BR112020021476A2

BR112020021476A2 - Animal de criação, célula, métodos para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos e para aumentar a resistência de um animal de criação à infecção por um patógeno, população de animais de criação e molécula de ácido nucleico

Info

Publication number: BR112020021476A2
Application number: BR112020021476-0A
Authority: BR
Inventors: Randall S. Prather; Kevin D. Wells; Kristin M. Whitworth
Original assignee: The Curators Of The University Of Missouri
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2021-01-19
Also published as: CN112313330A; AU2019257776A1; JP2021521844A; CA3096283A1; PH12020551629A1; KR20210005661A; US20200236914A1; MX2020010926A; WO2019210175A1

Abstract

animal de criação, célula, métodos para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos e para aumentar a resistência de um animal de criação à infecção por um patógeno, população de animais de criação e molécula de ácido nucleico. são fornecidos animais de criação e sua progênie compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase n (anpep). as células animais que contêm essas sequências cromossômicas modificadas também são fornecidas. os animais, progênie e células têm maior resistência a patógenos, incluindo vírus da gastroenterite transmissível (tgev) e coronavírus respiratório suíno (prcv). os animais, progênie e células podem, opcionalmente, compreender ainda pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína cd163 e/ou uma proteína siglec1. métodos para produzir animais não humanos ou linhagens de animais não humanos resistentes a patógenos também são fornecidos.

Description

“ANIMAL DE CRIAÇÃO, CÉLULA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ANIMAL NÃO HUMANO OU UMA LINHAGEM DE ANIMAIS NÃO HUMANOS E PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA DE UM ANIMAL DE CRIAÇÃO À INFECÇÃO POR UM PATÓGENO, POPULAÇÃO DE ANIMAIS DE CRIAÇÃO E MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO” REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS APRESENTADA ELETRONICAMENTE

[001] A cópia oficial da listagem de sequências é apresentada eletronicamente via EFS-Web como uma listagem de sequências formatada em ASCII com um arquivo denominado “(16UMC002-WO) Sequence Listing filed

4.26.19”, criado em 26 de abril de 2019 e possuindo um tamanho de 318,7 kilobytes e é depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento formatado em ASCII é parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere a animais de criação e sua progênie compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP).

A invenção também se refere a células animais compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP. Os animais e as células têm resistência aumentada a patógenos, incluindo vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) e coronavírus respiratório suíno (PRCV). A invenção refere-se ainda a animais de criação, progênie e células animais que compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP) e também compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 e/ou pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1. A invenção também se refere a métodos para produzir animais não humanos ou linhagens de animais não humanos resistentes a patógenos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] As infecções respiratórias e entéricas causadas por coronavírus têm impactos importantes para a saúde humana e animal. A infecção de porcos recém-nascidos imunologicamente virgens com vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) ou vírus da diarreia epidêmica suína (PEDV) pode incorrer em perdas próximas de 100% de mortalidade; o resultado da desidratação causada pela destruição de enterócitos mediada por vírus, resultando em uma diarreia malabsortiva e desidratação (Madson et al., 2016; Saif et al., 2012). O TGEV apareceu pela primeira vez nos Estados Unidos na década de 1940 (Doyle e Hutchings, 1946). O surgimento mais recente do vírus da diarreia epidêmica suína (PEDV), em 2013, foi responsável pela morte de quase sete milhões de porcos nos EUA, uma perda estimada de 10% na produção de suínos (Stevenson et al., 2013). O TGEV também pode causar mortalidade neonatal de 100%. Em porcos mais velhos, a infecção com TGEV ou PEDV resulta em apenas sinais clínicos leves seguidos de recuperação completa.

[004] Junto com os coronavírus humanos, caninos e felinos, PEDV e TGEV pertencem ao gênero Alphacoronavirus na família Coronaviridae (Lin et al., 2015). O coronavírus respiratório suíno (PRCV) também é um Alphacoronavirus e está intimamente relacionado ao TGEV. O PRCV geralmente causa infecção subclínica ou doença respiratória leve, mas casos graves foram descritos e há evidências de que pode piorar a gravidade da doença quando os porcos são duplamente infectados com PRCV e outro vírus, tal como o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) (Killoran et al., 2016; Van Reeth et al., 1996). Além disso, o status positivo para PRCV de um rebanho pode ter implicações econômicas, porque alguns países não importarão animais positivos para PRCV.

[005] Coronavírus são vírus de RNA envelopados de sentido positivo, de fita simples, colocados na ordem, Nidovirales. A marca característica dos nidovírus é a síntese de um conjunto agrupado de mRNAs subgenômicos. A característica estrutural única dos coronavírus é a “coroa” formada pelas proteínas spike que se projetam a partir da superfície do vírion. Embora a proteína spike viral seja a proteína receptora primária para todos os coronavírus, os receptores de superfície celular correspondentes variam (Li, 2015). Delmas et al. foi o primeiro a caracterizar a aminopeptidase N suína (ANPEP, APN ou CD13) como um receptor candidato para TGEV (Delmas et al., 1992). ANPEP suína é uma metalopeptidase de membrana do tipo II responsável pela remoção de aminoácidos N-terminais de substratos protéicos durante a digestão no intestino.

[006] A ANPEP é expressa em uma variedade de tipos de células e tecidos, incluindo células epiteliais tubulares renais e do intestino delgado, granulócitos, macrófagos e em membranas sinápticas. A ANPEP é abundantemente expressa nas células epiteliais do intestino delgado (enterócitos). A ANPEP é altamente expressa durante a vascularização do tecido, tal como na manutenção do endotélio, formação de tumor (Bhagwat et al., 2001; Guzman-Rojas et al., 2012) e mamogênese.

[007] Embora as células epiteliais do intestino delgado pareçam ser o principal sítio de infecção clínica do vírus PED, outros sítios, tais como macrófagos alveolares, também podem ser infectados (Park e Shin, 2014). De fato, dados de sequenciamento profundo de macrófagos alveolares identificaram mensagem para ANPEP (não publicado). Foi proposto que outros sítios de infecção podem servir como reservatórios para infecções persistentes (Park e Shin, 2014).

[008] A ANPEP é uma metaloprotease dependente de zinco ligada à membrana que hidrolisa resíduos N-terminais não substituídos com cadeias laterais neutras. Seu único substrato conhecido no túbulo proximal renal é a angiotensina III; que se cliva à angiotensina IV. Ela também metaboliza encefalinas e endorfinas. Por fim, atua na transdução de sinais, controle e diferenciação do ciclo celular.

[009] Além de seu papel como um receptor para certos coronavírus, a ANPEP também desempenha papéis importantes em muitos processos fisiológicos, incluindo metabolismo de peptídeos, motilidade celular e adesão, sensação de dor, regulação da pressão arterial, angiogênese e metástase tumoral, quimiotaxia de células imunes, motilidade espermática, adesão célula-célula e regulação do humor (Chen et al., 2012).

[010] As ANPEP suína e humana compartilham alta identidade de sequência e propriedades bioquímicas e cinéticas indistinguíveis (Chen et al., 2012). O gene ANPEP está localizado no cromossomo 7 do porco e tem pelo menos três variantes de splice. Dois promotores de ANPEP foram identificados em células mielóides/ fibroblastos e em células epiteliais intestinais (Shapiro et al., 1991). Eles estão separados por cerca de 8 kb e produzem transcritos com várias regiões não codificantes 5’. O promotor epitelial está localizado próximo à região codificadora, enquanto o promotor mielóide é distal (Shapiro et al., 1991).

Existem três variantes de transcrições/ splice publicamente aceitas associadas ao gene ANPEP: X1, X2 e X3. A variante X1 tem 20 éxons e codifica uma proteína de 1017 aminoácidos. As variantes X2 e X3 têm 21 éxons e cada uma codifica uma proteína de 963 aminoácidos. A proteína ANPEP madura tem um segmento hidrofóbico de 24 aminoácidos próximo ao seu N-terminal e serve como um sinal para a inserção na membrana. O grande domínio C-terminal extracelular contém uma região semelhante a um domínio de superfamília de metaloproteinase de ligação de zinco, uma junção rica em Ser/ Thr citosólica e um estabilizador de estado de transição.

[011] Como pode ser apreciado a partir do suprecitado, existe uma necessidade na técnica para o desenvolvimento de estratégias para induzir resistência a TGEV e vírus relacionados, tais como PRCV, em animais.

[012] Outra doença economicamente importante de suínos na América do Norte, Europa e Ásia é a síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRS), que custa aos produtores norte-americanos aproximadamente $600 milhões anualmente (Holtkamp et al., 2013). Síndromes de doenças clínicas causadas por infecção com vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) foram relatadas pela primeira vez nos Estados Unidos em 1987 (Keffaber, 1989) e mais tarde na Europa em 1990 (Wensvoort et al., 1991).

A infecção com PRRSV resulta em doença respiratória, incluindo tosse e febre, falha reprodutiva durante o final da gestação e desempenho de crescimento reduzido. O vírus também participa de uma variedade de interações da síndrome da doença polimicrobiana, enquanto mantém uma infecção subclínica permanente (Rowland et al., 2012). As perdas são o resultado de doenças respiratórias em porcos jovens, baixo desempenho de crescimento, falha reprodutiva e infecção in utero (Keffaber, 1989).

[013] O vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) pertence à família Arterividae juntamente com o vírus que eleva a lactato desidrogenase murino, o vírus da febre hemorrágica símia e o vírus da arterite equina. Estruturalmente, os arterivírus se assemelham aos togavírus, mas semelhantes aos coronavírus, replicam-se por meio de um conjunto agrupado 3’-co-terminal de mRNAs subgenômicos, que possuem um líder comum e uma cauda poli-A. Os arterivírus compartilham propriedades importantes relacionadas à patogênese viral, incluindo um tropismo por macrófagos e a capacidade de causar doença grave e infecção persistente

(Plagemann, 1996). As comparações moleculares entre os vírus norte- americanos e europeus colocam todos os isolados de PRRSV em um dos dois genótipos, Tipo 2 ou Tipo 1, respectivamente. Embora os dois genótipos possuam apenas cerca de 70% de identidade no nível de nucleotídeo (Nelsen et al., 1999), ambos compartilham um tropismo por células CD163-positivas, estabelecem infecções de longo prazo e produzem sinais clínicos semelhantes.

[014] A CD163 é uma proteína de membrana tipo 1 de 130 kDa composta por nove domínios de receptor scavenger rico em cisteína (SRCR) e dois domínios espaçadores juntamente com um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática curta (Fabriek et al., 2005). CD163 porcina contém 17 éxons que codificam para uma sequência sinal de peptídeo seguido por nove domínios de SRCR, dois domínios ligantes (também referidos como domínios de prolina serina treonina (PST), localizados após SRCR 6 e SRCR 9), e um domínio citoplasmático seguido por uma cauda citoplasmática curta. A expressão de superfície de CD163 é restrita a células da linhagem monócito- macrófago. Além de funcionar como um receptor de vírus, a CD163 exibe várias funções importantes relacionadas à manutenção da homeostase normal. Por exemplo, após infecção ou dano ao tecido, a CD163 funciona como uma molécula necrófaga (scavenger), removendo complexos haptoglobina- hemoglobina do sangue (Kristiansen et al., 2001). Os produtos de degradação de heme resultantes regulam a resposta inflamatória associada (Fabriek et al., 2005). A eliminação de HbHp é uma função importante da CD163 e localiza-se no SRCR 3 (Madsen et al., 2004). Os metabólitos liberados por macrófagos após a degradação da HbHp incluem bilirrubina, CO e ferro livre. Uma função importante da CD163 é a prevenção da toxicidade oxidativa que resulta da hemoglobina livre (Kristiansen et al., 2001; Soares et al., 2009).

[015] Outras funções importantes de C163 incluem a adesão de eritroblastos (SRCR2), sendo um receptor TWEAK (indutor de apoptose fraco relacionado a fator de necrose tumoral) (SRCR1-4 e 6-9), sendo um receptor bacteriano (SRCR5), e sendo um receptor do vírus suíno africano (Sanchez- Torres et al. 2003). A CD163 também tem um papel potencial como um modulador imunológico (discutido em Van Gorp et al. 2010).

[016] A CD163 foi descrita pela primeira vez como um receptor para PRRSV por Calvert et al. (2007). A transfecção de linhagens celulares não permissivas com cDNAs de CD163 de uma variedade de espécies, incluindo símios, humanos, caninos e camundongos, pode tornar as células permissivas à infecção por PRRSV (Calvert et al., 2007). Além de CD163, uma segunda proteína receptora, CD169 (também conhecida como sialoadesina ou SIGLEC1), foi identificada como sendo um receptor PRRSV primário envolvido na formação da interação inicial com o heterodímero de matriz GP5 (M), a principal proteína na superfície do vírion (Delputte et al., 2002). Neste modelo, a interação subsequente entre a CD163 e o heterotrímero GP2, 3, 4 em um compartimento endossômico medeia o desencapsulamento e a liberação do genoma viral no citoplasma (Van Breedam et al., 2010, Allende et al., 1999). Estes resultados apoiaram estudos anteriores in vitro que mostram que as linhagens celulares resistentes a PRRSV sem CD169 e CD163 de superfície suportaram a replicação do vírus após a transfecção com um plasmídeo CD163 (Welch et al., 2010).

[017] Outro receptor para PRRSV foi identificado, purificado, sequenciado e denominado SIGLEC1, CD169 ou sialoadesina (Vanderheijden et al., 2003; Wissink et al., 2003). SIGLEC1 é uma proteína transmembrana pertencente a uma família de lectinas semelhantes a imunoglobulinas de ligação ao ácido siálico. Foi descrita pela primeira vez como um receptor de ligação a eritrócitos de ovelha em macrófagos de tecidos hematopoiéticos e linfóides (Delputte et al., 2004). As proteínas SIGLEC contêm um domínio V-set N- terminal contendo o sítio de ligação de ácido siálico, seguido por um número variável de domínios C2-set, um domínio transmembrana e uma cauda citoplasmática. Em contraste com outras proteínas SIGLEC, SIGLEC1 não tem um motivo baseado em tirosina na cauda citoplasmática (Oetke et al., 2006). A SIGLEC1, que é expressa em macrófagos, atua nas interações célula a célula por meio da ligação de ligantes de ácido siálico em eritrócitos, neutrófilos, monócitos, células NK, células B e algumas células T citotóxicas. A interação SIGLEC1-ácido siálico participa de vários aspectos da imunidade adaptativa, como processamento de antígenos e apresentação às células T e ativação de células B e células T CD8 (revisado em Martinez-Pomares et al., 2012 e O'Neill et al., 2013).

[018] Foi sugerido que um domínio N-terminal intacto em SIGLEC1 seja necessário e suficiente para a ligação e internalização de PRRSV por macrófagos cultivados (An et al., 2010; Delputte et al., 2007). A transfecção de células SIGLEC1-negativas, como PK-15, com SIGLEC1 é suficiente para mediar a internalização do vírus. A incubação de células permissivas a PRRSV com anticorpo monoclonal anti-SIGLEC1 (MAb) bloqueia a ligação e internalização de PRRSV (Vanderheijden N et al., 2003). No lado do vírus, a remoção do ácido siálico da superfície do vírion ou pré-incubação do vírus com lectinas específicas do ácido siálico bloqueia a infecção (Delputte et al., 2004; Delputte et al., 2007; Van Breedam et al., 2010).

[019] Muitas características da patogênese do PRRSV (especialmente no nível molecular) e da epizootiologia são mal compreendidas, dificultando, assim, os esforços de controle. Atualmente, os produtores frequentemente vacinam suínos contra PRRSV com cepas vivas atenuadas modificadas ou vacinas de vírus mortos, entretanto, as vacinas atuais geralmente não fornecem proteção satisfatória. Isso se deve tanto à variação da cepa quanto à estimulação inadequada do sistema imunológico. Além das preocupações sobre a eficácia das vacinas PRRSV disponíveis, há fortes evidências de que a vacina viva modificada atualmente em uso pode persistir em porcos individuais e rebanhos suínos e acumular mutações (Mengeling et al.

1999), como foi demonstrado com isolados de campo virulentos após infecção experimental de porcos (Rowland et al., 1999). Além disso, foi demonstrado que o vírus da vacina é eliminado no sêmen de varrões vacinados (Christopher- Hennings et al., 1997). Como alternativa à vacinação, alguns técnicos defendem uma estratégia de “teste e remoção” em rebanhos reprodutores (Dee et al., 1998). O uso bem-sucedido desta estratégia depende da remoção de todos os porcos que estão infectados de forma aguda ou persistente com PRRSV, seguida de controles rígidos para prevenir a reintrodução do vírus. A dificuldade e grande parte das despesas associadas a essa estratégia é que pouco se sabe sobre a patogênese da infecção persistente por PRRSV e, portanto, não existem técnicas confiáveis para identificar porcos infectados de forma persistente.

[020] Assim, também existe uma necessidade na técnica de induzir resistência a PRRSV em animais. Também seria benéfico induzir resistência a PRRSV e TGEV e/ou PRCV no mesmo animal.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[021] Animais de criação e sua progênie são fornecidos. Os animais e a progênie compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP).

[022] Células animais também são fornecidas. As células animais compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[023] Outros animais de criação e sua progênie são fornecidos.

Os animais e a progênie compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP e pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163.

[024] Outras células animais são fornecidas. As células animais compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP e pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163.

[025] Animais de criação adicionais e sua progênie são fornecidos. Os animais e a progênie compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP e pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

[026] Células animais adicionais são fornecidas. As células animais compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP e pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

[027] Outros animais de criação e sua progênie são fornecidos.

Os animais e a progênie compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP, pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 e pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

[028] Outras células animais são fornecidas. As células animais compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP, pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 e pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

[029] É fornecido um método para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos. O animal ou a linhagem tem susceptibilidade reduzida a um patógeno. O método compreende modificar um oócito ou um espermatozóide para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP) em pelo menos um dentre o oócito e o espermatozóide e fertilizar o oócito com o espermatozóide para criar um óvulo fertilizado contendo a sequência cromossômica modificada no gene que codifica uma proteína ANPEP. O método compreende ainda transferir o óvulo fertilizado para uma fêmea portadora, em que a gestação e o parto a termo produzem animais de prole. O método compreende, adicionalmente, fazer triagem dos animais de prole quanto à susceptibilidade ao patógeno e selecionar animais de prole que têm susceptibilidade reduzida ao patógeno em comparação com animais que não compreendem uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[030] Outro método para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos é fornecido. O animal ou a linhagem tem susceptibilidade reduzida a um patógeno. O método compreende modificar um óvulo fertilizado para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP no óvulo fertilizado. O método compreende ainda transferir o óvulo fertilizado para uma fêmea portadora, em que a gestação e o parto a termo produzem animais de prole. O método compreende, adicionalmente, fazer triagem dos animais de prole quanto à susceptibilidade ao patógeno e selecionar animais de prole que têm susceptibilidade reduzida ao patógeno em comparação com animais que não compreendem uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[031] É fornecido um método para aumentar a resistência de um animal de criação à infecção por um patógeno. O método compreende modificar pelo menos uma sequência cromossômica em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP) de modo que a produção ou atividade da proteína ANPEP seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína ANPEP em um animal de criação que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[032] Uma população de animais de criação é fornecida. A população compreende dois ou mais de qualquer um dos animais de criação e/ou sua progênie aqui descritos.

[033] Outra população de animais é fornecida. A população compreende dois ou mais animais produzidos por qualquer um dos métodos descritos neste documento e/ou sua progênie.

[034] Uma molécula de ácido nucleico é fornecida. A molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135; (b) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132; e (c) um cDNA de (a) ou (b).

[035] Outros objetos e características serão em parte evidentes e em parte apontados a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[036] Figura 1. Vetores de direcionamento e CRISPRs usados para modificar a CD163. O painel A representa os éxons 7, 8 e 9 de tipo selvagem do gene CD163 que foi direcionado para modificação usando CRISPRs. O painel B mostra o vetor de direcionamento projetado para substituir o éxon 7 de porco (domínio de porco SRCR5 de CD163) com DNA que codifica SRCR8 humano de CD163L. Este vetor de direcionamento foi usado em transfecções com seleção de drogas por G418. Os iniciadores de PCR para o ensaio de longo alcance, braço esquerdo e braço direito são marcados com setas para 1230, 3752, 8791, 7765 e 7775. O painel C representa um vetor de direcionamento idêntico ao mostrado no painel B, mas em que o cassete Neo foi removido. Este vetor de direcionamento foi usado para direcionar CD163 em células que já eram resistentes à neomicina. Os iniciadores usados em ensaios de pequenas deleções são ilustrados com setas e marcados com GCD163F e GCD163R. O painel D enfatiza os éxons direcionados pelos CRISPRs. A localização dos CRISPRs 10, 131, 256 e 282 é representada pelas setas voltadas para baixo no éxon 7. Os números CRISPR representam o número de pares de bases da junção íntron-éxon do íntron 6 e éxon 7.

[037] Figura 2. Vetor de direcionamento e CRISPRs usados para modificar CD1D. O painel A representa os éxons 3, 4, 5, 6 e 7 de tipo selvagem do gene CD1D que foi direcionado para modificação por CRISPRs. O painel B mostra o vetor de direcionamento projetado para substituir o éxon 3 com marcador selecionável Neo. Este vetor de direcionamento foi usado em combinação com CRISPRs para modificar CD1D. Os iniciadores de PCR para o ensaio de longo alcance, braço esquerdo e braço direito são marcados com setas para 3991, 4363, 7373 e 12806. O painel C representa os éxons direcionados por CRISPRs. Os locais dos CRISPRs 4800, 5350, 5620 e 5626 são representados pelas setas voltadas para baixo no éxon 3. Os iniciadores usados em ensaios de pequenas deleções são ilustrados com setas e marcados com GCD1DF e GCD1DR.

[038] Figura 3. Geração de porcos knockout CD163 e CD1D por CRISPR/Cas9 e SCNT. A) Deleção direcionada de CD163 em células somáticas após a transfecção com CRISPR/Cas9 e DNA doador. Um genótipo de tipo selvagem (WT) resulta em uma banda de 6545 pares de bases (pb). As faixas 1- 6 representam seis colônias diferentes de uma única transfecção com CRISPR 10 com Cas9 e DNA doador contendo Neo. As faixas 1, 4 e 5 mostram uma grande deleção homozigótica de 1500–2000 pb. A faixa 2 representa uma deleção homozigótica menor. As faixas 3 e 6 representam um alelo WT e uma pequena deleção ou modificação bialélica de ambos os alelos. As modificações exatas de cada colônia foram determinadas apenas por sequenciamento para colônias usadas para SCNT. A banda fraca WT em algumas das faixas pode representar contaminação cruzada de fibroblastos fetais de uma colônia WT vizinha. NTC = sem controle de molde. B) Deleção direcionada de CD1D em células somáticas após a transfecção com CRISPR/Cas9 e DNA doador. Um genótipo WT resulta em uma banda de 8729 pb. As faixas 1–4 representam colônias com uma deleção de 500–2000 pb de CD1D. A faixa 4 parece ser uma colônia WT. NTC = sem controle de molde. C) Imagem de porco knockout CD163 produzida por SCNT durante o estudo. Este leitão macho contém uma deleção homozigótica de 1506 pb de CD163. D) Imagem de porcos CD1D produzidos durante o estudo. Esses leitões contêm uma deleção de 1653 pb de CD1D. E) Genótipo de duas ninhadas SCNT contendo a deleção de 1506 pb de CD163. As faixas 1–3 (ninhada 63) e as faixas 1–4 (ninhada 64) representam o genótipo de cada leitão de cada ninhada. Porca indica a fêmea receptora dos embriões de SCNT, e WT representa um controle WT. NTC = sem controle de molde. F) Genótipo de duas ninhadas SCNT contendo a deleção de 1653 pb de CD1D. As faixas 1–7 (ninhada 158) e as faixas 1–4 (ninhada 159) representam o genótipo de cada leitão.

[039] Figura 4. Efeito do sistema CRISPR/Cas9 em embriões suínos. A) Frequência de formação de blastocisto após injeção de diferentes concentrações do sistema CRISPR/Cas9 em zigotos. A toxicidade do sistema CRISPR/Cas9 foi mais baixa a 10 ng/μl. B) O sistema CRISPR/Cas9 pode interromper com sucesso a expressão de eGFP em blastocistos quando introduzido em zigotos. Ampliação original X4. C) Tipos de mutações no eGFP geradas usando o sistema CRISPR/Cas9: genótipo WT (SEQ ID NO: 16), #1 (SEQ ID NO: 17), #2 (SEQ ID NO: 18) e #3 (SEQ ID NO: 19).

[040] Figura 5. Efeito do sistema CRISPR/Cas9 no direcionamento de CD163 em embriões suínos. A) Exemplos de mutações geradas em CD163 pelo sistema CRISPR/Cas9: genótipo WT (SEQ ID NO: 20), #1-1 (SEQ ID NO: 21), #1-4 (SEQ ID NO: 22), e #2-2 (SEQ ID NO: 23). Todos os embriões examinados por sequenciamento de DNA apresentaram mutação na CD163 (18/18). CRISPR 131 está destacado em negrito. B) Leitura de sequenciamento de uma deleção homozigótica causada pelo sistema CRISPR/Cas9. A imagem representa # 1–4 do painel A carregando uma deleção de 2 pb de CD163.

[041] Figura 6. Efeito do sistema CRISPR/Cas9 quando introduzido com dois tipos de CRISPRs. A) Amplificação por PCR de CD163 em blastocistos injetados com CRISPR/Cas9 como zigotos. As faixas 1, 3, 6 e 12 mostram a deleção projetada entre dois CRISPRs diferentes. B) Amplificação por PCR de CD1D em blastocistos injetados com CRISPR/Cas9 como zigotos.

CD1D teve menor frequência de deleção, conforme determinado por eletroforese em gel, quando comparado à CD163 (3/23); as faixas 1, 8 e 15 mostram deleções óbvias em CD1D. C) O sistema CRISPR/Cas9 direcionou com sucesso dois genes quando o sistema foi fornecido com dois CRISPRs direcionando CD163 e eGFP. As modificações de CD163 e eGFP são mostradas: CD163 WT (SEQ ID NO: 24), CD163 #1 (SEQ ID NO: 25), CD163 #2 (SEQ ID NO: 26), CD163 #3 (SEQ ID NO: 27), eGFP WT (SEQ ID NO: 28), eGFP #1-1 (SEQ ID NO: 29), eGFP #1-2 (SEQ ID NO: 30), eGFP #2 (SEQ ID NO: 31), e eGFP #3 (SEQ ID NO: 32).

[042] Figura 7. Porcos knockout CD163 gerados pelo sistema CRISPR/Cas9 injetados em zigotos. A) amplificação por PCR de CD163 dos porcos knockout; um sinal claro de deleção foi detectado nas ninhadas 67-2 e 67-4. B) Imagem de porcos knockout CD163 com um portador. Todos os animais são saudáveis e não apresentam sinais de anormalidades. C) Genótipo de porcos knockout CD163. A sequência do tipo selvagem (WT) é mostrada como SEQ ID NO: 33. Dois animais (das ninhadas 67-1 (SEQ ID NO: 34) e 67-3 (SEQ ID NO: 37)) são portadores de uma deleção ou inserção homozigótica em CD163. Os outros dois animais (das ninhadas 67-2 e 67-4) são portadores de uma modificação bialélica de CD163: #67-2 A1 (SEQ ID NO: 35), #67-2 A2 (SEQ ID NO: 36), #67-4 A1 (SEQ ID NO: 38), e #67-4 a2 (SEQ ID NO: 39). A deleção foi causada pela introdução de dois CRISPRs diferentes com o sistema Cas9.

Nenhum animal da injeção do zigoto para CD163 apresentou um genótipo em mosaico.

[043] Figura 8. Porcos knockout CD1D gerados pelo sistema CRISPR/Cas9 injetado em zigotos. A) amplificação por PCR de CD1D de porcos knockout; 166-1 mostra um genótipo em mosaico para CD1D. 166-2, 166-3 e 166-4 não mostram uma mudança no tamanho do amplicon, mas o sequenciamento do amplicon revelou modificações. WT FF = fibroblastos fetais de tipo selvagem. B) A amplificação por PCR do ensaio de longo alcance mostrou uma deleção clara de um alelo nos leitões 166-1 e 166-2. C) Imagem de porcos knockout CD1D com portador. D) Dados de sequência de porcos knockout de CD1D; WT (SEQ ID NO: 40), #166-1.1 (SEQ ID NO: 41), #166-1.2 (SEQ ID NO: 42), #166-2 (SEQ ID NO: 43), #166-3.1 (SEQ ID NO: 44), #166-3.2 (SEQ ID NO: 45) e #166-4 (SEQ ID NO: 46). O códon de iniciação atg no éxon 3 é mostrado em negrito e também em letras minúsculas.

[044] Figura 9. Sinais clínicos durante a infecção aguda por PRRSV. Resultados da avaliação diária para a presença de sinais respiratórios e febre para CD163 +/+ (n = 6) e CD163 -/- (n = 3).

[045] Figura 10. Histopatologia pulmonar durante infecção aguda por PRRSV. Fotomicrografias representativas de tecidos corados com H e E de porcos knockout e de tipo selvagem. O painel esquerdo mostra edema e infiltração de células mononucleares. O painel direito de um porco knockout mostra a arquitetura pulmonar de um pulmão normal.

[046] Figura 11. Viremia nos vários genótipos. Observe que os dados de leitão CD163 -/- ficam ao longo do eixo X.

[047] Figura 12. Produção de anticorpos em porcos alelos nulos, de tipo selvagem e não caracterizados.

[048] Figura 13. Expressão da superfície celular de CD163 em porcos individuais. As linhas que aparecem em direção à direita nos painéis não caracterizado A, não caracterizado B e CD163 +/+, representam o anticorpo CD163, enquanto as linhas que aparecem em direção aos lados esquerdos desses painéis são os controles sem anticorpo (fundo). Observe que nos animais CD163 -/-, a coloração de CD163 se sobrepõe ao controle de fundo, e que a coloração de CD163 nos alelos não caracterizados está aproximadamente a meio caminho entre o nível de WT e o fundo (observe também que esta é uma escala logarítmica, portanto menos de ~ 10%).

[049] Figura 14. Nível de CD169 em macrófagos alveolares de três porcos representativos e o controle sem anticorpos (anti-CD169 marcado com FITC).

[050] Figura 15. Viremia nos vários genótipos. Observe que os dados do leitão de Δ43 aminoácidos estão ao longo do eixo X.

[051] Figura 16. Sequência genômica de éxons 7-10 de CD163 de tipo selvagem usada como uma sequência de referência (SEQ ID NO: 47). A sequência inclui 3000 pb a montante do éxon 7 até a última base do éxon 10. As regiões sublinhadas mostram as localizações dos éxons 7, 8, 9 e 10, respectivamente.

[052] Figura 17. Diagrama de modificações de CD163 ilustrando várias modificações cromossômicas de CD163, o produto de proteína previsto para cada modificação e a expressão relativa de macrófagos para cada modificação, conforme medido pelo nível de CD163 de superfície em macrófagos alveolares suínos (PAMs). As regiões pretas indicam íntrons e as regiões brancas indicam éxons. A região hachurada indica o mimetizador do éxon 11 de hCD163L1, o homólogo do éxon 7 suíno. A região cinza indica o íntron sintetizado com o construto PGK Neo.

[053] Figura 18. Diagrama da proteína CD163 porcina e sequência do gene. A) Domínios de SRCR da proteína CD163 (ovais) e PST (quadrados) junto com os éxons do gene correspondentes. B) Comparação de SRCR 5 de CD163 porcino (SEQ ID NO: 120) com o homólogo SRCR 8 de CD163L1 humano (SEQ ID NO: 121).

[054] Figura 19. Resultados representativos para a expressão de superfície de CD163 e CD169 em PAMs de porcos de tipo selvagem e CD163- modificados. Os painéis A – E mostram resultados para as modificações de CD163 conforme ilustrado na Figura 17. Os dados agrupados para d7(1467) e d7(1280) são mostrados no painel D.

[055] Figura 20. Níveis de haptoglobina no soro em porcos do tipo selvagem e CD163-modificados.

[056] Figura 21. Permissividade relativa de PAMs de tipo selvagem e HL11m para infecção com isolados de PRRSV Tipo 2.

[057] Figura 22. Infecção de porcos CD163-modificados com isolados de PRRSV Tipo 1 e Tipo 2.

[058] Figura 23. Carga de vírus para porcos WT e CD163- modificados infectados com vírus Tipo 2.

[059] Figura 24. Estratégia de inativação (knockout) de SIGLEC1.

O painel A mostra a organização de SIGLEC1 suína, que contém 21 éxons e abrange aproximadamente 20 kb (número de acesso do GenBank CU467609).

O painel B ilustra o construto de direcionamento usado para recombinação homóloga. As sequências de iniciador para amplificação e clonagem por PCR são marcadas (F) e (R). O fragmento de DNA do “braço superior” está ~ 3,5 kpb a montante do éxon 1 e inclui parte do éxon 1 (após o códon de iniciação). O domínio de ligação siálico está localizado no éxon 2. O fragmento de DNA do “braço inferior” inclui os éxons 4, 5, 6 e parte do éxon 7. A maior parte do éxon 1 e todos os éxons 2 e 3 foram substituídos com um cassete de neomicina (neo) sob o controle de um promotor PGK. Um cassete de timidina quinase (TK) estava disponível imediatamente a jusante do braço inferior, mas não foi usada para seleção. Três códons de terminação in-frame (sss) foram introduzidos no final dos braços superiores e inferiores, incluindo-os nos iniciadores de PCR antisenso e senso usados para amplificar a região. O painel C mostra o gene SIGLEC1 mutado após recombinação homóloga. As setas horizontais mostram a localização dos iniciadores de PCR usados para a triagem (ver Tabela 17 para sequências de iniciadores).

[060] Figura 25. Triagem de PCR de alelos SIGLEC1+/- de tipo selvagem e direcionados em porcos fundadores transgênicos. Iniciadores de PCR, “c” e “d” (ver setas marcadas na Figura 24) foram usados para amplificar o DNA genômico dos oito porcos fundadores, derivados do clone 4-18 macho. O painel A mostra o DNA de células KW2 (as células iniciais usadas para transfecção), o plasmídeo de direcionamento, as células direcionadas 4-18 (observe as duas bandas, ~ 2.400 e ~ 2.900 pb), um fibroblasto não direcionado e branco de água como um controle de PCR negativo. A seta mostra a localização de uma banda fraca de 2.900 pb para o clone 4-18. O painel B mostra os resultados para oito porcos transgênicos F0. Observe a presença de duas bandas (~ 2.400 e 2.900 pb) para cada leitão. Um clone 4-18 de tipo selvagem, 11-1 e o plasmídeo de direcionamento mostram apenas uma única banda. Alguns tamanhos de fragmentos dos marcadores de tamanho molecular são indicados.

[061] Figura 26. Identificação de Southern blot de porcos knockout na ninhada F2 #52. A seta superior aponta para a localização da banda do tipo selvagem (7.892 pb), enquanto a seta inferior identifica a localização prevista da inativação gênica (7.204 pb). Os padrões de tamanho molecular são mostrados (STD). Além dos porcos SIGLEC1 (-/-), exemplos de porcos de tipo selvagem (+/ +) e heterozigotos (+/-) também são representados.

[062] A Figura 27. Expressão de SIGLEC1 (CD169) e CD163 na superfície de células PAM. Células PAM frescas foram coradas para CD169 (mAb 3B11/11) ou CD163 (mAb 2A10/11). As células PAM coradas apenas com IgG de cabra anti-camundongo conjugado com FITC foram incluídas como um controle de fundo.

[063] Figura 28. Sequência genômica dos éxons 2–4 da ANPEP de tipo selvagem usada como sequência de referência (SEQ ID NO: 135). A sequência inclui os últimos 773 pares de bases no íntron 2, éxon 2, íntron 3, éxon 3, íntron 4, éxon 4 e 81 pares de bases do íntron 5. As regiões sublinhadas mostram as localizações dos éxons 2, 3 e 4, respectivamente. Os Guias CRISPR 2 e 3 (Tabela 20) que têm como alvo o éxon 2 estão, cada um, em negrito e sublinhados duas vezes.

[064] Figura 29. Resultados de PCR ilustrativos para fetos derivados de SCNT que detectam alelos ANPEP modificados.

[065] Figura 30. Resultados de PCR ilustrativos para fetos injetados em zigoto que detectam alelos ANPEP modificados.

[066] Figuras 31 e 32. Resultados de PCR ilustrativos para porcos vivos nascidos de injeções de zigoto que detectam alelos ANPEP modificados.

[067] Figura 33. Diagrama esquemático dos alelos ANPEP de tipo selvagem e modificados presentes em animais usados em estudos de desafio de TGEV e PEDV.

[068] Figura 34. Resultados de imunohistoquímica ilustrativos para a coloração ANPEP do íleo de porcos do tipo selvagem (+/ +), porcos com dois alelos ANPEP nulos (-/ -) ou um alelo ANPEP nulo em combinação com um alelo com uma deleção in-frame de 9 pares de bases (deleção de 3 aminoácidos, -/ d9) ou 12 pares de bases (4 aminoácidos, -/ d12).

[069] Figura 35. Fotografia do porco 158-1, possuindo uma sequência cromossômica modificada para ANPEP, na maturidade sexual.

[070] Figura 36. Resultados de PCR ilustrativos que medem os níveis de vírus PEDV no soro e fezes de porcos de tipo selvagem e porcos com inativação ou deleção in-frame em ANPEP, medidos 0, 7 e 9 dias após a exposição a PEDV.

[071] Figura 37. Resultados de imunohistoquímica ilustrativos para a coloração do antígeno PEDV do íleo de porcos de tipo selvagem e porcos com inativação (KO) ou deleção in-frame em ANPEP, 9 dias após a exposição inicial a PEDV.

[072] Figura 38. Resultados de PCR ilustrativos medindo os níveis de vírus TGEV em fezes de porcos de tipo selvagem e porcos com inativação ou deleção in-frame em ANPEP, medidos 0, 3, 6 e 7 dias após a exposição ao TGEV.

[073] Figura 39. Resultados de imunohistoquímica ilustrativos para a coloração do antígeno TGEV do íleo de porcos do tipo selvagem e porcos com inativação (KO) ou deleção in-frame em ANPEP, 9 dias após a exposição inicial ao vírus.

[074] Figura 40. Dados de ensaio ELISA ilustrativos mostrando a presença ou ausência de anticorpo específico para TGEV em porcos de tipo selvagem e porcos com inativação (KO) ou deleção in-frame em ANPEP.

[075] Figura 41. Resultados de PCR ilustrativos mostrando alelos CD163 modificados (Painel A), alelos ANPEP (Painel B) e alelos SIGLEC1 (Painel C) em uma ninhada de animais gerados pelo cruzamento de porcos com sequências cromossômicas modificadas para ANPEP, CD163 e/ou SIGLEC1. As modificações da ANPEP foram confirmadas a partir do Painel B por sequenciamento de Sanger (Painel D).

[076] Figura 42. Imagens ilustrativas de microscopia fluorescente de células alveolares de pulmão de suíno obtidas de ANPEP-/- (KO, Painel A) e animais do tipo selvagem (WT, Painel B). As células foram infectadas com TGEV, PRCV e PEDV, conforme indicado. Os núcleos foram corados com iodeto de propídio (colunas da esquerda nos painéis A e B). As células infectadas com vírus foram detectadas usando anticorpos anti-proteína N de coronavírus marcados com FITC (colunas do meio nos painéis A e B). As imagens mescladas são mostradas nas colunas da direita nos painéis A e B.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[077] A presente invenção é direcionada a animais de criação e sua progênie compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP).

A invenção também se refere a células animais compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP. Os animais e as células têm resistência aumentada a patógenos, incluindo vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) e coronavírus respiratório suíno (PRCV).

[078] Os animais e as células têm modificações cromossômicas (por exemplo, inserções, deleções ou substituições) que inativam ou, de outro modo, modulam a atividade do gene ANPEP. A ANPEP está envolvida na entrada do TGEV nas células. Assim, os animais ou células com genes ANPEP inativados exibem resistência ao TGEV quando desafiados. Os animais e as células podem ser criados usando qualquer número de protocolos, incluindo aqueles que fazem uso de edição de genes.

[079] Além da pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP), os animais, progênie e animais podem compreender ainda pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 e/ou pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1. Tais animais adequadamente têm resistência aumentada a patógenos adicionais, por exemplo, vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV).

[080] Populações de qualquer um dos animais aqui descritos também são fornecidas.

