSV (Provost, et al., 2012). Propriedades importantes da linhagem celular SJPL incluíram a presença de CD151 e a ausência de sialoadesina e CD163.

Quando considerados em conjunto, esses dados forneceram evidências convincentes de que a presença de CD151 por si só é suficiente para suportar a replicação de PRRSV. Os resultados deste estudo mostrando a ausência de infecção por PRRSV em macrófagos e porcos possuindo um fenótipo CD163 nulo indica que o CD151, como um receptor alternativo para PRRSV, não é biologicamente relevante.

[0323] As proteínas virais GP2a e GP4, que fazem parte do complexo de heterotrímero GP2a, GP3, GP4 na superfície de PRRSV, podem ser co-precipitadas com CD163 em ensaios pull-down de células transfectadas com plasmídeos GP2 e GP4 (Das, et al., 2009). Presumivelmente, GP2 e GP4 formam uma interação com um ou mais dos domínios de SRCR de CD163.

Ensaios de infecciosidade in vitro incorporando uma estrutura de cDNA de

CD163 suíno contendo uma troca de domínio entre SRCR 5 suíno e o homólogo de SRCR 8 de hCD163-L1 localizaram ainda a região utilizada pelos vírus Tipo 1 para SRCR 5 (Van Gorp, et al., 2010). É interessante especular que a interação estável entre GP2/ GP4 e CD163 ocorre por meio de SRCR 5.

Glicoproteínas virais adicionais, tais como GP3 e GP5, podem estabilizar ainda mais o complexo vírus-receptor ou podem funcionar como moléculas co- receptoras. A necessidade de SRCR 5 foi investigada neste estudo infectando macrófagos e porcos possuindo o alelo HL11m, que recriou a troca de domínio de SRCR 8 de CD163L1 fazendo substituições de 33 pb no éxon 7 suíno. O alelo HL11m também incluiu um cassete de neomicina para seleção de células positivas para a alteração genética (Figura 17). Os porcos HL11m expressaram CD163 em PAMs, embora em níveis reduzidos em comparação com PAMs WT (Figura 19, compare os painéis A e E). A expressão reduzida foi provavelmente devido à presença do cassete de neomicina, que estava localizado entre o mimetizador do éxon 11 e o íntron seguinte. Os porcos HL11m não foram permissivos para a infecção com o vírus Tipo 1, confirmando a importância do SRCR 5. No entanto, macrófagos HL11m e porcos HL11m suportaram infecção com o vírus Tipo 2. Com base nos resultados de titulação do vírus e da porcentagem de infecção, os PAMs dos porcos HL11m mostraram uma diminuição geral na permissividade para o vírus em comparação com os macrófagos WT (Tabela 15 e Figura 17). A diminuição da permissividade pode ser devido aos níveis reduzidos de CD163 nos macrófagos HL11m, combinados com uma afinidade reduzida do vírus para a proteína de CD163 modificada. Assumindo que o vírus Tipo 2 possui um requisito de SRCR 5 e que L1 SRCR 8 pode funcionar como um substituto adequado, a menor afinidade pode ser explicada pela diferença nas sequências de peptídeos entre SRCR 8 humano e SRCR 5 suíno (ver Figura 18, painel B). No entanto, a permissividade reduzida dos PAMs não se traduziu para o porco. A viremia média para os porcos HL11m não foi significativamente diferente quando comparada aos porcos WT (Figura 23). Além dos PAMs, a infecção por PRRSV de macrófagos do tecido intravascular, septal e linfóide contribui para a viremia (Lawson et al., 1997 e Morgan et al., 2014). As contribuições potenciais dessas e de outras populações de células positivas para CD163 na manutenção da carga viral geral em porcos HL11m merecem estudo adicional.

[0324] Embora os plasmídeos CD163 possuindo deleções de domínios de SRCR sejam estavelmente expressos em células HEK (Van Gorp et al., 2010), a deleção dos éxons 7 e 8 em d7(1467) e d7(1280) resultou na falta de expressão de superfície detectável de CD163 (Figura 19, painel D).

Uma vez que o mAB 2A10 usado para citometria de fluxo reconhece os três domínios de SRCR N-terminais (Van Gorp et al., 2010), e possivelmente o 7º e 8º domínios (Sanchez, et al., 1999), a ausência de detecção não era devida à remoção de um epítopo 2A10 nas proteínas mutadas. Embora uma pequena quantidade de expressão de CD163 pudesse ser detectada em PAMs de alguns dos porcos d7(129) (ver Figura 19, painel C), a quantidade de proteína expressa não foi suficiente para suportar a infecção por PRRSV em PAMs ou porcos. A ausência de expressão de CD163 nos mutantes de deleção do éxon 7 e 8 não é totalmente compreendida, mas é provavelmente o resultado de degradação de mRNA e/ou de proteína.

