CN112313330A - 具有经修饰氨肽酶n(anpep)基因的抗病原体动物 - Google Patents

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Abstract

提供在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的家畜动物及其后代。还提供含有这种经修饰染色体序列的动物细胞。动物、后代和细胞对病原体的抗性增加，该病原体包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪呼吸道冠状病毒(PRCV)。动物、后代和细胞可任选地在编码CD163蛋白和/或SIGLEC1蛋白的基因中进一步包含至少一个经修饰染色体序列。还提供生产病原体抗性非人动物或非人动物谱系的方法。

Description

具有经修饰氨肽酶N(ANPEP)基因的抗病原体动物
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技术领域
本发明涉及在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的家畜动物及其后代。本发明进一步涉及在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的动物细胞。动物和细胞对病原体的抗性增加，该病原体包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪呼吸道冠状病毒(PRCV)。本发明进一步涉及家畜动物、后代和动物细胞，该家畜动物、后代和动物细胞在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列，并且还在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列和/或在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。本发明进一步涉及生产抗病原体非人动物或非人动物谱系的方法。
背景技术
由冠状病毒引起的呼吸道感染和肠道感染对人类健康和动物健康两者都具有重要影响。用传染性胃肠炎病毒(TGEV)或猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染免疫学上幼稚的新活猪可导致接近100％的死亡率损失；由病毒介导的肠上皮细胞破坏导致的脱水的结果是导致吸收不良性腹泻和脱水(Madson等人，2016；Saif等人，2012)。TGEV最早出现在20世纪40年代的美国(Doyle and Hutchings.，1946)。最近2013年出现的猪流行性腹泻病毒(PEDV)导致美国近700万只猪死亡，估计猪生产损失为10％(Stevenson等人，2013)。TGEV还可导致100％的初生仔畜死亡率。在年龄较大的猪中，感染TGEV或PEDV仅导致轻微的临床体征，然后完全恢复。
PEDV和TGEV以及人、犬和猫冠状病毒都属于冠状病毒科的α冠状病毒属(Lin等人，2015)。猪呼吸道冠状病毒(PRCV)也是一种α冠状病毒，并且与TGEV密切相关。PRCV通常会导致亚临床感染或轻度呼吸道疾病，但已描述了严重病例，并且有证据表明，当猪同时感染PRCV和另一种病毒(诸如猪呼吸和生殖综合征病毒(PRRSV))时，其可导致疾病的严重性恶化(Killoran等人，2016；Van Reeth等人，1996)。此外，PRCV阳性状态的畜群可能具有经济影响，因为一些国家将不会进口PRCV阳性的动物。
冠状病毒是按照巢状病毒目顺序置放的有包膜的单链正义RNA病毒。巢状病毒的特征性标志是一组嵌套的亚基因组mRNA的合成。冠状病毒的独特结构特征是由从病毒体的表面突出的尖峰蛋白形成的“冠状”。尽管病毒尖峰蛋白是所有冠状病毒的主要受体蛋白，但对应的细胞表面受体有所不同(Li，2015)。Delmas等人首次将猪氨肽酶N(ANPEP，APN或CD13)描述为TGEV的候选受体(Delmas等人，1992)。猪ANPEP是一种II型膜金属肽酶，负责在肠道消化过程中从蛋白底物中移除N末端氨基酸。
ANPEP在多种细胞类型和组织中表达，包括小肠和肾小管上皮细胞、粒细胞、巨噬细胞和突触膜。ANPEP在小肠的上皮细胞(肠上皮细胞)中大量表达。ANPEP在组织血管化(诸如内皮维持、肿瘤形成(Bhagwat等人，2001；Guzman-Rojas等人，2012)和乳腺发育)过程中高度表达。
虽然小肠的上皮细胞似乎是PED病毒临床感染的主要位点，但诸如肺泡巨噬细胞等其他位点也可能被感染(Park and Shin，2014)。事实上，来自肺泡巨噬细胞的深度测序数据已经确定出ANPEP的消息(未公开)。据提议，其他感染位点可用作持续感染的储库(Park and Shin，2014)。
ANPEP是水解带有中性侧链的未取代的N末端残基的膜结合的锌依赖性金属蛋白酶。其在肾近端小管中唯一已知的底物是血管紧张素III；血管紧张素III会切割成血管紧张素IV。其还代谢脑啡肽和内啡肽。最后，其在信号转导、细胞周期控制和分化中起作用。
除了其作为某些冠状病毒的受体之外，ANPEP还在许多生理过程中发挥重要作用，包括肽代谢、细胞运动和粘附、痛觉、血压调节、肿瘤血管生成和转移、免疫细胞趋化性、精子运动、细胞-细胞粘附和情绪调节(Chen等人，2012)。
猪类和人ANPEP共享高度的序列同一性及无法区分的生化和动力学性质(Chen等人，2012)。ANPEP基因位于猪的染色体7上，并且具有至少三个剪接变体。已在骨髓/成纤维细胞和肠上皮细胞中确定出ANPEP的两种启动子(Shapiro等人，1991)。它们分开约8kb，并且产生具有不同5’非编码区域的转录物。上皮启动子位于编码区域附近，而骨髓启动子位于远端(Shapiro等人，1991)。有三种公开接受的转录物/剪接变体与ANPEP基因相关联：X1、X2和X3。变体X1有20个外显子，并且编码1017氨基酸蛋白。变体X2和X3两者具有21个外显子，并且每一者编码963氨基酸蛋白。成熟的ANPEP蛋白在其N末端附近具有24氨基酸疏水片段，并且用作膜插入的信号。大的细胞外C末端结构域含有锌结合金属蛋白酶超家族结构域样区域、细胞质Ser/Thr富集连接和过渡态稳定剂。
从上文可以理解，在本领域中需要开发在动物中诱导对TGEV和诸如PRCV等相关病毒的抗性的策略。
在北美、欧洲和亚洲，猪的另一种经济上重要的疾病是猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)，其每年使北美生产者付出大约$600的成本(Holtkamp等人，2013)。由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染引起的临床疾病综合征首次在1987年在美国报导(Keffaber，1989)且后来在1990年在欧洲报道(Wensvoort等人，1991)。感染PRRSV会导致呼吸系统疾病，包括咳嗽和发烧、晚期妊娠期间生殖失败和生长性能下降。该病毒还参与多种微生物疾病综合征的相互作用，同时维持终生亚临床感染(Rowland等人，2012)。损失是幼猪呼吸道疾病、生长性能不佳、繁殖失败和子宫内感染的结果(Keffaber，1989)。
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与鼠乳酸脱氢酶升高病毒、猿猴出血热病毒和马动脉炎病毒一起属于动脉炎病毒科。在结构上，动脉炎病毒像囊膜病毒，但类似于冠状病毒，经由一组嵌套的3’-共末端亚基因组mRNA进行复制，这些mRNA拥有共同的前导和多聚腺苷酸尾。动脉炎病毒共享与病毒发病机制相关的重要性质，包括对巨噬细胞的趋向性和导致严重疾病和持续感染的能力(Plagemann，1996)。北美和欧洲病毒之间的分子比较将所有PRRSV分离株分别归入两种基因型2型或1型中的一种。尽管这两种基因型在核苷酸水平上只有约70％的同一性(Nelsen等人，1999)，但所述两者对CD163阳性细胞共享趋向性，建立长期感染，并产生类似的临床体征。
CD163是130kDa 1型膜蛋白，其由九个清道夫受体半胱氨酸富集(SRCR)结构域和两个间隔物结构域以及跨膜结构域和短细胞质尾区构成(Fabriek等人，2005)。猪类CD163含有编码肽信号序列的17个外显子，后跟九个SRCR结构域、两个接头结构域(也被称为脯氨酸丝氨酸苏氨酸(PST)结构域，位于SRCR 6和SRCR 9之后)和细胞质结构域，后跟短细胞质尾区。CD163的表面表达被局限于单核细胞-巨噬细胞谱系的细胞。除了用作病毒受体，CD163还表现出几个与维持正常体内平衡有关的重要功能。例如，在感染或组织损伤后，CD163用作清道夫分子，以从血液中移除触珠蛋白-血红蛋白复合体(Kristiansen等人，2001)。所得血红素降解产物调节相关联的炎症反应(Fabriek等人，2005)。HbHp清除是CD163的主要功能，并且定位至SRCR 3(Madsen等人，2004)。HbHp降解后巨噬细胞释放的代谢物包括胆红素、CO和游离铁。CD163的一个重要功能防止由游离血红蛋白引起的氧化毒性(Kristiansen等人，2001；Soares等人，2009)。
C163的其他重要功能包括成红细胞粘附(SRCR2)，作为TWEAK(肿瘤坏死因子样弱细胞凋亡诱导剂)受体(SRCR1-4&6-9)，作为细菌受体(SRCR5)，以及作为非洲猪病毒受体(Sanchez-Torres等人2003)。CD163还具有作为免疫调节剂的潜在作用(在in Van Gorp等人2010中作出讨论)。
Calvert等人(2007)首次将CD163描述为PRRSV的受体。用来自多种物种(包括猿猴、人、犬和小鼠)的CD163 cDNA转染非许可细胞系可使细胞允许PRRSV感染(Calvert等人，2007)。除了CD163，第二受体蛋白CD169(也称为唾液酸粘附素或SIGLEC1)被确定为参与形成与GP5-基质(M)异源二聚体初始相互作用的主要PRRSV受体，即病毒体的表面上的主要蛋白(Delputte等人，2002)。在这个模型中，CD163与GP2、3、4异源三聚体之间在内体区域室中的后续相互作用会介导病毒基因组的脱壳和向细胞质中的释放(Van Breedam等人，2010，Allende等人，1999)。这些结果支持了先前的体外研究，表明缺乏表面CD169和CD163的PRRSV抗性细胞系在用CD163质粒转染后支持病毒复制(Welch等人，2010)。
PRRSV的另一受体已被确定、纯化、测序并命名为SIGLEC1、CD169或唾液酸粘附素(Vanderheijden等人，2003；Wissink等人，2003)。SIGLEC1是属于唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族的跨膜蛋白。其首先被描述为造血组织和淋巴组织的巨噬细胞上的绵羊红细胞结合受体(Delputte等人，2004)。SIGLEC蛋白含有含唾液酸结合位点的N末端V-set结构域，随后是可变数量的C2-set结构域、跨膜结构域和细胞质尾区。与其他SIGLEC蛋白相比，SIGLEC1在细胞质尾区没有酪氨酸基基序(Oetke等人，2006)。在巨噬细胞上表达的SIGLEC1通过唾液酸配体在红细胞、中性粒细胞、单核细胞、NK细胞、B细胞和一些细胞毒性T细胞上的结合，在细胞间相互作用中起作用。SIGLEC1-唾液酸相互作用参与适应性免疫的几个方面，诸如抗原处理和向T细胞的呈递以及B细胞和CD8 T细胞的激活(在Martinez-Pomares等人，2012和O’Neill等人，2013进行了综述)。
SIGLEC1上完整的N末端结构域已被建议对于培养的巨噬细胞的PRRSV结合和内化是必需和足够的(An等人，2010；Delputte等人，2007)。用SIGLEC1转染SIGLEC1阴性细胞(诸如PK-15)足以介导病毒内化。用抗SIGLEC1单克隆抗体(MAb)孵育PRRSV-许可细胞会阻断PRRSV结合和内化(Vanderheijden N等人，2003)。在病毒方面，从病毒体的表面移除唾液酸或用唾液酸特异性凝集素预孵育病毒会阻断感染(Delputte等人，2004；Delputte等人，2007；Van Breedam等人，2010)。
PRRSV发病机制(尤其是在分子水平上)和动物流行病学两者的许多特征都知之甚少，因此使得控制工作变得困难。目前，生产者经常用经修饰减毒活毒株或灭活病毒疫苗对猪进行PRRSV疫苗接种，然而，目前的疫苗通常不能提供令人满意的保护。这是由于菌株变异和免疫系统刺激不足两方面造成的。除了对可用PRRSV疫苗的效力的担忧之外，有强有力的证据表明，目前使用的经修饰活疫苗可在个体猪和猪群中持续存在，并积累突变(Mengeling等人1999)，如猪实验感染后的强毒田间分离株所证实的(Rowland等人，1999)。此外，已经表明疫苗病毒在接种野猪的精子中脱落(Christopher-Hennings等人，1997)。作为疫苗接种的替代方式，一些专家提倡在配种畜群中采用“测试和移除”策略(Dee等人，1998)。这一策略的成功使用取决于移除所有急性或持续感染PRRSV的猪，然后进行严格控制以防止病毒的再次引入。与这一策略相关联的困难和大部分费用是，对持续PRRSV感染的发病机制知之甚少，并且因此没有可靠的技术来确定持续感染的猪。
因此，在本领域中还需要在动物中诱导对PRRSV的抗性。在同一动物中诱导PRRSV和TGEV和/或PRCV抗性也是有益的。
发明内容
提供家畜动物及其后代。动物和后代在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
还提供动物细胞。动物细胞在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
提供其他家畜动物及其后代。动物和后代在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列且在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
提供其他动物细胞。动物细胞在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列且在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
提供额外的家畜动物及其后代。动物和后代在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列且在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
提供额外的动物细胞。动物细胞在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列且在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
提供其他家畜动物及其后代。动物和后代在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列，在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列，且在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
提供其他动物细胞。动物细胞在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列，在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列，且在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
提供一种生产非人动物或非人动物谱系的方法。动物或谱系对病原体的易感性降低。该方法包含：修饰卵母细胞或精细胞，以将编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入该卵母细胞和该精细胞中的至少一者中，并用该精细胞使该卵母细胞受精，以产生在编码ANPEP蛋白的该基因中含有经修饰染色体序列的受精卵。该方法进一步包含：将该受精卵转移至代孕雌性动物中，其中妊娠和足月分娩生产后代动物。该方法另外包含：筛选后代动物对病原体的易感性，和选择与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物相比，对该病原体的易感性降低的后代动物。
提供另一种生产非人动物或非人动物谱系的方法。动物或谱系对病原体的易感性降低。该方法包含：修饰受精卵，以将编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入该受精卵。该方法进一步包含：将该受精卵转移至代孕雌性动物中，其中妊娠和足月分娩生产后代动物。该方法另外包含：筛选后代动物对病原体的易感性，和选择与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物相比，对该病原体的易感性降低的后代动物。
提供一种提高家畜动物对病原体感染的抗性的方法。该方法包含修饰编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的至少一个染色体序列，使得与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物中的ANPEP蛋白生产或活性相比，ANPEP蛋白生产或活性降低。
提供一种家畜动物群体。该群体包含两种或更多种本文所述的任何家畜动物和/或其后代。
提供另一种动物群体。该群体包含通过本文所述的任何方法制成的两种或更多种动物和/或其后代。
提供一种核酸分子。该核酸分子包含选自由以下各项组成的群组中的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO：135的序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失；
(b)与SEQ ID NO：132的序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失；和
(c)(a)或(b)的cDNA。
其他目的和特征将部分地显而易见，且部分地在下文中指出。
附图说明
图1.用于修饰CD163的靶向介体和CRISPR。板图A描绘使用CRISPR进行修饰所靶向的CDl63基因的野生型外显子7、8和9。板图B示出被设计用于用编码CD163L的人SRCR8的DNA替换猪外显子7(CD163的猪结构域SRCR5)的靶向介体。这一靶向介体用于通过G418进行药物选择的转染。用于远程、左臂和右臂测定的PCR引物用箭头标记为1230、3752、8791、7765和7775。板图C描绘与板图B所示者相同的靶向载体，但其中移除了Neo盒。这一靶向介体用于靶向已经具有新霉素抗性的细胞中的CD163。小缺失测定中使用的引物用箭头示出，并且被标记为GCD163F和GCD163R。板图D强调CRISPR所靶向的外显子。CRISPR 10、131、256和282的位置由外显子7上的向下箭头表示。CRISPR编号表示来自内含子6和外显子7的内含子-外显子连接处的碱基对的数量。
图2.用于修饰CD1D的靶向介体和CRISPR。板图A描绘通过CRISPR进行修饰所靶向的CD1D基因的野生型外显子3、4、5、6和7。板图B示出被设计用于用选择性标记物Neo替换外显子3的靶向介体。这一靶向介体与CRISPR组合用于修饰CD1D。用于远程、左臂和右臂测定的PCR引物用箭头标记为3991、4363、7373和12806。板图C描绘CRISPR所靶向的外显子。CRISPR4800、5350、5620和5626的位置由外显子3上的向下箭头表示。小缺失测定中使用的引物用箭头示出，并且被标记为GCD1DF和GCD1DR。
图3.用CRISPR/Cas9和SCNT产生CD163和CD1D敲除猪。A)用CRISPR/Cas9和供体DNA转染后，体细胞中CD163的靶向缺失。野生型(WT)基因型形成6545碱基对(bp)条带。泳道1至6表示来自用具有Cas9的CRISPR 10和含有Neo的供体DNA进行单一转染的六个不同的菌落。泳道1、4和5示出1500至2000bp的大纯合缺失。泳道2表示较小的纯合缺失。泳道3和6表示WT等位基因和小缺失或两个等位基因的双等位基因修饰。每个菌落的确切修饰仅通过用于SCNT的菌落的测序来确定。一些泳道中的微弱的WT条带可表示来自邻近WT菌落的胎儿成纤维细胞的交叉污染。NTC＝无模板控制。B)用CRISPR/Cas9和供体DNA转染后，体细胞中CD1D的靶向缺失。WT基因型形成8729bp条带。泳道1至4表示具有CDlD的500至2000bp缺失的菌落。泳道4似乎是WT菌落。NTC＝无模板控制。C)研究期间SCNT生产的CDl63敲除猪的图像。这一雄性小猪含有CD163的纯合1506bp缺失。D)研究期间生产的CD1D猪的图像。这些小猪含有CD1D的1653bp缺失。E)含有CD163的1506bp缺失的两个SCNT窝的基因型。泳道1至3(窝63)和泳道1至4(窝64)表示每窝的每一小猪的基因型。母猪指示SCNT胚胎的受体(recipient)雌性动物，而WT表示WT对照。NTC＝无模板控制。F)含有CD1D的1653bp缺失的两个SCNT窝的基因型。泳道1至7(窝l58)和泳道1至4(窝159)表示每一小猪的基因型。
图4.CRISPR/Cas9系统在猪类胚胎中的效果。A)在合子中注射不同浓度的CRISPR/Cas9系统后胚泡形成的频率。CRISPR/Cas9系统的毒性在10ng/μl时最低。B)当引入合子时，CRISPR/Cas9系统可成功地破坏胚泡中eGFP的表达。原始放大倍数X4。C)使用CRISPR/Cas9系统产生的eGFP上的突变类型：WT基因型(SEQ ID NO：16)、#1(SEQ ID NO：17)、#2(SEQ IDNO：18)和#3(SEQ ID NO：19)。
图5.CRISPR/Cas9系统在猪类胚胎中靶向CD163的效果。A)由CRISPR/Cas9系统在CD163上产生的突变的实例：WT基因型(SEQ ID NO：20)、#1-1(SEQ ID NO：21)、#1-4(SEQ IDNO：22)和#2-2(SEQ ID NO：23)。所有通过DNA测序进行检查的胚胎在CD163上都显示出突变(18/18)。CRISPR 131以粗体突出显示。B)由CRISPR/Cas9系统引起的纯合缺失的测序读数。该图像表示板图A中带有CD163的2bp缺失的#1-4。
图6.CRISPR/Cas9系统在引入两种类型的CRISPR时的效果。A)在作为合子的注射CRISPR/Cas9的胚泡中CD163的PCR扩增。泳道1、3、6和12显示出两个不同CRISPR之间的设计缺失。B)在作为合子的注射CRISPR/Cas9的胚泡中CD1D的PCR扩增。与CD163(3/23)相比，CD1D具有通过凝胶电泳确定的较低缺失频率；泳道1、8和15在CD1D中显示出明显的缺失。C)当CRISPR/Cas9系统被提供两个靶向CD163和eGFP的CRISPR时，该系统成功地靶向两个基因。显示出CD163和eGFP的修饰：CD163 WT(SEQ ID NO：24)、CD163#1(SEQ ID NO：25)、CD163#2(SEQ ID NO：26)、CD163#3(SEQ ID NO：27)、eGFP WT(SEQ ID NO：28)、eGFP#1-1(SEQ ID NO：29)、eGFP#l-2(SEQ ID NO：30)、eGFP#2(SEQ ID NO：31)和eGFP#3(SEQ ID NO：32)。
图7.通过将CRISPR/Cas9系统注射至合子中而产生的CD163敲除猪。A)敲除猪的CD163的PCR扩增；在窝67-2和67-4中检测到明显的缺失迹象。B)具有代孕体的CD163敲除猪的图像。所有的动物都很健康，并且没有显示出异常的迹象。C)CD163敲除猪的基因型。野生型(WT)序列如SEQ ID NO：33所示。两只动物(来自窝67-1(SEQ ID NO：34)和窝67-3(SEQ IDNO：37))在CD163中携带纯合缺失或插入。另外两只动物(来自窝67-2和67-4)携带CD163的双等位基因修饰：#67-2A1(SEQ ID NO：35)、#67-2A2(SEQ ID NO：36)、#67-4A1(SEQ ID NO：38)和#67-4a2(SEQ ID NO：39)。该缺失是由于在Cas9系统中引入两种不同的CRISPR而导致的。来自CD163的合子注射的动物没有显示出嵌合基因型。
图8.通过将CRISPR/Cas9系统注射至合子中而产生的CD1D敲除猪。A)来自敲除猪的CD1D的PCR扩增；166-1显示出CD1D的嵌合基因型。166-2、166-3和166-4没有显示出扩增子大小的变化，但扩增子的测序揭示了修饰。WT FF＝野生型胎儿成纤维细胞。B)远程测定的PCR扩增显示出小猪166-1和166-2中的一个等位基因的明显缺失。C)具有代孕体的CD1D敲除猪的图像。D)CD1D敲除猪的序列数据；WT(SEQ ID NO：40)、#166-1.1(SEQ ID NO：41)、#166-1.2(SEQ ID NO：42)、#166-2(SEQ ID NO：43)、#166-3.1(SEQ ID NO：44)、#166-3.2(SEQ ID NO：45)和#166-4(SEQ ID NO：46)。外显子3中的atg起始密码子以粗体和小写显示。
图9.急性PRRSV感染期间的临床体征。对存在呼吸体征和发热的每日评估结果CD163+/+(n＝6)和CD163-/-(n＝3)。
图10.急性PRRSV感染期间的肺组织病理学。野生型和敲除猪的H和E染色组织的代表性显微照片。左板图显示出水肿和单核细胞浸润。敲除猪的右板图示出正常肺的肺架构。
图11.各种基因型的病毒血症。注意，CD163-/-小猪数据沿着X轴。
图12.无效、野生型和无特征等位基因猪的抗体生产。
图13.CD163在个体猪中的细胞表面表达。在无特征A、无特征B和CD163+/+板图中出现在右侧的线表示CD163抗体，而在这些板图的左侧出现的线是无抗体对照(背景)。注意，在CD163-/-动物中，CD163染色与背景对照重叠，并且无特征等位基因中的CD163染色大致在WT水平与背景之间的一半(还注意，这是对数标度，因此小于约10％)。
图14.三只代表性猪的肺泡巨噬细胞上CD169的水平和无抗体对照(FITC标记的抗CD169)。
图15.各种基因型的病毒血症。注意，Δ43氨基酸小猪数据沿着X轴。
图16.用作参考序列(SEQ ID NO：47)的野生型CD163外显子7至10的基因组序列。该序列包括外显子7上游的3000bp至外显子10的最后一个碱基。下划线区域分别示出外显子7、8、9和10的位置。
图17.CD163修饰图示出几种CD163染色体修饰、每种修饰的预测蛋白产物和每种修饰的相对巨噬细胞表达，如通过猪肺泡巨噬细胞(PAM)上的表面CD163的水平所测量的。黑色区域指示内含子，并且白色区域指示外显子。阴影区域指示hCD163L1外显子11拟态者，即猪类外显子7的同源物。灰色区域指示具有PGK Neo构建体的合成内含子。
图18.猪类CD163蛋白和基因序列图。A)CD163蛋白SRCR(椭圆形)和PST(正方形)结构域以及对应的基因外显子。B)猪CD163 SRCR 5(SEQ ID NO：120)与人CD163L1 SRCR 8(SEQ ID NO：121)同源物的比较。
图19.CD163和CD169在来自野生型和CD163修饰猪的PAM上的表面表达的代表性结果。板图A至E示出如图17所示CD163修饰的结果。d7(1467)和d7(1280)的汇总数据显示在板图D中。
图20.野生型和CD163修饰猪的血清触珠蛋白水平。
图21.野生型和HL11m PAM对2型PRRSV分离株感染的相对许可性。
图22.CD163修饰猪感染1型和2型PRRSV分离株。
图23.感染2型病毒的WT和CD163修饰猪的病毒载量。
图24.SIGLEC1敲除策略。板图A示出猪类SIGLEC1的组织化，其含有21个外显子，并且跨度为大约20kb(基因库(GenBank)登录号：CU467609)。板图B示出用于同源重组的靶向构建体。用于PCR扩增和克隆的引物序列被标记为(F)和(R)。‘上臂’DNA片段是外显子1上游的约3.5kbp，并且包括外显子1的一部分(起始密码子之后)。唾液结合结构域位于外显子2中。‘下臂’DNA片段包括外显子4、5、6和外显子7的一部分。在PGK启动子的控制下，大部分外显子1以及所有外显子2和3被新霉素(neo)盒取代。胸苷激酶(TK)盒可直接在下臂下游获得，但不用于选择。通过将三个框内终止密码子(sss)包括在用于扩增该区域的反义和有义PCR引物中，将其引入上臂和下臂的末端。板图C示出同源重组后突变的SIGLEC1基因。水平箭头示出用于筛选的PCR引物的位置(引物序列参见表17)。
图25.转基因首建猪中野生型和靶向SIGLEC1+/-等位基因的PCR筛选。PCR引物“c”和“d”(参见图24中标记的箭头)用于扩增来自八只首建猪的基因组DNA，该猪来自雄性4-18克隆。板图A示出来自KW2细胞(用于转染的初始细胞)、靶向质粒、靶向细胞4-18(注意两个条带，约2,400和约2,900bp)、非靶向成纤维细胞和作为阴性PCR对照的水空白的DNA。箭头示出4-18克隆的微弱的2,900bp条带的位置。板图B示出八只F0转基因猪的结果。注意每只小猪有两个条带(约2,400和2,900bp)。野生型4-18克隆、11-1和靶向质粒仅显示单一条带。指示分子大小标记物的一些片段大小。
图26.F2窝#52中的敲除猪的Southern印迹确定。上箭头指向野生型条带(7,892bp)的位置，而下箭头确定基因敲除(7,204bp)的预测位置。示出分子大小标准(STD)。除了的SIGLEC1(-/-)猪，还描述了野生型(+/+)和杂合(+/-)猪的实例。
图27.SIGLEC1(CD169)和CD163在PAM细胞的表面上的表达。新鲜的PAM细胞进行CD169(mAb 3B11/11)或CD163(mAb 2A10/11)染色。仅用FITC结合的山羊抗小鼠IgG染色的PAM细胞被包括作为背景对照。
图28.用作参考序列(SEQ ID NO：135)的野生型ANPEP外显子2-4的基因组序列。该序列包括内含子2中的最后773个碱基对、外显子2、内含子3、外显子3、内含子4、外显子4和内含子5的81个碱基对。下划线区域分别示出外显子2、3和4的位置。靶向外显子2的CRISPR向导2和3(表20)均用粗体和双下划线标出。
图29.SCNT来源的胎儿检测修饰ANPEP等位基因的说明性PCR结果。
图30.合子注射的胎儿检测修饰ANPEP等位基因的说明性PCR结果。
图3l和图32.从合子注射检测修饰ANPEP等位基因出生的活猪的说明性PCR结果。
图33.用于TGEV和PEDV攻击研究的动物中存在的野生型和经修饰ANPEP等位基因的示意图。
图34.来自野生型猪(+/+)、具有两个无效ANPEP等位基因(-/-)或一个无效ANPEP等位基因与具有9个碱基对(3个氨基酸缺失，-/d9)或12个碱基对(4个氨基酸，-/d12)框内缺失的等位基因组合的猪的回肠的ANPEP染色的说明性免疫组织化学分析结果。
图35.具有ANPEP的经修饰染色体序列的猪158-1在性成熟时的照片。
图36.在暴露于PEDV后0、7和9天测量的野生型猪和在ANPEP中具有敲除或框内缺失的猪的血清和粪便中的PEDV病毒水平的说明性PCR测量结果。
图37.在初始暴露于PEDV后9天，野生型猪和在ANPEP中具有敲除(KO)或框内缺失的猪的回肠的PEDV抗原染色的说明性免疫组织化学分析结果。
图38.在暴露于TGEV后0、3、6和7天测量的野生型猪和在ANPEP中具有敲除或框内缺失的猪的粪便中的TGEV病毒水平的说明性PCR测量结果。
图39.在初始暴露于病毒后9天，野生型猪和在ANPEP中具有敲除(KO)或框内缺失的猪的回肠的TGEV抗原染色的说明性免疫组织化学分析结果。
图40.示出野生型猪和在ANPEP中具有敲除(KO)或框内缺失的猪中存在或不存在TGEV特异性抗体的说明性ELISA测定数据。
图41.说明性PCR结果，其示出在通过将具有ANPEP、CD163和/或SIGLEC1的经修饰染色体序列的猪杂交而产生的一窝动物中经修饰CD163等位基因(板图A)、ANPEP等位基因(板图B)和SIGLEC1等位基因(板图C)。通过桑格测序(板图D)从板图B证实了ANPEP修饰。
图42.从ANPEP-/-(KO，板图A)和野生型(WT，板图B)动物获得的猪类肺泡细胞的说明性荧光显微镜图像。细胞感染了TGEV、PRCV和PEDV，如图所示。细胞核用碘化丙啶染色(板图A和板图B中的左栏)。使用FITC标记的冠状病毒抗N蛋白抗体检测病毒感染细胞(板图A和B中的中间栏)。合并的图像显示在板图A和板图B的右栏中。
具体实施方式
本发明是指向在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的家畜动物及其后代。本发明进一步涉及在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的动物细胞。动物和细胞对病原体的抗性增加，该病原体包括传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪呼吸道冠状病毒(PRCV)。
动物和细胞具有染色体修饰(例如，插入、缺失或取代)，该染色体修饰灭活或以其他方式调节ANPEP基因活性。ANPEP参与TGEV进入细胞。因此，当受到攻击时，具有灭活的ANPEP基因的动物或细胞对TGEV显示出抗性。动物和细胞可用任何数量的方案来形成，包括那些利用基因编辑的方案。
除了编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的至少一个经修饰染色体序列之外，动物、后代和动物在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列，和/或在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。这种动物合适地对其他病原体(例如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV))的抗性增加。
还提供本文所述的任何动物的群体。
本发明进一步指向生产抗病原体非人动物或非人动物谱系的方法，该方法包含在编码ANPEP蛋白的基因中引入经修饰染色体序列。
该方法可包含：向动物细胞或卵母细胞或胚胎中引入一种药剂，该药剂特异性结合至细胞的染色体靶位点，并导致双链DNA断裂，或者以其他方式使用基因编辑方法(诸如成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶融合蛋白或大范围核酸酶)来灭活或降低其中的ANPEP基因或蛋白的活性。
本文还描述一个或多个特定ANPEP基因座与能够实现ANPEP基因座内特定核酸序列的切割和/或整合的多肽串联使用。ANPEP基因座与能够实现ANPEP基因座的切割和/或整合的多肽或RNA串联使用的实例包括选自由以下各项组成的群组的多肽：锌指蛋白、大范围核酸酶、TAL结构域、TALEN、RNA引导CRISPR/Cas重组酶、亮氨酸拉链和本领域中的技术人员已知的其他者。具体实例包括包含位点特异性DNA结合结构域多肽和切割结构域多肽(例如核酸酶)的嵌合(“融合”)蛋白，诸如包含锌指多肽和FokI核酸酶多肽的ZFN蛋白。本文描述包含特异性结合至ANPEP基因的DNA结合结构域的多肽。这种多肽还可包含核酸酶(切割)结构域或半结构域(例如归巢核酸内切酶，包括具有经修饰DNA结合结构域的归巢核酸内切酶)和/或连接酶结构域，使得多肽可诱导靶向双链断裂，和/或促进感兴趣的核酸在断裂位点的重组。靶向ANPEP基因座的DNA结合结构域可以是DNA切割功能结构域。前述多肽可用于将外源核酸引入宿主生物体(例如动物物种)的基因组中的一个或多个ANPEP基因座。DNA结合结构域可包含具有一个或多个锌指(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个锌指)的锌指蛋白，该锌指蛋白被工程化(非天然存在)以结合至ANPEP基因内的任何序列。本文所述的任何锌指蛋白可结合至靶基因的编码序列内或相邻序列(例如启动子或其他表达元素)内的靶位点。锌指蛋白可结合至ANPEP基因中的靶位点。
定义
当介绍本发明的元素或其优选实施例时，冠词“一(a、an)”、“所述(the和said)”旨在意指存在元素中的一个或多个。
术语“和/或”意指与这一术语相关联的任何一个项目、项目的任何组合或所有项目。
“结合蛋白”是一种能够结合至另一个分子的蛋白。结合蛋白可结合至例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。在蛋白结合蛋白的情况下，其可结合至自身(以形成同型二聚体、同型三聚体等)和/或其可结合至一种或多种不同蛋白的一个或多个分子。一种结合蛋白可具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。
术语“包含”、“包括”和“具有”旨在是包括性的，并且意味着除了列出的元素之外，还可存在额外的元素。
术语“CRISPR”代表“成簇的规律间隔的短回文重复序列”。CRISPR系统包括I型、II型和III型CRISPR系统。
术语“Cas”是指“CRISPR相关联蛋白”。Cas蛋白包括但不限于Cas9家族成员蛋白、Cas6家族成员蛋白(例如Csy4和Cas6)和Cas5家族成员蛋白。
术语“Cas9”一般可指与野生型Cas9多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。说明性Cas9序列是由第2016/0046963号美国专利公开的SEQ ID NO：1-256和795-1346提供。第2016/0046963号美国专利公开的SEQ ID NO：1-256和795-1346以引用方式并入本文中。“Cas9”可指可指与野生型Cas9多肽(例如来自酿脓链球菌)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。“Cas9”可指Cas9蛋白的野生型或经修饰形式，其可包含氨基酸变化，诸如缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合体或其任意组合。
术语“Cas5”一般可指可指与野生型说明性Cas5多肽(例如来自脱硫弧菌的Cas5)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。第2016/0046963号美国专利公开的图42中提供说明性Cas5序列。第2016/0046963号美国专利公开的图42以引用方式并入本文中。“Cas5”一般可指可指与野生型Cas5多肽(例如来自脱硫弧菌的Cas5)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。“Cas5”可指Cas5蛋白的野生型或经修饰形式，其可包含氨基酸变化，诸如缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合体或其任意组合。
术语“Cas6”一般可指可指与野生型说明性Cas6多肽(例如来自极端嗜热菌的Cas6)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。第201 6/0046963号美国专利公开的图41中提供说明性Cas6序列。第2016/0046963号美国专利公开的图41以引用方式并入本文中。“Cas6”一般可指可指与野生型Cas6多肽(例如来自极端嗜热菌)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。“Cas6”可指Cas6蛋白的野生型或经修饰形式，其可包含氨基酸变化，诸如缺失、插入、取代、变体、突变、融合、嵌合体或其任意组合。
术语“CRISPR/Cas9”或“CRISPR/Cas9系统”是指用于基因工程的可编程核酸酶系统，其包括Cas9蛋白或其衍生物以及一种或多种非编码RNA，该非编码RNA可为Cas9提供CRISPR RNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)的功能。crRNA和tracrRNA可单独使用，或者可加以组合以生产一个“引导RNA”(gRNA)。crRNA或gRNA提供与基因组靶标互补的序列。
“疾病抗性”是动物的特征，其中动物避免作为动物-病原体相互作用(诸如猪类动物和TGEV、PRCV或PRRSV之间的相互作用)的结果的疾病症状。也就是说，防止病原体引起动物疾病和相关联的疾病症状，或者作为另一选择，减少临床体征的发生率和/或严重性或减少临床症状。本领域中的技术人员将理解，本文公开的组合物和方法可与本领域中可获得的用于保护动物免受病原体攻击的其他组合物和方法一起使用。
关于规定的核酸利用“编码”或“被编码”意味着包含用于翻译成规定蛋白的信息。编码蛋白的核酸可在核酸的翻译区域内包含插入序列(例如内含子)，或者可缺少这种插入的非翻译序列(例如，在cDNA中)。蛋白编码所使用的信息是通过使用密码子来规定的。通常，氨基酸序列由核酸使用“通用”遗传密码来编码。当合成制备或改变核酸时，可利用核酸将被表达的预期宿主的已知密码子偏好。
如本文所用的“基因编辑(gene editing、gene edited、genetically edited)”和“基因编辑效应物”是指将归巢技术与天然存在或人工工程化核酸酶(也被称为“分子剪刀”、“归巢核酸内切酶”或“靶向核酸内切酶”)一起使用。核酸酶在基因组中的期望位置处产生特定的双链染色体断裂(DSB)，在一些情况下，该基因组利用细胞的内源性机制来修复由同源重组(HR)和/或非同源末端连接(NHEJ))的自然过程诱导的断裂。基因编辑效应物包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统(例如CRISPR/Cas9系统)和大范围核酸酶(例如重新工程化为归巢核酸内切酶的大范围核酸酶)。该术语还包括转基因程序和技术的使用，包括例如变化是缺失或相对小的插入(通常小于20nt)和/或不从外源物种引入DNA的情况。该术语还涵盖后代动物，诸如由初始基因编辑动物通过有性杂交或无性繁殖产生的后代动物。
术语“基因组工程”、“基因工程(genetic engineering、geneticallyengineered)”、“基因改变(genetically altered、genetic alteration)”、“基因组修饰(genome modification、genome modification和genomically modified)”可指通过缺失、插入、突变或取代特定核酸序列来改变基因组。改变可以是基因或位置特异性的。基因组工程可使用核酸酶来切割核酸，从而产生用于改变的位点。还考虑了非基因组核酸的工程化。含有核酸酶结构域的蛋白可通过与核酸靶向核酸形成复合体来结合和切割靶核酸。在一个实例中，切割可在靶核酸中引入双链断裂。核酸可被修复，例如通过内源性非同源末端连接(NHEJ)机制。在另一个实例中，可插入一段核酸。核酸靶向核酸和定点多肽的修饰可引入用于基因组工程的新功能。
如本文所用的“归巢DNA技术”、“归巢技术”和“归巢核酸内切酶”包括允许规定分子靶向规定DNA序列的任何机制，包括锌指(ZF)蛋白、类转录激活因子效应物(TALE)大范围核酸酶和CRISPR系统(例如CRISPR/Cas9系统)。
术语“抗性增加”和“易感性降低”在本文中意指但不限于，与病原体感染相关联的临床体征或临床症状的发生率和/或严重性在统计学上显著降低。例如，“抗性增加”或“易感性降低”可指与具有未修饰染色体序列的对照动物相比，在CD163基因蛋白中包含经修饰染色体序列的动物中，与TGEV、PRCV或PRRSV感染相关联的临床体征或临床症状的发生率和/或严重性在统计学上显著降低。术语“临床症状在统计学上显著减少”意指但不限于，在用感染剂攻击后，经修饰受试者群组中至少一种临床症状的发生的频率比未修饰的对照组低至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少50％，及甚至更优选至少70％。
“敲除”意指基因的结构或调节机制的破坏。敲除可通过靶向介体、替换介体或打靶介体的同源重组或基因陷阱介体的随机插入来产生，从而导致基因功能的完全、部分或有条件的丧失。
术语“家畜动物”包括传统上在畜牧业中饲养的任何动物，例如有蹄类动物(例如偶蹄类)、鸟类动物(例如鸡、火鸡、鸭、鹅、珍珠鸡或乳鸽)、马类动物(例如马或驴)。偶蹄动物包括但不限于猪类动物(例如猪)、牛类动物(例如奶牛的食用牛)、绵羊类动物、山羊类动物、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼和鹿。术语“家畜动物”不包括大鼠、小鼠或其他啮齿动物。
如本文所用的术语“突变”包括与野生型序列相比，多核苷酸的核苷酸序列(诸如例如基因或编码DNA序列(CDS))的改变。该术语包括但不限于取代、插入、框移、缺失、倒位、易位、复制、剪接供体位点突变、点突变等。
在本文中，“临床体征的发生率和/或严重性降低”或“临床症状减少”意指但不限于，与野生型感染相比，一群组中受感染的受试者的数量减少，表现出感染的临床体征的受试者的数量减少或消除，或一个或多个受试者中存在的任何临床体征的严重性降低。例如，这些术语涵盖感染、肺部病理、病毒血症、抗体生产、病原体负载减少、病原体脱落、病原体传播减少或TGEV、PRCV或PRRSV症状的任何临床体征减少中的任何临床体征。优选地，与CD163基因中没有修饰且被感染的受试者相比，在本发明的一种或多种动物中这些临床体征减少至少10％。更优选地，在本发明的受试者中临床体征减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，及甚至更优选至少50％。
此处提到的核苷酸序列中从核苷酸x至核苷酸y的缺失意指该范围内的所有核苷酸都已被删除，包括x和y。因此，例如，短语“与SEQ ID NO：135相比从核苷酸1,397至核苷酸1,578的182个碱基对缺失”意指核苷酸1,397至1,578中的每一者都已被删除，包括核苷酸1,397和1,578。
动物对疾病的“抗性”是动物的特征，其中动物避免作为动物-病原体相互作用(诸如猪类动物和TGEV、PRCV或PRRSV之间的相互作用)的结果的疾病症状。也就是说，防止病原体引起动物疾病和相关联的疾病症状，或者作为另一选择，减少临床体征的发生率和/或严重性或减少临床症状。本领域中的技术人员将理解，本文公开的方法可与本领域中可获得的用于保护动物免受病原体攻击的其他组合物和方法一起使用。
“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复序列结构域/单元的多肽。重复序列结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单个“重复单元”(也被称为“重复序列”)的长度通常为33-35个氨基酸，并且表现出与天然存在的TALE蛋白内的其他TALE重复序列具有至少一些序列同源性。锌指和TALE结合结构域可被“工程化”以结合至预定核苷酸序列，例如经由天然存在的锌指或TALE蛋白的辨识螺旋区域的工程化(改变一个或多个氨基酸)。因此，工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白。用于将DNA结合蛋白工程化的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的DNA结合蛋白是自然界中不存在的蛋白，其设计/组成主要来自合理的标准。设计的合理标准包括应用替代规则和计算机算法来处理数据库中的信息，该数据库存储现有ZFP和/或TALE设计的信息和结合数据。参见例如第6,140,081号、第6,453,242号和第6,534,261号美国专利；还参见WO 98/53058、WO98/53059、WO 98/53060、WO 02/016536和WO 03/016496以及第20110301073号美国公开。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白或较大蛋白内的结构域，该锌指是结构通过锌离子的配位而稳定的结合结构域内的氨基酸序列区域。术语锌指DNA结合蛋白通常被缩写为锌指蛋白或ZFP。
“选定”锌指蛋白或TALE是生产主要是通过诸如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择等经验过程的自然界中没有发现的蛋白。参见例如第5,789,538号美国专利；第5,925,523号美国专利；第6,007,988号美国专利；第6,013,453号美国专利；第6,200,759号美国专利；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO01/88197、WO 02/099084和第20110301073号美国公开。
下文定义各种其他术语。
在编码ANPEP蛋白的基因中具有经修饰染色体序列的动物和细胞
本文描述家畜动物及其后代和动物细胞，该家畜动物及其后代和动物细胞在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列，例如插入或缺失(“INDEL”)，其赋予对病原体(例如传染性胃肠炎病毒(TGEV)或猪呼吸道冠状病毒(PRCV))感染具有改善的或完全的抗性。
全长猪类ANPEP基因(SEQ ID NO：132)几乎有30,000个碱基对长，并且具有至少三个剪接变体。根据剪接变体，猪类ANPEP基因含有20或21个外显子。然而，这三个剪接变体在外显子2即所靶向的区域上实际上是相同的，以制成大多数本文所述的基因编辑动物。为了便于参考，提供参考序列(SEQ ID NO：135)，该参考序列包括外显子2的编码区域，起始密码子前1000个核苷酸和外显子2末端后1000个核苷酸。由于起始密码子出现在外显子2内，因此参考序列SEQ ID NO：135含有内含子2中的最后773个碱基对、外显子2、内含子3、外显子3、内含子4、外显子4和内含子5的81个碱基对。图28中提供参考序列SEQ ID NO：135的注释版本。在图28中，外显子2、3和4的位置用下划文本标出，并且起始密码子用粗体小写文本(“atg”)示出。
还提供全长野生型猪类ANPEP的核苷酸序列(SEQ ID NO：132)以及由剪接变体X2和X3编码的全长野生型猪类ANPEP蛋白的氨基酸序列(963个氨基酸；SEQ ID NO：134)和由剪接变体X1编码的全长野生型猪类ANPEP蛋白的氨基酸序列(1017个氨基酸；SEQ ID NO：133)。剪接变体X2和X3生产相同的氨基酸序列。
表1提供这三种剪接变体中每一种的外显子在SEQ ID NO：132中的位置。
表1：ANPEP外显子
Figure BDA0002848210210000191
Figure BDA0002848210210000201
*在所有三种变体中，起始密码子出现在核苷酸9986处。
提供在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的家畜动物及其后代。
还提供在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的动物细胞。
经修饰染色体序列可以是被改变的序列，使得其与TGEV和/或PRCV感染相关的ANPEP蛋白功能被削弱、减少或消除。因此，本文所述的动物和细胞可被称为“敲除”动物或细胞。
与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物、后代或细胞对病原体感染的易感性相比，编码该ANPEP蛋白的该基因中的该经修饰染色体序列会降低该动物、后代或细胞对该病原体感染的易感性。
该修饰优选基本上消除动物、后代或细胞对病原体的易感性。更优选地，该修饰会完全消除动物、后代或细胞对病原体的易感性，使得动物在暴露于病原体后不会显示出疾病的任何临床体征。
例如，当动物是猪类动物并且病原体是TGEV时，具有该修饰的猪类动物在暴露于TGEV后没有显示出TGEV感染的任何临床体征(例如呕吐、腹泻、脱水、过度口渴)。此外，在具有该修饰的猪类动物中，在粪便或血清中不能检测到TGEV核酸，在回肠中不能检测到TGEV抗原，并且血清对TGEV特异性抗体呈阴性。
类似地，暴露于病原体的具有该修饰的细胞不会被病原体感染。
病原体可包含病毒。例如，病原体可包含冠状病毒科病毒，例如冠状病毒亚科病毒。
该病毒优选地包含冠状病毒(例如，α冠状病毒属病毒)。
当该病毒包含α冠状病毒属病毒时，α冠状病毒属病毒优选地包含传染性胃肠炎病毒(TGEV)。
例如，传染性胃肠炎病毒可包含TGEV Purdue株。