[081] A presente invenção é ainda direcionada a métodos para a produção de animais não humanos ou linhagens de animais não humanos resistentes a patógenos compreendendo a introdução de uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[082] Os métodos podem compreender a introdução em uma célula animal ou em um oócito ou em um embrião de um agente que se liga especificamente a um sítio alvo cromossômico da célula e causa uma quebra de DNA de fita dupla ou, de outra forma, inativa ou reduz a atividade de um gene ou proteína ANPEP nele usando métodos de edição de genes, tais como o sistema Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)/Cas, Nucleases Efetoras Semelhantes a Ativador de Transcrição (TALENs), Nuclease Dedo de Zinco (ZFN), proteínas de fusão recombinase ou meganucleases.

[083] Também é descrito aqui o uso de um ou mais loci ANPEP particulares em tandem com um polipeptídeo capaz de efetuar a clivagem e/ou integração de sequências de ácido nucleico específicas dentro dos loci ANPEP.

Exemplos do uso de loci ANPEP em tandem com um polipeptídeo ou RNA capaz de efetuar clivagem e/ou integração dos loci ANPEP incluem um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste em proteínas dedo de zinco, meganucleases, domínios TAL, TALENs, recombinases de CRISPR/Cas guiado por RNA, zíperes de leucina e outros conhecidos pelos técnicos no assunto. Exemplos particulares incluem uma proteína quimérica (“fusão”) compreendendo um polipeptídeo de domínio de ligação a DNA sítio-específico e polipeptídeo de domínio de clivagem (por exemplo, uma nuclease), tal como uma proteína ZFN compreendendo um polipeptídeo dedo de zinco e um polipeptídeo de nuclease FokI. São descritos aqui polipeptídeos compreendendo um domínio de ligação a DNA que se liga especificamente a um gene ANPEP. Tal polipeptídeo também pode compreender um domínio de nuclease (clivagem) ou meio-domínio (por exemplo, uma endonuclease teleguiada (homing endonuclease), incluindo uma endonuclease teleguiada com um domínio de ligação a DNA modificado) e/ou um domínio de ligase, de modo que o polipeptídeo pode induzir uma quebra de fita dupla direcionada e/ou facilitar a recombinação de um ácido nucleico de interesse no sítio da quebra. Um domínio de ligação a DNA que tem como alvo um locus ANPEP pode ser um domínio funcional de clivagem de DNA. Os polipeptídeos anteriores podem ser usados para introduzir um ácido nucleico exógeno no genoma de um organismo hospedeiro (por exemplo, uma espécie animal) em um ou mais loci ANPEP. Os domínios de ligação a DNA podem compreender uma proteína dedo de zinco com um ou mais dedos de zinco (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais dedos de zinco), que é projetada (não ocorre naturalmente) para se ligar a qualquer sequência dentro de um gene ANPEP.

Qualquer uma das proteínas dedo de zinco aqui descritas pode se ligar a um sítio alvo dentro da sequência de codificação do gene alvo ou dentro de sequências adjacentes (por exemplo, promotor ou outros elementos de expressão). A proteína dedo de zinco pode se ligar a um sítio alvo em um gene ANPEP.

DEFINIÇÕES

[084] Ao introduzir elementos da presente invenção ou a(s) forma(s) de realização preferida(s) da mesma, os artigos “um”, “uma”, “o”, “a” e “dito”, “dita” pretendem significar que há um ou mais dos elementos.

[085] O termo “e/ou” significa qualquer um dos itens, qualquer combinação dos itens ou todos os itens aos quais este termo está associado.

[086] Uma “proteína de ligação” é uma proteína que é capaz de se ligar a outra molécula. Uma proteína de ligação pode se ligar a, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação a DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação a RNA) e/ou uma molécula de proteína (uma proteína de ligação a proteína). No caso de uma proteína de ligação a proteína, ela pode se ligar a si mesma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode se ligar a uma ou mais moléculas de uma proteína ou proteínas diferentes. Uma proteína de ligação pode ter mais de um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, as proteínas dedo de zinco têm atividade de ligação a DNA, ligação a RNA e ligação a proteína.

[087] Os termos “compreendendo”, “incluindo” e “possuindo” destinam-se a ser inclusivos e significam que pode haver elementos adicionais além dos elementos listados.

[088] O termo “CRISPR” significa “repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas”. Os sistemas CRISPR incluem sistemas CRISPR Tipo I, Tipo II e Tipo III.

[089] O termo “Cas” refere-se a “proteína associada a CRISPR”.

As proteínas Cas incluem, mas não estão limitadas a proteínas membros da família Cas9, proteínas membros da família Cas6 (por exemplo, Csy4 e Cas6) e proteínas membros da família Cas5.

[090] O termo “Cas9” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas9 de tipo selvagem (por exemplo, Cas9 de S. pyogenes). Sequências Cas9 ilustrativas são fornecidas por SEQ ID NOs. 1– 256 e 795–1346 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963. As SEQ ID NOs. 1-256 e 795-1346 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963 são aqui incorporados por referência. “Cas9” pode se referir a um polipeptídeo com no máximo cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas9 de tipo selvagem (por exemplo, de S. pyogenes). “Cas9” pode se referir ao tipo selvagem ou a uma forma modificada da proteína Cas9 que pode compreender uma alteração de aminoácido, tal como uma deleção, inserção, substituição, variante, mutação, fusão, quimera ou qualquer combinação dos mesmos.

[091] O termo “Cas5” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas5 ilustrativo de tipo selvagem (por exemplo, Cas5 de D. vulgaris). As sequências Cas5 ilustrativas são fornecidas na Figura 42 da Publicação da Patente U.S. nº 2016/0046963. A Figura 42 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963 é aqui incorporada por referência. “Cas5” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com no máximo cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas5 de tipo selvagem (por exemplo, um Cas5 de D. vulgaris). “Cas5” pode se referir ao tipo selvagem ou a uma forma modificada da proteína Cas5 que pode compreender uma alteração de aminoácido, tal como uma deleção, inserção, substituição, variante, mutação, fusão, quimera ou qualquer combinação dos mesmos.

[092] O termo “Cas6” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com pelo menos cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas6 ilustrativo de tipo selvagem (por exemplo, um Cas6 de T. thermophilus). Sequências Cas6 ilustrativas são fornecidas na Figura 41 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963. A Figura 41 da Publicação de Patente U.S. nº 2016/0046963 é aqui incorporada por referência. “Cas6” pode se referir, de modo geral, a um polipeptídeo com no máximo cerca de 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência e/ou similaridade de sequência com um polipeptídeo Cas6 de tipo selvagem (por exemplo, de T. thermophilus). “Cas6” pode se referir ao tipo selvagem ou a uma forma modificada da proteína Cas6 que pode compreender uma alteração de aminoácido, tal como uma deleção, inserção, substituição, variante, mutação, fusão, quimera ou qualquer combinação dos mesmos.

[093] Os termos “CRISPR/Cas9” ou “sistema CRISPR/Cas9” referem-se a um sistema de nuclease programável para engenharia genética que inclui uma proteína Cas9, ou seu derivado, e um ou mais RNAs não codificantes que podem fornecer a função de um RNA CRISPR (crRNA) e RNA transativador (tracrRNA) para o Cas9. O crRNA e o tracrRNA podem ser usados individualmente ou podem ser combinados para produzir um “RNA guia” (gRNA). O crRNA ou gRNA fornecem uma sequência que é complementar ao alvo genômico.

[094] “Resistência à doença” é uma característica de um animal, em que o animal evita os sintomas da doença que são o resultado de interações patógeno-animal, tais como interações entre um animal porcino e TGEV, PRCV ou PRRSV. Ou seja, patógenos são impedidos de causar doenças animais e os sintomas de doença associados, ou alternativamente, uma redução da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos ou redução dos sintomas clínicos. Um técnico no assunto apreciará que as composições e métodos revelados neste documento podem ser usados com outras composições e métodos disponíveis na técnica para proteger animais do ataque de patógenos.

[095] Por “codificação” ou “codificado”, em relação a um ácido nucleico especificado, entende-se que compreende a informação para tradução na proteína especificada. Um ácido nucleico que codifica uma proteína pode compreender sequências intervenientes (por exemplo, íntrons) dentro de regiões traduzidas do ácido nucleico, ou pode não ter tais sequências não traduzidas intervenientes (por exemplo, como no cDNA). A informação pela qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons.

Normalmente, a sequência de aminoácidos é codificada pelo ácido nucleico usando o código genético “universal”. Quando o ácido nucleico é preparado ou alterado sinteticamente, pode-se tirar vantagem das preferências de códon conhecidas do hospedeiro pretendido onde o ácido nucleico deve ser expresso.

[096] Conforme usado neste documento, “edição de gene”, “gene editado”, “geneticamente editado” e “efetores de edição de gene” referem-se ao uso de tecnologia teleguiada com nucleases de ocorrência natural ou artificialmente projetadas, também referidas como “tesouras moleculares”, “endonucleases teleguiadas” ou “endonucleases de direcionamento”. As nucleases criam quebras cromossômicas de fita dupla (DSBs) específicas em locais desejados no genoma, que em alguns casos aproveita os mecanismos endógenos da célula para reparar a quebra induzida por processos naturais de recombinação homóloga (HR) e/ou união de extremidades não homólogas (NHEJ). Os efetores de edição de genes incluem Nucleases Dedo de zinco (ZFNs), Nucleases Efetoras Semelhantes a Ativador de Transcrição (TALENs), sistemas de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR) (por exemplo, o sistema CRISPR/Cas9) e meganucleases (por exemplo, meganucleases re-projetadas como endonucleases teleguiadas). Os termos também incluem o uso de procedimentos e técnicas transgênicas, incluindo, por exemplo, quando a alteração é uma deleção ou inserção relativamente pequena (normalmente menos de 20 nt) e/ou não introduz DNA de uma espécie estranha. O termo também abrange animais de prole, tais como aqueles criados por cruzamentos sexuais ou propagação assexuada a partir do animal de gene editado inicial.

[097] Os termos “engenharia genômica”, “engenharia genética”, “projetado geneticamente”, “alterado geneticamente”, “alteração genética”, “modificação do genoma”, “modificação genômica” e “modificado genomicamente” podem referir-se à alteração do genoma por deleção, inserção, mutação ou substituição de sequências de ácido nucleico específicas.

A alteração pode ser específica de gene ou localização. A engenharia genômica pode usar nucleases para cortar um ácido nucleico, gerando assim um sítio para a alteração. A engenharia de ácido nucleico não genômico também é contemplada. Uma proteína contendo um domínio de nuclease pode ligar e clivar um ácido nucleico alvo formando um complexo com um ácido nucleico direcionado ao ácido nucleico. Em um exemplo, a clivagem pode introduzir quebras de fita dupla no ácido nucleico alvo. Um ácido nucleico pode ser reparado, por exemplo, por máquinas endógenas de união de extremidades não homólogas (NHEJ). Em outro exemplo, um pedaço de ácido nucleico pode ser inserido. Modificações de ácidos nucleicos direcionados a ácidos nucleicos e polipeptídeos sítio-direcionados podem introduzir novas funções a serem utilizadas para a engenharia genômica.

[098] Conforme usado aqui, “tecnologia de DNA teleguiada”, “tecnologia teleguiada” e “endonuclease teleguiada” incluem quaisquer mecanismos que permitem que uma molécula especificada seja direcionada para uma sequência de DNA especificada, incluindo proteínas Dedo de Zinco (ZF), meganucleases Efetoras Semelhantes a Ativador de Transcrição (TALEs) e sistemas CRISPR (por exemplo, o sistema CRISPR/Cas9).

[099] Os termos “resistência aumentada” e “susceptibilidade reduzida” aqui significam, mas não estão limitados a uma redução estatisticamente significativa da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos ou sintomas clínicos que estão associados à infecção por patógenos. Por exemplo, “resistência aumentada” ou “susceptibilidade reduzida” pode se referir a uma redução estatisticamente significativa da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos ou sintomas clínicos que estão associados à infecção por TGEV, PRCV ou PRRSV em um animal compreendendo uma sequência cromossômica modificada em uma proteína do gene CD163 em comparação com um animal de controle que possui uma sequência cromossômica não modificada. O termo “redução estatisticamente significativa de sintomas clínicos” significa, mas não está limitado a que a frequência na incidência de pelo menos um sintoma clínico no grupo modificado de indivíduos é de pelo menos 10%, de preferência pelo menos 20%, mais preferencialmente pelo menos 30%, ainda mais preferencialmente pelo menos 50% e ainda mais preferencialmente pelo menos 70% menor do que no grupo de controle não modificado após o desafio com o agente infeccioso.

[0100] Inativação (“knockout”) significa a interrupção da estrutura ou mecanismo regulador de um gene. Inativações podem ser geradas por meio de recombinação homóloga de vetores de direcionamento, vetores de substituição ou vetores hit-and-run ou inserção aleatória de um vetor de armadilha de gene, resultando em perda completa, parcial ou condicional da função do gene.

[0101] O termo “animal de criação” inclui quaisquer animais tradicionalmente criados no setor pecuário, por exemplo, um ungulado (por exemplo, um artiodáctilo), um animal aviário (por exemplo, galinhas, perus, patos, gansos, galinha d’angola ou pombos), um animal equino (por exemplo, cavalos ou burros). Os artiodáctilos incluem, mas não estão limitados a animais porcinos (por exemplo, porcos), animais bovinos (por exemplo, gado de corte ou vaca leiteira), animais ovinos, animais caprinos, búfalos, camelos, lhamas, alpacas e veados. O termo “animal de criação” não inclui ratos, camundongos ou outros roedores.

[0102] Conforme usado neste documento, o termo “mutação” inclui alterações na sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo, tais como, por exemplo, um gene ou sequência de DNA codificante (CDS), em comparação com a sequência de tipo selvagem. O termo inclui, sem limitação, substituições, inserções, deslocamentos (frameshifts), deleções, inversões, translocações, duplicações, mutações de sítio splice-doador, mutações pontuais e semelhantes.

[0103] Aqui, “redução da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos” ou “redução dos sintomas clínicos” significa, mas não está limitado a, reduzir o número de indivíduos infectados em um grupo, reduzir ou eliminar o número de indivíduos exibindo sinais clínicos de infecção, ou reduzir a gravidade de quaisquer sinais clínicos que estão presentes em um ou mais indivíduos, em comparação com a infecção de tipo selvagem. Por exemplo,

esses termos abrangem quaisquer sinais clínicos de infecção, patologia pulmonar, viremia, produção de anticorpos, redução da carga de patógenos, liberação de patógenos, redução na transmissão de patógenos ou redução de qualquer sinal clínico sintomático de TGEV, PRCV ou PRRSV. De preferência, estes sinais clínicos são reduzidos em um ou mais animais da invenção em pelo menos 10% em comparação com indivíduos que não têm uma modificação no gene CD163 e que são infectados. Mais preferencialmente, os sinais clínicos são reduzidos em indivíduos da invenção em pelo menos 20%, preferencialmente em pelo menos 30%, mais preferencialmente em pelo menos 40%, e ainda mais preferencialmente em pelo menos 50%.

[0104] As referências aqui a uma deleção em uma sequência de nucleotídeos do nucleotídeo x ao nucleotídeo y significam que todos os nucleotídeos no intervalo foram deletados, incluindo x e y. Assim, por exemplo, a frase “uma deleção de 182 pares de bases do nucleotídeo 1.397 ao nucleotídeo 1.578, em comparação com a SEQ ID NO: 135” significa que cada um dos nucleotídeos 1.397 a 1.578 foi deletado, incluindo os nucleotídeos

1.397 e 1.578.

[0105] “Resistência” de um animal a uma doença é uma característica de um animal, em que o animal evita os sintomas da doença que são o resultado de interações patógeno-animal, tais como interações entre um animal porcino e TGEV, PRCV ou PRRSV. Ou seja, os patógenos são impedidos de causar doenças em animais e os sintomas de doenças associados ou, alternativamente, uma redução da incidência e/ou gravidade dos sinais clínicos ou redução de sintomas clínicos. Um técnico no assunto apreciará que os métodos aqui revelados podem ser usados com outras composições e métodos disponíveis na técnica para proteger animais do ataque de patógenos.

[0106] Um “domínio de ligação a DNA TALE” ou “TALE” é um polipeptídeo que compreende um ou mais domínios/ unidades de repetição TALE. Os domínios de repetição estão envolvidos na ligação do TALE à sua sequência de DNA alvo cognata. Uma única “unidade de repetição” (também referida como uma “repetição”) tem tipicamente 33-35 aminoácidos de comprimento e exibe pelo menos alguma homologia de sequência com outras sequências de repetição TALE dentro de uma proteína TALE de ocorrência natural. Os domínios de ligação TALE e dedo de zinco e podem ser “projetados” para se ligarem a uma sequência de nucleotídeos predeterminada, por exemplo, por meio de engenharia (alterando um ou mais aminoácidos) da região de hélice de reconhecimento de proteínas TALE ou dedo de zinco de ocorrência natural. Portanto, as proteínas de ligação a DNA projetadas (dedos de zinco ou TALEs) são proteínas que não ocorrem naturalmente. Exemplos não limitativos de métodos para a engenharia de proteínas de ligação a DNA são projeto e seleção. Uma proteína de ligação a DNA projetada é uma proteína que não ocorre na natureza, cujo projeto/ composição resulta principalmente de critérios racionais. Os critérios racionais para o projeto incluem a aplicação de regras de substituição e algoritmos computadorizados para processamento de informações em um banco de dados que armazena informações de projetos de ZFP e/ou TALE existentes e dados de ligação. Ver, por exemplo, Patente U.S. nº 6.140.081; 6.453.242; e 6.534.261; ver também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496 e Publicação U.S. nº 20110301073.

[0107] Uma “proteína de ligação a DNA de dedo de zinco” (ou domínio de ligação) é uma proteína, ou um domínio dentro de uma proteína maior, que se liga ao DNA de uma maneira sequência-específica através de um ou mais dedos de zinco, que são regiões de sequência de aminoácidos dentro do domínio de ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon zinco. O termo proteína de ligação a DNA de dedo de zinco é frequentemente abreviado como proteína dedo de zinco ou ZFP.

[0108] Uma proteína dedo de zinco “selecionada” ou TALE é uma proteína não encontrada na natureza, cuja produção resulta principalmente de um processo empírico, tal como exibição de fago, armadilha de interação ou seleção híbrida. Ver, por exemplo, Patente U.S. nº 5.789.538; Patente U.S. nº

5.925.523; Patente U.S. nº 6.007.988; Patente U.S. nº 6.013.453; Patente U.S.

nº 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970, WO 01/88197, WO 02/099084 e Publicação U.S. nº

20110301073.

[0109] Vários outros termos são definidos a seguir.

ANIMAIS E CÉLULAS COM UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM GENE QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA ANPEP

[0110] São descritos neste documento animais de criação e sua progênie e células animais compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP, por exemplo, uma inserção ou uma deleção (“INDEL”), que confere resistência melhorada ou completa à infecção por um patógeno (por exemplo, vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) ou coronavírus respiratório suíno (PRCV)).

[0111] O gene ANPEP suíno de comprimento completo (SEQ ID NO: 132) tem quase 30.000 pares de bases de comprimento e tem pelo menos três variantes de splice. Dependendo da variante de splice, o gene ANPEP suíno contém 20 ou 21 éxons. No entanto, as três variantes de splice são virtualmente idênticas em todo o éxon 2, a região que foi direcionada para fazer a maioria dos animais geneticamente editados aqui descritos. Para facilidade de referência, é fornecida uma sequência de referência (SEQ ID NO: 135) que inclui a região de codificação do éxon 2, 1000 nucleotídeos precedendo o códon de iniciação e 1000 nucleotídeos após o final do éxon 2. Uma vez que o códon de iniciação ocorre dentro do éxon 2, a sequência de referência SEQ ID NO: 135 contém os últimos 773 pares de bases no íntron 2, éxon 2, íntron 3, éxon 3, íntron 4, éxon 4 e 81 pares de bases do íntron 5. Uma versão anotada da sequência de referência SEQ ID NO: 135 é fornecido na Figura 28. Na Figura 28, as localizações dos éxons 2, 3 e 4 são marcadas com texto sublinhado e o códon de iniciação é mostrado em texto minúsculo em negrito (“atg”).

[0112] Uma sequência de nucleotídeos para ANPEP suíno de tipo selvagem de comprimento completo (SEQ ID NO: 132) também é fornecida, assim como as sequências de aminoácidos para a proteína ANPEP suína de tipo selvagem de comprimento completo codificada pelas variantes de splice X2 e X3 (963 aminoácidos; SEQ ID NO: 134) e a proteína ANPEP suína de tipo selvagem de comprimento completo codificada pela variante de splice X1 (1017 aminoácidos; SEQ ID NO: 133). As variantes de splice X2 e X3 produzem sequências de aminoácidos idênticas.

[0113] A Tabela 1 fornece as localizações dos éxons na SEQ ID NO: 132 para cada uma das três variantes de splice.

TABELA 1: ÉXONS DE ANPEP Variante X1 Variante X2 Variante X3 Número do Nucleotídeos na SEQ Nucleotídeos na SEQ ID Nucleotídeos na SEQ ID Éxon ID NO: 132 NO: 132 NO:132 1 2092–2176 2083..2176 2082..2176 2* 9760..10584 9760..10584 9763..10584 3 11094..11236 11094..11236 11094..11236 4 11364..11503 11364..11503 11364..11503 5 11927..12053 11927..12053 11927..12053 6 12148–12302 12148..12302 12148..12302 7 12532–12645 12532..12645 12532..12645 8 12743–12886 12743..12886 12743..12886 9 13064–13129 13064..13129 13064..13129 10 13253..13318 13253..13318 13253..13318 11 15209..15384 15209..15384 15209..15384 12 15624..15999 15624..15703 15624..15703 13 16102..16157 15866..15999 15866..15999

Variante X1 Variante X2 Variante X3 Número do Nucleotídeos na SEQ Nucleotídeos na SEQ ID Nucleotídeos na SEQ ID Éxon ID NO: 132 NO: 132 NO:132 14 17087..17234 16102..16157 16102..16157 15 21446..21537 17087..17234 17087..17234 16 22017..22127 21446..21537 21446..21537 17 22255..22422 22017..22127 22017..22127 18 23148..23288 22255..22422 22255..22422 19 24061..24142 23148..23288 23148..23288 20 24265..24857 24061..24142 24061..24142 21 Nenhum 24265..24857 24265..24857 * O códon de iniciação ocorre no nucleotídeo 9986 em todas as três variantes.

[0114] São fornecidos animais de criação e sua progênie compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP).

[0115] Células animais compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP também são fornecidas.

[0116] As sequências cromossômicas modificadas podem ser sequências que são alteradas de modo que a função de uma proteína ANPEP no que se refere a infecção por TGEV e/ou PRCV seja prejudicada, reduzida ou eliminada. Assim, os animais e as células aqui descritos podem ser referidos como animais ou células “knockout”.

[0117] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP reduz a susceptibilidade do animal, progênie ou célula à infecção por um patógeno, em comparação com a susceptibilidade de um animal de criação, progênie ou célula que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP à infecção pelo patógeno.

[0118] A modificação, de preferência, elimina substancialmente a susceptibilidade do animal, progênie ou célula ao patógeno. A modificação, mais preferencialmente, elimina completamente a susceptibilidade do animal,

progênie ou célula ao patógeno, de modo que os animais não apresentem quaisquer sinais clínicos de doença após a exposição ao patógeno.

[0119] Por exemplo, quando o animal é um animal porcino e o patógeno é TGEV, os animais porcinos possuindo a modificação não mostram quaisquer sinais clínicos de infecção por TGEV (por exemplo, vômito, diarreia, desidratação, sede excessiva) após a exposição ao TGEV Além disso, em animais porcinos com a modificação, o ácido nucleico do TGEV não pode ser detectado nas fezes ou no soro, o antígeno do TGEV não pode ser detectado no íleo e o soro é negativo para o anticorpo específico para TGEV.

[0120] Da mesma forma, as células possuindo a modificação que são expostas ao patógeno não são infectadas com o patógeno.

[0121] O patógeno pode compreender um vírus. Por exemplo, o patógeno pode compreender um vírus da família Coronaviridae, por exemplo, um vírus da subfamília Coronavirinae.

[0122] O vírus compreende, preferencialmente, um coronavírus (por exemplo, um vírus do gênero Alphacoronavirus).

[0123] Quando o vírus compreende um vírus do gênero Alphacoronavirus, o vírus do gênero Alphacoronavirus compreende, preferencialmente, um vírus da gastroenterite transmissível (TGEV).

[0124] Por exemplo, o vírus da gastroenterite transmissível pode compreender a cepa TGEV Purdue.

[0125] Alternativamente ou além disso, o vírus pode compreender um coronavírus respiratório suíno (PRCV).

[0126] O animal de criação ou progênie pode compreender um ungulado, um animal aviário ou um animal equino. A célula pode ser derivada de um ungulado, um animal aviário ou um animal equino.

[0127] Quando o animal ou progênie é um animal aviário ou qunado a célula é uma célula derivada de um animal aviário, o animal aviário pode compreender uma galinha, um peru, um pato, um ganso, uma galinha d'angola ou um pombo.

[0128] Quando o animal ou progênie é um animal equino ou quando a célula é uma célula derivada de um animal equino, o animal equino pode compreender um cavalo ou um burro.

[0129] Quando o animal ou progênie é um ungulado ou quando a célula é uma célula derivada de um ungulado, o ungulado pode compreender um artiodáctilo. Por exemplo, o artiodáctilo pode compreender um animal porcino (por exemplo, um porco), um animal bovino (por exemplo, gado de corte ou vaca leiteira), um animal ovino, um animal caprino, um búfalo, um camelo, uma lhama, uma alpaca, ou um veado.

[0130] O animal ou progênie compreende preferencialmente um animal porcino. A célula compreende preferencialmente uma célula derivada de um animal porcino.

[0131] O animal ou progênie pode ser um embrião, um jovem ou um adulto.

[0132] Da mesma forma, a célula pode compreender uma célula embrionária, uma célula derivada de um animal jovem ou uma célula derivada de um animal adulto.

[0133] Por exemplo, a célula pode compreender uma célula embrionária.

[0134] A célula pode compreender uma célula derivada de um animal jovem.

[0135] O animal, progênie ou célula pode ser heterozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

[0136] O animal, progênie ou célula pode ser homozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

[0137] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP pode compreender uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[0138] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0139] A deleção pode compreender uma deleção in-frame.

[0140] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0141] A inserção, a deleção, a substituição ou a combinação de qualquer uma das mesmas pode resultar em uma codificação incorreta no alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0142] Quando a inserção, a deleção, a substituição ou a combinação de qualquer uma das mesmas resulta em uma codificação incorreta no alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, a codificação incorreta pode resultar em um códon de terminação prematuro no alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0143] Quando a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção, a deleção pode compreender uma deleção do códon de iniciação do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP. Quando o códon de iniciação é deletado, nenhuma proteína ANPEP é produzida.

[0144] Quando a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção, a deleção pode compreender uma deleção de toda a sequência de codificação do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0145] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0146] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP, preferencialmente, faz com que a produção ou atividade da proteína ANPEP seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína ANPEP em um animal, progênie, ou célula que carece da sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

[0147] De preferência, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP resulta na produção de substancialmente nenhuma proteína ANPEP funcional pelo animal, progênie ou célula. Por “substancialmente nenhuma proteína ANPEP funcional” entende-se que o nível de proteína ANPEP no animal, progênie ou célula é indetectável, ou se detectável, é pelo menos cerca de 90% inferior, de preferência pelo menos cerca de 95% inferior, mais preferencialmente pelo menos cerca de 98%, inferior, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% inferior ao nível observado em um animal, progênie ou célula que não compreende as sequências cromossômicas modificadas.

[0148] Para qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, o animal, progênie ou célula, de preferência, não produz a proteína ANPEP.

[0149] Em qualquer um dos animais, progênie ou células, a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação em: éxon 2 de um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; éxon 4 de um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; um íntron que é contíguo ao éxon 2 ou éxon 4 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0150] A sequência cromossômica modificada compreende adequadamente uma modificação no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, uma modificação no íntron 1 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP ou uma combinação das mesmas.

[0151] A título de exemplo, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção que começa no íntron 1 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP e termina no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0152] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção ou uma deleção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP. Por exemplo, a inserção ou deleção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP pode ser a jusante do códon de iniciação.

[0153] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0154] Quando a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, a deleção pode compreender uma deleção in-frame no éxon 2.

[0155] Por exemplo, a deleção in-frame no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP pode resultar na deleção dos aminoácidos 194 a 196 da proteína ANPEP.

[0156] Alternativamente, a deleção in-frame no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP pode resultar na deleção dos aminoácidos 194 a 197 da proteína ANPEP. A deleção in-frame pode ainda resultar na substituição do resíduo de valina na posição 198 da proteína ANPEP com outro aminoácido, por exemplo, um resíduo de isoleucina.

[0157] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0158] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: uma deleção de

182 pares de bases do nucleotídeo 1.397 ao nucleotídeo 1.578, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 5 pares de bases começando no nucleotídeo 1.397; uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.574 ao nucleotídeo 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo

1.577 ao nucleotídeo 1.585, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 867 pares de bases do nucleotídeo 819 ao nucleotídeo

1.685, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 867 pares de bases do nucleotídeo 882 ao nucleotídeo 1.688, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.580 e 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.579 e 1.580, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos

1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 267 pares de bases do nucleotídeo 1.321 ao nucleotídeo

1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 267 pares de bases do nucleotídeo 1.323 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 12 pares de bases do nucleotídeo

1.582 ao nucleotídeo 1.593, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 25 pares de bases do nucleotídeo 1.561 ao nucleotídeo 1.585, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 25 pares de bases do nucleotídeo 1.560 ao nucleotídeo

1.584, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.575 ao nucleotídeo 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.574 ao nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; uma deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo

1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0159] Por exemplo, em qualquer um dos animais, progênie ou células, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; a deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; a deleção de 12 pares de bases do nucleotídeo 1.582 ao nucleotídeo 1.593, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; a deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0160] Em qualquer um dos animais, progênie ou células, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; a deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0161] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 182 pares de bases do nucleotídeo 1.397 ao nucleotídeo

1.578, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 5 pares de bases começando no nucleotídeo 1.397.

[0162] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a deleção de 182 pares de bases do nucleotídeo 1.397 ao nucleotídeo 1.578, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 5 pares de bases começando no nucleotídeo 1.397, a inserção de 5 pares de bases pode compreender a sequência CCCTC (SEQ ID NO: 169).

[0163] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.574 ao nucleotídeo 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0164] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.577 ao nucleotídeo 1.585, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0165] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0166] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 867 pares de bases do nucleotídeo 819 ao nucleotídeo 1.685, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0167] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 867 pares de bases do nucleotídeo 882 ao nucleotídeo 1.688, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0168] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0169] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, a inserção pode compreender um único resíduo de timina (T).

[0170] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.580 e 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0171] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.580 e 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, a inserção pode compreender um único resíduo de timina (T) ou um único resíduo de adenina (A).

[0172] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.579 e 1.580, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0173] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.579 e 1.580, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, a inserção pode compreender um único resíduo de adenina (A).

[0174] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0175] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, a inserção de 2 pares de bases pode compreender um dinucleotídeo AT.

[0176] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 267 pares de bases do nucleotídeo 1.321 ao nucleotídeo

1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0177] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 267 pares de bases do nucleotídeo 1.323 ao nucleotídeo

1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0178] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0179] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 12 pares de bases do nucleotídeo 1.582 ao nucleotídeo 1.593, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0180] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 25 pares de bases do nucleotídeo 1.561 ao nucleotídeo 1.585, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0181] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 25 pares de bases do nucleotídeo 1.560 ao nucleotídeo 1.584, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0182] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.575 ao nucleotídeo 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0183] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.574 ao nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135.

[0184] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940.

[0185] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940, a inserção de 8 pares de bases pode compreender a sequência GGGGCTTA (SEQ ID NO: 179).

[0186] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580.

[0187] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580, a inserção de 4 pares de bases pode compreender a sequência TCGT (SEQ ID NO: 180).

[0188] O gene ANPEP no animal, progênie ou célula pode compreender qualquer combinação de qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas aqui descritas.

[0189] Por exemplo, o animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que o a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0190] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo

1.580; e a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0191] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo

1.580; e a deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0192] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo

1.580; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0193] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; e a deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo

1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0194] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 17.235 a

22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0195] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 17.235 a 22.016 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0196] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 21.446 a

21.537 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0197] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 21.479 a

21.529 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0198] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 51 pares de bases do nucleotídeo 21.479 ao nucleotídeo 21.529 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0199] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 21.479 a

21.523 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0200] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 45 pares de bases do nucleotídeo 21.479 ao nucleotídeo 21.523 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0201] Como outro exemplo, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 3 pares de bases do nucleotídeo 21.509 ao nucleotídeo 21.511 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0202] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 21.538 ao

22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0203] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 22.017 ao

22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0204] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 22.054 ao

22.256 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0205] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 22.054 ao

22.126 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0206] Quando a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação em qualquer lugar dentro da região que compreende os nucleotídeos 17.235 ao 22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção ou uma deleção.

[0207] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção. A deleção pode, opcionalmente, incluir uma deleção in-frame.

[0208] Quando a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação em qualquer lugar dentro da região que compreende os nucleotídeos 17.235 ao 22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma substituição.

[0209] Por exemplo, a substituição pode compreender uma substituição de um ou mais dos nucleotídeos no códon ACC nos nucleotídeos

21,509 ao 21,511 da SEQ ID NO: 132 com um nucleotídeo diferente, para produzir um códon que codifica um aminoácido diferente.

[0210] Quando a substituição compreende uma substituição de um ou mais dos nucleotídeos no códon ACC nos nucleotídeos 21.509 ao

21.511 da SEQ ID NO: 132 com um nucleotídeo diferente, para produzir um códon que codifica um aminoácido diferente, a substituição do um ou mais nucleotídeos pode resultar na substituição da treonina (T) no aminoácido 738 da SEQ ID NO: 134 ou da treonina (T) no aminoácido 792 da SEQ ID NO: 133 com um resíduo de glicina (G), alanina (A), cisteína (C), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), prolina (P), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W), ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), asparagina (N), glutamina (Q), histidina (H), lisina (K) ou arginina (R).

[0211] Por exemplo, a substituição resulta na substituição da treonina (T) no aminoácido 738 da SEQ ID NO: 134 ou da treonina (T) no aminoácido 792 da SEQ ID NO: 133 com um resíduo de glicina (G), alanina (A), cisteína (C), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), asparagina (N), glutamina (Q), histidina (H), lisina (K) ou arginina (R).

[0212] A substituição resulta adequadamente na substituição da treonina (T) no aminoácido 738 da SEQ ID NO: 134 ou da treonina (T) no aminoácido 792 da SEQ ID NO: 133 com um resíduo de valina (V) ou arginina (R).

[0213] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, a sequência cromossômica modificada pode interromper uma região de splice de íntron-éxon. A interrupção de uma região de splice de íntron-éxon pode resultar em omissão de éxon ou inclusão de íntron devido à falta de splicing a jusante da região de splice de íntron-éxon, bem como éxons a jusante adicionais no mRNA resultante.

[0214] A fim de interromper uma região de splice de íntron-éxon, qualquer nucleotídeo que seja necessário para o splicing pode ser alterado. Por exemplo, a maioria dos íntrons termina na sequência “AG”. Se o resíduo de guanina (G) nesta sequência for substituído com uma base diferente, o splice não ocorrerá neste sítio e, em vez disso, ocorrerá no próximo dinucleotídeo AG a jusante.

[0215] As regiões de splice de íntron-éxon também podem ser interrompidas modificando a sequência no início do íntron. A maioria dos íntrons começa com a sequência consenso RRGTRRRY (SEQ ID NO: 186), onde “R” é qualquer purina e “Y” é qualquer pirimidina. Se o resíduo de guanina (G) nesta sequência for modificado e/ou se duas ou mais das outras bases forem modificadas, o íntron pode se tornar não funcional e não se unirá.

[0216] As regiões de splice de íntron-éxon também podem ser interrompidas por quaisquer outros métodos conhecidos na técnica.

[0217] Qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas no gene que codifica a proteína ANPEP aqui descrita pode consistir na deleção, inserção ou substituição.

[0218] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, o animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0219] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0220] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0221] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0222] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0223] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0224] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 99,9% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0225] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0226] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, o animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0227] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0228] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0229] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0230] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0231] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0232] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com pelo menos 99,9% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0233] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP com 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0234] Qualquer um dos animais, progênie ou células pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 177 ou 178.

[0235] Por exemplo, qualquer um dos animais, progênie ou células pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 177, 178, 166, 167, 170, 172 ou 171.

[0236] Qualquer um dos animais, progênie ou células pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 177, 178, 166, 167 ou 171.

ANIMAIS E CÉLULAS COM UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM

GENE QUE CODIFICA UMA ANPEP E COMPREENDENDO AINDA UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM GENE QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA CD163

[0237] Qualquer um dos animais de criação, progênie ou células que compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP pode ainda compreender pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163.

[0238] A CD163 tem 17 éxons e a proteína é composta por uma região extracelular com 9 domínios de receptor scavenger rico em cisteína (SRCR), um segmento transmembrana e uma cauda citoplasmática curta.

Várias variantes diferentes resultam do splicing diferencial de um único gene (Ritter et al. 1999a; Ritter et al. 1999b). Grande parte dessa variação é explicada pelo comprimento da cauda citoplasmática.

[0239] A CD163 tem uma série de funções importantes, incluindo atuar como um receptor scavenger de haptoglobina-hemoglobina. A eliminação da hemoglobina livre no sangue é uma função importante da CD163, pois o grupo heme pode ser muito tóxico (Kristiansen et al. 2001). A CD163 possui uma cauda citoplasmática que facilita a endocitose. A mutação dessa cauda resulta na diminuição da captação do complexo haptoglobina-hemoglobina (Nielsen et al. 2006). Outras funções da C163 incluem a adesão de eritroblastos (SRCR2), sendo um receptor TWEAK (SRCR1-4 e 6-9), um receptor bacteriano (SRCR5), um receptor do vírus suíno africano (Sánchez- Torres et al. 2003) e um potencial papel como um modulador imunológico (discutido em Van Gorp et al. 2010).

[0240] A CD163 é um membro da superfamília de receptor scavenger rico em cisteína (SRCR) e tem um domínio intracelular e 9 domínios de SRCR extracelulares. Em humanos, a endocitose da captação de hemoglobina-heme mediada por CD163 via SRCR3 protege as células do estresse oxidativo (Schaer et al., 2006a; Schaer et al., 2006b; Schaer et al., 2006c). A CD163 também serve como um receptor para indutor de apoptose fraco relacionado a fator de necrose tumoral (TWEAK: SRCR1-4 e 6-9), um receptor de patógenos (vírus da Peste Suína Africana; bactéria: SRCR2) e ligação a eritroblastos (SRCR2).

[0241] A CD163 desempenha um papel na infecção pelo vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV), bem como muitos outros patógenos. Portanto, animais, progênie e células com uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 podem ter susceptibilidade reduzida à infecção por PRRSV, bem como susceptibilidade reduzida à infecção por outros patógenos que dependem da CD163 para entrada em uma célula ou para posterior replicação e/ou persistência na célula. O processo de infecção do PRRSV começa com a ligação inicial ao heparan sulfato na superfície do macrófago alveolar. O vírus é então internalizado por endocitose mediada por claterina. Outra molécula, a CD163, facilita então o desencapsulamento do vírus no endossomo (Van Breedam et al. 2010). O genoma viral é liberado e a célula é infectada.

[0242] São descritos aqui os animais e sua progênie e células compreendendo pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163, por exemplo, uma inserção ou uma deleção (“INDEL”), que confere resistência melhorada ou completa à infecção por um patógeno (por exemplo, PRRSV) sobre o animal. A depositante demonstrou que a CD163 é o gene crítico na infecção por PRRSV e criou linhagens e animais resistentes a fundadores (ver, por exemplo, Publicação PCT nº WO 2017/023570 e Publicação de Pedido de Patente US nº 2017/0035035, cujos conteúdos são incorporados aqui por referência em sua totalidade).

[0243] Assim, quando o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP e uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163, o animal, progênie ou célula será resistente à infecção a vários patógenos. Por exemplo, quando o animal ou progênie é um animal porcino ou quando a célula é uma célula porcina, o animal, progênie ou célula será resistente à infecção por TGEV devido à sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP e também será resistente à infecção por PRRSV devido à sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163.