[0325] Em 2003, a CD163 foi identificada como um receptor para o vírus da peste suína africana (ASFV; Sánchez-Torres et al., 2003). Esta conclusão foi baseada na observação de que macrófagos infectados possuem um fenótipo maduro positivo para CD163, e anticorpos anti-CD163, tais como 2A10, bloqueiam a infecção por ASFV de macrófagos in vitro. Resta ser determinado se os porcos CD163-nulo são resistentes à infecção por ASFV.

[0326] Os modelos de cultura celular que incorporam modificações ao receptor de PRRSV forneceram informações valiosas para os mecanismos de entrada, replicação e patogênese de PRRSV. Um aspecto único deste estudo foi a condução de experimentos paralelos in vivo usando porcos receptor-modificados. Esta pesquisa tem impactos importantes na viabilidade do desenvolvimento de curas preventivas para uma das doenças mais sérias já enfrentadas pela indústria suína global.

EXEMPLO 4: INATIVANTE DE CD163 MATERNO PROTEGENDO OS FETOS DA INFECÇÃO COM O VÍRUS DA SÍNDROME RESPIRATÓRIA E REPRODUTIVA SUÍNA (PRRSV).

[0327] Os exemplos 1 a 3 acima demonstram que os porcos com um inativante completo (KO) do gene CD163 não têm expressão de CD163 nos macrófagos e não suportam a infecção por PRRSV (ver também Whitworth et al., 2016; Wells et al., 2017). Uma vez que a expressão de CD163 é uma característica dominante e herdada de uma forma Mendeliana clássica, a prole que possui expressão e função de CD163 normal pode ser derivada cruzando uma porca KO CD163-/- com um macho selvagem (WT) CD163+/+. Para este estudo, as porcas CD163 KO foram cruzadas com machos WT, produzindo fetos heterozigotos CD163+/-, a fim de determinar se a presença do genótipo CD163 KO da mãe seria suficiente para proteger os fetos após a infecção materna com PRRSV. Neste estudo, fetos positivos para CD163, recuperados entre 109 dias de gestação ou 20 dias após a infecção materna, foram completamente protegidos de PRRSV em mães que possuíam um inativante completo do receptor CD163. Os resultados demonstram um meio prático de eliminar as doenças reprodutivas associadas ao PRRSV, uma importante fonte de dificuldades econômicas para a agricultura.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0328] Edição do gene CD163. Os métodos CRISPR/ Cas9 usados para gerar todos os alelos KO são descritos em detalhes nos Exemplos 1 a 3 acima. Animais de tipo selvagem e inativante, ou animais heterozigotos gerados conforme descrito nos Exemplos 1 a 3 e tendo os alelos descritos na

Tabela 16 foram usados nos experimentos descritos neste Exemplo. Cada um desses alelos é descrito nos Exemplos 1 a 3 e na Publicação PCT Nº WO 2017/023570, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. As edições específicas para os alelos B, D e E também são descritas em Whitworth et al., 2014, e a edição específica no Alelo C (inserção de 2 bp) é descrita em Whitworth et al., 2016. Todos os alelos descritos na Tabela 16 foram identificados com base no sequenciamento de DNA. O genótipo inativante foi confirmado pela ausência de expressão de CD163, que foi medida pela coloração de macrófagos alveolares com mAb anti-CD163, 2A10, como descrito acima no Exemplo 2.

TABELA 16. ALELOS CD163.

SEQ ID Alelo Descrição Em referência à SEQ ID NO: 47 NO.

SEQ ID NO: 47 (sequência parcial A Tipo selvagem 47 WT CD163 incluindo o exon 7) Inserção de 7 pares de bases entre o Knockout nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo B (inserção de 7 bp 3.149 em comparação com a 99 no exon 7) sequência de referência SEQ ID NO: 47 Inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de Knockout referência SEQ ID NO: 47, com uma C (inserção de 2 bp 103 deleção de 377 pares de bases do no exon 7) nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo

2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47, no mesmo alelo Deleção de 11 pares de bases do Knockout nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo D (deleção de 11 bp 3.147 em comparação com a 102 no exon 7) sequência de referência SEQ ID NO:

47.