作为另一选择或另外地，该病毒可包含猪呼吸道冠状病毒(PRCV)。
家畜动物或后代可包含有蹄类动物、鸟类动物或马类动物。细胞可源自有蹄类动物、鸟类动物或马类动物。
当动物或后代是鸟类动物时或当细胞是源自鸟类动物的细胞时，鸟类动物可包含鸡、火鸡、鸭、鹅、珍珠鸡或乳鸽。
当动物或后代是马类动物时或当细胞是源自马类动物的细胞时，马类动物可包含马或驴。
当动物或后代是有蹄类动物时或当细胞是源自有蹄类动物的细胞时，有蹄类动物可包含偶蹄动物。例如，偶蹄动物可包含猪类动物(例如猪)、牛类动物(例如肉牛或奶牛)、绵羊类动物、山羊类动物、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼或鹿。
动物或后代优选地包含猪类动物。细胞优选地包含源自猪类动物的细胞。
动物或后代可以是胚胎、幼体或成体。
类似地，细胞可包含胚胎细胞、源自幼年动物的细胞或源自成年动物的细胞。
例如，细胞可包含胚胎细胞。
细胞可包含源自幼年动物的细胞。
动物、后代或细胞可对于编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列是杂合的。
动物、后代或细胞可对于编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列是纯合的。
编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的插入、在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的缺失、在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的取代或其任意组合。
例如，经修饰染色体序列可包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的缺失。
缺失可包含框内缺失。
经修饰染色体序列可包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的插入。
插入、缺失、取代或其任意组合可在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中产生错编码。
当插入、缺失、取代或其任意组合在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中导致错编码时，该错编码可在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中导致提前终止密码子。
当经修饰染色体序列包含缺失时，该缺失可包含编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的起始密码子的缺失。当起始密码子被删除时，不会产生ANPEP蛋白。
当经修饰染色体序列包含缺失时，该缺失可包含编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的整个编码序列的缺失。
经修饰染色体序列可包含编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的取代。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，与在编码该ANPEP蛋白的该基因中缺少该经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中的ANPEP蛋白生产或活性相比，编码该ANPEP蛋白的该基因中的该经修饰染色体序列优选地导致ANPEP蛋白生产或活性降低。
优选地，在编码该ANPEP蛋白的该基因中的该经修饰染色体序列导致该动物、后代或细胞生产基本上无功能性ANPEP蛋白。利用“基本上无功能ANPEP蛋白”，其意味着动物、后代或细胞中ANPEP蛋白的水平无法检测或在能够检测的情况下比在不包含经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中观察到的水平低至少约90％，优选地低至少约95％，更优选地低至少约98％，并且甚至更优选地低至少约99％。
对于本文所述的任何动物、后代或细胞，动物、后代或细胞优选地不产生ANPEP蛋白。
在任何动物、后代或细胞中，经修饰染色体序列包含在以下者中的修饰：编码该ANPEP蛋白的该基因的等位基因的外显子2；编码该ANPEP蛋白的该基因的等位基因的外显子4；内含子，该内含子与编码该ANPEP蛋白的该基因的该等位基因的外显子2或外显子4相邻；或者其任意组合。
经修饰染色体序列合适地包含编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的修饰、编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的内含子1中的修饰或其组合。
作为一个实例，经修饰染色体序列可包含从编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的内含子1开始，并且在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中结束的缺失。
经修饰染色体序列可包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的插入或缺失。例如，在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的插入或缺失可在起始密码子的下游。
经修饰染色体序列可包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的缺失。
在经修饰染色体序列包含在编码该ANPEP蛋白的该基因的该等位基因的外显子2中的缺失时，该缺失可包含在外显子2中的框内缺失。
例如，编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的框内缺失可导致ANPEP蛋白的氨基酸194至196的缺失。
作为另一选择，在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的框内缺失可导致ANPEP蛋白的氨基酸194至197的缺失。框内缺失可进一步导致在ANPEP蛋白的位置198处的缬氨酸残基被另一个氨基酸(例如异亮氨酸残基)取代。
经修饰染色体序列可包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的插入。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，经修饰染色体序列可包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,397至核苷酸1,578的182个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,397开始的5个碱基对插入替换；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,574至核苷酸1,582的9个碱基对缺失；与参考序列SEQID NO：135相比，从核苷酸1,577至核苷酸1,585的9个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,581至核苷酸1,589的9个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸819至核苷酸1,685的867个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸882至核苷酸1,688的867碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,580和1,581之间的1个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,579和1,580之间的1个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,321至核苷酸1,587的267个碱基对缺失；与参考序列SEQID NO：135相比，从核苷酸1,323至核苷酸1,589的267个碱基对缺失；与参考序列SEQ IDNO：135相比，核苷酸1,581的1个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,582至核苷酸1,593的12个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,561至核苷酸1,585的25个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,560至核苷酸1,584的25个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,575至核苷酸1,582的8个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,574至核苷酸1,581的8个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；以及其任意组合。
例如，在任何动物、后代或细胞中，经修饰染色体序列可包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；与参考序列SEQ IDNO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581至核苷酸1,589的9个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,582至核苷酸1,593的12个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581的1个碱基对缺失；以及其任意组合。
在任何动物、后代或细胞中，经修饰染色体序列可包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581的1个碱基对缺失；以及其任意组合。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,397至核苷酸1,578的182个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,397开始的5个碱基对插入替换。
当与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列包含从核苷酸1,397至核苷酸1,578的182个碱基对缺失(其中缺失的序列被从核苷酸1,397开始的5个碱基对插入替换)时，5个碱基对插入可包含序列CCCTC(SEQ ID NO：169)。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,574至核苷酸1,582的9个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,577至核苷酸1,585的9个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,581至核苷酸1,589的9个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸819至核苷酸1,685的867个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸882至核苷酸1,688的867个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入。
当与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列包含核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入时，该插入可包含单个胸腺嘧啶(T)残基。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含核苷酸1,580和1,581之间的1个碱基对插入。
当与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列包含核苷酸1,580和1,581之间的1个碱基对插入时，该插入可包含单个胸腺嘧啶(T)残基或单个腺嘌呤(A)残基。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含核苷酸1,579和1,580之间的1个碱基对插入。
当与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列包含核苷酸1,579和1,580之间的1个碱基对插入时，该插入可包含单个腺嘌呤(A)残基。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入。
当与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列包含核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入时，该2个碱基对插入可包含AT二核苷酸。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,321至核苷酸1,587的267个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,323至核苷酸1,589的267个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含核苷酸1,581的1个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,582至核苷酸1,593的12个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,561至核苷酸1,585的25个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,560至核苷酸1,584的25个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,575至核苷酸1,582的8个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,574至核苷酸1,581的8个碱基对缺失。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换。
当与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列包含从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失(其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换)时，8个碱基对插入可包含序列GGGGCTTA(SEQ ID NO：179)。
与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列可包含从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换。
当与参考序列SEQ ID NO：135相比，经修饰染色体序列包含从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失(其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换)时，4个碱基对插入可包含序列TCGT(SEQ ID NO：180)。
动物、后代或细胞中的ANPEP基因可包含本文所述的任何经修饰染色体序列的任何组合。
例如，动物、后代或细胞可包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；以及与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入。
动物、后代或细胞可包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；以及与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入。
动物、后代或细胞可包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；以及与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，核苷酸1,581的1个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；以及与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入。
动物、后代或细胞可包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；以及与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，自核苷酸1,581至核苷酸1,589的9个碱基对缺失。
在本文所述的任何家畜动物、后代或细胞中，经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸17,235至22,422的区域内的修饰。
例如，经修饰染色体序列可包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸17,235至22,016的区域内的修饰。
经修饰染色体序列可包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸21,446至21,537的区域内的修饰。
经修饰染色体序列可包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸21,479至21,529的区域内的修饰。
例如，经修饰染色体序列可包含参考序列SEQ ID NO：132的从核苷酸21,479至核苷酸21,529的51个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸21,479至21,523的区域内的修饰。
例如，经修饰染色体序列可包含参考序列SEQ ID NO：132的从核苷酸21,479至核苷酸21,523的45个碱基对缺失。
作为进一步的实例，经修饰染色体序列可包含参考序列SEQ ID NO：132的从核苷酸21,509至核苷酸21,511的3个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸21,538至22,422的区域内的修饰。
经修饰染色体序列可包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸22,017至22,422的区域内的修饰。
经修饰染色体序列可包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸22,054至22,256的区域内的修饰。
经修饰染色体序列可包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸22,054至22,126的区域内的修饰。
当经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸17,235至22,422的区域内的任何地方的修饰时，经修饰染色体序列可包含插入或缺失。
例如，经修饰染色体序列可包含缺失。该缺失可任选地包含框内缺失。
当经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸17,235至22,422的区域内的任何地方的修饰时，经修饰染色体序列可包含取代。
例如，取代可包含用不同的核苷酸取代SEQ ID NO：132的核苷酸2l,509至21,511处的ACC密码子中的一个或多个核苷酸，以产生编码不同氨基酸的密码子。
在该取代包含用不同的核苷酸取代SEQ ID NO：132的核苷酸21,509至21,511的ACC密码子中的一个或多个核苷酸，以产生编码不同氨基酸的密码子时，该一个或多个核苷酸的取代可导致SEQ ID NO：134的氨基酸738处的苏氨酸(T)或SEQ ID NO：133的氨基酸792处的苏氨酸(T)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基替换。
例如，该取代导致SEQ ID NO：134的氨基酸738处的苏氨酸(T)或SEQ ID NO：133的氨基酸792处的苏氨酸(T)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基替换。
该取代合适地导致SEQ ID NO：134的氨基酸738处的苏氨酸(T)或SEQ ID NO：133的氨基酸792处的苏氨酸(T)被缬氨酸(V)或精氨酸(R)残基替换。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，经修饰染色体序列可破坏内含子-外显子剪接区域。内含子-外显子剪接区域的破坏可导致外显子跳跃或内含子包括，这是由于缺少内含子-外显子剪接区域下游的剪接以及所得mRNA中的其他下游外显子。
为了破坏内含子-外显子剪接区域，剪接所需的任何核苷酸都可被改变。例如，大多数内含子以序列“AG”结尾。如果此序列中的鸟嘌呤(G)残基被不同的碱基替换，则剪接将不会发生在此位点处，而是将发生在下一个下游的AG二核苷酸处。
内含子-外显子剪接区域也可通过对内含子开始处的序列进行修饰来破坏。大多数内含子以共有序列RRGTRRRY(SEQ ID NO：186)开始，其中“R”是任何嘌呤，并且“Y”是任何嘧啶。如果此序列中的鸟嘌呤(G)残基被修饰和/或如果其他碱基中的两个或更多个被修饰，则内含子可能会失去功能且将不会剪接。
内含子-外显子剪接区域也可通过本领域中已知的任何其他方法来破坏。
本文所述的在编码ANPEP蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列可由缺失、插入或取代组成。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQID NO：135具有至少80％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：135具有至少85％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：135具有至少90％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：135具有至少95％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：135具有至少98％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：135具有至少99％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：135具有至少99.9％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：135具有100％的序列同一性。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQID NO：132具有至少80％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：132具有至少85％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：132具有至少90％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：132具有至少95％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：132具有至少98％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：132具有至少99％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：132具有至少99.9％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码ANPEP蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：132具有100％的序列同一性。
任何动物、后代或细胞可包含有包含SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、170、171、172、173、174、176、177或178的染色体序列。
例如，任何动物、后代或细胞可包含有包含SEQ ID NO：177、178、166、167、170、172或171的染色体序列。
任何动物、后代或细胞可包含有包含SEQ ID NO：177、178、166、167或171的染色体序列。
在编码ANPEP蛋白的基因中具有经修饰染色体序列并且还在编码CD163蛋白的基因中包含经修饰染色体序列的动物和细胞
在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的任何家畜动物、后代或细胞还可在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
CD163有17个外显子，并且该蛋白由具有9个清道夫受体半胱氨酸富集(SRCR)结构域的胞外区域、跨膜区段和短细胞质尾区构成。几个不同的变体由单个基因的差异剪接产生(Ritter等人1999a；Ritter等人1999b)。许多这种变化是由细胞质尾区的长度造成的。
CD163具有许多重要功能，包括用作触珠蛋白-血红蛋白清道夫受体。消除血液中的游离血红蛋白是CD163的重要功能，因为血红素基团可能具有很强的毒性(Kristiansen等人2001)。CD163有促进内吞作用的细胞质尾区。此尾区的突变导致触珠蛋白-血红蛋白复合体摄取减少(Nielsen等人2006)。C163的其他功能包括成红细胞粘附(SRCR2)，作为TWEAK受体(SRCR1-4&6-9)、细菌受体(SRCR5)、非洲猪病毒受体(Sánchez-Torres等人2003)和作为免疫调节剂的潜在作用(在Van Gorp等人2010中作出讨论)。
CD163是清道夫受体半胱氨酸富集(SRCR)超家族的成员，并且具有胞内结构域和9个胞外SRCR结构域。在人类中，经由SRCR3介导血红蛋白-血红素摄取的CD163的内吞作用会保护细胞免受氧化应激(Schaer等人，2006a；Schaer等人，2006b；Schaer等人，2006c)。CDl63还用作肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导剂(TWEAK：SRCRl-4&6-9)的受体、病原体受体(非洲猪瘟病毒；细菌：SRCR2)和成红细胞结合(SRCR2)。
CD163在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及许多其他病原体的感染中起作用。因此，在编码CD163蛋白的基因中具有经修饰染色体序列的动物、后代和细胞可降低对PRRSV感染的易感性以及降低对依赖CD163进入细胞或随后在细胞中复制和/或存活的其他病原体感染的易感性。PRRSV的感染过程始于初始结合至肺泡巨噬细胞的表面上的硫酸乙酰肝素。然后病毒经由网格蛋白介导的内吞作用被内化。另一分子CD163则有利于病毒在内体中的脱壳(Van Breedam等人2010)。病毒基因组被释放，并且细胞被感染。
本文描述动物及其后代和细胞，该动物及其后代和细胞在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列，例如插入或缺失(“INDEL”)，其赋予动物对病原体(例如PRRSV)感染具有改善的或完全的抗性。申请人已经证明CD163是PRRSV感染中的关键基因，并且已经产生了抗首建动物和细胞系(参见例如第WO 2017/023570号PCT公开和第2017/0035035号美国专利申请公开，其内容通过引用方式全文并入本文中)。
因此，当动物、后代或细胞包含在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列和在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列两者时，动物、后代或细胞将对多种病原体的感染具有抗性。例如，当动物或后代是猪类动物时或当细胞是猪类细胞时，动物、后代或细胞将由于在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列而对TGEV感染具有抗性，且还将由于在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列而对PRRSV感染具有抗性。
与在编码CD163蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物、后代或细胞对病原体感染的易感性相比，在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列会降低动物、后代或细胞对病原体(例如，病毒，诸如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV))感染的易感性。
在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列优选地会基本上消除动物、后代或细胞对病原体的易感性。更优选地，该修饰会完全消除动物、后代或细胞对病原体的易感性，使得动物在暴露于病原体后不会显示出疾病的任何临床体征。
例如，当动物是猪类动物且病原体是PRRSV时，在编码CD163蛋白的基因中具有经修饰染色体序列的猪类动物在暴露于PRRSV后没有显示出任何PRRSV感染的临床体征(例如呼吸窘迫、食欲不振、嗜睡、发烧、晚期妊娠期间的繁殖失败)。此外，在具有该修饰的猪类动物中，PRRSV核酸不能在血清中检测到，且不产生PRRSV特异性抗体。
病原体可包含病毒。
该病毒可包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。
在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可降低动物、后代或细胞对1型PRRSV病毒、2型PRRSV或1型和2型两种PRRSV病毒的易感性。
在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可降低动物、后代或细胞对PRRSV分离株的易感性，该分离株选自由NVSL 97-7895、KS06-72109、P129、VR2332、CO90、AZ25、MLV-ResPRRS、KS62-06274、KS483(SD23983)、CO84、SD13-15、Lelystad、03-1059、03-1060、SD01-08、4353PZ和其任意组合组成的群组。
动物、后代或细胞可对于编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列是杂合的。
动物、后代或细胞可对于编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列是纯合的。
在编码CD163蛋白的基因中包含经修饰染色体序列的任何动物、后代或细胞中，经修饰染色体序列可包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的插入、在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的缺失、在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的取代或其任意组合。
例如，在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的缺失。
作为另一选择或另外地，在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的插入。
缺失、取代或其任意组合可在编码CD163蛋白的基因的等位基因中导致错编码。
插入、缺失、取代或错编码可在编码CD163蛋白的基因的等位基因中导致提前终止密码子。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，与在编码该CD163蛋白的该基因中缺少该经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中的CD163蛋白生产或活性相比，编码该CD163蛋白的该基因中的该经修饰染色体序列优选地导致CD163蛋白生产或活性降低。
优选地，在编码该CD163蛋白的该基因中的该经修饰染色体序列导致该动物、后代或细胞生产基本上无功能性CD163蛋白。利用“基本上无功能性CD163蛋白”，其意味着动物、后代或细胞中CD163蛋白的水平无法检测或在能够检测的情况下比在不包含经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中观察到的水平低至少约90％，优选地低至少约95％，更优选地低至少约98％，且甚至更优选地低至少约99％。
当动物、后代或细胞在编码CD163蛋白的基因中包含经修饰染色体序列时，动物、后代或细胞优选地不生产CD163蛋白。
在编码CD163蛋白的基因中包含经修饰染色体序列的动物或后代可包含猪类动物。
类似地，在编码CD163蛋白的基因中包含经修饰染色体序列的细胞可包含猪类细胞。
当动物或后代包含猪类动物时或当细胞包含猪类细胞时，在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含以下中的修饰：编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7；编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子8；与编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7或外显子8相邻的内含子；或者其任意组合。
例如，在编码CDl63蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7中的修饰。
在编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7中的修饰可包含插入。
在编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7中的修饰可包含缺失。
当动物、后代或细胞包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的缺失时，该缺失可任选地包含框内缺失。
当动物或后代包含猪类动物时或当细胞包含猪类细胞时，在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：与参考序列SEQ IDNO：47相比，自核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，在核苷酸3,149和3,l50之间的2个碱基对插入，和在同一等位基因上，与参考序列SEQID NO：47相比，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,024至核苷酸3,147的124个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,024至核苷酸3,146的123个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,147和3,148之间的1个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,030至核苷酸3,159的130个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,030至核苷酸3,161的132个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸1,525至核苷酸3,030的1506个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,724至核苷酸4,096的1373个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的1467个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中还存在与参考序列SEQID NO：47相比，在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸3,172的28个碱基对缺失；与参考序列SEQID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失；与参考序列SEQ IDNO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,440至核苷酸4,160的1720个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,015至核苷酸3,466的452个碱基对缺失；以及其任意组合。
SEQ ID NO：47提供野生型猪类CD163的部分核苷酸序列。SEQ ID NO：47包含从野生型猪类CD163基因的外显子7上游的3000个碱基对(bp)至此基因的外显子10的最后一个碱基的区域。SEQ ID NO：47在本文中用作参考序列且示于图16中。
例如，在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含选自由以下各项组成群组中的修饰：与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，和与参考序列SEQ ID NO：47相比，在同一等位基因上，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失；以及其任意组合。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，和与参考序列SEQ ID No：47相比，在相同等位基因上，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失。
当经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，和与参考序列SEQ ID NO：47相比，在相同等位基因上，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失时，2个碱基对插入可包含二核苷酸AG。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,024至核苷酸3,147的124个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,024至核苷酸3,146的123个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,147和3,148之间的1个碱基对插入。
当经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,147和3,148之间的1个碱基对插入时，该1个碱基对插入可包含单个腺嘌呤残基。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,030至核苷酸3,159的130个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,030至核苷酸3,161的132个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸1,525至核苷酸3,030的1506个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入。
当经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入时，该7个碱基对插入可包含序列TACTACT(SEQ ID NO：115)。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,724至核苷酸4,096的1373个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的1467个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中还存在与参考序列SEQ ID NO：47相比，外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失。
当经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失(其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中还存在与参考序列SEQ ID NO：47相比，在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失)时，该12个碱基对插入可包含序列TGTGGAGAATTC(SEQ ID NO：116)。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸3,172的28个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换。
当经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失(其中缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换)时，该11个碱基对插入可包含序列AGCCAGCGTGC(SEQ ID NO：117)。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,440至核苷酸4,160的1720个碱基对缺失。
经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,015至核苷酸3,466的452个碱基对缺失。
动物、后代或细胞中的CD163基因可包含本文所述的任何经修饰染色体序列的任何组合。
例如，动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，和与参考序列SEQ IDNO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中还存在与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失；以及与参考序列SEQID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，和与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中还存在与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失；以及与参考序列SEQID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的1467个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，和与参考序列SEQ IDNO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的1467个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的11个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，和与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸3,024至核苷酸3,147的124个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,024至核苷酸3,146的123个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸3,030至核苷酸3,159的130个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,030至核苷酸3,161的132个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,724至核苷酸4,096的1373个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸3,145至核苷酸3,172的28个碱基对缺失；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,440至核苷酸4,160的1720个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，在CD163基因的一个等位基因中，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，和与参考序列SEQ ID NO：47相比，在CD163基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中在CD163基因的一个等位基因中，缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，其中与参考序列SEQ ID NO：47相比，在CD163基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失。
动物、后代或细胞可包含：与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中在CD163基因的一个等位基因中，缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；以及与参考序列SEQ ID NO：47相比，在CD163基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失。
本文所述的在编码CD163蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列可由缺失、插入或取代组成。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，该动物、后代或细胞可在编码CD163蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQID NO：47具有至少80％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码CD163蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：47具有至少85％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码CD163蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：47具有至少90％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码CD163蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：47具有至少95％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码CD163蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：47具有至少98％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码CD163蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：47具有至少99％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码CD163蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：47具有至少99.9％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码CD163蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：47具有100％的序列同一性。
任何动物、后代或细胞可包含有包含SEQ ID NO：98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或119的染色体序列。
在编码ANPEP蛋白的基因和编码CD163蛋白的基因中都包含经修饰染色体序列的任何动物、后代或细胞中，动物、后代或细胞可包含本文所述的在编码ANPEP蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列和本文所述的在编码CD163蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列的任何组合。
例如，在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ IDNO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入，并且在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失。
在编码ANPEP蛋白的基因中具有经修饰染色体序列且进一步在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含经修饰染色体序列的动物和细胞
在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的任何动物、后代或细胞可进一步在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
动物、后代或细胞可对于在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列是杂合的。
动物、后代或细胞可对于在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列是纯合的。
在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的插入、在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的缺失、在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的取代或其任意组合。
例如，在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的缺失。