[0244] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 reduz a susceptibilidade do animal, progênie ou célula à infecção por um patógeno (por exemplo, um vírus como o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV)), em comparação com a susceptibilidade de um animal, progênie ou célula que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 à infecção pelo patógeno.

[0245] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163, de preferência, elimina substancialmente a susceptibilidade do animal, progênie ou célula ao patógeno. A modificação, mais preferencialmente, elimina completamente a susceptibilidade do animal, progênie ou célula ao patógeno, de modo que os animais não apresentam quaisquer sinais clínicos de doença após a exposição ao patógeno.

[0246] Por exemplo, quando o animal é um animal porcino e o patógeno é PRRSV, os animais porcinos com a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 não mostram quaisquer sinais clínicos de infecção por PRRSV (por exemplo, dificuldade respiratória, inapetência, letargia, febre, falha reprodutiva durante o final da gestação) após exposição a PRRSV. Além disso, em animais porcinos com a modificação, o ácido nucleico de PRRSV não pode ser detectado no soro e não produz anticorpos específicos para PRRSV.

[0247] O patógeno pode compreender um vírus.

[0248] O vírus pode compreender um vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV).

[0249] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode reduzir a susceptibilidade do animal, progênie ou célula a um vírus PRRSV Tipo 1, um vírus PRRSV Tipo 2 ou a ambos os vírus PRRSV Tipo 1 e Tipo 2.

[0250] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode reduzir a susceptibilidade do animal, progênie ou célula a um isolado de PRRSV selecionado a partir do grupo que consiste em NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, Lelystad, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ e combinações de qualquer um dos mesmos.

[0251] O animal, progênie ou célula pode ser heterozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163.

[0252] O animal, progênie ou célula pode ser homozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163.

[0253] Em qualquer um dos animais, progênie ou células compreendendo uma sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163, a sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163, uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163, uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína CD163 ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0254] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode compreender uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0255] Alternativamente ou além disso, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode compreender uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0256] A deleção, a substituição ou a combinação de qualquer uma das mesmas pode resultar em uma codificação incorreta no alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0257] A inserção, a deleção, a substituição ou a codificação incorreta podem resultar em um códon de terminação prematuro no alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0258] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163, preferencialmente, faz com que a produção ou atividade da proteína CD163 seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína CD163 em um animal, progênie, ou célula que carece da sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163.

[0259] De preferência, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 resulta na produção de substancialmente nenhuma proteína CD163 funcional pelo animal, progênie ou célula. Por “substancialmente nenhuma proteína CD163 funcional”, entende-se que o nível de proteína CD163 no animal, progênie ou célula é indetectável ou, se detectável, é pelo menos cerca de 90% inferior, de preferência pelo menos cerca de 95% inferior, mais preferencialmente pelo menos cerca de 98%, inferior, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% inferior ao nível observado em um animal, progênie ou célula que não compreende as sequências cromossômicas modificadas.

[0260] Quando o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163, o animal, progênie ou célula preferencialmente não produz a proteína CD163.

[0261] O animal ou progênie compreendendo uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 pode compreender um animal porcino.

[0262] Da mesma forma, a célula que compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 pode compreender uma célula porcina.

[0263] Quando o animal ou progênie compreende um animal porcino ou quando a célula compreende uma célula porcina, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode compreender uma modificação em: éxon 7 de um alelo do gene que codifica a proteína CD163; éxon 8 de um alelo do gene que codifica a proteína CD163;

um íntron que é contíguo ao éxon 7 ou éxon 8 do alelo do gene que codifica a proteína CD163; ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0264] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode compreender uma modificação no éxon 7 do alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0265] A modificação no éxon 7 do alelo do gene que codifica a proteína CD163 pode compreender uma inserção.

[0266] A modificação no éxon 7 do alelo do gene que codifica a proteína CD163 pode compreender uma deleção.

[0267] Quando o animal, progênie ou célula compreende uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163, a deleção pode opcionalmente compreender uma deleção in-frame.

[0268] Quando o animal ou progênie compreende um animal porcino ou quando a célula compreende uma célula porcina, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: uma deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com uma deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no mesmo alelo; uma deleção de 124 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 123 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.146 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e 3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 130 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.159 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 132 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo

3.161 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1506 pares de bases do nucleotídeo 1.525 ao nucleotídeo 3.030 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1373 pares de bases do nucleotídeo 2.724 ao nucleotídeo 4.096 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 28 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113; uma deleção de 1720 pares de bases do nucleotídeo 2.440 ao nucleotídeo 4.160 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; uma deleção de

452 pares de bases do nucleotídeo 3.015 ao nucleotídeo 3.466 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0269] A SEQ ID NO: 47 fornece uma sequência de nucleotídeos parcial para CD163 porcina de tipo selvagem. A SEQ ID NO: 47 inclui uma região começando com 3.000 pares de bases (pb) a montante do éxon 7 do gene CD163 porcino de tipo selvagem até a última base do éxon 10 deste gene. A SEQ ID NO: 47 é usada aqui como uma sequência de referência e é mostrada na Figura 16.

[0270] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no mesmo alelo; a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo

4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113; a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0271] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0272] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com uma deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no mesmo alelo.

[0273] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com uma deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no mesmo alelo, a inserção de 2 pares de bases pode compreender o dinucleotídeo AG.

[0274] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 124 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0275] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 123 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.146 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0276] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e 3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0277] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e 3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, a inserção de 1 par de bases pode compreender um único resíduo de adenina.

[0278] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 130 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.159 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0279] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 132 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.161 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0280] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1506 pares de bases do nucleotídeo 1.525 ao nucleotídeo

3.030 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0281] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo

3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0282] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, a inserção de 7 pares de bases pode compreender a sequência TACTACT (SEQ ID NO: 115).

[0283] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo

4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0284] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1373 pares de bases do nucleotídeo 2.724 ao nucleotídeo

4.096 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0285] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo

3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0286] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0287] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, a inserção de 12 pares de bases pode compreender a sequência TGTGGAGAATTC (SEQ ID NO: 116).

[0288] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 28 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0289] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo

4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0290] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo

4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113.

[0291] Quando a sequência cromossômica modificada compreende a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, a inserção de 11 pares de bases pode compreender a sequência AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).

[0292] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 1720 pares de bases do nucleotídeo 2.440 ao nucleotídeo

4.160 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0293] A sequência cromossômica modificada pode compreender uma deleção de 452 pares de bases do nucleotídeo 3.015 ao nucleotídeo 3.466 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0294] O gene CD163 no animal, progênie ou célula pode compreender qualquer combinação de qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas aqui descritas.

[0295] Por exemplo, o animal, progênie ou célula pode compreender a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0296] O animal, progênie ou célula pode compreender a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0297] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0298] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0299] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0300] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0301] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0302] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0303] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0304] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 124 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 123 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.146 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0305] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 130 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.159 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 132 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.161 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0306] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 1373 pares de bases do nucleotídeo 2.724 ao nucleotídeo 4.096 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0307] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 28 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0308] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e a deleção de 1720 pares de bases do nucleotídeo 2.440 ao nucleotídeo 4.160 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0309] O animal, progênie ou célula pode compreender a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163.

[0310] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163.

[0311] O animal, progênie ou célula pode compreender a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene CD163.

[0312] Qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas no gene que codifica a proteína CD163 aqui descrita pode consistir na deleção, inserção ou substituição.

[0313] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, o animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0314] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0315] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0316] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0317] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 com pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0318] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0319] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 com pelo menos 99,9% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0320] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 com 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

[0321] Qualquer um dos animais, progênie ou células pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo a SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 ou 119.

[0322] Em qualquer um dos animais, progênie ou células compreendendo sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína ANPEP e um gene que codifica uma proteína CD163, o animal, progênie ou célula pode compreender qualquer combinação de qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína ANPEP aqui descrita e qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína CD163 aqui descrita.

[0323] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP pode compreender a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, e a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode compreender a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

ANIMAIS E CÉLULAS COM UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM

GENE QUE CODIFICA UMA ANPEP E COMPREENDENDO AINDA UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM GENE QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA SIGLEC1

[0324] Qualquer um dos animais, progênie ou células que compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP pode ainda compreender pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

[0325] O animal, progênie ou célula pode ser heterozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0326] O animal, progênie ou célula pode ser homozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0327] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1, uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1, uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1 ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[0328] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0329] Quando a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC compreende uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1, a deleção pode compreender uma deleção in-frame.

[0330] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0331] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0332] A deleção, a substituição ou a combinação de qualquer uma das mesmas pode resultar em uma codificação incorreta no alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0333] A inserção, a deleção, a substituição ou a codificação incorreta podem resultar em um códon de terminação prematuro no alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0334] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1, preferencialmente, faz com que a produção ou atividade da proteína SIGLEC1 seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína SIGLEC1 em um animal, progênie, ou célula que carece da sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0335] De preferência, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 resulta na produção de substancialmente nenhuma proteína SIGLEC1 funcional pelo animal, progênie ou célula. Por “substancialmente nenhuma proteína SIGLEC1 funcional”, significa que o nível de proteína SIGLEC1 no animal, progênie ou célula é indetectável, ou se detectável, é pelo menos cerca de 90% inferior, de preferência pelo menos cerca de 95% inferior, mais preferencialmente pelo menos cerca de 98% inferior, e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 99% inferior ao nível observado em um animal, progênie ou célula que não compreende as sequências cromossômicas modificadas.

[0336] Quando o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1, o animal, progênie ou célula preferencialmente não produz a proteína SIGLEC1.

[0337] O animal ou progênie compreendendo uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1 pode compreender um animal porcino.

[0338] Da mesma forma, a célula que compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1 pode compreender uma célula porcina.

[0339] Quando o animal ou progênie compreende um animal porcino ou quando a célula compreende uma célula porcina, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender uma modificação em: éxon 1 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1; éxon 2 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1; éxon 3 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1; um íntron que é contíguo ao éxon 1, éxon 2 ou éxon 3 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1; ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0340] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender uma deleção no éxon 1, éxon 2 e/ou éxon 3 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0341] A sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender uma deleção de parte do éxon 1 e todos os éxons 2 e 3 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0342] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção de 1.247 pares de bases do nucleotídeo 4.279 ao nucleotídeo 5.525 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 122.

[0343] A SEQ ID NO: 122 fornece uma sequência de nucleotídeos parcial para SIGLEC1 suína de tipo selvagem. A SEQ ID NO: 122 começa em 4.236 nucleotídeos a montante do éxon 1, inclui todos os íntrons e éxons até o éxon 7, e 1.008 nucleotídeos após o final do éxon 7. A SEQ ID NO: 122 é usada como uma sequência de referência neste documento.

[0344] Quando a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende uma deleção, a sequência deletada pode ser opcionalmente substituída com um cassete de neomicina.

Por exemplo, o animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 123. A SEQ ID NO: 123 fornece uma sequência de nucleotídeos parcial em que, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 122, há uma deleção de 1.247 pares de bases de nucleotídeo 4.279 a 5.525 e a sequência deletada é substituída com um cassete selecionável de neomicina de 1.855 pares de bases orientado na direção oposta em comparação com SEQ ID NO: 122.

Esta inserção/ deleção resulta na perda de parte do éxon 1 e de todos dos éxons 2 e 3 do gene SIGLEC1.

[0345] Qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas no gene que codifica a proteína SIGLEC1 aqui descrita pode consistir na deleção, inserção ou substituição.

[0346] Em qualquer um dos animais, progênie ou células aqui descritos, o animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0347] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 com pelo menos 85% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0348] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 com pelo menos 90% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0349] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 com pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0350] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 com pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0351] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 com pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0352] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 com pelo menos 99,9% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0353] O animal, progênie ou célula pode compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 com 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0354] Em qualquer um dos animais, progênie ou células compreendendo sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína ANPEP e um gene que codifica uma proteína SIGLEC1, o animal, progênie ou célula pode compreender qualquer combinação de qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína ANPEP aqui descrita e qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1 aqui descrita.

[0355] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP pode compreender a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, e a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender a deleção de 1.247 pares de bases do nucleotídeo 4.279 ao nucleotídeo 5.525 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 122.

ANIMAIS E CÉLULAS COM UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM

E UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM GENE QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA SIGLEC1

[0356] Qualquer um dos animais, progênie ou células que compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP pode ainda compreender pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 e pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

[0357] Quando o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP, uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 e uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1, o animal, progênie ou célula pode compreender qualquer combinação de qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína ANPEP aqui descrita, qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína CD163 aqui descrita e qualquer uma das sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1 aqui descrita.

[0358] Por exemplo, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP pode compreender a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 pode compreender a deleção de 1.247 pares de bases do nucleotídeo 4.279 ao nucleotídeo 5.525 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 122, e a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 pode compreender a deleção de 1.387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

ANIMAIS E CÉLULAS GENETICAMENTE EDITADOS

[0359] Qualquer um dos animais ou progênie aqui descritos pode ser um animal geneticamente editado.

[0360] Da mesma forma, qualquer uma das células aqui descritas pode ser uma célula geneticamente editada.

[0361] O animal, progênie ou célula pode ser um animal, progênie ou célula que foi editado usando uma endonuclease teleguiada. A endonuclease teleguiada pode ser uma endonuclease de ocorrência natural, mas é preferencialmente uma endonuclease teleguiada de ocorrência não natural, projetada racionalmente, que tem uma sequência de reconhecimento de DNA que foi projetada de modo que a endonuclease tenha como alvo uma sequência cromossômica em um gene que codifica uma proteína ANPEP, CD163 ou SIGLEC1.

[0362] Assim, a endonuclease teleguiada pode ser uma endonuclease teleguiada projetada. A endonuclease teleguiada pode compreender, por exemplo, um sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR), uma Nuclease Efetora Semelhante a Ativador de Transcrição (TALEN), uma Nuclease Dedo de Zinco (ZFN), uma proteína de fusão recombinase, uma meganuclease ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0363] A nuclease teleguiada compreende preferencialmente um sistema CRISPR. Exemplos de sistemas CRISPR que podem ser usados para criar animais porcinos fêmeas para uso nos métodos descritos neste documento incluem, mas não estão limitados a CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas5 e CRISPR/Cas6.

[0364] O uso de várias endonucleases teleguiadas, incluindo sistemas CRISPR e TALENs, para gerar animais geneticamente editados é discutido mais adiante.

[0365] A sequência cromossômica editada pode ser (1) inativada, (2) modificada ou (3) compreender uma sequência integrada resultando em uma mutação nula. Quando a sequência cromossômica editada está em um gene ANPEP, uma sequência cromossômica inativada é alterada de modo que a função da proteína ANPEP no que se refere à infecção por TGEV e/ou PRCV é prejudicada, reduzida ou eliminada. Quando a sequência cromossômica editada está em um gene CD163, uma sequência cromossômica inativada é alterada de modo que a função da proteína CD163 no que diz respeito à infecção por PRRSV é prejudicada, reduzida ou eliminada. Assim, um animal geneticamente editado que compreende uma sequência cromossômica inativada pode ser denominado um “knock out” ou um “knock out condicional”.

Da mesma forma, um animal geneticamente editado compreendendo uma sequência integrada pode ser denominado um “knock in” ou um “knock in condicional”. Além disso, um animal geneticamente editado compreendendo uma sequência cromossômica modificada pode compreender uma(s) mutação(ões) pontual(is) direcionada(s) ou outra modificação de modo que um produto de proteína alterado seja produzido. Resumidamente, o processo pode compreender a introdução em um embrião ou célula de pelo menos uma molécula de RNA que codifica uma nuclease dedo de zinco direcionada e, opcionalmente, pelo menos um polinucleotídeo acessório. O método compreende ainda a incubação do embrião ou célula para permitir a expressão da nuclease dedo de zinco, em que uma quebra de fita dupla introduzida na sequência cromossômica direcionada pela nuclease dedo de zinco é reparada por um processo de reparo de DNA de união de extremidades não homólogas propenso a erros ou um processo de reparo de DNA dirigido por homologia. O método de edição de sequências cromossômicas que codificam uma proteína associada ao desenvolvimento da linha germinativa usando a tecnologia de nuclease dedo de zinco direcionada é rápido, preciso e altamente eficiente.

[0366] Alternativamente, o processo pode compreender o uso de um sistema CRISPR (por exemplo, um sistema CRISPR/Cas9) para modificar a sequência genômica. Para usar Cas9 para modificar sequências genômicas, a proteína pode ser entregue diretamente a uma célula. Alternativamente, um mRNA que codifica Cas9 pode ser entregue a uma célula, ou um gene que fornece a expressão de um mRNA que codifica Cas9 pode ser entregue a uma célula. Além disso, tanto o crRNA específico do alvo quanto um tracrRNA podem ser entregues diretamente a uma célula ou o(s) gRNA(s) específico(s) do alvo podem ser a uma célula (esses RNAs podem ser alternativamente produzidos por um gene construído para expressar esses RNAs). A seleção de sítios alvo e projetada de crRNA/ gRNA são bem conhecidos na técnica. Uma discussão sobre construção e clonagem de gRNAs pode ser encontrada em http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/ CRISPR-Reagent-Description-Rev20140509.pdf.

[0367] Pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 pode ser usado como um sítio alvo para a edição sítio-específica. A edição sítio- específica pode incluir a inserção de um ácido nucleico exógeno (por exemplo, um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse) ou deleções de ácidos nucleicos do locus. Por exemplo, a integração do ácido nucleico exógeno e/ou deleção de parte do ácido nucleico genômico pode modificar o locus de modo a produzir um gene ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 interrompido (isto é, atividade reduzida da proteína ANPEP, CD163 ou SIGLEC1).

TIPOS DE CÉLULAS

[0368] Qualquer uma das células aqui descritas pode compreender uma célula germinativa ou um gameta.

[0369] Por exemplo, qualquer uma das células aqui descritas pode compreender um espermatozóide.

[0370] Alternativamente, qualquer uma das células aqui descritas pode compreender um óvulo (por exemplo, um óvulo fertilizado).

[0371] Qualquer uma das células aqui descritas pode compreender uma célula somática.

[0372] Por exemplo, qualquer uma das células aqui descritas pode compreender um fibroblasto (por exemplo, um fibroblasto fetal).

[0373] Qualquer uma das células aqui descritas pode compreender uma célula embrionária.

[0374] Qualquer uma das células aqui descritas pode compreender uma célula derivada de um animal jovem.

[0375] Qualquer uma das células aqui descritas pode compreender uma célula derivada de um animal adulto.

MÉTODOS PARA PRODUZIR ANIMAIS E LINHAGENS COM SUSCEPTIBILIDADE REDUZIDA A UM PATÓGENO

[0376] É fornecido um método para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos com susceptibilidade reduzida a um patógeno. O método compreende modificar um oócito ou um espermatozóide para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP) em pelo menos um dentre o oócito e o espermatozóide e fertilizar o oócito com o espermatozóide para criar um óvulo fertilizado contendo a sequência cromossômica modificada no gene que codifica uma proteína ANPEP. O método compreende ainda transferir o óvulo fertilizado para uma fêmea portadora, em que a gestação e o parto a termo produzem animais de prole. O método compreende, adicionalmente, fazer a triagem dos animais de prole quanto à susceptibilidade ao patógeno e selecionar animais de prole que têm susceptibilidade reduzida ao patógeno em comparação com animais que não compreendem uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[0377] Outro método para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos com susceptibilidade reduzida a um patógeno é fornecido. O método compreende modificar um óvulo fertilizado para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP no óvulo fertilizado. O método compreende ainda transferir o óvulo fertilizado para uma fêmea portadora, em que a gestação e o parto a termo produzem animais de prole. O método compreende, adicionalmente, fazer a triagem dos animais de prole quanto à susceptibilidade ao patógeno e selecionar animais de prole que têm susceptibilidade reduzida ao patógeno em comparação com animais que não compreendem uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[0378] Em qualquer um desses métodos, o animal pode compreender um animal de criação.

[0379] A etapa de modificar o oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado pode compreender a edição genética do oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado.

[0380] O oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado pode ser heterozigoto para a sequência cromossômica modificada.

[0381] O oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado pode ser homozigoto para a sequência cromossômica modificada.

[0382] A fertilização pode compreender a inseminação artificial.

[0383] Em qualquer um dos métodos para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos com susceptibilidade reduzida a um patógeno, o método pode compreender ainda modificar o oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 no oócito, no espermatozóide ou no óvulo fertilizado.

[0384] Alternativamente ou além disso, em qualquer um dos métodos para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos com susceptibilidade reduzida a um patógeno, o método pode compreender ainda modificar o oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1 no oócito, no espermatozóide ou no óvulo fertilizado.

[0385] É fornecido um método para aumentar a resistência de um animal de criação à infecção por um patógeno. O método compreende modificar pelo menos uma sequência cromossômica em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP) de modo que a produção ou atividade da proteína ANPEP seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína ANPEP em um animal de criação que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[0386] O método pode ainda compreender opcionalmente a modificação de pelo menos uma sequência cromossômica em um gene que codifica uma proteína CD163, de modo que a produção ou atividade da proteína CD163 seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína CD163 em um animal de criação que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163.

[0387] Alternativamente ou além disso, o método pode ainda compreender, opcionalmente, modificar pelo menos uma sequência cromossômica em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1, de modo que a produção ou atividade da proteína SIGLEC1 seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína SIGELC1 em um animal de criação que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

[0388] A etapa de modificação da pelo menos uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP pode compreender a edição genética da sequência cromossômica.

[0389] Em qualquer um dos métodos descritos neste documento compreendendo edição genética, a edição genética pode compreender o uso de uma endonuclease teleguiada. A endonuclease teleguiada pode ser uma endonuclease de ocorrência natural, mas é de preferência uma endonuclease teleguiada de ocorrência não natural, projetada racionalmente, que tem uma sequência de reconhecimento de DNA que foi projetada de modo que a endonuclease tenha como alvo uma sequência cromossômica em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[0390] Assim, a endonuclease teleguiada pode ser uma endonuclease teleguiada projetada. A endonuclease teleguiada pode compreender, por exemplo, um sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR), uma Nuclease Efetora Semelhante a Ativador de Transcrição (TALEN), uma Nuclease Dedo de Zinco (ZFN), uma proteína de fusão recombinase, uma meganuclease ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0391] A nuclease teleguiada compreende preferencialmente um sistema CRISPR. Exemplos de sistemas CRISPR que incluem, mas não estão limitados a CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas5 e CRISPR/Cas6.

[0392] Qualquer um dos métodos descritos neste documento pode produzir qualquer um dos animais descritos neste documento.

[0393] Qualquer um dos métodos descritos neste documento pode ainda compreender o uso do animal como um animal fundador.

POPULAÇÕES DE ANIMAIS

[0394] Populações de animais também são fornecidas aqui.

[0395] Uma população de animais de criação é fornecida. A população compreende dois ou mais de qualquer um dos animais de criação e/ou sua progênie aqui descritos.

[0396] Outra população de animais é fornecida. A população compreende dois ou mais animais produzidos por qualquer um dos métodos descritos neste documento e/ou sua progênie.

[0397] Assim, os animais na população compreenderão uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP. Os animais na população também podem compreender opcionalmente sequências cromossômicas modificadas em um gene que codifica uma proteína CD163 e/ou um gene que codifica uma proteína SIGELC1.

[0398] As populações são resistentes à infecção por um patógeno.

[0399] O patógeno pode compreender um vírus. Por exemplo, o patógeno pode compreender um vírus da família Coronaviridae, por exemplo, um vírus da subfamília Coronavirinae.

[0400] O vírus compreende preferencialmente um coronavírus (por exemplo, um vírus do gênero Alphacoronavirus).

[0401] Quando o vírus compreende um vírus do gênero Alphacoronavirus, o vírus do gênero Alphacoronavirus compreende preferencialmente um vírus da gastroenterite transmissível (TGEV).

[0402] Por exemplo, o vírus da gastroenterite transmissível pode compreender a cepa TGEV Purdue.

[0403] Alternativamente ou adicionalmente, o vírus pode compreender um coronavírus respiratório suíno (PRCV).

[0404] Quando os animais na população também compreendem uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163, a população também será resistente à infecção por um vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV) (por exemplo, vírus PRRSV Tipo 1, Vírus PRRSV Tipo 2, ou ambos os vírus PRRSV Tipo 1 e Tipo 2 e/ou um isolado PRRSV selecionado a partir do grupo que consiste em NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62- 06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, Lelystad, 03-1059, 03-1060, SD01- 08, 4353PZ e combinações de qualquer um dos mesmos).

ÁCIDOS NUCLEICOS

[0405] Moléculas de ácido nucleico também são fornecidas aqui.

[0406] Uma molécula de ácido nucleico é fornecida. A molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135; (b) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132; e (c) um cDNA de (a) ou (b).

[0407] Qualquer uma das moléculas de ácido nucleico pode ser uma molécula de ácido nucleico isolada.

[0408] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132.

[0409] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132.

[0410] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 87,5% de identidade com a SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132.

[0411] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132.

[0412] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132.

[0413] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID

NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132.

[0414] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132.

[0415] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132.

[0416] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80% de identidade com a SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135.

[0417] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 85% de identidade com a SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135.

[0418] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 87,5% de identidade com a SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135.

[0419] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135.

[0420] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID

NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135.

[0421] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 98% de identidade com a SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135.

[0422] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99% de identidade com a SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135.

[0423] A molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135.

[0424] A substituição, inserção ou deleção reduz ou elimina a produção ou atividade da proteína ANPEP, em comparação com um ácido nucleico que não compreende a substituição, inserção ou deleção.

[0425] A molécula de ácido nucleico pode compreender SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 177 ou 178.

[0426] Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode compreender SEQ ID NO: 177, 178, 166, 167 ou 171.

MARCADORES DE AFINIDADE

[0427] Um “marcador de afinidade” pode ser um marcador de afinidade de peptídeo ou um marcador de afinidade de ácido nucleico. O termo “marcador de afinidade” se refere, de modo geral, a uma sequência de proteína ou ácido nucleico que pode ser ligada a uma molécula (por exemplo, ligada por uma pequena molécula, proteína ou ligação covalente). Um marcador de afinidade pode ser uma sequência não nativa. Um marcador de afinidade de peptídeo pode compreender um peptídeo. Um marcador de afinidade de peptídeo pode ser aquele que é capaz de fazer parte de um sistema de divisão (por exemplo, dois fragmentos de peptídeo inativos podem se combinar em trans para formar um marcador de afinidade ativo). Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode compreender um ácido nucleico. Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode ser uma sequência que pode se ligar seletivamente a uma sequência de ácido nucleico conhecida (por exemplo, através de hibridização). Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode ser uma sequência que pode se ligar seletivamente a uma proteína. Um marcador de afinidade pode ser fundido a uma proteína nativa. Um marcador de afinidade pode ser fundido a uma sequência de nucleotídeos.

[0428] Às vezes, um, dois ou uma pluralidade de marcadores de afinidade podem ser fundidos a uma proteína nativa ou sequência de nucleotídeos. Um marcador de afinidade pode ser introduzido em um ácido nucleico direcionado a ácido nucleico usando métodos de transcrição in vitro ou in vivo. Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem incluir, por exemplo, um marcador químico, uma sequência de ligação da proteína de ligação a RNA, uma sequência de ligação da proteína de ligação a DNA, uma sequência hibridizável a um polinucleotídeo marcado por afinidade, um aptâmero de RNA sintético ou um aptâmero de DNA sintético. Exemplos de marcadores de afinidade de ácido nucleico químicos podem incluir, mas não estão limitados a ribo-nucleotrifosfatos contendo biotina, corantes fluorescentes e digoxeginin. Exemplos de marcadores de afinidade de ácido nucleico de ligação a proteína podem incluir, mas não estão limitados à sequência de ligação MS2, a sequência de ligação U1A, sequências de proteína de ligação haste-alça, a sequência boxB, a sequência eIF4A ou qualquer sequência reconhecida por uma proteína de ligação ao RNA. Exemplos de oligonucleotídeos marcados por afinidade de ácido nucleico podem incluir, mas não estão limitados a oligonucleotídeos biotinilados, oligonucleotídeos 2, 4- dinitrofenil, oligonucleotídeos com fluoresceína e oligonucleotídeos conjugados com amina primária.

[0429] Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode ser um aptâmero de RNA. Aptâmeros podem incluir aptâmeros que se ligam a teofilina, estreptavidina, dextrano B512, adenosina, guanosina, guanina/ xantina, 7-metil- GTP, aptâmeros de aminoácidos, como aptâmeros que se ligam a arginina, citrulina, valina, triptofano, cianocobalamina, N-metilmesoporfirina IX, flavina, NAD e aptâmeros antibióticos, tais como aptâmeros que se ligam a tobramicina, neomicina, lividomicina, canamicina, estreptomicina, viomicina e cloranfenicol.

[0430] Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode compreender uma sequência de RNA que pode ser ligada por um polipeptídeo sítio-direcionado. O polipeptídeo sítio-direcionado pode ser condicionalmente enzimaticamente inativo. A sequência de RNA pode compreender uma sequência que pode ser ligada por um membro dos sistemas CRISPR Tipo I, Tipo II e/ou Tipo III. A sequência de RNA pode ser ligada por uma proteína membro da família RAMP. A sequência de RNA pode ser ligada por uma proteína membro da família Cas9, uma proteína membro da família Cas6 (por exemplo, Csy4, Cas6). A sequência de RNA pode ser ligada por uma proteína membro da família Cas5 (por exemplo, Cas5). Por exemplo, Csy4 pode se ligar a uma sequência de grampo de RNA específica com alta afinidade (Kd ~ 50 pM) e pode clivar o RNA em um sítio 3’ para o grampo.

[0431] Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode compreender uma sequência de DNA que pode ser ligada por um polipeptídeo sítio-direcionado. O polipeptídeo sítio-direcionado pode ser condicionalmente enzimaticamente inativo. A sequência de DNA pode compreender uma sequência que pode ser ligada por um membro dos sistemas CRISPR Tipo I,

Tipo II e/ou Tipo III. A sequência de DNA pode ser ligada por uma proteína Argonauta. A sequência de DNA pode ser ligada por uma proteína contendo um domínio dedo de zinco, um domínio TALE ou qualquer outro domínio de ligação a DNA.

[0432] Um marcador de afinidade de ácido nucleico pode compreender uma sequência de ribozima. Ribozimas adequadas podem incluir peptidil transferase 23 SrRNA, RnaseP, íntrons do Grupo I, íntrons do Grupo II, ribozima de ramificação GIR1, Leadzyme, ribozimas de grampo, ribozimas cabeça de martelo, ribozimas HDV, ribozimas CPEB3, ribozimas VS, ribozima glmS, ribozima CoTC e ribozimas sintéticas.

[0433] Marcadores de afinidade de peptídeo podem compreender marcadores que podem ser usados para rastreamento ou purificação (por exemplo, uma proteína fluorescente, tal como proteína fluorescente verde (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato; um marcador His, (por exemplo, um marcador 6XHis); um marcador de hemaglutinina (HA); um marcador FLAG; um marcador Myc; um marcador GST; um marcador MBP; um marcador de proteína de ligação à quitina; um marcador de calmodulina; um marcador V5; um marcador de ligação à estreptavidina; e semelhantes).

[0434] Ambos os marcadores de afinidade de ácido nucleico e peptídeo podem compreender marcadores de moléculas pequenas, tais como biotina ou digitoxina, e marcadores de marcas fluorescentes, tais como por exemplo, fluorosceína, rodamina, corantes Alexa fluor, corante Cianina3, corante Cianina5.

[0435] Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem estar localizados em 5’ em relação a um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico direcionado a ácido nucleico). Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem estar localizados em 3’ em relação a um ácido nucleico. Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem estar localizados em 5’ e 3’

em relação a um ácido nucleico. Os marcadores de afinidade de ácido nucleico podem estar localizados dentro de um ácido nucleico. Os marcadores de afinidade de peptídeo podem estar localizados no N-terminal em relação a uma sequência de polipeptídeo. Os marcadores de afinidade de peptídeo podem estar localizados no C-terminal em relação a uma sequência de polipeptídeo.

Os marcadores de afinidade de peptídeo podem estar localizados no N- terminal e no C-terminal em relação a uma sequência polipeptídica. Uma pluralidade de marcadores de afinidade pode ser fundida a um ácido nucleico e/ou uma sequência de peptídeo.

AGENTES DE CAPTURA

[0436] Conforme usado neste documento, “agente de captura” pode, de modo geral, se referir a um agente que pode purificar um polipeptídeo e/ou um ácido nucleico. Um agente de captura pode ser uma molécula ou material biologicamente ativo (por exemplo, qualquer substância biológica encontrada na natureza ou sintética, e inclui, mas não está limitada a células, vírus, partículas subcelulares, proteínas, incluindo mais especificamente anticorpos, imunoglobulinas, antígenos, lipoproteínas, glicoproteínas, peptídeos, polipeptídeos, complexos de proteínas, complexos de (estrepto)avidina-biotina, ligantes, receptores ou pequenas moléculas, aptâmeros, ácidos nucleicos, DNA, RNA, ácidos nucleicos peptídicos, oligossacarídeos, polissacarídeos, lipopolissacarídeos, metabólitos celulares, haptenos, substâncias farmacologicamente ativas, alcalóides, esteróides, vitaminas, aminoácidos e açúcares). Em algumas formas de realização, o agente de captura pode compreender um marcador de afinidade. Em algumas formas de realização, um agente de captura pode se ligar preferencialmente a um polipeptídeo alvo ou ácido nucleico de interesse. Os agentes de captura podem flutuar livremente em uma mistura. Os agentes de captura podem ser ligados a uma partícula (por exemplo, uma conta, uma microconta, uma nanopartícula). Os agentes de captura podem ser ligados a uma superfície sólida ou semi-sólida. Em alguns casos, os agentes de captura são irreversivelmente ligados a um alvo. Em outros casos, os agentes de captura são reversivelmente ligados a um alvo (por exemplo, se um alvo pode ser eluído, ou pelo uso de um produto químico, tal como o imidazol).

INTEGRAÇÃO DIRECIONADA DE UM ÁCIDO NUCLEICO EM UM LOCUS CD163

[0437] A integração sítio-específica de um ácido nucleico exógeno em um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 pode ser realizada por qualquer técnica conhecida pelos técnicos no assunto. Por exemplo, a integração de um ácido nucleico exógeno em um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 pode compreender o contato de uma célula (por exemplo, uma célula isolada ou uma célula em um tecido ou organismo) com uma molécula de ácido nucleico compreendendo o ácido nucleico exógeno. Essa molécula de ácido nucleico pode compreender sequências de nucleotídeos que flanqueiam o ácido nucleico exógeno que facilita a recombinação homóloga entre a molécula de ácido nucleico e pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1. As sequências de nucleotídeos que flanqueiam o ácido nucleico exógeno que facilita a recombinação homóloga podem ser complementares aos nucleotídeos endógenos do locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1. Alternativamente, as sequências de nucleotídeos que flanqueiam o ácido nucleico exógeno que facilita a recombinação homóloga podem ser complementares aos nucleotídeos exógenos previamente integrados. Uma pluralidade de ácidos nucleicos exógenos pode ser integrada em um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1, tal como no empilhamento gênico.

[0438] A integração de um ácido nucleico em um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 pode ser facilitada (por exemplo, catalisada) por maquinaria celular endógena de uma célula hospedeira, tal como, por exemplo e sem limitação, DNA endógeno e enzimas recombinase endógenas.

Alternativamente, a integração de um ácido nucleico em um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 pode ser facilitada por um ou mais fatores (por exemplo, polipeptídeos) que são fornecidos a uma célula hospedeira. Por exemplo, polipeptídeos de nuclease(s), recombinase(s) e/ou ligase podem ser fornecidos (independentemente ou como parte de um polipeptídeo quimérico) pelo contato dos polipeptídeos com a célula hospedeira ou pela expressão dos polipeptídeos dentro da célula hospedeira. Por conseguinte, um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos um polipeptídeo de nuclease, recombinase e/ou ligase pode ser introduzido na célula hospedeira, simultaneamente ou sequencialmente com um ácido nucleico a ser integrado sítio-especificamente em um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1, em que o pelo menos um polipeptídeo de nuclease, recombinase e/ou ligase é expresso a partir da sequência de nucleotídeos na célula hospedeira.

POLIPEPTÍDEOS DE LIGAÇÃO A DNA

[0439] A integração sítio-específica pode ser realizada usando fatores que são capazes de reconhecer e se ligar a sequências de nucleotídeos particulares, por exemplo, no genoma de um organismo hospedeiro. Por exemplo, muitas proteínas compreendem domínios polipeptídicos que são capazes de reconhecer e se ligar ao DNA de uma maneira sítio-específica.

Uma sequência de DNA que é reconhecida por um polipeptídeo de ligação a DNA pode ser referida como uma sequência “alvo”. Domínios polipeptídicos que são capazes de reconhecer e se ligar ao DNA de uma maneira sítio- específica geralmente dobram-se corretamente e funcionam independentemente para se ligar ao DNA de uma maneira sítio-específica, mesmo quando expressos em um polipeptídeo diferente da proteína a partir da qual o domínio foi originalmente isolado. Da mesma forma, as sequências alvo para reconhecimento e ligação por polipeptídeos de ligação a DNA são, de modo geral, capazes de ser reconhecidas e ligadas por tais polipeptídeos, mesmo quando presentes em grandes estruturas de DNA (por exemplo, um cromossomo), particularmente quando o sítio onde a sequência alvo está localizada é um conhecido por ser acessível a proteínas celulares solúveis (por exemplo, um gene).

[0440] Embora os polipeptídeos de ligação a DNA identificados a partir de proteínas que existem na natureza normalmente se ligam a uma sequência de nucleotídeos discreta ou motivo (por exemplo, uma sequência de reconhecimento consenso), existem métodos que são conhecidos na técnica para modificar muitos desses polipeptídeos de ligação a DNA para reconhecer uma sequência de nucleotídeos ou motivo diferente. Os polipeptídeos de ligação a DNA incluem, por exemplo e sem limitação: domínios de ligação a DNA dedo de zinco; zíperes de leucina; domínios de ligação a DNA UPA; GAL4; TAL; LexA; repressores Tet; LacI; e receptores de hormônios esteróides.

[0441] Por exemplo, o polipeptídeo de ligação a DNA pode ser um dedo de zinco. Motivos dedo de zinco individuais podem ser projetados para direcionar e ligar especificamente a qualquer um de uma grande variedade de sítios de DNA. Os polipeptídeos dedo de zinco Cys2His2 canônico (bem como Cys3His não canônico) se ligam ao DNA inserindo uma α-hélice no sulco principal da dupla hélice de DNA alvo. O reconhecimento do DNA por um dedo de zinco é modular; cada dedo contata principalmente três pares de bases consecutivos no alvo e alguns resíduos-chave no polipeptídeo medeiam o reconhecimento. Ao incluir múltiplos domínios de ligação a DNA dedo de zinco em uma endonuclease de direcionamento, a especificidade de ligação a DNA da endonuclease de direcionamento pode ser ainda aumentada (e, portanto, a especificidade de quaisquer efeitos reguladores de gene conferidos desse modo também pode ser aumentada). Ver, por exemplo, Urnov et al. (2005) Nature 435: 646-51. Assim, um ou mais polipeptídeos de ligação a DNA dedo de zinco podem ser projetados e utilizados de modo que uma endonuclease de direcionamento introduzida em uma célula hospedeira interaja com uma sequência de DNA que é única dentro do genoma da célula hospedeira.

[0442] De preferência, a proteína dedo de zinco é de ocorrência não natural, em que é projetada para se ligar a um sítio alvo de escolha. Ver, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al.

(2001) Ann. Rev. Biochem. 70: 313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol.

19: 656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12: 632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 411-416; Patente U.S. nº 6.453.242;

6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317;

7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; e Publicação de Patente U.S. nº 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

[0443] Um domínio de ligação dedo de zinco projetado pode ter uma nova especificidade de ligação, em comparação com uma proteína dedo de zinco de ocorrência natural. Os métodos de engenharia incluem, mas não estão limitados a, projeto racional e vários tipos de seleção. O projeto racional inclui, por exemplo, o uso de bancos de dados que compreendem sequências de nucleotídeos tripletos (ou quadrupletos) e sequências de aminoácidos dedo de zinco individuais, em que cada sequência de nucleotídeo tripleto ou quadrupleto está associada a uma ou mais sequências de aminoácidos de dedos de zinco que se ligam à sequência tripleto ou quadrupleto particular. Ver, por exemplo, Patente U.S. nº 6.453.242 e 6.534.261.

[0444] Métodos de seleção exemplificativos, incluindo exibição de fago e sistemas de dois híbridos, são revelados na Patente U.S. nº 5.789.538;

5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; e

6.242.568; bem como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2.338.237. Além disso, o aumento da especificidade de ligação para domínios de ligação dedo de zinco foi descrito, por exemplo, em WO 02/077227.