Deleção de 1382 pares de bases do Knockout nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo (deleção de 1382

4.494 em comparação com a bp que incluiu sequência de referência SEQ ID NO: E parte do exon 7 e 113 47, em que a sequência deletada é 8 com uma substituída por uma inserção de 11 inserção de 11 bp pares de bases começando no no exon 7) nucleotídeo 3.113

[0329] Infecção por PRRSV. A cepa PRRSV usada neste estudo, NVSL 97-7895 (NVSL), é uma cepa de laboratório isolada em 1997 de um rebanho no sudeste de Iowa, EUA, que estava passando por uma tempestade de aborto de PRRS (Halbur et al., 1997). O vírus, mantido como um isolado de baixa passagem, foi propagado e titulado em células MARC-145. Aos 89 a 91 dias de gestação, as porcas foram inoculadas com 105 TCID50 de vírus diluído em 5 ml de meio de cultura. Metade do inóculo foi administrado por injeção intramuscular e o restante foi administrado por via intranasal. Todas as porcas foram mantidas em um ambiente que permitisse a exposição contínua ao vírus liberado por companheiros infectados. Amostras de sangue foram coletadas das porcas antes da infecção, sete dias após a inoculação (dpi) e no momento da eutanásia. O ácido nucleico de PRRSV foi medido pelo isolamento do RNA total do soro seguido por PCR de PRRSV em tempo real com transcriptase reversa (Tetracore, Rockville, MD). Uma curva padrão foi gerada usando os padrões de quantificação fornecidos no kit RT-PCR. Os resultados são relatados como modelos log10 por reação de 25 μl, que se aproxima do número de modelos de RNA viral por ml de sangue.

RESULTADOS

[0330] Uma descrição detalhada dos alelos knockout usados neste estudo é mostrada na Tabela 16 acima. Cada alelo inativante possuía uma mutação no exon 7 que se previa que resultaria em uma mudança de quadro do códon seguida por um códon de parada prematuro no mRNA. Os acasalamentos entre os pais WT e CD163 KO estão resumidos na Tabela 17.

O primeiro grupo de três mães, que serviram como controles de infecção positiva, eram mães CD163+/+ portadoras de fetos CD163+/+ (grupo ++/ ++). Um segundo grupo (--/ +-) eram mães CD163-/- portadoras de fetos CD163+/-. Neste grupo, as mães CD163-/- são incapazes de suportar a replicação de PRRS, enquanto os fetos CD163+/- retêm suscetibilidade à infecção por PRRS. E, finalmente, um terceiro grupo (--/ --) consistia em mães CD163-/- portadoras de fetos CD163-/-. Para o último grupo, mães e fetos devem ser resistentes à infecção.

TABELA 17. GENÓTIPOS PARENTAIS E FETAIS DE CD163.

Genótipo CD163 Coleção de Fetos Porca No. Pais*1 Dia da Dia da No. de Feto Macho Parideira Infecção *2 gestação *3 Fetos 138 +/+ (A/A) +/+ (A/A) +/+ 91 106 16 139*4 +/+ (A/A) +/+ (A/A) +/+ 91 106 14 140 +/+ (A/A) +/+ (A/A) +/+ 91 106 12 84 +/+ (A/A) -/- (B/C) +/- 89 109 14

87 +/+ (A/A) -/- (B/C) +/- 89 109 17 122 +/+ (A/A) -/- (E/C) +/- 89 109 11 86 -/- (C/D) -/- (B/D) -/- 90 109 7 121 -/- (C/D) -/- (B/D) -/- 90 109 9 * 1 Alelos CD163 são identificados na Tabela 1 * 2 dias de gestação em que as mães foram infectadas * 3 dias de gestação em que os fetos foram removidos * 4 mães infectadas com PRRSV abortadas aos 106 dias de gestação

[0331] Os sinais clínicos nas mães infectadas do tipo selvagem (WT) incluíram letargia e inapetência transitória. As parideiras KO não mostraram sinais clínicos. Durante o período de estudo, uma parideira WT, nº 139, abortou no dia 106 de gestação (15 dpi). O ácido nucleico de PRRSV, medido a 7 dpi, mostrou um nível de viremia para a parideira No. 139 de 5,5 modelos log10 por reação, demonstrando a presença de uma infecção de PRRSV produtiva. Entre 15 e 20 dpi, todas as mães restantes foram sacrificadas e os cornos uterinos removidos imediatamente. Começando na ponta de cada corno, fetos e placentas foram removidos e avaliados quanto à presença de patologia anatômica. Uma amostra de sangue foi obtida de cada feto. Se não fosse possível obter sangue, uma amostra de fluido era coletada da cavidade abdominal. O número de fetos recuperados de cada mãe está listado na Tabela 17. Para o grupo CD163 WT ++/ ++) (incluindo a mãe que abortou), o número de fetos foi de 16, 14 e 12 (média = 14,0). As mães CD163 KO carregando os fetos CD163+/- (grupo --/ +-) geraram 14, 17 e 11 fetos (média = 13,6). Para as mães CD163 KO portadoras de fetos CD163 KO (grupo --/ --), o número de fetos foi 7 e 9. Os resultados para viremia fetal e patologia bruta estão resumidos na Figura 24 e Tabela 18.