当在编码SIGLEC蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的缺失时，该缺失可包含框内缺失。
在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的插入。
在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的取代。
缺失、取代或其任意组合可在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中导致错编码。
插入、缺失、取代或错编码可在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中导致提前终止密码子。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，与在编码SIGLEC1蛋白的基因中缺少经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中的SIGLEC1蛋白生产或活性相比，编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列优选地导致SIGLEC1蛋白生产或活性降低。
优选地，在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列导致动物、后代或细胞生产基本上无功能性SIGLEC1蛋白。利用“基本上无功能性SIGLEC1蛋白”，其意味着动物、后代或细胞中SIGLEC1蛋白的水平无法检测或在能够检测的情况下比在不包含经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中观察到的水平低至少约90％，优选地低至少约95％，更优选地低至少约98％，并且甚至更优选地低至少约99％。
当动物、后代或细胞在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含经修饰染色体序列时，动物、后代或细胞优选地不生产SIGLEC1蛋白。
在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含经修饰染色体序列的动物或后代可包含猪类动物。
类似地，在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含经修饰染色体序列的细胞可包含猪类细胞。
当动物或后代包含猪类动物时或当细胞包含猪类细胞时，在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含以下中的修饰：编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子1；编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子2；编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子3；与编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子1、外显子2或外显子3相邻的内含子；或者其任意组合。
例如，在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子l、外显子2和/或外显子3中的缺失。
在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子1的部分和外显子2及3全部的缺失。
例如，经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：122相比，从核苷酸4,279至核苷酸5,525的1,247个碱基对缺失。
SEQ ID NO：122提供野生型猪类SIGLEC1的部分核苷酸序列。SEQ ID NO：122始于外显子1上游的4,236个核苷酸，包括所有内含子和至外显子7的外显子以及外显子7末端后的1,008个核苷酸。SEQ ID NO：122在此处用作参考序列。
当在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含缺失时，缺失的序列可任选地被新霉素盒替换。例如，动物、后代或细胞可包含有包含SEQ ID NO：123的染色体序列。SEQ ID NO：123提供部分核苷酸序列，其中与参考序列SEQ ID NO：122相比，存在从核苷酸4,279至5,525的1,247个碱基对缺失，并且缺失的序列被1,855个碱基对新霉素选择性盒替换，该新霉素选择性盒在与SEQ ID NO：122相反的方向上取向。这一插入/缺失导致SIGLEC1基因的外显子1的部分以及外显子2和3全部的丧失。
本文所述的在编码SIGLEC1蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列可由缺失、插入或取代组成。
在本文所述的任何动物、后代或细胞中，该动物、后代或细胞可在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQID NO：122具有至少80％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：122具有至少85％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：122具有至少90％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：122具有至少95％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：122具有至少98％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：122具有至少99％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：122具有至少99.9％的序列同一性。
该动物、后代或细胞可在编码SIGLEC1蛋白的基因中包含染色体序列，该序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：122具有100％的序列同一性。
在编码ANPEP蛋白的基因和编码SIGLEC1蛋白的基因中都包含经修饰染色体序列的任何动物、后代或细胞中，动物、后代或细胞可包含本文所述的在编码ANPEP蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列和本文所述的在编码SIGLEC1蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列的任何组合。
例如，在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ IDNO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入，并且在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：122相比，从核苷酸4,279至核苷酸5,525的1,247个碱基对缺失。
在编码ANPEP蛋白的基因中包含经修饰染色体序列，并且进一步包含在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列和在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列的动物和细胞
在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的任何动物、后代或细胞可进一步包含在编码CDl63蛋白的基因中的至少一个经修饰染色体序列和在编码SIGLEC1蛋白的基因中的至少一个经修饰染色体序列。
当动物、后代或细胞包含在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列、在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列和在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列时，动物、后代或细胞可包含本文所述在编码ANPEP蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列、本文所述在编码CD163蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列和本文所述在编码SIGLEC1蛋白的基因中的任何经修饰染色体序列的任何组合。
例如，在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ IDNO：135相比，核苷酸l,581和1,582之间的1个碱基对插入；在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：122相比，从核苷酸4,279至核苷酸5,525的1,247个碱基对缺失，并且在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列可包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失。
经基因编辑的动物和细胞
本文描述的任何动物或后代可以是经基因编辑的动物。
同样，本文所述的任何细胞可以是经基因编辑的细胞。
动物、后代或细胞可以是已使用归巢核酸内切酶编辑的动物、后代或细胞。归巢核酸内切酶可以是天然存在的核酸内切酶，但优选是合理设计的、非天然存在的归巢核酸内切酶，其具有已经被设计成使核酸内切酶靶向编码ANPEP、CD163或SIGLEC1蛋白的基因中的染色体序列的DNA辨识序列。
因此，归巢核酸内切酶可以是设计的归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶可包含，例如，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶融合蛋白、大范围核酸酶或其任意组合。
归巢核酸酶优选地包含CRISPR系统。可用于产生用于本文所述方法的雌性猪类动物的CRISPR系统的实例包括但不限于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas5和CRISPR/Cas6。
下文将进一步讨论使用各种归巢核酸内切酶(包括CRISPR系统和TALEN)来产生经基因编辑的动物。
经编辑的染色体序列可以是(1)失活的，(2)修饰的，或(3)包含导致无效突变的整合序列。当经编辑的染色体序列在ANPEP基因中时，失活的染色体序列被改变，使得其与TGEV和/或PRCV感染相关的ANPEP蛋白功能被削弱、减少或消除。当经编辑的染色体序列在CD163基因中时，失活的染色体序列被改变，使得其与PRRSV感染相关的CD163蛋白功能被削弱、减少或消除。因此，包含失活的染色体序列的经基因编辑的动物可被称为“敲除”或“条件敲除”。类似地，包含整合序列的经基因编辑的动物可被称为“敲入”或“条件敲入”。此外，包含经修饰染色体序列的经基因编辑的动物可包含靶向点突变或其他修饰，使得生产经改变的蛋白产物。简单来说，该过程可包含将至少一种编码靶向锌指核酸酶的RNA分子和任选的至少一种辅助多核苷酸引入胚胎或细胞中。该方法进一步包含对胚胎或细胞进行孵育以允许锌指核酸酶的表达，其中通过锌指核酸酶引入靶向染色体序列的双链断裂通过易错的非同源末端连接DNA修复过程或同源导向DNA修复过程来修复。使用靶向锌指核酸酶技术编辑编码与种系发育相关联的蛋白的染色体序列的方法是快速、精确和高效的。
作为另一选择，该过程可包含使用CRISPR系统(例如CRISPR/Cas9系统)来修饰基因组序列。要使用Cas9来修饰基因组序列，可将蛋白直接递送至细胞。作为另一选择，可将编码Cas9的mRNA递送至细胞，或者可将提供编码Cas9的mRNA表达的基因递送至细胞。此外，可将靶特异性crRNA和tracrRNA直接递送至细胞，或者可将靶特异性gRNA递送至细胞(作为另一选择，这些RNA可由被构建成表达这些RNA的基因来产生)。靶位点的选择和crRNA/gRNA的设计在本领域中是众所周知的。关于gRNA的构建和克隆的讨论可在以下网站上找到：http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/CRISPR-Reagent-Description-Rev20140509.pdf。
至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座可用作进行位点特异性编辑的靶位点。位点特异性编辑可包括外源核酸(例如，包含编码感兴趣多肽的核苷酸序列的核酸)的插入或来自基因座的核酸的缺失。例如，外源核酸的整合和/或部分基因组核酸的缺失可修饰基因座，从而产生被破坏的(即，ANPEP、CD163或SIGLEC1蛋白的活性降低)4NPEP、CD163或SIGLEC1基因。
细胞类型
本文所述的任何细胞均可包含生殖细胞或配子。
例如，本文所述的任何细胞均可包含精细胞。
作为另一选择，本文所述的任何细胞可包含卵细胞(例如受精卵)。
本文所述的任何细胞均可包含体细胞。
例如，本文所述的任何细胞均可包含成纤维细胞(例如胎儿成纤维细胞)。
本文所述的任何细胞均可包含胚胎细胞。
本文所述的任何细胞均可包含源自幼年动物的细胞。
本文所述的任何细胞均可包含源自成年动物的细胞。
生产对病原体的易感性降低的动物和谱系的方法
提供一种生产对病原体的易感性降低的非人动物或非人动物谱系的方法。该方法包含：修饰卵母细胞或精细胞，以将编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入该卵母细胞和该精细胞中的至少一者中，并用该精细胞使该卵母细胞受精，以产生在编码ANPEP蛋白的该基因中含有经修饰染色体序列的受精卵。该方法进一步包含：将该受精卵转移至代孕雌性动物中，其中妊娠和足月分娩生产后代动物。该方法另外包含：筛选后代动物对病原体的易感性，和选择与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物相比，对该病原体的易感性降低的后代动物。
提供另一种生产对病原体的易感性降低的非人动物或非人动物谱系的方法。该方法包含：修饰受精卵，以将编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入该受精卵。该方法进一步包含：将该受精卵转移至代孕雌性动物中，其中妊娠和足月分娩生产后代动物。该方法另外包含：筛选后代动物对病原体的易感性，和选择与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物相比，对该病原体的易感性降低的后代动物。
在任一种这些方法中，动物可包含家畜动物。
修饰卵母细胞、精细胞或受精卵的步骤可包含卵母细胞、精细胞或受精卵的基因编辑。
卵母细胞、精细胞或受精卵可对于经修饰染色体序列是杂合的。
卵母细胞、精细胞或受精卵可对于经修饰染色体序列是纯合的。
受精可包含人工授精。
在生产对病原体的易感性降低的非人动物或非人动物谱系的任何方法中，该方法可进一步包含修饰卵母细胞、精细胞或受精卵，以将编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入卵母细胞、精细胞或受精卵。
作为另一选择或另外，在生产对病原体的易感性降低的非人动物或非人动物谱系的任何方法中，该方法可进一步包含修饰卵母细胞、精细胞或受精卵，以将编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入卵母细胞、精细胞或受精卵。
提供一种提高家畜动物对病原体感染的抗性的方法。该方法包含修饰编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的至少一个染色体序列，使得与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物中的ANPEP蛋白生产或活性相比，ANPEP蛋白生产或活性降低。
该方法任选地可进一步包含修饰编码CD163蛋白的基因中的至少一个染色体序列，使得与在编码CD163蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物中的CD163蛋白生产或活性相比，CD163蛋白生产或活性降低。
作为另一选择或另外，该方法任选地可进一步包含修饰编码SIGLEC1蛋白的基因中的至少一个染色体序列，使得与在编码SIGLEC1蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物中的SIGLEC1蛋白生产或活性相比，SIGLEC1蛋白生产或活性降低。
修饰编码ANPEP蛋白的基因中的该至少一个染色体序列的步骤可包含染色体序列的基因编辑。
在本文描述的包含基因编辑的任何方法中，基因编辑可包含归巢核酸内切酶的使用。归巢核酸内切酶可以是天然存在的核酸内切酶，但优选是合理设计的、非天然存在的归巢核酸内切酶，其具有已经被设计成使核酸内切酶靶向编码ANPEP蛋白的基因中的染色体序列的DNA辨识序列。
因此，归巢核酸内切酶可以是设计的归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶可包含，例如，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶融合蛋白、大范围核酸酶或其任意组合。
归巢核酸酶优选地包含CRISPR系统。CRISPR系统的实例包括但不限于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas5和CRISPR/Cas6。
本文所述的任何方法均可生产本文所述的任何动物。
本文所述的任何方法可进一步包含将动物用作首建动物。
动物群体
本文还提供动物群体。
提供一种家畜动物群体。该群体包含两种或更多种本文所述的任何家畜动物和/或其后代。
提供另一种动物群体。该群体包含通过本文所述的任何方法制成的两种或更多种动物和/或其后代。
因此，群体中的动物均将在编码ANPEP蛋白的基因中包含经修饰染色体序列。群体中的动物还可任选地在编码CD163蛋白的基因和/或编码SIGELC1蛋白的基因中包含经修饰染色体序列。
群体对病原体感染具有抗性。
病原体可包含病毒。例如，病原体可包含冠状病毒科病毒，例如冠状病毒亚科病毒。
该病毒优选地包含冠状病毒(例如，α冠状病毒属病毒)。
当该病毒包含α冠状病毒属病毒时，α冠状病毒属病毒优选地包含传染性胃肠炎病毒(TGEV)。
例如，传染性胃肠炎病毒可包含TGEV Purdue株。
作为另一选择或另外地，该病毒可包含猪呼吸道冠状病毒(PRCV)。
当群体中的动物还在编码CD163蛋白的基因中包含经修饰染色体序列时，该群体还将对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)(例如，1型PRRSV病毒、2型PRRSV病毒、或1型和2型两种PRRSV病毒，和/或选自由NVSL 97-7895、KS06-72109、P129、VR2332、CO90、AZ25、MLV-ResPRRS、KS62-06274、KS483(SD23983)、CO84、SD13-15、Lelystad、03-1059、03-1060、SD01-08、4353PZ和其任意组合组成的群组中的PRRSV分离株)的感染具有抗性。
核酸
本文还提供核酸分子。
提供一种核酸分子。该核酸分子包含选自由以下各项组成的群组中的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO：135的序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失；
(b)与SEQ ID NO：132的序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失；和
(c)(a)或(b)的cDNA。
任何核酸分子均可以是分离的核酸分子。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：132具有至少80％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：132具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：132具有至少87.5％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：132具有至少90％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：132具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：132具有至少98％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：132具有至少99％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：132具有至少99.9％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：135具有至少80％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：135具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：135具有至少87.5％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：135具有至少90％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：135具有至少95％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：135具有至少98％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：135具有至少99％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失。
核酸分子可包含与SEQ ID NO：135具有至少99.9％同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失。
与不包含取代、插入或缺失的核酸相比，取代、插入或缺失会减少或消除ANPEP蛋白的生产或活性。
核酸分子可包含SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、170、171、172、173、174、176、177或178。
例如，核酸分子可包含SEQ ID NO：177、178、166、167或171。
亲和标签
“亲和标签”可以是肽亲和标签或核酸亲和标签。术语“亲和标签”一般是指可结合至分子(例如，通过小分子、蛋白或共价键结合)的蛋白或核酸序列。亲和标签可以是非天然序列。肽亲和标签可包含肽。肽亲和标签可以是能够成为分裂系统一部分的标签(例如，两个失活肽片段可反式结合在一起以形成活性亲和标签)。核酸亲和标签可包含核酸。核酸亲和标签可以是能够选择性结合至已知核酸序列(例如通过杂交)的序列。核酸亲和标签可以是能够选择性结合至蛋白的序列。亲和标签可与天然蛋白融合。亲和标签可与核苷酸序列融合。
有时，一个、两个或多个亲和标签可与天然蛋白或核苷酸序列融合。可使用体外或体内转录的方法将亲和标签引入核酸靶向核酸。核酸亲和标签可包括例如化学标签、RNA结合蛋白结合序列、DNA结合蛋白结合序列、可与带亲和标签的多核苷酸杂交的序列、合成RNA适体或合成DNA适体。化学核酸亲和标签的实例可包括但不限于含有生物素、荧光染料和digoxeginin的核糖核酸三磷酸。蛋白结合核酸亲和标签的实例可包括但不限于MS2结合序列、U1A结合序列、茎环结合蛋白序列、boxB序列、eIF4A序列或由RNA结合蛋白辨识的任何序列。带核酸亲和标签的寡核苷酸的实例可包括但不限于生物素化的寡核苷酸、2，4-二硝基苯基寡核苷酸、荧光素寡核苷酸和伯胺结合的寡核苷酸。
核酸亲和标签可以是RNA适体。适体可包括结合至茶碱、链霉亲和素、葡聚糖B512、腺苷、鸟苷、鸟嘌呤/黄嘌呤、7-甲基-GTP的适体；氨基酸适体，诸如结合至精氨酸、瓜氨酸、缬氨酸、色氨酸、氰钴胺、N-甲基间卟啉IX、黄素、NAD的适体；和抗生素适体，诸如结合至妥布霉素、新霉素、利维霉素、卡那霉素、链霉素、紫霉素和氯霉素的适体。
核酸亲和标签可包含可被定点多肽结合的RNA序列。定点多肽可以是条件性酶失活的。RNA序列可包含可被I型、II型和/或III型CRISPR系统的成员结合的序列。RNA序列可被RAMP家族成员蛋白结合。RNA序列可被Cas9家族成员蛋白、Cas6家族成员蛋白(例如，Csy4、Cas6)结合。RNA序列可被Cas5家族成员蛋白(例如Cas5)结合。例如，Csy4可以高亲和力(Kd约50pM)结合至特定的RNA发夹序列，并可在发夹的3’位点处切割RNA。
核酸亲和标签可包含可被定点多肽结合的DNA序列。定点多肽可以是条件性酶失活的。DNA序列可包含可被I型、II型和/或III型CRISPR系统的成员结合的序列。DNA序列可被Argonaut蛋白结合。DNA序列可被含有锌指结构域、TALE结构域或任何其他DNA结合结构域的蛋白结合。
核酸亲和标签可包含核酶序列。合适的核酶可包括肽基转移酶23SrRNA、RnaseP、I组内含子、II组内含子、GIR1分支核酶、先导酶、发夹状核酶、锤头状核酶、HDV核酶、CPEB3核酶、VS核酶、glmS核酶、CoTC核酶和合成核酶。
肽亲和标签可包含可用于跟踪或纯化的标签(例如，荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)、YFP、RFP、CFP、mCherry、tdTomato；His标签(例如，6XHis标签)；血凝素(HA)标签；FLAG标签；Myc标签；GST标签；MBP标签；几丁质结合蛋白标签；钙调素标签；V5标签；链霉亲和素结合标签；和类似标签)。
核酸和肽亲和标签两者可包含小分子标签，诸如生物素或洋地黄毒苷；以及荧光标记标签，诸如(例如)荧光素、罗丹明、Alexa荧光染料、花青3染料、花青5染料。
核酸亲和标签可位于核酸(例如，核酸靶向核酸)的5’处。核酸亲和标签可位于核酸的3’处。核酸亲和标签可位于核酸的5’和3’处。核酸亲和标签可位于核酸内。肽亲和标签可位于多肽序列的N末端。肽亲和标签可位于多肽序列的C末端。肽亲和标签可位于多肽序列的N末端和C末端。多个亲和标签可与核酸和/或多肽序列融合。
捕获剂
如本文所用的“捕获剂”一般可指可对多肽和/或核酸进行纯化的药剂。捕获剂可以是生物活性分子或材料(例如，在天然或合成中发现的任何生物物质，并且包含但不限于细胞、病毒、亚细胞颗粒、蛋白，更具体来说包括抗体、免疫球蛋白、抗原、脂蛋白、糖蛋白、肽、多肽、蛋白复合体、(链状)抗生物素蛋白-生物素复合体、配体、受体或小分子、适体、核酸、DNA、RNA、肽核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、药理活性物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸和糖)。在一些实施例中，捕获剂可包含亲和标签。在一些实施例中，捕获剂可优先结合至靶多肽或感兴趣的核酸。捕获剂可在混合物中自由浮动。捕获剂可结合至颗粒(例如珠、微珠、纳米颗粒)。捕获剂可结合至固体或半固体表面。在一些情况下，捕获剂不可逆地结合至靶标。在其他情况下，捕获剂可逆地结合至靶标(例如，如果靶可标被洗脱，或者通过使用诸如咪唑等化学物质)。
核酸在CD163基因座处的靶向整合
外源核酸在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处的位点特异性整合可通过本领域中技术人员已知的任何技术来完成。例如，外源核酸在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处的整合可包含将细胞(例如，分离的细胞或者组织或生物体中的细胞)与包含外源核酸的核酸分子接触。这种核酸分子可包含位于外源核酸两侧的核苷酸序列，该序列促进核酸分子和至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座之间的同源重组。促进同源重组的外源核酸两侧的核苷酸序列可与ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座的内源核苷酸互补。作为另一选择，促进同源重组的外源核酸两侧的核苷酸序列可与先前整合的外源核苷酸互补。多个外源核酸可整合在一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处，例如在基因堆叠中。
可通过宿主细胞的内源性细胞机制(诸如(例如)但不限于内源性DNA和内源性重组酶)来促进(例如，催化)核酸在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处的整合。作为另一选择，可通过提供给宿主细胞的一种或多种因子(例如多肽)来促进核酸在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处的整合。例如，核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽可通过将多肽与宿主细胞接触或通过在宿主细胞内表达多肽来提供(独立地或作为嵌合多肽的一部分)。因此，包含编码至少一种核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽的核苷酸序列的核酸可与在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处的待位点特异性整合的核酸同时或依序引入宿主细胞中，其中该至少一种核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽由宿主细胞中的核苷酸序列表达。
DNA结合多肽
位点特异性整合可通过使用能够辨识和结合至特定核苷酸序列(例如在宿主生物体的基因组中)的因子来完成。例如，许多蛋白包含能够以位点特异性方式辨识和结合至DNA的多肽结构域。被DNA结合多肽辨识的DNA序列可被称为“靶”序列。能够以位点特异性方式辨识和结合至DNA的多肽结构域一般正确折叠，并独立地用于以位点特异性方式结合DNA，即使当在不同于最初分离结构域的蛋白的多肽中表达时也是如此。类似地，用于被DNA结合多肽辨识和结合的靶序列一般能够被这种多肽辨识和结合，即使当存在于大的DNA结构(例如，染色体)中时，特别是当靶序列所在的位点是已知可被可溶性细胞蛋白(例如，基因)接近的位点时。
虽然从自然界存在的蛋白中确定出的DNA结合多肽通常结合至离散的核苷酸序列或基序(例如共有辨识序列)，但是本领域中存在并已知用于修饰许多这种DNA结合多肽以辨识不同核苷酸序列或基序的方法。DNA结合多肽包括例如但不限于：锌指DNA结合结构域；亮氨酸拉链；UPADNA结合结构域；GAL4；TAL；LexA；Tet阻遏物；LacI；和类固醇激素受体。
例如，DNA结合多肽可以是锌指。单个锌指基序可被设计成靶向并特异性结合至任何大范围的DNA位点。规范Cys2His2(以及非规范Cys3His)锌指多肽通过在靶标DNA双螺旋的大沟中插入α-螺旋来结合DNA。锌指对DNA的辨识是模块化的；每个锌指主要接触靶标中的三个连续的碱基对，并且多肽中的几个关键残基介导辨识。通过在靶向核酸内切酶中包括多个锌指DNA结合结构域，可进一步提高靶向核酸内切酶的DNA结合特异性(并且因此也可提高由此赋予的任何基因调节效应的特异性)。参见例如Urnov等人(2005)Nature 435：646-51。因此，一种或多种锌指DNA结合多肽可被工程化和利用，使得引入宿主细胞的靶向核酸内切酶与宿主细胞基因组内独特的DNA序列相互作用。
优选地，锌指蛋白是非天然存在的，因为它被工程化为结合至所选择的靶位点。参见例如Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416；第6,453,242号、第6,534,261号、第6,599,692号、第6,503,717号、第6,689,558号、第7,030,215号、第6,794,136号、第7,067,317号、第7,262,054号、第7,070,934号、第7,361,635号、第7,253,273号美国专利；和第2005/0064474号、第2007/0218528号、第2005/0267061号美国专利公开。
与天然存在的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可具有新的结合特异性。工程方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括例如使用包含三重(或四重)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每一三重或四重核苷酸序列与结合特定三重或四重序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关联。参见例如第6,453,242号和第6,534,261号美国专利。
实例性选择方法(包括噬菌体展示和双杂交系统)公开在第5,789,538号、第5,925,523号、第6,007,988号、第6,013,453号、第6,410,248号、第6,140,466号、第6,200,759号和第6,242,568号美国专利；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237中。此外，例如在WO 02/077227中已经描述了增强锌指结合结构域的结合特异性。
此外，如这些和其他参考文献中所公开的，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何合适的接头序列(包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头)连接在一起。对于长度为6个或更多个氨基酸的实例性接头序列还参见第6,479,626号、第6,903,185号和第7,153,949号美国专利。本文所述的蛋白可包括蛋白的单个锌指之间的合适接头的任何组合。
靶位点的选择：ZFP和融合蛋白(和编码融合蛋白的多核苷酸)的设计和构建方法是本领域中的技术人员已知的，并详细描述在第6,140,0815号、第789,538号、第6,453,242号、第6,534,261号、第5,925,523号、第6,007,988号、第6,013,453号、第6,200,759号美国专利；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496中。
此外，如这些和其他参考文献中所公开的，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何合适的接头序列(包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头)连接在一起。对于长度为6个或更多个氨基酸的实例性接头序列还参见第6,479,626号、第6,903,185号和第7,153,949号美国专利。本文所述的蛋白可包括蛋白的单个锌指之间的合适接头的任何组合。
当使用锌指核酸酶对本文所述的动物或细胞进行基因编辑时，可使用包含将编码靶向锌指核酸酶的至少一种RNA分子和任选的至少一种辅助多核苷酸引入胚胎或细胞中的过程来产生动物或细胞。该方法进一步包含对胚胎或细胞进行孵育以允许锌指核酸酶的表达，其中通过锌指核酸酶引入靶向染色体序列的双链断裂通过易错的非同源末端连接DNA修复过程或同源导向DNA修复过程来修复。使用靶向锌指核酸酶技术编辑编码与种系发育相关联的蛋白的染色体序列的方法是快速、精确和高效的。
作为另一选择，DNA结合多肽是来自GAL4的DNA结合结构域。GAL4是酿酒酵母中的模块化反式激活因子，但它在许多其他生物中也用作反式激活因子。参见例如Sadowski等人(1988)Nature 335：563-4。在此调节系统中，编码半乳糖代谢途径的酶的基因在酿酒酵母中的表达通过可用碳源来严格调节。Johnston(1987)Microbiol.Rev.5l：458-76。这些代谢酶的转录控制通过阳性调节蛋白GAL4和GAL4特异性结合的17bp对称DNA序列(上游激活序列(UAS))之间的相互作用来介导。
天然GAL4由881个氨基酸残基组成，分子量为99kDa。GAL4包含功能自主的结构域，该结构域的联合活性负责GAL4在体内的活性。Ma and Ptashne(1987)Cell 48：847-53)；Brent and Ptashne(1985)Cell 43(3 Pt 2)：729-36。GAL4的N末端65个氨基酸包含GAL4DNA结合结构域。Keegan等人(1986)Science 231：699-704；Johnston (1987)Nature 328：353-5。序列特异性结合需要存在由DNA结合结构域中存在的六个Cys残基配位的二价阳离子。含配位阳离子的结构域通过与DNA螺旋的大沟直接接触，而与17bp UAS每一端的保守CCG三联体相互作用并辨识该三联体。Marmorstein等人(1992)Nature 356：408-14。蛋白的DNA结合功能将C末端转录激活结构域定位在启动子附近，使得激活结构域可指引转录。
可使用的其他DNA结合多肽包括例如但不限于来自AVRBS3诱导型基因的结合序列；来自AVRBS3诱导型基因的共有结合序列或由其工程化的合成结合序列(UPA DNA结合结构域)；TAL；LexA(参见例如Brent&Ptashne(1985)，见上)；LacR(参见例如Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-56；Baim等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(12)：5072-6)；类固醇激素受体(Elliston等人(1990)J.Biol.Chem.265：11517-121)；Tet阻遏物(第6,271,341号美国专利)和突变的Tet阻遏物，其在四环素(Tc)存在的情况下(除了不存在之外)结合至tet操纵子序列；NF-κB的DNA结合结构域；和调节系统的组分，描述在Wang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(17)：8180-4中，其利用激素受体GAL4和VP16的融合。
本文所述方法和组合物中使用的一种或多种核酸酶的DNA结合结构域可包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)TAL效应物DNA结合结构域。参见例如第2011/0301073号美国专利公开。
作为另一选择，核酸酶可包含CRISPR系统。例如，核酸酶可包含CRISPR/Cas系统。
(CRISPR相关联)系统在细菌和古细菌中进化为一种适应性免疫系统，以抵御病毒攻击。当暴露于病毒时，病毒DNA的短片段被整合至CRISPR基因座。RNA是从包括病毒序列的CRISPR基因座的一部分转录而来的。含有与病毒基因组互补的序列的该RNA介导Cas蛋白(例如Cas9蛋白)靶向病毒基因组中的序列。Cas蛋白切割并因此使病毒靶标沉默。最近，CRISPR/Cas系统已被改编用于真核细胞的基因组编辑。位点特异性双链断裂(DSB)的引入能够通过两种内源性DNA修复机制(非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR))中的一种来实现靶序列改变。CRISPR/Cas系统还用于基因调节，包括转录抑制和激活，而不改变靶序列。例如，基于CRISPR/Cas系统的靶向基因调节可例如使用酶失活Cas9(也称为催化死亡Cas9)。
CRISPR/Cas系统包括编码系统的RNA组分的CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)基因座以及编码蛋白的Cas(CRISPR相关联)基因座(Jansen等人，2002.Mol.Microbiol.43：1565-1575；Makarova等人，2002.Nucleic Acids Res.30：482-496；Makarova等人，2006.Biol.Direct 1：7；Haft等人，2005.PLoS Comput.Biol.1：e60)。微生物宿主中的CRISPR基因座含有Cas基因和能够对CRISPR介导的核酸切割的特异性进行编程的非编码RNA元素的组合。
II型CRISPR是最具特征性系统之一，并且本质上通过四个顺序性步骤进行靶向DNA双链断裂。首先，两个非编码RNA即pre-crRNA阵列和tracrRNA从CRISPR基因座转录。第二，tracrRNA与pre-crRNA的重复区域杂交，并介导pre-crRNA加工成含有单个间隔序列的成熟crRNA。第三，成熟的crRNA：tracrRNA复合体经由crRNA上的间隔区和靶DNA上邻近前间隔区邻近基序(PAM)(靶标辨识的附加要求)的前间隔区之间的瓦特生-克里克碱基配对将Cas9指引至靶DNA。最后，Cas9介导靶DNA的切割以在前间隔区内产生双链断裂。
为了使用CRISPR/Cas系统来产生靶向插入和缺失，该两个非编码RNA(crRNA和TracrRNA)可被称为引导RNA(gRNA)的单个RNA替换。CRISPR/Cas系统的活性包含三个步骤：(i)在称为“适应”的过程中，将外源DNA序列插入CRISPR阵列以防止未来的攻击，(ii)相关蛋白的表达，以及阵列的表达和处理，随后是(iii)RNA介导的对外源核酸的干扰。在细菌细胞中，若干Cas蛋白与CRISPR/Cas系统的天然功能有关，并在诸如插入外源DNA等功能中发挥作用。
Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白的“功能性衍生物”。天然序列多肽的“功能性衍生物”是具有与天然序列多肽相同的定性生物学性质的化合物。“功能性衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，只要它们具有与对应天然序列多肽相同的生物活性即可。本文预期的生物活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、共价修饰及其融合体。Cas多肽或其片段的合适衍生物包括但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合体、共价修饰。包括Cas蛋白或其片段以及Cas蛋白或其片段的衍生物的Cas蛋白可从细胞中获得，或者化学合成，或者通过这两种程序的组合来获得。细胞可以是天然生产Cas蛋白的细胞，或者是天然生产Cas蛋白并经基因工程化以生产更高表达水平的内源Cas蛋白或从外源引入的核酸生产Cas蛋白的细胞，该核酸编码与内源Cas相同或不同的Cas。在一些情况下，细胞不会自然生产Cas蛋白，而是经基因工程化来生产Cas蛋白。
当使用CRISPR系统对本文所述的动物或细胞进行基因编辑时，CRISPR/Cas9系统可用于产生动物或细胞。要使用Cas9来编辑基因组序列，可将蛋白直接递送至细胞。作为另一选择，可将编码Cas9的mRNA递送至细胞，或者可将提供编码Cas9的mRNA表达的基因递送至细胞。此外，可将靶特异性crRNA和tracrRNA直接递送至细胞，或者可将靶特异性gRNA递送至细胞(作为另一选择，这些RNA可由被构建成表达这些RNA的基因来生产)。靶位点的选择和crRNA/gRNA的设计在本领域中是众所周知的。关于gRNA的构建和克隆的讨论可在以下网站上找到：http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/CRISPR-Reagent-Description-Rev20140509.pdf。
DNA结合多肽可特异性辨识和结合至宿主生物体的基因组核酸内包含的靶核苷酸序列。在一些实例中，在宿主基因组中可发现任意数量的靶核苷酸序列的离散实例。靶核苷酸序列在生物体的基因组内可能很少(例如，在基因组中可能存在少于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2或约1个靶序列拷贝)。例如，靶核苷酸序列可位于生物体的基因组内的独特位点。靶核苷酸序列可以是例如但不限于相对于彼此随机分散在整个基因组中；位于基因组中的不同连锁群中；位于相同的连锁群中；位于不同的染色体上；位于同一条染色体上；位于基因组中在生物体中的相似条件下(例如，在相同或基本上功能相同的调节因子的控制下)表达的位点处；并且在基因组中彼此靠近定位(例如，靶序列可包含在基因组基因座处整合为多联体的核酸中)。
靶向核酸内切酶
特异性辨识和结合至靶核苷酸序列的DNA结合多肽可包含在嵌合多肽中，从而赋予嵌合多肽与靶序列的特异性结合。在实例中，这种嵌合多肽可包含例如但不限于核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽，如上所述的这些多肽。包含DNA结合多肽和核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽的嵌合多肽也可包含其他功能性多肽基序和/或结构域，诸如(例如)但不限于：位于嵌合蛋白中的功能性多肽之间的间隔序列；前导肽；将融合蛋白靶向细胞器(例如细胞核)的肽；被细胞酶切割的多肽；肽标签(例如Myc、His等)；和不干扰嵌合多肽的功能的其他氨基酸序列。
嵌合多肽中的功能行多肽(例如，DNA结合多肽和核酸酶多肽)可以可操作地连接。嵌合多肽的功能性多肽可通过其在编码在框架内彼此扎结的至少功能性多肽的单个多核苷酸中的表达而可操作地连接，从而产生编码嵌合蛋白的嵌合基因。作为另一选择，嵌合多肽的功能性多肽可通过其他方式(诸如通过独立表达的多肽的交联)可操作地连接。
特异性辨识和结合至靶核苷酸序列的DNA结合多肽或引导RNA可包含在天然分离蛋白(或其突变体)中，其中天然分离蛋白或其突变体还包含核酸酶多肽(并且也可包含重组酶和/或连接酶多肽)。这种分离蛋白的实例包括TALEN、重组酶(例如Cre、Hin、Tre和FLP重组酶)、RNA引导CRISPR/Cas9和大范围核酸酶。
如本文所用的术语“靶向核酸内切酶”是指包含DNA结合多肽或引导RNA和核酸酶多肽的天然或工程分离的蛋白及其突变体，以及包含DNA结合多肽或引导RNA和核酸酶的嵌合多肽。可使用任何靶向核酸内切酶，该靶向核酸内切酶包含特异性辨识和结合至包含在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座中的靶核苷酸序列的DNA结合多肽或引导RNA(例如，由于靶序列包含在基因座处的天然序列中，或者由于靶序列已经被引入基因座中，例如通过重组)。
合适的嵌合多肽的一些实例包括但不限于以下多肽的组合：锌指DNA结合多肽；FokI核酸酶多肽；TALE结构域；亮氨酸拉链；转录因子DNA结合基序；和从例如但不限于TALEN、重组酶(例如Cre、Hin、RecA、Tre和FLP重组酶)、RNA引导CRISPR/Cas9、大范围核酸酶中分离的DNA辨识和/或切割结构域；和本领域中的技术人员已知的其他者。特定实例包括包含位点特异性DNA结合多肽和核酸酶多肽的嵌合蛋白。嵌合多肽可通过本领域中的技术人员已知的方法进行工程化，以改变包含在嵌合多肽中的DNA结合多肽的辨识序列，从而将嵌合多肽靶向感兴趣的特定核苷酸序列。
嵌合多肽可包含DNA结合结构域(例如锌指、TAL效应物结构域等)和核酸酶(切割)结构域。切割结构域可与DNA结合结构域异源，例如来自核酸酶的锌指DNA结合结构域和切割结构域，或来自不同核酸酶的TALEN DNA结合结构域和切割结构域，或大范围核酸酶DNA结合结构域和切割结构域。异源切割结构域可从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可得到切割结构域的实例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见例如2002-2003Catalogue，New England Biolabs，Beverly，Mass.；和Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。切割DNA的其他酶是已知的(例如51核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNAse I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；也参见Linn等人(eds.)Nucleases，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1993)。这些酶(或其功能性片段)中的一种或多种可用作切割结构域和切割半结构域的来源。
类似地，切割半结构域可源自任何核酸酶或其部分，如上所述，其需要二聚化以获得切割活性。一般来说，如果融合蛋白包含切割半结构域，则切割需要两种融合蛋白。作为另一选择，可使用包含两个切割半结构域的单一蛋白。两个切割半结构域可源自相同的核酸内切酶(或其功能性片段)，或者每个切割半结构域可源自不同的核酸内切酶(或其功能性片段)。此外，两种融合蛋白的靶位点优选相对于彼此设置，使得两种融合蛋白与其各自靶位点的结合将切割半结构域放置成彼此空间取向，这允许切割半结构域例如通过二聚化形成功能切割结构域。因此，靶位点的近边缘可被5-8个核苷酸或15-18个核苷酸分开。然而，任意整数个核苷酸或核苷酸对可介于两个靶位点之间(例如，2至50个或更多个核苷酸对)。一般来说，切割位点位于靶位点之间。
限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够序列特异性结合至DNA(在辨识位点处)，并在结合位点处或其附近切割DNA，例如，使得一个或多个外源序列(供体/转基因)整合在结合(靶)位点处或其附近。某些限制酶(例如IIS型)在远离辨识位点的位点处切割DNA，并具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶Fok I催化DNA的双链切割，在一条链上离其辨识位点9个核苷酸处，而在另一条链上离其辨识位点13个核苷酸处。参见例如第5,356,802号、第5,436,150号和第5,487,994号美国专利；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269：31，978-31，982。因此，融合蛋白可包含来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域(或切割半结构域)和一个或多个锌指结合结构域，该结构域可被工程化或可不被工程化。
一种切割结构域可与结合结构域分离的实例性IIS型限制性酶是Fok I。这一特定的酶作为二聚体具有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10,570-10,575。因此，为了本公开的目的，在公开的融合蛋白中使用的Fok I酶的部分被认为是切割半结构域。因此，对于使用锌指-Fok I融合体的细胞序列的靶向双链切割和/或靶向取代，每种都包含Fok I切割半结构域的两种融合蛋白可用于重建催化活性切割结构域。作为另一选择，也可使用含有DNA结合结构域和两个Fok I切割半结构域的单个多肽分子。
切割结构域或切割半结构域可以是保持切割活性或保持多聚体化(例如，二聚化)以形成功能性切割结构域的能力的蛋白的任何部分。
实例性IIS型限制酶在第2007/0134796号美国专利公开中作出描述。额外的限制酶也含有可分离的结合和切割结构域，并且这些是本公开所设想的。参见例如Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res.31：418-420。
切割结构域可包含最小化或防止同源二聚化的一个或多个工程化切割半结构域(也称为二聚化结构域突变体)，例如在第2005/0064474号、第2006/0188987号和第2008/0131962号美国专利公开中所述。