[0445] Além disso, conforme revelado nestas e em outras referências, os domínios de dedo de zinco e/ou proteínas dedo de zinco com múltiplos dedos podem ser ligados entre si usando quaisquer sequências de ligantes adequados, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Ver, também, Patente U.S. nº 6.479.626; 6.903.185; e

7.153.949 para sequências ligantes exemplificativas de 6 ou mais aminoácidos de comprimento. As proteínas aqui descritas podem incluir qualquer combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína.

[0446] Seleção de sítios alvo: ZFPs e métodos para projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos que as codificam) são conhecidos pelos técnicos no assunto e descritos em detalhes na Patente US nº 6.140.0815; 789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988;

6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970, WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.

[0447] Além disso, conforme revelado nestas e outras referências, os domínios de dedo de zinco e/ou proteínas dedo de zinco com múltiplos dedos podem ser ligados entre si usando quaisquer sequências de ligantes adequados, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Ver, também, Patente U.S. nº 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949 para sequências ligantes exemplificativas de 6 ou mais aminoácidos de comprimento. As proteínas aqui descritas podem incluir qualquer combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína.

[0448] Quando um animal ou célula, conforme descrito neste documento, foi geneticamente editado usando uma nuclease dedo de zinco, o animal ou célula pode ser criado usando um processo que compreende introduzir, em um embrião ou célula, pelo menos uma molécula de RNA que codifica uma nuclease dedo de zinco direcionada e, opcionalmente, pelo menos um polinucleotídeo acessório. O método compreende ainda a incubação do embrião ou célula para permitir a expressão da nuclease dedo de zinco, em que uma quebra de fita dupla introduzida na sequência cromossômica direcionada pela nuclease dedo de zinco é reparada por um processo de reparo de DNA de união de extremidades não homólogas propenso a erros ou um processo de reparo de DNA dirigido por homologia. O método de edição de sequências cromossômicas que codificam uma proteína associada ao desenvolvimento da linha germinativa usando a tecnologia de nuclease dedo de zinco direcionada é rápido, preciso e altamente eficiente.

[0449] Alternativamente, o polipeptídeo de ligação a DNA é um domínio de ligação a DNA de GAL4. A GAL4 é um transativador modular em Saccharomyces cerevisiae, mas também opera como um transativador em muitos outros organismos. Ver, por exemplo, Sadowski et al. (1988) Nature 335: 563-4. Neste sistema regulatório, a expressão de genes que codificam enzimas da via metabólica da galactose em S. cerevisiae é estritamente regulada pela fonte de carbono disponível. Johnston (1987) Microbiol. Rev. 51: 458-76. O controle transcripcional dessas enzimas metabólicas é mediado pela interação entre a proteína reguladora positiva, GAL4, e uma sequência de DNA simétrica de 17 pb à qual GAL4 se liga especificamente (a sequência de ativação a montante (UAS)).

[0450] A GAL4 nativa consiste em 881 resíduos de aminoácidos, com um peso molecular de 99 kDa. A GAL4 compreende domínios funcionalmente autônomos, as atividades combinadas dos quais são responsáveis pela atividade de GAL4 in vivo. Ma e Ptashne (1987) Cell 48: 847-53); Brent e Ptashne (1985) Cell 43 (3 Pt 2): 729-36. Os 65 aminoácidos N-

terminais de GAL4 compreendem o domínio de ligação a DNA de GAL4.

Keegan et al. (1986) Science 231: 699-704; Johnston (1987) Nature 328: 353-

5. A ligação sequência-específica requer a presença de um cátion bivalente coordenado por seis resíduos Cys presentes no domínio de ligação ao DNA. O domínio contendo cátions coordenados interage com e reconhece um tripleto CCG conservado em cada extremidade do UAS de 17 pb por meio de contatos diretos com o sulco principal da hélice de DNA. Marmorstein et al. (1992) Nature 356: 408-14. A função de ligação a DNA da proteína posiciona os domínios de ativação transcripcional C-terminal na vizinhança do promotor, de modo que os domínios de ativação podem dirigir a transcrição.

[0451] Polipeptídeos de ligação a DNA adicionais que podem ser usados incluem, por exemplo e sem limitação, uma sequência de ligação de um gene induzível por AVRBS3; uma sequência de ligação consenso de um gene induzível por AVRBS3 ou sequência de ligação sintética projetada a partir dele (por exemplo, domínio de ligação a DNA UPA); TAL; LexA (ver, por exemplo, Brent & Ptashne (1985), supra); LacR (ver, por exemplo, Labow et al.

(1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343-56; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 88 (12): 5072-6); um receptor de hormônio esteróide (Elliston et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 11517-121); o repressor Tet (Patente U.S. nº 6.271.341) e um repressor Tet mutado que se liga a uma sequência de operador tet na presença, mas não na ausência, de tetraciclina (Tc); o domínio de ligação a DNA de NF-kappaB; e componentes do sistema regulatório descrito em Wang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (17): 8180-4, que utiliza uma fusão de GAL4, um receptor de hormônio, e VP16.

[0452] O domínio de ligação a DNA de uma ou mais das nucleases usadas nos métodos e composições aqui descritos pode compreender um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL de ocorrência natural ou projetado (de ocorrência não natural). Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. nº 2011/0301073.

[0453] Alternativamente, a nuclease pode compreender um sistema CRISPR. Por exemplo, a nuclease pode compreender um sistema CRISPR/Cas.

[0454] O sistema (associado ao CRISPR) evoluiu em bactérias e arqueas como um sistema imunológico adaptativo para se defender contra o ataque viral. Após a exposição a um vírus, segmentos curtos de DNA viral são integrados no locus CRISPR. O RNA é transcrito a partir de uma porção do locus CRISPR que inclui a sequência viral. Esse RNA, que contém a sequência complementar ao genoma viral, medeia o direcionamento de uma proteína Cas (por exemplo, proteína Cas9) para a sequência no genoma viral. A proteína Cas cliva e, assim, silencia o alvo viral. Recentemente, o sistema CRISPR/ Cas foi adaptado para edição de genoma em células eucarióticas. A introdução de quebras de fita dupla (DSBs) sítio-específicas permite a alteração da sequência alvo por meio de um dos dois mecanismos de reparo de DNA endógeno - união de extremidades não homólogas (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR). O sistema CRISPR/ Cas também tem sido usado para a regulação gênica, incluindo repressão e ativação da transcrição sem alterar a sequência alvo. A regulação gênica direcionada com base no sistema CRISPR/ Cas pode, por exemplo, usar um Cas9 enzimaticamente inativo (também conhecido como Cas9 cataliticamente morto).

[0455] Os sistemas CRISPR/ Cas incluem um locus CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas), que codifica componentes de RNA do sistema, e um locus Cas (associado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565- 1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al.,

2006. Biol. Diret 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60). Os loci

CRISPR em hospedeiros microbianos contêm uma combinação de genes Cas, bem como elementos de RNA não codificantes capazes de programar a especificidade da clivagem de ácido nucleico mediada por CRISPR.

[0456] O CRISPR Tipo II é um dos sistemas mais bem caracterizados e realiza quebra de fita dupla de DNA direcionada na natureza em quatro etapas sequenciais. Primeiro, dois RNAs não codificantes, a matriz de pré-crRNA e tracrRNA, são transcritos a partir do locus CRISPR. Em segundo lugar, o tracrRNA hibridiza para as regiões de repetição do pré-crRNA e medeia o processamento de pré-crRNA em crRNAs maduros contendo sequências espaçadoras individuais. Terceiro, o complexo crRNA: tracrRNA maduro direciona Cas9 para o DNA alvo via emparelhamento de bases Watson-Crick entre o espaçador no crRNA e o protoespaçador no DNA alvo próximo ao motivo adjacente do protoespaçador (PAM), um requisito adicional para o reconhecimento do alvo. Finalmente, Cas9 medeia a clivagem do DNA alvo para criar uma quebra de fita dupla dentro do protoespaçador.

[0457] Para uso do sistema CRISPR/ Cas para criar inserções e deleções direcionadas, os dois RNAs não codificantes (crRNA e o TracrRNA) podem ser substituídos por um único RNA referido como um RNA guia (gRNA).

A atividade do sistema CRISPR/ Cas compreende três etapas: (i) inserção de sequências de DNA exógenas na matriz CRISPR para evitar ataques futuros, em um processo denominado “adaptação”, (ii) expressão das proteínas relevantes, bem como expressão e processamento da matriz, seguido por (iii) interferência mediada por RNA com o ácido nucleico estranho. Na célula bacteriana, várias proteínas Cas estão envolvidas com a função natural do sistema CRISPR/ Cas e desempenham papéis em funções como a inserção do DNA estranho, etc.

[0458] A proteína Cas pode ser um “derivado funcional” de uma proteína Cas de ocorrência natural. Um “derivado funcional” de um polipeptídeo de sequência nativa é um composto com uma propriedade biológica qualitativa em comum com um polipeptídeo de sequência nativa. “Derivados funcionais” incluem, mas não estão limitados a fragmentos de uma sequência nativa e derivados de um polipeptídeo de sequência nativa e seus fragmentos, desde que tenham uma atividade biológica em comum com um polipeptídeo de sequência nativa correspondente. Uma atividade biológica aqui contemplada é a capacidade do derivado funcional de hidrolisar um substrato de DNA em fragmentos. O termo “derivado” abrange ambas as variantes de sequência de aminoácidos de polipeptídeo, modificações covalentes e fusões dos mesmos.

Derivados adequados de um polipeptídeo Cas ou um fragmento do mesmo incluem, mas não estão limitados a mutantes, fusões, modificações covalentes da proteína Cas ou um fragmento da mesma. A proteína Cas, que inclui a proteína Cas ou um fragmento da mesma, bem como derivados da proteína Cas ou um fragmento dos mesmos, pode ser obtida a partir de uma célula ou sintetizada quimicamente ou por uma combinação desses dois procedimentos.

A célula pode ser uma célula que produz naturalmente a proteína Cas, ou uma célula que produz naturalmente a proteína Cas e é geneticamente modificada para produzir a proteína Cas endógena em um nível de expressão mais alto ou para produzir uma proteína Cas a partir de um ácido nucleico introduzido exogenamente, cujo ácido nucleico codifica uma Cas que é a mesma ou diferente da Cas endógena. Em alguns casos, a célula não produz naturalmente a proteína Cas e é geneticamente modificada para produzir uma proteína Cas.

[0459] Quando um animal ou célula, conforme descrito neste documento, foi geneticamente editado usando um sistema CRISPR, um sistema CRISPR/Cas9 pode ser usado para gerar o animal ou célula. Para usar Cas9 para editar sequências genômicas, a proteína pode ser entregue diretamente a uma célula. Alternativamente, um mRNA que codifica Cas9 pode ser entregue a uma célula, ou um gene que fornece a expressão de um mRNA que codifica Cas9 pode ser entregue a uma célula. Além disso, tanto o crRNA específico do alvo quanto um tracrRNA podem ser entregues diretamente a uma célula ou o(s) gRNA(s) específico(s) do alvo podem ser a uma célula (esses RNAs podem ser alternativamente produzidos por um gene construído para expressar esses RNAs). A seleção de sítios alvo e projetada de crRNA/ gRNA são bem conhecidos na técnica. Uma discussão sobre construção e clonagem de gRNAs pode ser encontrada em http://www.genome- engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/CRISPR-Reagent- Description-Rev20140509.pdf.

[0460] Um polipeptídeo de ligação a DNA pode reconhecer especificamente e se ligar a uma sequência de nucleotídeos alvo compreendida dentro de um ácido nucleico genômico de um organismo hospedeiro. Qualquer número de instâncias discretas da sequência de nucleotídeos alvo pode ser encontrado no genoma do hospedeiro em alguns exemplos. A sequência de nucleotídeos alvo pode ser rara dentro do genoma do organismo (por exemplo, menos do que cerca de 10, cerca de 9, cerca de 8, cerca de 7, cerca de 6, cerca de 5, cerca de 4, cerca de 3, cerca de 2 ou cerca de 1 cópia(s) da sequência alvo podem existir no genoma). Por exemplo, a sequência de nucleotídeos alvo pode estar localizada em um único sítio dentro do genoma do organismo. As sequências de nucleotídeos alvo podem ser, por exemplo e sem limitação, dispersas aleatoriamente ao longo do genoma em relação umas às outras; localizadas em diferentes grupos de ligação no genoma; localizadas no mesmo grupo de ligação; localizadas em cromossomos diferentes; localizadas no mesmo cromossomo; localizadas no genoma em sítios que são expressos sob condições semelhantes no organismo (por exemplo, sob o controle do mesmo, ou de fatores reguladores substancialmente funcionalmente idênticos); e localizadas próximas umas das outras no genoma (por exemplo, as sequências alvo podem estar compreendidas em ácidos nucleicos integrados como concatemers em loci genômicos).

ENDONUCLEASES DE DIRECIONAMENTO

[0461] Um polipeptídeo de ligação a DNA que reconhece especificamente e se liga a uma sequência de nucleotídeo alvo pode estar compreendido dentro de um polipeptídeo quimérico, de modo a conferir ligação específica à sequência alvo sobre o polipeptídeo quimérico. Em exemplos, tal polipeptídeo quimérico pode compreender, por exemplo e sem limitação, polipeptídeos de nuclease, recombinase e/ou ligase, como esses polipeptídeos são descritos acima. Polipeptídeos quiméricos compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA e um polipeptídeo de nuclease, recombinase e/ou ligase também podem compreender outros motivos polipeptídicos funcionais e/ou domínios, tais como, por exemplo e sem limitação: uma sequência espaçadora posicionada entre os polipeptídeos funcionais na proteína quimérica; um peptídeo líder; um peptídeo que direciona a proteína de fusão a uma organela (por exemplo, o núcleo); polipeptídeos que são clivados por uma enzima celular; marcadores de peptídeos (por exemplo, Myc, His, etc.); e outras sequências de aminoácidos que não interferem com a função do polipeptídeo quimérico.

[0462] Polipeptídeos funcionais (por exemplo, polipeptídeos de ligação a DNA e polipeptídeos de nuclease) em um polipeptídeo quimérico podem ser operativamente ligados. Os polipeptídeos funcionais de um polipeptídeo quimérico podem ser operativamente ligados pela sua expressão a partir de um único polinucleotídeo que codifica pelo menos os polipeptídeos funcionais ligados uns aos outros na estrutura, de modo a criar um gene quimérico que codifica uma proteína quimérica. Alternativamente, os polipeptídeos funcionais de um polipeptídeo quimérico podem ser operativamente ligados por outros meios, tais como por reticulação de polipeptídeos expressos independentemente.

[0463] Um polipeptídeo de ligação a DNA, ou RNA guia que reconhece especificamente e se liga a uma sequência de nucleotídeo alvo pode estar compreendido dentro de uma proteína isolada natural (ou mutante da mesma), em que a proteína isolada natural, ou mutante da mesma, também compreende um polipeptídeo de nuclease (e também pode compreender um polipeptídeo de recombinase e/ou ligase). Exemplos de tais proteínas isoladas incluem TALENs, recombinases (por exemplo, Cre, Hin, Tre e FLP recombinase), CRISPR/Cas9 guiada por RNA e meganucleases.

[0464] Tal como aqui utilizado, o termo “endonuclease de direcionamento” refere-se a proteínas isoladas naturais ou projetadas e mutantes das mesmas que compreendem um polipeptídeo de ligação a DNA ou RNA guia e um polipeptídeo de nuclease, bem como polipeptídeos quiméricos compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA ou RNA guia e uma nuclease. Qualquer endonuclease de direcionamento compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA ou RNA guia que especificamente reconhece e se liga a uma sequência de nucleotídeos alvo compreendida dentro de um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 (por exemplo, porque a sequência alvo está compreendida dentro da sequência nativa no locus, ou porque a sequência alvo foi introduzida no locus, por exemplo, por recombinação) pode ser usada.

[0465] Alguns exemplos de polipeptídeos quiméricos adequados incluem, sem limitação, combinações dos seguintes polipeptídeos: polipeptídeos de ligação a DNA dedo de zinco; um polipeptídeo de nuclease FokI; domínios TALE; zíperes de leucina; motivos de ligação a DNA do fator de transcrição; e domínios de reconhecimento e/ou clivagem de DNA isolados de, por exemplo e sem limitação, um TALEN, uma recombinase (por exemplo, recombinases Cre, Hin, RecA, Tre e FLP), CRISPR/Cas9 guiado por RNA, uma meganuclease; e outros conhecidos dos técnicos no assunto. Exemplos particulares incluem uma proteína quimérica compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA sítio-específico e um polipeptídeo de nuclease. Os polipeptídeos quiméricos podem ser projetados por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto para alterar a sequência de reconhecimento de um polipeptídeo de ligação a DNA compreendido no polipeptídeo quimérico, de modo a direcionar o polipeptídeo quimérico para uma sequência de nucleotídeos particular de interesse.

[0466] O polipeptídeo quimérico pode compreender um domínio de ligação a DNA (por exemplo, dedo de zinco, domínio efetor de TAL, etc.) e um domínio de nuclease (clivagem). O domínio de clivagem pode ser heterólogo ao domínio de ligação a DNA, por exemplo, um domínio de ligação a DNA dedo de zinco e um domínio de clivagem de uma nuclease ou um domínio de ligação a DNA TALEN e um domínio de clivagem, ou domínio de ligação a DNA de meganuclease e domínio de clivagem de uma nuclease diferente. Os domínios de clivagem heterólogos podem ser obtidos a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. Endonucleases exemplificativas das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitadas a endonucleases de restrição e endonucleases teleguiadas. Ver, por exemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass.; e Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388. Enzimas adicionais que clivam o DNA são conhecidas (por exemplo, 51 Nuclease; nuclease de feijão mungo; DNAse I pancreática; nuclease microcócica; endonuclease de levedura HO; ver também Linn et al. (Eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas como uma fonte de domínios de clivagem e meios-domínios de clivagem.

[0467] Da mesma forma, um meio-domínio de clivagem pode ser derivado de qualquer nuclease ou porção da mesma, conforme estabelecido acima, que requer dimerização para atividade de clivagem. Em geral, duas proteínas de fusão são necessárias para a clivagem se as proteínas de fusão compreenderem meios-domínios de clivagem. Alternativamente, pode ser usada uma única proteína compreendendo dois meios-domínios de clivagem.

Os dois meios-domínios de clivagem podem ser derivados da mesma endonuclease (ou fragmentos funcionais das mesmas), ou cada meio-domínio de clivagem pode ser derivado de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais das mesmas). Além disso, os sítios alvo para as duas proteínas de fusão estão preferencialmente dispostos, um em relação ao outro, de modo que a ligação das duas proteínas de fusão aos seus respectivos sítios alvo coloque os meios-domínios de clivagem em uma orientação espacial entre si que permite que os meio-domínios de clivagem formem um domínio de clivagem funcional, por exemplo, por dimerização. Assim, as bordas próximas dos sítios alvo podem ser separadas por 5-8 nucleotídeos ou por 15-18 nucleotídeos. No entanto, qualquer número inteiro de nucleotídeos, ou pares de nucleotídeos, pode intervir entre dois sítios alvo (por exemplo, de 2 a 50 pares de nucleotídeos ou mais). Em geral, o sítio de clivagem fica entre os sítios alvo.

[0468] Endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação sequência-específica ao DNA (em um sítio de reconhecimento) e clivagem de DNA em ou próximo ao sítio de ligação, por exemplo, de tal modo que um ou mais sequências exógenas (doadores/ transgenes) são integradas em ou próximo aos sítios de ligação (alvo). Certas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) clivam o DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima Fok I do Tipo IIS catalisa a clivagem de fita dupla de DNA, em 9 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento em uma fita e 13 nucleotídeos de seu sítio de reconhecimento na outra. Ver, por exemplo, Patente U.S. nº 5.356.802; 5.436.150 e 5.487.994; bem como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4275-4279; Li et al.

(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 91: 883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 31.978-

31.982. Assim, as proteínas de fusão podem compreender o domínio de clivagem (ou meio-domínio de clivagem) de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco, que podem ou não ser projetados.

[0469] Uma enzima de restrição do Tipo IIS exemplificativa, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fok I. Esta enzima particular é ativa como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 95: 10.570-10.575. Por conseguinte, para os fins da presente invenção, a porção da enzima Fok I usada nas proteínas de fusão reveladas é considerada um meio-domínio de clivagem. Assim, para clivagem de fita dupla direcionada e/ ou substituição direcionada de sequências celulares usando fusões de dedo de zinco-Fok I, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um meio- domínio de clivagem FokI, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma única molécula de polipeptídeo contendo um domínio de ligação a DNA e dois meios-domínios de clivagem Fok I também pode ser usada.

[0470] Um domínio de clivagem ou meio-domínio de clivagem pode ser qualquer porção de uma proteína que retém a atividade de clivagem ou que retém a capacidade de multimerizar (por exemplo, dimerizar) para formar um domínio de clivagem funcional.

[0471] Enzimas de restrição do Tipo IIS exemplificativas são descritas na Publicação de Patente U.S. nº 2007/0134796. Enzimas de restrição adicionais também contêm domínios de ligação e clivagem separáveis, e estes são contemplados pela presente invenção. Ver, por exemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 418-420.

[0472] O domínio de clivagem pode compreender um ou mais meios-domínios de clivagem projetados (também referidos como mutantes de domínio de dimerização) que minimizam ou evitam a homodimerização, como descrito, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. nº 2005/0064474; 2006/0188987 e 2008/0131962.

[0473] Alternativamente, as nucleases podem ser montadas in vivo no sítio alvo de ácido nucleico usando a chamada tecnologia de “enzima dividida” (ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. nº 20090068164). Os componentes de tais enzimas divididas podem ser expressos em construtos de expressão separados ou podem ser ligados em um quadro aberto de leitura onde os componentes individuais são separados, por exemplo, por um peptídeo 2A autoclivável ou sequência IRES. Os componentes podem ser domínios de ligação de dedo de zinco individuais ou domínios de um domínio de ligação de ácido nucleico de meganuclease.

NUCLEASES DEDO DE ZINCO

[0474] Um polipeptídeo quimérico pode compreender uma nuclease dedo de zinco (ZFN) projetada sob medida que pode ser projetada para entregar uma quebra de DNA de fita dupla sítio-específica direcionada na qual um ácido nucleico exógeno, ou DNA doador, pode ser integrado (ver publicação de patente US 2010/0257638). As ZFNs são polipeptídeos quiméricos contendo um domínio de clivagem não específico de uma endonuclease de restrição (por exemplo, FokI) e um polipeptídeo de domínio de ligação a DNA de dedo de zinco. Ver, por exemplo, Huang et al. (1996) J.

Protein Chem. 15: 481-9; Kim et al. (1997a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 3616-20; Kim et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1156-60; Kim et al.

(1994) Proc Natl. Acad. Sci. USA 91: 883-7; Kim et al. (1997b) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 94: 12875-9; Kim et al. (1997c) Gene 203: 43-9; Kim et al. (1998) Biol.

Chem. 379: 489-95; Nahon e Raveh (1998) Nucleic Acids Res. 26: 1233-9; Smith et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 674-81. As ZFNs podem compreender domínios de ligação a DNA dedo de zinco não canônicos (consulte a publicação de patente US 2008/0182332). A endonuclease de restrição FokI deve dimerizar através do domínio de nuclease, a fim de clivar o DNA e introduzir uma quebra de fita dupla. Consequentemente, as ZFNs contendo um domínio de nuclease de tal endonuclease também requerem dimerização do domínio de nuclease a fim de clivar o DNA alvo. Mani et al.

(2005) Biochem. Biophys. Res. Comum. 334: 1191-7; Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28: 3361-9. A dimerização da ZFN pode ser facilitada por dois sítios de ligação a DNA adjacentes e opostamente orientados. Id.

[0475] Um método para a integração sítio-específica de um ácido nucleico exógeno em pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 de um hospedeiro pode compreender introduzir, em uma célula do hospedeiro, uma ZFN, em que a ZFN reconhece e se liga a uma sequência de nucleotídeos alvo, em que a sequência de nucleotídeos alvo está compreendida em pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 do hospedeiro. Em certos exemplos, a sequência de nucleotídeos alvo não está compreendida no genoma do hospedeiro em qualquer outra posição além do pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1. Por exemplo, um polipeptídeo de ligação a DNA da ZFN pode ser projetado para reconhecer e se ligar a uma sequência de nucleotídeos alvo identificada no pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 (por exemplo, por sequenciamento do locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1). Um método para a integração sítio-específica de um ácido nucleico exógeno em pelo menos um locus de desempenho ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 de um hospedeiro que compreende a introdução, em uma célula do hospedeiro, de uma ZFN, também pode compreender a introdução, na célula,

de um ácido nucleico exógeno, em que a recombinação do ácido nucleico exógeno em um ácido nucleico do hospedeiro compreendendo pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 é facilitada pelo reconhecimento sítio- específico e ligação da ZFN à sequência alvo (e subsequente clivagem do ácido nucleico compreendendo o locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1).

ÁCIDOS NUCLEICOS EXÓGENOS OPCIONAIS PARA INTEGRAÇÃO EM UM LOCUS ANPEP, CD163 OU SIGLEC1

[0476] Ácidos nucleicos exógenos para integração em um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 incluem: um ácido nucleico exógeno para integração sítio-específica em pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1, por exemplo e sem limitação, um ORF; um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma endonuclease de direcionamento; e um vetor compreendendo pelo menos um de cada ou ambos os anteriores. Assim, ácidos nucleicos particulares incluem sequências de nucleotídeos que codificam um polipeptídeo, sequências de nucleotídeos estruturais e/ou sítios de ligação e reconhecimento de polipeptídeo de ligação a DNA.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO EXÓGENO OPCIONAIS PARA INTEGRAÇÃO SÍTIO- ESPECÍFICA

[0477] Como observado acima, a inserção de uma sequência exógena (também chamada de “sequência doadora” ou “doador” ou “transgene”) é fornecida, por exemplo, para a expressão de um polipeptídeo, correção de um gene mutante ou para expressão aumentada de um gene de tipo selvagem. Será facilmente evidente que a sequência doadora tipicamente não é idêntica à sequência genômica onde é colocada. Uma sequência doadora pode conter uma sequência não homóloga flanqueada por duas regiões de homologia para permitir o reparo dirigido por homologia (HDR) eficiente no local de interesse. Além disso, as sequências doadoras podem compreender uma molécula de vetor contendo sequências que não são homólogas à região de interesse na cromatina celular. Uma molécula doadora pode conter várias regiões descontínuas de homologia com a cromatina celular. Por exemplo, para a inserção direcionada de sequências normalmente não presentes em uma região de interesse, as referidas sequências podem estar presentes em uma molécula de ácido nucleico doadora e flanqueada por regiões de homologia para sequenciar na região de interesse.

[0478] O polinucleotídeo doador pode ser DNA ou RNA, de fita simples ou de fita dupla e pode ser introduzido em uma célula na forma linear ou circular. Ver, por exemplo, Publicação de Patente U.S. nº 2010/0047805, 2011/0281361, 2011/0207221 e 2013/0326645. Se introduzida na forma linear, as extremidades da sequência doadora podem ser protegidas (por exemplo, da degradação exonucleolítica) por métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. Por exemplo, um ou mais resíduos de didesoxinucleotídeos são adicionados ao terminal 3’ de uma molécula linear e/ou oligonucleotídeos autocomplementares são ligados a uma ou ambas as extremidades. Ver, por exemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272: 886-889. Métodos adicionais para proteger polinucleotídeos exógenos da degradação incluem, mas não estão limitados a adição de grupo(s) amino terminal e o uso de ligações internucleotídicas modificadas, tais como, por exemplo, fosforotioatos, fosforamidatos e resíduos de O-metil ribose ou desoxirribose.

[0479] Um polinucleotídeo pode ser introduzido em uma célula como parte de uma molécula de vetor com sequências adicionais, tais como, por exemplo, origens de replicação, promotores e genes que codificam resistência a antibióticos. Além disso, os polinucleotídeos doadores podem ser introduzidos como ácido nucleico puro, como ácido nucleico complexado com um agente tal como um lipossoma ou poloxâmero, ou podem ser entregues por vírus (por exemplo, adenovírus, AAV, herpesvírus, retrovírus, lentivírus e lentivírus defeituoso da integrasse (IDLV)).

[0480] O doador é, de modo geral, integrado de modo que sua expressão seja conduzida pelo promotor endógeno no sítio de integração, ou seja, o promotor que conduz a expressão do gene endógeno no qual o doador está integrado (por exemplo, ANPEP, CD163 ou SIGLEC1). No entanto, será evidente que o doador pode compreender um promotor e/ou potencializador, por exemplo um promotor constitutivo ou um promotor induzível ou específico de tecido.

[0481] Além disso, embora não sejam necessárias para a expressão, as sequências exógenas também podem incluir sequências regulatórias da transcrição ou tradução, por exemplo, promotores, potencializadores, isoladores, sítios de entrada do ribossomo interno, sequências que codificam os peptídeos 2A e/ou sinais de poliadenilação.

[0482] Os ácidos nucleicos exógenos que podem ser integrados de uma maneira sítio-específica em pelo menos um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1, de modo a modificar o locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 incluem, por exemplo e sem limitação, os ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse; ácidos nucleicos compreendendo um gene agronômico; ácidos nucleicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma molécula de RNAi; ou ácidos nucleicos que interrompem o gene ANPEP, CD163 ou SIGLEC1.

[0483] Um ácido nucleico exógeno pode ser integrado em um locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1, de modo a modificar o locus ANPEP, CD163 ou SIGLEC1, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo de interesse, de modo que a sequência de nucleotídeos é expressa no hospedeiro a partir do locus ANPEP,

CD163 ou SIGLEC1. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de interesse (por exemplo, uma proteína estranha) é expresso a partir de uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de interesse em quantidades comerciais. Em tais exemplos, o polipeptídeo de interesse pode ser extraído da célula hospedeira, tecido ou biomassa.

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE COMPREENDEM UMA SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS QUE CODIFICA UMA ENDONUCLEASE DE DIRECIONAMENTO

[0484] Uma sequência de nucleotídeos que codifica uma endonuclease de direcionamento pode ser projetada por manipulação (por exemplo, ligação) de sequências de nucleotídeos nativas que codificam polipeptídeos compreendidos na endonuclease de direcionamento. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos de um gene que codifica uma proteína compreendendo um polipeptídeo de ligação a DNA pode ser inspecionada para identificar a sequência de nucleotídeos do gene que corresponde ao polipeptídeo de ligação a DNA, e essa sequência de nucleotídeos pode ser usada como um elemento de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma endonuclease de direcionamento compreendendo o polipeptídeo de ligação a DNA. Alternativamente, a sequência de aminoácidos de uma endonuclease de direcionamento pode ser usada para deduzir uma sequência de nucleotídeos que codifica a endonuclease de direcionamento, por exemplo, de acordo com a degenerescência do código genético.

[0485] Em moléculas de ácido nucleico exemplificativas compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma endonuclease de direcionamento, o último códon de uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de nuclease e o primeiro códon de uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação a DNA podem ser separados por qualquer número de tripletos de nucleotídeos, por exemplo, sem codificação para um íntron ou um “STOP”. Da mesma forma, o último códon de uma sequência de nucleotídeos que codifica uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação a DNA e o primeiro códon de uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de nuclease podem ser separados por qualquer número de tripletos de nucleotídeos. O último códon (ou seja, o mais 3’ na sequência de ácido nucleico) de uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de nuclease e uma segunda sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de ligação a DNA, podem ser fundidos no registro de fase com o primeiro códon de um outra sequência de codificação de polinucleotídeo diretamente contígua a ela, ou separada dela por não mais do que uma curta sequência de peptídeo, tal como aquela codificada por um ligante de nucleotídeo sintético (por exemplo, um ligante de nucleotídeo que pode ter sido usado para conseguir a fusão).

Exemplos de tais sequências polinucleotídicas adicionais incluem, por exemplo e sem limitação, marcadores, peptídeos de direcionamento e sítios de clivagem enzimática. Da mesma forma, o primeiro códon do mais 5’ (na sequência de ácido nucleico) da primeira e segunda sequências polinucleotídicas pode ser fundido no registro de fase com o último códon de uma sequência de codificação de polinucleotídeo adicional diretamente contígua a ela, ou separada dela por não mais do que uma curta sequência de peptídeo.

[0486] Uma sequência que separa sequências polinucleotídicas que codificam polipeptídeos funcionais em uma endonuclease de direcionamento (por exemplo, um polipeptídeo de ligação a DNA e um polipeptídeo de nuclease) pode, por exemplo, consistir em qualquer sequência, de modo que a sequência de aminoácidos codificada não é susceptível de significativamente alterar a tradução da endonuclease de direcionamento. Devido à natureza autônoma de polipeptídeos de nuclease conhecidos e polipeptídeos de ligação a DNA conhecidos, as sequências intervenientes não irão interferir com as respectivas funções dessas estruturas.

OUTROS MÉTODOS DE INATIVAÇÃO (KNOCKOUT)

[0487] Várias outras técnicas conhecidas na técnica podem ser usadas para inativar genes para fazer animais knockout e/ou para introduzir construtos de ácido nucleico em animais para produzir animais fundadores e para fazer linhagens de animais, em que o construto de inativação ou ácido nucleico está integrado no genoma. Tais técnicas incluem, sem limitação, microinjeção pronuclear (Patente US nº 4.873.191), transferência de genes mediada por retrovírus em linhas germinativas (Van der Putten et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-1652), direcionamento de genes em células-tronco embrionárias (Thompson et al. (1989) Cell 56, 313-321), eletroporação de embriões (Lo (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814), transferência de genes mediada por espermatozóide (Lavitrano et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 14230-14235; Lavitrano et al. (2006) Reprod.

Fert. Develop. 18, 19-23), e transformação in vitro de células somáticas, tais como células de cúmulos ou mamárias, ou células-tronco adultas, fetais ou embrionárias, seguido por transplante nuclear (Wilmut et al. (1997) Nature 385, 810-813; e Wakayama et al. (1998) Nature 394, 369-374). Microinjeção pronuclear, transferência de genes mediada por espermatozóide e transferência nuclear de células somáticas são técnicas particularmente úteis.

Um animal que é genomicamente modificado é um animal em que todas as suas células têm a modificação, incluindo suas células da linha germinativa.

Quando são usados métodos que produzem um animal que é mosaico em sua modificação, os animais podem ser consanguíneos e a progênie que é genomicamente modificada pode ser selecionada. A clonagem, por exemplo, pode ser usada para fazer um animal mosaico se suas células forem modificadas no estado de blastocisto, ou a modificação genômica pode ocorrer quando uma única célula é modificada. Animais que são modificados para não amadurecerem sexualmente podem ser homozigotos ou heterozigotos para a modificação, dependendo da abordagem específica que é usada. Se um determinado gene for inativado por uma modificação de inativação, a homozigosidade normalmente seria necessária. Se um determinado gene for inativado por uma interferência de RNA ou estratégia negativa dominante, a heterozigosidade é frequentemente adequada.

[0488] Normalmente, na microinjeção de embrião/ zigoto, um construto de ácido nucleico ou mRNA é introduzido em um óvulo fertilizado; um ou dois óvulos fertilizados com células são usados como a estrutura nuclear que contém o material genético da cabeça do espermatozóide e o óvulo é visível dentro do protoplasma. Óvulos fertilizados em estágio pronuclear podem ser obtidos in vitro ou in vivo (isto é, recuperados cirurgicamente do oviduto de animais doadores). Óvulos fertilizados in vitro podem ser produzidos da seguinte forma. Por exemplo, ovários suínos podem ser coletados em um matadouro e mantidos a 22-28 °C durante o transporte. Os ovários podem ser lavados e isolados para aspiração folicular, e folículos variando de 4–8 mm podem ser aspirados para tubos cônicos de centrífuga de 50 mL usando agulhas de calibre 18 e sob vácuo. O fluido folicular e os oócitos aspirados podem ser enxaguados através de pré-filtros com TL-HEPES comercial (Minitube, Verona, Wis.). Oócitos rodeados por uma massa de cúmulos compacta podem ser selecionados e colocados no MEIO DE MATURAÇÃO DE OÓCITOS TCM-199 (Minitube, Verona, Wis.) suplementado com 0,1 mg/ml de cisteína, 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico, 10% de fluido folicular suíno, 50 µM de 2-mercaptoetanol, 0,5 mg/ml de cAMP, 10 IU/ml cada de gonadotrofina de soro de égua grávida (PMSG) e gonadotrofina coriônica humana (hCG) por aproximadamente 22 horas em ar umidificado a 38,7 °C e 5% de CO2. Posteriormente, os oócitos podem ser movidos para meio de maturação TCM-199 fresco, que não conterá cAMP, PMSG ou hCG e incubados por mais 22 horas. Oócitos maduros podem ser retirados de suas células de cúmulos por vórtex em hialuronidase a 0,1% por 1 minuto.

[0489] Para suínos, oócitos maduros podem ser fertilizados em 500 µl de sistema de meio Minitube PORCPRO IVF (Minitube, Verona, Wis.) em placas de fertilização de 5 poços Minitube. Na preparação para a fertilização in vitro (IVF), o sêmen de varrão recém-coletado ou congelado pode ser lavado e ressuspenso em meio de PORCPRO IVF até 400.000 espermatozóides. As concentrações de espermatozóide podem ser analisadas por análise de sêmen assistida por computador (SPERMVISION, Minitube, Verona, Wis.). A inseminação final in vitro pode ser realizada em um volume de 10 µl a uma concentração final de aproximadamente 40 espermatozóides móveis/ oócito, dependendo do varrão. Todos os oócitos fertilizantes podem ser incubados a 38,7 °C em atmosfera de 5,0% de CO2 por seis horas. Seis horas após a inseminação, os presumíveis zigotos podem ser lavados duas vezes em NCSU-23 e transferidos para 0,5 ml do mesmo meio. Este sistema pode produzir 20-30% de blastocistos rotineiramente na maioria dos varrões com uma taxa de inseminação polispérmica de 10-30%.

[0490] Construtos de ácido nucleico linearizado ou mRNA podem ser injetados em um dos pronúcleos ou no citoplasma. Em seguida, os óvulos injetados podem ser transferidos para uma fêmea receptora (por exemplo, nos ovidutos de uma fêmea receptora) e deixados se desenvolver na fêmea receptora para produzir os animais transgênicos ou com edição genética. Em particular, embriões fertilizados in vitro podem ser centrifugados a 15.000 x g por 5 minutos para sedimentar lipídios permitindo a visualização do pró-núcleo.

Os embriões podem ser injetados usando um injetor Eppendorf FEMTOJET e podem ser cultivados até a formação de blastocisto. As taxas de clivagem do embrião e formação e qualidade de blastocisto podem ser registradas.

[0491] Os embriões podem ser transferidos cirurgicamente para o útero de receptores assíncronos. Normalmente, 100-200 (por exemplo, 150- 200) embriões podem ser depositados na junção ampola-istmo do oviduto usando um cateter TOMCAT® de 5,5 polegadas. Após a cirurgia, o exame de ultrassom em tempo real da gravidez pode ser realizado.

[0492] Na transferência nuclear de células somáticas, uma célula transgênica ou geneticamente editada, tal como um blastômero embrionário, fibroblasto fetal, fibroblasto de orelha de adulto ou célula da granulosa que inclui um construto de ácido nucleico descrito acima, pode ser introduzida em um oócito enucleado para estabelecer uma célula combinada. Os oócitos podem ser enucleados por dissecção parcial da zona perto do corpo polar e, em seguida, pressionando o citoplasma na área de dissecção. Normalmente, uma pipeta de injeção com uma ponta chanfrada afiada é usada para injetar a célula transgênica ou geneticamente editada em um oócito enucleado interrompido na meiose 2. Em algumas convenções, oócitos interrompidos na meiose-2 são denominados ovos. Depois de produzir um embrião suíno ou bovino (por exemplo, por fusão e ativação do oócito), o embrião é transferido para os ovidutos de uma fêmea receptora, cerca de 20 a 24 horas após a ativação. Ver, por exemplo, Cibelli et al. (1998) Science 280, 1256-1258 e patente U.S. nº 6.548.741, 7.547.816, 7.989.657 ou 6.211.429. Para porcos, as fêmeas receptoras podem ser verificadas quanto à gravidez aproximadamente 20-21 dias após a transferência dos embriões.