[0332] Tabela 18. Resumo da infecção fetal e patologia. *1

Viremia Porca Genótipo Genótipo No. total Nº de fetos Patologia Parideira No. Parideira do Feto de fetos infectados *3 *2 138 +/+ +/+ 16 3.6 13 (80%) 8 (50%) 139*4 +/+ +/+ 14 5.5 ND ND 140 +/+ +/+ 12 4.1 11 (92) 8 (72) 84 -/- +/- 14 N 0 (0) 1 (07) 87 -/- +/- 17 N 0 (0) 1 (06) 122 -/- +/- 11 N 0 (0) 0 (0) 86 -/- -/- 7 N 0 (0) 0 (0) 121 -/- -/- 9 N 0 (0) 0 (0) *1 A tabela é um resumo combinado dos dados apresentados na Tabela 17 e Figura 24 *2 Viremia mostrada como modelos nucleicos de vírus log10 por PCR *3 Fetos mostrando patologia, conforme descrito para a Figura 24 *4 Porca abortou antes da recuperação dos fetos

[0333] A Figura 24 descreve cada um dos resultados fetais após infecção materna com PRRSV. Os números à esquerda identificam cada parideira. Abaixo de cada parideira entre parênteses está o resultado para PRRS do PCR no soro, medido como modelos log10 por reação. “N” é negativo para ácido nucleico de PRRSV (Ct > 39). Os fetos são identificados por número e posição relativa dentro de cada corno uterino. Os asteriscos identificam as amostras de PCR fetal obtidas do fluido abdominal. O número abaixo de cada feto é o resultado de PRRS do PCR no soro fetal (modelos log10 por reação). O número dentro de cada círculo refere-se à presença de patologia anatômica: 1) feto normal; 2) feto pequeno; 3) alterações na placenta, como descolamento de placenta e/ ou necrose; 4) feto corado com mecônio; 5) o feto está morto e necrótico. As letras minúsculas identificam o genótipo dos fetos individuais (ver Tabela 17). Chave: a, A/ A; b, C/ A; c, B/ A; d, E/ A; e, B/ C; f, B/ D; g, D/ C; h, D/ D; i, E/ C; j, E/ D; ND não determinado porque o feto estava necrótico; nd o genótipo não foi determinado.

[0334] A nível anatômico, 50% e 72% dos fetos derivados das duas mães CD163 WT (++/ ++), No. 138 e No. 140, mostraram algum grau de patologia, incluindo fetos menores do que o normal (11% de todos os fetos), fetos com placentas descoladas ou necróticas (14%), coloração de mecônio (7%) e fetos que estavam mortos e necróticos (25%). As observações da patologia são típicas de PRRS reprodutivo. As mesmas ninhadas mostraram uma alta taxa de infecção por PRRSV, com 92% dos fetos testando positivo para a presença de ácido nucleico de PRRSV. Os resultados do PCR para os fetos das mães WT ilustram duas propriedades importantes da infecção fetal por PRRSV. Primeiro, havia uma grande variação entre os fetos na concentração do vírus detectado no soro, resultado da infecção dos fetos em momentos diferentes. Em segundo lugar, o nível de viremia nem sempre foi correlacionado com a patologia. Por exemplo, o Feto No. 5 da parideira No.

138 possuía um alto nível de viremia (7,3 modelos log10 por reação) e ainda assim o feto não parecia afetado. A razão para a discrepância entre a viremia e a patologia não é clara. Uma possibilidade é que a patologia fetal seja o resultado de dano tecidual que ocorre no lado materno e não relacionado ao nível de viremia fetal. No campo, esses leitões recém-nascidos normais, mas infectados, podem funcionar como “supershedders”, o que facilita a rápida disseminação de PRRSV em um sistema de produção. Para o grupo --/ +- (mães nº 84, 87 e 122), todos os fetos pareciam normais, com a pequena exceção de dois fetos menores do que os outros irmãos da mesma ninhada. O tamanho menor do que o normal é provavelmente uma consequência do apinhamento dentro do corno uterino que diminui a área de superfície da placenta, restringindo assim o crescimento do feto em desenvolvimento. Todas as mães e fetos no grupo --/ +- foram negativos para a presença de ácido nucleico de PRRSV. Para o último grupo, --/ --, não havia patologia visível, e todas as mães (nº 86 e 121) e fetos eram negativos para ácido nucleico de PRRSV.