作为另一选择，可使用所谓的“分裂酶”技术在体内核酸靶位点处组装核酸酶(参见例如第20090068164号美国专利公开)。这种分裂酶的组分可在单独的表达构建体上表达，或者可在其中单个组分被分离的一个开放阅读框中连接，例如通过自切割2A肽或IRES序列。组分可以是单个锌指结合结构域或大范围核酸酶核酸结合结构域的结构域。
锌指核酸酶
嵌合多肽可包含定制设计的锌指核酸酶(ZFN)，该锌指核酸酶可被设计为递送靶向位点特异性双链DNA断裂，外源核酸或供体DNA可整合至该断裂中(参见第2010/0257638号美国专利公开)。ZFN是含有来自限制性核酸内切酶(例如FokI)的非特异性切割结构域和锌指DNA结合结构域多肽的嵌合多肽。参见例如Huang等人(1996)J.Protein Chem.15：481-9；Kim等人(1997a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：3616-20；Kim等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1156-60；Kim等人(1994)Proc Natl.Acad.Sci.USA 91：883-7；Kim等人(1997b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：12875-9；Kim等人(1997c)Gene 203：43-9；Kim等人(1998)Biol.Chem.379：489-95；Nahon and Raveh(1998)Nucleic AcidsRes.26：1233-9；Smith等人(1999)Nucleic Acids Res.27：674-81。ZFN可包含非规范锌指DNA结合结构域(参见第2008/0182332号美国专利公开)。FokI限制性核酸内切酶必须经由核酸酶结构域二聚化，以切割DNA并引入双链断裂。因此，含有来自这种核酸内切酶的核酸酶结构域的ZFN也需要核酸酶结构域的二聚化来切割靶DNA。Mani等人(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.334：1191-7；Smith等人(2000)Nucleic Acids Res.28：3361-9。ZFN的二聚化可通过两个相邻的、相反取向的DNA结合位点来促进。Id。
一种将外源核酸位点特异性整合至宿主的至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座中的方法可包含将ZFN引入宿主细胞，其中ZFN辨识并结合至靶核苷酸序列，其中靶核苷酸序列包含在宿主的至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座中。在某些实例中，除了该至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座之外，靶核苷酸序列不包含在宿主的基因组的任何其他位置处。例如，ZFN的DNA结合多肽可被工程化以辨识和结合至在该至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座中确定的靶核苷酸序列(例如，通过对ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座测序)。包含将ZFN引入宿主的细胞的将外源核酸位点特异性整合至宿主的至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1性能基因座中的方法还可包含将外源核酸引入细胞，其中将外源核酸重组至包含该至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座的宿主的核酸中是通过ZFN与靶序列的位点特异性辨识和结合(以及随后切割包含ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座的核酸)来促进。
在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处整合的任选外源核酸
在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处整合的外源核酸包括：用于在至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座中进行位点特异性整合的外源核酸，例如但不限于ORF；包含编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列的核酸；和包含前述之一或两者的至少一种的介体。因此，特定核酸包括编码多肽的核苷酸序列、结构核苷酸序列和/或DNA结合多肽辨识和结合位点。
用于位点特异性整合的任选外源核酸分子
如上所述，提供外源序列(也称为“供体序列”或“供体”或“转基因”)的插入，例如用于多肽的表达、突变基因的纠正或野生型基因的增加表达。将显而易见的是，供体序列通常与其所在的基因组序列不同。供体序列可含有在两个同源区域两侧的非同源序列，以便在感兴趣的位置进行高效的同源定向修复(HDR)。此外，供体序列可包含介体分子，该介体分子含有与细胞染色质中的感兴趣区域不同源的序列。供体分子可含有几个与细胞染色质同源的不连续区域。例如，对于通常不存在于感兴趣区域中的序列的靶向插入，该序列可存在于供体核酸分子中，并且两侧是与感兴趣区域中的序列同源的区域。
供体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA，并且可以线性或环状形式引入细胞。参见例如第2010/0047805号、第2011/0281361号、第2011/020722l号和第2013/0326645号美国专利公开。如果以线性形式引入，则可通过本领域中的技术人员已知的方法保护供体序列的末端(例如免受核酸外切酶降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3’末端，和/或将自互补寡核苷酸扎结至一端或两端。参见例如Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4959-4963；Nehls等人(1996)Science 272：886-889。保护外源多核苷酸不被降解的其他方法包括但不限于添加末端氨基和使用经修饰核苷酸间连接，诸如(例如)硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。
多核苷酸可作为介体分子的一部分引入细胞，该介体分子具有额外的序列，诸如(例如)复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体多核苷酸可作为裸核酸、与诸如脂质体或泊洛沙姆等药剂络合的核酸引入，或者可由病毒(例如腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))递送。
供体一般是整合的，使得其表达由整合位点处的内源启动子、即驱动整合有供体的内源基因(例如ANPEP、CD163或SIGLEC1)的表达的启动子驱动。然而，将显而易见的是，供体可包含启动子和/或增强子，例如组成型启动子或诱导型或组织特异性启动子。
此外，尽管表达并不需要，但外源序列也可包括转录或翻译调节序列，例如启动子、增强子、绝缘体、内部核糖体进入位点、编码2A肽和/或聚腺苷酸化信号的序列。
可以位点特异性方式整合至至少一个ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座中以修饰ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座的外源核酸包括，例如但不限于包含编码感兴趣多肽的核苷酸序列的核酸；包含农艺基因的核酸；包含编码RNAi分子的核苷酸序列的核酸；或破坏ANPEP、CD163或SIGLEC1基因的核酸。
外源核酸可在ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座处整合，从而修饰ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座，其中核酸包含编码感兴趣多肽的核苷酸序列，使得核苷酸序列在宿主中从ANPEP、CD163或SIGLEC1基因座表达。在一些实例中，感兴趣多肽(例如，外源蛋白)从编码感兴趣多肽的核苷酸序列以商业数量表达。在这种实例中，感兴趣多肽可从宿主细胞、组织或生物质中提取。
包含编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子
编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列可通过操纵(例如，扎结)编码包含在靶向核酸内切酶中的多肽的天然核苷酸序列来工程化。例如，可检查编码包含DNA结合多肽的蛋白的基因的核苷酸序列，以确定对应于DNA结合多肽的基因的核苷酸序列，并且可使用该核苷酸序列作为编码包含DNA结合多肽的靶向核酸内切酶的核苷酸序列的元素。作为另一选择，可使用靶向核酸内切酶的氨基酸序列来推导编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列，例如，根据基因密码的简并性。
在包含编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列的实例性核酸分子中，编码核酸酶多肽的第一多核苷酸序列的最后密码子和编码DNA结合多肽的第二多核苷酸序列的第一密码子可被任意数量的核苷酸三联体分开，例如，不编码内含子或“停止”。同样，编码DNA结合多肽的第一多核苷酸序列的核苷酸序列的最后一个密码子和编码核酸酶多肽的第二多核苷酸序列的第一密码子可被任意数量的核苷酸三联体分开。编码核酸酶多肽的第一多核苷酸序列和编码DNA结合多肽的第二多核苷酸序列的最后一个密码子(即，核酸序列中的大部分3’)可与和其直接相邻的另一多核苷酸编码序列的第一密码子相配准融合，或者通过不超过一个短肽序列与其分离，诸如由合成核苷酸接头(例如，可能已经用于实现融合的核苷酸接头)编码的短肽序列。这种进一步的多核苷酸序列的实例包括例如但不限于标签、靶向肽和酶切割位点。同样，第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列的大部分5’(在核酸序列中)的第一密码子可与和其直接相邻的另一个多核苷酸编码序列的最后一个密码子以相配准形式融合，或者通过不超过一个短肽序列与其分离。
分离编码靶向核酸内切酶中的功能性多肽(例如，DNA结合多肽和核酸酶多肽)的多核苷酸序列的序列可例如由任何序列组成，使得编码的氨基酸序列不可能显著改变靶向核酸内切酶的翻译。由于已知核酸酶多肽和已知DNA结合多肽的自主性质，插入序列将不会干扰这些结构各自的功能。
其他敲除方法
本领域中已知的各种其他技术可用于灭活基因以制作敲除动物和/或将核酸构建体引入动物以生产首建动物和制作动物品系，其中敲除或核酸构建体整合至基因组中。这种技术包括但不限于原核显微注射(第4,873,191号美国专利)、逆转录病毒介导的基因转移至生殖系(Van der Putten等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，6148-1652)、胚胎干细胞中的基因靶向(Thompson等人(1989)Cell 56，313-321)、胚胎的电穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.3，1803-1814)、精子介导的基因转移(Lavitrano等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，14230-14235；Lavitrano等人(2006)Reprod.Fert.Develop.18，19-23)和体外转化体细胞诸如卵丘或乳腺细胞或成人、胎儿或胚胎干细胞，随后进行核移植(Wilmut等人(1997)Nature 385，810-813；和Wakayama等人(1998)Nature 394，369-374)。原核显微注射、精子介导的基因转移和体细胞核转移是特别有用的技术。经基因修饰的动物是指其所有细胞均具有该修饰的动物，包括其生殖系细胞。当使用生产在其修饰中嵌合的动物的方法时，动物可以是近交的，并且可选择经基因修饰的后代。例如，如果嵌合体动物的细胞在胚泡状态下被修饰，则可使用克隆来制作嵌合体动物，或者当单细胞被修饰时，可进行基因组修饰。根据所使用的具体途径，经修饰使其不发生性成熟的动物对于修饰可以是纯合的或者杂合的。如果特定基因通过敲除修饰失活，则通常将需要纯合性。如果特定基因通过RNA干扰或显性负策略失活，则杂合性通常是足够的。
典型地，在胚胎/合子显微注射中，将核酸构建体或mRNA引入受精卵；使用一个或两个细胞受精卵作为含有来自精子头部的基因物质的核结构，并且卵子在原生质内是可见的。原核阶段受精卵可在体外或体内获得(即，通过手术从供体动物的输卵管中回收)。体外受精卵可按如下方式生产。例如，可在屠宰场收集猪卵巢，并在运输过程中保持在22-28℃下。可清洗和分离卵巢以用于滤泡抽吸，并且介于4-8mm范围内的滤泡可使用18个计量注射针且在真空下抽吸至50mL锥形离心管中。可通过预滤器用商业TL-HEPES(Minitube，维罗纳，威斯康星州)来冲洗卵泡液和抽吸出的卵母细胞。可选择被致密卵丘块包围的卵母细胞，并将其在补充有0.1mg/mL半胱氨酸、10ng/mL表皮生长因子、10％猪类卵泡液、50μM 2-巯基乙醇、0.5mg/ml cAMP、分别为10IU/mL的妊娠母马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)的TCM-199卵母细胞成熟培养基(Minitube，维罗纳，威斯康星州)中、在38.7℃和5％CO2下在加湿空气中放置大约22小时。随后，可将卵母细胞移至新鲜的TCM-199成熟培养基中，该培养基将不含cAMP、PMSG或hCG，并再孵育22小时。成熟的卵母细胞可通过在0.1％透明质酸酶中涡旋1分钟来剥离其卵丘细胞。
对于猪来说，可将成熟的卵母细胞在微试管5孔受精培养皿中的500μl的微试管PORCPRO体外受精培养基系统(Minitube，维罗纳，威斯康星州)中受精。在体外受精(IVF)的准备过程中，新鲜收集或冷冻的公猪精子可在PORCPRO IVF培养基中洗涤并重悬至400,000个精子。可通过计算机辅助精子分析(SPERMVISION，Minitube，维罗纳，威斯康星州)来分析精子浓度。根据公猪，可将最终的体外授精在10μl的体积中在最终浓度大约为40个活动精子/卵母细胞下进行。可将所有受精的卵母细胞在38.7℃下在5.0％CO2气氛中孵育六小时。授精后六小时，可将假定合子在NCSU-23中洗涤两次，并移至0.5mL相同的培养基中。此系统可在大多数公猪中以10-30％的多精受精率常规生产20-30％的胚泡。
可将线性化的核酸构建体或mRNA注射至一个原核或细胞质中。然后可将注射的卵子转移至受体雌性动物(例如，转移至受体雌性动物的输卵管中)，并允许在受体雌性动物中发育以生产转基因或经基因编辑的动物。特别是，可将体外受精胚胎在15,000×g下离心分离5分钟以沉淀脂质，从而使原核可见。可使用Eppendorf FEMTOJET注射器来注射胚胎，并可培养直至胚泡形成。可记录胚胎卵裂和胚泡形成的速率和质量。
可将胚胎通过手术转移至异步受体的子宫中。典型地，可使用5.5英寸
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导管将100-200(例如，150-200)个胚胎沉积至输卵管的壶腹-峡部连接处。手术后，可进行怀孕的实时超声检查。
在体细胞核转移中，可将包括上述核酸构建体的转基因或经基因编辑的细胞(诸如胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞、成人耳成纤维细胞或粒膜细胞)引入去核卵母细胞中，以建立组合细胞。可通过在极体附近进行部分透明带解剖，然后在解剖区域处压出细胞质来对卵母细胞进行去核。典型地，使用具有尖锐斜面尖端的注射移液管来将转基因或经基因编辑的细胞注射至在减数分裂2停滞的去核卵母细胞中。在一些惯例中，在减数分裂2停滞的卵母细胞被称为卵子。在生产猪类或牛类胚胎后(例如，通过融合和激活卵母细胞)，将胚胎在激活后约20至24小时转移至受体雌性动物的输卵管。参见例如Cibelli等人(1998)Science 280，1256-1258和第6,548,741号、第7,547,816号、第7,989,657号或第6,211,429号美国专利。对于猪来说，在胚胎转移后大约20-21天，可检查受体雌性动物的怀孕情况。
可使用标准配种技术来从初始杂合子首建动物中形成对于灭活基因为纯合的动物。然而，可能不需要纯合性。本文所述的经基因编辑的猪可与其他感兴趣的猪一起配种。
一旦经基因编辑的动物已经产生，可使用标准技术来评估内源核酸的失活。初始筛选可通过Southern印迹分析来完成，以确定是否发生了失活。关于Southern分析的描述，参见sections 9.37-9.52 of Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，second edition，Cold Spring Harbor Press，Plainview；N.Y。也可使用聚合酶链反应(PCR)技术来初始筛选PCR是指其中扩增靶核酸的程序或技术。一般来说，采用来自感兴趣区域末端或更远的序列信息来设计寡核苷酸引物，该寡核苷酸引物在序列上与待扩增模板的相反链相同或相似。可使用PCR来扩增来自DNA和RNA的特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。引物的长度通常为14至40个核苷酸，但其长度可介于10个核苷酸至数百个核苷酸的范围内。PCR描述在例如PCR Primer：A Laboratory Manual，ed.Dieffenbach and Dveksler，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995中。也可通过连接酶链式反应、链置换扩增、自持序列复制或基于核酸序列的扩增来扩增核酸。参见例如Lewis(1992)Genetic Engineering News 12，1；Guatelli等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874；和Weiss(1991)Science 254：1292。在胚泡阶段，可通过PCR、Southern杂交和splinkerette PCR对胚胎进行单独处理以进行分析(参见例如Dupuy等人Proc Natl Acad Sci USA (2002)99：4495)。
干扰RNA
已知多种干扰RNA(RNAi)系统。双链RNA(dsRNA)诱导同源基因转录物的序列特异性降解。RNA诱导沉默复合体(RISC)将dsRNA代谢为小21-23核苷酸小干扰RNA(siRNA)。RISC含有双链RNAse(dsRNAse，例如Dicer)和ssRNAse(例如Argonaut 2或Ago2)。RISC利用反义链作为引导来寻找可切割的靶。已知siRNA和微RNA(miRNA)两者。一种使经基因编辑的动物中的基因失活的方法包含诱导针对靶基因和/或核酸的RNA干扰，使得降低靶基因和/或核酸的表达。
例如，外源核酸序列可诱导针对编码多肽的核酸的RNA干扰。例如，可使用与靶DNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或小发夹状RNA(shRNA)来降低该DNA的表达。用于siRNA的构建体可如例如在Fire等人(1998)Nature 391：806；Romano and Masino(1992)Mol.Microbiol.6：3343；Cogoni等人(1996)EMBO J.15：3153；Cogoni and Masino(1999)Nature 399：166；Misquitta and Paterson (1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：1451；和Kennerdell and Carthew (1998)Cell 95：1017中所述来生产。用于shRNA的构建体可如McIntyre and Fanning (2006)BMC Biotechnology 6：1所述进行生产。一般来说，shRNA被转录成含有互补区域的单链RNA分子，该互补区域可退火并形成短发夹。
找到针对特定基因的单一个体功能性siRNA或miRNA的可能性很高。例如，siRNA的特定序列的可预测性为约50％，但许多干扰RNA可很有把握地被制作成其中的至少一个将是有效的。
可使用表达针对编码ANPEP、CD163或SIGLEC1的基因的RNAi的体外细胞、体内细胞或经基因编辑的动物，诸如家畜动物。RNAi可以是例如选自由siRNA、shRNA、dsRNA、RISC和miRNA组成的群组。
诱导型系统
可使用诱导型系统来灭活ANPEP、CD163或SIGLEC1基因。已知允许对基因失活进行空间和时间控制的各种诱导型系统。几个已被证明在猪类动物体内具有功能。
诱导型系统的实例是可用来调节核酸的转录的四环素(tet)启动子系统。在此系统中，突变的Tet阻遏物(TeRT)与单纯疱疹病毒VP 16反式激活蛋白的激活结构域融合，从而产生由tet或多西环素(dox)调节的四环素受控的转录激活因子(tTA)。在没有抗生素的情况下，转录是最小的，而在tet或dox存在的情况下，转录是诱导的。替代诱导型系统包括蜕皮激素或雷帕霉素系统。蜕皮激素是昆虫脱皮激素，其生产是由蜕皮激素受体的异源二聚体和超螺旋基因(USP)的产物来控制。表达是通过用蜕皮激素或蜕皮激素的类似物(诸如米乐甾酮A)处理来诱导的。对动物施用以触发诱导型系统的药剂被称为诱导剂。
四环素诱导型系统和Cre/loxP重组酶系统(组成型或诱导型)是最常用的诱导型系统。四环素诱导型系统涉及四环素受控的反式激活因子(tTa)/反向tTA(rtTA)。在体内使用这些系统的方法涉及产生经基因编辑的动物的两个品系。一种动物品系在选定启动子的控制下表达激活因子(tTA、rtTA或Cre重组酶)。另一动物品系表达受体，其中感兴趣的基因(或待改变的基因)的表达受tTA/rtTA反式激活因子的靶序列控制(或位于loxP序列的两侧)。该两种动物交配会提供对基因表达的控制。
四环素依赖性调节系统(tet系统)依赖于两个组分，即四环素受控的反式激活因子(tTA或rtTA)和以四环素依赖方式控制下游cDNA的表达的tTA/rtTA依赖性启动子。在四环素或其衍生物(诸如多西环素)不存在的情况下，tTA结合至tetO序列，以允许tTA依赖性启动子的转录激活。然而，在多西环素的存在下，tTA不能与其靶标相互作用，并且不会发生转录。使用tTA的tet系统被称为tet-OFF，因为四环素或多西环素允许转录下调。四环素或其衍生物的施用允许体内转基因表达的时间控制。rtTA是tTA的变体，其在强力霉素不存在的情况下不起作用，但需要存在配体进行反式激活。因此，这种tet系统被称为tet-ON。tet系统已经在体内用于诱导表达几种转基因，以编码例如报告基因、癌基因或参与信号级联的蛋白。
Cre/lox系统使用Cre重组酶，该Cre重组酶通过两个疏远的Cre辨识序列(即loxP位点)之间的交叉来催化位点特异性重组。通过Cre介导的重组，将这两个loxP序列之间引入的DNA序列(称为floxed DNA)切除。使用空间控制(用组织或细胞特异性启动子)或时间控制(用诱导型系统)控制转基因和/或经基因编辑的动物中Cre的表达会导致控制这两个loxP位点之间的DNA切除。一种应用是条件基因失活(条件敲除)。另一种途径是蛋白过度表达，其中在启动子序列和感兴趣的DNA之间插入floxed终止密码子。经基因编辑的动物直至Cre表达后才表达转基因，从而导致floxed终止密码子的切除。此系统已应用于组织特异性肿瘤发生和B淋巴细胞中受控的抗原受体表达。还开发了诱导型Cre重组酶。诱导型Cre重组酶仅通过施用外源配体来激活。诱导型Cre重组酶是含有原始Cre重组酶和特异性配体结合结构域的融合蛋白。Cre重组酶的功能活性依赖于能够结合至融合蛋白中的此特定结构域的外部配体。
可使用包含受诱导型系统控制的ANPEP、CD163或SIGLEC1基因的体外细胞、体内细胞或经基因编辑的动物(诸如家畜动物)。动物的染色体修饰可以是基因组的或嵌合的。诱导型系统可例如选自由Tet-On、Tet-Off、Cre-lox和Hif1α组成的群组。
介体和核酸
为了敲除目的、为了使基因失活、为了获得基因表达或为了其他目的，可将多种核酸引入细胞。如本文所用的术语核酸包括DNA、RNA和核酸类似物以及双链或单链(即有义或反义单链)的核酸。核酸类似物可在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处进行修饰，以提高例如核酸的稳定性、杂交性或溶解性。碱基部分处的修饰包括脱氧胸苷的脱氧尿苷和脱氧胞苷的5-甲基-2’-脱氧胞苷和5-溴-2’-脱氧胞苷。糖部分的修饰包括核糖糖的2’羟基的修饰，以形成2’-O-甲基或2’-O-烯丙基糖。脱氧核糖磷酸骨架可被修饰以产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分连接至六元吗啉代环或肽核酸，其中脱氧磷酸骨架被假肽骨架替换，并且四个碱基被保留。参见Summerton and Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3)：187；和Hyrup等人(1996)Bioorgan.Med.Chem.4：5。此外，脱氧磷酸骨架可被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、磷酰胺酯或烷基磷酸三酯骨架替换。
靶核酸序列可以可操作地连接至调节区域，诸如启动子。调节区域可以是猪类调节区域，或可来自其他物种。如本文所用，可操作地连接是指相对于核酸序列以允许或促进靶核酸转录的方式定位调节区域。
任何类型的启动子都可以可操作地连接至靶核酸序列。启动子的实例包括但不限于组织特异性启动子、组成型启动子、诱导型启动子和对特定刺激有反应或无反应的启动子。合适的组织特异性启动子可导致核酸转录物在β细胞中的优先表达，并且包括例如人胰岛素启动子。其他组织特异性启动子可导致例如肝细胞或心脏组织中的优先表达，并且可分别包括白蛋白或α-肌球蛋白重链启动子。可使用促进核酸分子表达而没有显著组织或时间特异性的启动子(即组成型启动子)。例如，可使用β-肌动蛋白启动子，诸如鸡β-肌动蛋白基因启动子、泛素启动子、微小CAG启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，以及病毒启动子，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子或巨细胞病毒(CMV)启动子。例如，可使用鸡β肌动蛋白基因启动子和CMV增强子的融合体作为启动子。参见例如Xu等人(2001)Hum.Gene Ther.12：563；和Kiwaki等人(1996)Hum.Gene Ther.7：821。
可用于核酸构建体的其他调节区域包括但不限于聚腺苷酸化序列、翻译控制序列(例如内部核糖体进入区段，IRES)、增强子、诱导元素或内含子。这种调节区域可能不是必需的，但它们可通过影响转录、mRNA的稳定性、翻译效率等来增加表达。这种调节区域可根据需要包括在核酸构建体中，以获得核酸在细胞中的最佳表达。然而，在没有这种附加元素的情况下，有时可获得充分的表达。
可使用编码信号肽或选择性标记物的核酸构建体。可使用信号肽，使得经编码的多肽被指引至特定的细胞位置(例如，细胞表面)。选择性标记物的非限制性实例包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷类磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。这种标记物可用于在培养中选择稳定的转化体。其他选择性标记物包括荧光多肽，诸如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
编码选择性标记物的序列的两侧可以是重组酶的辨识序列，例如Cre或Flp。例如，选择性标记物的两侧可以是loxP辨识位点(Cre重组酶辨识的34-bp辨识位点)或FRT辨识位点，使得可从构建体中切除选择性标记物。参见Orban，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89：6861，for a review of Cre/lox technology，and Brand and Dymecki，Dev.Cell(2004)6：7。也可使用含有被选择性标记基因中断的Cre或Flp可激活转基因的转座子来获得具有转基因的条件表达的动物。例如，驱动标记物/转基因的表达的启动子可以是普遍存在的或组织特异性的，这将导致标记物在F0动物(例如猪)中普遍存在或组织特异性表达。转基因的组织特异性激活可例如通过将普遍表达标记物中断转基因的猪与以组织特异性方式表达Cre或Flp的猪杂交，或者通过将表达标记物中断转基因的猪与普遍表达Cre或Flp重组酶的猪杂交来实现。转基因的受控表达或标记物的受控切除允许转基因的表达。
外源核酸可编码多肽。编码多肽的核酸序列可包括编码“标签”的标签序列，该“标签”被设计成有助于经编码多肽的后续操纵(例如，有助于定位或检测)。标签序列可插入编码多肽的核酸序列中，使得经编码标签位于多肽的羧基或氨基末端处。经编码标签的非限制性实例包括谷胱甘肽S转移酶(GST)和FLAGTM标签(柯达，纽黑文，康涅狄格州)。
核酸构建体可用SssI CpG甲基化酶甲基化(新英格兰生物实验室，伊普斯威奇，马萨诸塞州)。一般来说，核酸构建体可在37℃的缓冲液中与S-腺苷甲硫氨酸和SssI CpG-甲基化酶一起孵育。通过在37℃下将构建体与一个单位的HinP1I核酸内切酶一起孵育1小时并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，可证实超甲基化。
可使用多种技术，将核酸构建体引入任何类型的胚胎、胎儿或成年动物细胞，包括例如生殖细胞(诸如卵母细胞或卵)、祖细胞、成年或胚胎干细胞、原始生殖细胞、肾细胞(诸如PK-15细胞)、胰岛细胞、β细胞、肝细胞或成纤维细胞(诸如真皮成纤维细胞)。技术的非限制性实例包括使用转座子系统、可感染细胞的重组病毒、或能够将核酸递送至细胞的脂质体或其他非病毒方法(诸如电穿孔、显微注射或磷酸钙沉淀)。
在转座子系统中，核酸构建体的转录单位，即可操作地连接至外源核酸序列的调节区域的两侧是转座子的反向重复序列。几个转座子系统(包括例如睡美人(参见第6,613,752号美国专利和第2005/0003542号美国公开)；青蛙王子(Miskey等人(2003)NucleicAcids Res.31：6873)；Tol2(Kawakami(2007)Genome Biology 8(Suppl.1)：S7)；弥诺斯(Pavlopoulos等人(2007)Genome Biology 8(Suppl.1)：S2)；Hsmar1(Miskey等人(2007))Mol Cell Biol.27：4589)；和Passport已被开发用于将核酸引入细胞，包括小鼠、人和猪细胞。睡美人转座子特别有用。转座酶可作为蛋白递送，编码在与外源核酸相同的核酸构建体上，可引入至单独的核酸构建体上，或者作为mRNA(例如，体外转录和加帽mRNA)提供。
核酸构建体中还可包括绝缘体元素，以维持外源核酸的表达并抑制宿主基因的不需要的转录。参见例如第2004/0203158号美国公开。通常，绝缘体元素位于转录单位的两侧，并且位于转座子的反向重复序列内部。绝缘体元素的非限制性实例包括矩阵附着区域(MAR)型绝缘体元素和边界型绝缘体元素。参见例如第6,395,549号、第5,731,178号、第6,100,448号和第5,610,053号美国专利以及第2004/0203158号美国公开。
核酸可并入至介体中。介体是包括任何特定的DNA区段的宽泛术语，其被设计成从载体移动至靶DNA。介体可被称为表达介体或介体系统，其是将DNA插入带入基因组或其他靶向DNA序列(诸如附加体、质粒或甚至病毒/噬菌体DNA区段)所需的一组组分。用于在动物体内进行基因递送的介体系统(诸如病毒介体(例如逆转录病毒、腺相关联病毒和整合噬菌体病毒)和非病毒介体(例如转座子))具有两个基本组分：1)由DNA(或反向转录成cDNA的RNA)构成的介体，和2)辨识介体和DNA靶序列两者并将介体插入靶DNA序列的转座酶、重组酶或其他整合酶。介体通常含有一个或多个表达盒，该表达盒包含一个或多个表达控制序列，其中表达控制序列是分别控制和调节另一个DNA序列或mRNA的转录和/或翻译的DNA序列。
已知许多不同类型的介体。例如，已知质粒和病毒介体，例如逆转录病毒介体。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点、合适的启动子和任选的增强子、必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。介体的实例包括：质粒(其也可以是另一种介体的载体)、腺病毒、腺相关联病毒(AAV)、慢病毒(例如经修饰HIV-1、SIV或FIV)、逆转录病毒(例如ASV、ALV或MoMLV)和转座子(例如睡美人、P-元素、Tol-2、青蛙王子、piggyBac)。
如本文所用的术语核酸是指RNA和DNA两者，包括例如cDNA、基因组DNA、合成的(例如化学合成的)DNA，以及天然存在的和化学修饰的核酸，例如合成碱基或替代骨架。核酸分子可以是双链或单链的(即有义或反义单链)。
首建动物、动物品系、性状和繁殖
首建动物可通过克隆和本文所述的其他方法来生产。首建体可对于基因改变是纯合的，就像合子或原始细胞经历纯合修饰一样。同样，也可制作杂合的首建体。在动物在编码ANPEP蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列的情况下，首建体优选是杂合子。首建体可能是基因修饰的，这意味着其基因组中的所有细胞都经历了修饰。首建体可对于修饰为嵌合的，如当介体被引入胚胎中的多个细胞中的一者时，通常是在胚泡阶段可能发生的。可测试嵌合体动物的后代，以确定基因修饰的后代。当形成一群动物时，建立可通过有性繁殖或辅助繁殖技术进行繁殖的动物品系和一致表达该修饰的异种或纯合后代。
在家畜中，已知许多等位基因连接至各种性状，诸如生产性状、类型性状、可加工性性状和其他功能性状。技术人员习惯于监测和量化这些性状，例如Visscher等人，Livestock Production Science，40(1994)123-137、第7,709,206号美国专利、US 2001/0016315、US 2011/0023140和US 2005/0153317。动物品系可包括选自由生产性状、类型性状、可加工性性状、生育性状、母性性状和抗病性状组成的群组中的性状。其他性状包括重组基因产物的表达。
具有一种或多种期望性状的动物可被修饰以防止其性成熟。由于动物在成熟前是不育的，因此可通过控制动物的传播来调节性成熟。因此，已经被配种或修饰成具有一种或多种性状的动物可被提供给受体，受体将对动物进行配种并将这些性状的值用于自身的风险降低。例如，可修饰动物的基因组，其中修饰包含性成熟基因的失活，其中野生型动物中的性成熟基因表达对性成熟具有选择性的因子。可通过施用化合物来治疗动物，以弥补由诱导动物性成熟的基因表达的缺失引起的缺陷。
需要施用化合物来诱导性成熟的动物的配种可有利地在处理设施处完成。处理设施可在控制良好的牲畜上实施标准化方案，以高效地生产出一致的动物。动物后代可被分配至多个地点进行饲养。因此，农场和农民(包括牧场和牧场主的术语)可订购具有规定年龄和/或重量和/或性状范围的期望数量的后代，并在期望的时间和/或地点将其交付。然后，受体(例如农民)可按照其意愿饲养动物并将其递送至市场。
可将具有失活性成熟基因的经基因编辑的家畜动物递送(例如，递送至一个或多个地点、多个农场)。动物的年龄可在约1天与约180天之间。动物可具有一种或多种性状(例如表达期望性状或高价值性状或新性状或重组性状的性状)。
已详细描述了本发明，将显而易见的是在不脱离所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下，可进行修改和变型。
实例
提供以下非限制性实例来进一步说明本发明。
实例1至3描述在其CD163基因中具有经修饰染色体序列的猪的产生以及这种猪对PRRSV感染的抗性。实例4描述SIGLEC1敲除猪的产生。实例5和6描述在其ANPEP基因中具有经修饰染色体序列的猪的产生以及这种猪对TGEV的抗性。实例7描述对于选自CD163、SIGLEC1和ANPEP的至少两个基因中的染色体修饰为杂合的猪的产生。实例8描述如何将实例7中产生的猪用于产生对于选自CD163、SIGLEC1和ANPEP的至少两个基因中的染色体修饰为纯合的动物，以及将如何测试这种动物对TGEV和PRRSV的抗性。
实例1：使用CRISPR/Cas9系统从体外来源的卵母细胞和胚胎生产基因工程化猪
最近的报告描述归巢核酸内切酶，诸如锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关联(Cas9)系统中的组分，该报告表明猪的基因工程(GE)现在可能更高效。靶向归巢核酸内切酶可在基因组中的特定位置处诱导双链断裂(DSB)，并且如果提供供体DNA，则通过非同源末端连接(NHEJ)或刺激同源重组(HR)来引起随机突变。如果随靶向核酸酶一起提供供体DNA，则可用归巢核酸内切酶通过HR实现基因组的靶向修饰。在体细胞中引入特定的修饰后，使用这些细胞经由SCNT来生产用于各种用途的GE猪。因此，归巢核酸内切酶是产生GE猪的有用工具。在不同的归巢核酸内切酶中，在其用作防御机制时从原核生物改编的CRISPR/Cas9系统似乎是一种有效的途径。在自然界中，Cas9系统需要三个组分，即含有与靶序列互补的区域的RNA(约20个碱基)，(顺式抑制RNA[crRNA])；含有与crRNA互补的区域的RNA(反式激活crRNA[tracrRNA])以及Cas9，即此复合体中的酶蛋白组分。单一引导RNA(gRNA)可被构建成发挥碱基配对的crRNA和tracrRNA的作用。gRNA/蛋白复合体可扫描基因组，并在与crRNA/gRNA互补的区域处催化DSB。与其他设计的核酸酶不同，只需要设计短寡聚物来构建靶向感兴趣基因所需的试剂，而组装ZFN和TALEN需要一系列克隆步骤。
与目前基因破坏的标准方法不同，设计的核酸酶的使用会提供使用合子作为GE的起始材料的机会。家畜中的基因破坏的标准方法涉及经培养细胞中的HR和随后通过体细胞核转移(SCNT)来重建胚胎。由于通过SCNT生产的克隆动物有时显示出发育缺陷的体征，因此通常使用SCNT/GE首建体的后代来进行研究，以避免混淆SCNT异常和表型，如果首建动物用于实验，则可能会发生这种情况。考虑到与啮齿类动物相比，猪的妊娠期更长且住房成本更高，因此减少对配种的需求存在时间和成本方面的有益效果。最近的报告证明，将ZFN和TALEN直接注射至猪类合子中可破坏内源基因，并且生产具有期望突变的小猪。然而，只有约10％的小猪显示出靶基因的双等位基因修饰，并且一些呈现出嵌合基因型。最近的文章证明CRISPR/Cas9系统可在发育中的胚胎中诱导突变，并以比ZFN或TALEN更高的效率生产GE猪。然而，从CRISPR/Cas9系统生产的GE猪也具有嵌合基因型。此外，所有上述研究均使用体内来源的合子进行实验，这需要密集的劳动和大量的母猪来获得足够数量的合子。
本实例描述一种在经由注射体外来源的合子和修饰体细胞两者随后进行SCNT产生GE猪时使用CRISPR/Cas9系统的高效途径。靶向两个内源基因(CD163和CD1D)和一个转基因(eGFP)，并且只有体外来源的卵母细胞或合子被分别用于SCNT或RNA注射。CD163似乎是猪繁殖与呼吸综合征病毒生产性感染所需要的，这种病毒已知会给养猪业造成重大经济损失。CD1D被认为是一种非经典的主要组织相容性复合体蛋白，并且参与向不变的自然杀伤T细胞呈递脂质抗原。缺乏这些基因的猪被设计用于农业和生物医学的模型。eGFP转基因被用作初步概念验证实验和方法优化的靶标。
材料和方法
化学品和试剂。除非另有说明，否则本研究中使用的所有化学品均购自西格玛。
设计gRNA以建构特定的CRISPR
引导RNA被设计至CD163的外显子7内的区域，该区域是野生型CD163独有的，并且不存在于结构域交换靶向介体(如下所述)中，使得CRISPR将导致野生型CD163内的DSB，但不导致结构域交换靶向介体中的DSB。仅存在靶向介体将引入单核苷酸多态性(SNP)的四个位置，该单核苷酸多态性将会改变酿脓链球菌(Spy)前间隔区相邻基序(PAM)。选定所有四个靶标，包括：
Figure BDA0002848210210000761
Figure BDA0002848210210000762
和
Figure BDA0002848210210000763
PAM可通过每个gRNA中的粗体字来确定。
对于CD1D突变，CRISPR靶标的搜索被任意限制在初级转录物的前1000bp内的编码链。然而，RepeatMasker[26](“猪”重复文库)确定出起始于初级转录物的碱基943的重复元素。对CRISPR靶标的搜索被限制于初级转录物的前942bp。由于最后一个Spy PAM位于碱基873处，因此搜索被进一步限制于初级转录物的前873bp。选择第一靶标(CRISPR 4800)是因为它与初级转录物
Figure BDA0002848210210000764
中位于碱基42处的起始密码子重叠。选择另外两个靶标(CRISPR 5620和5626)是因为它们在任意选定区域
Figure BDA0002848210210000765
和
Figure BDA0002848210210000766
中距离第一个选择最远。这些靶标重叠。就起始密码子来说，最接近的Spy PAM位于简单序列中，该序列含有通过肉眼评定确定的广泛均聚序列。选择第四靶标(CRISPR 5350)是因为相对于第一个靶标选择，它是最接近的靶标，其不含有广泛均聚区域
Figure BDA0002848210210000767
通过在基因库中搜索相似的猪类序列，证实了所设计的crRNA的特异性。将寡核苷酸(表2)退火并克隆至p330X介体中，该介体含有两个表达盒，人类密码子优化的酿脓链球菌(hSpy)Cas9和嵌合引导RNA。P330X按照张实验室方案(http://www.addgene.org/crispr/zhang/)用BbsI(新英格兰生物实验室)消化。
为了靶向eGFP，在eGFP起始密码子的前60bp内设计了两个靶向eGFP编码序列的特异性gRNA。eGFP1和eGFP2 gRNA均在反义链上，并且eGFPl直接靶向起始密码子。eGFP1 gRNA序列是
Figure BDA0002848210210000768
Figure BDA0002848210210000771
并且eGFP2 gRNA序列是
Figure BDA0002848210210000772
表2.设计的crRNAs。引物1和引物2按照张方案退火。
引物 序列(5’-3’) SEQ ID NO：
CD163 10 1 CACCGGAAACCCAGGCTGGTTGGA 48
CD163 10 2 AAACTCCAACCAGCCTGGGTTTCC 49
CD163 131 1 CACCGGAACTACAGTGCGGCACTG 50
CD163 131 2 AAACCAGTGCCGCACTGTAGTTCC 51
CD163 256 1 CACCGCAGTAGCACCCCGCCCTGAC 52
CD163 256 2 AAACGTCAGGGCGGGGTGCTACTGC 53
CD163 282 1 CACCGTGTAGCCACAGCAGGGACGT 54
CD163 282 2 AAACACGTCCCTGCTGTGGCTACAC 55
CD1D 4800 1 CACCGCCAGCCTCGCCCAGCGACAT 56
CD1D 4800 2 AAACATGTCGCTGGGCGAGGCTGGC 57
CD1D 5350 1 CACCGCAGCTGCAGCATATATTTAA 58
CD1D 5350 2 AAACTTAAATATATGCTGCAGCTGC 59
CD1D 5620 1 CACCGCTTTCATTTATCTGAACTCA 60
CD1D 5620 2 AAACTGAGTTCAGATAAATGAAAGC 61
CD1D 5626 1 CACCGTTATCTGAACTCAGGGTCCC 62
CD1D 5626 2 AAACGGGACCCTGAGTTCAGATAAC 63
eGFP 1 1 CACCGCTCCTCGCCCTTGCTCACCA 64
eGFP 1 2 AAACTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC 65
eGFP 2 1 CACCGGACCAGGATGGGCACCACCC 66
eGFP 2 2 AAACGGGTGGTGCCCATCCTGGTCC 67
CD163和CD1D基因的供体DNA的合成
猪类CD163和CD1D两者均是通过PCR从胎儿成纤维细胞中分离的DNA进行扩增的，该胎儿成纤维细胞将用于以后的转染，以确保靶向介体和转染细胞系之间的同基因匹配。简单来说，使用正向引物CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT(SEQ ID NO：11)和反向引物TATTTCTCTCACATGGCCAGTC(SEQ ID NO：12)的LA taq(克隆技术)用于扩增CD163的9538bp片段。该片段经DNA序列验证并用于建构结构域交换靶向介体(图1)。此介体在外显子7内包括33个点突变，使得其将编码与来自外显子11的人CD163L相同的氨基酸序列。替换外显子为315bp。此外，随后的内含子被经修饰肌生长抑制素内含子B替换，内含子B容置可被Cre重组酶(Cre)移除的选择性标记基因，并且之前在含有保留的loxP位点时证明了正常的剪接(Wells，未公布的结果)。该构建体的长臂为3469bp，并包括结构域交换DS外显子。短臂为1578bp，并且包括外显子7和8(图1，板图B)。在第一次转染实验中，此质粒被用来试图替换外显子7的编码区域，并允许经由选择性标记物(G418)来选择靶向事件。如果靶向发生，则标记物可被Cre重组酶删除。然后，对CD163 DS靶向介体进行修饰，以与已经含有被Neo破坏的SIGLEC1基因的细胞系一起使用，该Neo不能被Cre删除。在此靶向介体中，Neo盒、loxP和肌生长抑制素内含子B被移除，并且只有DS外显子保留有WT长臂和短臂(图1，板图C)。
用使用正向引物CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT(SEQ ID NO：13)和反向引物GACTGGCCATGTGAGAGAAATA(SEQ ID NO：14)的LAtaq来扩增猪类CD1D的基因组序列，从而得到8729bp片段。对该片段进行DNA测序，并用于建构图2所示的靶向介体。Neo盒在磷酸甘油激酶(PGK)启动子的控制下，并且两侧具有为了选择而引入的loxP序列。构建体的长臂为4832bp，并且短臂为3563bp，并且包括外显子6和7。如果成功进行了HR，则外显子3、4和5将被移除并用Neo盒替换。如果NHEJ修复发生错误，则外显子3将被破坏。
胎儿成纤维细胞收集
在妊娠第35天收集猪类胎儿组织以产生细胞系。从大白猪家庭杂交建立两个野生型(WT)雄性和雌性胎儿成纤维细胞系。在这些研究中，还使用了以前被修饰成含有Neo盒(SIGLEC1-/-基因学)的雄性和雌性胎儿成纤维细胞。如所述收集具有很少修饰的胎儿成纤维细胞；将每个胎儿的碎组织在20毫升消化培养基(杜尔贝科改良的Eagle培养基[DMEM]，含有L-谷氨酰胺和1g/L D-右旋葡萄糖[Cellgro]，补充有200单位/毫升胶原酶和25库尼兹单位/毫升DNAseI)中在38.5℃下消化了5小时。消化后，用DMEM、15％胎牛血清(FBS)和40μg/ml庆大霉素洗涤和培养胎儿成纤维细胞。过夜培养后，将细胞胰蛋白酶化并在-80℃下在具有10％二甲基亚砜的FBS中等分冷冻，并存储在液氮中。
细胞转染和基因分型
转染条件与先前前报道的基本相同。供体DNA总是以1μg的恒定量与不同量的CRISPR/Cas9质粒(如下所列)一起使用。在转染前，用MLUI(CD163)(NEB)或AFLII(CD1D)(NEB)将供体DNA线性化。如前所述，在转染前通过PCR确定已建立细胞系的性别。对雄性和雌性细胞系两者都进行转染，并且在转染之间一起分析基因组修饰数据。将相似传代次数(2-4)的胎儿成纤维细胞系培养2天，并在含有L-谷氨酰胺和1g/L D-葡萄糖(Cellgro)且补充有15％FBS、2.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和10mg/ml庆大霉素的DMEM中生长至75％-85％融汇。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(生命技术公司(Life Technologies))洗涤成纤维细胞并胰蛋白酶化。细胞分开后，立即用电穿孔培养基(75％胞盐(cytosalts)[120mMKCl，0.15mM CaCl2，10mM K2HPO4，pH 7.6，5Mm MgCl2])和25％Opti-MEM(生命技术公司)来冲洗细胞。使用血细胞计数器对细胞浓度进行量化。将细胞在600X g下沉淀5分钟，并以1X106的浓度重悬于电穿孔培养基中。在通过BTX ECM 2001在250V下施加三个(1msec)方波脉冲的条件下，每次电穿孔使用2mm间隙的比色皿中的200μl细胞。电穿孔后，将细胞重悬于上述DMEM中。为了选择，在转染后24小时添加600μg/ml G418(生命技术公司)，并且在第7天更换培养基。转染后第14天挑选菌落。如果使用G418选择，则胎儿成纤维细胞以10,000个细胞/平板进行平板处理，而如果不使用G418选择，则以50个细胞/平板进行平板处理。通过应用在菌落周围用高压灭菌真空油脂密封的10mm高压灭菌克隆圆筒收集胎儿成纤维细胞菌落。用PBS冲洗菌落，并经由胰蛋白酶收获；然后重悬于DMEM培养基中。将一部分(1/3)重悬的菌落转移至96孔PCR板中，并且剩余的(2/3)细胞在24孔板的孔中进行培养。将细胞沉淀物重悬在6μl裂解缓冲液(40mM Tris，pH 8.9，0.9％Triton X-100，0.4mg/ml蛋白酶K[NEB])中，在65℃下孵育30分钟以进行细胞裂解，然后在85℃下孵育10分钟以使蛋白酶K失活。
DS的PCR筛选和大缺失及小缺失
HR定向修复的检测。使用长程PCR来确定CD163或CD1D上的突变。使用三种不同的PCR测定来确定HR事件：从供体DNA中的CD163或CD1D序列跨越至右侧或左侧上的内源CD163或CD1D序列的区域的PCR扩增，以及扩增涵盖所设计供体DNA的CD163或CD1D的大区域的长程PCR。由于外源Neo序列的增加，PCR产物的大小增加1.8kb(CD1D)或3.5kb(CD163)认为是基因的HR定向修复的证据。所有的PCR条件包括在95℃下初始变性2分钟，随后是在94℃下30秒、在50℃下30秒和在68℃下7-10分钟的33个循环。按照制造商的建议，所有的测定均使用LA taq。引物示于表3中。
表3.用于确定CD163和CD1D的HR定向修复的引物
Figure BDA0002848210210000791
Figure BDA0002848210210000801
小缺失测定(NHEJ)。通过由CRISPR/Cas9系统引入的投射切割位点两侧的CD163或CD1D的PCR扩增来确定小缺失。CD163和CD1D的扩增子的大小分别为435bp和1244bp。用LAtaq对来自胚胎和胎儿成纤维细胞的裂解物进行PCR扩增。测定的PCR条件是在95℃下初始变性2分钟，然后是在94℃下30秒、在56℃下30秒和在72℃下1分钟的33个循环。对于转染细胞的基因分型，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增子来鉴定插入和缺失(INDEL)。对于胚胎基因分型，随后使用PCR中使用的正向引物对所得PCR产物进行DNA测序，以鉴定小缺失。引物信息示于表4中。
表4.用于通过CD163和CD1D上的NHEJ鉴定突变的引物
引物 序列(5’-3’) SEQ ID NO：
GCD163F GGAGGTCTAGAATCGGCTAAGCC 80
GCD163R GGCTACATGTCCCGTCAGGG 81
GCD1DF GCAGGCCACTAGGCAGATGAA 82