[0493] Técnicas de reprodução padrão podem ser usadas para criar animais que são homozigotos para o gene inativado dos animais fundadores heterozigotos iniciais. A homozigosidade pode não ser necessária, no entanto. Os porcos geneticamente editados aqui descritos podem ser cruzados com outros porcos de interesse.

[0494] Uma vez que os animais geneticamente editados foram gerados, a inativação de um ácido nucleico endógeno pode ser avaliada usando técnicas padrão. A triagem inicial pode ser realizada por análise de Southern blot para determinar se a inativação ocorreu ou não. Para uma descrição da análise de Southern, consulte as seções 9.37-9.52 de Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Press, Plainview; N.Y. As técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) também podem ser utilizadas na triagem inicial.

A PCR refere-se a um procedimento ou técnica em que os ácidos nucleicos alvo são amplificados. De modo geral, a informação de sequência das extremidades da região de interesse ou além é empregada para projetar iniciadores de oligonucleotídeos que são idênticos ou semelhantes em sequência às fitas opostas do molde a ser amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas de DNA, bem como RNA, incluindo sequências de DNA genômico total ou RNA celular total. Os iniciadores têm tipicamente 14 a 40 nucleotídeos de comprimento, mas podem variar de 10 nucleotídeos a centenas de nucleotídeos de comprimento. A PCR é descrita em, por exemplo, PCR Primer: A Laboratory Manual, ed. Dieffenbach e Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press,

1995. Os ácidos nucleicos também podem ser amplificados por reação em cadeia da ligase, amplificação por deslocamento de fita, replicação de sequência auto-sustentada ou amplificação baseada em sequência de ácido nucleico. Ver, por exemplo, Lewis (1992) Genetic Engineering News 12,1; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874; e Weiss (1991) Science 254: 1292. No estágio de blastocisto, os embriões podem ser processados individualmente para análise por PCR, hibridização Southern e PCR splinkerette (ver, por exemplo, Dupuy et al. Proc Natl Acad Sci USA (2002) 99: 4495).

RNAS DE INTERFERÊNCIA

[0495] Uma variedade de sistemas de RNA de interferência (RNAi) são conhecidos. O RNA de fita dupla (dsRNA) induz a degradação sequência-específica de transcritos de genes homólogos. O complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) metaboliza o dsRNA em pequenos RNAs de interferência de 21-23 nucleotídeos (siRNAs). O RISC contém uma RNAse de fita dupla (dsRNAse, por exemplo, Dicer) e ssRNAse (por exemplo, Argonaut 2 ou Ago2). O RISC utiliza fita antisenso como um guia para encontrar um alvo clivável. Ambos siRNAs e microRNAs (miRNAs) são conhecidos. Um método de inativar um gene em um animal geneticamente editado compreende induzir a interferência de RNA contra um gene alvo e/ou ácido nucleico de modo que a expressão do gene alvo e/ou ácido nucleico seja reduzida.

[0496] Por exemplo, a sequência de ácido nucleico exógena pode induzir interferência de RNA contra um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. Por exemplo, pequeno RNA de interferência de fita dupla (siRNA) ou pequeno RNA de grampo (shRNA) homólogo a um DNA alvo pode ser usado para reduzir a expressão desse DNA. Os construtos para siRNA podem ser produzidos conforme descrito, por exemplo, em Fire et al. (1998) Nature 391: 806; Romano e Masino (1992) Mol. Microbiol. 6: 3343; Cogoni et al. (1996) EMBO J. 15: 3153; Cogoni e Masino (1999) Nature 399: 166; Misquitta e Paterson (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 1451; e Kennerdell e Carthew (1998) Cell 95: 1017. Construtos para shRNA podem ser produzidos conforme descrito por McIntyre e Fanning (2006) BMC Biotechnology 6: 1. Em geral, os shRNAs são transcritos como uma molécula de RNA de fita simples contendo regiões complementares, que podem recombinar em baixa temperatura (anneal) e formar grampos curtos.

[0497] A probabilidade de encontrar um único siRNA ou miRNA funcional individual direcionado a um gene específico é alta. A previsibilidade de uma sequência específica de siRNA, por exemplo, é de cerca de 50%, mas uma série de RNAs de interferência podem ser feitos com boa confiança de que pelo menos um deles será eficaz.

[0498] Células in vitro, células in vivo ou um animal geneticamente editado, tal como um animal de criação, que expressam um RNAi direcionado contra um gene que codifica ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 podem ser usados.

O RNAi pode ser, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em siRNA, shRNA, dsRNA, RISC e miRNA.

SISTEMAS INDUZÍVEIS

[0499] Um sistema induzível pode ser usado para inativar um gene ANPEP, CD163 ou SIGLEC1. Vários sistemas induzíveis são conhecidos que permitem o controle espacial e temporal da inativação de um gene. Vários provaram ser funcionais in vivo em animais porcinos.

[0500] Um exemplo de um sistema induzível é o sistema promotor tetraciclina (tet)-on, que pode ser usado para regular a transcrição do ácido nucleico. Neste sistema, um repressor Tet mutado (TetR) é fundido ao domínio de ativação da proteína transativadora VP 16 do vírus herpes simplex para criar um ativador transcripcional controlado por tetraciclina (tTA), que é regulado por tet ou doxiciclina (dox). Na ausência de antibiótico, a transcrição é mínima, enquanto na presença de tet ou dox, a transcrição é induzida. Os sistemas induzíveis alternativos incluem os sistemas de ecdisona ou rapamicina. A ecdisona é um hormônio da muda de inseto cuja produção é controlada por um heterodímero do receptor da ecdisona e o produto do gene ultraspiracle (USP).

A expressão é induzida por tratamento com ecdisona ou um análogo da ecdisona, como muristerona A. O agente que é administrado ao animal para desencadear o sistema induzível é referido como um agente de indução.

[0501] O sistema induzível por tetraciclina e o sistema de recombinase Cre/loxP (constitutivo ou induzível) estão entre os sistemas induzíveis mais comumente usados. O sistema induzível por tetraciclina envolve um transativador controlado por tetraciclina (tTA)/ tTA reverso (rtTA).

Um método para usar esses sistemas in vivo envolve a geração de duas linhagens de animais geneticamente editados. Uma linhagem animal expressa o ativador (tTA, rtTA ou Cre recombinase) sob o controle de um promotor selecionado. Outra linhagem de animais expressa o aceptor, no qual a expressão do gene de interesse (ou do gene a ser alterado) está sob o controle da sequência alvo para os transativadores tTA/rtTA (ou é flanqueada por sequências loxP). Cruzar os dois animais fornece controle da expressão do gene.

[0502] Os sistemas reguladores dependentes de tetraciclina (sistemas tet) dependem de dois componentes, ou seja, um transativador controlado por tetraciclina (tTA ou rtTA) e um promotor dependente de tTA/ rtTA que controla a expressão de um cDNA a jusante, em uma forma dependente de tetraciclina. Na ausência de tetraciclina ou seus derivados (como a doxiciclina), o tTA se liga às sequências tetO, permitindo a ativação transcripcional do promotor dependente de tTA. No entanto, na presença de doxiciclina, o tTA não pode interagir com seu alvo e a transcrição não ocorre. O sistema tet que usa tTA é denominado tet-OFF, porque a tetraciclina ou doxiciclina permite a regulação negativa da transcrição. A administração de tetraciclina ou seus derivados permite o controle temporal da expressão do transgene in vivo. O rtTA é uma variante do tTA que não é funcional na ausência de doxiciclina, mas requer a presença do ligante para transativação.

Este sistema tet é, portanto, denominado tet-ON. Os sistemas tet foram usados in vivo para a expressão induzível de vários transgenes, codificando, por exemplo, genes repórter, oncogenes ou proteínas envolvidas em uma cascata de sinalização.

[0503] O sistema Cre/lox usa a recombinase Cre, que catalisa a recombinação sítio-específica por cruzamento entre duas sequências de reconhecimento Cre distantes, isto é, sítios loxP. Uma sequência de DNA introduzida entre as duas sequências loxP (denominado DNA floxed) é excisada por recombinação mediada por Cre. O controle da expressão de Cre em um animal transgênico e/ou com edição genética, usando o controle espacial (com um promotor tecido- ou célula-específico) ou o controle temporal (com um sistema induzível), resulta no controle da excisão de DNA entre os dois sítios loxP. Uma aplicação é para a inativação condicional de genes (knockout condicional). Outra abordagem é para a superexpressão de proteínas, em que um códon de terminação floxed é inserido entre a sequência do promotor e o DNA de interesse. Animais geneticamente editados não expressam o transgene até que Cre seja expresso, levando à excisão do códon de terminação floxed. Esse sistema foi aplicado à oncogênese tecido- específica e à expressão controlada do receptor de antígeno em linfócitos B.

Também foram desenvolvidas recombinases Cre induzíveis. A recombinase Cre induzível é ativada apenas pela administração de um ligante exógeno. As recombinases Cre induzíveis são proteínas de fusão contendo a recombinase Cre original e um domínio de ligação ao ligante específico. A atividade funcional da recombinase Cre é dependente de um ligante externo que é capaz de se ligar a este domínio específico na proteína de fusão.

[0504] Células in vitro, células in vivo ou um animal geneticamente editado, tal como um animal de criação que compreende um gene ANPEP, CD163 ou SIGLEC1 sob controle de um sistema induzível, podem ser usados. A modificação cromossômica de um animal pode ser genômica ou em mosaico.

O sistema induzível pode ser, por exemplo, selecionado a partir do grupo que consiste em Tet-On, Tet-Off, Cre-lox e Hif1 alfa.

VETORES E ÁCIDOS NUCLÉICOS

[0505] Uma variedade de ácidos nucleicos pode ser introduzida nas células para fins de inativação, para inativação de um gene, para obter a expressão de um gene ou para outros fins. Tal como aqui utilizado, o termo ácido nucleico inclui DNA, RNA e análogos de ácido nucleico e ácidos nucleicos que são de fita dupla ou fita simples (isto é, uma fita simples senso ou uma antisenso). Os análogos de ácido nucleico podem ser modificados na fração de base, fração de açúcar ou estrutura de fosfato para melhorar, por exemplo, a estabilidade, hibridização ou solubilidade do ácido nucleico. As modificações na fração de base incluem desoxiuridina para desoxitimidina e 5- metil-2'-desoxicitidina e 5-bromo-2'-doxicitidina para desoxicitidina. As modificações da fração de açúcar incluem a modificação da hidroxila 2’ do açúcar ribose para formar açúcares 2’-O-metila ou 2’-O-alila. A estrutura de fosfato de desoxirribose pode ser modificada para produzir ácidos nucleicos de morfolino, em que cada fração de base está ligada a um anel de morfolino de seis membros ou ácidos nucleicos de peptídeo, em que a estrutura de desoxifosfato é substituída por uma estrutura de pseudopeptídeo e as quatro bases são retidas. Ver, Summerton e Weller (1997) Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7 (3): 187; e Hyrup et al. (1996) Bioorgan. Med. Chem. 4: 5. Além disso, a estrutura de desoxifosfato pode ser substituída com, por exemplo, uma estrutura de fosforotioato ou fosforoditioato, uma estrutura fosforoamidita ou uma de alquilfosfotriéster.

[0506] A sequência de ácido nucleico alvo pode ser operacionalmente ligada a uma região regulatória, tal como um promotor. As regiões regulatórias podem ser regiões regulatórias suínas ou podem ser de outras espécies. Tal como aqui utilizado, operacionalmente ligado refere-se ao posicionamento de uma região regulatória em relação a uma sequência de ácido nucleico de modo a permitir ou facilitar a transcrição do ácido nucleico alvo.

[0507] Qualquer tipo de promotor pode ser operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico alvo. Exemplos de promotores incluem, sem limitação, promotores tecido-específicos, promotores constitutivos, promotores induzíveis e promotores responsivos ou não responsivos a um estímulo particular. Os promotores tecido-específicos adequados podem resultar na expressão preferencial de um transcrito de ácido nucleico em células beta e incluem, por exemplo, o promotor de insulina humana. Outros promotores tecido-específicos podem resultar em expressão preferencial em, por exemplo, hepatócitos ou tecido cardíaco e podem incluir os promotores da albumina ou da cadeia pesada da alfa-miosina, respectivamente. Um promotor que facilita a expressão de uma molécula de ácido nucleico sem tecido significativo ou especificidade temporal, pode ser usado (ou seja, um promotor constitutivo). Por exemplo, um promotor de beta- actina, tal como o promotor do gene de beta-actina de frango, promotor de ubiquitina, promotor de miniCAGs, promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) ou promotor de 3-fosfoglicerato quinase (PGK) pode ser usado, assim como promotores virais, tais como o promotor da timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV-TK), o promotor do SV40 ou um promotor do citomegalovírus (CMV). Por exemplo, uma fusão do promotor do gene da beta actina de frango e o potencializador de CMV pode ser usada como um promotor. Ver, por exemplo, Xu et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 563; e Kiwaki et al. (1996) Hum. Gene Ther. 7: 821.

[0508] Regiões regulatórias adicionais que podem ser úteis em construtos de ácido nucleico incluem, mas não estão limitados a sequências de poliadenilação, sequências de controle de tradução (por exemplo, um segmento de entrada de ribossomo interno, IRES), potencializadores, elementos induzíveis ou íntrons. Tais regiões regulatórias podem não ser necessárias, embora possam aumentar a expressão afetando a transcrição, estabilidade do mRNA, eficiência de tradução ou semelhantes. Essas regiões regulatórias podem ser incluídas em um construto de ácido nucleico conforme desejado para obter a expressão ideal dos ácidos nucleicos na(s) célula(s).

Expressão suficiente, no entanto, às vezes pode ser obtida sem esses elementos adicionais.

[0509] Um construto de ácido nucleico pode ser usado que codifica peptídeos sinal ou marcadores selecionáveis. Os peptídeos sinal podem ser usados de modo que um polipeptídeo codificado seja direcionado para um local celular específico (por exemplo, a superfície da célula). Exemplos não limitativos de marcadores selecionáveis incluem puromicina, ganciclovir, adenosina desaminase (ADA), aminoglicosídeo fosfotransferase (neo, G418, APH), dihidrofolato redutase (DHFR), higromicina-B-fosfotransferase, timidina quinase (TK), e xantina-guanina fosforibosiltransferase (XGPRT). Esses marcadores são úteis para selecionar transformantes estáveis em cultura.

Outros marcadores selecionáveis incluem polipeptídeos fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde ou proteína fluorescente amarela.

[0510] Uma sequência que codifica um marcador selecionável pode ser flanqueada por sequências de reconhecimento para uma recombinase, como, por exemplo, Cre ou Flp. Por exemplo, o marcador selecionável pode ser flanqueado por sítios de reconhecimento loxP (sítios de reconhecimento de 34 pb reconhecidos pela recombinase Cre) ou sítios de reconhecimento FRT de modo que o marcador selecionável possa ser excisado do construto. Ver, Orban, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1992) 89: 6861, para uma revisão da tecnologia Cre/lox, e Brand e Dymecki, Dev. Cell (2004) 6: 7.

Um transposon contendo um transgene ativável por Cre- ou Flp interrompido por um gene marcador selecionável também pode ser usado para obter animais com expressão condicional de um transgene. Por exemplo, um promotor que direciona a expressão do marcador/ transgene pode ser ubíquo ou tecido-específico, o que resultaria na expressão ubíqua ou tecido-específica do marcador em animais F0 (por exemplo, porcos). A ativação específica de tecido do transgene pode ser realizada, por exemplo, cruzando um porco que expressa de forma ubíqua um transgene interrompido por marcador para um porco que expressa Cre ou Flp de uma maneira tecido-específica, ou cruzando um porco que expressa um transgene interrompido por marcador de uma maneira tecido-específica para um porco que expressa de forma ubíqua a recombinase Cre ou Flp. A expressão controlada do transgene ou excisão controlada do marcador permite a expressão do transgene.

[0511] O ácido nucleico exógeno pode codificar um polipeptídeo.

Uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo pode incluir uma sequência de marcador que codifica um “marcador” projetado para facilitar a manipulação subsequente do polipeptídeo codificado (por exemplo, para facilitar a localização ou detecção). As sequências de marcador podem ser inseridas na sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, de modo que o marcador codificado esteja localizado no terminal carboxila ou amino do polipeptídeo. Exemplos não limitativos de marcadores codificados incluem glutationa S-transferase (GST) e marcador FLAGTM (Kodak, New Haven, Conn.).

[0512] Construtos de ácido nucleico podem ser metilados usando uma SssI CpG metilase (New England Biolabs, Ipswich, Mass.). Em geral, o construto de ácido nucleico pode ser incubado com S-adenosilmetionina e SssI CpG-metilase em tampão a 37 °C. A hipermetilação pode ser confirmada pela incubação do construto com uma unidade de endonuclease HinP1I por 1 hora a 37 °C e ensaio por eletroforese em gel de agarose.

[0513] Os construtos de ácido nucleico podem ser introduzidos em células animais embrionárias, fetais ou adultas de qualquer tipo, incluindo, por exemplo, células germinativas, tais como um oócito ou um óvulo, uma célula progenitora, uma célula-tronco adulta ou embrionária, uma célula germinativa primordial, uma célula de rim, tal como uma célula PK-15, uma célula de ilhota, uma célula beta, uma célula do fígado ou um fibroblasto, como um fibroblasto dérmico, usando uma variedade de técnicas. Exemplos não limitantes de técnicas incluem o uso de sistemas de transposon, vírus recombinantes que podem infectar células, ou lipossomas ou outros métodos não virais, tais como eletroporação, microinjeção ou precipitação com fosfato de cálcio, que são capazes de entregar ácidos nucleicos às células.

[0514] Em sistemas de transposon, a unidade transcripcional de um construto de ácido nucleico, isto é, a região regulatória operacionalmente ligada a uma sequência de ácido nucleico exógena, é flanqueada por uma repetição invertida de um transposon. Vários sistemas de transposon, incluindo, por exemplo, Sleeping Beauty (ver, patente U.S. 6.613.752 e publicação U.S. nº 2005/0003542); Frog Prince (Miskey et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 6873); Tol2 (Kawakami (2007) Genome Biology 8 (Suppl.1): S7; Minos (Pavlopoulos et al. (2007) Genome Biology 8 (Suppl.1): S2); Hsmar1 (Miskey et al. (2007)) Mol Cell Biol. 27: 4589); e Passport foram desenvolvidos para introduzir ácidos nucléicos em células, incluindo células de camundongos, humanos e porcos. O transposon de Sleeping Beauty é particularmente útil.

Uma transposase pode ser distribuída como uma proteína, codificada no mesmo construto de ácido nucleico que o ácido nucleico exógeno, pode ser introduzida em um construto de ácido nucleico separado ou fornecida como um mRNA (por exemplo, um mRNA transcrito in vitro e coberto).

[0515] Elementos isolantes também podem ser incluídos em um construto de ácido nucleico para manter a expressão do ácido nucleico exógeno e para inibir a transcrição indesejada de genes hospedeiros. Ver, por exemplo, Publicação U.S. 2004/0203158. Normalmente, um elemento isolante flanqueia cada lado da unidade transcripcional e é interno à repetição invertida do transposon. Exemplos não limitativos de elementos isolantes incluem os elementos isolantes do tipo região de fixação da matriz (MAR) e elementos isolantes do tipo borda. Ver, por exemplo, patente U.S. nº 6.395.549,

5.731.178, 6.100.448 e 5.610.053, e publicação U.S. nº 2004/0203158.

[0516] Os ácidos nucleicos podem ser incorporados em vetores.

Um vetor é um termo amplo que inclui qualquer segmento de DNA específico projetado para se mover de um transportador para um DNA alvo. Um vetor pode ser referido como um vetor de expressão ou um sistema de vetor, que é um conjunto de componentes necessários para realizar a inserção de DNA em um genoma ou outra sequência de DNA direcionada, como um epissoma, plasmídeo ou mesmo um segmento de DNA de vírus/ fago. Sistemas de vetores, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus, vírus adeno- associados e vírus de fago integrantes) e vetores não virais (por exemplo, transposons) usados para entrega de genes em animais têm dois componentes básicos: 1) um vetor composto de DNA (ou RNA que é reversamente transcrito em um cDNA) e 2) uma transposase, recombinase ou outra enzima integrase que reconhece o vetor e uma sequência alvo de DNA e insere o vetor na sequência de DNA alvo. Os vetores mais frequentemente contêm um ou mais cassetes de expressão que compreendem uma ou mais sequências de controle de expressão, em que uma sequência de controle de expressão é uma sequência de DNA que controla e regula a transcrição e/ou tradução de outra sequência de DNA ou mRNA, respectivamente.

[0517] Muitos tipos diferentes de vetores são conhecidos. Por exemplo, plasmídeos e vetores virais, por exemplo, vetores retrovirais, são conhecidos. Os plasmídeos de expressão de mamíferos têm tipicamente uma origem de replicação, um promotor adequado e potencializador opcional, sítios de ligação ao ribossomo necessários, um sítio de poliadenilação, sítios doadores e aceitadores de splice, sequências de terminação transcripcional e sequências não transcritas de flanqueamento 5’. Exemplos de vetores incluem: plasmídeos (que também podem ser um transportador de outro tipo de vetor), adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), lentivírus (por exemplo, HIV-1 modificado, SIV ou FIV), retrovírus (por exemplo, ASV, ALV ou MoMLV) e transposons (por exemplo, Sleeping Beauty, elementos P, Tol-2, Frog Prince, piggyBac).

[0518] Tal como aqui utilizado, o termo ácido nucleico refere-se a RNA e DNA, incluindo, por exemplo, cDNA, DNA genômico, DNA sintético (por exemplo, sintetizado quimicamente), bem como ácidos nucleicos de ocorrência natural e quimicamente modificados, por exemplo, bases sintéticas ou estruturas alternativas. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita dupla ou fita simples (isto é, uma fita simples senso ou uma antisenso).

ANIMAIS FUNDADORES, LINHAGENS DE ANIMAIS, CARACTERÍSTICAS E REPRODUÇÃO

[0519] Animais fundadores podem ser produzidos por clonagem e outros métodos aqui descritos. Os fundadores podem ser homozigotos para uma alteração genética, como no caso em que um zigoto ou uma célula primária sofre uma modificação homozigótica. Da mesma forma, fundadores também podem ser feitos que são heterozigotos. No caso dos animais que compreendem pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP, os fundadores são preferencialmente heterozigotos. Os fundadores podem ser modificados genomicamente, o que significa que todas as células em seu genoma foram modificadas. Os fundadores podem ser um mosaico para uma modificação, como pode acontecer quando os vetores são introduzidos em uma de uma pluralidade de células em um embrião, normalmente em um estágio de blastocisto. A progênie de animais em mosaico pode ser testada para identificar a progênie que é genomicamente modificada. Uma linhagem animal é estabelecida quando um grupo de animais foi criado, que pode ser reproduzido sexualmente ou por técnicas de reprodução assistida, com progênie heterogênea ou homozigótica expressando consistentemente a modificação.

[0520] Em animais de criação, muitos alelos são conhecidos por estarem ligados a várias características, tais como características de produção, características de tipo, características de trabalhabilidade e outras características funcionais. Os técnicos no assunto estão acostumados a monitorar e quantificar essas características, por exemplo, Visscher et al., Livestock Production Science, 40 (1994) 123-137, patente US 7.709.206, US 2001/0016315, US 2011/0023140 e US 2005/0153317. Uma linhagem animal pode incluir uma característica escolhida a partir de uma característica no grupo que consiste em uma característica de produção, uma característica de tipo, uma característica de trabalhabilidade, uma característica de fertilidade, uma característica materna e uma característica de resistência a doenças.

Outras características incluem a expressão de um produto de gene recombinante.

[0521] Animais com uma característica ou características desejadas podem ser modificados para prevenir sua maturação sexual. Como os animais são estéreis até a maturidade, é possível regular a maturidade sexual como forma de controlar a disseminação dos animais. Animais que foram cruzados ou modificados para ter uma ou mais características podem, portanto, ser fornecidos a receptores com um risco reduzido de que os receptores criem os animais e se apropriem do valor das características para si próprios. Por exemplo, o genoma de um animal pode ser modificado, em que a modificação compreende a inativação de um gene de maturação sexual, em que o gene de maturação sexual em um animal de tipo selvagem expressa um fator seletivo para a maturação sexual. O animal pode ser tratado pela administração de um composto para remediar uma deficiência causada pela perda de expressão do gene para induzir a maturação sexual no animal.

[0522] A criação de animais que requerem a administração de um composto para induzir a maturidade sexual pode ser vantajosamente realizada em uma instalação de tratamento. A instalação de tratamento pode implementar protocolos padronizados em animais bem controlados para produzir animais consistentes de maneira eficiente. A progênie animal pode ser distribuída para uma pluralidade de locais a serem criados. Fazendas e fazendeiros (um termo que inclui um rancho e rancheiros) podem, portanto, ordenar um número desejado de progênie com uma faixa especificada de idades e/ou pesos e/ou características e tê-los entregues em um momento e/ou local desejado. Os destinatários, por exemplo, fazendeiros, podem então criar os animais e entregá-los ao mercado como desejarem.

[0523] Um animal de criação geneticamente editado com um gene de maturação sexual inativado pode ser entregue (por exemplo, a um ou mais locais, a uma pluralidade de fazendas). Os animais podem ter uma idade entre cerca de 1 dia e cerca de 180 dias. O animal pode ter uma ou mais características (por exemplo, um que expressa uma característica desejada ou uma característica de alto valor ou uma nova característica ou uma característica recombinante).

[0524] Tendo descrito a invenção em detalhes, será evidente que modificações e variações são possíveis sem se afastar do escopo da invenção definido nas reivindicações anexas.

EXEMPLOS

[0525] Os seguintes exemplos não limitativos são fornecidos para ilustrar ainda mais a presente invenção.

[0526] Os exemplos 1 a 3 descrevem a geração de porcos possuindo sequências cromossômicas modificadas em seus genes CD163, e a resistência de tais porcos à infecção por PRRSV. O Exemplo 4 descreve a geração de porcos knockout SIGLEC1. Os Exemplos 5 e 6 descrevem a geração de porcos possuindo sequências cromossômicas modificadas em seus genes ANPEP e a resistência de tais porcos ao TGEV. O Exemplo 7 descreve a geração de porcos heterozigotos para modificações cromossômicas em pelo menos dois genes selecionados a partir de CD163, SIGLEC1 e ANPEP. O Exemplo 8 descreve como os porcos gerados no Exemplo 7 serão usados para gerar animais homozigotos para modificações cromossômicas em pelo menos dois genes selecionados a partir de CD163, SIGLEC1 e ANPEP, e como esses animais serão testados quanto à resistência a TGEV e PRRSV.

EXEMPLO 1: USO DO SISTEMA CRISPR/CAS9 PARA PRODUZIR PORCOS

GENETICAMENTE MODIFICADOS A PARTIR DE OÓCITOS E EMBRIÕES DERIVADOS IN VITRO

[0527] Relatórios recentes que descrevem endonucleases teleguiadas, tais como Nuclease Dedo de Zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição (TALENs) e componentes no sistema agrupado repetições palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR)/ (Cas9) associado a CRISPR, sugerem que a engenharia genética (GE) em porcos pode agora ser mais eficiente.

Endonucleases teleguiadas direcionadas podem induzir quebras de fita dupla (DSBs) em locais específicos no genoma e causar mutações aleatórias por meio de união de extremidades não homólogas (NHEJ) ou estimulação de recombinação homóloga (HR) se o DNA doador for fornecido. A modificação direcionada do genoma por meio de HR pode ser alcançada com endonucleases teleguiadas se o DNA doador for fornecido junto com a nuclease direcionada. Após a introdução de modificações específicas nas células somáticas, essas células foram usadas para produzir porcos GE para vários fins via SCNT. Assim, as endonucleases teleguiadas são uma ferramenta útil na geração de porcos GE. Entre as diferentes endonucleases teleguiadas, o sistema CRISPR/Cas9, adaptado de procariotos onde é usado como um mecanismo de defesa, parece ser uma abordagem eficaz. Na natureza, o sistema Cas9 requer três componentes, um RNA (~ 20 bases) que contém uma região que é complementar à sequência alvo (RNA cis-reprimido [crRNA]), um RNA que contém uma região que é complementar ao crRNA (crRNA transativador [tracrRNA]), e Cas9, o componente de proteína enzimática neste complexo. Um único RNA guia (gRNA) pode ser construído para servir aos papéis do crRNA e tracrRNA emparelhados com base. O complexo gRNA/ proteína pode varrer o genoma e catalisar uma DSB em regiões que são complementares ao crRNA/ gRNA. Ao contrário de outras nucleases projetadas, apenas um oligômero curto precisa ser projetado para construir os reagentes necessários para direcionar um gene de interesse, enquanto uma série de etapas de clonagem são necessárias para montar ZFNs e TALENs.

[0528] Ao contrário dos métodos padrão atuais para a interrupção de gene, o uso de nucleases projetadas oferece a oportunidade de usar zigotos como material de partida para GE. Os métodos padrão para a interrupção de gene em animais de criação envolvem HR em células de cultura e subsequente reconstrução de embriões por transferência nuclear de células somáticas (SCNT). Como os animais clonados produzidos por meio ds SCNT às vezes mostram sinais de defeitos de desenvolvimento, a progênie dos fundadores de SCNT/GE é normalmente usada para pesquisas para evitar a confusão de anomalias do SCNT e fenótipo que poderiam ocorrer se os animais fundadores fossem usados para experimentos. Considerando o período de gestação mais longo e os custos de alojamento mais elevados dos porcos em comparação com os roedores, há benefícios de tempo e custo na redução da necessidade de reprodução. Um relatório recente demonstrou que a injeção direta de ZFNs e TALENs em zigotos suínos poderia interromper um gene endógeno e produzir leitões com as mutações desejadas. No entanto, apenas cerca de 10% dos leitões apresentaram modificação bialélica do gene alvo, e alguns apresentaram genótipos em mosaico. Um artigo recente demonstrou que o sistema CRISPR/Cas9 pôde induzir mutações em embriões em desenvolvimento e produzir porcos GE com uma eficiência mais alta do que ZFNs ou TALENs. No entanto, porcos GE produzidos a partir do sistema CRISPR/Cas9 também possuíam genótipos em mosaico. Além disso, todos os estudos acima mencionados usaram zigotos derivados in vivo para os experimentos, que requerem trabalho intensivo e numerosas porcas para obter um número suficiente de zigotos.

[0529] O presente exemplo descreve uma abordagem eficiente para usar o sistema CRISPR/Cas9 na geração de porcos GE por meio de injeção de zigotos derivados in vitro e modificação de células somáticas seguida por SCNT. Dois genes endógenos (CD163 e CD1D) e um transgene (eGFP) foram direcionados, e apenas oócitos ou zigotos derivados in vitro foram usados para injeções de SCNT ou RNA, respectivamente. O CD163 parece ser necessário para a infecção produtiva pelo vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos, um vírus conhecido por causar uma perda econômica significativa para a indústria suína. CD1D é considerada uma proteína do complexo principal de histocompatibilidade não clássica e está envolvida na apresentação de antígenos lipídicos para células T natural killer invariantes. Porcos deficientes nesses genes foram projetados para serem modelos para a agricultura e a biomedicina. O transgene eGFP foi usado como um alvo para experimentos preliminares de prova de conceito e otimizações de métodos.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0530] Produto químico e reagentes. Salvo indicação em contrário, todos os produtos químicos usados neste estudo foram adquiridos da Sigma.

PROJETO DE GRNAS PARA CONSTRUIR CRISPRS ESPECÍFICOS

[0531] Os RNAs guia foram projetados para regiões dentro do éxon 7 de CD163 que eram exclusivas para o CD163 de tipo selvagem e não estavam presentes no vetor de direcionamento de troca de domínio (descrito abaixo), de modo que o CRISPR resultaria em DSB dentro do CD163 de tipo selvagem, mas não no vetor de direcionamento de troca de domínio. Havia apenas quatro locais em que o vetor de direcionamento introduziria um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) que alteraria um motivo adjacente do protoespaçador (PAM) de S. pyogenes (Spy). Todos os quatro alvos foram selecionados, incluindo: (SEQ ID NO: 1) GGAAACCCAGGCTGGTTGGAgGG (CRISPR 10), (SEQ ID NO: 2) GGAACTACAGTGCGGCACTGtGG (CRISPR 131), (SEQ ID NO: 3) CAGTAGCACCCCGCCCTGACgGG (CRISPR 256) e (SEQ ID NO: 4) TGTAGCCACAGCAGGGACGTcGG (CRISPR 282).

[0532] O PAM pode ser identificado pela fonte em negrito em cada gRNA.

[0533] Para mutações CD1D, a busca por alvos CRISPR foi arbitrariamente limitada à fita de codificação dentro dos primeiros 1000 pb da transcrição primária. No entanto, RepeatMasker [26] (biblioteca de repetição “Pig”) identificou um elemento repetitivo começando na base 943 da transcrição primária. A busca por alvos CRISPR foi então limitada aos primeiros 942 pb da transcrição primária. A busca foi ainda limitada aos primeiros 873 pb da transcrição primária, uma vez que o último Spy PAM está localizado na base

873. O primeiro alvo (CRISPR 4800) foi selecionado porque se sobrepôs ao códon de iniciação localizado na base 42 na transcrição primária

(CCAGCCTCGCCCAGCGACATgGG (SEQ ID NO: 5)). Dois alvos adicionais (CRISPRs 5620 e 5626) foram selecionados porque eram os mais distais à primeira seleção dentro da região selecionada arbitrariamente (CTTTCATTTATCTGAACTCAgGG (SEQ ID NO: 6)) e TTATCTGAACTCAGGGTCCCcGG (SEQ ID NO: 7)). Esses alvos se sobrepõem. Em relação ao códon de iniciação, os Spy PAMs mais proximais estavam localizados em uma sequência simples que continha uma sequência extensivamente homopolimérica determinada por avaliação visual. O quarto alvo (CRISPR 5350) foi selecionado porque, em relação à seleção do primeiro alvo, era o alvo mais proximal que não continha regiões homopoliméricas extensas (CAGCTGCAGCATATATTTAAgGG (SEQ ID NO: 8)). A especificidade dos crRNAs projetados foi confirmada pela pesquisa de sequências porcinas semelhantes no GenBank. Os oligonucleotídeos (Tabela 2) foram recombinados em baixa temperatura e clonados no vetor p330X que contém dois cassetes de expressão, um Cas9 de S. pyogenes otimizado para códons humanos (hSpy) e o RNA guia quimérico. O P330X foi digerido com BbsI (New England Biolabs) seguindo o protocolo do laboratório Zhang (http://www.addgene.org/crispr/zhang/).

[0534] Para atingir eGFP, dois gRNAs específicos direcionados à sequência de codificação de eGFP foram projetados dentro dos primeiros 60 pb do códon de iniciação de eGFP. Ambos gRNA eGFP1 e eGFP2 estavam na fita antisenso e eGFP1 direcionava diretamente o códon de iniciação. A sequência de gRNA de eGFP1 era CTCCTCGCCCTTGCTCACCAtGG (SEQ ID NO: 9) e a sequência de gRNA de eGFP2 era GACCAGGATGGGCACCACCCcGG (SEQ ID NO: 10).

TABELA 2. CRRNAS PROJETADOS.

[0535] O Iniciador 1 e o Iniciador 2 foram recombinados em baixa temperatura seguindo o protocolo de Zhang.

Iniciador Sequência (5’ – 3’) SEQ ID NO.

CD163 10 1 CACCGGAAACCCAGGCTGGTTGGA 48 CD163 10 2 AAACTCCAACCAGCCTGGGTTTCC 49 CD163 131 1 CACCGGAACTACAGTGCGGCACTG 50 CD163 131 2 AAACCAGTGCCGCACTGTAGTTCC 51 CD163 256 1 CACCGCAGTAGCACCCCGCCCTGAC 52 CD163 256 2 AAACGTCAGGGCGGGGTGCTACTGC 53 CD163 282 1 CACCGTGTAGCCACAGCAGGGACGT 54 CD163 282 2 AAACACGTCCCTGCTGTGGCTACAC 55 CD1D 4800 1 CACCGCCAGCCTCGCCCAGCGACAT 56 CD1D 4800 2 AAACATGTCGCTGGGCGAGGCTGGC 57 CD1D 5350 1 CACCGCAGCTGCAGCATATATTTAA 58 CD1D 5350 2 AAACTTAAATATATGCTGCAGCTGC 59 CD1D 5620 1 CACCGCTTTCATTTATCTGAACTCA 60 CD1D 5620 2 AAACTGAGTTCAGATAAATGAAAGC 61 CD1D 5626 1 CACCGTTATCTGAACTCAGGGTCCC 62 CD1D 5626 2 AAACGGGACCCTGAGTTCAGATAAC 63 eGFP 1 1 CACCGCTCCTCGCCCTTGCTCACCA 64 eGFP 1 2 AAACTGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC 65 eGFP 2 1 CACCGGACCAGGATGGGCACCACCC 66 eGFP 2 2 AAACGGGTGGTGCCCATCCTGGTCC 67 SÍNTESE DE DNA DOADOR PARA OS GENES CD163 E CD1D

[0536] Tanto o CD163 como o CD1D suínos foram amplificados por PCR a partir de DNA isolado dos fibroblastos fetais que seriam usados para transfecções posteriores para garantir uma correspondência isogênica entre o vetor de direcionamento e a linhagem celular transfectada. Resumidamente, LA taq (Clontech) usando o iniciador direto CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT (SEQ ID NO: 11) e o iniciador reverso TATTTCTCTCACATGGCCAGTC (SEQ ID NO: 12) foram usados para amplificar um fragmento de 9538 pb de CD163.

O fragmento foi validado por sequência de DNA e usado para construir o vetor de direcionamento de troca de domínio (Figura 1). Este vetor incluiu 33 mutações pontuais dentro do éxon 7 de modo que codificasse a mesma sequência de aminoácidos que o CD163L humano do éxon 11. O éxon de substituição tinha 315 pb. Além disso, o íntron subsequente foi substituído com um íntron B de miostatina modificado que alojava um gene marcador selecionável que poderia ser removido com recombinase Cre (Cre) e havia demonstrado anteriormente splicing normal ao abrigar o sítio loxP retido (Wells, resultados não publicados). O braço longo do construto tinha 3469 pb e incluía o éxon de DS de troca de domínio. O braço curto tinha 1578 pb e incluía os éxons 7 e 8 (Figura 1, painel B). Este plasmídeo foi usado para tentar substituir a região codificadora do éxon 7 nos primeiros experimentos de transfecção e permitiu a seleção de eventos de direcionamento através do marcador selecionável (G418). Se o direcionamento ocorresse, o marcador poderia ser deletado pela recombinase Cre. O vetor de direcionamento CD163 DS foi então modificado para uso com linhagens celulares que já continham um gene SIGLEC1 interrompido com Neo que não podia ser deletado por Cre. Neste vetor de direcionamento, o cassete Neo, loxP e íntron B de miostatina, foram removidos e apenas o éxon DS permaneceu com o braço longo e curto WT (Figura 1, painel C).

[0537] A sequência genômica para CD1D suíno foi amplificada com LA taq usando o iniciador direto CTCTCCCTCACTCTAACCTACTT (SEQ ID NO: 13) e o iniciador reverso GACTGGCCATGTGAGAGAAATA (SEQ ID NO: 14), resultando em um fragmento de 8729 pb. O fragmento foi sequenciado por DNA e usado para construir o vetor de direcionamento mostrado na Figura 2. O cassete Neo está sob o controle de um promotor de fosfoglicerol quinase (PGK) e flanqueado com sequências loxP, que foram introduzidas para seleção. O braço longo do construto tinha 4832 pb e o braço curto tinha 3563 pb, e incluía os éxons 6 e 7. Se a HR bem-sucedida ocorresse, os éxons 3, 4 e 5 seriam removidos e substituídos com o cassete Neo. Se o reparo do NHEJ ocorresse incorretamente, então o éxon 3 seria interrompido.

COLETA DE FIBROBLASTOS FETAIS

[0538] Tecido fetal suíno foi coletado no dia 35 de gestação para criar linhagens celulares. Duas linhagens celulares de fibroblastos fetais masculinos e femininos de tipo selvagem (WT) foram estabelecidas a partir de um grande cruzamento doméstico branco. Fibroblastos fetais masculinos e femininos que foram previamente modificados para conter um cassete Neo (genética SIGLEC1 -/-) também foram usados nesses estudos. Fibroblastos fetais foram coletados conforme descrito com pequenas modificações; tecido picado de cada feto foi digerido em 20 ml de meio de digestão (meio Eagle modificado por Dulbecco [DMEM] contendo L-glutamina e 1 g/l de D-glicose [Cellgro] suplementado com 200 unidades/ml de colagenase e 25 unidades Kunitz/ ml DNAseI) durante 5 horas a 38,5 °C. Após a digestão, as células de fibroblastos fetais foram lavadas e cultivadas com DMEM, 15% de soro fetal bovino (FBS) e 40 µg/ml de gentamicina. Após cultura de um dia para outro, as células foram tripsinizadas e congeladas a -80 °C em alíquotas em FBS com 10% de dimetilsulfóxido e armazenadas em nitrogênio líquido.