[0335] Os resultados deste estudo demonstram claramente que a ausência de CD163 na mãe é suficiente para proteger o feto suscetível a PRRSV. Embora a prole CD163-positiva derivada de mães CD163 KO sejam suscetíveis ao vírus imediatamente após o nascimento, a proteção contra PRRSV no útero fornece um meio de eliminar uma fonte importante de perda econômica e sofrimento animal.

[0336] Os exemplos aqui divulgados são fornecidos a título de exemplificação e não se destinam a limitar o escopo da invenção.

[0337] Em vista do acima exposto, será visto que os vários objetivos da invenção são alcançados e outros resultados vantajosos obtidos.

[0338] Como várias alterações podem ser feitas nos produtos e métodos acima sem se afastar do escopo da invenção, pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima e mostrada nos desenhos anexos seja interpretada como ilustrativa e não como um sentido limitante.

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TABELA DE SEQUÊNCIAS

SEQ TIPO DESCRIÇÃO SEQ ID NO: 1 nucleotídeo CRISPR 10 SEQ ID NO: 2 nucleotídeo CRISPR 131 SEQ ID NO: 3 nucleotídeo CRISPR 256 SEQ ID NO: 4 nucleotídeo CRISPR 282 SEQ ID NO: 5 nucleotídeo CRISPR 4800 SEQ ID NO: 6 nucleotídeo CRISPR 5620 SEQ ID NO: 7 nucleotídeo CRISPR 5626 SEQ ID NO: 8 nucleotídeo CRISPR 5350 SEQ ID NO: 9 nucleotídeo eGFP1 SEQ ID NO: 10 nucleotídeo eGFP2 SEQ ID NO: 11 nucleotídeo fragmento do iniciador direto 9538 SEQ ID NO: 12 nucleotídeo fragmento do iniciador reverso 9538 SEQ ID NO: 13 nucleotídeo fragmento do iniciador direto 8729 SEQ ID NO: 14 nucleotídeo fragmento do iniciador direto 8729 SEQ ID NO: 15 nucleotídeo TIPO SELVAGEM CD163 SEQ ID NO: 16 nucleotídeo Figura 4, painel C WT SEQ ID NO: 17 nucleotídeo Figura 4, painel C #1 SEQ ID NO: 18 nucleotídeo Figura 4, painel C #2 SEQ ID NO: 19 nucleotídeo Figura 4, painel C #3 SEQ ID NO: 20 nucleotídeo Figura 5, painel A WT SEQ ID NO: 21 nucleotídeo Figura 5, painel A #1-1 SEQ ID NO: 22 nucleotídeo Figura 5, painel A #1-4

SEQ ID NO: 23 nucleotídeo Figura 5, painel A #2-2

SEQ ID NO: 24 nucleotídeo Figura 6, painel C CD163 WT

SEQ ID NO: 25 nucleotídeo Figura 6, painel C CD163 #1

SEQ ID NO: 26 nucleotídeo Figura 6, painel C CD163 #2

SEQ ID NO: 27 nucleotídeo Figura 6, painel C CD163 #3

SEQ ID NO: 28 nucleotídeo Figura 6, painel C eGFP WT

SEQ ID NO: 29 nucleotídeo Figura 6, painel C eGFP #1-1

SEQ ID NO: 30 nucleotídeo Figura 6, painel C eGFP #1-2

SEQ ID NO: 31 nucleotídeo Figura 6, painel C eGFP #2

SEQ ID NO: 32 nucleotídeo Figura6, painel C eGFP #3

SEQ ID NO: 33 nucleotídeo Figura 7, painel C WT

SEQ ID NO: 34 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-1

SEQ ID NO: 35 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-2 a1

SEQ ID NO: 36 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-2 a2

SEQ ID NO: 37 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-3

SEQ ID NO: 38 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-4 a1

SEQ ID NO: 39 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-4 a2

SEQ ID NO: 40 nucleotídeo Figura 8, painel D WT

SEQ ID NO: 41 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-1.1

SEQ ID NO: 42 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-1.2

SEQ ID NO: 43 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-2

SEQ ID NO: 44 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-3.1

SEQ ID NO: 45 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-3.2

SEQ ID NO: 46 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-4

SEQ ID NO: 47 nucleotídeo Figura 16 WT CD163 parcial

SEQ ID NOs. 48 a 67 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 1)

SEQ ID NOs. 68 a 79 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 2)

SEQ ID NOs. 80 a 85 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 3)

SEQ ID NOs. 86 a 97 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 4)