GCD1DR GAGCTGACACCCAAGAAGTTCCT 83
eGFP1 GGCTCTAGAGCCTCTGCTAACC 84
eGFP2 GGACTTGAAGAAGTCGTGCTGC 85
体细胞核转移(SCNT)
为了生产SCNT胚胎，使用母猪来源的卵母细胞(ART公司(ART，Inc.))或来自当地屠宰场的小母猪来源的卵母细胞。将母猪来源的卵母细胞在成熟培养基(TCM-199，具有2.9mM Hepes、5μg/ml胰岛素、10ng/ml表皮生长因子[EGF]、0.5μg/ml猪类卵泡刺激素[p-FSH]、0.91mM丙酮酸盐、0.5mM半胱氨酸、10％猪类卵泡液和25ng/ml庆大霉素)中运输过夜，并在24小时后转移至新鲜培养基中。成熟40-42小时后，通过在0.1％透明质酸酶存在下涡旋，从卵母细胞中移除卵丘细胞。使小母猪来源的卵母细胞如下所述成熟进行体外受精(IVF)。在操纵过程中，将卵母细胞置于补充有7.0μg/ml细胞松弛素B的操纵培养基(TCM-199[生命技术公司]，具有0.6mM NaHCO3、2.9mM Hepes、30mM NaCl、10ng/ml庆大霉素和3mg/ml BSA，渗透性为305mOsm)中。移除极体和可能含有中期II板的一部分邻近的细胞质，并且通过使用薄玻璃毛细管将供体细胞置于卵黄周围空间中。然后使用BTX电子细胞操纵器(哈佛仪器公司(Harvard Apparatus))以1.2kV/cm的两个DC脉冲(1秒间隔)将重建的胚胎在融合培养基(0.3M甘露醇、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2和0.5mM Hepes)中融合30秒。融合后，将融合的胚胎在黑暗中用200μM硫柳汞充分活化10分钟，并用8mM二硫苏糖醇充分活化30分钟。然后如前所述将胚胎在具有0.5μM Scriptaid(S7817；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))即组蛋白去乙酰化酶抑制剂的改良的猪类合子培养基PZM3-MU1中孵育14-16小时。
体外受精(IVF)
对于IVF，来自青春期前小母猪的卵巢是从屠宰场(农田食品公司(FarmlandFoods Inc.))获得的。使用附接至10ml注射器的18号皮下注射针从中等大小(3-6mm)的卵泡中抽吸未成熟卵母细胞。然后选择细胞质均匀暗且周围卵丘细胞完整的卵母细胞进行成熟。将约50个卵丘卵母细胞复合体在含有具有3.05mM葡萄糖、0.91mM丙酮酸钠、0.57mM半胱氨酸、10ng/ml EGF、0.5g/ml促黄体生成素(LH)、0.5μg/ml FSH、10ng/ml庆大霉素(应用制药公司(APP Pharm))和0.1％聚乙烯醇的500μl成熟培养基TCM-199(英杰公司(Invitrogen))的孔中在38.5℃、5％CO2下在加湿空气中置放42-44小时。在成熟结束时，通过在0.1％透明质酸酶存在下涡旋3分钟，从卵母细胞中移除周围的卵丘细胞。然后，将体外成熟的卵母细胞以25-30个卵母细胞为一组，放入50μl IVF培养基液滴(改良的Tris缓冲培养基，含有113.1mM NaCl、3mM KC1、7.5mM CaC12、11mM葡萄糖、20mM Tris、2mM咖啡因、5mM丙酮酸钠和2mg/ml牛血清白蛋白[BSA])中。将一个100μl冷冻精子沉淀物在补充有0.1％BSA的3ml Dulbecco PBS中解冻。通过离心分离将冷冻的WT或新鲜的eGFP精子在60％Percoll中以6503g洗涤20分钟，并在改良的Tris缓冲培养基中洗涤10分钟。在一些情况下，将对于先前描述的eGFP转基因为杂合的新收集的精子在PBS中洗涤三次。然后将精子沉淀物用IVF培养基重悬至0.5X 106细胞/毫升。将五十微升精子悬浮液引入至含有卵母细胞的液滴中。将配子在38.5℃下在5％CO2的气氛中在空气中共孵育5小时。受精后，将胚胎在PZM3-MU1中在38.5℃和5％CO2下在空气中孵育。
胚胎转移
在第一次静止发情期后的第1天(SCNT)或第6天(合子注射的)，将产生以生产GECD163或CD1D猪的胚胎转移至代孕体中。对于第6天的转移，在PZM3-MU1中，在10ng/ml ps48(斯迪姆蒙特公司(Stemgent，Inc.))的存在下，将合子再培养五天。将胚胎通过手术转移至代孕体的输卵管的壶腹-峡部连接处。
CRISPR/Cas9系统的RNA的体外合成
使用PCR来扩增体外转录的模板DNA(表5)。用于细胞转染实验的CRISPR/Cas9质粒用作PCR的模板。为了表达合子中的Cas9，使用mMESSAGE mMACHINE超级试剂盒(Ambion)来生产Cas9的mRNA。然后使用Poly(A)拖尾试剂盒(Ambion)将poly A信号添加至Cas9 mRNA中。CRISPR引导RNA是由MEGAshortscript(Ambion)生产的。在1.5％琼脂糖凝胶上观察合成的RNA的质量，并且然后稀释至10ng/μl的最终浓度(gRNA和Cas9两者)，并分配至3μl等分试样中。
表5.用于扩增体外转录的模板的引物。
Figure BDA0002848210210000821
将所设计的CRISPR/Cas9系统显微注射入合子中
使用FemtoJet显微注射器(艾本德公司(Eppendorf))将编码Cas9和gRNA的信使RNA在受精后14小时注射至受精卵母细胞(假定合子)的细胞质中。显微注射是在尼康倒置显微镜(尼康公司(Nikon Corporation)；日本东京)的受热台上在操纵培养基中执行。然后用10ng/ml ps48将注射的合子转移至PZM3-MU1中，直至进一步使用。
统计分析
具有经修饰基因组的菌落数分类为1，并且基因组未修饰的菌落分类为0。通过使用P值为0.05被认为是显著的PROC GLM(SAS)确定差异。平均值按最小二乘法计算。数据被呈现为数值平均值±SEM。
结果
体细胞中CD163和CD1D的CRISPR/Cas9介导的敲除
在2μg/μl供体DNA的量下，测试了靶向CD163的四种不同CRISPR质粒(引导10、131、256和282)的效率(表6)。CRISPR 282比CRISPR 10和256处理导致显著更多的平均菌落形成(P＜0.05)。根据上述的长程PCR测定，发现了介于503bp至多达1506bp范围内的大缺失，而不是最初预期的通过HR的DS(图3，板图A)。这是意外的，因为以前关于其他DNA编辑系统的报告显示，在猪中使用ZFN，6-333bp的缺失要小得多。与CRISPR 256和282相比，CRISPR 10和所有四种CRISPR的混合导致具有经修饰基因组的菌落数量更高(表6，P＜0.002)。用CRISPR 10和含有Neo但与CD163无同源性的质粒转染导致没有菌落出现大的缺失。有趣的是，在没有任何CRISPR的情况下引入供体DNA时，也检测到一个单等位基因缺失。这种测定可能表示对突变率估计不足，这是因为没有对通过测序转染体细胞中琼脂糖凝胶上无法检测到的任何潜在小缺失进行筛选。
表6.靶向CD163的四种不同CRISPR质粒(引导10、131、256和282)的效率。以2μg至1μg供体DNA的量测试了四种不同的CRISPR(如图1所示)。
Figure BDA0002848210210000831
*4+供体DNA的混合表示0.5μg的每个CRISPR与1μg供体DNA的等量混合。供体DNA处理作为无CRISPR对照，并且10+Neo处理示出在CRISPR处理中观察到的大缺失仅在CD163供体DNA也存在时存在。
Figure BDA0002848210210000832
执行ANOVA，以比较菌落/平板的平均数量从而估计CRISPR毒性和具有经修饰基因组的菌落百分比。p值分别为0.025和0.0002。n/a＝此种处理没有重复，因此没有执行统计分析。
Figure BDA0002848210210000833
具有HR的菌落者表示部分HR事件。
a-c上标字母指示菌落/平板的平均数和具有经修饰基因组的菌落百分比两者的处理之间存在显著差异(P＜0.05)。
最初的目标是通过HR获得针对CD163的结构域交换(DS)靶向事件，但是CRISPR没有增加靶向CD163的效率。应注意的是，这种靶向介体的各种组合已经被用于通过利用传统转染的HR修饰CD163，并且在筛选3399个菌落后导致0个靶向事件(惠特沃思和普拉瑟(Whitworth and Prather)，未公开的结果)。获得了两只猪，其具有由HR产生的完整DS，该DS含有试图通过用CRISPR 10和DS靶向介体作为供体DNA转染而引入的所有33个突变。
接下来，在无需药物选择的情况下测试CRISPR/Cas9诱导的突变的效率；这一研究中所用的胎儿成纤维细胞系已经整合了Neo抗性盒和SIGLEC1的敲除。还测试了CRISPR/Cas9和供体DNA的比率是否将会增加基因组修饰或在高浓度下导致毒性效应。选择CRISPR131进行这项试验是因为在之前的实验中，它导致了大量的菌落总数和具有经修饰基因组的菌落百分比的增加。将CRISPR 131 DNA的量从3∶1增加至20∶1对胎儿成纤维细胞的存活率没有显著影响。在各种CRISPR浓度之间，基因组经NHEJ修饰的菌落百分比没有显著差异，但NHEJ数最高，比率为10∶1(表7，P＝0.33)。即使在CRISPR DNA与供体DNA的最高比率(20∶1)下，也没有观察到HR。
表7.在无药物选择情况下CRISPR/Cas9诱导的突变的效率。在没有使用G418选择的先前修饰的细胞系中，比较了供体DNA与CRISPR 131 DNA的四种不同的比率。
Figure BDA0002848210210000841
a对于具有NHEJ修复的菌落百分比，处理组之间的显著差异(P＞0.05)。
b随着CRISPR浓度的增加，基因组修饰菌落的数量无显著差异(P＞0.33)。
基于这一经验，尝试了体细胞中CD1D的靶向破坏。在雄性和雌性细胞中设计并测试了四种不同的CRISPR。CD1D的修饰可从三个应用的CRISPR中检测到，但是使用CRISPR5350没有导致CD1D的修饰，其中具有足够大的缺失以通过琼脂糖凝胶电泳检测到(表8)。有趣的是，尽管提供了供体DNA，但没有通过HR获得基因变化。然而，观察到与CD163敲除实验类似的大的缺失(图3，板图B)。当CRISPR/Cas9不与供体DNA一起使用时，没有检测到具有大缺失的CD1D的靶向修饰。CRISPR/Cas9引导靶向的CD1D修饰在雄性和雌性细胞菌落中分别为4/121和3/28。转染数据中仅包括琼脂糖凝胶电泳可检测到的INDEL。
表8.以2μg至1μg供体DNA的量测试了四种不同的CRISPRS(如图2所示)。供体DNA处理作为无CRISPR对照。
Figure BDA0002848210210000842
Figure BDA0002848210210000851
利用GE细胞通过SCNT生产CD163和CD1D猪
呈现CD163或CD1D修饰的细胞用于SCNT以生产CD163和CD1D敲除猪(图3)。用来自经CRISPR/Cas9系统转染的雄性和雌性胎儿成纤维细胞的SCNT胚胎执行七次胚胎转移(CD163表9)、六次胚胎转移(无CD163 Neo)和五次胚胎转移(CD1D)至受体小母猪中。六只(CD163)、两只(无CD163 Neo)和四只(CD1D)(表10)受体小母猪受孕至足月，从而致使受孕率分别为85.7％。33.3％和80％。在CD163受体上，五只通过剖腹产产下健康的小猪。一只(O044)自然产仔。产仔数介于一至八只范围内。四只猪因出生后不能茁壮成长而被安乐死。一只小猪因为严重的腭裂而被安乐死。所有剩余的小猪看起来是健康的(图3，板图C)。在图3、板图B中所述的由用CRISPR 10和供体DNA转染的胎儿成纤维细胞产生的两窝雄性小猪在与CRISPR 10相邻的外显子7中具有30bp缺失，并且在前面的内含子中还有1476bp缺失，因此移除CD163的内含子6/外显子7连接(图3，板图E)。基因型和预测翻译总结在表11中。一只雄性小猪和一窝雌性小猪(4只小猪)是通过对先前修饰的SIGLEC1细胞进行无CD163 Neo转染而获得的。所有五只小猪都是SIGLEC1和CD163的双敲除体。雄性小猪具有CD163的双等位基因修饰，在一个等位基因上外显子7中的28bp缺失和在另一个等位基因上的1387bp缺失，其包括外显子7的部分缺失以及外显子8和前面内含子的完全缺失，从而移除内含子外显子连接。雌性小猪具有CD163的双等位基因突变，包括1382bp缺失、一个等位基因上的11bp插入和另一个等位基因上CD163的1720bp缺失。CD163修饰和预测翻译的总结可见于表11中。CD1D修饰和通过CRISPR修饰的预测翻译的总结可见于表12中。简单来说，一窝雌性和两窝雄性出生，从而得到13只小猪。一只小猪出生后立即死亡。13只小猪中的十二只含有CD1D的双等位基因或纯合缺失(图3，板图F)。一只小猪是WT。
表9.CD163的胚胎转移数据。
Figure BDA0002848210210000861
*CD163 CRISPR NT系表示用通过转染修饰的胎儿成纤维细胞系由NT产生的胚胎。
CRISPR注射胚胎是在1细胞期用CD163引导RNA和CAS9 RNA注射的IVF胚胎。
CD163 CRISPR NT-无Neo胎儿系表示由NT用先前修饰的胎儿成纤维细胞产生的胚胎，该胎儿成纤维细胞已经是通过转染而不使用选择性标记物修饰的Neo抗性系。
Figure BDA0002848210210000863
MU是指在密苏里大学抽吸并成熟的小母猪卵母细胞，如材料和方法的IVF IVFse4ction所述。ART是指如材料和方法的SCNT章节所述购买和成熟的母猪卵母细胞。
表10.CD1D的胚胎转移数据。
Figure BDA0002848210210000862
*CD1D CRISPR NT系表示用通过转染修饰的胎儿成纤维细胞系由NT产生的胚胎。CRISPR注射胚胎是在1细胞期用CD1D引导RNA和CAS9 RNA注射的IVF胚胎。
Figure BDA0002848210210000864
MU是指在密苏里大学抽吸并成熟的小母猪卵母细胞，如材料和方法的IVF IVFse4ction所述。ART是指如材料和方法的SCNT章节所述购买和成熟的母猪卵母细胞。
表11.CD163经修饰猪的基因型和翻译预测。一些猪含有双等位基因类型的修饰，但只描述了一个等位基因和没有通过PCR扩增的另一个经修饰等位基因。
Figure BDA0002848210210000871
Figure BDA0002848210210000881
*KO，敲除
**不包括在内，因为小猪被安乐死。
Figure BDA0002848210210000882
本列中的SEQ ID NO是指显示与SEQ ID NO：47相关的INDEL的序列的SEQ ID NO。
a插入的序列是TACTACT(SEQ ID NO：115)
b插入的序列是AG。
c插入的序列是单一腺嘌呤(A)残基。
d插入的序列是TGTGGAGAATTC(SEQ ID NO：116)。
e插入的序列是AGCCAGCGTGC(SEQ ID NO：117)。
表12.CD1D修饰猪的基因型和翻译预测
Figure BDA0002848210210000883
*KO，敲除CRISPR/Cas9系统在猪类合子中的效率
基于利用CRISPR/Cas9系统靶向破坏体细胞中的CD163和CD1D，此种途径被应用于猪类胚胎发生。首先，测试了CRISPR/Cas9系统在胚胎发育中的有效性。将靶向eGFP的CRISPR/Cas9系统引入合子，该合子用来自对于eGFP转基因是杂合的公猪的精子进行受精。注射后，监测随后表达eGFP的胚胎。测试了各种浓度的CRISPR/Cas9系统，并且观察了递送的CRISPR/Cas9系统的细胞毒性(图4，板图A)；注射CRISPR/Cas9后的胚胎发育低于对照组。然而，由于在CRISPR/Cas9注射的群组中没有发现表达eGFP的胚胎，因此所检查的CRISPR/Cas9的所有浓度在产生eGFP的修饰方面都是有效的(图4，板图B)；在未注射的对照胚胎中，67.7％是绿色的，表明eGFP的表达。当对单个胚泡进行基因分型时，可在CRISPR结合位点附近确定小的突变(图4，板图C)。基于毒性和有效性，以下实验使用了10ng/μl的gRNA和Cas9mRNA。
当设计用于靶向CD163的CRISPR/Cas9组分被引入假定合子中时，观察到随后胚泡中基因的靶向编辑。当针对CD163突变对单个胚泡进行基因分型时，在所有胚胎中都发现了特异性突变(100％GE效率)。更重要的是，虽然可发现具有纯合或双等位基因修饰的胚胎(分别为8/18和3/18)(图5)，但也检测到嵌合(单等位基因修饰)基因型(4/18胚胎)。用2ng/μl Cas9和10ng/μl CRISPR注射池中的一些胚胎(8/10)，并且没有发现突变形成效率的差异。接下来，基于体外结果，引入表示不同gRNA的两个CRISPR以在胚胎发生期间破坏CD163或CD1D，从而诱导靶基因的特异性缺失。结果，可通过引入两个引导体成功诱导CD163和CD1D的设计缺失。设计缺失被定义为在引入的该两个引导体之间移除基因组序列的缺失。在接受两个靶向CD163的CRISPR的胚胎中，除了一个胚胎外，所有胚胎都导致CD163的靶向修饰。此外，发现5/13胚胎在CD163上具有设计缺失(图6，板图A)，并且10/13胚胎似乎具有以纯合或双等位基因方式对CD163的修饰。用两个CRISPR靶向CD1D也是有效的，因为所有的胚胎(23/23)显示出CDlD的修饰。然而，CDlD的设计缺失可仅在两个胚胎(2/23)中发现(图6，板图B)。在二十三个具有嵌合基因型的胚胎中也发现了五个，但其余的胚胎是CD1D的纯合或双等位基因修饰。最后，测试了CRISPR/Cas9系统能否在同一胚胎中靶向多个基因。为此，在用杂合eGFP精子进行受精的合子中执行了靶向CD163和eGFP。当针对CD163和eGFP对来自注射胚胎的胚泡进行基因分型时，发现发现CD163和eGFP在胚胎发生期间被成功靶向。测序结果证明，通过引入多个CRISPR和Cas9可靶向多个基因(图6，板图C)。
从CRISPR/Cas9注射的合子生产CD163和CD1D突变体
在先前体外研究成功的基础上，生产了一些CRISPR/Cas9注射的合子，并且每个受体转移了46-55个胚泡(因为这一数量已被证明对从体外来源的胚胎生产猪是有效的)。执行了四次胚胎转移，CD163和CD1D各两次，并且每次修饰都获得了受孕。生产了四只携带对CD163的修饰的健康小猪(表9)。来自受体母猪ID O083的所有小猪即窝67，显示出CD163的纯合或双等位基因修饰(图7)。两个小猪显示出通过两个所递送的CRISPR得到的CD163的设计缺失。所有的小猪都很健康。对于CD1D，一次受孕还生产了四只小猪(受体母猪识别号O165的窝166)：一只雌性和三只雄性(表10)。一只小猪(166-1)确实携带了CD1D的嵌合突变，包括完全移除了含有起始密码子的外显子3的362bp缺失(图8)。一只小猪含有在一个等位基因上的6bp插入和2bp错配以及在另一个等位基因上的大的缺失。另外两只小猪具有双等位基因单bp插入。对于CD163没有检测到嵌合突变。
讨论
通过为农业和生物医学提供更多的GE猪，GE猪生产效率的提高可产生广泛的影响。上述数据表明，通过使用CRISPR/Cas9系统，可高效率地生产具有特定突变的GE猪。CRISPR/Cas9系统成功地用于编辑体细胞和植入前胚胎中的基因。
当将CRISPR/Cas9系统引入体细胞时，其成功地诱导了NHEJ对靶基因的靶向破坏，但没有增加HR的靶向能力。个体CRISPR/Cas9在体细胞中的靶向效率是可变的，这表明引导体的设计可影响靶向效率。具体来说，当将CRISPR 5350和Cas9引入体细胞时，无法发现CD1D的靶向修饰。这表明，在生产猪之前设计多个gRNA并验证其效率可能是有益的。在存在供体DNA的情况下，缺乏HR定向修复的原因尚不清楚。在筛选用CRISPR和供体DNA转染的886个菌落(CD163和CD1D两者)后，只有一个菌落具有部分HR事件的证据。结果证明，CRISPR/Cas9系统与引入的供体DNA一起工作，从而导致靶基因上意外的大缺失，但没有增加这两种特定靶介体的HR效率。然而，用于大缺失观察的具体机制尚不知晓。我们群组以前的报告表明，供体DNA可有效地与ZFN一起用于诱导HR定向修复。类似地，当供体DNA与CRISPR/Cas9系统一起使用时，发现靶向效率增加，但未观察到完全的HR定向修复。在使用ZFN的先前研究中，观察到靶向修饰可通过HR和NHEJ的组合发生，因为在ZFN诱导的DSB之后发现引入供体DNA的部分重组。一种解释可能是，在归巢核酸内切酶诱导的DSB后，HR和NHEJ途径不是独立的，而是可共同作用完成修复过程。虽然在这些实验结果中没有发现统计学差异，但是更高浓度的CRISPR可提高体细胞中的靶向效率。这可能表明CRISPR是CRISPR/Cas9系统的限制因素，但需要进一步验证。靶向细胞通过SCNT成功地用于生产GE猪，表明CRISPR/Cas9的应用不影响细胞被克隆的能力。一些小猪因为健康问题被安乐死；然而，这在SCNT来源的小猪中并不少见。
当CRISPR/Cas9系统通过合子注射引入发育中的胚胎时，近100％的胚胎和猪在靶向基因中含有INDEL，从而证明该技术在胚胎发生期间非常有效。在本研究中观察到的效率超过了在胚胎发生期间利用归巢核酸内切酶的其他研究中报道的频率。达到胚泡阶段的胚胎数量减少表明，本研究中引入的CRISPR/Cas9的浓度可能对胚胎有毒性。进一步优化递送系统可提高胚胎的存活率，并且因此提高过程的总体效率。此处观察到的接近100％的诱变率不同于以前在猪中CRISPR/Cas9介导的敲除中的报告；然而，研究之间的效率差异可能是所选引导体和靶标的组合。在本研究中，较低浓度的CRISPR/Cas9(分别为10ng/μl)在发育中的胚胎和生产GE猪中产生突变是有效的。这一浓度低于以前在猪合子中报告的浓度(125ng/μl Cas9和12.5ng/μl CRISPR)。CRISPR/Cas9组分的较低浓度可能对发育中的胚胎有益，因为将过量的核酸引入发育中的胚胎可能是有毒的。在体外测定中，在CRISPR/Cas9注射的胚胎中发现了一些嵌合基因型；然而，通过这种途径生产的仅一只小猪具有嵌合基因型。潜在地，注射CRISPR/Cas9组分可能比引入其他归巢核酸内切酶更有效，因为嵌合基因型被认为是在合子中使用CRISPR/Cas9系统的主要障碍。本结果证明的使用CRISPR/Cas9系统的另一个有益效果是从注射CRISPR/Cas9系统的IVF来源的合子中生产的CD163敲除猪没有丢失，而从SCNT得到的一些小猪在几天后被安乐死。这表明该技术不仅可绕过在产生敲除猪时对SCNT的需要，还可克服与SCNT相关联的常见健康问题。现在将CRISPR/Cas9mRNA注射至合子中已经得到优化，未来的实验也将包括共注射供体DNA。
本研究证明，在合子中引入两个具有Cas9的CRISPR可诱导发育中胚胎的染色体缺失，并生产具有预期缺失的猪，即两个CRISPR引导体之间的特异性缺失。这种设计缺失可能是有益的，因为可指定缺失的大小，而不是依赖于由NHEJ引起的随机事件。具体来说，如果由归巢核酸内切酶引起的核苷酸的插入/缺失是三的倍数，则突变可能会导致亚效突变，因为将不会发生框移。然而，通过引入两个CRISPR，可造成更大的缺失，这将具有更高的机会产生非功能性蛋白。有趣的是，CD1D CRISPR在基因组中在比CD163更大的区域上被设计；CD163 CRISPR 10和131之间的距离为124bp，而CD1D的CRISPR 4800和5350之间的距离为550bp。研究显示出在产生缺失时，CRISPR之间的更长距离不是很有效。然而，由于本研究包括仅有限数量的观察结果，并且需要考虑单个CRISPR的功效(此处未涉及)，因此需要进一步研充来验证CRISPR之间的距离与导致预期缺失的概率之间的关系。
CRISPR/Cas9系统还会有效地在同一胚胎中同时靶向两个基因，唯一的额外步骤是引入一个额外的CRISPR和crRNA。这说明与其他归巢核酸内切酶相比，易于破坏多个基因。这些结果表明，这种技术可用于靶向可能具有补偿效应的基因簇或基因家族，从而证明除非所有基因都被破坏，否则很难确定单个基因的作用。结果证明，CRISPR/Cas9技术可用于通过提高体细胞中的基因靶向的效率和直接合子注射来产生GE猪。
实例2：在编码CD163蛋白的基因中具有经修饰染色体序列的猪对PRRSV的抗性增 加
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)在过去的四分之一世纪蹂躏了养猪业。在本实例中显示出，CD163无效动物没有显示出为PRRSV感染的所有特点的感染、肺病理学、病毒血症或抗体生产的临床体征。不仅确认了PRRSV进入中介体；而且如果以类似方式产生的动物被允许进入食物供应，则已经描述防止重大经济损失和动物痛苦的策略。
材料和方法
基因分型
基因分型是基于DNA测序和mRNA测序两者。此公畜的基因型在一个等位基因中具有11bp缺失，当翻译时预测结构域5的45个氨基酸，从而在氨基酸64处产生提前终止密码子。在另一个等位基因中，在外显子7中具有2bp添加，并且在外显子7前的内含子中具有377bp缺失，当翻译时，预测结构域5的前49个氨基酸，从而在氨基酸85处产生提前终止码。一只母猪在一个等位基因中具有7bp添加，翻译后预测结构域5的前48个氨基酸，从而在氨基酸70处产生提前终止密码子。另一个等位基因是无特征的(A)，因为通过PCR或长程6.3kbPCR都没有来自外显子7的条带。另外3头母猪是克隆体，并且在外显子7中具有129bp缺失，预测会导致来自结构域5的43个氨基酸的缺失。另一个等位基因是无特征的(B)。
PRRSV在培养中的生长和用于感染猪的病毒接种物的生产包含在批准的IBC申请973中
如在批准的IBC方案973中所述生长一种PRRSV型菌株，分离株NVSL 97-7895(基因库#AF325691 2001-02-11)。这种实验室分离株已用于实验研究约20年(Ladinig等人，2015)。第二分离株用于第2次试验，如前所述的KS06-72109(Prather等人，2013)。
猪感染PRRSV
使用PRRSV的标准化感染方案来感染猪。对三周大的小猪接种大约104 TCID50的PRRS病毒，该病毒通过肌内(IM)和鼻内(IN)路径施用。每天对猪进行监测，并且根据CMG兽医的建议对表现出疾病症状的猪进行处理。显示出严重痛苦和有感染危险的猪被人道安乐死并收集样本。工作人员和兽医对猪的基因状态视而不见，以消除评价或处理中的偏见。感染期间体液中存在PRRSV；因此，收集血样并存储在-80℃下，直至进行测量以确定每只猪的病毒血症的数量或程度。实验结束时，对猪进行称重和人道安乐死，并且收集组织并固定在10％缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并由委员会认证的病理学家进行组织病理学处理。
受攻击猪的表型评分
猪的表型每天被盲目评分如下：猪的态度是什么？态度得分：0：BAR，1：QAR，2：轻度抑郁，3：抑郁，4：垂死。猪的身体状况如何？身体状况得分：1：瘦弱，2：瘦，3：理想，4：肥胖，5：过度肥胖/过胖。猪的直肠温度是多少？正常体温101.6-103.6°F(发烧被认为≥104°F)。存在跛行(级别)？什么肢体？评价四肢关节肿胀和蹄损伤(检查蹄的底部和侧面)。跛行得分：1：无跛行，2：行走时轻微不均匀，一些关节中出现僵硬但无跛行，3：轻微跛行，行走时轻度跛行，4：中度跛行，包括触趾跛行的明显跛行，5：重度跛行，肢体无负重，需要鼓励站立/行走。存在呼吸困难(级别)？存在张口呼吸？存在任何鼻腔分泌物(分泌物颜色，分泌物量：轻度/中度/严重)？你注意到动物在咳嗽吗？存在任何眼部分泌物？呼吸得分：0：正常，1：应激时(处理时)轻度呼吸困难和/或呼吸急促，2：休息时轻度呼吸困难和/或呼吸急促，3：应激时(处理时)中度呼吸困难和/或呼吸急促，4：休息时中度呼吸困难和/或呼吸急促，5：应激时(处理时)重度呼吸困难和/或呼吸急促，6：休息时重度呼吸困难和/或呼吸急促。存在腹泻(级别)或呕吐的证据？存在任何血或粘液？腹泻得分：0：未记录排泄物，1：正常粪便，2：软粪便但已成形(软酸奶稠度，形成牛肉饼)，3：褐色/棕褐色液体腹泻伴有颗粒状粪便，4：褐色/棕褐色液体腹泻伴有颗粒状粪便，5：类似于水的液体腹泻。
此评分系统是由梅根·尼德维尔德博士在KSU开发的，并基于以下出版物(Halbur等人，1995；Merck；Miao等人，2009；Patience and Thacker，1989；Winckler and Willen，2001)。得分和温度是通过使用基于基因型分离的ANOVA作为处理进行分析。
PRRSV病毒血症的测量
病毒血症经由两种途径来确定。病毒滴定是通过向96孔板中融汇的MARC-145细胞中添加1∶10系列血清稀释液来执行。如前所述，血清在补充有8％胎牛血清、盘尼西林、链霉素和两性霉素B的Eagle最低必需培养基中稀释(Prather等人，2013)。孵育4天后，用显微镜检查细胞是否存在细胞病变效应。显示细胞病变效应的最高稀释被评分为滴定终点。总RNA是通过使用用于测量病毒核酸的生命技术公司的MagMAX-96病毒RNA分离试剂盒从血清中分离。根据制造商的说明，通过在CFX-96实时PCR系统(Bio-Rad)上使用来自Tetracore的EZ-PRRSV MPX 4.0试剂盒来执行逆转录聚合酶链反应。每个反应(25μl)含有来自5.8μl血清的RNA。标准曲线是通过制备试剂盒中供应的RNA对照的系列稀释液来构建的。报告每个PCR的模板数量。
PAM细胞的SIGLEC1和CD163染色
通过切除肺并用约100ml冷磷酸盐缓冲盐水填充其来收集猪肺泡巨噬细胞(PAM)。回收磷酸盐缓冲盐水洗剂后，将细胞沉淀并重悬在5ml冷磷酸盐缓冲盐水中，并存储在冰上。将大约107PAM在以具有5％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水稀释的5ml各种抗体(抗猪CD169(克隆3B11/11；AbD Serotec)；抗猪CD163(克隆2A10/11；AbD Serotec))中在冰上孵育30分钟。将细胞洗涤并重悬在染色缓冲液中稀释的1/100稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)结合山羊抗小鼠IgG(生命技术公司)中，并在冰上孵育30分钟。通过使用FACSCalibur流式血细胞计数器和细胞探索软件(Cell Quest software)(碧迪公司(Becton Dickinson))分析至少104个细胞。
PRRSV特异性Ig的测量
为了测量PRRSV特异性Ig，在细菌中表达重组PRRSV N蛋白(Trible等人，2012)，并通过使用试剂盒(路明克斯公司(Luminex Corporation))将其与磁性路明克斯珠结合。将N蛋白偶联的珠在含10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水中稀释至2,500个珠/50μl，并放入96孔圆底聚苯乙烯板的孔中。将血清在含10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水中进行1∶400稀释，并且在两个孔中添加了50μl，并在室温下轻轻摇动的情况下孵育30分钟。接下来，用含有10％山羊血清和50μl生物素-SP结合亲和纯化的山羊抗猪二次抗体(IgG，杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))的磷酸盐缓冲盐水洗涤(3X)平板，或者添加了在含有10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水中稀释至2μg/ml的生物素标记的亲和纯化的山羊抗猪IgM(KPL)。孵育30分钟后洗涤(3X)平板，并且然后添加50μl链霉亲和素结合的藻红蛋白(2μg/ml(莫斯公司(Moss，Inc.))，在含10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水)。稍后将平板洗涤30分钟，并且将微球重悬在100μl含10％山羊血清的磷酸盐缓冲盐水中，通过使用MAGPIX和路明克斯xPONENT 4.2软件进行分析。报道了平均荧光强度(MFI)。
结果
通过使用以上在实例1中所述的CRISPR/Cas9技术来产生CD163的突变。通过合子注射和体细胞核转移来生产几只首建动物。这些首建体中的一些交配，从而形成后代进行研究。一只雄性首建体与具有两种基因型的雌性交配。雄性首建体(67-1)在一个等位基因上的外显子7中具有11bp缺失，并且在另一个等位基因的外显子7中具有2bp添加(并且在前面的内含子中具有377bp缺失)，并被预测为无效动物(CD163-/-)。一个雌性首建体(65-1)在一个等位基因中的外显子7中具有7bp添加且具有无特征对应等位基因，并且因此被预测对于敲除是杂合的(CD163-/？)。第二个首建体雌性基因型(3只克隆动物)含有无特征等位基因和在外显子7中具有129bp缺失的等位基因。这种缺失预测会导致结构域5中的43个氨基酸的缺失。这些动物之间的交配导致所有的小猪都从公猪身上遗传无效等位基因，或者是43个氨基酸缺失，或者是从母猪身上遗传了一个无特征等位基因。除了作为病毒攻击的阳性对照的野生型小猪，这会生产另外4种基因型(表13)。
表13.对PRRSV攻击(NVSL和KS06菌株)进行抗性测试的基因型
Figure BDA0002848210210000951
断奶时，经基因编辑的小猪和野生型年龄匹配的小猪被运送至堪萨斯州立大学接受PRRSV攻击。如前所述，进行了PRRSV攻击(Prather等人，2013)。三周大的小猪被带至攻击设施，并保持作为单独的群组。所有实验都是在机构动物使用和生物安全委员会批准后开始的。驯化后，用PRRSV分离株NVSL 97-7895(Ladinig等人，2015)攻击猪，在MARC-145细胞上繁殖(Kim等人，1993)。猪受到大约105TCID50病毒的攻击。一半的接种物是肌内递送的，并且其余的是鼻内递送的。所有被感染的猪被保持为一个单独的群组，这使得病毒能够从被感染的围栏伙伴中持续暴露。在感染后35天和终止感染时即第35天的不同时间收集血样。对猪进行尸检，并且将组织固定在10％缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并进行组织病理学处理。感染过程中记录的PRRSV相关联临床体征包括呼吸窘迫、食欲不振、嗜睡和发烧。图9总结了研究期间临床体征的结果。如所期望的，野生型(CD163+/+)猪显示出PRRSV感染的早期体征，该感染在第5天与第14天之间达到高峰，并在研究的剩余时间内持续存在于该群组中。发热猪的百分比在约第10天达到高峰。相比之下，在整个研究期间，无效(CD163-/-)小猪没有显示出临床体征的证据。急性PRRSV感染期间的呼吸体征反映在肺部中显著的组织病理学变化中(表14)。野生型猪的感染显示出与PRRS相一致的组织病理学，包括单核细胞浸润的间质性水肿(图10)。相比之下，在无效(CD163-/-)猪中没有肺部变化的证据。各种基因型的样本大小为小；尽管如此，野生型的平均得分为3.85(n＝7)，无特征A为1.75(n＝4)，无特征B为1.33(n＝3)，并且无效者(CD163-/-)为0(n＝3)。
表14.显微镜肺评价
Figure BDA0002848210210000961
峰值临床体征与血液中的PRRSV水平相关。通过从血清中分离总RNA，然后使用商业逆转录酶实时PRRSV PCR测试(Tetracore，马里兰州罗克维尔市)扩增PRRSV RNA来执行病毒核酸的测量。通过制备RT-PCR试剂盒中供应的PRRSV RNA对照组的系列稀释液来产生标准曲线，并且将结果标准化为每50μl PCR反应的模板数。PRRSV分离株遵循野生型CD163+/+猪的PRRSV病毒血症的过程(图11)。病毒血症在第四天明显，在第11天达到高峰，并且在研究结束前下降。相比之下，在研究期间的任何时间点，在CD163-/-猪中没有检测到病毒RNA。与病毒血症一致，通过无效和无特征等位基因猪的抗体生产在第14天能够被检测到，并增加至第28天。在无效动物中没有抗体生产(图12)。综上，这些数据表明，野生型猪支持PRRSV复制，并且产生与PRRS一致的临床体征。相比之下，敲除猪没有产生病毒血症和临床体征，即使猪被接种并不断暴露在感染的围栏伙伴中。
在研究结束时，通过肺灌洗来移除猪肺泡巨噬细胞，并对SIGLEC1(CDl69，克隆3B11/11)和CD163(克隆2A10/11)的表面表达进行染色，如前所述(Prather等人，2013)。在CD163+/+野生型动物上检测到相对高水平的CD163表达(图13)。相比之下，CD163-/-猪只显示出背景水平的抗CD163染色，从而证实了敲除表型。野生型和敲除型猪两者的另一种巨噬细胞标记物CD169的表达水平相似(图14)。其他巨噬细胞表面标记物(包括MHC II和CD172)对两种基因型是相同的(数据未显示)。
虽然样本大小为小，但在整个实验过程中，相对于其他三种基因型的猪(无特征A为1.32kg±0.17，n＝4；无特征B为1.20kg±0.16，n＝3；无效者为1.21kg±0.16，n＝3)，野生型猪的体重增加较少(平均日增重为0.81kg±0.33，n＝7)。
在第二次试验中，6个野生型、6个Δ43氨基酸和6只具有无特征等位基因(B)的猪如上所述被攻击，除了KS06-72109用于接种小猪之外。与NVSL数据相似，野生型和无特征B小猪出现了病毒血症。然而，在Δ43氨基酸猪中，KS06没有导致病毒血症(图15；表8)。
含义和结论
与养猪业最具临床相关性的疾病是PRRS。虽然疫苗接种计划已经成功预防或改善了大多数猪病原体，但PRRSV被证明更具挑战性。此处，CD163被确定为此病毒株的进入中介体。首建公猪是通过将CRISPR/Cas9注射至合子中产生的(Whitworth等人，2014)，并且因此没有转基因。此外，母猪的一个等位基因(也是用CRISPR/Cas9产生的)不含转基因。因此，小猪#40携带一个等位基因中的7bp添加以及另一个等位基因中的11bp缺失，但没有转基因。考虑到猪基因组为约28亿bp，CD163的这些病毒抗性等位基因表示较小的基因组编辑(Groenen等人，2012)。如果以类似方式产生的动物被引入食物供应，则可防止重大的经济损失。
实例3：用人CD163样同源SRCR结构域8替换CD163 SRCR结构域5的猪对基因型1猪 繁殖和PRRS病毒的抗性增加
CD163被认为是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的主要受体。在本研究中，对猪进行了基因编辑(GE)，以使其具有以下基因型之一：CD163的完全敲除(KO)，CD163清道夫受体半胱氨酸富集的(SRCR)结构域5内的缺失，或用编码人CD163样(hCD163L1)SRCR 8结构域的同源物的合成外显子替换(结构域交换)SRCR结构域5。猪肺泡巨噬细胞(PAM)的免疫分型显示出具有KO或SRCR结构域5缺失的猪不表达CD163，并且PAM不支持PRRSV感染。来自猪的具有hCD163L1结构域8同源物的PAM表达CD163并支持2型基因型病毒的复制，但不支持1型基因型病毒的复制。用代表性1型和2型病毒感染CD163修饰的猪产生了相似的结果。尽管1型和2型病毒被认为在几个水平(包括CD163作为受体的要求)上在基因和表型上是相似的，但是结果证明PRRSV基因型之间在CD163分子的辨识上有明显的差异。
材料和方法
猪类CD163基因的基因组修饰
涉及动物和病毒的实验是根据动物科学社团联合会关于研究和教学中的农用动物的保健和使用指南、美国农业部《动物福利法(Animal Welfare Act)》和《动物福利条例(Animal Welfare Regulations)》来执行，并且得到堪萨斯州立大学和密苏里大学机构动物保健和使用委员会以及机构生物安全委员会的批准。本研究中使用的CD163突变是使用前面实例中描述的CRISPR/Cas9技术来产生的。突变如图17图解表示。图17所示的图解基因组区域覆盖猪类CD163基因从内含子6至内含子8的序列。图17中图解的内含子和外显子没有按比例绘制。预测的蛋白产物在每个基因组结构的右侧示出。通过PAM上的表面CD163水平测量的相对巨噬细胞表达显示在图17的最右侧。黑色区域指示内含子；白色区域指示外显子；阴影区域指示hCD163L1外显子11拟态者，即猪类外显子7的同源物；并且灰色区域指示如图17所示的具有PGK Neo构建体的合成内含子。
图17所示的CD163基因构建体KO-d7(11)具有在外显子7中从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失。CD163基因构建体KO-i7(2)具有在外显子7中在核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入以及在外显子7上游的内含子中从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失。这些编辑被预测会导致框移突变和提前终止密码子，从而导致SRCR 5和KO表型的仅部分翻译。另外三个突变产生了外显子7中的缺失。第一个d7(129)具有在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失。d7(129)构建体还具有外显子6中从核苷酸488至核苷酸2,417的缺失，其中缺失的序列被12bp插入替换。另外两个缺失构建体d7(1467)和d7(1280)具有外显子7和8的完全缺失，如图17所示。d7(1467)具有从核苷酸2,431至核苷酸3,897的1467个碱基对缺失，并且d7(1280)具有从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失。对于这些缺失构建体，其他CD163外显子保持完整。
图17中所示的最后一个构建体HL11m是使用靶向事件产生的，该靶向事件使外显子7缺失，并用合成的外显子替换它，该合成的外显子编码人CD163样1蛋白的SRCR 8的同源物(hCD163L1结构域8由hCD163L1外显子11编码)。SRCR 8肽序列是通过在猪类外显子7序列中进行33个核苷酸改变而产生的。新霉素盒包括在合成的外显子中，以能够针对修饰进行筛选。SEQ ID NO：118提供HL11m构建体在对应于参考序列SEQ ID NO：47中相同区域的区域中的核苷酸序列。
猪类CD163蛋白和基因的图解提供在图18中。CD163蛋白SCRC(椭圆形)和PST(正方形)结构域以及对应的基因外显子显示在图18的板图A中。猪类CD163SRCR 5(SEQ ID NO：120)和人CD163 SRCR 8同源物(SEQ ID NO：121)的肽序列比较显示在图18的板图B中。该图基于基因库登录号AJ311716(猪CD163)和GQ397482(hCD163-L1)。
病毒
表15列出本实例中使用的病毒小组。将分离株在MARC-145细胞上繁殖和滴定(Kim等人，1993)。为了滴定，每种病毒在补充有7％的FBS、Pen-Strep(分别为80单位/ml和80μg/ml)、3μg/ml FUNGIZONE(两性霉素B)和25mM HEPES的MEM中进行1∶10系列稀释。将稀释的样品一式四份添加至96孔板中融汇的MARC-145细胞，最终体积为每孔200μl，并在5％CO2中在37℃下孵育四天。滴定终点被确定为具有细胞病变效应(CPE)的最后一孔。50％组织培养感染剂量(TCID50/ml)是用前面描述的方法计算的(Reed and Muench 1938)。
表15.PRRSV分离株
Figure BDA0002848210210000991
Figure BDA0002848210210001001
*NA，不适用。
肺泡巨噬细胞感染
巨噬细胞的制备和感染如前所述执行(Gaudreault，等人，2009和Patton，等人，2008)。从安乐死的猪中取出肺，并且通过向气管中倒入100ml冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行灌洗。夹住气管且轻轻按摩肺部。将肺泡内容物倒入50ml离心管中并存储在冰上。通过在4℃下以1200×g离心分离10分钟而使猪肺泡巨噬细胞(PAM)沉淀。将沉淀物重悬并在冷的无菌PBS中洗涤一次。将细胞沉淀物重悬在含有45％RPMI 1640、45％胎牛血清(FBS)和10％二甲基亚砜(DMSO)的冷冻培养基中，并存储在液氮中直至使用。将冷冻细胞在冰上解冻，计数并在培养基(RPMI 1640，补充有10％FBS、PenStrep和FUNGIZONE；RPMI-FBS)中调整为5x105个细胞/ml。将每孔大约103个PAM添加至96孔板中，并在5％CO2中在37℃下孵育过夜。轻轻洗涤细胞以移除不粘附的细胞。将系列1∶10稀释的病毒添加至三个孔中。孵育过夜后，用PBS洗涤细胞，并用80％丙酮固定10分钟。干燥后，将孔用PRRSV N蛋白特异性SDOW-17 mAb(农村技术公司(Rural Technologies Inc.))染色，该SDOW-17 mAb在含有1％鱼明胶(PBS-FG；西格玛奥德里奇公司)的PBS中进行1∶1000稀释。在37℃下孵育30分钟后，用PBS洗涤细胞，并用在PBS-FG中进行1∶200稀释的ALEXAFLUOR 488标记的抗小鼠IgG(赛默飞世尔科技公司(Thermofisher Scientific))染色。将平板在37℃下在黑暗中孵育30分钟，用PBS洗涤，并在荧光显微镜下观察。50％组织培养感染剂量(TCID50)/ml是根据前面描述的方法计算的(Reed and Muench 1938)。
PAM上的CD169和CD163表面表达的测量
如前所述执行CD169和CD163的表面表达的染色(Prather等人，2013)。将大约1X106PAM置于12mmx75mm聚苯乙烯流式细胞仪(FACS)管中，并在室温下在1ml含有10％正常小鼠血清的PBS中孵育15分钟，以阻断Fc受体。通过离心分离使细胞沉淀并重悬在5μl的FITC结合的小鼠抗猪类CDl69 mAb(克隆3B11/11；AbD Serotec)和5μl的PE结合的小鼠抗猪类CD163 mAb(克隆：2A10/11，AbD Serotec)。孵育30分钟后，用含1％牛血清白蛋白(BSA部分V；Hyclone)的PBS洗涤细胞两次，并立即在具有FCS Express 5软件(De Novo软件)的BDLSR Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)上进行分析。每个样品分析至少10,000个细胞。
PRRS病毒血症的测量
根据制造商的说明，使用Ambion的MagMAX 96病毒分离试剂盒(应用生物系统公司(Applied Biosystems))从50μl血清中分离出RNA。根据制造商的说明，使用EZ-PRRSV MPX4.0实时RT-PCR靶标特异性试剂(Tetracore)对PRRSV RNA进行量化。每个板含被设计与RT-PCR试剂一起使用的Tetracore量化标准和对照组。使用推荐的循环参数，在96孔格式的CFX96触摸式实时PCR检测系统(Bio-Rad)上进行PCR。PCR测定结果被报告为每50μl反应体积为log10 PRRSV RNA拷贝数，其大约为每ml血清的拷贝数。病毒血症随时间变化的曲线下面积(AUC)是使用用于Windows的GraphPad Prism version 6.00计算的。
PRRSV抗体的测量
如前所述进行用于检测针对PRRSV核衣壳(N)蛋白的抗体的微球荧光免疫测定(FMIA)(Stephenson等人，2015)。根据制造商的指示，将重组PRRSV蛋白偶联至羧化LuminexMAGPLEX聚苯乙烯微球珠上。对于FMIA，将悬浮在含有10％山羊血清的50μL PBS(PBS-GS)中的大约2500个抗原包被的珠放置在96孔聚苯乙烯圆底板的每个孔中。血清在PBS-GS中进行1∶400稀释，并向每个孔中添加50μl。将平板用箔纸包裹，并在室温下在轻轻摇动的情况下孵育30分钟。将平板放在磁体上，并且用190μl的PBS-GS洗涤珠三次。为了检测IgG，将50μl生物素-SP结合的亲和纯化山羊抗猪二次抗体(IgG，杰克逊免疫研究公司)在PBS-GS中稀释至2μg/ml，并向每个孔中添加100μl。将平板在室温下孵育30分钟，并洗涤三次，然后添加50μl链霉亲和素结合的藻红蛋白(在PBS-GS中为2μg/ml；SAPE)。30分钟后，洗涤微球，重悬在100μl的PBS-GS中，并且使用MAGPIX仪器(LUMINEX)和LUMINEX xPONENT 4.2软件进行分析。平均荧光强度(MFI)是在最少100个微球珠上计算的。
触珠蛋白(HP)的测量
使用猪类特异性Hp ELISA试剂盒(根威生物技术公司(Genway Biotech Inc.))测量血清中的Hp量，并根据制造商的说明执行各步骤。将血清样品在1X稀释液中进行1∶10,000稀释，并且用移液管在预先包被的抗猪Hp 96孔ELISA板上一式两份移液，在室温下孵育15分钟，然后洗涤三次。向每个孔中添加抗Hp-辣根过氧化物酶(HRP)结合物，并在室温下在黑暗中孵育15分钟。洗涤平板，并且向每个孔中添加100μl发色底物溶液。在黑暗中孵育10分钟后，向每个孔中添加100μl终止溶液。将平板在基于Fluostar Omega过滤器的微孔板阅读器(BMG实验室技术公司(BMG Labtech))上以450nm读取。
结果
CD163修饰的猪的PAM的表型性质
使用肺灌洗材料中细胞的前向和侧向散射性质来门控单核细胞亚群。图17所示的不同染色体修饰的代表性CD169和CD163染色结果呈现在图19中。在图19的板图A中呈现的代表性实例中，来自WT猪的超过91％的PAM对于CD169和CD163都是阳性的。本研究中使用的12只WT猪的结果显示出平均值85+/-8％的双阳性细胞。如图19的板图B所示，来自CD163 KO猪的PAM没有显示出CD163的证据，但是保留了CD169的正常表面水平。虽然预测源自d7(1467)和d7(1280)缺失基因型的CD163多肽应产生锚定于PAM表面的经修饰CD163多肽，但免疫染色结果显示出没有表面表达CD163(参见图19，板图D)。由于MAb 2A10辨识位于前三个SRCR结构域中的表位，因此检测的缺失不是免疫反应表位缺失的结果。预测d7(129)基因型在SRCR 5中具有43个氨基酸缺失(参见图17)。在图19的板图C中呈现的实例中，只有2.4％的细胞落在双阳性象限中。对本研究中使用的九只d7(129)猪的PAM的分析显示出双阳性细胞的百分比在0％至3.6％之间(平均值＝0.9％)。CD169的表面表达保持与WT PAM相似。为了本研究的目的，具有KO、d7(1467)、d7(1280)和d7(129)基因型的猪都被归类为具有CD163-无效表型。
含有hCD163L1结构域8肽序列HL11m的CD163修饰显示出在PAM上CD163+和CD169+的双重表达(图19的板图E)。然而，在本研究中分析的所有HL11m猪中，CD163的表面表达与WTPAM相比明显降低。CD163的水平呈连续表达，在没有检测到CD163至猪具有中等水平的CD163范围内。在图19的板图E所示的实例中，大约60％的细胞处于双阳性象限，而40％的细胞仅进行CD169染色。来自总计24只HL11m猪的PAM的分析显示出38+/-12％的PAM细胞仅对CD169呈阳性，并且54+/-14％为双阳性(CD169+CD163+)。
WT和CD163修饰的猪的循环触珠蛋白水平
作为清除分子，CDl63负责移除血液中的HbHp复合体(Fabriek，等人，2005；Kristiansen等人，2001；和Madsen等人，2004)。血清中的Hp水平为确定表达CD163的巨噬细胞的整体功能性质提供一种方便的方法。在三至四周龄时，就在感染PRRSV之前，测量了来自WT、HL11m和CD163无效猪的血清中的Hp水平。图20中呈现的结果显示出来自WT猪的血清具有最低量的Hb(平均A450＝23+/-0.18，n＝10)。每一群组的平均值和标准偏差为WT，0.23+/-0.18，n＝10；HL11m，1.63+/-0.8，n＝11；和对于无效群组，2.06+/-0.57，n＝9。无效群组由不表达CD163的基因型(CD163无效表型猪)构成。Hp测量是在单个ELISA平板上进行。具有相同字母的群组没有显著差异(p＞0.05，利用邓尼特后验(Dunnett’s post-test)的克鲁斯卡尔-沃利斯(Kruskal-Wallis)ANOVA)。WT猪的A450平均值与HL11m和CD163无效猪的A450平均值显著不同(p＜0.05)。虽然HL11m群组的A450平均值低于CD163-无效群组(A450＝1.6+/-0.8对2.1+/-0.6)，但差异在统计学上并不显著。由于HbHp和CD163之间的相互作用是通过SRCR 3发生的(Madsen等人，2004)，因此与WT猪相比，HL11m猪中循环Hp的增加可能不是CD163对Hb/Hp亲和力降低的结果，而是CDl63+巨噬细胞数量减少以及剩余巨噬细胞上的CD163表达减少的结果(参见图19的板图E)。