TRANSFECÇÃO CELULAR E GENOTIPAGEM

[0539] As condições de transfecção foram essencialmente conforme relatado anteriormente. O DNA doador foi sempre usado em uma quantidade constante de 1 µg com quantidades variáveis de plasmídeo CRISPR/Cas9 (listado abaixo). O DNA doador foi linearizado com MLUI (CD163) (NEB) ou AFLII (CD1D) (NEB) antes da transfecção. O sexo das linhagens celulares estabelecidas foi determinado por PCR, conforme descrito anteriormente, antes da transfecção. Ambas as linhagens celulares masculinas e femininas foram transfectadas e os dados de modificação do genoma foram analisados em conjunto entre as transfecções. Linhagens celulares de fibroblastos fetais com número de passagem semelhante (2–4) foram cultivadas por 2 dias e crescidas até 75%-85% de confluência em

DMEM contendo L-glutamina e 1 g/l D-glicose (Cellgro) suplementado com 15% de FBS, 2,5 ng/ml de fator de crescimento de fibroblasto básico e 10 mg/ ml de gentamicina. As células de fibroblastos foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Life Technologies) e tripsinizadas.

Assim que as células se destacaram, as células foram enxaguadas com um meio de eletroporação (75% de citosais [KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4 10 mM, pH 7,6, MgCl2 5 Mm]) e 25% de Opti-MEM (LifeTechnologies). A concentração celular foi quantificada por meio de um hemocitômetro. As células foram peletizadas a 600 x g durante 5 minutos e ressuspensas a uma concentração de 1 x 10 6 em meio de eletroporação.

Cada eletroporação usou 200 µl de células em cubetas de lacuna de 2 mm com três (1 mseg) pulsos de onda quadrada administrados através de um BTX ECM 2001 a 250 V. Após a eletroporação, as células foram ressuspensas em DMEM descrito acima. Para a seleção, 600 µg/ml de G418 (Life Technologies) foram adicionados 24 horas após a transfecção e o meio foi trocado no Dia 7. As colônias foram coletadas no Dia 14 após a transfecção. Fibroblastos fetais foram colocados em placas a 10.000 células/ placa se a seleção de G418 foi usada e a 50 células/ placa se nenhuma seleção de G418 foi usada. Colônias de fibroblasto fetal foram coletadas aplicando cilindros de clonagem autoclavados de 10 mm vedados ao redor de cada colônia por graxa autoclavada a vácuo. As colônias foram enxaguadas com PBS e colhidas via tripsina; então ressuspensas em meio de cultura DMEM. Uma parte (1/3) da colônia ressuspensa foi transferida para uma placa de PCR de 96 poços, e as células restantes (2/3) foram cultivadas em um poço de uma placa de 24 poços. Os péletes celulares foram ressuspensos em 6 µl de tampão de lise (Tris 40 mM, pH 8,9, 0,9% de Triton X-100, 0,4 mg/ml de proteinase K [NEB]), incubados a 65 °C por 30 minutos para lise celular, seguido por 85 °C por 10 minutos para inativar a proteinase K.

TRIAGEM DE PCR PARA DS E GRANDES E PEQUENAS DELEÇÕES

[0540] Detecção de reparo dirigido por HR. PCRs de longo alcance foram usadas para identificar mutações em CD163 ou CD1D. Três ensaios de PCR diferentes foram usados para identificar eventos de HR: amplificação por PCR de regiões abrangendo desde as sequências de CD163 ou CD1D no DNA doador até as sequências endógenas de CD163 ou CD1D no lado direito ou esquerdo e uma PCR de longo alcance que amplificou grandes regiões de CD163 ou CD1D abrangendo os DNAs doadores projetados. Um aumento no tamanho de um produto de PCR, seja 1,8 kb (CD1D) ou 3,5 kb (CD163), decorrente da adição de sequências de Neo exógenas, foi considerado evidência de reparo dirigido por HR dos genes. Todas as condições de PCR incluíram uma desnaturação inicial de 95 °C por 2 minutos seguida de 33 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 50 °C e 7–10 minutos a 68 °C. LA taq foi usado para todos os ensaios seguindo as recomendações dos fabricantes. Os iniciadores são mostrados na Tabela 3.

TABELA 3. INICIADORES USADOS PARA IDENTIFICAR O REPARO DIRIGIDO POR HR DE CD163 E CD1D

SE Q

ID Iniciador Sequência (5’ – 3’) NO. TTGTTGGAAGGCTCACTGTCCTT 68 Iniciador de Ensaio de Longo Alcance CD163 1230F G Iniciador de Ensaio de Longo Alcance CD163 7775 R ACAACTAAGGTGGGGCAAAG 69 Iniciador de Ensaio de Braço Esquerdo CD163 1230 TTGTTGGAAGGCTCACTGTCCTT 70

F G Iniciador de Ensaio de Braço Esquerdo CD163 8491 71

R GGAGCTCAACATTCTTGGGTCCT Iniciador de Ensaio de Braço Direito CD163 3752 F GGCAAAATTTTCATGCTGAGGTG 72 GCACATCACTTCGGGTTACAGT 73 Iniciador de Ensaio de Braço Direito CD163 7765 R G Iniciador de Ensaio de Longo Alcance CD1D F 3991 74

F CCCAAGTATCTTCAGTTCTGCAG Iniciador de Ensaio de Longo Alcance CD1D R 12806 TACAGGTAGGAGAGCCTGTTTT 75

R G SE Q

ID Iniciador Sequência (5’ – 3’) NO. Iniciador de Ensaio de Braço Esquerdo CD1D F 3991 76

F CCCAAGTATCTTCAGTTCTGCAG Iniciador de Ensaio de Braço Esquerdo CD1D 7373 R CTCAAAAGGATGTAAACCCTGGA 77 Iniciador de Ensaio de Braço Direito CD1D 4363 F TGTTGATGTGGTTTGTTTGCCC 78 TACAGGTAGGAGAGCCTGTTTT 79 Iniciador de Ensaio de Braço Direito CD1D 12806 R G

[0541] Ensaio de pequenas deleções (NHEJ). Pequenas deleções foram determinadas por amplificação por PCR de CD163 ou CD1D flanqueando um sítio de corte projetado introduzido pelo sistema CRISPR/Cas9. O tamanho dos amplicons foi de 435 pb e 1244 pb para CD163 e CD1D, respectivamente. Os lisados de embriões e fibroblastos fetais foram amplificados por PCR com LA taq. As condições de PCR dos ensaios foram uma desnaturação inicial de 95 °C durante 2 minutos seguida por 33 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 56 °C e 1 minuto a 72 °C. Para a genotipagem das células transfectadas, inserções e deleções (INDELs) foram identificadas separando os amplicons de PCR por eletroforese em gel de agarose. Para a genotipagem de embriões, os produtos de PCR resultantes foram subsequentemente sequenciados por DNA para identificar pequenas deleções usando iniciadores diretos usados na PCR. As informações do iniciador são mostradas na Tabela 4. TABELA 4. INICIADORES USADOS PARA IDENTIFICAR MUTAÇÕES POR MEIO DE NHEJ EM CD163 E CD1D Iniciador Sequência (5’ – 3’) SEQ ID NO.

GCD163F GGAGGTCTAGAATCGGCTAAGCC 80 GCD163R GGCTACATGTCCCGTCAGGG 81 GCD1DF GCAGGCCACTAGGCAGATGAA 82 GCD1DR GAGCTGACACCCAAGAAGTTCCT 83 eGFP1 GGCTCTAGAGCCTCTGCTAACC 84 eGFP2 GGACTTGAAGAAGTCGTGCTGC 85

TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULAS SOMÁTICAS (SCNT)

[0542] Para produzir embriões de SCNT, foram usados oócitos derivados de porcas (ART, Inc.) ou oócitos derivados de leitoa de um matadouro local. Os oócitos derivados de porca foram transportados de um dia para outro em meio de maturação (TCM-199 com Hepes 2,9 mM, 5 µg/ml de insulina, 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico [EGF], 0,5µg/ml de hormônio folículo-estimulante de suíno [p-FSH], piruvato 0,91 mM, cisteína 0,5 mM, fluido folicular suíno a 10% e 25 ng/ml de gentamicina) e transferidos para meio fresco após 24 horas. Após 40-42 horas de maturação, as células de cúmulos foram removidas dos oócitos por vórtex na presença de hialuronidase a 0,1%. Os oócitos derivados de leitoas foram maturados conforme descrito abaixo para fertilização in vitro (IVF). Durante a manipulação, os oócitos foram colocados no meio de manipulação (TCM-199 [Life Technologies] com NaHCO 3 0,6 mM, Hepes 2,9 mM, NaCl 30 mM, 10 ng/ml de gentamicina e 3 mg/ml de BSA, com osmolaridade de 305 mOsm) suplementado com 7,0 µg/ml de citocalasina B. O corpo polar juntamente com uma porção do citoplasma adjacente, presumivelmente contendo a placa metafásica II, foi removido e uma célula doadora foi colocada no espaço perivitelino usando um capilar de vidro fino. Os embriões reconstruídos foram então fundidos em um meio de fusão (manitol 0,3 M, CaCl2 0,1 mM, MgCl2 0,1 mM e Hepes 0,5 mM) com dois pulsos de CC (intervalo de 1 segundo) a 1,2 kV/cm por 30 segundos usando um BTX Eletro Cell Manipulator (Harvard Apparatus). Após a fusão, os embriões fundidos foram totalmente ativados com timerosal 200 μM por 10 minutos no escuro e ditiotreitol 8 mM por 30 minutos. Os embriões foram então incubados em meio de zigoto suíno modificado PZM3-MU1 com Scriptaid 0,5 μM (S7817; Sigma-Aldrich), um inibidor de histona desacetilase, por 14-16 horas, conforme descrito anteriormente.

FERTILIZAÇÃO IN VITRO (IVF)

[0543] Para IVF, ovários de leitoas pré-púberes foram obtidos de um matadouro (Farmland Foods Inc.). Oócitos imaturos foram aspirados de folículos de tamanho médio (3-6 mm) usando uma agulha hipodérmica de calibre 18 acoplada a uma seringa de 10ml. Oócitos com citoplasma uniformemente escuro e células de cúmulos circundantes intactas foram então selecionados para maturação. Cerca de 50 complexos de oócitos de cúmulos foram colocados em um poço contendo 500µl de meio de maturação, TCM-199 (Invitrogen) com glicose 3,05 mM, piruvato de sódio 0,91 mM, cisteína 0,57 mM, 10 ng/ml de EGF, 0,5 µg/ml de hormônio luteinizante (LH), 0,5 µg/ml de FSH, 10 ng/ml de gentamicina (APP Pharm) e álcool polivinílico a 0,1% por 42 a 44 horas a 38,5 °C, 5% de CO2, em ar umidificado. No final da maturação, as células de cúmulos circundantes foram removidas dos oócitos por vórtex durante 3 minutos na presença de hialuronidase a 0,1%. Em seguida, os oócitos maturados in vitro foram colocados em gotículas de 50µl de meio IVF (meio tamponado com Tris modificado contendo NaCl 113,1 mM, KCl 3 mM, CaCl2 7,5 mM, glicose 11 mM, Tris 20 mM, cafeína 2 mM, piruvato de sódio 5 mM e 2 mg/ml de albumina sérica bovina [BSA]) em grupos de 25 a 30 oócitos.

Um pélete de sêmen congelado de 100 µl foi descongelado em 3 ml de Dulbecco PBS suplementado com BSA a 0,1%. Tanto o sêmen WT congelado quanto o sêmen eGFP fresco foi lavado em Percoll a 60% por 20 minutos a 650 3 g e em meio tamponado com Tris modificado por 10 minutos por centrifugação. Em alguns casos, o sêmen recém-coletado heterozigoto para um transgene eGFP descrito anteriormente foi lavado três vezes em PBS. O pélete de sêmen foi então ressuspenso com meio IVF a 0,5 x 106 células/ml.

Cinquenta microlitros da suspensão de sêmen foram introduzidos nas gotículas com oócitos. Os gametas foram co-incubados por 5 horas a 38,5 °C em uma atmosfera de 5% de CO2 em ar. Após a fertilização, os embriões foram incubados em PZM3-MU1 a 38,5 °C e 5% de CO2 em ar.

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO

[0544] Os embriões gerados para produzir porcos GE CD163 ou CD1D foram transferidos para portadoras no Dia 1 (SCNT) ou 6 (zigoto injetado) após o primeiro estro permanente. Para a transferência do Dia 6, os zigotos foram cultivados por cinco dias adicionais em PZM3-MU1 na presença de 10 ng/ml de ps48 (Stemgent, Inc.). Os embriões foram transferidos cirurgicamente para a junção ampular-ístérmica do oviduto da portadora.

SÍNTESE IN VITRO DE RNA PARA SISTEMA CRISPR/CAS9

[0545] O DNA molde para a transcrição in vitro foi amplificado usando PCR (Tabela 5). O plasmídeo CRISPR/Cas9 usado para experimentos de transfecção de células serviu como molde para o PCR. A fim de expressar o Cas9 nos zigotos, o kit mMESSAGE mMACHINE Ultra (Ambion) foi usado para produzir mRNA de Cas9. Em seguida, um sinal poli A foi adicionado ao mRNA Cas9 usando um kit de resíduo Poly (A) (Ambion). Os RNAs guia CRISPR foram produzidos por MEGAshortscript (Ambion). A qualidade dos RNAs sintetizados foi visualizada em um gel de agarose a 1,5% e, em seguida, diluídos para uma concentração final de 10 ng/μl (ambos gRNA e Cas9) e distribuídos em alíquotas de 3 μl.

TABELA 5. INICIADORES USADOS PARA AMPLIFICAR MOLDES PARA TRANSCRIÇÃO IN

VITRO Iniciadores Sequência (5’ – 3’) SEQ ID NO. Cas9 F: TAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC 86 R: GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC 87 eGFP 1 F: TTAATACGACTCACTATAGGCTCCTCGCCCTTGCTCACCA 88 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 89 CD163 10 F: TTAATACGACTCACTATAGGAAACCCAGGCTGGTTGGA 90 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 91 CD163 131 F: TTAATACGACTCACTATAGGAACTACAGTGCGGCACTG 92 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 93

Iniciadores Sequência (5’ – 3’) SEQ ID NO. CD1D 4800 F: TTAATACGACTCACTATAGGCCAGCCTCGCCCAGCGACAT 94 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 95 CD1D 5350 F: TTAATACGACTCACTATAGGCAGCTGCAGCATATATTTAA 96 R: AAAAGCACCGACTCGGTGCC 97 MICROINJEÇÃO DO SISTEMA CRISPR/CAS9 PROJETADO EM ZIGOTOS

[0546] O RNA mensageiro que codifica para Cas9 e gRNA foi injetado no citoplasma de oócitos fertilizados 14 horas após a fertilização (zigotos presumíveis) usando um microinjetor FemtoJet (Eppendorf). A microinjeção foi realizada em meio de manipulação na platina aquecida de um microscópio invertido Nikon (Nikon Corporation; Tóquio, Japão). Os zigotos injetados foram então transferidos para o PZM3-MU1 com 10 ng/ml de ps48 até uso posterior.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[0547] O número de colônias com um genoma modificado foi classificado como 1, e as colônias sem uma modificação do genoma foram classificadas como 0. As diferenças foram determinadas usando PROC GLM (SAS) com um valor P de 0,05 sendo considerado como significativo. As médias foram calculadas como médias de quadrados mínimos. Os dados são apresentados como médias numéricas ± SEM.

RESULTADOS INATIVAÇÃO MEDIADA POR CRISPR/CAS9 DE CD163 E CD1D EM CÉLULAS

SOMÁTICAS

[0548] A eficiência de quatro plasmídeos CRISPRs diferentes (guias 10, 131, 256 e 282) direcionados a CD163 foi testada a uma quantidade de 2 µg/µl de DNA doador (Tabela 6). CRISPR 282 resultou em formação de colônias significativamente mais média do que os tratamentos CRISPR 10 e 256 (P < 0,05). A partir do ensaio de PCR de longo alcance descrito acima, grandes deleções foram encontradas variando de 503 pb a tanto quanto 1506 pb em vez de um DS a HR como foi originalmente planejado (Figura 3, painel A). Isso não era esperado porque relatórios anteriores com outros sistemas de edição de DNA mostraram deleções muito menores de 6–333 pb usando ZFN em porcos. CRISPR 10 e uma mistura de todos os quatro CRISPRs resultou em um maior número de colônias com um genoma modificado do que CRISPR 256 e 282 (Tabela 6, P < 0,002). A transfecção com CRISPR 10 e um plasmídeo contendo Neo, mas sem homologia com CD163, resultou em nenhuma colônia apresentando a grande deleção. Curiosamente, uma deleção monoalélica também foi detectada quando o DNA doador foi introduzido sem qualquer CRISPR. Este ensaio provavelmente representa uma subestimação da taxa de mutação porque quaisquer pequenas deleções potenciais por sequenciamento que não puderam ser detectadas em um gel de agarose nas células somáticas transfectadas não foram triadas.

TABELA 6. EFICIÊNCIA DE QUATRO PLASMÍDEOS CRISPR DIFERENTES (GUIAS 10, 131, 256 E 282) DIRECIONADOS A CD163.

[0549] Quatro CRISPRs diferentes foram testados em uma quantidade de 2 μg a 1 μg de DNA doador (mostrado na Figura 1). Percentual Nº Nº médio de colônias Nº total Nº de Colônia total de com um Tratamento * de colônias com Reps de colônias/ genoma colônias NHEJ HR placas placa † modificado † 10+DNA doador 76 102 0,75bc 11 1‡ 15,79a 4 131+DNA doador 102 51 2,00ab 11 0 10,78ab 3 256+DNA doador 43 49 0,88c 2 0 4,65bc 3 282+DNA doador 109 46 2,37a 3 0 2,75bc 3 Mistura de 4+DNA doador 111 55 2,02ab 20 0 18,02a 3 DNA doador 48 52 0,92bc 1 0 2,08bc 3 10 + Neo (sem CD163) 26 20 1,3n/a 0 0 0,00c 1

[0550] * A mistura de 4 + DNA doador representa uma mistura igual de 0,5 μg de cada CRISPR com 1 μg de DNA doador. O tratamento com

DNA doador serviu como o controle sem CRISPR e o tratamento com 10 + Neo ilustra que as grandes deleções observadas nos tratamentos com CRISPR estavam presentes apenas quando o DNA doador CD163 também estava presente.

[0551] † ANOVA foi realizada comparando o número médio de colônias/ placa para estimar a toxicidade CRISPR e na porcentagem de colônias com um genoma modificado. Os valores de P foram 0,025 e 0,0002, respectivamente. n/a = Não houve replicatas para este tratamento, portanto, nenhuma análise estatística foi realizada.

[0552] ‡ A única colônia com HR representa um evento parcial de HR.

[0553] a–c Letras sobrescritas indicam uma diferença significativa entre os tratamentos para o número médio de colônias/ placa e porcentagem de colônias com um genoma modificado (P <0,05).

[0554] O objetivo inicial era obter um evento de direcionamento de troca de domínio (DS) por HR para CD163, mas os CRISPRs não aumentaram a eficiência de direcionamento de CD163. Deve-se notar que várias combinações deste vetor de direcionamento foram usadas para modificar CD163 por HR por transfecções tradicionais e resultou em 0 eventos de direcionamento após a triagem de 3399 colônias (Whitworth e Prather, resultados não publicados). Dois porcos foram obtidos com um DS completo resultante de HR que continha todas as 33 mutações que foram tentadas a serem introduzidas por transfecção com CRISPR 10 e o vetor de direcionamento de DS como DNA doador.

[0555] Em seguida, a eficiência de mutações induzidas por CRISPR/Cas9 sem seleção de droga foi testada; a linhagem celular de fibroblasto fetal usada neste estudo já tinha uma integração do cassete Neo resistente e uma inativação de SIGLEC1. Também foi testado se a razão de

CRISPR/Cas9 e DNA doador aumentaria a modificação do genoma ou resultaria em um efeito tóxico em uma concentração elevada. O CRISPR 131 foi selecionado para este ensaio porque, no experimento anterior, resultou em um alto número de colônias totais e um aumento na porcentagem de colônias possuindo um genoma modificado. Quantidades crescentes de DNA CRISPR 131 de 3:1 a 20:1 não tiveram um efeito significativo na capacidade de sobrevivência do fibroblasto fetal. A porcentagem de colônias com um genoma modificado por NHEJ não foi significativamente diferente entre as várias concentrações de CRISPR, mas teve o maior número de NHEJ em uma razão de 10:1 (Tabela 7, P = 0,33). Mesmo na razão mais alta de DNA CRISPR para DNA doador (20:1), HR não foi observado.

TABELA 7. EFICIÊNCIA DE MUTAÇÕES INDUZIDAS POR CRISPR/CAS9 SEM SELEÇÃO DE DROGAS.

[0556] Quatro razões diferentes de DNA doador para DNA de CRISPR 131 foram comparadas em uma linhagem celular previamente modificada sem o uso da seleção G418. Razão de Número Número Percentual Percentual Número Número DNA médio de de de Colônia de de de Reps doador: colônias / colônias colônias com HR colônias Placas colônias CRISPR placas NHEJ com NHEJ com HR 1:0 30 79 2,6 1 1,3a 0 0,0 2 1:3 30 84 2,8 1 1,2a 0 0,0 2 1:5 27 76 2,8 2 2,6a 0 0,0 2 1:10 32 63 2,0 5 7,9a 0 0,0 2 1:20 35 77 2,2 3 3,9a 0 0,0 2

[0557] a Diferença significativa entre os tratamentos para o percentual de colônias com reparo de NHEJ (P > 0,05).

[0558] b Não houve diferença significativa no número de colônias modificadas pelo genoma com o aumento da concentração de CRISPR (P > 0,33).

[0559] Com base neste experimento, a interrupção direcionada de CD1D em células somáticas foi tentada. Quatro CRISPRs diferentes foram projetados e testados em células masculinas e femininas. As modificações de CD1D puderam ser detectadas a partir de três dos CRISPRs aplicados, mas o uso de CRISPR 5350 não resultou na modificação de CD1D com uma deleção grande o suficiente para se detectar por eletroforese em gel de agarose (Tabela 8). Curiosamente, nenhuma alteração genética foi obtida por meio de HR, embora o DNA doador tenha sido fornecido. No entanto, grandes deleções semelhantes aos experimentos de inativação de CD163 foram observadas (Figura 3, painel B). Nenhuma modificação direcionada de CD1D com uma grande deleção foi detectada quando CRISPR/Cas9 não foi usado com o DNA doador. A modificação de CD1D a partir de direcionamento guiado por CRISPR/Cas9 foi 4/121 e 3/28 em colônias de células masculinas e femininas, respectivamente. Apenas INDELs detectáveis por eletroforese em gel de agarose foram incluídos nos dados de transfecção.

TABELA 8. Q UATRO CRISPRS DIFERENTES FORAM TESTADOS EM UMA Q UANTIDADE DE 2 ΜG A 1 ΜG DE DNA DOADOR (MOSTRADO NA FIGURA 2).

[0560] O tratamento de DNA doador serviu como o controle sem CRISPR. Número total de Sexo Tratamento colônias INDEL Eficiência (%) Masculino 4800 +DNA doador 29 2 6,9 Masculino 5350+DNA doador 20 0 0 Masculino 5620+DNA doador 43 1 2,33 Masculino 5626+DNA doador 29 2 6,9 Masculino DNA doador 28 0 0 Feminino 4800 +DNA doador 2 0 0 Feminino 5350+DNA doador 8 0 0

Número total de Sexo Tratamento colônias INDEL Eficiência (%) Feminino 5620+DNA doador 10 0 0 Feminino 5626+DNA doador 8 3 37,5 Feminino DNA doador 7 0 0 PRODUÇÃO DE PORCOS CD163 E CD1D POR MEIO DE SCNT USANDO CÉLULAS GE

[0561] As células que apresentam modificação de CD163 ou CD1D foram usadas para SCNT para produzir porcos knockout CD163 e CD1D (Figura 3). Sete transferências de embriões (CD163 Tabela 9), seis transferências de embriões (CD163-sem Neo) e cinco transferências de embriões (CD1D) em leitoas receptoras foram realizadas com embriões de SCNT de fibroblastos fetais masculinos e femininos transfectados com sistemas CRISPR/Cas9. Seis (CD163), duas (CD163-sem Neo) e quatro (CD1D) (Tabela 10) das leitoas receptoras permaneceram grávidas o termo, resultando em taxas de gravidez de 85,7%, 33,3% e 80%, respectivamente.

Das receptoras de CD163, cinco deram à luz leitões saudáveis por cesariana.

Uma (O044) pariu naturalmente. O tamanho da ninhada variou de um a oito.

Quatro porcos foram sacrificados por causa da deficiência de desenvolvimento após o nascimento. Um leitão foi sacrificado devido a uma grave fenda palatina. Todos os leitões restantes parecem saudáveis (Figura 3, painel C).

Duas ninhadas de leitões machos resultantes de fibroblastos fetais transfectados com CRISPR 10 e DNA doador descrito na Figura 3, o painel B tinha uma deleção de 30 pb no éxon 7 adjacente a CRISPR 10 e uma deleção adicional de 1476 pb do íntron anterior, removendo assim a junção íntron 6/ éxon 7 de CD163 (Figura 3, painel E). Os genótipos e as traduções previstas estão resumidos na Tabela 11. Um leitão macho e uma ninhada fêmea (4 leitões) foram obtidos a partir da transfecção CD163-sem Neo de células SIGLEC1 previamente modificadas. Todos os cinco leitões foram inativos duplos para SIGLEC1 e CD163. O leitão macho teve uma modificação bialélica de CD163 com uma deleção de 28 pb no éxon 7 em um alelo e uma deleção de 1387 pb no outro alelo que incluía uma deleção parcial do éxon 7 e deleção completa do éxon 8 e do íntron anterior, removendo assim a junção íntron éxon. Os leitões fêmeas tinham uma mutação bialélica de CD163, incluindo uma deleção de 1382 pb com uma inserção de 11 pb em um alelo e uma deleção de 1720 pb de CD163 no outro alelo. Um resumo das modificações de CD163 e as traduções previstas pode ser encontrado na Tabela 11. Um resumo das modificações CD1D e traduções previstas por modificação CRISPR pode ser encontrado na Tabela 12. Resumidamente, nasceram uma ninhada de fêmeas e duas ninhadas de machos, resultando em 13 leitões. Um leitão morreu imediatamente após o nascimento. Doze dos 13 leitões continham uma deleção bialélica ou homozigótica de CD1D (Figura 3, painel F). Um leitão era WT.

TABELA 9. DADOS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES PARA CD163. Fonte Dia Identificação # Embriões de Resultado Linhagem* Sexo do do porco Transferidos Oócito do Leitão Estro † 4 leitões CD163 vivos (2 O047 CRISPR Masculino 240 ART 2 sacrificados NT após o nascimento) CD163 3 leitões O015 CRISPR Masculino 267 ART 1 vivos (todos NT saudáveis) 7 leitões vivos (1 CD163 nascido O044 CRISPR Masculino 206 ART 1 morto, 1 NT sacrificado após o nascimento) 1 leitão CD163 macho O053 CRISPR Masculino 224 ART 2 (sacrificado

NT no dia 13) CD163 O08 Masculino 226 ART 1 0 leitões

CRISPR

Fonte Dia Identificação # Embriões de Resultado Linhagem* Sexo do do porco Transferidos Oócito do Leitão Estro †

NT 8 leitões CD163 vivos (1 O094 CRISPR Feminino 193 MU 2 sacrificado NT devido a FTT) 9 leitões vivos (2 CD163 sacrificados O086 CRISPR Feminino 213 MU 1 no dia 0, 2

NT devido a FTT) CD163 injetado O082 com Masculino/Feminino 50 Blástico MU 5 0 leitões

CRISPR 10/131 CD163 injetado 4 leitões O083 com Masculino 46 Blástico MU 5 vivos

CRISPR 10/131 CD163 1 leitão

CRISPR O99 Masculino 156 ART 1 vivo, 1 NT-sem leitão morto Neo CD163

CRISPR O128 Masculino 196 ART 2 0 leitões NT-sem Neo CD163

CRISPR O100 Masculino 261 MU 3 0 leitões NT-sem Neo CD163

CRISPR O134 Masculino/Feminino 181 MU 1 0 leitões NT-sem Neo CD163 CRISPR 4 leitões 200889 Feminino 202 ART 1 NT-sem vivos Neo CD163

CRISPR O135 Feminino 169 ART 2 0 leitões NT-sem Neo

[0562] * A linhagem CD163 CRISPR NT representa embriões criados por NT com uma linhagem de fibroblasto fetal modificada por transfecção. Os embriões injetados com CRISPR eram embriões IVF injetados no estágio celular 1 com RNA guia de CD163 com RNA CAS9. A linhagem fetal CD163 CRISPR NT-sem Neo representa embriões criados por NT com um fibroblasto fetal previamente modificado que já era uma linhagem Neo resistente modificada por transfecção sem o uso de um marcador selecionável.

[0563] † MU refere-se a oócitos de leitoas que foram aspirados e maturados na Universidade de Missouri, conforme descrito na seção de IVF dos Materiais e Métodos. ART refere-se a oócitos de porcas que foram comprados e maturados conforme descrito na seção SCNT dos Materiais e Métodos.

TABELA 10. DADOS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES PARA CD1D. # Font Dia Identificaç Embriões e de do ão do Linhagem * Sexo Resultado Transferid Oócit Estr porco os o† o 200888 CD1D CRISPR NT Masculino 201 ART 2 7 leitões vivos O61 CD1D CRISPR NT Masculino 239 ART 0 4 leitões vivos O164 CD1D CRISPR NT Feminino 199 MU 2 0 leitões O156 CD1D CRISPR NT Feminino 204 MU 2 0 leitões 4 leitões CD1D injetado Masculino/ O165 55 Blástico MU 6 (1 fêmea, 3 4800/5350 Feminino machos) CD1D injetado Masculino/ O127 55 Blástico MU 6 0 leitões 4800/5350 Feminino O121 CD1D CRISPR NT Feminino 212 ART 1 2 leitões vivos

[0564] * A linhagem CD1D CRISPR NT representa embriões criados por NT com uma linhagem de fibroblasto fetal modificada por transfecção. Os embriões injetados com CRISPR eram embriões IVF injetados no estágio celular 1 com RNA guia de CD1D com RNA CAS9.

[0565] † MU refere-se a oócitos de leitoas que foram aspirados e maturados na Universidade de Missouri, conforme descrito na seção de IVF dos Materiais e Métodos. ART refere-se a oócitos de porcas que foram comprados e maturados conforme descrito na seção SCNT dos Materiais e Métodos.

TABELA 11. GENÓTIPO E PREDIÇÃO TRANSLACIONAL PARA PORCOS CD163-

MODIFICADOS

[0566] Alguns porcos contêm um tipo de modificação bialélica, mas têm apenas um alelo descrito e outro alelo modificado que não foi amplificado por PCR. Mecanismo de Em referência a SEQ ID NO: Nº de leitões Tradução de Tamanho de SEQ ID NO† terminação prematuro Descrição Códon de proteína* Ninhada INDELs reparo Tipo 47 63 7 NHEJ Bialélico Deleção Deleção de Δ422–527 Não Deleçã 98 KO ou CD163 e de 1506 pb 30 pb no o de nt 64 éxon 7 1.525 Outro alelo ao nt Não 3.030 caracterizado , não amplificável 65 3 NHEJ Bialélico Inserção Inserção no KO Sim Inserçã 99 de 7 pb éxon 7 (491) o entre nt

3.148 e

3.149 a 65 2 NHEJ Bialélico Deleção Deleção KO Sim ** ** de 503 pb parcial do (491) éxon 7 e 8 Outro alelo Não caracterizado 65 2 NHEJ Bialélico Deleção Deleção Δ422–631 Não Deleçã 100 CD163 de 1280 pb completa dos o de nt éxons 7 e 8 2.818 101 Δ422–631 Não ao nt CD163 Deleção Deleção 4.097 de 1373 pb completa dos éxons 7 e 8 Deleçã o de nt

2.724 ao nt

Mecanismo de Em referência a SEQ ID NO: Nº de leitões Tradução de Tamanho de SEQ ID NO† terminação prematuro Descrição Códon de proteína* Ninhada INDELs reparo Tipo 47

4.096 66 1 NHEJ Homozig Inserção Inserção da ** ** oto de 2015 pb estrutura do vetor de direcionamen to no éxon 7 67- 1 NHEJ Bialélico Deleção Deleção no KO Sim Deleçã 102 1 de 11 pb éxon 7 (485) o de nt

3.137 Inserção ao nt 103 de 2 pb, Inserção no 3.147 deleção de éxon 7 377 pb no Inserçã íntron 6 o de 2 pb entre nt

3.149 e nt

3.150 b com uma deleção de 377 pb de nt

2.573 ao nt

2.949 67- 1 NHEJ Bialélico Deleção Deleção no KO Sim Deleçã 104 2 de 124 pb éxon 7 (464) o de nt

3.024 Δ429–470 ao nt 105 CD163 Deleção Deleção no Não 3.147 de 123 pb éxon 7 Deleçã o de nt

3.024 ao nt

3.146 67- 1 NHEJ Bialélico Inserção Inserção no KO Sim Inserçã 106 3 de 1 pb éxon 7 (489) o entre nt

3.147 e Outro alelo Não 3.148c

Mecanismo de Em referência a SEQ ID NO: Nº de leitões Tradução de Tamanho de SEQ ID NO† terminação prematuro Descrição Códon de proteína* Ninhada INDELs reparo Tipo 47 caracterizado , não amplificável 67- 1 NHEJ Bialélico Deleção Deleção no KO Sim Deleçã 107 4 de 130 pb éxon 7 (462) o de nt

3.030 Δ430–474 ao nt 108 CD163 Deleção Deleção no Não 3.159 de 132 pb éxon 7 Deleçã o de nt

3.030 ao nt

3.161 68 6 NHEJ Bialélico Deleção Deleção Δ422–631 Não Deleçã 109 CD163 e de 1467 pb completa dos o de nt 69 éxons 7 e 8 2.431 ao nt Outro alelo Não 3.897 caracterizado , não amplificável 68 2 NHEJ Bialélico Deleção Deleção no Δ435–478 Não Deleçã 110 CD163 e de 129 pb, éxon 7 o de nt 69 deleção de 488 ao 1930 pb no nt íntron 6 2.417 no éxon 6, a sequên Não cia Outro alelo caracterizado deletad , não aé amplificável substitu ída com uma inserçã o de 12 pb d começa ndo em

Mecanismo de Em referência a SEQ ID NO: Nº de leitões Tradução de Tamanho de SEQ ID NO† terminação prematuro Descrição Códon de proteína* Ninhada INDELs reparo Tipo 47 nt 488 e uma deleção adicion al de 129 pb de nt

3.044 ao nt

3.172 65 3 WT Porcos do SEQ ID 47 e tipo NO: 47 69 selvagem criados a partir de uma colônia mista 70 2 NHEJ Em Deleção Deleção no KO Sim Deleçã 111 SIGLEC de 28 pb éxon 7 (528) o de nt 1–/– 3.145 Bialélico KO ao nt 112 Deleção Deleção Não 3.172 de 1387 pb parcial no éxon 7 e Deleçã todo o éxon o de nt 8 3.145 ao nt

4.531 73 4 NHEJ Em Deleção Deleção KO Não Deleçã 113 SIGLEC de 1382 pb parcial no o de nt 1–/– + Inserção éxon 7 e 3.113 Bialélico de 11 pb todo o éxon ao nt 8 4.494, 114 sequên Δ422–631 cia CD163 Deleção deletad de 1720 pb a Deleção substitu completa dos ída éxons 7 e 8 com uma inserçã o de 11 pbe

Mecanismo de Em referência a SEQ ID NO: Nº de leitões Tradução de Tamanho de SEQ ID NO† terminação prematuro Descrição Códon de proteína* Ninhada INDELs reparo Tipo 47 começa ndo em nt

3.113 Deleçã o de nt

2.440 ao nt

4.160 * KO, knockout ** Não incluído porque os leitões foram sacrificados.

† SEQ ID NOs nesta coluna referem-se às SEQ ID NOs para as sequências que mostram os INDELs em relação à SEQ ID NO: 47. a A sequência inserida foi TACTACT (SEQ ID NO: 115) b A sequência inserida foi AG. c A sequência inserida era um único resíduo de adenina (A). d A sequência inserida foi TGTGGAGAATTC (SEQ ID NO: 116). e A sequência inserida foi AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).

TABELA 12. GENÓTIPO E PREDIÇÃO TRANSLACIONAL PARA PORCOS CD1D-

MODIFICADOS Númer Traduçã Ninhad Mecanismo Tamanho de o de Tipo Descrição o de a de reparo INDEL leitões proteína Deleção 158, Homozigot Deleção de 11 NHEJ do éxon 3, KO* 159 o 1653 pb 4e5 Deleção Homozigot Deleção de do éxon 5 167 2 NHEJ KO o 1265 pb e 72 pb do éxon 6 Remoção Deleção de 24 do códon 166-1 1 NHEJ Bialélico KO pb de iniciação

Númer Traduçã Ninhad Mecanismo Tamanho de o de Tipo Descrição o de a de reparo INDEL leitões proteína no éxon 3 Interrupçã o do Deleção de 27 códon de pb iniciação no éxon 3 Deleção de 362 Deleção pb + 5 pb do éxon 3 Adição de Inserção de 6 pb 6 pb antes + do códon 166-2 1 NHEJ Bialélico CD1Dko/+ incompatibilidad de e de 2 pb iniciação no éxon 3 Remoção do códon de Deleção de iniciação 1598 pb no éxon 3 e deleção dos éxons 4,5 Adição de G/T no éxon 3 166-3 1 NHEJ Bialélico Inserção de 1 pb antes do CD1D+/+ códon de iniciação no éxon 3 Adição de A no éxon Homozigot 3 antes do 166-4 1 NHEJ Inserção de 1 pb CD1D+/+ o códon de iniciação no éxon 3 * KO, knockout EFICIÊNCIA DO SISTEMA CRISPR/CAS9 EM ZIGOTOS SUÍNOS

[0567] Com base na interrupção direcionada de CD163 e CD1D em células somáticas usando o sistema CRISPR/Cas9, esta abordagem foi aplicada à embriogênese porcina. Em primeiro lugar, a eficácia do sistema CRISPR/Cas9 em embriões em desenvolvimento foi testada. O sistema

CRISPR/Cas9 direcionado a eGFP foi introduzido em zigotos fertilizados com sêmen de um varrão heterozigoto para o transgene eGFP. Após a injeção, embriões subsequentes expressando eGFP foram monitorados. Várias concentrações do sistema CRISPR/Cas9 foram testadas e a citotoxicidade do sistema CRISPR/Cas9 entregue foi observada (Figura 4, painel A); o desenvolvimento embrionário após a injeção de CRISPR/Cas9 foi menor em comparação com o controle. No entanto, todas as concentrações de CRISPR/Cas9 que foram examinadas foram eficazes na geração de modificação de eGFP porque nenhum embrião com expressão de eGFP foi encontrado no grupo injetado com CRISPR/Cas9 (Figura 4, painel B); dos embriões de controle não injetados 67,7% eram verdes, indicando expressão de eGFP. Quando os blastocistos individuais foram genotipados, foi possível identificar pequenas mutações perto dos sítios de ligação CRISPR (Figura 4, painel C). Com base na toxicidade e eficácia, 10 ng/μl de gRNA e mRNA de Cas9 foram usados para os seguintes experimentos.