SEQ ID NO: 98 nucleotídeo Alelo com deleção de 1506 pb

SEQ ID NO: 99 nucleotídeo Alelo com inserção de 7 pb

SEQ ID NO: 100 nucleotídeo Alelo com deleção de 1280 pb

SEQ ID NO: 101 nucleotídeo Alelo com deleção de 1373 pb

SEQ ID NO: 102 nucleotídeo Alelo com deleção de 11 pb

SEQ ID NO: 103 nucleotídeo Alelo com inserção de 2 pb e deleção de

377 pb

SEQ ID NO: 104 nucleotídeo Alelo com deleção de 124 pb

SEQ ID NO: 105 nucleotídeo Alelo com deleção de 123 pb

SEQ ID NO: 106 nucleotídeo Alelo com inserção de 1 pb

SEQ ID NO: 107 nucleotídeo Alelo com deleção de 130 pb

SEQ ID NO: 108 nucleotídeo Alelo com deleção de 132 pb

SEQ ID NO: 109 nucleotídeo Alelo com deleção de 1467 pb

SEQ ID NO: 110 nucleotídeo Alelo com deleção de 1930 pb no éxon 6,

deleção de 129 pb no éxon 7, e inserção de

12 pb

SEQ ID NO: 111 nucleotídeo Alelo com deleção de 28 pb

SEQ ID NO: 112 nucleotídeo Alelo com deleção de 1387 pb

SEQ ID NO: 113 nucleotídeo Alelo com deleção de 1382 pb e inserção de 11 pb

SEQ ID NO: 114 nucleotídeo Alelo com deleção de 1720 pb

SEQ ID NO: 115 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ ID NO: 99

SEQ ID NO: 116 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ ID NO: 110

SEQ ID NO: 117 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ ID NO: 113

SEQ ID NO: 118 nucleotídeo Sequência de troca de domínio

SEQ ID NO: 119 nucleotídeo Alelo com deleção de 452 pb

SEQ ID NO: 120 peptídeo SRCR 5 de CD163 suíno

SEQ ID NO: 121 peptídeo Homólogo SRCR 8 de CD163L1 humano

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA PROTEGER UM FETO SUÍNO DA

INFECÇÃO COM O VÍRUS DA SÍNDROME RESPIRATÓRIA E REPRODUTIVA SUÍNA (PRRSV), o método caracterizado por compreender a reprodução de um animal suíno fêmea com um animal suíno macho, em que: o animal suíno fêmea compreende sequências cromossômicas modificadas em ambos os alelos de seu gene CD163, em que as sequências cromossômicas modificadas reduzem a suscetibilidade do animal suíno fêmea à infecção por PRRSV, em comparação com a suscetibilidade à infecção por PRRSV de um animal suíno fêmea que não compreende quaisquer sequências cromossômicas modificadas nos alelos de seu gene CD163; e o animal suíno macho compreende pelo menos um alelo CD163 de tipo selvagem.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo animal suíno macho compreender dois alelos CD163 de tipo selvagem.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelas sequências cromossômicas modificadas reduzirem a suscetibilidade do animal suíno fêmea a um vírus PRRSV Tipo 1, um PRRSV Tipo 2 ou a ambos os vírus PRRSV Tipo 1 e Tipo 2.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelas sequências cromossômicas modificadas reduzirem a suscetibilidade do animal suíno fêmea a um isolado de PRRSV selecionado a partir do grupo que consiste em NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV- ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, Lelystad, 03- 1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ e combinações dos mesmos.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender um animal suíno fêmea geneticamente editado.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo animal suíno fêmea ser geneticamente editado usando uma endonuclease teleguiada (homing endonuclease).

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela endonuclease teleguiada compreender uma endonuclease teleguiada projetada.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 7, caracterizado pela endonuclease teleguiada compreender um sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR), uma Nuclease Efetora Semelhante a Ativador de Transcrição (TALEN), uma Nuclease Dedo de zinco (ZFN), uma proteína de fusão recombinase, uma meganuclease ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo animal suíno fêmea ser geneticamente editado usando um sistema de CRISPR.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender a mesma sequência cromossômica modificada em ambos os alelos do gene CD163.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender uma primeira sequência cromossômica modificada em um primeiro alelo do gene CD163 e uma segunda sequência cromossômica modificada em um segundo alelo do gene CD163, a primeira e a segunda sequência cromossômica modificada sendo diferente uma da outra.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por cada alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea compreender uma inserção, uma deleção ou uma combinação das mesmas.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por pelo menos um alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea compreender uma deleção.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizado por pelo menos um alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea compreender uma inserção.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelas sequências cromossômicas modificadas fazerem com que a produção ou atividade da proteína de CD163 seja reduzida, em comparação com a produção ou atividade da proteína de CD163 em um animal suíno fêmea que não possui as sequências cromossômicas modificadas.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelas sequências cromossômicas modificadas resultarem na produção de proteína de CD163 substancialmente não funcional pelo animal suíno fêmea.