用1型和2型病毒感染PAM
CD163修饰的猪对PRRSV的许可性最初是通过用一组六个1型和九个2型PRRSV分离株体外感染PAM细胞来评价的(病毒列表参见表15)。板图中的病毒表示不同的基因型，以及核苷酸和肽序列、发病机制和分离年限的差异。表16中呈现的数据显示出对每个CD163基因型群组使用来自三只猪的PAM的结果形式实验。列出的病毒对应于表15中列出的PRRSV分离株。结果显示为平均值+/-受感染的PAM百分比的标准偏差。CD163-无效PAM来自表达d7(129)等位基因的猪(CD163基因构建体和PAM上的CD163表达分别参见图17和19)。
表16.用不同PRRSV分离株感染来自野生型和GE猪的PAM
Figure BDA0002848210210001031
Figure BDA0002848210210001041
如所期望的，WT PAM被所有病毒感染。相比之下，CD163-无效表型猪对所有病毒的感染都是阴性的。在来自HL11m猪的PAM的反应中观察到显著差异。没有1型病毒能够感染HL11m PAM；然而，2型小组中的所有病毒都感染了HL11m PAM，尽管与WT PAM相比百分比低得多。
还通过比较相同2型病毒的WT和HL11m PAM之间的病毒滴定终点来评价许可性。显示两只WT和两只HL11m猪的结果(图21)。基于具有相同病毒样品的巨噬细胞培养物的感染来计算log10TCID50值。感染结果表示来自每种基因型的两种不同的猪。用于感染的病毒列于表15中。来自HL11m猪的PAM的log10TCID50值比感染相同病毒的WT PAM低1-3个对数。唯一的例外是感染了经修饰活病毒疫苗株。总的来说，结果表明来自HL11m猪的PAM对2型病毒感染的易感性或许可性降低。
用1型和2型病毒感染CD163修饰的猪
用代表性1型(SD13-15)(图22，板图A，左图)和2型(NVSL 97-7895)(图22，板图A，右图)病毒感染WT(圆形)、HL11m(正方形)和CD163-无效(三角形)猪。无效表型猪源自KO和d(1567)等位基因(参见图17)。来自接种相同病毒的三种基因型的猪在一个围栏中共混，这使得CD163修饰的猪能够连续暴露于从WT围栏伙伴脱落的病毒。感染代表性1型病毒的猪的数量为：WT(n＝4)、HL11m(n＝5)和无效(n＝3)；和2型病毒：WT(n＝4)、HL11m(n＝4)和无效(n＝3)。如图22所示，感染1型或2型病毒的CD163无效猪在所有时间点对于病毒血症均为阴性，并且没有血清转化。如所期望的，在两种病毒感染后7天，WT猪被有效感染，其具有的平均病毒血症水平接近每50μl PCR反应为106个模板。至第14天，所有的WT猪都已血清转化(参见图22，板图B)。与PAM感染结果一致(表16)，五只感染1型病毒的HL11m猪没有显示出病毒血症或PRRSV抗体的证据。用NVSL 2型分离株感染的所有HL11m猪都支持感染和血清转化(图22，板图B)。HL11m猪的许可性降低的存在尚不清楚。四只HL11m猪中的三只的平均病毒血症与WT猪相似。然而，对于一只HL11m猪，#101(图22中的开放方块，板图A右图)，与HL11m基因型群组中的其他猪相比，病毒血症大大降低。对猪#101的病毒血症减少3至4个对数的解释尚不清楚，但表明一些HL11m猪可能对PRRSV具有较低的许可性，观察到支持体外PAM感染结果(表16)。由于所有的猪都接种相同量的病毒，并保持与WT猪共混，因此猪#101的较低病毒血症不是接受较低量病毒或较少暴露于病毒的结果。巨噬细胞的流式细胞术显示出猪#101的CD163表达与其他HL11m猪相当(数据未显示)。外显子11拟态序列中的序列没有差异。
使用两种病毒NVSL 97-7895和KS06-72109进行了额外的病毒感染试验。结果示于图23中。感染后对猪进行35天的跟踪，并且数据报告为在感染后3、7、11、14、21、28和35天进行病毒血症测量的曲线下面积(AUC)。如图23所示，对于NVSL，感染NVSL的七只WT猪的平均AUC值为168+/-8，而七只HL11m猪的平均AUC值为165+/-15。对于KS06，六只WT和六只HL11m猪的平均AUC值分别为156+/-9和163+/-13。对于两种病毒来说，WT猪和HL11m猪之间没有统计学上的显著差异(p＞0.05)。综合考虑，结果显示出HL11m猪不支持感染1型PRRSV，但保持对感染2型病毒的许可性。尽管来自体外感染了2型分离株的HL11m猪的PAM的PRRSV许可性有所降低，但这种差异并没有转化至猪身上。对于图23所示的结果，通过计算35天感染期内每只猪的曲线下面积(AUC)来确定病毒载量。使用在感染后0、4、7、10、14、21、28和35天得到的log10 PCR病毒血症测量值进行AUC计算。水平线表示平均值和标准偏差。关键词：WT＝野生型猪，HL11＝HL11m基因型猪；Null＝CD163-无效基因型。
讨论
CD163是对清除血液中过量的Hb和响应于组织损伤调节炎症来说重要的巨噬细胞表面蛋白。其还用作病毒受体。CD163参与促炎和抗炎反应(Van Gorp等人，2010)。CD163阳性巨噬细胞被置于交替激活的巨噬细胞的M2群组中，其一般被描述为具有高度吞噬和抗炎性。M2巨噬细胞参与机械组织损伤或感染后的清理和修复(Stein等人，1992)。在抗炎能力中，CD163表达由抗炎蛋白(诸如IL-10)上调(Sulahian，等人，2002)。在炎症过程中，CD163通过从血液中移除循环血红素来减少氧化应激，从而减少炎症。血红素降解产物(诸如胆绿素、胆红素和一氧化碳)是有效的抗炎分子(Soares and Bach，2009和Jeney等人，2002)。在促炎能力中，抗CD163抗体或细菌在巨噬细胞表面上交联CD163导致促炎细胞因子(包括IL-6、GM-CSF、TNFα和IL-1β)的局部释放(Van den Heuvel等人，1999和Fabriek等人，2009)。
缺乏CDl63的GE猪不能支持2型PRRSV分离株的复制(Whitworth等人，2016)。在本研究中，体外感染试验证明CDl63无效表型巨噬细胞对广泛小组的l型和2型PRRSV分离株的抗性，进一步扩展抗性，以可能包括所有PRRSV分离株(表16)。在体内证实了CD163-无效表型巨噬细胞对1型和2型病毒的抗性(图22和图23)。基于这些结果，可排除文献中先前描述的其他PRRSV受体的贡献(Zhang and Yoo，2015)。例如，Shanmukhappa等人(2007)表明用CD151质粒转染的非许可性BHK细胞获得了支持PRRSV复制的能力，并且与多克隆抗CD151抗体一起孵育被显示出显著降低MARC-145细胞的感染。此外，最初开发用于传播猪流感病毒的猿猴细胞系SJPL先前被显示为支持PRRSV复制(Provost，等人，2012)。SJPL细胞系的重要性质包括CD151的存在以及唾液酸粘附素和CD163的缺乏。综合起来，这些数据提供CD151单独存在足以支持PRRSV复制的令人信服的证据。显示出巨噬细胞和具有CD163无效表型的猪不存在PRRSV感染的本研究的结果表明作为PRRSV的替代受体的CD151在生物学上不相关。
形成PRRSV表面上的GP2a、GP3、GP4异源三聚体复合体的一部分的病毒蛋白GP2a和GP4可在用GP2和GP4质粒转染的细胞的下拉测定中与CD163共沉淀(Das，等人，2009)。据推测，GP2和GP4与一个或多个CD163 SRCR结构域形成相互作用。结合猪类CD163 cDNA骨架(含有猪类SRCR 5和来自hCD163-L1 SRCR 8的同源物之间的结构域交换)的体外感染性测定进一步将1型病毒所利用的区域定位于SRCR 5(Van Gorp，等人，2010)。有趣的是推测GP2/GP4和CD163之间的稳定相互作用通过SRCR 5发生。额外的病毒糖蛋白(诸如GP3和GP5)可进一步稳定病毒-受体复合体或可用作共受体分子。在本研究中，通过感染巨噬细胞和具有HL11m等位基因的猪来研究对SRCR 5的需求，该HL11m等位基因通过在猪类外显子7中进行33bp取代来重建CD163L1 SRCR 8结构域交换。HL11m等位基因还包括新霉素盒，以用于选择对基因改变呈阳性的细胞(图17)。HL11m猪在PAM上表达CD163，但与WT PAM相比水平降低(图19，比较板图A和板图E)。表达减少可能是由于新霉素盒的存在，该新霉素盒位于外显子11拟态者和随后的内含子之间。HL11m猪不允许感染1型病毒，从而证实了SRCR 5的重要性。然而，HL11m巨噬细胞和HL11m猪确实支持感染2型病毒。基于病毒滴定和百分比感染结果，来自HL11m猪的PAM显示出与WT巨噬细胞相比，病毒许可性总体降低(表16和图17)。许可性降低可能是由于HL11m巨噬细胞上CD163的水平降低，加上病毒对经修饰CD163蛋白的亲和力降低。假设2型病毒具有SRCR 5型的要求，并且L1 SRCR 8可用作合适的替代物，较低的亲和力可通过人SRCR 8和猪类SRCR 5之间的肽序列差异来解释(参见图18，板图B)。然而，PAM降低的许可性并没有转化至猪。HL11m猪的平均病毒血症与WT猪相比没有显著差异(图23)。除了PAM之外，血管内、隔膜和淋巴组织巨噬细胞的PRRSV感染也会导致病毒血症(Lawson等人，1997和Morgan等人，2014)。这些和其他CD163阳性细胞群体在维持HL11m猪的总体病毒载量方面的潜在贡献值得进一步研究。
即使具有SRCR结构域缺失的CD163质粒在HEK细胞中稳定表达(Van Gorp等人，2010)，d7(1467)和d7(1280)中的外显子7和8的缺失导致CD163缺乏可检测的表面表达(图19，板图D)。由于用于流式细胞术的2A10 mAB辨识三个N-末端SRCR结构域(Van Gorp等人，2010)，以及可能第7和第8个结构域(Sanchez，等人，1999)，检测的缺乏不是由于突变蛋白中2A10表位的移除。虽然在来自一些d7(129)猪的PAM上可检测到少量的CD163表达(参见图19，板图C)，但表达的蛋白的量不足以支持PAM或猪的PRRSV感染。外显子7和8缺失突变体中CD163表达的缺失无法完全理解，但可能是mRNA和/或蛋白降解的结果。
在2003年，CD163被确定为非洲猪瘟病毒(ASFV；Sánchez-Torres等人，2003)的受体。这个结论基于以下观察：感染的巨噬细胞具有成熟的CD163阳性表型，并且抗CD163抗体(诸如2A10)在体外阻断巨噬细胞的ASFV感染。CD163无效猪是否对ASFV感染有抗性还有待确定。
结合对PRRSV受体的修饰的细胞培养模型为PRRSV进入、复制和发病机制提供了有价值的见解。本研究的一个独特方面是使用受体修饰的猪进行体内平行实验。本研究对开发全球养猪业面临的最严重疾病之一的预防性治疗的可行性具有重要影响。
实例4：SIGLEC敲除猪的产生
下面的实例描述SIGLEC1敲除猪的产生。
材料和方法
除非另有说明，否则本研究中使用的所有化学品均购自密苏里州圣路易斯西格玛(Sigma)。
猪类SIGLEC1基因的靶向破坏
动物和病毒的使用是由密苏里大学和/或堪萨斯州立大学的大学动物保健和机构生物安全委员会批准的。结合同源重组以从SIGLEC1中移除编码外显子2和3的蛋白，并引入提前终止密码子以消除剩余编码序列的表达(图24)。猪类SIGLEC1 cDNA(基因库登录号NM214346)编码来自5，193个碱基的mRNA转录物的210kDa的蛋白(Vanderheijden等人，2003)。来自SIGLEC1(基因库登录号CU467609)周围区域的基因组序列用于制备寡核苷酸引物，以通过高保真PCR(AccuTaq；英杰公司)来扩增基因组片段以用于产生靶向构建体。根据与小鼠和人基因组序列的比较，预测猪类SIGLEC1具有21个外显子。此外，外显子2在猪、小鼠和人中是保守的。肽序列比对揭示了已知与唾液酸结合有关的小鼠SIGLEC1中外显子2编码区域中的六个氨基酸在猪SIGLEC1中是保守的。一个片段“上臂”表示第一个编码外显子的一部分和起始密码子上游的3,304bp。第二个片段或“下臂”的长度为4,753bp，并且其表示第三编码外显子下游的大部分内含子，并延伸至第六内含子(包括第四、第五和第六编码外显子)。在下臂和上臂之间是以相反方向插入的neo盒，并且该neo盒置于磷酸甘油激酶(PGK)启动子的控制下。
为了便于参考，本文提供部分野生型SIGLEC1序列作为SEQ ID NO：122。参考序列从外显子l上游的4,236个核苷酸开始，并且包括所有内含子和至外显子7的外显子，以及外显子7末端之后的1,008个核苷酸。SEQ ID NO：123提供含有本文所述修饰的部分SIGLEC1序列，如图24的板图C所示。与部分野生型序列(SEQ ID NO：122)相比，在SEQ ID NO：123中，存在从核苷酸4,279至5,525的1,247个碱基对缺失，并且缺失的序列被1,855个碱基对新霉素选择性盒替换，该新霉素选择性盒在与SEQ ID NO：122相反的方向上取向。这一插入/缺失导致SIGLEC1基因的外显子1的部分以及外显子2和3全部的丧失。
从妊娠第35天开始，从大型商业白猪(长白猪)中分离出雄性和雌性胎儿成纤维细胞原代细胞系。细胞在杜尔贝科修饰的Eagles培养基(DMEM)中培养并生长48小时至80％融汇，该培养基含有5mM谷氨酰胺、碳酸氢钠(3.7克/升)、青霉素-链霉素和1克/升右旋葡萄糖，并进一步补充有15％胎牛血清(FBS；Hy-克隆)、10g/ml庆大霉素和2.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。转染前4小时移除并替换培养基。用10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤成纤维细胞，并且用1ml 0.05％胰蛋白酶-EDTA(英杰公司)从75-cm2的烧瓶中取出。
将细胞重悬在DMEM中，通过以600×g离心分离10分钟来收集，用Opti-MEM(英杰公司)洗涤，并以600×g再次离心分离10分钟。胞盐(75％胞盐[120mM KCl、0.15mM CaCl2、10mM K2HPO4、pH 7.6、5mM MgCl2]和25％Opti-MEM[英杰公司])用于重悬沉淀物(van denHoff等人，1992)。用血细胞计数器对细胞进行计数，并将细胞调整至1×106/ml。用0.75-10g双链或单链靶向DNA(通过热变性获得)在200μl含有1×106个细胞/ml的转染培养基中执行细胞电穿孔。在BTX ECM2001电子细胞操纵器中，通过使用三个250V的1-ms脉冲对细胞进行电穿孔。将电穿孔的细胞以10,000/13-cm平板的DMEM-FBS-碱性成纤维细胞生长因子稀释，并在没有选择性压力的情况下培养过夜。第二天，用含有G418(艮他霉素，0.6mg/ml)的培养基替换培养基。选择10天后，分离G418抗性菌落，并转移至24孔板进行扩张。PCR用于确定SIGLEC1的靶向是否成功。PCR引物“f”和“b”以及PCR引物“a”和“e”(表17；图24)用于确定两臂的成功靶向。引物“f”和“e”在每个靶向臂区域外退火。PCR引物“c”和“d”用于确定完整neo基因的插入。
体细胞核转移
猪卵母细胞购自AR公司(ARInc.)(威斯康星州麦迪逊市)，并根据供应商的说明成熟。在体外成熟42至44小时后，将卵母细胞通过在0.5mg/ml透明质酸酶中轻轻涡旋而剥离卵丘细胞。选择具有良好形态和可见极体(中期II)的卵母细胞，并将其在38.5℃下保存在操纵培养基(TCM-199[生命技术公司]，具有0.6mM NaHCO3、2.9mM Hepes、30mM NaCl、10ng/ml庆大霉素和3mg/ml BSA，并且渗透性为305mOsm)中，直至细胞核转移。
使用倒置显微镜，用保持微量移液管将无卵丘的卵母细胞保持在补充有7.5g/ml细胞松弛素B并覆盖有矿物油的操纵培养基滴中。用靠近第一极体的细玻璃注射微量移液管穿透透明带，并且将含有中期II染色体的第一极体和邻近的细胞质抽吸至移液管中。取出移液管，并且丢弃内容物。选择具有光滑表面的单个圆形且明亮的供体细胞，并将其转移至与卵母细胞膜相邻的卵黄周隙中(Lai等人，2006和Lai等人，2002)。将核转移复合体(卵母细胞加成纤维细胞)在低钙浓度的融合培养基(0.3M甘露醇，0.1mM CaCl2·2H2O，0.1mMMgCl2·6H2O，0.5mM HEPES)中融合。然后通过在黑暗中用200M硫柳汞处理10分钟激活融合的卵母细胞，漂洗，并用8mM二硫苏糖醇(DTT)处理30分钟；再次冲洗卵母细胞以移除剩余的DTT(Machaty等人，2001；Machaty等人，1997)。融合和激活后，将卵母细胞用补充有4mg/ml牛血清白蛋白的猪类合子培养基3洗涤三次(Im等人，2004)，并在38.5℃下在5％O2、90％N2和5％CO2的加湿气氛中培养30分钟。将那些成功融合的复合体培养15至21小时，直至外科胚胎转移。
胚胎转移
通过施用根据取决于发情周期阶段的方案在饲料中混合14天的18至20mg REGU-MATE(烯丙孕素，2.2mg/mL；英特威公司(Intervet)，特拉华州米尔斯伯勒)将代孕小母猪同步化。在最后一次REGU-MATE处理(105小时)后，肌内注射1,000单位的人绒毛膜促性腺激素以诱导发情。使用在发情当天(第0天)或发情后第一天的代孕猪(Lai等人，2002)。以无菌方式制备代孕体，并进行尾部腹部切开以暴露生殖道。将胚胎通过卵巢菌毛转移至一个输卵管。在第30天左右，通过腹部超声检查对猪进行受孕检查，然后在妊娠期间每周检查一次，直至妊娠第114天分娩。
转基因小猪的PCR和Southern印迹证实
对于PCR和Southern印迹测定，从尾部组织中分离基因组DNA。简单来说，在55℃下，用0.1mg/ml蛋白酶K(西格玛，密苏里州圣路易斯市)在100mM NaCl、10mM Tris(pH8.0)、25mM EDTA(pH 8.0)和0.5％SDS中将组织消化过夜。用中和的苯酚和氯仿依次提取材料，并且用乙醇使DNA沉淀(Green等人，2012)。通过用引物进行PCR来执行野生型和靶向SIGLEC1等位基因二者的检测，该引物退火至SIGLEC1的靶向区域两侧的DNA。引物列于下表17中。使用三对引物分别扩增胸苷激酶(TK)下臂区域(“a”正向和“e”反向，图24中的黑色箭头)、上臂Neo区域(“f”正向和“b”反向，图24中的浅灰色箭头)、以及外显子1和neo基因(“c”正向和“d”反向，图24中的深灰色箭头)。引物“c”和“d”(图24中的深灰色箭头)的结合被设计成分别产生野生型和靶向等位基因的约2,400和约2,900bp。
表17：用于扩增SIGLEC1修饰的PCR引物
引物名称(靶标) 序列(5’至3’) SEQ ID No：
“a”正向(TK) AGAGGCCACTTGTGTAGCGC 124
“e”反向(TK) CAGGTACCAGGAAAAACGGGT 125
“f”正向(上臂Neo) GGAACAGGCTGAGCCAATAA 126
“b”反向(上臂Neo) GGTTCTAAGTACTGTGGTTTCC 127
“c”正向(外显子1和neo) GCATTCCTAGGCACAGC 128
“d”反向(外显子1和neo) CTCCTTGCCATGTCCAG 129
对于Southern印迹测定，将基因组DNA在37℃下用ScaI和MfeI(新英格兰生物实验室(New England BioLabs))消化。MfeI的位点位于翻译起始位点上游的基因组区域和内含子6中。neo盒中存在ScaI位点。将消化的DNA在琼脂糖凝胶上分离，通过毛细管作用转移至尼龙膜(止动剂NY+；默克密理博(EMD Millipore))上，并通过紫外线交联固定化(Green等人，2012)。使用下表18中列出的寡核苷酸，通过PCR扩增含有内含子4以及外显子4和5的部分的基因组片段，并根据制造商的方案(罗氏公司(Roche))用地高辛标记。按照制造商的建议(罗氏公司)执行杂交、洗涤和信号检测。野生型和靶向SIGLEC1基因的预测大小分别为7,892和7,204bp。
表18：用于Southern印迹测定的寡核苷酸
寡核苷酸 序列(5’至3’) SEQ ID NO：
2789F GATCTGGTCACCCTCAGCT 130
3368R GCGCTTCCTTAGGTGTATTG 131
PAM细胞的SIGLEC1(CD169)和CD163表面染色
通过肺灌洗收集PAM细胞(猪肺泡巨噬细胞)。简单来说，将切除的肺用大约100ml冷的PBS填充。单次洗涤后，将沉淀物重悬在大约5ml冷的PBS中，并存储在冰上。将大约107个PAM细胞在5ml 20μg/ml在具有5％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS(PBS-FBS)中稀释的抗猪类CD169(克隆3B11/11；AbD Serotec)或抗猪类CD163(克隆2A10/11；AbD Serotec)抗体中在冰上孵育了30分钟。将细胞离心分离、洗涤并重悬在染色缓冲液中稀释的1/100异硫氰酸荧光素(FITC)结合的山羊抗小鼠IgG(生命技术公司)中，并在冰上孵育30分钟。用FACSCalibur流式血细胞计数器和细胞探索软件(Becton，Dickinson)分析至少104个细胞。
结果
SIGLEC1敲除猪的产生
如图24图解示出，使用的敲除策略集中在产生SIGLEC1的剧烈改变，使得外显子2和3被消除，并且期望从突变的基因中没有获得功能性蛋白。此外，通过用在相反方向上取向的新霉素选择性盒替换外显子1的一部分以及外显子2和3的全部来实现基因的进一步破坏(Mansour等人，1988)。用各种质粒制剂(0.75至10μg/μl，单链和双链构建体，以及中等和大尺寸构建体)进行了三十四次转染。还包括表示五种不同猪类胚胎细胞系的雄性和雌性细胞。对2,000多个菌落进行了筛选，以确定是否存在neo盒的靶向插入。使用PCR引物对“f”加“B”和“a”加“e”(图24，板图B和C)来检查构建体上臂和下臂的成功靶向。两个菌落测试对于正确插入的存在为阳性，一个雄性和一个雌性(数据未显示)。
来自雄性克隆4-18的细胞被用于体细胞核转移和将666个胚胎转移至代孕体中。将克隆胚胎转移至两个代孕体内，总共生产了八只小猪。一个代孕体在妊娠第115天产下了六只正常的雄性小猪。在妊娠第117天，对第二个代孕体进行了剖腹产，得到两只正常的雄性小猪。用雌性细胞(658个胚胎)也进行了三次胚胎转移，但没有一次确定怀孕。图25示出用从八个雄性小猪克隆体(F0)中提取的基因组DNA执行的PCR的结果，该克隆体是从4-18个靶向胎儿成纤维细胞系中产生的。为了检测这两种等位基因，用引物“C”和“d”执行PCR(图24，板图C)。预测的PCR产物大小为野生型等位基因约2,400bp，并且目标等位基因约2,900bp。用引物“c”和“d”进行PCR的结果示于图25中。所有的猪对于野生型2,400-bp和靶向2,900-bp等位基因的存在测试呈阳性(图25，板图B)。结合来自用于克隆的细胞系、靶向4-18成纤维细胞细胞系和非靶向4-18细胞系的DNA的对照PCR产生了预测的产物(图25，板图A)。通过用由图24中的浅灰色和黑色箭头所辨识的引物对扩增区域进一步证实了靶向突变的存在，其预测分别产生约4,500和约5,000bp的产物。结果显示出这两种产物都存在于八只首建猪中(数据未显示)。
五只Fo雄性动物用于与野生型雌性动物交配，得到67只F1后代(40只雄性动物和27只雌性动物)，其中39只(58％)为SIGLEC1+/-。一只F1雄性动物与一只F1雌性动物交配(窝52)，得到一窝12只猪，其中11只在断奶前保持存活。后代中野生型和靶向等位基因的确定是通过基因组DNA的Southern印迹完成的。图26中的结果显示出四只SIGLEC1+//+，三只SIGLEC1+/-，和四只SIGLEC1-/- F2动物。
CD169(SIGLEC1)和CD163在PAM细胞上的表达。
在研究结束时，从猪获得用于抗体染色的细胞。如图27所示，来自SIGLEC1+//+和SIGLEC1+/-猪的大于90％的PAM细胞对CD169和CD163呈双重阳性。相比之下，所有的SIGLEC1-/-猪对CD169的表面表达呈阴性，但对CD163仍为阳性。结果显示出来自所有SIGLEC1-/-猪的细胞上均不存在CD169表达。CD169表面表达的不存在并没有改变PRRSV共受体CD163的表达。
实例5：使用CRISPR/Cas9系统从体外来源的卵母细胞和胚胎生产在ANPEP中具有 染色体修饰的猪
材料和方法
化学品和试剂
除非另有说明，否则本研究中使用的所有化学品均购自密苏里州圣路易斯西格玛。
设计gRNA以建构ANPEP特异性CRISPR
使用ANPEP的全长基因组序列(SEQ ID NO：132)来设计CRISPR引导RNA。此转录物具有30,000个碱基对和三个剪接变体(X1、X2和X3)。X1具有20个外显子，并且编码1017氨基酸蛋白产物(SEQ ID NO：133)。X2和X3在外显子2中的起始密码子前出现的剪接位点不同，并且两者编码相同的963氨基酸产物(SEQ ID NO：134)。
引导RNA(gRNA)被设计至位于ANPEP基因的外显子2内的区域，因为起始密码子位于外显子2内。为了便于参考，本文提供包含全长ANPEP序列的一部分的参考序列(SEQ IDNO：135)。参考序列SEQ ID NO：135包含内含子2的一部分、外显子2、内含子3、外显子3、内含子4、外显子4和内含子4的一部分。此参考序列(SEQ ID NO：135)包含外显子2内起始密码子前的1000个核苷酸、外显子2的编码区域和外显子2末端后的1000个核苷酸。此序列的注释版本显现在图28中。在图28中，外显子2、3和4用下划线标出。外显子2始于图28中的核苷酸775，与变体X1和X2一致(变体X3始于外显子2的核苷酸778)。这种差异对蛋白产物没有影响，因为其发生在起始密码子之前(起始密码子在SEQ ID NO：135的核苷酸1001-1003处，并且在图28中以小写粗体显示)。因此，SEQ ID NO：135中的外显子2、3和4编码三个变体(SEQID NO：133或SEQ ID NO：134)之间编码的两种蛋白产物中的前294个氨基酸。为了便于参考，下面在本实例和实例6中描述的每一个INDEL都参考参考序列SEQ ID NO：135进行描述。当参考氨基酸序列时，参考由剪接变体X2和X3变体(SEQ ID NO：134)编码的963个氨基酸蛋白。然而，本领域中的普通技术人员将能够容易地确定剪接变体X1(SEQ ID NO：133)编码的氨基酸序列中的插入或缺失发生的位点。在下面的表19中提供对应于图28中出现的参考SEQ ID NO：135中包括的内含子和外显子的核苷酸列表。
表19：图28中内含子/外显子的位置
核苷酸范围 位置/限定符
1...774 内含子2的末端
775...1599 外显子2(位于nt 1001处的起始密码子(atg))
1600...2109 内含子3
2110...2251 外显子3
2252...2378 内含子4
2379...2518 外显子4
2519...2599 内含子5的开始
所有的引导RNA都被设计成在起始密码子之后，使得INDEL将更有可能导致框移和提前起始密码子。选定的六个靶标与酿脓链球菌(Spy)前间隔区相邻基序(PAM)相邻(Ran等人2015)并列在下表20中。通过每个gRNA中的括号来确定PAM。引导体2和3也在图28中在SEQID NO：135中用粗体和双下划线确定。通过在基因库中搜索相似的猪类序列，证实了所设计的crRNA的特异性。
表20：ANPEP CRISPR引导体
Figure BDA0002848210210001131
将对应于下表21中列出的每个ANPEP靶标的正向(F)和反向(R)寡核苷酸退火并克隆至p330X介体中，该介体含有两个表达盒，人类密码子优化的酿脓链球菌(hSpy)Cas9和嵌合引导RNA。将P330X按照张实验室方案用BbsI(新英格兰生物实验室)消化(得自http://www.addgene.org/crispr/zhang/；还参见Cong等人，2013和Hsu等人，2013)。密苏里大学DNA核心设施的桑格测序证实了每个引导体的克隆成功。将成功克隆的质粒在TOP10电抗性细胞(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德市)中繁殖，并且用Qiagen质粒Maxi试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，马里兰州日耳曼敦)执行大规模质粒制备。将质粒在-20℃下冷冻，直至用于体外转录模板或转染。
表21：为ANPEP编辑设计的crRNA。
引物名称 序列(5’至3’) SEQ ID No：
ANPEP引导体1引物1(正) CACCGCTTCTACCGCAGCGAGTACA 142
ANPEP引导体1引物2(反) AAACTGTACTCGCTGCGGTAGAAGC 143
ANPEP引导体2引物1(正) CACCGTACCGCAGCGAGTACATGGA 144
ANPEP引导体2引物2(反) AAACTCCATGTACTCGCTGCGGTAC 145
ANPEP引导体3引物1(正) CACCGCCTCCTCGGCGTGGCGGCCG 146
ANPEP引导体3引物2(反) AAACCGGCCGCCACGCCGAGGAGGC 147
ANPEP引导体4引物1(正) CACCGCACCATCATCGCTCTGTCTG 148
ANPEP引导体4引物2(反) AAACCAGACAGAGCGATGATGGTGC 149
ANPEP引导体5引物1(正) CACCGTACCTCACTCCCAACGCGGA 150
ANPEP引导体5引物2(反) AAACTCCGCGTTGGGAGTGAGGTAC 151
ANPEP引导体6引物1(正) CACCGAGCTCAACTACACCACCCAG 152
ANPEP引导体6引物2(反) AAACCTGGGTGGTGTAGTTGAGCTC 153
胎儿成纤维细胞收集
在妊娠第35天收集猪类胎儿以产生用于转染的细胞系。从大白猪家庭杂交建立一个野生型雄性和一个野生型雌性胎儿成纤维细胞系。如先前所述收集具有很少修饰的胎儿成纤维细胞(Lai and Prather.，2003a)；将每个胎儿背部的碎组织在20mL消化培养基(杜尔贝科改良的Eagles培养基(含有L-谷氨酰胺和1g/L D-右旋葡萄糖(Cellgro，维吉尼亚州马纳萨斯市)以及200单位/毫升胶原酶和25库尼兹单位/毫升DNAseI))中在38.5℃下消化了5小时。消化后，用含有15％胎牛血清(FBS)和40μg/ml庆大霉素的DMEM洗涤和培养胎儿成纤维细胞。过夜培养后，将细胞胰蛋白酶化并在具有10％二甲基亚砜(DMSO)的FBS中等分缓慢冷冻至-80℃，并长期存储在液氮中。
用ANPEP CRISPR gRNA转染
转染条件类似于先前报道的方案(Ross等人，2010；Whitworth等人，2014)。简单来说，在17次转染的不同组合中测试了六个ANPEP引导体。总CRISPR引导体浓度为2μg/转染。将相似传代次数(2-4)的胎儿成纤维细胞系培养两天，并在含有L-谷氨酰胺和1g/L D-葡萄糖(Cellgro，维吉尼亚州马纳萨斯市；DMEM)且补充有15％胎牛血清(FBS)、2.5ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(西格玛)、10mg/ml庆大霉素和25μg/ml FUNGIZONE(两性霉素B)的杜尔贝科改良的Eagles培养基中生长至75％-85％融汇。用磷酸盐缓冲盐水(PBS；生命技术公司，得克萨斯州奥斯汀市)洗涤成纤维细胞并胰蛋白酶化。细胞分开后，立即用电穿孔培养基(75％胞盐(120mM KCl、0.15mM CaCl2、10mM K2HPO4、pH 7.6、5Mm MgCl2))(Yanez等人，2016)和25％OPTI-MEM(生命技术公司)来冲洗细胞。通过使用血细胞计数器对细胞进行计数。将细胞在600x g下沉淀5分钟，并以1X106/ml的浓度重悬在电穿孔培养基中。每次电穿孔使用2mm间隙比色皿中的200μL(总细胞数为0.2X 106)细胞，和通过BTX ECM 2001电穿孔系统在250伏下施加的三个(1毫秒)方波脉冲。电穿孔后，将细胞重悬在上述DMEM培养基中。转染后第14天挑选菌落。胎儿成纤维细胞以50个细胞/板的速度平板培养(Beton andWells 2014)。通过在每个菌落周围密封10mm高压灭菌克隆圆筒来收集胎儿成纤维细胞菌落。用PBS冲洗菌落，并经由胰蛋白酶收获，并且然后重悬在DMEM培养基中。将一部分(1/3)重悬的菌落转移至96孔PCR板中用于基因分型，并且剩余的(2/3)细胞在24孔板的孔中进行培养以用于细胞繁殖和随后的体细胞核转移(SCNT)。将细胞沉淀物重悬在6μL裂解缓冲液(40mM Tris，pH 8.9，0.9％Triton X-100，0.4mg/ml蛋白酶K；新英格兰生物实验室)中，在65℃下孵育30分钟以进行细胞裂解，然后在85℃下孵育10分钟以使蛋白酶K失活。然后将细胞裂解物用于经由PCR进行基因分型。
体细胞核转移(SCNT)
为了生产SCNT胚胎，从德索托生物科学有限责任公司(Desoto Biosciences LLC)(西摩，NT)购买了母猪来源的卵母细胞。将母猪来源的卵母细胞在成熟培养基(TCM199，具有2.9mM HEPES、5μg/ml胰岛素、10ng/mL EGF、0.5μg/mL p-FSH、0.91mM丙酮酸、0.5mM半胱氨酸、10％猪类卵泡液和25ng/mL庆大霉素)中运输过夜，并在24小时后转移至新鲜培养基中。成熟40-42小时后，通过在0.1％透明质酸酶存在下涡旋，从卵母细胞中移除卵丘细胞。在SCNT期间，将卵母细胞置于补充有7.0μg/mL细胞松弛素B的操纵培养基(TCM199，具有0.6mM NaHCO3、2.9mM HEPES、30mM NaCl、10ng/mL庆大霉素和3mg/ml BSA；并且渗透性为305)中。移除极体和可能含有中期II板的一部分邻近的细胞质，并且通过使用薄玻璃毛细管将供体细胞置于卵黄周围空间中(Lai and Prather.，2003b)。然后使用BTX电子细胞操纵器(哈佛仪器公司)以1.2kV/cm的两个DC脉冲(1秒间隔)将重建的胚胎在融合培养基(0.3M甘露醇、0.1mM CaCl2、0.1mM MgCl2、0.5mM HEPES)中融合30微秒。融合后，将融合的胚胎在黑暗中用200μM硫柳汞化学活化10分钟，并用8mM二硫苏糖醇化学活化30分钟(Machaty等人，1997)。然后将胚胎在具有0.5μM Scriptaid(西格玛奥德里奇公司，S7817)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂的改良的猪类受精卵培养基PZM3-MU1(Bauer等人，2010；Yoshioka等人，2002)中孵育14-16小时，如前所述(Whitworth等人，2011；Zhao等人，2010；Zhao等人，2009)。
体外受精(IVF)
对于IVF，来自青春期前小母猪的卵巢是从屠宰场(农田食品公司，密苏里州米兰)获得的。使用附接至10ml注射器的18号皮下注射针从中等大小(3-6mm)的卵泡中抽吸未成熟卵母细胞。然后选择具有同源细胞质和完整浆膜的卵母细胞以及周围卵丘细胞进行成熟。将约50个卵丘卵母细胞复合体在含有500μL成熟培养基(TCM-199(英杰公司，纽约州格兰德艾兰)，具有3.05mM葡萄糖、0.91mM丙酮酸钠、0.57mM半胱氨酸、10ng/mL表皮生长因子(EGF)、0.5μg/mL促黄体生成素(LH)、0.5μg/mL卵泡刺激素(FSH)、10ng/ml庆大霉素(应用制药公司，伊利诺伊州绍姆堡镇)和0.1％聚乙烯醇(PVA))的孔中在38.5℃、5％CO2下在加湿空气中置放42-44小时。成熟后，通过在0.1％透明质酸酶存在下涡旋3分钟，从卵母细胞中移除周围的卵丘细胞。将体外成熟的卵母细胞以25-30个卵母细胞为一组，放入50μL IVF培养基液滴(改良的Tris缓冲培养基(mTBM)，含有113.1mM NaCl、3mM KCl、7.5mM CaCl2、11mM葡萄糖、20mM Tris、2mM咖啡因、5mM丙酮酸钠和2mg/mLBSA)中。将一个100μL的野生型精子冷冻沉淀物在补充有0.1％BSA的3mL杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中解冻。将精子在60％珀可中以650×g洗涤20分钟，并且在mTBM中离心分离10分钟。然后将精子沉淀物用IVF培养基重悬至0.5×106个细胞/mL。将五十μL精子悬浮液引入至含有卵母细胞的液滴中。将配子在38.5℃下在5％CO2的气氛中在空气中共孵育5小时。受精后，将胚胎在PZM3-MU1(Bauer等人2010；Yoshioka等人2002)中、在38.5℃下在5％CO2的空气气氛中进行孵育。
CRISPR/Cas9系统的RNA的体外合成
如前所述制备用于合子注射的gRNA(Whitworth等人，2017)。首先通过整合DNA技术以gBlock的形式合成了模板引导DNA。将T7启动子序列添加至引导体的上游用于体外转录(在表22中用下划线标出)。将每个gBlock稀释至最终浓度0.1ng/μl，并且用体外转录(IVT)正向引物(对于每个CRISPR引导体是独特的)和表22中列出的相同反向引物(gRNA反1)进行PCR扩增。PCR条件包括在98℃下初始变性1分钟，然后是98℃(10秒)、68℃(30秒)和72℃(30秒)的35个循环。通过使用QIAGEN PCR纯化试剂盒来纯化每个PCR扩增的gBlock。将纯化的gBlock扩增子然后用作使用MEGASHORTSCRIPT转录试剂盒(Ambion)进行体外转录的模板。在2.0％无RNA琼脂糖凝胶上观察到RNA质量。经由NANODROP分光光度法来确定浓度和260∶280的比率。加帽和多聚腺苷酸化的Cas9 mRNA购自西格玛。将RNA稀释至最终浓度为20ng/μL(gRNA和Cas9两者)，分配至3μL等份试样，并在-80℃下存储至注射。
表22：用于扩增体外转录的模板DNA的引物。
Figure BDA0002848210210001171
将ANPEP CRISPR/Cas9系统合子注射至合子中
Cas9 mRNA购自西格玛奥德里奇(密苏里州圣路易斯)，并与ANPEP gRNA 2和3混合(表20)。选择gRNA2是因为其在胎儿成纤维细胞转染后具有最高的编辑效率。选择gRNA 3作为阴性对照，因为其在胎儿成纤维细胞转染后没有编辑能力。选择这一设计是为了观察两种方法(胎儿成纤维细胞转染和合子注射)之间是否将观察到相似的编辑率。gRNA2和gRNA3(20ng/μl)和Cas9 mRNA(20ng/μl)的混合在受精后14小时使用FEMTOJET显微注射器(埃普多夫(Eppendorf)；德国汉堡)共同注射至受精卵母细胞的细胞质中。在操纵培养基(TCM199，具有0.6mM NaHCO3、2.9mM HEPES、30mM NaCl、10ng/mL庆大霉素和3mg/mL BSA；并且渗透性为305)在尼康倒置显微镜(尼康公司(Nikon Corporation)；日本东京)的加热台上执行显微注射。然后用10ng/mL ps48将注射的合子转移至PZM3-MU1中，直至胚胎转移或允许发育至胚泡阶段进行基因型确认。
基因分型测定
使用基因组DNA通过PCR、琼脂糖凝胶电泳和随后的桑格DNA测序来评估基因型。用下面表23中列出的ANPEP特异性引物，使用标准方案和LA Taq(Takara，加利福尼亚州山景城)执行PCR。PCR条件由96℃下2分钟和95℃下30秒、50℃下40秒、和72℃下1分钟的35个循环、然后72℃下延长2分钟组成。然后在2.0％琼脂糖凝胶上分离965bp扩增子，以确定明显的插入或缺失。扩增子也进行桑格测序，以确定修饰的确切位置。对来自活猪的扩增子进行TOPO克隆和DNA测序，以确定两个等位基因的确切修饰。
表23：用于PCR的ANPEP特异性引物
Figure BDA0002848210210001181
胚胎转移
将为生产ANPEP编辑的猪而产生的胚胎转移至受体小母猪中进行足月分娩。对于SCNT和IVF合子注射的胚胎，将胚胎培养过夜并在发情周期的第1天转移至小母猪的输卵管中(SCNT)，或者培养五天，然后在发情周期的第4、5或6天转移至小母猪的输卵管中(IVF和SCNT)。在10ng/mLps48(5-(4-氯-苯基)-3-苯基-戊-2-烯酸；Stemgent，Inc.，马萨诸塞州坎布里奇市)的存在下，将所有胚胎在PZM3-MU1(Bauer等人.2010)中运输至手术位点。无论发育阶段如何，均将所有胚胎通过手术转移至受体小母猪的输卵管的壶腹-峡部连接处(Lee等人2013)。用SCNT胚胎进行了总共四次胚胎转移(ET)，并且用合子注射的胚胎进行了六次ET。使用转染后分离的原始菌落的供体细胞执行SCNT的前两次胚胎转移。将用于SCNT的后两个ET的供体细胞从前两个ET收集的第35天胎儿中分离。
免疫组织化学分析
使用标准程序执行免疫组织化学分析以检测修饰猪的回肠中ANPEP的存在。收集后，立即将肠组织置于10％缓冲福尔马林中。处理后，将石蜡包埋切片安装在载玻片上。将切片用徕卡(Leica)BOND脱蜡溶液(溶剂系脱蜡溶液)脱蜡，并且使用徕卡BOND表位修复溶液1(用于福尔马林固定的石蜡包埋组织的热诱导表位修复的柠檬酸盐系pH6.0表位修复溶液)将抗原修复在100℃下执行20分钟。将载玻片在室温下用3％过氧化氢孵育5分钟，并使用NexES IHC染色模块(塔纳医疗(Ventana Medical))上的自动化程序进行可视化。针对覆盖人CD13的400至500个氨基酸的肽制备的兔抗CD13(APN)多克隆抗体(Abcam)用于检测APN抗原。将抗体在徕卡BOND一次抗体稀释液(含有Tris-缓冲盐水、表面活性剂、蛋白稳定剂和0.35％PROCLIN 950(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮溶液))中进行1∶3200稀释，并在载玻片上在室温下孵育15分钟。洗涤载玻片，并且用抗兔IgG辣根过氧化物酶(HRP)检测结合的抗体。用3，3’-二氨基联苯胺(DAB)观察HRP活性，并且用苏木精复染载玻片。
结果
用ANPEP CRISPR引导质粒转染
执行总计17次转染，以确定哪种CRISPR引导体将用CRISPR诱导ANPEP编辑高效地编辑ANPEP基因并分离出原代细胞系用于SCNT。每个实验中的转染效率总结在下表24中。当单独转染时，ANPEP引导体2导致最高数量的经编辑菌落。用ANPEP引导体2转染总计四次，并且编辑效率在0-23.3％范围内。如果在DNA电泳后PCR扩增子存在可观察到的大小差异，则认为菌落被编辑。仅所得猪和胎儿被测序以确定编辑的精确位置和大小。ANPEP引导体1是第二个最高效的引导体，在四次转染中编辑率在0-7.1％的范围内。有趣的是，当ANPEP引导体1和2混合并共转染时，三次转染的编辑率为0％。ANPEP引导体3和4未导致编辑(各两次转染)，并且ANPEP引导体5和6导致2.9％和4.2％的编辑，但每个引导体仅执行一次转染。为SCNT选择用ANPEP引导体2转染的菌落E9、F7、D11和用ANPEP引导体1转染的菌落A10。
表24：CRISPR引导体的转染效率
处理 转染 性别 菌落数 平板数 平均菌落/平板 经编辑菌落数 经编辑菌落百分比
ANPEP 1 1 雄性 42 17 2.47 3 7.1
ANPEP 2 2 雄性 31 12 2.58 1 3.2
ANPEP 1+2混合 3 雄性 23 19 1.21 0 0.0
ANPEP 1 4 雌性 27 10 2.70 1 3.7
ANPEP 2 5 雌性 30 10 3.00 7 23.3<sup>a</sup>
ANPEP 1+2混合 6 雌性 14 10 1.40 0 0.0
ANPEP 1 7 雄性 46 10 4.60 0 0.0
ANPEP 2 8 雄性 36 10 3.60 0 0.0
ANPEP 3 9 雄性 40 10 4.00 0 0.0
ANPEP 4 10 雄性 35 10 3.50 0 0.0
ANPEP 1 11 雄性 41 10 4.10 1 2.4<sup>b</sup>
ANPEP 2 12 雄性 21 10 2.10 3 14.3<sup>c</sup>
ANPEP 1+2混合 13 雄性 34 10 3.40 0 0.0
ANPEP 3 14 雌性 28 10 2.80 0 0.0
ANPEP 4 15 雌性 33 10 3.30 0 0.0
ANPEP 5 16 雌性 35 10 3.50 1 2.9
ANPEP 6 17 雌性 24 10 2.40 1 4.2
a用于SCNT的细胞(E9，F7)；b用于SCNT的细胞(A10)；c用于SCNT的细胞(D11)
经ANPEP编辑细胞的体细胞核转移
来自菌落E9、F7、D11和A10的细胞用于SCNT。从每组细胞重建相同数量的胚胎，但是胚胎在ET过程中被混合在一只猪中。用这些原代菌落细胞执行两次胚胎转移，并且两只猪怀孕。怀孕在第35天终止，以收集胎儿。从猪O279中收集了十个胎儿，其中三个在ANPEP基因中含有双等位基因编辑。从猪O307中收集了五个胎儿，其中三个在ANPEP基因中含有双等位基因编辑。对每个胎儿进行基因分型，并且所得基因型列于下表25中。
图29示出代表性琼脂糖凝胶，其示出从ET至受体O279和O307中观察到的四种基因型的PCR的扩增子。泳道1是182bp缺失/无WT，泳道2是9bp缺失/无WT，泳道3是野生型，泳道4是867bp缺失(朝向凝胶底部的明带)/无WT，并且泳道5是野生型。许多胎儿是双等位基因的(即有两个经修饰等位基因)。在每种情况下，他们都具有一个特征等位基因(例如，182bp缺失)和一个非野生型等位基因。没有测序或确定第二非野生型等位基因。野生型核酸和水分别用作阳性和阴性对照。
从每个胎儿产生胎儿成纤维细胞系，并且然后将三个胎儿系用于SCNT，以用于另外两个SCNT和ET。没有一只受体猪从新建立的胎儿细胞系中怀孕(表25)。
表25：来自经ANPEP编辑胚胎的体细胞核转移的胚胎转移数据。
Figure BDA0002848210210001201
*原代细胞系直接源自转染。ANPEP FF系源自从猪O279和O307收集的胎儿。
合子注射
尝试用注射ANPEP gRNA的IVF合子进行六次ET。胚胎转移数据总结在下表26中。前三次ET导致两次怀孕。一只猪没有怀孕。一个受体(猪O345)在第35天被安乐死，并且收集了六个胎儿。六个胎儿中，四个含有表26中总结的ANPEP基因的编辑。图30提供描绘这六个胎儿中存在的等位基因的代表性PCR结果。标记为“水”的泳道为阴性无模板对照。标记为“WT对照”的泳道是含有来自未转染的胎儿成纤维细胞的DNA的野生型阳性对照。泳道1-6提供六个胎儿的PCR结果，发现它们具有以下基因编辑：(1)泳道1：1个碱基对插入/无野生型；(2)泳道2：2个碱基对插入/野生型；(3)泳道3：野生型；(4)泳道4：野生型；(5)泳道5：3个碱基对插入，9个碱基对缺失和267个碱基对缺失(嵌合)；和(6)泳道6：9个碱基对缺失/野生型。当基因型描述包括短语“无WT”或“无野生型”时，这意味着胎儿具有一个无特征且未测序的(但不是野生型)的第二等位基因。命名的经修饰等位基因被测序并在下文描述。
第三只猪产下四只小猪，其中三只被编辑。此窝(“窝4”)的基因型通过使用TOPO克隆和桑格测序来确定，并总结在表27中。图4示出代表性PCR结果，其显示出与野生型(WT)或无模板对照(NTC)相比，来自这四只小猪的每个ANPEP等位基因。图31中的泳道1-4对应于：(1)小猪4-1，具有在等位基因1中的外显子2中的9个碱基对缺失，以及等位基因2中的野生型序列；(2)小猪4-2，具有在等位基因1中的外显子2中的1个碱基对插入，以及在等位基因2中的外显子2中的2个碱基对插入；(3)小猪4-3，具有在两个等位基因中的野生型序列；和(4)小猪4-4，具有在等位基因1中的外显子2中的9个碱基对缺失，以及在等位基因2中的野生型序列。经修饰等位基因被测序，并在下文中描述(表29和30)。来自此窝的一只雌性动物(4-2)用作产生小猪以用于下面实例6中描述的PEDV和TGEV攻击的首建动物。
用卵母细胞执行其余三次ET，该卵母细胞在含有成纤维细胞生长因子2(FGF2)、白血病抑制因子(LIF)和胰岛素样生长因子1(IGF1)(分别为40ng/ml、20ng/ml和20ng/ml)的培养基中成熟。这些生长因子(统称为FLI)被Yuan及其同事证明会提高卵母细胞成熟的质量(Yuan等人，2017)。在这三次FLI胚胎转移中，两个受体没有怀孕，并且一个受体产下了九只小猪。在九只小猪中，七只含有ANPEP中的编辑，并且两只为野生型。此窝(“窝158”)的基因型使用TOPO克隆和桑格测序来确定，并总结在下表28中。图32中示出代表性PCR结果，其绘示与野生型(WT)或无模板对照(NTC)相比，来自这些小猪的每个ANPEP等位基因。来自这一窝的一只雌性动物(158-1)和来自这一窝的一只雄性动物(158-9)被用作首建动物，以形成用于下述实例6中描述的PEDV和TGEV攻击的小猪。
表26：直接注射ANPEP引导RNA的体外受精来源的合子的胚胎转移数据。
Figure BDA0002848210210001211
Figure BDA0002848210210001221
*指示卵母细胞在FLI处理的培养基中培养(Yuan等人，2017)
表27：窝“4”的基因型
猪ID 性别 等位基因1 等位基因2 基因型
4-1 F 外显子2中的9bp缺失 WT ANPEP<sup>+/-9bp</sup>
4-2 F 外显子2中的1bp插入 外显子2中的2bp插入 ANPEP<sup>-/-</sup>
4-3 M WT WT ANPEP<sup>+/+</sup>
4-4 M 外显子2中的9bp缺失 WT ANPEP<sup>+/-9bp</sup>
表28：窝“158”的基因型
Figure BDA0002848210210001222
*158-1对于等位基因1、等位基因2、外显子2中的1bp插入、野生型等位基因和外显子2中的9bp缺失是嵌合的。
#158-2对于等位基因1、等位基因2、外显子2中的1bp缺失、外显子2中的2bp错配和外显子2中的26bp缺失是嵌合的。
插入-缺失(INDEL)的基因分型和表型表征
表25-28中确定的每个经修饰等位基因都是基于从外显子2两侧的基因组DNA扩增的PCR产物的测序来确定的。通过将来自经修饰动物的代表性RNA翻译成氨基酸序列来确定这些等位基因对蛋白翻译和表型的预期效果。下表29和30详细总结了每个等位基因。
选择来自两窝活仔的三只猪(158-1、158-9和4-2)作为用于下文实例6中描述的疾病研究的首建动物。对每个等位基因赋予一个字母名称，A-H，其中等位基因A为野生型。每个经修饰等位基因和野生型ANPEP等位基因与预测表型一起图解示出在图33中。在图33中，黑色矩形表示编码区域，并且灰色区域表示插入。数字指示插入和/或缺失发生的位置。
经ANPEP修饰公猪(158-9)和一只经修饰母畜具有双等位基因无效编辑，由B和C等位基因(公猪)或D和E等位基因(母畜)组成。第二个经修饰母畜(158-1)对于野生型(A)、无效(H)、无效(D)和其他经编辑等位基因(F和G)的组合是嵌合的。B等位基因具有包括起始密码子缺失的661个碱基对缺失，并且缺失的序列被8个碱基对插入替换。因此，B等位基因导致蛋白的完全损失。C等位基因是由于8个碱基对缺失，其中缺失的序列被一个和3个碱基对插入替换，导致从氨基酸194开始的错编码和氨基酸223处的提前终止密码子的框移编辑。两个无效等位基因D和E也含有框移编辑，分别是1或2个碱基对插入的结果。具体来说，外显子2中的1和2bp插入导致两个等位基因在氨基酸194处的错编码，以及1个碱基对插入在氨基酸220处和2个碱基对插入在氨基酸225处的提前终止密码子。等位基因H含有一个碱基对缺失，这也导致了氨基酸194处的错编码和氨基酸224处的提前终止密码子。F等位基因和G等位基因分别具有9个和12个碱基对缺失，这没有引起框移编辑；相反，与野生型氨基酸序列(SEQ ID NO：134)相比，这些导致了分别为194-M-E-G和194-M-E-G-N的肽序列的移除。与野生型氨基酸序列(SEQ ID NO：134)相比，等位基因G还具有V198I的单个氨基酸取代。
为了便于参考，下表29描述从SCNT和IVF实验中收集的胎儿中确定的每个编辑(图29和30)。下表30描述在来自窝4(图31)和158(图32)的活猪中发现的每个编辑，包括在首建动物(等位基因A-H)中发现的编辑。在适用的情况下，确定与在非首建动物(或胎儿)中发现的等位基因A-H相同的等位基因。
通过对在修饰猪的回肠中ANPEP(CD13)的表达进行免疫组织化学分析(IHC)，证实了首建动物(等位基因A-H)中每个编辑的表型(图34)。图34示出猪回肠的代表性IHC图像，其具有两个A等位基因(野生型，+/+)，两个无效等位基因(E/B；-/-)，或与等位基因F(9个碱基对/3个氨基酸缺失；B/F；-/d9)或G(12个碱基对/4个氨基酸缺失；B/G或C/G；-/d12)组合的无效等位基因。图34中标记为-/d12的图像表示用B/G或C/G基因型获得的结果。