[0568] Quando os componentes de CRISPR/Cas9 projetados para direcionar o CD163 foram introduzidos em zigotos presumíveis, a edição direcionada dos genes nos blastocistos subsequentes foi observada. Quando blastocistos individuais foram genotipados para mutação de CD163, mutações específicas foram encontradas em todos os embriões (100% de eficiência de GE). Mais importante, embora os embriões pudessem ser encontrados com modificações homozigóticas ou bialélicas (8/18 e 3/18, respectivamente) (Figura 5), genótipos em mosaico (modificações monoalélicas) também foram detectados (4/18 embriões). Alguns embriões (8/10) do grupo foram injetados com 2 ng/μl de Cas9 e 10 ng/μl de CRISPR e nenhuma diferença foi encontrada na eficiência da mutagênese. Em seguida, com base nos resultados in vitro, dois CRISPRs representando diferentes gRNA foram introduzidos para interromper CD163 ou CD1D durante a embriogênese para induzir uma deleção específica dos genes alvo. Como resultado, foi possível induzir com sucesso uma deleção projetada de CD163 e CD1D introduzindo dois guias. Uma deleção projetada é definida como uma deleção que remove a sequência genômica entre os dois guias introduzidos. Entre os embriões que receberam dois CRISPRs direcionados a CD163, todos, exceto um embrião, resultaram em uma modificação direcionada de CD163. Além disso, descobriu- se que 5/13 embriões tinham uma deleção projetada em CD163 (Figura 6, painel A) e 10/13 embriões pareciam ter modificação de CD163 de forma homozigótica ou bialélica. O direcionamento de CD1D com dois CRISPRs também foi eficaz porque todos os embriões (23/23) mostraram uma modificação de CD1D. No entanto, a deleção projetada de CD1D só pode ser encontrada em dois embriões (2/23) (Figura 6, painel B). Cinco dos vinte e três embriões possuindo genótipos em mosaico também foram encontrados, mas o restante dos embriões tinha modificação homozigótica ou bialélica de CD1D.

Finalmente, foi testado se vários genes podem ser direcionados pelo sistema CRISPR/Cas9 dentro do mesmo embrião. Para este propósito, o direcionamento de CD163 e eGFP foi realizado nos zigotos que foram fertilizados com sêmen heterozigoto eGFP. Quando os blastocistos dos embriões injetados foram genotipados para CD163 e eGFP, descobriu-se que CD163 e eGFP foram direcionados com sucesso durante a embriogênese. Os resultados de sequenciamento demonstraram que vários genes podem ser direcionados pela introdução de vários CRISPRs com Cas9 (Figura 6, painel C).

PRODUÇÃO DE MUTANTES CD163 E CD1D A PARTIR DE ZIGOTOS INJETADOS COM CRISPR/CAS9

[0569] Com base no sucesso do estudo in vitro anterior, alguns zigotos injetados com CRISPR/Cas9 foram produzidos e 46-55 blastocistos foram transferidos por receptor (porque este número se mostrou eficaz na produção de porcos a partir de embriões derivados in vitro). Quatro transferências de embriões foram realizadas, duas de cada para CD163 e CD1D, e uma gravidez para cada modificação foi obtida. Quatro leitões saudáveis foram produzidos com modificações no CD163 (Tabela 9). Todos os leitões, ninhada 67 da porca receptora ID O083, apresentaram modificação homozigótica ou bialélica de CD163 (Figura 7). Dois leitões mostraram a deleção projetada de CD163 pelos dois CRISPRs entregues. Todos os leitões eram saudáveis. Para CD1D, uma gravidez também produziu quatro leitões (ninhada 166 da porca receptora de identificação O165): uma fêmea e três machos (Tabela 10). Um leitão (166-1) carregava uma mutação em mosaico de CD1D, incluindo uma deleção de 362 pb que removeu completamente o éxon 3 que contém o códon de iniciação (Figura 8). Um leitão continha uma inserção de 6 pb com uma incompatibilidade de 2 pb em um alelo com uma grande deleção no outro alelo. Dois leitões adicionais tiveram uma inserção bialélica de um único pb. Não foram detectadas mutações em mosaico para CD163.

DISCUSSÃO

[0570] Um aumento na eficiência da produção de porcos GE pode ter um amplo impacto ao fornecer mais porcos GE para a agricultura e biomedicina. Os dados descritos acima mostram que, usando o sistema CRISPR/Cas9, porcos GE com mutações específicas podem ser produzidos com alta eficiência. O sistema CRISPR/Cas9 foi aplicado com sucesso para editar genes em células somáticas e em embriões pré-implantação.

[0571] Quando o sistema CRISPR/Cas9 foi introduzido em células somáticas, ele induziu com sucesso a interrupção direcionada dos genes alvo por NHEJ, mas não aumentou a capacidade de direcionamento por HR. A eficiência de direcionamento de CRISPR/Cas9 individual em células somáticas foi variável, o que indicou que o projeto do guia pode afetar a eficiência de direcionamento. Especificamente, não foi possível encontrar a modificação direcionada de CD1D quando CRISPR 5350 e Cas9 foram introduzidos em células somáticas. Isso sugere que pode ser benéfico projetar vários gRNAs e validar suas eficiências antes de produzir porcos. A razão para a falta de reparo dirigido por HR com a presença de DNA doador ainda não está clara. Após a triagem de 886 colônias (CD163 e CD1D) transfectadas com CRISPR e DNA doador, apenas uma colônia apresentou evidência de um evento parcial de HR.

Os resultados demonstraram que o sistema CRISPR/Cas9 funcionou com DNA doador introduzido para causar grandes deleções inesperadas nos genes alvo, mas não aumentou a eficiência de HR para esses dois vetores de direcionamento específicos. No entanto, um mecanismo específico para a observação de grande deleção não é conhecido. Relatórios anteriores de nosso grupo sugeriram que um DNA doador pode ser usado efetivamente com um ZFN para induzir o reparo dirigido por HR. Da mesma forma, um aumento na eficiência de direcionamento foi observado quando o DNA doador foi usado com o sistema CRISPR/Cas9, mas o reparo dirigido por HR completo não foi observado. Em um estudo anterior usando ZFN, foi observado que a modificação direcionada pode ocorrer por meio de uma combinação de HR e NHEJ porque uma recombinação parcial foi encontrada do DNA doador introduzido após DSBs induzidas pelo ZFN. Uma explicação pode ser que as vias de HR e NHEJ não são independentes, mas podem agir juntas para completar o processo de reparo após DSBs induzidas por endonucleases teleguiadas. Concentrações mais altas de CRISPRs podem melhorar a eficiência de direcionamento em células somáticas, embora nenhuma diferença estatística tenha sido encontrada nesses resultados experimentais. Isso pode sugerir que CRISPR é um fator limitante no sistema CRISPR/Cas9, mas é necessária uma validação adicional. As células direcionadas foram usadas com sucesso para produzir porcos GE por meio de SCNT, indicando que a aplicação de CRISPR/Cas9 não afeta a capacidade das células de serem clonadas. Alguns leitões foram sacrificados por causa de problemas de saúde; no entanto, isso não é incomum em leitões derivados de SCNT.

[0572] Quando o sistema CRISPR/Cas9 foi introduzido em embriões em desenvolvimento por injeção de zigoto, quase 100% dos embriões e porcos continham um INDEL no gene alvo, demonstrando que a tecnologia é muito eficaz durante a embriogênese. A eficiência observada durante este estudo supera as frequências relatadas em outros estudos utilizando endonucleases teleguiadas durante a embriogênese. Uma diminuição no número de embriões atingindo o estágio de blastocisto sugeriu que a concentração de CRISPR/Cas9 introduzida neste estudo pode ser tóxica para embriões. Otimização adicional do sistema de entrega pode aumentar a capacidade de sobrevivência dos embriões e, assim, melhorar a eficiência geral do processo. A taxa de mutagênese de quase 100% observada aqui foi diferente de um relatório anterior em inativação mediada por CRISPR/Cas9 em porcos; no entanto, a diferença de eficiência entre os estudos pode ser uma combinação do guia e do alvo selecionados. No presente estudo, concentrações mais baixas de CRISPR/Cas9 (10 ng/μl cada) foram eficazes na geração de mutações em embriões em desenvolvimento e na produção de porcos GE. A concentração é inferior à relatada anteriormente em zigotos suínos (125 ng/μl de Cas9 e 12,5 ng/μl de CRISPR). A concentração mais baixa de componentes CRISPR/Cas9 poderia ser benéfica para embriões em desenvolvimento porque a introdução de quantidades excessivas de ácido nucleico em embriões em desenvolvimento pode ser tóxica. Alguns genótipos em mosaico foram observados em embriões injetados com CRISPR/Cas9 a partir dos ensaios in vitro; no entanto, apenas um leitão produzido por meio da abordagem tinha um genótipo em mosaico. Potencialmente, uma injeção com componentes de CRISPR/Cas9 pode ser mais eficaz do que a introdução de outras endonucleases teleguiadas porque o genótipo em mosaico foi considerado um obstáculo principal de uso do sistema CRISPR/Cas9 em zigotos. Outro benefício de usar o sistema CRISPR/Cas9 demonstrado pelos presentes resultados é que nenhum porco knockout para CD163 produzido a partir de zigotos derivados de IVF injetados com sistema CRISPR/Cas9 foi perdido, enquanto alguns leitões resultantes de SCNT foram sacrificados após alguns dias. Isso sugere que a tecnologia poderia não apenas contornar a necessidade do SCNT na geração de porcos knockout, mas poderia também superar os problemas de saúde comuns associados ao SCNT. Agora que a injeção de mRNA CRISPR/Cas9 em zigotos foi otimizada, os experimentos futuros incluirão também a co-injeção de DNA doador.

[0573] O presente estudo demonstra que a introdução de dois CRISPRs com Cas9 em zigotos pode induzir deleções cromossômicas em embriões em desenvolvimento e produzir porcos com uma deleção pretendida, isto é, deleção específica entre os dois guias CRISPR. Essa deleção projetada pode ser benéfica porque é possível especificar o tamanho da deleção em vez de depender de eventos aleatórios causados por NHEJ. Especificamente, se houver inserção/ deleção de nucleotídeos em um múltiplo de três causado por uma endonuclease teleguiada, a mutação pode resultar em uma mutação hipomórfica porque nenhuma mudança de quadro ocorreria. No entanto, com a introdução de dois CRISPRs, é possível causar deleções maiores que terão uma chance maior de gerar proteínas não funcionais. Curiosamente, os CD1D CRISPRs foram projetados em uma área maior no genoma do que o CD163; havia uma distância de 124 pb entre CD163 CRISPR 10 e 131 enquanto havia uma distância de 550 pb entre CRISPR 4800 e 5350 para CD1D. A distância maior entre os CRISPRs não foi muito eficaz em gerar uma deleção, conforme mostrado no estudo. No entanto, como o presente estudo incluiu apenas um número limitado de observações e há necessidade de considerar a eficácia dos CRISPRs individuais, o que não é abordado aqui, é necessário estudo adicional para verificar a relação entre a distância entre os CRISPRs e a probabilidade de causar as deleções pretendidas.

[0574] O sistema CRISPR/Cas9 também foi eficaz no direcionamento de dois genes simultaneamente dentro do mesmo embrião com a única etapa extra sendo a introdução de um CRISPR adicional com crRNA.

Isso ilustra a facilidade de interromper genes múltiplos em comparação com outras endonucleases teleguiadas. Esses resultados sugerem que essa tecnologia pode ser usada para direcionar agrupamentos de genes ou famílias de genes que podem ter um efeito compensatório, sendo difícil determinar o papel de genes individuais, a menos que todos os genes sejam interrompidos.

Os resultados demonstram que a tecnologia CRISPR/Cas9 pode ser aplicada na geração de porcos GE, aumentando a eficiência do direcionamento de genes em células somáticas e por injeção direta de zigoto.

EXEMPLO 2: RESISTÊNCIA AUMENTADA A PRRSV EM SUÍNOS COM UMA SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM GENE QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA CD163

[0575] O Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva dos Suínos (PRRSV) devastou a indústria suína no último quarto de século. É mostrado no presente exemplo que os animais CD163 nulos não apresentam sinais clínicos de infecção, patologia pulmonar, viremia ou produção de anticorpos que são todas marcas de infecção por PRRSV. Não apenas um mediador de entrada de PRRSV foi confirmado; mas se animais criados de forma semelhante pudessem entrar no suprimento de alimentos, então uma estratégia para prevenir perdas econômicas significativas e sofrimento animal foi descrita.

MATERIAIS E MÉTODOS GENOTIPAGEM

[0576] A genotipagem foi baseada no sequenciamento de DNA e sequenciamento de mRNA. O genótipo do macho tinha uma deleção de 11 pb em um alelo que, quando traduzido, previu 45 aminoácidos no domínio 5, resultando em um códon de terminação prematuro no aminoácido 64. No outro alelo, houve uma adição de 2 pb no éxon 7 e deleção de 377 pb no íntron antes do éxon 7 que, quando traduzido, previu os primeiros 49 aminoácidos do domínio 5, resultando em um códon de terminação prematuro no aminoácido

85. Uma porca teve uma adição de 7 pb em um alelo que, quando traduzido, previu os primeiros 48 aminoácidos do domínio 5, resultando em um códon de terminação prematuro no aminoácido 70. O outro alelo era não caracterizado (A), uma vez que não havia banda do éxon 7 por PCR ou PCR de longo alcance de 6,3 kb. As outras 3 porcas eram clones e tinham uma deleção de 129 pb no éxon 7 que se prevê que resulte na deleção de 43 aminoácidos do domínio 5. O outro alelo era não caracterizado (B).

O CRESCIMENTO DE PRRSV EM CULTURA E A PRODUÇÃO DE INÓCULO DE VÍRUS

PARA A INFECÇÃO DE PORCOS ESTÃO COBERTOS PELO PEDIDO APROVADO DO IBC 973

[0577] Uma cepa tipo de PRRSV, isolado NVSL 97-7895 (GenBank #AF325691 2001-02-11), foi cultivada conforme descrito no protocolo aprovado de IBC 973. Este isolado de laboratório foi usado em estudos experimentais por cerca de 20 anos (Ladinig et al., 2015). Um segundo isolado foi usado para o segundo ensaio, KS06-72109, conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013).

INFECÇÃO DE PORCOS COM PRRSV

[0578] Um protocolo de infecção padronizado para PRRSV foi usado para a infecção de porcos. Leitões com três semanas de idade foram inoculados com aproximadamente 104 TCID50 de vírus PRRS que foi administrado por vias intramuscular (IM) e intranasal (IN). Os porcos foram monitorados diariamente e os que apresentavam sintomas de doença foram tratados de acordo com as recomendações dos veterinários CMG. Porcos que apresentam grande aflição e estão em perigo de sucumbir à infecção são sacrificados humanamente e as amostras são coletadas. A equipe e os veterinários desconheciam o status genético dos porcos para eliminar a tendência na avaliação ou no tratamento. PRRSV está presente nos fluidos corporais durante a infecção; portanto, amostras de sangue foram coletadas e armazenadas a -80 °C até serem medidas para determinar a quantidade ou o grau de viremia em cada porco. No final do experimento, os porcos foram pesados e sacrificados humanamente, e os tecidos coletados e fixados em formalina tamponada a 10%, embebidos em parafina e processados para histopatologia por um patologista certificado.

PONTUAÇÃO DE FENÓTIPO DOS PORCOS DESAFIADOS

[0579] O fenótipo dos porcos foi cegamente pontuado diariamente como segue: Qual é a atitude do porco? Pontuação de atitude: 0: BAR, 1: QAR, 2: Ligeiramente deprimido, 3: Deprimido, 4: Moribundo. Qual é a condição corporal do porco? Pontuação de condição corporal: 1: Emaciado, 2: Magro, 3: Ideal, 4: Gordo, 5: Gordura excessiva/ Obeso. Qual é a temperatura retal do porco? Temperatura corporal normal de 101,6–103,6 °F (febre considerada ≥ 104 °F). Existe alguma manqueira (grau)? Qual membro? Avalie os membros quanto a inchaço nas articulações e lesões no casco (verifique a parte inferior e as laterais do casco). Pontuação de manqueira: 1: sem manqueira, 2: ligeiramente irregular ao caminhar, parece rígido em algumas articulações, mas sem manqueira, 3: manqueira leve, claudicação leve ao caminhar, 4: manqueira moderada, claudicação óbvia incluindo dedo tocando o coxo, 5: manqueira severa, sem sustentação de peso no membro, precisa de incentivo para ficar de pé/ andar. Existe alguma dificuldade respiratória (grau)? Existe respiração com a boca aberta? Existe alguma secreção nasal (cor da secreção, quantidade de secreção: leve/ moderada/ grave)? Você notou o animal tossindo? Existe alguma secreção ocular? Pontuação respiratória: 0: Normal, 1:

dispnéia e/ou taquipnéia leve quando estressado (quando manuseado), 2: dispnéia e/ou taquipnéia leve quando em repouso, 3: dispnéia e/ou taquipnéia moderada quando estressado (quando manuseado), 4: dispnéia e/ou taquipnéia moderada quando em repouso, 5: dispnéia e/ou taquipnéia grave quando estressado (quando manuseado), 6: dispnéia e/ou taquipnéia grave quando em repouso. Há evidência de diarreia (grau) ou vômito? Existe sangue ou muco? Pontuação de diarreia: 0: sem fezes notadas, 1: fezes normais, 2: fezes moles, mas formadas (consistência de iogurte macio, cria torta de vaca), 3: diarreia líquida de coloração castanha/ marrom-claro com material fecal particulado, 4: diarreia líquida de coloração castanha/ marrom-claro sem material fecal particulado, 5: diarreia líquida com aparência semelhante à água.

[0580] Este sistema de pontuação foi desenvolvido pela Dra.

Megan Niederwerder na KSU e é baseado nas seguintes publicações (Halbur et al., 1995; Merck; Miao et al., 2009; Patience e Thacker, 1989; Winckler e Willen, 2001) Pontuações e temperaturas foram analisadas usando ANOVA separada com base nos genótipos como tratamentos.

MEDIÇÃO DE VIREMIA DE PRRSV

[0581] A viremia foi determinada por meio de duas abordagens. A titulação do vírus foi realizada adicionando diluições em série 1:10 de soro a células MARC-145 confluentes em uma placa de 96 poços. O soro foi diluído em meio essencial mínimo de Eagle suplementado com 8% de soro fetal bovino, penicilina, estreptomicina e anfotericina B conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013). As células foram examinadas após 4 dias de incubação para a presença de um efeito citopático usando microscópio. A maior diluição mostrando um efeito citopático foi pontuada como o ponto final da titulação. O RNA total foi isolado do soro usando o kit de isolamento de RNA viral MagMAX-96 da Life Technologies para medir o ácido nucleico viral. A reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa foi realizada usando o kit EZ-PRRSV MPX 4.0 da Tetracore em um sistema de PCR em tempo real CFX-96 (Bio-Rad) de acordo com as instruções do fabricante. Cada reação (25 µl) continha RNA de 5,8 µl de soro. A curva padrão foi construída preparando diluições em série de um controle de RNA fornecido no kit (Tetracore). O número de moldes por PCR é relatado.

COLORAÇÃO DE SIGLEC1 E CD163 DE CÉLULAS PAM

[0582] Macrófagos alveolares suínos (PAMs) foram coletados por excisão dos pulmões e preenchendo-os com ~ 100 ml de solução salina tamponada com fosfato fria. Depois de recuperar as células de lavagem com solução salina tamponada com fosfato, foram peletizadas e ressuspensas em 5 ml de solução salina tamponada com fosfato fria e armazenadas em gelo.

Aproximadamente 107 PAMs foram incubados em 5 ml dos vários anticorpos (anti-CD169 porcino (clone 3B11/ 11; AbD Serotec); anti-CD163 porcino (clone 2A10/ 11; AbD Serotec)) diluído em solução salina tamponada com fosfato com 5% de soro fetal bovino e azida sódica a 0,1% por 30 minutos em gelo. As células foram lavadas e ressuspensas em 1/100 de diluição de IgG de cabra anti-camundongo conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Life Technologies) diluído em tampão de coloração e incubado por 30 minutos em gelo. Pelo menos 104 células foram analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCalibur e software Cell Quest (Becton Dickinson).

MEDIÇÃO DE IG ESPECÍFICA DE PRRSV

[0583] Para medir a Ig específica de PRRSV, a proteína N de PRRSV recombinante foi expressa em bactérias (Trible et al., 2012) e conjugada com contas magnéticas Luminex usando um kit (Luminex Corporation). As contas acopladas à proteína N foram diluídas em solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra para 2.500 contas/ 50µl e colocadas nos poços de uma placa de poliestireno de fundo redondo de 96 poços. O soro foi diluído 1:400 em solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra e 50µl foram adicionados em poços em duplicata e incubados durante 30 minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Em seguida, a placa foi lavada (3X) com solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra e foi adicionado 50µl de anticorpo secundário de cabra anti-suíno purificado por afinidade conjugado com biotina-SP (IgG, Jackson ImmunoResearch) ou IgM de cabra anti-suíno purificado por afinidade marcado com biotina (KPL) diluído para 2 µg/ml em solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra. As placas foram lavadas (3X) após 30 minutos de incubação e, em seguida, foram adicionados 50µl de ficoeritrina conjugada com estreptavidina (2 µg/ml (Moss, Inc.) em solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra). As placas foram lavadas 30 minutos mais tarde e as microesferas foram ressuspensas em 100 µl de solução salina tamponada com fosfato contendo 10% de soro de cabra e analisadas usando o software MAGPIX e o Luminex xPONENT 4.2. A intensidade média de fluorescência (MFI) é relatada.

RESULTADOS

[0584] Mutações em CD163 foram criadas usando a tecnologia CRISPR/Cas9 conforme descrito acima no Exemplo 1. Vários animais fundadores foram produzidos a partir da injeção de zigoto e da transferência nuclear de células somáticas. Alguns desses fundadores foram cruzados criando progênie para estudo. Um único macho fundador foi cruzado com fêmeas com dois genótipos. O macho fundador (67-1) possuía uma deleção de 11 pb no éxon 7 em um alelo e uma adição de 2 pb no éxon 7 (e deleção de 377 pb no íntron anterior) do outro alelo e foi previsto para ser um animal nulo (CD163-/-). Uma fêmea fundadora (65-1) tinha uma adição de 7 pb no éxon 7 em um alelo e um alelo correspondente não caracterizado e, portanto, previu- se que era heterozigótica para o knockout (CD163-/?). Um segundo genótipo feminino fundador (3 animais que eram clones) continha um alelo ainda não caracterizado e um alelo com uma deleção de 129 pb no éxon 7. Prevê-se que essa deleção resulte em uma deleção de 43 aminoácidos no domínio 5. Os cruzamentos entre estes os animais resultaram em todos os leitões herdando um alelo nulo do varrão e a deleção de 43 aminoácidos ou um dos alelos não caracterizados das porcas. Além dos leitões de tipo selvagem que serviram como controles positivos para o desafio viral, isso produziu 4 genótipos adicionais (Tabela 13).

TABELA 13. GENÓTIPOS TESTADOS QUANTO À RESISTÊNCIA AO DESAFIO DE PRRSV (CEPAS NVSL E KS06) Alelos Resistência ao Desafio de PRRSV Medida por Viremia Paterno Materno NVSL KS06 Nulo Nulo Resistente N/A Nulo Δ43 Aminoácidos N/A Resistente Nulo Não caracterizado A Susceptível N/A Nulo Não caracterizado B Susceptível Susceptível Tipo selvagem Tipo selvagem Susceptível Susceptível

[0585] No desmame, leitões geneticamente editados e leitões de tipo selvagem de mesma idade foram transportados para a Universidade Estadual do Kansas para um desafio de PRRSV. Um desafio de PRRSV foi realizado conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013). Os leitões, com três semanas de idade, foram trazidos para a instalação de desafio e mantidos como um único grupo. Todos os experimentos foram iniciados após a aprovação dos comitês institucionais de uso de animais e biossegurança. Após a aclimatação, os porcos foram desafiados com um isolado de PRRSV, NVSL 97-7895 (Ladinig et al., 2015), propagado em células MARC-145 (Kim et al., 1993). Os porcos foram desafiados com aproximadamente 105 TCID50 de vírus.

Metade do inóculo foi administrado por via intramuscular e o restante administrado por via intranasal. Todos os porcos infectados foram mantidos como um único grupo, o que permitiu a exposição contínua do vírus de companheiros de cercado infectados. Amostras de sangue foram coletadas em vários dias até 35 dias após a infecção e no término, dia 35. Os porcos foram necropsiados e os tecidos fixados em formalina tamponada a 10%, embebidos em parafina e processados para histopatologia. Os sinais clínicos associados a PRRSV registados durante o curso da infecção incluíram dificuldade respiratória, inapetência, letargia e febre. Os resultados para sinais clínicos ao longo do período de estudo estão resumidos na Figura 9. Como esperado, os porcos do tipo selvagem de Tipo Selvagem (CD163 +/+) mostraram sinais precoces de infecção por PRRSV, que atingiu o pico entre os dias 5 e 14 e persistiu no grupo durante o restante do estudo. A percentagem de porcos febris atingiu o pico por volta do dia 10. Em contraste, os leitões Nulo (CD163 - /-) não mostraram evidência de sinais clínicos durante todo o período do estudo. Os sinais respiratórios durante a infecção aguda por PRRSV se refletem em alterações histopatológicas significativas no pulmão (Tabela 14). A infecção dos porcos de tipo selvagem mostrou histopatologia consistente com PRRS incluindo edema intersticial com a infiltração de células mononucleares (Figura 10). Em contraste, não houve evidência de alterações pulmonares nos porcos Nulo (CD163 -/-). O tamanho da amostra para os vários genótipos é pequeno; no entanto, as pontuações médias foram 3,85 (n = 7) para o tipo selvagem, 1,75 (n = 4) para o não caracterizado A, 1,33 (n = 3) para o não caracterizado B e 0 (n = 3) e para o nulo (CD163 -/-).

TABELA 14. AVALIAÇÃO MICROSCÓPICA DO PULMÃO Porco Genótipo Descrição Pontuação 41 Tipo selvagem 100% de congestão. Áreas multifocais de 3 edema. Infiltração de número moderado de linfócitos e macrófagos 42 Tipo selvagem 100% de congestão. Áreas multifocais de 3 edema. Infiltração de número moderado de linfócitos e macrófagos 47 Tipo selvagem 75% de infiltração multifocal com células 2

Porco Genótipo Descrição Pontuação mononucleares e edema leve 50 Tipo selvagem 75% de infiltração multifocal de células 3 mononucleares dentro de espaços alveolares e ao redor de pequenos vasos sanguíneos edema perivascular 51 Tipo selvagem 25% de atelectasia com infiltração moderada 1 de células mononucleares 52 Tipo selvagem 10% dos espaços alveolares colapsaram com 1 infiltração de um pequeno número de células mononucleares 56 Tipo selvagem 100% de infiltração intersticial difusa moderada 4 de células mononucleares. Septos interalveolares moderadamente espessados por hemorragia e edema.

45 Não caracterizado A 75% dos infiltrados multifocais de células 3 mononucleares, especialmente ao redor dos brônquios, vasos sanguíneos, espaços subpleurais e septos interalveolares.

49 Não caracterizado A 75% de infiltração multifocal moderada a 2 grande de células mononucleares. Alguns vasos com edema leve.

53 Não caracterizado A 10% de infiltração multifocal pequena de 1 células mononucleares 57 Não caracterizado A 15% de infiltração de células mononucleares 1 46 Não caracterizado B Pneumonia intersticial moderada 2 48 Não caracterizado B Edema perivascular e infiltração de células 2 mononucleares em torno de vasos de pequeno e médio porte e em torno de septos interalveolares 54 Não caracterizado B Sem alterações 0 40 Nulo Sem alterações 0 43 Nulo Sem alterações 0 55 Nulo Sem alterações 0

[0586] Os sinais clínicos de pico correlacionaram com os níveis de PRRSV no sangue. A medição do ácido nucleico viral foi realizada pelo isolamento do RNA total do soro seguido pela amplificação do RNA de PRRSV usando um teste de PCR de PRRSV em tempo real com transcriptase reversa comercial (Tetracore, Rockville, MD). Uma curva padrão foi gerada pela preparação de diluições em série de um controle de RNA de PRRSV, fornecido no kit de RT-PCR e os resultados foram padronizados como os moldes de número por 50 µl de reação de PCR. O isolado de PRRSV seguiu o curso para viremia de PRRSV nos porcos CD163+/+ de tipo selvagem (Figura 11). A viremia foi aparente no dia quatro, atingiu um pico no dia 11 e diminuiu até o final do estudo. Em contraste, o RNA viral não foi detectado nos porcos CD163- /- em qualquer momento durante o período de estudo. Consistente com a viremia, a produção de anticorpos pelos porcos de alelos nulos e não caracterizados foi detectável por 14 e aumentou até o dia 28. Não houve produção de anticorpos nos animais nulos (Figura 12). Juntos, esses dados mostram que porcos de tipo selvagem suportam a replicação de PRRSV com a produção de sinais clínicos consistentes com PRRS. Em contraste, os porcos knockout não produziram viremia nem sinais clínicos, embora os porcos tenham sido inoculados e constantemente expostos a companheiros de cercado infectados.

[0587] No final do estudo, macrófagos alveolares suínos foram removidos por lavagem pulmonar e corados para a expressão de superfície de SIGLEC1 (CD169, clone 3B11/11) e CD163 (clone 2A10/11), conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013). Níveis relativamente altos de expressão de CD163 foram detectados em animais CD163 +/+ de tipo selvagem (Figura 13).

Em contraste, os porcos CD163 -/- mostraram apenas níveis de fundo de coloração anti-CD163, confirmando assim o fenótipo knockout. Os níveis de expressão para outro marcador de macrófago CD169 foram semelhantes para porcos de tipo selvagem e knockout (Figura 14). Outros marcadores de superfície de macrófagos, incluindo MHC II e CD172 foram os mesmos para ambos os genótipos (dados não mostrados).

[0588] Embora o tamanho da amostra fosse pequeno, os porcos do tipo selvagem tenderam a ganhar menos peso ao longo do experimento (ganho médio diário de 0,81 kg ± 0,33, n = 7) em relação aos porcos dos outros três genótipos (não caracterizado A 1,32 kg ± 0,17, n = 4; não caracterizado B 1,20 kg ± 0,16, n = 3; nulo 1,21 kg ± 0,16, n = 3).

[0589] Em um segundo ensaio, 6 do tipo selvagem, 6 Δ43 aminoácidos e 6 porcos com um alelo não caracterizado (B) foram desafiados conforme descrito acima, exceto KS06-72109 que foi usado para inocular os leitões. Semelhante aos dados de NVSL, os leitões não caracterizados B e de tipo selvagem desenvolveram viremia. No entanto, nos porcos de Δ43 aminoácidos o KS06 não resultou em viremia (Figura 15; Tabela 8).

IMPLICAÇÕES E CONCLUSÕES

[0590] A doença mais clinicamente relevante para a indústria suína é a PRRS. Embora os programas de vacinação tenham sido bem- sucedidos em prevenir ou melhorar a maioria dos patógenos suínos, o PRRSV provou ser um desafio maior. Aqui o CD163 é identificado como um mediador de entrada para esta cepa viral. O varrão fundador foi criado por injeção de CRISPR/Cas9 em zigotos (Whitworth et al., 2014) e, portanto, não há transgene. Além disso, um dos alelos da porca (também criado usando CRISPR/Cas9) não contém um transgene. Assim, o leitão #40 carrega uma adição de 7 pb em um alelo e uma deleção de 11 pb no outro alelo, mas nenhum transgene. Esses alelos de resistência a vírus de CD163 representam pequenas edições do genoma, considerando que o genoma suíno tem cerca de 2,8 bilhões de pb (Groenen et al., 2012). Se animais criados de forma semelhante fossem introduzidos no suprimento de alimentos, perdas econômicas significativas poderiam ser evitadas.

EXEMPLO 3: RESISTÊNCIA AUMENTADA AO VÍRUS PRRS E GENÓTIPO 1 REPRODUTIVO PORCINO EM SUÍNOS COM DOMÍNIO 5 DE SRCR DE CD163 SUBSTITUÍDO COM DOMÍNIO 8 DE SRCR DE HOMOLOGIA SEMELHANTE A CD163

HUMANO

[0591] O CD163 é considerado o principal receptor para o vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV). Neste estudo, os porcos foram geneticamente editados (GE) para possuírem um dos seguintes genótipos: knockout completo (KO) de CD163, deleções no domínio 5 do receptor scavenger rico em cisteína (SRCR) de CD163 ou substituição (troca de domínio) do domínio 5 de SRCR com um éxon sintetizado que codifica um homólogo do domínio 8 de SRCR semelhante a CD163 humano (hCD163L1).

A imunofenotipagem de macrófagos alveolares suínos (PAMs) mostrou que os porcos com KO ou deleções de domínio 5 de SRCR não expressaram CD163 e os PAMs não suportaram infecção por PRRSV. Os PAMs de porcos que possuíam o homólogo de domínio 8 hCD163L1 expressaram CD163 e suportaram a replicação de vírus de genótipo Tipo 2, mas não Tipo 1. A infecção de porcos CD163-modificados com vírus representativos de Tipo 1 e Tipo 2 produziu resultados semelhantes. Embora os vírus Tipo 1 e Tipo 2 sejam considerados geneticamente e fenotipicamente semelhantes em vários níveis, incluindo o requisito de CD163 como um receptor, os resultados demonstram uma diferença distinta entre os genótipos de PRRSV no reconhecimento da molécula de CD163.

MATERIAIS E MÉTODOS MODIFICAÇÕES GENÔMICAS DO GENE CD163 PORCINO

[0592] Experimentos envolvendo animais e vírus foram realizados de acordo com o Guia da Federação das Sociedades de Ciência Animal para o Cuidado e Uso de Animais Agrícolas em Pesquisa e Ensino, o Ato de Bem- Estar Animal do USDA e Regulamentos de Bem-Estar Animal, e foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Biossegurança e Comitês Institucionais de Cuidado e Uso de Animais da Universidade Estadual do Kansas e da Universidade de Missouri. As mutações em CD163 usadas neste estudo foram criadas usando a tecnologia CRISPR/Cas9 conforme descrito acima nos exemplos anteriores. As mutações são diagramadas na Figura 17. A região genômica diagramada, mostrada na Figura 17, cobre a sequência do íntron 6 ao íntron 8 do gene CD163 porcino. Os íntrons e éxons diagramados na Figura 17 não estão em escala. O produto proteico previsto é ilustrado à direita de cada estrutura genômica. A expressão relativa de macrófagos, medida pelo nível de CD163 de superfície em PAMs, é mostrada na extremidade direita da Figura 17. As regiões pretas indicam íntrons; as regiões brancas indicam éxons; a região hachurada indica o mimetizador do éxon 11 de hCD163L1, o homólogo do éxon 7 suíno; e a região cinza indica um íntron sintetizado com o construto PGK Neo como mostrado na Figura 17.

[0593] O construto do gene CD163 KO-d7 (11) mostrado na Figura 17 possui uma deleção de 11 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo

3.137 ao nucleotídeo 3.147. O construto do gene CD163 KO-i7 (2), possui uma inserção de 2 pares de bases no éxon 7 entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150, bem como uma deleção de 377 pares de bases no íntron a montante do éxon 7, do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949. Prevê-se que essas edições causem mutações de deslocamentos e códons de terminação prematuros, resultando na tradução apenas parcial de SRCR 5 e do fenótipo KO. Três outras mutações produziram deleções no éxon 7. A primeira, d7(129), tem uma deleção de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo

3.172. O construto d7(129) também tem uma deleção do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 no éxon 6, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pb. Os outros dois construtos de deleção, d7(1467) e d7(1280), têm deleções completas dos éxons 7 e 8, conforme ilustrado na

Figura 17. O d7(1467) tem uma deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 e o d7(1280) tem uma deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097. Para esses construtos de deleção, os outros éxons de CD163 permaneceram intactos.

[0594] O último construto mostrado na Figura 17, HL11m, foi produzido usando um evento de direcionamento que deletou o éxon 7 e o substituiu com um éxon sintetizado que codificou um homólogo de SRCR 8 da proteína 1 semelhante a CD163 humana (domínio 8 de hCD163L1 é codificado pelo éxon 11 de hCD163L1). A sequência de peptídeo SRCR 8 foi criada fazendo alterações de 33 nucleotídeos na sequência do éxon 7 suíno. Um cassete de neomicina foi incluído no éxon sintetizado para permitir a triagem para a modificação. A SEQ ID NO: 118 fornece a sequência de nucleotídeos para o construto HL11m na região correspondente à mesma região na sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0595] Um diagrama da proteína e do gene CD163 porcino é fornecido Figura 18. Os domínios da proteína CD163 SCRC (ovais) e PST (quadrados) juntamente com os éxons do gene correspondentes são mostrados no painel A da Figura 18. Uma comparação de sequência de peptídeos para SRCR 5 de CD163 porcino (SEQ ID NO: 120) e homólogo de SRCR 8 de CD163 humano (SEQ ID NO: 121) é apresentada no painel B da Figura 18. A figura é baseada nos números de acesso do GenBank AJ311716 (porco CD163) e GQ397482 (hCD163-L1).

VÍRUS

[0596] O painel de vírus usado neste exemplo está listado na Tabela 15. Os isolados foram propagados e titulados em células MARC-145 (Kim et al., 1993). Para titulação, cada vírus foi diluído em série 1:10 em MEM suplementado com 7% de FBS, Pen-Strep (80 unidades/ml e 80μg/ml, respectivamente), 3μg/ml de FUNGIZONA (anfotericina B) e HEPES 25 mM. As amostras diluídas foram adicionadas em quadruplicatas às células MARC-145 confluentes em uma placa de 96 poços para um volume final de 200 μl por poço e incubadas por quatro dias a 37 °C em 5% de CO2. O ponto final da titulação foi identificado como o último poço com efeito citopático (CPE). A dose infecciosa de 50% da cultura de tecidos (TCID50/ml) foi calculada usando um método como descrito anteriormente (Reed e Muench 1938).

TABELA 15. ISOLADOS DE PRRSV. Vírus Genótipo Ano isolado Nº GenBank NVSL 97-7895 2 1997 AY545985 KS06-72109 2 2006 KM252867 P129 2 1995 AF494042 VR2332 2 1992 AY150564 CO90 2 2010 KM035799 AZ25 2 2010 KM035800 MLV-ResPRRS 2 NA* AF066183 KS62-06274 2 2006 KM035798 KS483 (SD23983) 2 1992 JX258843 CO84 2 2010 KM035802 SD13-15 1 2013 NA Lelystad 1 1991 M96262 03-1059 1 2003 NA 03-1060 1 2003 NA SD01-08 1 2001 DQ489311 4353PZ 1 2003 NA * NA, não disponível

INFECÇÃO DE MACRÓFAGOS ALVEOLARES

[0597] A preparação e a infecção de macrófagos foram realizadas conforme descrito anteriormente (Gaudreault, et al., 2009 e Patton, et al., 2008). Os pulmões foram removidos dos porcos sacrificados e lavados vertendo 100 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) fria na traqueia. As traqueias foram pinçadas e os pulmões massageados suavemente. O conteúdo alveolar foi vertido em tubos de centrífuga de 50 ml e armazenado em gelo. Macrófagos alveolares suínos (PAMs) foram sedimentados por centrifugação a 1200 x g por 10 minutos a 4 °C. Os péletes foram ressuspensos e lavados uma vez em PBS estéril frio. Os péletes celulares foram ressuspensos em meio de congelamento contendo 45% de RPMI 1640, 45% de soro fetal bovino (FBS) e 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenados em nitrogênio líquido até o uso. As células congeladas foram descongeladas em gelo, contadas e ajustadas para 5x10 5 células/ml em meio (RPMI 1640 suplementado com FBS a 10%, PenStrep e FUNGIZONA; RPMI- FBS). Aproximadamente 103 PAMs por poço foram adicionados a placas de 96 poços e incubados de um dia para outro a 37 °C em 5% de CO2. As células foram lavadas suavemente para remover as células não aderentes. Diluições em série de 1:10 de vírus foram adicionadas a poços em triplicata. Após incubação de um dia para outro, as células foram lavadas com PBS e fixadas por 10 minutos com acetona a 80%. Após a secagem, os poços foram corados com mAb SDOW-17 específico da proteína N de PRRSV (Rural Technologies Inc.) diluído 1:1000 em PBS com gelatina de peixe a 1% (PBS-FG; Sigma Aldrich). Após uma incubação de 30 minutos a 37 °C, as células foram lavadas com PBS e coradas com IgG anti-camundongo marcado com ALEXA FLUOR 488 (Thermofisher Scientific) diluído 1:200 em PBS-FG. As placas foram incubadas por 30 minutos no escuro a 37 °C, lavadas com PBS e visualizadas em um microscópio de fluorescência. A dose infecciosa de 50% da cultura de tecidos (TCID50)/ml foi calculada de acordo com um método como descrito anteriormente (Reed e Muench 1938).