17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo animal suíno fêmea não produzir a proteína de CD163.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por cada alelo do gene CD163 do animal suíno fêmea compreender uma modificação no exon 7, uma modificação no exon 8, uma modificação em um intron que é contíguo com o exon 7 ou exon 8, ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por um ou ambos os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea compreenderem uma modificação no exon 7 do gene CD163.

20. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 19, caracterizado pela modificação no exon 7 compreender uma deleção.

21. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20, caracterizado pela deleção compreender uma deleção na estrutura.

22. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizado pela modificação no exon 7 compreender uma inserção.

23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelas sequências cromossômicas modificadas em um ou ambos os alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea resultarem em uma codificação incorreta.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pela codificação incorreta resultar em um códon de parada prematuro a jusante da codificação incorreta no alelo do gene CD163.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado por pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: uma deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com uma deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no mesmo alelo; uma deleção de 124 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 123 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.146 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47; uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e

3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 130 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.159 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 132 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.161 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1506 pares de bases do nucleotídeo 1.525 ao nucleotídeo 3.030 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1373 pares de bases do nucleotídeo 2.724 ao nucleotídeo 4.096 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 28 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113; uma deleção de 1720 pares de bases do nucleotídeo 2.440 ao nucleotídeo 4.160 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 452 pares de bases do nucleotídeo 3.015 ao nucleotídeo 3.466 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; e combinações de qualquer uma das mesmas.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por: a modificação compreender a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no mesmo alelo, e a inserção de 2 pares de bases compreende o dinucleotídeo AG; a modificação compreender a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e 3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, e a inserção de 1 par de bases compreende um único resíduo de adenina; a modificação compreender a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, e a inserção de 7 pares de bases compreende a sequência TACTACT (SEQ ID NO: 115); a modificação compreender a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo

3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, e em que a inserção de 12 pares de bases compreende a sequência TGTGGAGAATTC (SEQ ID NO: 116); ou a modificação compreender a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, e a inserção de 11 pares de bases compreende a sequência AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).

27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, caracterizado por pelo menos um dos alelos do gene CD163 no animal suíno fêmea compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47;

a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no mesmo alelo; a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113; e combinações de qualquer uma das mesmas.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender: (a) a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em um alelo do gene CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163; (b) a deleção de 1382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída pela inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163; (c) a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em um alelo do gene CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene CD163; ou (d) a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída pela inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene CD163.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender: (a) a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em um alelo do gene CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163; ou (b) a deleção de 1382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163.

30. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 29, caracterizado pelos alelos do gene CD163 do animal suíno fêmea compreenderem uma sequência cromossômica possuindo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,9% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da referida sequência cromossômica fora da inserção ou da deleção.

31. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender uma sequência cromossômica que compreende a SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 ou 119 em um ou ambos os alelos do gene CD163.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender uma sequência cromossômica que compreende a SEQ ID NO: 99, 102, 103 ou 113 em um ou ambos os alelos do gene CD163.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender: (a) uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99 em um alelo do gene CD163 e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 103 no outro alelo do gene CD163;

(b) uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 113 em um alelo do gene CD163, e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99 no outro alelo do gene CD163; (c) uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99 em um alelo do gene CD163, e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 102 no outro alelo do gene CD163; ou (d) uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 113 em um alelo do gene CD163, e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 102 no outro alelo do gene CD163.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo animal suíno fêmea compreender: (a) uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99 em um alelo do gene CD163 e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 103 no outro alelo do gene CD163; ou (b) uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 113 em um alelo do gene CD163, e uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 99 no outro alelo do gene CD163.

35. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizado pela reprodução produzir um ou mais fetos que compreendem uma sequência cromossômica modificada em um único alelo do gene CD163.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelos fetos terem susceptibilidade reduzida à infecção por PRRSV enquanto no útero, em comparação com os fetos no útero em um animal suíno fêmea de tipo selvagem.

37. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pela reprodução compreender o acasalamento do animal suíno fêmea com o animal suíno macho.

38. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pela reprodução compreender a inseminação artificial do animal fêmea com esperma obtido do animal macho.

39. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pela reprodução compreender a transferência de um oócito fertilizado para o trato reprodutivo do animal suíno fêmea.

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo oócito fertilizado ter sido gerado por fertilização in vitro do oócito com esperma obtido do animal suíno macho.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pela fertilização in vitro compreender injeção intracitoplasmática de um oócito com esperma obtido do animal suíno macho.