为了产生图34所示的结果，石蜡包埋的组织切片用1∶32,000稀释的兔抗CD13多克隆抗体(Abcam)染色，该抗体是针对覆盖人CD13的400-500个氨基酸的肽制备的。用辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG检测结合的抗体，并且用3，3’-二氨基联苯胺(DAB)将HRP活性可视化。在来自具有两个野生型等位基因的动物的回肠中观察到对ANPEP的强免疫反应，而在具有两个无效等位基因的动物中没有观察到ANPEP免疫反应。在表型上，具有F或G等位基因的猪显示出对ANPEP的免疫反应性，除了在四个氨基酸缺失编辑中的免疫反应性较弱。
每天观察首建动物(158-1、158-9和4-2)突变的任何表型效应。图35示出猪158-1在性成熟时的照片。这些动物看起来都很健康，并且任何动物均没有被记录不良观察结果。特别是，没有观察到哺乳的显著问题。首建母猪158-1(具有野生型等位基因的嵌合体动物)正常挤奶。首建母猪4-2的第一窝产奶不好，但这对第一胎母猪来说并不罕见。首建母猪4-2在其第二窝时正常产奶。因此，乳腺发生和泌乳看起来是正常的。在提交申请时，猪158-1和158-9为大约2.5岁，并且猪4-2为约3岁，并且没有记录不良观察结果。
还每天监测用于下述实例6中描述的病毒攻击研究的所有动物的突变的任何表型效应。含有经修饰ANPEP等位基因的动物没有表现出任何TGEV感染的体征，并且看起来是健康的。
表29：来自SCNT和IVF实验的胎儿编辑(图29和30)
Figure BDA0002848210210001241
Figure BDA0002848210210001251
a插入是CCCTC(SEQ ID NO：169)
b插入是单一胸腺嘧啶(T)残基。
c插入的序列是AT。
表30：对窝4和窝158的活猪的编辑(图31和32)
Figure BDA0002848210210001252
Figure BDA0002848210210001261
a插入是单一胸腺嘧啶(T)残基。d插入的序列是GGGGCTTA(SEQ ID NO：179)*首建猪
b插入的序列是AT。e插入的序列是TCGT(SEQ ID NO：180)
c插入是单一腺嘌呤(A)残基。#这只猪也具有1bp错配(C-＞T)，其被确定为与CRISPR修饰无关的多态性。
实例6：在编码ANPEP蛋白的基因中具有经修饰染色体序列的猪对TGEV的抗性增加
在本实例中，用猪流行性腹泻病毒(PEDV)或传染性胃肠炎病毒(TGEV)攻击在ANPEP中具有经修饰染色体序列的猪，并进行监测以评估它们对感染的抗性。通过病毒血症滴度和其他标记物测量时，缺乏ANPEP导致对TGEV的抗性增加，但对PEDV的抗性没有增加。
材料和方法
用于PEDV研究的配种猪
对于PEDV研究，通过每天喂养6.8mL含有15mg烯丙孕素的产品MATRIX(英特威公司(Intervet Inc.)，特拉华州米尔斯伯勒市)，连续14天将两只小母猪(4-2和158-1)同步化。小母猪4-2和158-1在停止烯丙孕素后五天内发情，并通过从公猪158-9收集的精子进行人工授精(AI)来配种。小母猪4-2没有怀孕。妊娠117天后，母猪158-1产下8头健康的小猪。一只小猪被母猪压死了。
用于TGEV攻击的配种猪
又对ANPEP编辑F1猪进行配种，以产生ANPEP编辑猪窝，用于TGEV攻击。通过上述相同的方法将同样的两只小母猪(4-2和158-1)同步化，并通过从公猪158-9收集的精子进行人工授精(AI)来配种。两只母猪158-1和4-2都怀孕了。母猪158-1产下四只小猪(窝127)。三只小猪健康，而一只小猪后腿结构不良，并且被安乐死。母猪4-2产下13只小猪(窝20)；11只小猪是健康的。一只小猪将不吃奶而死亡，而另一只小猪后腿结构不良。其他小猪中的两只后来被母猪压死了。
病毒
将PEDV KS13-09在补充有10％胎牛血清(FBS；西格玛公司)、1％Pen-Strep(Gibco)和0.25μg/ml FUNGIZONE(两性霉素B)的MEM中保存的VERO76细胞上繁殖。将细胞在含有2％胰蛋白酶磷酸盐肉汤(西格玛公司)和lμg/ml L-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮(TPCK；西格玛公司)的培养基中感染。对于病毒滴定，将96孔板中的VERO76细胞在37℃和5％CO2下用一式八份的病毒的1∶10系列稀释液感染。3小时后，用新鲜的感染培养基替换细胞培养基。18小时后，将细胞在4℃下用丙酮：甲醇混合物(比率为3∶2)固定30分钟，并与针对PEDV M蛋白(金思特科技公司(Genscript))的兔多克隆抗体的1∶500稀释液反应。用PBS洗涤后，添加了FITC结合的山羊抗兔IgG(杰克逊免疫研究公司)作为二次抗体。使用里德和明希方法(Reed and Muench，1938)计算病毒浓度为TCID50/ml。
将TGEV Purdue株在MEM-FBS培养基10％中保持的猪睾丸(ST)细胞上培养，此与PEDV描述的相同。为了滴定，将病毒在96孔组织培养板(BD法尔孔公司(BD Falcon))中的融汇ST细胞上一式四份进行1∶10系列稀释。在37℃和5％CO2下孵育3天后，检查孔是否存在细胞病变效应(CPE)。使用显示出CPE的最后一个孔作为滴定终点，并且每ml 50％组织培养物感染剂量(TCID50)如(Reed and Muench，1938所述进行计算。
用PEDV/TGEV感染
涉及动物和病毒的实验是根据动物科学社团联合会关于研究和教学中的农用动物的保健和使用指南、美国农业部《动物福利法(Animal Welfare Act)》和《动物福利条例(Animal Welfare Regulations)》来执行，并且得到堪萨斯州立大学和密苏里大学机构动物保健和使用以及机构生物安全委员会的批准。在攻击期间，所有受感染的WT和经ANPEP修饰猪被一起关在大型动物资源中心的一个房间中。因此，所有经ANPEP编辑猪都持续暴露于被感染的野生型同窝动物所散布的病毒中。对于感染，猪接受了从实验性感染猪的PCR阳性肠组织匀浆制备的初始剂量的PEDV(Niederwerder等人，2016)。四天后，用组织培养来源的分离株PEDV KS13-09第二次感染猪，该分离株以含有106TCID50病毒的10ml单剂量口服施用。对于TGEV，猪接受相同量的口服病毒。
从用PEDV攻击的前一天开始，每天收集每只动物的粪便拭子，直至研究结束。将每个拭子放入含有具有1％Pen-Strep和1％FUNGIZONE的1ml MEM的15ml圆锥形试管中。将试管短暂涡旋以混合拭子内容物，等分至1.5ml冷冻瓶中，然后存储在-80℃下。
初始暴露后第3、7和9天收集血清。粪便和血清均用RT-PCR进行检查，以检测PEDV或TGEV核酸。九天后，处死动物，并且在石蜡包埋的肠(回肠)上进行免疫组织化学分析(IHC)以检测PEDV或TGEV抗原。
用于检测病毒核酸的RT-PCR
根据翠丰仪器(KINGFISHER instrument)(赛默科技公司(Thermo Scientific))上的制造商的说明，使用MAGMAXTM-96总RNA分离试剂盒(英杰公司)从粪便和血清样品中提取总RNA。使用具有铂Taq DNA聚合酶和表31中所列引物且总体积为50μl的SUPERSCRIPTIII一步RT-PCR试剂盒来扩增PEDV核酸。PCR如下进行：初始逆转录在58℃下进行30分钟，随后在94℃下变性2分钟；然后是94℃下15秒，48℃下30秒，和68℃下90秒的40个循环。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上被可视化。根据溴化乙锭染色的强度记录结果。
使用实时程序(Vemulapalli R.，2016)扩增TGEV核酸。表31列出包括在TAQMAN快速病毒1步主混合物(赛默飞世尔公司)中的正向和反向引物以及TAQMAN探针(BHQ-1)。RT-PCR包括在50℃下逆转录30分钟，在95℃下逆转录15分钟，然后是在95℃下15秒，在56℃下30秒，和在72℃下15秒的45个循环。在96孔格式的CFX-96实时PCR系统(Bio-Rad)上执行PCR，并且每个样品的结果都报告为Ct值。
表31：用于病毒核酸的RT-PCR的引物
Figure BDA0002848210210001281
Figure BDA0002848210210001291
用于检测组织中的病毒抗原的免疫组织化学分析(IHC)
堪萨斯州立大学和密苏里大学兽医诊断实验室使用与实例5中所述用于检测修饰猪中的ANPEP抗原相似的方法作为常规诊断测试，执行检测感染动物的肠(回肠)中的PEDV和TGEV抗原水平的免疫组织化学分析。使用抗尖峰蛋白单克隆抗体来检测PEDV抗原(Cao等人，2013)。使用抗猫传染性腹膜炎冠状病毒抗体来检测TGEV抗原。
血清中TGEV特异性抗体的检测
使用阻断ELISA和间接免疫荧光抗体(IFA)来检测血清中的TGEV特异性抗体。对于IFA，将96孔板上融汇的ST细胞用200 TCID50/ml的TGEV Purdue感染。在37℃和5％CO2下孵育3天后，用80％丙酮固定细胞。将来自每只猪的血清在具有5％山羊血清的PBS(PBS-GS)中进行系列稀释。感染前从每只猪获得的血清样品用作阴性对照。在37℃下孵育1小时后，洗涤平板并将二次抗体添加至每个孔中。Alexa-Fluor-488 AffiPure山羊抗猪IgG(Cat#114-545-003，杰克逊免疫研究公司)在PBS-GS中以1∶400稀释液进行稀释。将平板在37℃下孵育1小时，用PBS洗涤，并在荧光显微镜下观察。使用来自赛诺瓦公司(Sanova)的试剂盒SVANOVIRTGEV/PRCV执行阻断测定。根据试剂盒说明执行测定，并且结果报告为标记的TGEV特异性抗体结合的抑制百分比。
结果
猪的配种和用PEDV感染
来自用于PEDV攻击的窝的每只后代小猪的基因型分类总结在下表32中。受攻击的小猪包括对于野生型ANPEP等位基因为杂合的三只猪、具有四个氨基酸缺失的两只猪、具有三个氨基酸缺失的一只猪和一只敲除猪。使用来自单独窝的五只野生型猪作为未修饰对照，且不包括在表中。
表32：来自用PEDV攻击的F2小猪的每个等位基因的基因型
Figure BDA0002848210210001292
Figure BDA0002848210210001301
在第三周，将小猪暴露于如上所述的PEDV，并且收集粪便和血清用于用RT-PCR进行表征。图36示出在第0、7和9天，每个感染猪的粪便和血清中PEDV核酸的标准化量，除了那些对于WT等位基因为杂合者。每只猪根据其基因型进行分类：野生型(黑色)、敲除/无效(白色)、3aa缺失(9bp缺失，灰色)和4aa缺失(12bp缺失，条纹)。通过PCR和IHC对所有猪进行PEDV量化的结果描绘在表33中。根据RT-PCR产物的PEDV量化描绘在图36中，作为溴化乙锭染色的测量；从用于强烈染色的(3+)至没有检测到PCR产物的(Neg.)。从感染后七天开始，所有猪的粪便中对PEDV核酸呈强阳性(表33，图36)。来自每组中的至少有一只猪(无效、三个氨基酸缺失、四个氨基酸缺失和WT)在第7天在血清中也呈阳性(表33；图36)。此外，IHC证实所有猪的肠上皮细胞中都有抗原(表33，图37)。图37显示针对PEDV抗原(黑色)而染色的野生型(板图A)、敲除型(板图B)、3aa缺失型(板图C)和4aa缺失型(板图D)猪中的回肠的代表性图像。因此，不存在ANPEP并不会防止PEDV感染。
表33：PEDV PCR和IHC结果的总结＊1
Figure BDA0002848210210001302
用于TGEV感染的猪的配种
用于TGEV攻击的每只后代小猪的基因型分类总结在表34(窝20)和表35(窝127)中。总之，来自窝20的六只小猪和来自窝127的两只小猪用TGEV进行攻击。其中，7只对于ANPEP无效，并且一只具有三个氨基酸缺失。使用来自单独窝的七只野生型猪作为阳性对照。
表34：来自用TGEV攻击的母猪4-2的窝20的小猪的基因型
Figure BDA0002848210210001311
#NC：不受攻击；*ND：不确定
表35：来自用TGEV攻击的母猪158-1的窝127的小猪的基因型
耳标 研究ID<sup>#</sup> 性别 基因型 等位基因1 等位基因2 基因型分类
127-1 NC 公猪 ANPEP<sup>-/-</sup> 1bp插入 8bp缺失，4bp添加 C/D
127-2 140 小母猪 ANPEP<sup>9/-</sup> 9bp缺失 661bp缺失+8bp添加 B/F
127-3 153 小母猪 ANPEP<sup>-/-</sup> 1bp缺失 8bp缺失，4bp添加 C/H
127-4 NC 小母猪 ANPEP<sup>+/-</sup> WT 661bp缺失+8bp添加 A/B
#NC：不受攻击
TGEV攻击的结果
当小猪三周大时，如上所述使用与PEDV攻击相同的途径、剂量和安置条件用TGEVPurdue对它们进行攻击。分别从研究中移除一只野生型(WT)猪和一只敲除(KO)猪，并且在第4天进行安乐死以进行测试。使用商业RT-PCR测定来检测粪便和血清中的病毒的存在，并且使用IHC来检测回肠中的TGEV抗原。图38中提供初始暴露于TGEV后第0、3、6和7天时粪便中的病毒的PCR结果。结果显示为Ct值。黑色圆圈表示WT猪，其从第3天开始对于粪便中TGEV核酸的存在呈阳性。在感染的第一周期间，在具有F等位基因(三个氨基酸缺失，灰色圆圈)的一只猪的粪便中或在七只敲除(KO)猪(白色圆圈)的任何一只中没有检测到病毒核酸(图38)。注意，第6天和第7天仅绘制了6只WT和KO动物，因为在第4天从研究中移除了一只WT和一只KO猪进行免疫组织化学分析(见下文)。13天研究结束时，所有猪的RT-PCR均为阴性(数据未显示)。
图39显示对于来自野生型猪(WT，板图A)、敲除猪(KO，板图B)或具有无效等位基因和含有三个aa缺失的等位基因的猪(KO/-d3；板图C)的TGEV抗原进行染色的回肠的代表性免疫组织化学分析图像。在感染后4天，在粪便中存在最大量病毒核酸的时间段期间，对从研究中移除的一只WT和KO猪执行肠组织上的TGEV抗原染色。WT猪对于回肠中TGEV抗原的存在呈阳性(图39，板图A)，而ANPEP KO猪呈阴性(图39，板图B)。感染后13天，对于TGEV抗原，对来自具有三个氨基酸缺失(F等位基因)的猪的肠组织进行染色。结果显示对于在回肠中病毒抗原的抗体染色呈阳性(图39，板图C)。
使用免疫荧光(IFA)和阻断ELISA测定来测试研究结束时获得的血清中是否存在TGEV特异性抗体。免疫荧光测定(IFA)和阻断ELISA测定均显示出WT和F等位基因猪对TGEV特异性抗体的存在呈阳性；然而，在ANPEP KO猪中没有检测到TGEV特异性抗体(图40)。在图40中，水平线显示出阳性/阴性结果的截止值。加号和减号显示出使用间接IFA进行抗体测量的结果。尽管具有三个氨基酸缺失的猪在粪便中对于TGEV核酸呈阴性，但回肠中对于TGEV抗原的阳性染色和阳性抗体反应证实了这只猪被有效感染。注意，图40中的猪的数量反映在第4天移除用于IHC的WT和KO猪后剩余的猪的数量。
这些数据确立ANPEP的存在是猪感染TGEV所需要的。他们还建议减少ANPEP功能(例如，如在F等位基因的情况中那样)可提供有益的结果，如通过降低粪便中的病毒水平所测量的。
实例7：在选自ANPEP、SIGLEC1和CD163的至少两个基因中产生对于染色体修饰为 杂合的动物
材料和方法
配种
通过用对于CD163基因和SIGLEC1基因中的编辑均为杂合的异型杂交小母猪人工授精而对携带具有ANPEP编辑的一个等位基因(1bp插入，等位基因D，SEQ ID NO：166)和野生型(WT)等位基因的异型杂交小母猪(14-1)进行配种(表36)。CD163基因中的编辑是与参考序列SEQ ID NO：4相比从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失，使得CD163基因包含SEQ ID NO：112。SIGLEC1基因中的编辑是与参考序列SEQ ID NO：122相比，从核苷酸4,279至核苷酸5,525的1,247个碱基对缺失，其中缺失的序列被新霉素基因盒替换，使得SIGLEC1基因包含SEQ ID NO：123。
母猪产下10只健康的小猪，没有木乃伊或死产的胎儿。小猪出生时看起来都很健康。两只小猪被安乐死，因为只有一个等位基因被编辑。其余的小猪继续保持健康，并且截至归档时，已近2个月大。
表36：生产窝144的配种组合
Figure BDA0002848210210001331
基因分型
DNA分离：通过在250μL裂解缓冲液(40mM Tris，pH 8.9，0.9％Triton X-100，0.4mg/mL蛋白酶K，(NEB))中消化一小块切下的尾，并在56℃下孵育12小时进行细胞裂解，然后在85℃下孵育10分钟以使蛋白酶K失活来制备基因组DNA裂解物。直接使用尾裂解物基因组DNA作为PCR的模板。
CD163：使用基因组DNA来通过PCR和琼脂糖凝胶电泳评估基因型。用CDl63特异性正向引物“TTGTTGGAAGGCTCACTGTCCTTG”(SEQ ID NO：68，表3)和反向引物“ACAACTAAGGTGGGGCAAAG”(SEQ ID NO：69，表3)通过使用标准方案和LA Taq(塔卡拉公司(Takara)，加利福尼亚州山景城)执行PCR。PCR条件是95℃下2分钟和94℃下30秒、50℃下30秒及68℃下7分钟的33个循环、然后72℃下最终延伸2分钟。然后在1.25％琼脂糖凝胶上分离6358bp扩增子。电泳后1387bp缺失是可见的且不进行测序。确切的顺序是从首建动物得知的。
ANPEP：使用基因组DNA通过PCR琼脂糖凝胶电泳和随后的桑格DNA测序来评估基因型。用ANPEP特异性正向引物“ACGCTGTTCCTGAATCT”(SEQ ID NO：161，表23)和反向引物“GGGAAAGGGCTGATTGTCTA”(SEQ ID NO：162，表23)通过使用标准方案和LA Taq(塔卡拉公司，加利福尼亚州山景城)执行PCR。PCR条件是96℃下2分钟和95℃下30秒、50℃下40秒及72℃下1分钟的35个循环、然后72℃下延长2分钟。然后在2.0％琼脂糖凝胶上分离965bp扩增子。扩增子在密苏里大学DNA中心通过桑格测序进行PCR纯化和测序。如果存在1bp插入，则该等位基因被归类为ANPEP编辑的。
SIGLEC1：使用基因组DNA来通过PCR和琼脂糖凝胶电泳评估基因型。用以下SIGLEC1特异性正向引物“GCATTCCTAGGCACAGC”(SEQ ID NO：128，表17)和反向引物“CTCCTTGCCATGTCCAG”(SEQ ID NO：129，表17)通过使用标准方案和LATaq(塔卡拉公司，加利福尼亚州山景城)执行PCR。PCR条件是94℃下2分钟和94℃下30秒、50℃下10秒及72℃下2.5分钟的35个循环、然后72℃下最终延伸5分钟。引物位于Neo插入物的两侧。野生型SIGLEC扩增子为2000bp。如果插入Neo，则扩增子是2600bp。来自窝144的SIGLEC1+/-在凝胶上将具有两个扩增子，2000bp和2600bp。
结果
对窝144小猪进行基因分型，得到具有所有三种修饰的1只雌性小猪(144-7)(表37)。两只雄性小猪(144-3，144-4)携带ANPEP和CD163编辑两者，但不携带SIGLEC1编辑。通过PCR对猪进行基因分型，并且结果示于图41中。除野生型外，CD163中的1387bp缺失由更小的扩增子来说明(图41，板图A)。在凝胶电泳后，在ANPEP基因中的1bp插入是不可见的，并且扩增子被测序以确定1bp插入的存在(图41的板图B和D)。SIGLEC1敲除是通过插入新霉素盒(Neo)实现的，并且因此扩增子大小的增加指示敲除(图41的板图C)。
表37：窝144的基因型
小猪 性别 ANPEP等位基因1 ANPEP等位基因2 CD163等位基因1 CDl63等位基因2 SIGLEC1等位基因1 SIGLEC等位基因2
144-1 M 1bp插入 野生型 野生型 野生型 SIGLEC-(Neo) 野生型
144-2 M 野生型 野生型 野生型 野生型 SIGLEC-(Neo) 野生型
144-3 M 1bp插入 野生型 1387bp缺失 野生型 野生型 野生型
144-4 M 1bp插入 野生型 1387bp缺失 野生型 野生型 野生型
144-5 M 1bp插入 野生型 野生型 野生型 SIGLEC-(Neo) 野生型
144-6 M 1bp插入 野生型 野生型 野生型 野生型 野生型
144-7 F 1bp插入 野生型 1387bp缺失 野生型 SIGLEC-(Neo) 野生型
144-8 F 野生型 野生型 1387bp缺失 野生型 野生型 野生型
144-9 F 1bp插入 野生型 野生型 野生型 SIGLEC-(Neo) 野生型
144-10 F 野生型 野生型 1387bp缺失 野生型 野生型 野生型
实例8：产生对于选自ANPEP、SIGLEC1和CD163的两个或更多个基因中的染色体修 饰为纯合的猪，并测试这种猪对TGEV和PRRSV的抗性
一旦它们达到性成熟，如上述实例7中所述产生的猪将用于产生对于染色体修饰(ANPEP和CD163两者，或ANPEP、CD163和SIGLEC1三者)均为纯合的猪。这将通过对含有所有三个修饰的雌性动物(144-7)和两个具有ANPEP和CD163修饰的雄性动物(144-3，144-4)进行配种来进行。这种杂交应得到对于ANPEP(-/-)和CD163(-/-)为纯合但仅对于SIGLEC1(+/-)为杂合的后代。为了产生含有所有三个等位基因(ANPEP、CD163和SIGLEC)的纯合敲除的动物，这些后代(F1代)将与如实例7中产生的额外三重杂合后代回交。作为另一选择，或者结合地，将重复实例7中描述的配种以产生雄性和雌性三重杂合系，它们将被杂交以产生三重纯合后代。因此，纯合三重敲除动物的产生至少需要两代，但可能将需要额外的几代来建立雄性和雌性三重杂合系。
一旦纯合双重(ANPEP-/-/CD163-/-)和三重(ANPEP-/-/CD163-/-/SIGLEC1-/-)敲除动物被制成，将使用上述实例6中描述的方法对它们进行TGEV抗性测试，并且使用上述实例2中描述的方法对它们进行PRRSV抗性测试。期望双重敲除动物和三重敲除动物都将对TGEV和PRRSV两者具有抗性。
鉴于以上所述，将看出本发明的几个目的已经实现，并且获得了其他有利的结果。
由于在不脱离本发明的范围的情况下，可对上述产品和方法进行各种改变，因此意图是上述描述中含有的以及附图中示出的所有内容都应被解释为说明性的，而不是限制性的。
实例9：用TGEV、PRCV和PEDV体外感染ANPEP KO和WT细胞。
通过切除肺并用约100ml冷磷酸盐缓冲盐水执行肺灌洗从ANPEP KO猪(猪20-10，表34)和WT猪收集猪肺泡巨噬细胞(PAM)。在补充有7％胎牛血清(FBS)和抗生素的MEM中培养两周之后，出现了一群成纤维细胞。成纤维细胞样细胞以感染复数(moi)＝l被TGEV、PRCV和PEDV分离株感染。实例6中描述TGEV和PEDV分离株的制备。通过在ST细胞上生长病毒制备了PRCV分离株。孵育24小时后，用80％丙酮固定细胞并干燥。使用FITC标记的冠状病毒抗N蛋白抗体检测病毒感染的细胞。用抗FIPV3-70mAb检测TGEV和PRCV。通过由内部制备的单克隆抗体检测出PEDV。用碘化丙锭对细胞核进行染色。在荧光显微镜下观察细胞。
图42显示被三种不同病毒感染的细胞的代表性荧光图像。ANPEP KO细胞显示出对TGEV和PCRV感染的明显的抗性，但对PEDV感染敏感(图42，板图A)。所有的WT细胞都显示出明显的三种病毒感染(图42，板图B)。因此，ANPEP蛋白的损失可能会使易感群体对PRCV和TGEV赋予抗性。
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序列表
SEO类型说明
SEQ ID NO：1核甘酸CRISPR 10
SEQ ID NO：2核甘酸CRISPR 131
SEQ ID NO：3核甘酸CRISPR 256
SEQ ID NO：4核甘酸CRISPR 282
SEQ ID NO：5核甘酸CRISPR 4800
SEQ ID NO：6核甘酸CRISPR 5620
SEQ ID NO：7核甘酸CRISPR 5626
SEQ ID NO：8核甘酸CRISPR 5350
SEQ ID NO：9核甘酸eGFP1
SEQ ID NO：10核甘酸eGFP2
SEQ ID NO：11核苷酸正向引物9538片段
SEQ ID NO：12核苷酸反向引物9538片段
SEQ ID NO：13核苷酸正向引物8729片段
SEQ ID NO：14核苷酸正向引物8729片段
SEQ ID NO：15核甘酸野生型CD163
SEQ ID NO：16核甘酸图4，板图C WT
SEQ ID NO：17核甘酸图4，板图C#1
SEQ ID NO：18核甘酸图4，板图C#2
SEQ ID NO：19核甘酸图4，板图C#3
SEQ ID NO：20核甘酸图5，板图A WT
SEQ ID NO：21核甘酸图5，板图A#1-1
SEQ ID NO：22核甘酸图5，板图A#l-4
SEQ ID NO：23核甘酸图5，板图A#2-2
SEQ ID NO：24核甘酸图6，板图C CD163 WT
SEQ ID NO：25核甘酸图6，板图C CD163#1
SEQ ID NO：26核甘酸图6，板图C CD163#2
SEQ ID NO：27核甘酸图6，板图C CD163#3
SEQ ID NO：28核甘酸图6，板图C eGFP WT
SEQ ID NO：29核甘酸图6，板图C eGFP#1-l
SEQ ID NO：30核甘酸图6，板图C eGFP#1-2
SEQ ID NO：31核甘酸图6，板图C eGFP#2
SEQ ID NO：32核甘酸图6，板图C eGFP#3
SEQ ID NO：33核甘酸图7，板图C WT
SEQ ID NO：34核甘酸图7，板图C#67-1
SEQ ID NO：35核甘酸图7，板图C#67-2a1
SEQ ID NO：36核甘酸图7，板图C#67-2a2
SEQ ID NO：37核甘酸图7，板图C#67-3
SEQ ID NO：38核甘酸图7，板图C#67-4a1
SEQ ID NO：39核甘酸图7，板图C#67-4a2
SEQ ID NO：40核甘酸图8，板图D WT
SEQ ID NO：41核甘酸图8，板图D#166-1.1
SEQ ID NO：42核甘酸图8，板图D#166-1.2
SEQ ID NO：43核甘酸图8，板图D#166-2
SEQ ID NO：44核甘酸图8，板图D#166-3.1
SEQ ID NO：45核甘酸图8，板图D#166-3.2
SEQ ID NO：46核甘酸图8，板图D#166-4
SEQ ID NO：47核甘酸图16WT CD163部分
SEQ ID NO：48-67核苷酸引物序列(表2)
SEQ ID NO：68-79核苷酸引物序列(表3)
SEQ ID NO：80-85核苷酸引物序列(表4)
SEQ ID NO：86-97核苷酸引物序列(表5)
SEQ ID NO：98核甘酸具有1506bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：99核甘酸具有7bp插入的CD163等位基因
SEQ ID NO：100核甘酸具有1280bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：101核甘酸具有1373bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：102核甘酸具有11bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：103核甘酸具有2bp插入和377bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：104核甘酸具有124bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：105核甘酸具有123bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：106核甘酸具有1bp插入的CDl63等位基因
SEQ ID NO：107核甘酸具有130bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：108核甘酸具有132bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：109核甘酸具有1467bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：110核甘酸具有外显子6中的1930bp缺失、外显子7中的129bp缺失和12bp插入的CD163等位基因
SEQ ID NO：111核甘酸具有28bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：112核甘酸具有1387bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：113核甘酸具有1382bp缺失和11bp插入的CD163等位基因
SEQ ID NO：114核甘酸具有1720bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：115核甘酸插入的序列是SEQ ID NO：99
SEQ ID NO：116核甘酸插入的序列是SEQ ID NO：110
SEQ ID NO：117核甘酸插入的序列是SEQ ID NO：113
SEQ ID NO：118核甘酸结构域交换序列
SEQ ID NO：119核甘酸具有452bp缺失的CD163等位基因
SEQ ID NO：120肽猪类CD163 SRCR 5
SEQ ID NO：121肽人CD163L1 SRCR 8同源物
SEQ ID NO：122核甘酸SIGLEC1部分WT参考序列
SEQ ID NO：123核甘酸具有1,247bp缺失和neo插入的SIGLEC1等位基因
SEQ ID NO：124-129核苷酸引物序列(表17)
SEQ ID NO：130-131核苷酸寡核苷酸序列(表18)
SEQ ID NO：132核甘酸全长ANPEP序列
SEQ ID NO：133肽猪类ANPEP(X1同源物)
SEQ ID NO：134肽猪类ANPEP(X2、X3同源物)
SEQ ID NO：135核甘酸ANPEP部分WT参考序列(图28)
SEQ ID NO：136核甘酸用于ANPEP靶向的CRISPR引导体1
SEQ ID NO：137核甘酸用于ANPEP靶向的CRISPR引导体2
SEQ ID NO：138核甘酸用于ANPEP靶向的CRISPR引导体3
SEQ ID NO：139核甘酸用于ANPEP靶向的CRISPR引导体4
SEQ ID NO：140核甘酸用于ANPEP靶向的CRISPR引导体5
SEQ ID NO：141核甘酸用于ANPEP靶向的CRISPR引导体6
SEQ ID NO：142核甘酸ANPEP引导体1引物(正向)
SEQ ID NO：143核甘酸ANPEP引导体1引物(反向)
SEQ ID NO：144核甘酸ANPEP引导体2引物(正向)
SEQ ID NO：145核甘酸ANPEP引导体2引物(反向)
SEQ ID NO：146核甘酸ANPEP引导体3引物(正向)
SEQ ID NO：147核甘酸ANPEP引导体3引物(反向)
SEQ ID NO：148核甘酸ANPEP引导体4引物(正向)
SEQ ID NO：149核甘酸ANPEP引导体4引物(反向)
SEQ ID NO：150核甘酸ANPEP引导体5引物(正向)
SEQ ID NO：151核甘酸ANPEP引导体5引物(反向)
SEQ ID NO：152核甘酸ANPEP引导体6引物(正向)
SEQ ID NO：153核甘酸ANPEP引导体6引物(反向)
SEQ ID NO：154-160核苷酸用于RNA扩增的引物(表22)
SEQ ID NO：161-162核苷酸引物序列(表23)
SEQ ID NO：163核甘酸具有182bp缺失和5bp插入的ANPEP等位基因
SEQ ID NO：164核甘酸具有9bp缺失的ANPEP等位基因
SEQ ID NO：165核甘酸具有867bp缺失的ANPEP等位基因
SEQ ID NO：166核甘酸具有1bp插入的ANPEP等位基因(等位基因D)
SEQ ID NO：167核甘酸具有2bp插入的ANPEP等位基因(等位基因E)
SEQ ID NO：168核甘酸具有267bp缺失的ANPEP等位基因
SEQ ID NO：169核甘酸插入的序列是SEQ NO：163
SEQ ID NO：170核甘酸具有9bp缺失的ANPEP等位基因(等位基因F)
SEQ ID NO：171核甘酸具有1bp缺失的ANPEP等位基因(等位基因H)
SEQ ID NO：172核甘酸具有12bp缺失的ANPEP等位基因(等位基因G)
SEQ ID NO：173核甘酸具有25bp缺失的ANPEP等位基因
SEQ ID NO：174核甘酸具有8bp缺失的ANPEP等位基因
SEQ ID NO：175核甘酸具有2bp错配的ANPEP等位基因
SEQ ID NO：176核甘酸具有1bp插入的ANPEP等位基因
SEQ ID NO：177核甘酸具有661bp缺失和8bp插入的ANPEP等位基因(等位基因B)
SEQ ID NO：178核甘酸具有8bp缺失和4bp插入的ANPEP等位基因(等位基因C)
SEQ ID NO：179核甘酸插入的序列是SEQ ID NO：177
SEQ ID NO：180核甘酸插入的序列是SEQ ID NO：178
SEQ ID NO：181-185核苷酸引物序列(表31)
SEQ ID NO：186核甘酸内含子共有序列
实施例
为了进一步说明，下面阐述本公开的另外的非限制性实施例。
实施例1是一种家畜动物或其后代或动物细胞，其在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
实施例2是根据实施例1所述的家畜动物、后代或细胞，其中与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物、后代或细胞对病原体感染的易感性相比，在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列会降低动物、后代或细胞对病原体感染的易感性。
实施例3是根据实施例2所述的家畜动物、后代或细胞，其中病原体包含病毒。
实施例4是根据实施例3所述的家畜动物、后代或细胞，其中病毒包含冠状病毒科病毒。
实施例5是根据实施例4所述的家畜动物、后代或细胞，其中病毒包含冠状病毒亚科病毒。
实施例6是根据实施例5所述的家畜动物、后代或细胞，其中病毒包含冠状病毒。
实施例7是根据实施例6所述的家畜动物、后代或细胞，其中冠状病毒包含α冠状病毒属病毒。
实施例8是根据实施例7所述的家畜动物、后代或细胞，其中α冠状病毒属病毒包含传染性胃肠炎病毒(TGEV)或猪呼吸道冠状病毒(PRCV)。
实施例9是根据实施例8所述的家畜动物、后代或细胞，其中TGEV包含TGEV Purdue株。
实施例10是根据实施例1至9中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中家畜动物选自由有蹄类动物、鸟类动物和马类动物组成的群组；或者其中细胞源自选自由有蹄类动物、鸟类动物和马类动物组成的群组中的动物。
实施例11是根据实施例10所述的家畜动物、后代或细胞，其中鸟类动物包含鸡、火鸡、鸭、鹅、珍珠鸡或乳鸽；或者其中马类动物包含马或驴。
实施例12是根据实施例10所述的家畜动物、后代或细胞，其中有蹄类动物包含偶蹄动物。
实施例13是根据实施例11所述的家畜动物、后代或细胞，其中偶蹄动物包含猪类动物、牛类动物、绵羊类动物、山羊类动物、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼或鹿。
实施例14是根据实施例13所述的家畜动物、后代或细胞，其中牛类动物包含肉牛或奶牛。
实施例15是根据实施例13所述的家畜动物、后代或细胞，其中偶蹄动物包含猪类动物。
实施例16是根据实施例15所述的家畜动物、后代或细胞，其中猪类动物包含猪。
实施例17是根据实施例1至16中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物或后代是胚胎、幼体或成体，或者其中细胞包含胚胎细胞、源自幼年动物的细胞或源自成年动物的细胞。
实施例18是根据实施例1至17中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞对于编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列是杂合的。
实施例19是根据实施例1至17中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞对于编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列是纯合的。
实施例20是根据实施例1至19中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的插入、在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的缺失、在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的取代或其任意组合。
实施例21是根据实施例20所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的缺失。
实施例22是根据实施例21所述的家畜动物、后代或细胞，其中缺失包含框内缺失。
实施例23是根据实施例20至22中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的插入。
实施例24是根据实施例20、21和23中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中插入、缺失、取代或其任意组合在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中产生错编码。
实施例25是根据实施例20、21、23和24中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中插入、缺失、取代或错编码在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中产生提前终止密码子。
实施例26是根据实施例20、21和23中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中缺失包含编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的起始密码子的缺失。
实施例27是根据实施例20、21、23和26中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中缺失包含编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的整个编码序列的缺失。
实施例28是根据实施例20至26中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因中的取代。
实施例29是根据实施例1至28中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中与在编码ANPEP蛋白的基因中缺少经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中的ANPEP蛋白生产或活性相比，在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列导致ANPEP蛋白生产或活性降低。
实施例30是根据实施例1至29中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列导致动物、后代或细胞生产基本上无功能性ANPEP蛋白。
实施例31是根据实施例1至30中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞不产生ANPEP蛋白。
实施例32是根据实施例1至31中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在以下者中的修饰：编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2；编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子4；内含子，其与编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2或外显子4相邻；或者其任意组合。
实施例33是根据实施例32所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的修饰、在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的内含子1中的修饰或其组合。
实施例34是根据实施例32或33所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含从编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的内含子1开始并在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2结束的缺失。
实施例35是根据实施例32或33所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的插入或缺失。
实施例36是根据实施例35所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的插入或缺失在起始密码子的下游。
实施例37是根据实施例32、33、36和37中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的缺失。
实施例38是根据实施例37所述的家畜动物、后代或细胞，其中缺失包含外显子2中的框内缺失。
实施例39是根据实施例38所述的家畜动物、后代或细胞，其中外显子2中的框内缺失导致ANPEP蛋白的氨基酸194至196的缺失。
实施例40是根据实施例38所述的家畜动物、后代或细胞，其中外显子2中的框内缺失导致ANPEP蛋白的氨基酸194至197的缺失。
实施例41是根据实施例40所述的家畜动物、后代或细胞，其中框内缺失进一步导致ANPEP蛋白的198位的缬氨酸残基被异亮氨酸残基取代。
实施例42是根据实施例32至41中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在编码ANPEP蛋白的基因的等位基因的外显子2中的插入。
实施例43是根据实施例32至42中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,397至核苷酸1,578的182个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1，397开始的5个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,574至核苷酸1,582的9个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,577至核苷酸1,585的9个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,581至核苷酸1,589的9个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸819至核苷酸1,685的867个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸882至核苷酸1,688的867个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,580与1,581之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,579与1,580之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的2个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,321至核苷酸1,587的267个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,323至核苷酸1,589的267个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581的1个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,582至核苷酸1,593的12个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,561至核苷酸1,585的25个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,560至核苷酸1,584的25个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,575至核苷酸1,582的8个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,574至核苷酸1,581的8个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；
以及其任意组合。
实施例44是根据实施例43的家畜动物、后代或细胞，其中：
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,397至核苷酸1,578的182个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,397开始的5个碱基对插入替换，并且5个碱基对插入包含序列CCCTC(SEQ ID NO：169)；
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入，并且插入包含单个胸腺嘧啶(T)残基；
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,580和1,581之间的1个碱基对插入，并且插入包含单个胸腺嘧啶(T)残基或单个腺嘌呤(A)残基；
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,579和1,580之间的1个碱基对插入，并且插入包含单个腺嘌呤(A)残基；
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入，并且插入包含AT二核苷酸；
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换，并且8个碱基对插入包含序列GGGGCTTA(SEQ ID NO：179)；或
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换，并且4个碱基对插入包含序列TCGT(SEQ ID NO：180)。
实施例45是根据实施例43或44所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的2个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,581至核苷酸1,589的9个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,582至核苷酸1,593的12个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581的1个碱基对缺失；
以及其任意组合。
实施例46是根据实施例45所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸l，580开始的4个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的2个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581的1个碱基对缺失；
以及其任意组合。
实施例47是根据实施例43至46中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞包含：
(a)与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；和
与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入；
(b)与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；和
与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入；
(c)与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸l，580开始的4个碱基对插入替换；和
与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，核苷酸1,581的1个碱基对缺失；
(d)与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；和
与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，核苷酸1,581和1,582之间的2个碱基对插入；或
(e)与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；和
与参考序列SEQ ID NO：135相比，在编码ANPEP蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸1,581至核苷酸1,589的9个碱基对缺失。
实施例48是根据实施例1至31中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸17,235至22,422的区域内的修饰。
实施例49是根据实施例48所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸17,235至22,016的区域内的修饰。
实施例50是根据实施例48或49所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸21,446至21,537的区域内的修饰。
实施例51是根据实施例48至50中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸21,479至21,529的区域内的修饰。
实施例52是根据实施例48至51中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸21,479至21,523的区域内的修饰。
实施例53是根据实施例52所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸21,538至22,422的区域内的修饰。
实施例54是根据实施例48或53所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸22,017至22,422的区域内的修饰。
实施例55是根据实施例48、53和54中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸22,054至22,256的区域内的修饰。