Figura 1 Éxons WT CD163 de tipo selvagem

Petição 870200129588, de 14/10/2020, pág. 339/382 Vetor de direcionamento de troca de domínio para CD163 Troca de domínio

Braço longo mNeo e Íntron Braço curto Íntron de CD163 poli(A) exógeno Éxons 8-10 de CD163 Codificação 3469 pb 1578 pb

Éxons WT 1/29

Vetor de direcionamento de troca de domínio para CD163 (sem Neo)

Codificação Projeto CRISPR CD163

Éxon 7 (direcionado para troca de domínio) Éxon 8 Éxon 9

ID de CRISPR

Figura 2

CD1D de tipo Éxons WT Éxons WT

Petição 870200129588, de 14/10/2020, pág. 340/382 selvagem

Vetor de direcionamento para CD1D 2/29

Braço longo mNeo e Braço curto Íntron de CD1D Éxons 6-7 de CD1D poli(A) 4363 pb 3672 pb

Projeto CRISPR CD1D

Éxon 3 (contém sítio de início ATG) Éxon 4 Éxon 5 e

ID de CRISPR e

Figura 3

Porca Porca

Ninhada 63 Ninhada 64

Ninhada 158 Ninhada 159 Porca Porca

Figura 4 blastocistos do dia 6 (%) Frequência média de

Controle

Campo brilhante Verde

Controle

CRISPR/Cas9 injetado pb pb pb pb Figura 5 pb pb pb Figura 6

Água

WT pb pb pb pb 67-4 67-3 67-2 67-1 Figura 7

Figura 8 Água 166-2 166-4 166-3

WT FF 166-1 Porca Petição 870200129588, de 14/10/2020, pág. 346/382 166-3 166-4 Água 166-2 166-1 Porca

WT FF 8/29 (- deleção de 632 pb) (- deleção de 27 pb) (- deleção de 24 pb) (Incompatibilidade de AG + 6 pb) (- deleção de 1598 pb) (+ 1 pb) (+ 1 pb) (+ 1 pb)

Figura 9

Sinais Respiratórios Febre Dia após a infecção

Figura 10

CD163+/+ CD163-/-

Dia do Desafio Não caracterizado A Não caracterizado B Tipo selvagem Figura 11

Vírus (Log10[(Moldes/Rxn])

Figura 12 Razão S / P de anticorpo N-específico

Não caracterizado A e B Tipo selvagem

Dia Após o Desafio

Figura 13 Contagem Contagem Contagem

CD163 Positivo Não caracterizado B

Contagem Contagem Contagem Continuação Figura 13 -

Figura 13 - Continuação

Não caracterizado A Contagem Contagem Contagem Contagem

Figura 13 - Continuação

Tipo Selvagem

Contagem Contagem Contagem Contagem Contagem

Fundo Contagem Contagem

Figura 14

Sem anticorpo

Tipo Selvagem

Não caracterizado A e B Contagem

Figura 15

Petição 870200129588, de 14/10/2020, pág. 356/382 18/29

Tipo selvagem Δ43 aminoácidos Não caracterizado B

Dia do Desafio

Figura 16 pb DEFINIÇÃO Gene CD163 de referência: 3000 pb pba montante do éxon 7 até a última base do éxon 10

ADESÃO

VERSÃO

FONTE ORGANISMO: porco

COMENTÁRIO COMENTÁRIO ApEinfo:metilado:1 CARACTERÍSTICAS Localização /Qualificadores misc_característica 1 . . 3000 /marcador=íntron 6 misc_característica 3001 . . 3315 /marcador=éxon 7 misc_característica 3316 . . 3412 /marcador=íntron 7 misc_característica 3413 . . 3727 /marcador=éxon 8 misc_característica 3728 . . 4501 /marcador=íntron 8 misc_característica 4502 . . 4594 /marcador=éxon 9 misc_característica 4595 . . 4676 /marcador=íntron 9 misc_característica 4676 . . 4989 /marcador=éxon 10

ORIGEM

Figura 16 - Continuação

Figura 17 Macrófago Modificação do Gene CD163 Produto previsto

Petição 870200129588, de 14/10/2020, pág. 359/382 Íntron Éxon Íntron Éxon Íntron

Solúvel Negativo

Solúvel Negativo 21/29

Negativo

Éxon Mimetizador HL8

Domínio citoplasmático Sequência sinal

Éxons Figura 18

Figura 19

Figura 19 - Continuação e

Figura 20

Nulo

Porco HL11 2 Porco HL11 1 Porco WT 2 Porco WT 1 Figura 21

Figura 22 Log10 Moldes/Rxn

Tipo 1 Tipo 2

Dia após a infecção

Tipo 1 Tipo 2

Nulo

Nulo Nulo Figura 23

Paride- Genótipo Corno uterino da direita Corno uterino da esquerda ira Nº.

Parid.

Feto

Figura 24