实施例56是根据实施例48和53至55中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含在包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸22,054至22,126的区域内的修饰。
实施例57是根据实施例48至56中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含插入或缺失。
实施例58是根据实施例57所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含缺失。
实施例59是根据实施例58所述的家畜动物、后代或细胞，其中缺失包含框内缺失。
实施例60是根据实施例32至59中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列破坏内含子-外显子剪接区域。
实施例61是根据实施例48至60中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含参考序列SEQ ID NO：132的从核苷酸21,479至核苷酸21,529的51个碱基对缺失。
实施例62是根据实施例48至60中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含参考序列SEQ ID NO：132的从核苷酸21,479至核苷酸21,523的45个碱基对缺失。
实施例63是根据实施例48至60中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含参考序列SEQ ID NO：132的从核苷酸21,509至核苷酸21,511的3个碱基对缺失。
实施例64是根据实施例48至60中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含取代。
实施例65是根据实施例64所述的家畜动物、后代或细胞，其中取代包含用不同的核苷酸取代SEQ ID NO：132的核苷酸21,509至21,511处的ACC密码子中的一个或多个核苷酸，以产生编码不同氨基酸的密码子。
实施例66是根据实施例65所述的家畜动物、后代或细胞，其中一个或多个核苷酸的取代导致SEQ ID NO：134的氨基酸738处的苏氨酸(T)或SEQ ID NO：133的氨基酸792处的苏氨酸(T)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基替换。
实施例67是根据实施例65或66所述的家畜动物、后代或细胞，其中取代导致SEQID NO：134的氨基酸738处的苏氨酸(T)或SEQ ID NO：133的氨基酸792处的苏氨酸(T)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基替换。
实施例68是根据实施例65至67中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中取代导致SEQ ID NO：134的氨基酸738处的苏氨酸(T)或SEQ ID NO：133的氨基酸792处的苏氨酸(T)被缬氨酸(V)或精氨酸(R)残基替换。
实施例69是根据实施例32至68中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列由缺失、插入或取代组成。
实施例70是根据实施例20至69中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞包含在编码ANPEP蛋白的基因中的染色体序列，该染色体序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：135或132具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9％或100％的序列同一性。
实施例71是根据实施例1至70中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中家畜动物、后代或细胞包含染色体序列，该染色体序列包含SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、170、171、172、173、174、176、177或178。
实施例72是根据实施例71所述的家畜动物、后代或细胞，其中家畜动物、后代或细胞包含染色体序列，该染色体序列包含SEQ ID NO：177、178、166、167、170、172或171。
实施例73是根据实施例71所述的家畜动物、后代或细胞，其中家畜动物、后代或细胞包含染色体序列，该染色体序列包含SEQ ID NO：177、178、166、167或171。
实施例74是根据实施例1至73中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中家畜动物、后代或细胞进一步在编码CD163蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
实施例75是根据实施例74所述的家畜动物、后代或细胞，其中与在编码CD163蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物、后代或细胞对病原体感染的易感性相比，在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列会降低动物、后代或细胞对病原体感染的易感性。
实施例76是根据实施例75所述的家畜动物、后代或细胞，其中病原体包含病毒。
实施例77是根据实施例76所述的家畜动物、后代或细胞，其中病毒包含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。
实施例78是根据实施例77所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列降低动物、后代或细胞对1型PRRSV病毒、2型PRRSV或1型和2型PRRSV病毒的易感性。
实施例79是根据实施例78所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列降低动物、后代或细胞对PRRSV分离株的易感性，该分离株选自由NVSL 97-7895、KS06-72109、P129、VR2332、CO90、AZ25、MLV-ResPRRS、KS62-06274、KS483(SD23983)、CO84、SD13-15、Lelystad、03-1059、03-1060、SD01-08、4353PZ和其任意组合组成的群组。
实施例80是根据实施例74至79中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞对于在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列是杂合的。
实施例81是根据实施例74至79中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞对于在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列是纯合的。
实施例82是根据实施例74至81中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的插入、在编码CDl63蛋白的基因的等位基因中的缺失、在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的取代或其任意组合。
实施例83是根据实施例82所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的缺失。
实施例84是根据实施例82或83所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因中的插入。
实施例85是根据实施例82至84中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中插入、缺失、取代或其任意组合在编码CD163蛋白的基因的等位基因中产生错编码。
实施例86是根据实施例82至85中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中插入、缺失、取代或错编码在编码CD163蛋白的基因的等位基因中产生提前终止密码子。
实施例87是根据实施例74至86中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中与在编码CD163蛋白的基因中缺少经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中的CD163蛋白生产或活性相比，在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列导致CD163蛋白生产或活性降低。
实施例88是根据实施例74至87中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列导致动物、后代或细胞生产基本上无功能性CD163蛋白。
实施例89是根据实施例74至80中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞不产生CD163蛋白。
实施例90是根据实施例74至89中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中家畜动物或后代包含猪类动物或其中细胞包含猪类细胞。
实施例91是根据实施例90所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含：编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7；编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子8；内含子，其与编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7或外显子8相邻；或者其任意组合。
实施例92是根据实施例91所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CDl63蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7中的修饰。
实施例93是根据实施例92所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CDl63蛋白的基因的等位基因的外显子7中的修饰包含缺失。
实施例94是根据实施例82至93中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中缺失包含框内缺失。
实施例95是根据实施例92至94中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因的等位基因的外显子7中的修饰包含插入。
实施例96是根据实施例90至95中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入；和与参考序列SEQ ID NO：47相比，在相同等位基因上，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,024至核苷酸3,147的124个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,024至核苷酸3,146的123个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,147与3,148之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,030至核苷酸3,159的130个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,030至核苷酸3,161的132个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸1,525至核苷酸3,030的1506个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,148与核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,724至核苷酸4,096的1373个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的1467个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中与参考序列SEQID NO：47相比，进一步存在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸3,172的28个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸2,440至核苷酸4,160的1720个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,015至核苷酸3,466的452个碱基对缺失；
以及其任意组合。
实施例97是根据实施例96所述的家畜动物、后代或细胞，其中：
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，与参考序列SEQ ID NO：47相比，在相同等位基因上，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失，并且2个碱基对插入包含二核苷酸AG；
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,147和3,148之间的1个碱基对插入，并且1个碱基对插入包含单个腺嘌呤残基；
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入，并且7个碱基对插入包含序列TACTACT(SEQ ID NO：115)；
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中与参考序列SEQ ID NO：47相比，进一步存在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失，并且其中12个碱基对插入包含序列TGTGGAGAATTC(SEQ ID NO：116)；或
修饰包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换，并且11个碱基对插入包含序列AGCCAGCGTGC(SEQ ID NO：117)。
实施例98是根据实施例96所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,148与核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，与参考序列SEQ ID NO：47相比，在相同等位基因上，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失；
以及其任意组合。
实施例99是根据实施例96至98中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞包含：
(a)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失；
(b)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；
(c)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失；
(d)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；
(e)与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，进一步存在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；
(f)与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸488至核苷酸2,417的1930个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸488开始的12个碱基对插入替换，并且其中与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，进一步存在外显子7中从核苷酸3,044至核苷酸3,172的129个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失；
(g)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的1467个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；
(h)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的1467个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失；
(i)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,431至核苷酸3,897的11个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；
(j)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸3,024至核苷酸3,147的124个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,024至核苷酸3,146的123个碱基对缺失；
(k)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸3,030至核苷酸3,159的130个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,030至核苷酸3,161的132个碱基对缺失；
(1)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸2,818至核苷酸4,097的1280个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,724至核苷酸4,096的1373个碱基对缺失；
(m)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，从核苷酸3,145至核苷酸3,172的28个碱基对缺失；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失；
(n)与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中在编码CD163蛋白的基因的一个等位基因中，缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在编码CD163蛋白的基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,440至核苷酸4,160的1720个碱基对缺失；
(o)与参考序列SEQ ID NO：47相比，在CD163基因的一个等位基因中，核苷酸3,148和核苷酸3,149之间的7个碱基对插入；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，与参考序列SEQ ID NO：47相比，在CD163基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；
(p)与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中在CD163基因的一个等位基因中，缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，核苷酸3,149和3,150之间的2个碱基对插入，与参考序列SEQ ID NO：47相比，在CD163基因的另一个等位基因中，从核苷酸2,573至核苷酸2,949的377个碱基对缺失；或
(q)与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,113至核苷酸4,494的1382个碱基对缺失，其中在CD163基因的一个等位基因中，缺失的序列被从核苷酸3,113开始的11个碱基对插入替换；和
与参考序列SEQ ID NO：47相比，在CD163基因的另一个等位基因中，从核苷酸3,137至核苷酸3,147的11个碱基对缺失。
实施例100是根据实施例82至99中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列由缺失插入或取代组成。
实施例10l是根据实施例82至100中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞包含在编码CD163蛋白的基因中的染色体序列，该染色体序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：47具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9％或100％的序列同一性。
实施例102是根据实施例74至101中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞包含染色体序列，该染色体序列包含SEQ ID NO：98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114或119。
实施例103是根据实施例74至102中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中：
在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入；并且
在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失。
实施例104是根据实施例1至103中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中家畜动物、后代或细胞进一步包含在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列。
实施例105是根据实施例104所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞对于在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列是杂合的。
实施例106是根据实施例104所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞对于在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列是纯合的。
实施例107是根据实施例104至106中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的插入、在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的缺失、在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的取代或其任意组合。
实施例108是根据实施例107所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的缺失。
实施例109是根据实施例108所述的家畜动物、后代或细胞，其中缺失包含框内缺失。
实施例110是根据实施例107至109中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的插入。
实施例111是根据实施例107至110中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中的取代。
实施例112是根据实施例107、108、110和111中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中插入、缺失、取代或其任意组合在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中产生错编码。
实施例113是根据实施例107、108和110至112中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中插入、缺失、取代或错编码在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因中产生提前终止密码子。
实施例114是根据实施例104至113中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中与在编码SIGLEC1蛋白的基因中缺少经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中的SIGLEC1蛋白生产或活性相比，在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列导致SIGLEC1蛋白生产或活性降低。
实施例115是根据实施例104至114中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列导致动物、后代或细胞生产基本上无功能性SIGLEC1蛋白。
实施例116是根据实施例104至115中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞不产生SIGLEC1蛋白。
实施例117是根据实施例104至116中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物或后代包含猪类动物或其中细胞包含猪类细胞。
实施例118是根据实施例117所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含以下中的修饰：在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子l；在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子2；在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子3；与在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子1、外显子2或外显子3相邻的内含子；或者其任意组合。
实施例119是根据实施例118所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子1、外显子2和/或外显子3中的缺失。
实施例120是根据实施例118或119所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含在编码SIGLEC1蛋白的基因的等位基因的外显子1的部分、外显子2和3的全部的缺失。
实施例121是根据实施例118至120中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：122相比，从核苷酸4,279至核苷酸5,525的1,247个碱基对缺失。
实施例122是根据实施例119至121中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中缺失的序列被新霉素基因盒替换。
实施例123是根据实施例107至122中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列由缺失插入或取代组成。
实施例124是根据实施例107至123中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞包含在编码SIGLEC1蛋白的基因中的染色体序列，该染色体序列在染色体序列的插入、缺失或取代之外的区域中与SEQ ID NO：122具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9％或100％的序列同一性。
实施例125是根据实施例104至124中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞包含了包含SEQ ID NO：123的染色体序列。
实施例126是根据实施例121至125中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中：
在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581和1,582之间的1个碱基对插入；并且
在编码SIGLEC1蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：122相比，从核苷酸4,279至核苷酸5,525的1,247个碱基对缺失。
实施例127是根据实施例126所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物、后代或细胞进一步包含在编码CD163蛋白的基因中的经修饰染色体序列，在编码CDl63蛋白的基因中的经修饰染色体序列包含与参考序列SEQ ID NO：47相比，从核苷酸3,145至核苷酸4,531的1387个碱基对缺失。
实施例128是根据实施例1至127中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物或后代包含经基因编辑的动物或后代，或者其中细胞包含经基因编辑的细胞。
实施例129是根据实施例128所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物或细胞已经使用归巢核酸内切酶进行了基因编辑。
实施例130是根据实施例129所述的家畜动物、后代或细胞，其中归巢核酸内切酶包含设计的归巢核酸内切酶。
实施例131是根据实施例129或130所述的家畜动物、后代或细胞，其中归巢核酸内切酶包含成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶融合蛋白、大范围核酸酶或其任意组合。
实施例132是根据实施例128至131中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中动物或细胞已经使用CRISPR系统进行了基因编辑。
实施例133是根据实施例1至132中任一项所述的家畜动物。
实施例134是根据实施例1至132中任一项所述的后代。
实施例135是根据实施例1至132中任一项所述的细胞。
实施例136是根据实施例135所述的细胞，其中细胞包含精细胞。
实施例137是根据实施例135所述的细胞，其中细胞包含卵细胞。
实施例138是根据实施例137所述的细胞，其中卵细胞包含受精卵。
实施例139是根据实施例135所述的细胞，其中细胞包含体细胞。
实施例140是根据实施例139所述的细胞，其中体细胞包含成纤维细胞。
实施例141是根据实施例141所述的细胞，其中成纤维细胞包含胎儿成纤维细胞。
实施例142是根据实施例135、139和140中任一项所述的细胞，其中细胞包含胚胎细胞或源自幼年动物的细胞。
实施例143是一种生产对病原体感染的易感性降低的非人动物或非人动物谱系的方法，其中方法包含：
修饰卵母细胞或精细胞，以将在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入卵母细胞和精细胞中的至少一者中，并用精细胞对卵母细胞进行受精，以产生在编码ANPEP蛋白的基因中含有经修饰染色体序列的受精卵；或者
修饰受精卵，以将在编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入受精卵；
将受精卵转移至代孕雌性动物中，其中妊娠和足月分娩生产后代动物；
筛选后代动物对病原体的易感性；和
选择与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物相比，对病原体的易感性降低的后代动物。
实施例144是根据实施例143所述的方法，其中动物包含家畜动物。
实施例145是根据实施例143或144所述的方法，其中修饰卵母细胞、精细胞或受精卵的步骤包含卵母细胞、精细胞或受精卵的基因编辑。
实施例146是根据实施例143至145中任一项所述的方法，其中卵母细胞、精细胞或受精卵对于经修饰染色体序列是杂合的。
实施例147是根据实施例143至145中任一项所述的方法，其中卵母细胞、精细胞或受精卵对于经修饰染色体序列是纯合的。
实施例148是根据实施例143至147中任一项所述的方法，其中受精包含人工授精。
实施例149是一种提高家畜动物对病原体感染的抗性的方法，包含修饰在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的至少一个染色体序列，使得与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物中的ANPEP蛋白生产或活性相比，ANPEP蛋白生产或活性降低。
实施例150是根据实施例149所述的方法，其中修饰在编码ANPEP蛋白的基因中的至少一个染色体序列的步骤包含染色体序列的基因编辑。
实施例151是根据实施例145至148和150中任一项所述的方法，其中基因编辑包含使用归巢核酸内切酶。
实施例152是根据实施例151所述的方法，其中归巢核酸内切酶包含设计的归巢核酸内切酶。
实施例153是根据实施例151或152所述的方法，其中归巢核酸内切酶包含成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶融合蛋白、大范围核酸酶或其组合。
实施例154是根据实施例145至148和150至153中任一项所述的方法，其中基因编辑包含使用CRISPR系统。
实施例155是根据实施例143至154中任一项所述的方法，其中方法产生根据实施例1至153中任一项所述的动物。
实施例156是根据实施例143至155中任一项所述的方法，进一步包含使用动物作为首建动物。
实施例157是一种家畜动物群体，包含根据实施例1至133中任一项所述的两种或更多种家畜动物和/或其后代。
实施例158是一种动物群体，包含通过根据实施例143至156中任一项所述的方法制成的两种或多种动物和/或其后代。
实施例159是根据实施例157或158所述的群体，其中动物群体对病原体感染具有抗性。
实施例160是根据实施例159所述的群体，其中病原体包含病毒。
实施例161是根据实施例160所述的群体，其中病毒包含传染性胃肠炎病毒(TGEV)或猪呼吸道冠状病毒(PRCV)。
实施例162。是一种核酸分子，包含选自由以下各项组成的群组中的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO：135的序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失；
(b)与SEQ ID NO：132的序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失；和
(c)(a)或(b)的cDNA。
实施例163是根据实施例162所述的核酸分子，其中核酸分子是分离的核酸分子。
实施例164是根据实施例162或163所述的核酸分子，其中核酸包含与SEQ ID NO：132或135具有至少80％、至少85％、至少87.5％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.9％同一性的核苷酸序列，其中核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132或135的至少一个取代、插入或缺失。
实施例165是根据实施例162至164中任一项所述的核酸分子，其中与不包含取代、插入或缺失的核酸相比，取代、插入或缺失会减少或消除ANPEP蛋白的生产或活性。
实施例166是根据实施例162至165中任一项所述的核酸分子，其中核酸包含SEQID NO：163、164、165、166、167、168、170、171、172、173、174、176、177或178。
实施例167是根据实施例166所述的核酸分子，其中核酸包含SEQ ID NO：177、178、166、167或171。
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Claims (35)

1.一种家畜动物或其后代或动物细胞，其在编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中包含至少一个经修饰染色体序列。
2.根据权利要求1所述的家畜动物、后代或细胞，其中与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物、后代或细胞对病原体感染的易感性相比，编码所述ANPEP蛋白的所述基因中的所述经修饰染色体序列会降低所述动物、后代或细胞对所述病原体感染的易感性。
3.根据权利要求2所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述病原体包含病毒。
4.根据权利要求3所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述病毒包含α冠状病毒属病毒。
5.根据权利要求4所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述α冠状病毒属病毒包含传染性胃肠炎病毒(TGEV)或猪呼吸道冠状病毒(PRCV)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述家畜动物包含猪类动物或其中所述细胞源自猪类动物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述动物或后代是胚胎、幼体或成体，或者其中所述细胞包含胚胎细胞、源自幼年动物的细胞或源自成年动物的细胞。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述动物、后代或细胞对于编码所述ANPEP蛋白的所述基因中的所述经修饰染色体序列是杂合的。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述动物、后代或细胞对于编码所述ANPEP蛋白的所述基因中的所述经修饰染色体序列是纯合的。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述经修饰染色体序列包含在编码所述ANPEP蛋白的所述基因的等位基因中的插入、在编码所述ANPEP蛋白的所述基因的等位基因中的缺失、在编码所述ANPEP蛋白的所述基因的等位基因中的取代或其任意组合。
11.根据权利要求10所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述插入、所述缺失、所述取代或其任意组合在编码所述ANPEP蛋白的所述基因的所述等位基因中产生错编码。
12.根据权利要求10所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述缺失包含：
编码所述ANPEP蛋白的所述基因的所述等位基因的起始密码子的缺失；或者
编码所述ANPEP蛋白的所述基因的所述等位基因的整个编码序列的缺失。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中与在编码所述ANPEP蛋白的所述基因中缺少所述经修饰染色体序列的动物、后代或细胞中的ANPEP蛋白生产或活性相比，编码所述ANPEP蛋白的所述基因中的所述经修饰染色体序列导致ANPEP蛋白生产或活性降低。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中编码所述ANPEP蛋白的所述基因中的所述经修饰染色体序列导致所述动物、后代或细胞生产基本上无功能性ANPEP蛋白。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述经修饰染色体序列包含在以下者中的修饰：编码所述ANPEP蛋白的所述基因的等位基因的外显子2；编码所述ANPEP蛋白的所述基因的等位基因的外显子4；内含子，所述内含子与编码所述ANPEP蛋白的所述基因的所述等位基因的外显子2或外显子4相邻；或者其任意组合。
16.根据权利要求15所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述经修饰染色体序列包含编码所述ANPEP蛋白的所述基因的所述等位基因的外显子2中的缺失，所述缺失包含外显子2中的框内缺失。
17.根据权利要求16所述的家畜动物、后代或细胞，其中外显子2中的所述框内缺失：
导致所述ANPEP蛋白的氨基酸194至196的缺失；或者
导致所述ANPEP蛋白的氨基酸194至197的缺失，其中所述框内缺失任选地进一步导致所述ANPEP蛋白的位置198处的缬氨酸残基被异亮氨酸残基取代。
18.根据权利要求15所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述经修饰染色体序列包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,397至核苷酸1,578的182个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,397开始的5个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,574至核苷酸1,582的9个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,577至核苷酸1,585的9个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,581至核苷酸1,589的9个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸819至核苷酸1,685的867个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸882至核苷酸1,688的867个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,580与1,581之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,579与1,580之间的1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的2个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,321至核苷酸1,587的267个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,323至核苷酸1,589的267个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581的1个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,582至核苷酸1,593的12个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,561至核苷酸1,585的25个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,560至核苷酸1,584的25个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,575至核苷酸1,582的8个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,574至核苷酸1,581的8个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的8个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的4个碱基对插入替换；
以及其任意组合。
19.根据权利要求18所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述经修饰染色体序列包含选自由以下各项组成的群组中的修饰：
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸940至核苷酸1,600的所述661个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸940开始的所述8个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,580至核苷酸1,587的所述8个碱基对缺失，其中缺失的序列被从核苷酸1,580开始的所述4个碱基对插入替换；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的所述1个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581与1,582之间的所述2个碱基对插入；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,581至核苷酸1,589的所述9个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，从核苷酸1,582至核苷酸1,593的所述12个碱基对缺失；
与参考序列SEQ ID NO：135相比，核苷酸1,581的所述1个碱基对缺失；
以及其任意组合。
20.根据权利要求1至14中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述经修饰染色体序列包含了包含参考序列SEQ ID NO：132的核苷酸17,235至22,422的区域内的修饰。
21.根据权利要求10至20中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述动物、后代或细胞包含编码所述ANPEP蛋白的所述基因中的染色体序列，所述染色体序列在所述染色体序列的所述插入、所述缺失或所述取代之外的区域中与SEQ ID NO：135或132具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.9％或100％的序列同一性。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述家畜动物、后代或细胞包含染色体序列，所述染色体序列包含SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、170、171、172、173、174、176、177或178。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述家畜动物、后代或细胞在编码CD163蛋白的基因中进一步包含至少一个经修饰染色体序列。
24.根据权利要求23所述的家畜动物、后代或细胞，其中与在编码CD163蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物、后代或细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染的易感性相比，编码所述CD163蛋白的所述基因中的所述经修饰染色体序列会降低所述动物、后代或细胞对所述猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的易感性。
25.根据权利要求23或24所述的家畜动物、后代或细胞，其中编码所述CD163蛋白的所述基因中的所述经修饰染色体序列导致所述动物、后代或细胞生产基本上无功能性CD163蛋白。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述家畜动物、后代或细胞在编码SIGLEC1蛋白的基因中进一步包含经修饰染色体序列。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述动物或后代包含经基因编辑的动物或后代，或者其中所述细胞包含经基因编辑的细胞。
28.根据权利要求27所述的家畜动物、后代或细胞，其中所述动物或细胞已经使用归巢核酸内切酶进行了基因编辑，所述归巢核酸内切酶包含成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶融合蛋白、大范围核酸酶或其任意组合。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含精细胞、卵细胞(任选地受精卵)或体细胞(任选成纤维细胞)。
30.一种生产对病原体感染的易感性降低的非人动物或非人动物谱系的方法，其中所述方法包含：
修饰卵母细胞或精细胞，以将编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入所述卵母细胞和所述精细胞中的至少一者中，并用所述精细胞使所述卵母细胞受精，以产生在编码ANPEP蛋白的所述基因中含有所述经修饰染色体序列的受精卵；或者
修饰受精卵，以将编码ANPEP蛋白的基因中的经修饰染色体序列引入所述受精卵；
将所述受精卵转移至代孕雌性动物中，其中妊娠和足月分娩生产后代动物；
筛选所述后代动物对所述病原体的易感性；和
选择与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的动物相比，对所述病原体的易感性降低的后代动物。
31.一种提高家畜动物对病原体感染的抗性的方法，包含修饰编码氨肽酶N(ANPEP)蛋白的基因中的至少一个染色体序列，使得与在编码ANPEP蛋白的基因中不包含经修饰染色体序列的家畜动物中的ANPEP蛋白生产或活性相比，ANPEP蛋白生产或活性降低。
32.一种家畜动物群体，包含根据权利要求1至28中任一项所述的两种或更多种家畜动物和/或其后代。
33.一种核酸分子，包含选自由以下各项组成的群组中的核苷酸序列：
(a)与SEQ ID NO：135的序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：135的至少一个取代、插入或缺失；
(b)与SEQ ID NO：132的序列具有至少80％序列同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132的至少一个取代、插入或缺失；和
(c)(a)或(b)的cDNA。
34.根据权利要求33所述的核酸分子，其中所述核酸包含与SEQ ID NO：132或135具有至少80％、至少85％、至少87.5％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或至少99.9％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列包含相对于SEQ ID NO：132或135的至少一个取代、插入或缺失。
35.根据权利要求33或34中任一项所述的核酸分子，其中所述核酸包含SEQ ID NO：163、164、165、166、167、168、170、171、172、173、174、176、177或178。
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