MEDIÇÃO DA EXPRESSÃO DE SUPERFÍCIE DE CD169 E CD163 EM PAMS

[0598] A coloração para a expressão de superfície de CD169 e CD163 foi realizada conforme descrito anteriormente (Prather et al., 2013). Aproximadamente 1X106 PAMs foram colocados em tubos de citometria de fluxo de poliestireno (FACS) de 12 mm x 75 mm e incubados por 15 minutos à temperatura ambiente em 1 ml de PBS com 10% de soro normal de camundongo para bloquear os receptores Fc. As células foram peletizadas por centrifugação e ressuspensas em 5 μl de mAb de camundongo anti-CD169 porcino conjugado com FITC (clone 3B11/11; AbD Serotec) e 5 μl de mAb de camundongo anti-CD163 porcino conjugado com PE (Clone: 2A10/11, AbD Serotec). Após 30 minutos de incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS contendo albumina sérica bovina a 1% (fração BSA V; Hyclone) e imediatamente analisadas em um citômetro de fluxo BD LSR Fortessa (BD Biosciences) com software FCS Express 5 (De Novo Software). Um mínimo de

10.000 células foi analisado para cada amostra.

MEDIÇÃO DE VIREMIA DE PRRS

[0599] O RNA foi isolado de 50 μl de soro usando o kit de isolamento de viral MagMAX 96 da Ambion (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA de PRRSV foi quantificado usando reagentes alvo-específicos EZ-PRRSV MPX 4.0 de RT-PCR em tempo real (Tetracore) realizados de acordo com as instruções do fabricante. Cada placa continha padrões de quantificação Tetracore e conjuntos de controle projetados para uso com os reagentes de RT-PCR. A PCR foi realizada em um sistema de detecção de PCR em tempo real CFX96 Touch (Bio-Rad) em um formato de 96 poços usando os parâmetros de ciclagem recomendados. Os resultados do ensaio de PCR foram relatados como log10 do número de cópias do RNA de PRRSV por 50 μl de volume de reação, que se aproxima do número de cópias por ml de soro. A área sob a curva (AUC) para viremia ao longo do tempo foi calculada usando GraphPad Prism versão 6.00 para Windows.

MEDIÇÃO DE ANTICORPO DE PRRSV

[0600] O imunoensaio fluorescente de microesferas (FMIA) para a detecção de anticorpos contra a proteína do nucleocapsídeo (N) de PRRSV foi realizado conforme descrito anteriormente (Stephenson et al., 2015). A proteína

N de PRRSV recombinante foi acoplada a contas de microesferas de poliestireno Luminex MAGPLEX carboxiladas de acordo com as instruções do fabricante. Para FMIA, aproximadamente 2500 contas revestidas com antígeno, suspensas em 50μL de PBS com 10% de soro de cabra (PBS-GS), foram colocadas em cada poço de uma placa de fundo redondo de poliestireno de 96 poços. Os soros foram diluídos 1:400 em PBS-GS e 50 μl foram adicionados a cada poço. A placa foi envolvida em papel alumínio e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação suave. A placa foi colocada em um ímã e as contas foram lavadas três vezes com 190µl de PBS- GS. Para a detecção de IgG, 50 µl de anticorpo secundário de cabra anti-suíno purificado por afinidade conjugado com biotina-SP (IgG, Jackson ImmunoResearch) foram diluídos para 2 µg/ml em PBS-GS e 100 µl adicionado a cada poço. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos e lavada três vezes seguida da adição de 50 µl de ficoeritrina conjugada com estreptavidina (2 µg/ml em PBS-GS; SAPE). Após 30 minutos, as microesferas foram lavadas, ressuspensas em 100 µl de PBS-GS e analisadas usando um instrumento MAGPIX (LUMINEX) e software LUMINEX xPONENT 4.2. A intensidade média de fluorescência (MFI) foi calculada em um mínimo de 100 contas de microesferas.

MEDIÇÃO DE HAPTOGLOBINA (HP)

[0601] A quantidade de Hp no soro foi medida usando um kit Hp ELISA específico para suíno (Genway Biotech Inc.) e as etapas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Amostras de soro foram diluídas 1:10.000 em solução diluente 1X e pipetadas em duplicata em uma placa de ELISA de 96 poços anti-porco pré-revestida, incubada em temperatura ambiente por 15 minutos, depois lavada três vezes. O conjugado anti-Hp- peroxidase de rábano silvestre (HRP) foi adicionado a cada poço e incubado no escuro em temperatura ambiente por 15 minutos. A placa foi lavada e 100 µl de solução de substrato de cromogênio foram adicionados a cada poço. Após a incubação no escuro por 10 minutos, 100 µl de solução de parada foram adicionados a cada poço. A placa foi lida a 450 nm em um leitor de microplacas baseado em filtro Fluostar Omega (BMG Labtech).

RESULTADOS PROPRIEDADES FENOTÍPICAS DE PAMS DE PORCOS CD163-MODIFICADOS

[0602] As propriedades de dispersão frontal e lateral das células no material de lavagem pulmonar foram utilizadas para a passagem na subpopulação mononuclear de células. Resultados de coloração de CD169 e CD163 representativos para as diferentes modificações cromossômicas mostradas na Figura 17 são apresentados na Figura 19. No exemplo representativo apresentado no painel A da Figura 19, mais de 91% dos PAMs dos porcos WT foram positivos para CD169 e CD163. Os resultados de 12 porcos WT usados neste estudo mostraram uma média de 85 +/- 8% de células duplo-positivo. Conforme mostrado no painel B da Figura 19, os PAMs dos porcos CD163 KO não mostraram evidências de CD163, mas mantiveram os níveis de CD169 de superfície normais. Embora tenha sido previsto que os polipeptídeos CD163 derivados dos genótipos de deleção d7(1467) e d7(1280) devam produzir polipeptídeos CD163 modificados ancorados à superfície PAM, os resultados de imunocoloração não mostraram expressão de superfície de CD163 (ver Figura 19, painel D). Uma vez que o MAb 2A10 reconhece um epítopo localizado nos primeiros três domínios de SRCR, a ausência de detecção não foi o resultado da deleção de um epítopo imunorreativo. O genótipo d7(129) foi previsto como possuindo uma deleção de 43 aminoácidos no SRCR 5 (ver Figura 17). No exemplo apresentado no painel C da Figura 19, apenas 2,4% das células caíram no quadrante duplo-positivo. A análise de PAMs de nove porcos d7(129) usados neste estudo mostrou porcentagens de células duplo-positivo variando de 0% a 3,6% (média = 0,9%). A expressão de superfície de CD169 permaneceu semelhante a PAMs WT. Para o propósito deste estudo, porcos possuindo os genótipos KO, d7(1467), d7(1280) e d7(129) foram todos categorizados como possuindo um fenótipo CD163-nulo.

[0603] A modificação CD163 contendo a sequência de peptídeo de domínio 8 hCD163L1 HL11m, mostrou expressão dupla de CD163+ e CD169+ em PAMs (painel E da Figura 19). No entanto, em todos os porcos HL11m analisados neste estudo, a expressão de superfície de CD163 foi significativamente reduzida em comparação com os PAMs WT. Os níveis de CD163 caíram em um continuum de expressão, variando de CD163 não detectável a porcos possuindo níveis moderados de CD163. No exemplo mostrado no painel E da Figura 19, aproximadamente 60% das células estavam no quadrante duplo-positivo, enquanto 40% das células coraram apenas para CD169. A análise de PAMs de um total de 24 porcos HL11m mostrou que 38 +/- 12% das células PAM eram positivas apenas para CD169 e 54 +/- 14% eram duplo-positivo (CD169+ CD163+).

NÍVEIS CIRCULANTES DE HAPTOGLOBINA EM PORCOS WT E CD163-

MODIFICADOS

[0604] Como uma molécula de eliminação, CD163 é responsável por remover complexos de HbHp do sangue (Fabriek, et al., 2005; Kristiansen et al., 2001; e Madsen et al., 2004). O nível de Hp no soro fornece um método conveniente para determinar as propriedades funcionais gerais de macrófagos que expressam CD163. Os níveis de Hp no soro de porcos WT, HL11m e CD163-nulo foram medidos com três a quatro semanas de idade, imediatamente antes da infecção com PRRSV.

Os resultados, apresentados na Figura 20, mostraram que os soros de porcos WT tinham as menores quantidades de Hb (média A450 = 23 +/ - 0,18, n = 10). A média e o desvio padrão para cada grupo foram WT, 0,23 +/- 0,18, n = 10; HL11m, 1,63 +/- 0,8, n = 11; e 2,06 +/- 0,57, n = 9, para o grupo nulo. O grupo nulo era composto por genótipos que não expressavam CD163 (porcos com fenótipo de CD163 nulo). As medições de Hp foram feitas em uma única placa de ELISA. Os grupos com a mesma letra não foram significativamente diferentes (p > 0,05, ANOVA unilateral de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunnett). O valor médio de A450 para porcos WT foi significativamente diferente daquele dos porcos HL11m e CD163-nulo (p < 0,05). Embora o valor médio de A450 tenha sido menor para o grupo HL11m em comparação com o grupo CD163-nulo (A450 = 1,6 +/- 0,8 versus 2,1 +/- 0,6), a diferença não foi estatisticamente significativa.

Uma vez que a interação entre HbHp e CD163 ocorre por meio de SRCR 3 (Madsen et al., 2004), o aumento de Hp circulante em porcos HL11m em comparação com porcos WT provavelmente não foi uma consequência de uma afinidade reduzida de CD163 para Hb/Hp, mas o resultado de números reduzidos de macrófagos CD163+ juntamente com expressão de CD163 reduzida nos macrófagos restantes (ver painel E da Figura 19).

I NFECÇÃO DE PAMS COM V ÍRUS TIPO 1 E TIPO 2

[0605] A permissividade dos porcos CD163-modificados para PRRSV foi avaliada inicialmente infectando células de PAM in vitro com um painel de seis isolados de PRRSV Tipo 1 e nove Tipo 2 (ver Tabela 15 para a lista de vírus). Os vírus no painel representam diferentes genótipos, bem como diferenças nas sequências de nucleotídeos e peptídeos, patogênese e anos de isolamento. Os dados apresentados na Tabela 16 mostram os resultados de experimentos usando PAMs de três porcos para cada grupo de genótipo CD163. Os vírus listados correspondem aos isolados de PRRSV listados na Tabela 15. Os resultados são mostrados como média +/- desvio padrão da porcentagem de PAMs infectados. Os PAMs CD163- nulo eram de porcos que expressam o alelo d7(129) (ver Figuras 17 e 19 para construtos do gene CD163 e expressão de CD163 em PAMs, respectivamente).

TABELA 16. INFECÇÃO DE PAMS DE P ORCOS DO TIPO S ELVAGEM E GE COM

DIFERENTES I SOLADOS DE PRRSV Genótipo/ Fenótipo (%de infecção) Tipo 1 WT (%) HL11m Nulo 13-15 56 +/- 9 0 0 Lelystad 62 +/- 15 0 0 03-1059 50 +/- 18 0 0 03-1060 61 +/- 12 0 0 01-08 64 +/- 20 0 0 4353-PZ 62 +/- 15 0 0 Tipo 2 WT (%) HL11m Nulo NVSL 97 59 +/- 15 8 +/- 08 0 KS-06 56 +/- 20 12 +/- 09 0 P129 64 +/- 11 8 +/- 06 0 VR2332 54 +/- 05 6 +/- 03 0 CO 10-90 43 +/- 18 8 +/- 08 0 CO 10-84 51 +/- 22 7 +/- 04 0 MLV-ResP 55 +/- 12 3 +/- 01 0 KS62 49 +/- 03 10 +/- 11 0 KS483 55 +/- 23 6 +/- 03 0

[0606] Como esperado, os PAMs WT foram infectados por todos os vírus. Em contraste, os porcos com fenótipo CD163-nulo foram negativos para infecção por todos os vírus. Uma diferença marcante foi observada na resposta de PAMs dos porcos HL11m. Nenhum dos vírus Tipo 1 foi capaz de infectar os PAMs HL11m; ao passo que todos os vírus no painel Tipo 2 infectaram os PAMs HL11m, embora em porcentagens muito menores em comparação com os PAMs WT.

[0607] A permissividade também foi avaliada pela comparação de pontos finais de titulação de vírus entre PAMs WT e HL11m para os mesmos vírus Tipo 2. Os resultados são mostrados para dois porcos WT e dois HL11m (Figura 21). Os valores log10TCID50 foram calculados com base na infecção de culturas de macrófagos com a mesma amostra de vírus. Os resultados da infecção representam dois porcos diferentes de cada genótipo. Os vírus usados para infecção estão listados na Tabela 15. Os valores log10TCID50 para PAMs de porcos HL11m foram 1–3 logs mais baixos em comparação com PAMs WT infectados com o mesmo vírus. A única exceção foi a infecção com uma cepa de vacina de vírus vivo modificado. Quando tomados em conjunto, os resultados sugerem que os PAMs de porcos HL11m possuem uma susceptibilidade ou permissividade reduzida à infecção com vírus Tipo 2.

INFECÇÃO DE PORCOS CD163-MODIFICADOS COM VÍRUS TIPO 1 E TIPO 2

[0608] Porcos WT (círculos), HL11m (quadrados) e CD163-nulo (triângulos) foram infectados com vírus Tipo 1 representativo (SD13-15) (Figura 22, painel A, gráfico da esquerda) e Tipo 2 (NVSL 97-7895) (Figura 22, painel A, gráfico da direita). Os porcos de fenótipo nulo foram derivados dos alelos KO e d(1567) (ver Figura 17). Porcos dos três genótipos inoculados com o mesmo vírus foram misturados em um cercado, o que permitiu a exposição contínua de porcos CD163-modificados ao vírus expelido de companheiros de cercado WT.

O número de porcos infectados com o vírus Tipo 1 representativo foi: WT (n = 4), HL11m (n = 5) e Nulo (n = 3); e vírus Tipo 2: WT (n = 4), HL11m (n = 4) e Nulo (n = 3). Como mostrado na Figura 22, os porcos CD163-nulo infectados com o vírus Tipo 1 ou Tipo 2 foram negativos para viremia em todos os instantes e não seroconverteram. Como esperado, os porcos WT foram infectados produtivamente, possuindo níveis médios de viremia de aproximadamente 106 moldes por 50 μl de reação de PCR em 7 dias após a infecção para ambos os vírus. Aos 14 dias, todos os porcos WT tinham seroconvertido (ver Figura 22, painel B). Consistente com os resultados da infecção de PAM (Tabela 16), os cinco porcos HL11m infectados com o vírus

Tipo 1 não mostraram evidência de viremia ou anticorpo PRRSV. Todos os porcos HL11m infectados com o isolado Tipo 2, NVSL, suportaram infecção e seroconverteram (Figura 22, painel B). A presença de uma permissão reduzida dos porcos HL11m não foi clara. A viremia média para três dos quatro porcos HL11m foi semelhante à dos porcos WT. No entanto, para um porco HL11m, #101 (quadrados abertos na Figura 22, gráfico à direita do painel A), a viremia foi muito reduzida em comparação com os outros porcos no grupo de genótipo HL11m. Uma explicação para a redução logarítmica de 3 a 4 na viremia para o Porco #101 não foi clara, mas sugeriu que alguns porcos HL11m podem ser menos permissivos para PRRSV, uma observação que apoia os resultados de infecção PAM in vitro (Tabela 16). Uma vez que todos os porcos foram inoculados com a mesma quantidade de vírus e permaneceram misturados com os porcos WT, a viremia mais baixa no Porco #101 não foi o resultado de receber uma quantidade menor de vírus ou menos exposição ao vírus. A citometria de fluxo de macrófagos mostrou que a expressão de CD163 para o Porco #101 foi comparável à de outros porcos HL11m (dados não mostrados).

Não houve diferença na sequência na sequência mimetizadora do éxon 11.

[0609] Ensaios de infecção de vírus adicionais foram realizados usando dois vírus, NVSL 97-7895 e KS06-72109. Os resultados são mostrados na Figura 23. Os porcos foram acompanhados por 35 dias após a infecção e os dados relatados como a área sob a curva (AUC) para medições de viremia feitas a 3, 7, 11, 14, 21, 28 e 35 dias após a infecção. Como mostrado na Figura 23, para NVSL, o valor médio de AUC para os sete porcos WT infectados com NVSL foi 168 +/- 8 contra 165 +/- 15 para os sete porcos HL11m. Para KS06, os valores médios de AUC para os seis porcos WT e seis HL11m foram 156 +/- 9 e 163 +/- 13, respectivamente. Para ambos os vírus, não houve diferença estatisticamente significativa entre os porcos WT e HL11m (p > 0,05). Quando tomados em conjunto, os resultados mostraram que os porcos HL11m não suportaram a infecção com PRRSV Tipo 1, mas mantiveram a permissividade para infecção com vírus Tipo 2. Embora tenha havido uma redução na permissividade de PRRSV de PAMs de porcos HL11m infectados in vitro com os isolados do Tipo 2, essa diferença não se traduziu para o porco. Para os resultados mostrados na Figura 23, a carga de vírus foi determinada calculando a área sob a curva (AUC) para cada porco ao longo de um período de infecção de 35 dias. O cálculo da AUC foi realizado usando medições de viremia de PCR log10 tomadas em 0, 4, 7, 10, 14, 21, 28 e 35 dias após a infecção. As linhas horizontais mostram a média e o desvio padrão.

Legenda: WT = porcos do tipo selvagem, HL11 = porcos com genótipo HL11m; Nulo = genótipo CD163-nulo.

DISCUSSÃO

[0610] A CD163 é uma proteína de superfície de macrófago importante para eliminar o excesso de Hb do sangue e modular a inflamação em resposta a danos nos tecidos. Ela também funciona como um receptor de vírus. A CD163 participa de respostas pró- e antiinflamatórias (Van Gorp et al., 2010). Os macrófagos positivos para CD163 são colocados dentro do grupo de macrófagos M2 alternativamente ativados, que são geralmente descritos como altamente fagocíticos e antiinflamatórios. Os macrófagos M2 participam da limpeza e do reparo após dano mecânico do tecido ou infecção (Stein et al., 1992). Em uma capacidade antiinflamatória, a expressão de CD163 é regulada positivamente por proteínas antiinflamatórias, como a IL-10 (Sulahian, et al., 2002). Durante a inflamação, a CD163 diminui a inflamação reduzindo a oxidação por meio da remoção do heme circulante do sangue. Produtos de degradação do heme, tais como bilverdina, bilirrubina e monóxido de carbono, são moléculas antiinflamatórias potentes (Soares e Bach, 2009 e Jeney et al., 2002). Em uma capacidade pró-inflamatória, a reticulação de CD163 na superfície do macrófago por anticorpo anti-CD163 ou bactérias resulta na liberação localizada de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-6, GM-CSF, TNFα e IL-1β (Van den Heuvel et al., 1999 e Fabriek et al., 2009).

[0611] Os porcos GE que carecem de CD163 não suportam a replicação de um isolado de PRRSV Tipo 2 (Whitworth et al., 2016). Neste estudo, os ensaios de infecção in vitro demonstram a resistência de macrófagos de fenótipo CD163 nulo a um extenso painel de isolados de PRRSV Tipo 1 e Tipo 2, estendendo ainda mais a resistência para incluir potencialmente todos os isolados de PRRSV (Tabela 16). A resistência dos macrófagos do fenótipo CD163-nulo aos vírus Tipo 1 e Tipo 2 foi confirmada in vivo (Figura 22 e Figura 23). Com base nesses resultados, a contribuição de outros receptores de PRRSV previamente descritos na literatura (Zhang e Yoo, 2015) pode ser descartada. Por exemplo, Shanmukhappa et al. (2007) mostraram que células BHK não permissivas transfectadas com um plasmídeo CD151 adquiriram a capacidade de suportar a replicação de PRRSV, e a incubação com um anticorpo policlonal anti-CD151 mostrou reduzir significativamente a infecção de células MARC-145. Além disso, uma linhagem celular de símio, SJPL, originalmente desenvolvida para uso na propagação de vírus da gripe suína, mostrou anteriormente suportar a replicação de PRRSV (Provost, et al., 2012). Propriedades importantes da linhagem celular SJPL incluíram a presença de CD151 e a ausência de sialoadesina e CD163.

Quando considerados em conjunto, esses dados forneceram evidências convincentes de que a presença de CD151 por si só é suficiente para suportar a replicação de PRRSV. Os resultados deste estudo mostrando a ausência de infecção por PRRSV em macrófagos e porcos possuindo um fenótipo CD163 nulo indica que o CD151, como um receptor alternativo para PRRSV, não é biologicamente relevante.

[0612] As proteínas virais GP2a e GP4, que fazem parte do complexo de heterotrímero GP2a, GP3, GP4 na superfície de PRRSV, podem ser co-precipitadas com CD163 em ensaios pull-down de células transfectadas com plasmídeos GP2 e GP4 (Das, et al., 2009). Presumivelmente, GP2 e GP4 formam uma interação com um ou mais dos domínios de SRCR de CD163.

Ensaios de infecciosidade in vitro incorporando uma estrutura de cDNA de CD163 porcino contendo uma troca de domínio entre SRCR 5 porcino e o homólogo de SRCR 8 de hCD163-L1 localizaram ainda a região utilizada pelos vírus Tipo 1 para SRCR 5 (Van Gorp, et al., 2010). É interessante especular que a interação estável entre GP2/ GP4 e CD163 ocorre por meio de SRCR 5.

Glicoproteínas virais adicionais, tais como GP3 e GP5, podem estabilizar ainda mais o complexo vírus-receptor ou podem funcionar como moléculas co- receptoras. A necessidade de SRCR 5 foi investigada neste estudo infectando macrófagos e porcos possuindo o alelo HL11m, que recriou a troca de domínio de SRCR 8 de CD163L1 fazendo substituições de 33 pb no éxon 7 suíno. O alelo HL11m também incluiu um cassete de neomicina para seleção de células positivas para a alteração genética (Figura 17). Os porcos HL11m expressaram CD163 em PAMs, embora em níveis reduzidos em comparação com PAMs WT (Figura 19, compare os painéis A e E). A expressão reduzida foi provavelmente devido à presença do cassete de neomicina, que estava localizado entre o mimetizador do éxon 11 e o íntron seguinte. Os porcos HL11m não foram permissivos para a infecção com o vírus Tipo 1, confirmando a importância do SRCR 5. No entanto, macrófagos HL11m e porcos HL11m suportaram infecção com o vírus Tipo 2. Com base nos resultados de titulação do vírus e da porcentagem de infecção, os PAMs dos porcos HL11m mostraram uma diminuição geral na permissividade para o vírus em comparação com os macrófagos WT (Tabela 16 e Figura 17). A diminuição da permissividade pode ser devido aos níveis reduzidos de CD163 nos macrófagos HL11m, combinados com uma afinidade reduzida do vírus para a proteína CD163 modificada. Assumindo que o vírus Tipo 2 possui um requisito de SRCR 5 e que L1 SRCR 8 pode funcionar como um substituto adequado, a menor afinidade pode ser explicada pela diferença nas sequências de peptídeos entre SRCR 8 humano e SRCR 5 porcino (ver Figura 18, painel B). No entanto, a permissividade reduzida dos PAMs não se traduziu para o porco. A viremia média para os porcos HL11m não foi significativamente diferente quando comparada aos porcos WT (Figura 23). Além dos PAMs, a infecção por PRRSV de macrófagos do tecido intravascular, septal e linfóide contribui para a viremia (Lawson et al., 1997 e Morgan et al., 2014). As contribuições potenciais dessas e de outras populações de células positivas para CD163 na manutenção da carga viral geral em porcos HL11m merecem estudo adicional.

[0613] Embora os plasmídeos CD163 possuindo deleções de domínios de SRCR sejam estavelmente expressos em células HEK (Van Gorp et al., 2010), a deleção dos éxons 7 e 8 em d7(1467) e d7(1280) resultou na falta de expressão de superfície detectável de CD163 (Figura 19, painel D).

Uma vez que o mAB 2A10 usado para citometria de fluxo reconhece os três domínios de SRCR N-terminais (Van Gorp et al., 2010), e possivelmente o 7º e 8º domínios (Sanchez, et al., 1999), a ausência de detecção não era devida à remoção de um epítopo 2A10 nas proteínas mutadas. Embora uma pequena quantidade de expressão de CD163 pudesse ser detectada em PAMs de alguns dos porcos d7(129) (ver Figura 19, painel C), a quantidade de proteína expressa não foi suficiente para suportar a infecção por PRRSV em PAMs ou porcos. A ausência de expressão de CD163 nos mutantes de deleção do éxon 7 e 8 não é totalmente compreendida, mas é provavelmente o resultado de degradação de mRNA e/ou de proteína.

[0614] Em 2003, a CD163 foi identificada como um receptor para o vírus da peste suína africana (ASFV; Sánchez-Torres et al., 2003). Esta conclusão foi baseada na observação de que macrófagos infectados possuem um fenótipo maduro positivo para CD163, e anticorpos anti-CD163, tais como

2A10, bloqueiam a infecção por ASFV de macrófagos in vitro. Resta ser determinado se os porcos CD163-nulo são resistentes à infecção por ASFV.

[0615] Os modelos de cultura celular que incorporam modificações ao receptor de PRRSV forneceram informações valiosas para os mecanismos de entrada, replicação e patogênese de PRRSV. Um aspecto único deste estudo foi a condução de experimentos paralelos in vivo usando porcos receptor-modificados. Esta pesquisa tem impactos importantes na viabilidade do desenvolvimento de curas preventivas para uma das doenças mais sérias já enfrentadas pela indústria suína global.

EXEMPLO 4: GERAÇÃO DE PORCOS KNOCKOUT SIGLEC

[0616] O exemplo a seguir descreve a geração de porcos knockout SIGLEC1.

MATERIAIS E MÉTODOS

[0617] Salvo indicação em contrário, todos os produtos químicos usados neste estudo eram da Sigma, St. Louis, MO.

INTERRUPÇÃO DIRECIONADA DO GENE SIGLEC1 SUÍNO

[0618] O uso de animais e vírus foi aprovado pelos comitês universitários de cuidados com animais e biossegurança institucional da Universidade de Missouri e/ou Universidade Estadual do Kansas. A recombinação homóloga foi incorporada para remover os éxons 2 e 3 de codificação da proteína de SIGLEC1 e introduzir códons de terminação prematuros para eliminar a expressão da sequência de codificação remanescente (Figura 24). O cDNA de SIGLEC1 suíno (número de acesso do GenBank NM214346) codifica uma proteína de 210 kDa de um transcrito de mRNA de 5.193 bases (Vanderheijden et al., 2003). A sequência genômica da região em torno de SIGLEC1 (número de acesso do GenBank CU467609) foi usada para preparar iniciadores de oligonucleotídeo para amplificar fragmentos genômicos por PCR de alta fidelidade (AccuTaq; Invitrogen) para a geração de um construto de direcionamento. Com base nas comparações com as sequências genômicas de camundongo e humano, o SIGLEC1 suíno foi previsto para possuir 21 éxons. Além disso, o éxon 2 é conservado entre porcos, camundongos e humanos. Os alinhamentos da sequência de peptídeos revelaram que os seis aminoácidos na região de codificação do éxon 2 em SIGLEC1 de camundongo, conhecidos por estarem envolvidos com a ligação de ácido siálico, são conservados em SIGLEC1 de porco. Um fragmento, o “braço superior” representou parte do primeiro éxon de codificação e 3.304 pb a montante do códon de iniciação. O segundo fragmento, ou “braço inferior”, tinha 4.753 pb de comprimento e representava a maior parte do íntron a jusante do terceiro éxon de codificação e estendia-se para o sexto íntron (incluindo o quarto, quinto e sexto éxon de codificação). Entre os braços inferior e superior havia um cassete neo inserido na direção oposta e colocado sob o controle de um promotor de fosfoglicerol quinase (PGK).

[0619] Para facilidade de referência, uma sequência de SIGLEC1 de tipo selvagem parcial é fornecida aqui como SEQ ID NO: 122. As sequências de referência começam 4.236 nucleotídeos a montante do éxon 1 e incluem todos os íntrons e éxons através do éxon 7 e 1.008 nucleotídeos após o final do éxon 7. A SEQ ID NO: 123 fornece uma sequência de SIGLEC1 parcial contendo a modificação aqui descrita, como ilustrado no painel C da Figura 24. Em comparação com a sequência parcial do tipo selvagem (SEQ ID NO: 122), na SEQ ID NO: 123 há uma deleção de 1.247 pares de bases do nucleotídeo 4.279 a 5.525 e a sequência deletada é substituída com um cassete selecionável de neomicina de 1.855 pares de bases orientado na direção oposta em comparação com SEQ ID NO: 122. Esta inserção/ deleção resulta na perda de parte do éxon 1 e todos os éxon 2 e 3 do gene SIGLEC1.

[0620] Linhagens celulares primárias de fibroblastos fetais masculinos e femininos, a partir do dia 35 de gestação, foram isoladas de grandes porcos brancos comerciais (Landrace). As células foram cultivadas e crescidas por 48 horas até 80% de confluência em meio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) contendo glutamina 5 mM, bicarbonato de sódio (3,7 g/litro), penicilina-estreptomicina e 1 g/litro de D-glicose, que foi suplementado adicionalmente com 15% de soro fetal bovino (FBS; Hy-Clone), 10 g/ml de gentamicina e 2,5 ng/ml de fator de crescimento de fibroblasto básico. O meio foi removido e substituído 4 horas antes da transfecção. As células de fibroblastos foram lavadas com 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e retiradas do frasco de 75 cm2 com 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (Invitrogen).

[0621] As células foram ressuspensas em DMEM, coletadas por centrifugação a 600 × g por 10 minutos, lavadas com Opti-MEM (Invitrogen) e centrifugadas novamente a 600 × g por 10 minutos. Citosais (75% de citosais [KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4 10 mM, pH 7,6, MgCl2 5 mM] e 25% de Opti-MEM [Invitrogen]) foram usados para ressuspender o pélete (van den Hoff et al., 1992). As células foram contadas com hemocitômetro e ajustadas para 1 × 106/ml. A eletroporação das células foi realizada com 0,75 a 10 g de DNA de direcionamento de fita simples ou dupla (obtido por desnaturação por calor) em 200 μl de meio de transfecção contendo 1 × 106 células/ml. As células foram eletroporadas em um manipulador BTX ECM2001 Electro Cell usando três pulsos de 1 ms de 250 V. As células eletroporadas foram diluídas em fator de crescimento de fibroblasto básico-DMEM-FBS em placa de 10.000/ 13 cm e cultivadas de um dia para outro sem pressão seletiva. No dia seguinte, o meio foi substituído com meio de cultura contendo G418 (GENTICIN, 0,6 mg/ml).

Após 10 dias de seleção, as colônias resistentes a G418 foram isoladas e transferidas para placas de 24 poços para expansão. O PCR foi usado para determinar se o direcionamento de SIGLEC1 foi bem-sucedido. Os iniciadores de PCR “f” e “b” e os iniciadores de PCR “a” e “e” (Tabela 17; Figura 24) foram usados para determinar o direcionamento bem-sucedido de ambos os braços.

Os iniciadores “f” e “e” recombinados em baixa temperatura fora da região de cada braço de direcionamento. Os iniciadores de PCR “c” e “d” foram usados para determinar a inserção de um gene neo intacto.

TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULAS SOMÁTICAS

[0622] Oócitos de porco foram adquiridos da AR Inc. (Madison, WI) e maturados de acordo com as instruções do fornecedor. Após 42 a 44 horas de maturação in vitro, os oócitos foram removidos das células de cúmulos por vórtex suave em hialuronidase 0,5 mg/ml. Oócitos com boa morfologia e corpo polar visível (metáfase II) foram selecionados e mantidos em meio de manipulação (TCM-199 [Life Technologies] com NaHCO3 0,6 mM, Hepes 2,9 mM, NaCl 30 mM, 10 ng/ml de gentamicina e 3 mg/ml de BSA, com osmolaridade de 305 mOsm) a 38,5 °C até a transferência nuclear.

[0623] Usando um microscópio invertido, um oócito livre de cúmulos foi mantido com uma micropipeta de retenção em gotas de meio de manipulação suplementado com 7,5 g/ml de citocalasina B e coberto com óleo mineral. A zona pelúcida foi penetrada com uma micropipeta injetora de vidro fino próximo ao primeiro corpo polar, e o primeiro corpo polar e o citoplasma adjacente, contendo os cromossomos da metáfase II, foram aspirados para dentro da pipeta. A pipeta foi retirada e o conteúdo foi descartado. Uma única célula doadora redonda e brilhante com uma superfície lisa foi selecionada e transferida para o espaço perivitelino adjacente à membrana do oócito (Lai et al., 2006 e Lai et al., 2002). O complexo de transferência nuclear (oócito mais fibroblasto) foi fundido em meio de fusão com uma baixa concentração de cálcio (manitol 0,3 M, CaCl2 0,1 mM · 2H2O, MgCl2 0,1 mM · 6H2O, HEPES 0,5 mM). Os oócitos fundidos foram então ativados por tratamento com timerosal 200 M de por 10 minutos no escuro, lavados e tratados com ditiotreitol 8 mM (DTT) por 30 minutos; os oócitos foram enxaguados novamente para remover o

DTT remanescente (Machaty et al., 2001; Machaty et al., 1997). Após a fusão e ativação, os oócitos foram lavados três vezes com Meio de Cultura Zigoto Suíno 3 suplementado com 4 mg/ml de albumina sérica bovina (Im et al., 2004) e cultivados a 38,5 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de O2, 90% de N2 e 5% de CO2 por 30 minutos. Os complexos que se fundiram com sucesso foram cultivados por 15 a 21 horas até a transferência cirúrgica do embrião.

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO

[0624] As leitoas portadoras foram sincronizadas pela administração de 18 a 20 mg de REGU-MATE (altrenogest, 2,2 mg/ml; Intervet, Millsboro, DE) misturado à ração por 14 dias de acordo com um esquema dependente do estágio do ciclo estral. Após o último tratamento REGU-MATE (105 horas), uma injeção intramuscular de 1.000 unidades de gonadotrofina coriônica humana foi administrada para induzir o estro. Porcas portadoras no dia do estro em pé (dia 0) ou no primeiro dia após o estro em pé foram usadas (Lai et al., 2002). As portadoras foram preparadas assepticamente, e uma incisão ventral caudal foi feita para expor o trato reprodutivo. Os embriões foram transferidos para um oviduto através da fímbria ovariana. As porcas foram avaliadas quanto à gravidez por exame de ultrassonografia abdominal por volta do dia 30 e, em seguida, verificadas uma vez por semana durante a gestação até o parto aos 114 dias de gestação.

CONFIRMAÇÃO DE PCR E SOUTHERN BLOT EM LEITÕES TRANSGÊNICOS

[0625] Para os ensaios de PCR e Southern blot, o DNA genômico foi isolado do tecido do rabo. Resumidamente, os tecidos foram digeridos de um dia para outro a 55 °C com 0,1 mg/ml de proteinase K (Sigma, St. Louis, MO) em NaCl 100 mM, Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 25 mM (pH 8,0) e SDS a 0,5%. O material foi extraído sequencialmente com fenol e clorofórmio neutralizados, e o DNA foi precipitado com etanol (Green et al., 2012). A detecção de ambos os alelos SIGLEC1 de tipo selvagem e direcionados foi realizada por PCR com iniciadores que recombinam em baixa temperatura com o DNA que flanqueia a região direcionada de SIGLEC1. Os iniciadores estão listados na Tabela 17 abaixo. Três pares de iniciadores foram usados para amplificar, respectivamente, a região do braço inferior da timidina quinase (TK) (“a” direto e “e” reverso, setas pretas na Figura 24), a região de Neo do braço superior (“f” direto e “b” reverso, setas cinza claro na Figura 24), e o éxon 1 e o gene neo (“c” direto e “d” reverso, setas cinza escuro na Figura 24). A incorporação dos iniciadores “c” e “d” (setas cinza escuro na Figura 24) foi projetada para produzir ~ 2.400 e ~ 2.900 pb dos alelos de tipo selvagem e direcionados, respectivamente.

TABELA 17: INICIADORES DE PCR PARA AMPLIFICAR AS MODIFICAÇÕES DE SIGLEC1 Nome do Iniciador (Alvo) Sequência (5’ a 3’) SEQ ID NO. “a” direto (TK) AGAGGCCACTTGTGTAGCGC 124 “e” reverso (TK) CAGGTACCAGGAAAAACGGGT 125 “f” direto (Neo de braço superior) GGAACAGGCTGAGCCAATAA 126 “b” reverso (Neo de braço superior) GGTTCTAAGTACTGTGGTTTCC 127 “c” direto (éxon 1 e neo) GCATTCCTAGGCACAGC 128 “d” reverso (éxon 1 e neo) CTCCTTGCCATGTCCAG 129

[0626] Para ensaios de Southern blot, o DNA genômico foi digerido a 37 °C com ScaI e MfeI (New England BioLabs). Os sítios para MfeI residem nas regiões genômicas a montante do sítio de início da tradução e no íntron 6. Um sítio ScaI está presente no cassete neo. O DNA digerido foi separado em gel de agarose, transferido para uma membrana de náilon (Immobilon NY +; EMD Millipore) por ação capilar e imobilizado por reticulação UV (Green et al., 2012). Um fragmento genômico contendo o íntron 4 e porções dos éxons 4 e 5 foi amplificado por PCR usando os oligonucleotídeos listados na Tabela 18 abaixo e marcado com digoxigenina de acordo com o protocolo do fabricante (Roche). A hibridização, lavagem e detecção de sinal foram realizadas de acordo com as recomendações do fabricante (Roche). Os tamanhos previstos dos genes de tipo selvagem e SIGLEC1 direcionados foram 7.892 e 7.204 pb, respectivamente.

TABELA 18: OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA ENSAIOS DE SOUTHERN BLOT Oligonucleotídeo Sequência (5’ a 3’) SEQ ID NO.

2789 F GATCTGGTCACCCTCAGCT 130 3368R GCGCTTCCTTAGGTGTATTG 131 COLORAÇÃO DE SUPERFÍCIE DE SIGLEC1 (CD169) E CD163 DE CÉLULAS PAM

[0627] Células PAM (macrófagos alveolares suínos) foram coletadas por lavagem pulmonar. Resumidamente, os pulmões excisados foram preenchidos com aproximadamente 100 ml de PBS frio. Após uma única lavagem, o pélete foi ressuspenso em aproximadamente 5 ml de PBS frio e armazenado em gelo. Aproximadamente 107 células PAM foram incubadas em 5 ml de 20 μg/ml de anticorpo anti-CD169 porcino (clone 3B11/11; AbD Serotec) ou anti-CD163 porcino (clone 2A10/11; AbD Serotec) diluído em PBS com 5% de FBS e 0,1% de azida de sódio (PBS-FBS) por 30 minutos em gelo. As células foram centrifugadas, lavadas e ressuspensas em 1/100 de IgG de cabra anti-camundongo conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Life Technologies) diluído em tampão de coloração e incubado por 30 minutos em gelo. Pelo menos 104 células foram analisadas usando um citômetro de fluxo FACSCalibur e software Cell Quest (Becton Dickinson).

RESULTADOS CRIAÇÃO DE PORCOS KNOCKOUT SIGLEC1

[0628] A estratégia de inativação usada, diagramada na Figura 24, focou na criação de alterações drásticas de SIGLEC1 de modo que os éxons 2 e 3 fossem eliminados e nenhuma proteína funcional fosse obtida a partir do gene mutado. Além disso, a interrupção adicional do gene foi realizada substituindo parte do éxon 1 e todos os éxons 2 e 3 com um cassete selecionável por neomicina orientado na direção oposta (Mansour et al., 1988). Trinta e quatro transfecções foram conduzidas com uma variedade de preparações de plasmídeo (0,75 a 10 μg/μl, ambos os construtos de fita simples e dupla, e ambos os construtos de tamanho médio e grande). Também foram incluídas células masculinas e femininas representando cinco diferentes linhagens celulares fetais porcinas. Mais de

2.000 colônias foram triadas quanto à presença da inserção direcionada do cassete neo. Os pares de iniciadores de PCR “f” mais “b” e “a” mais “e” (Figura 24, painéis B e C) foram usados para verificar o direcionamento bem-sucedido dos braços superior e inferior do construto. Duas colônias testaram positivo para a presença da inserção correta, um macho e uma fêmea (dados não mostrados).

[0629] Células do clone masculino, 4-18, foram usadas para transferência nuclear de células somáticas e a transferência de 666 embriões em portadoras. A transferência de embriões clonados em duas portadoras produziu um total de oito leitões. Uma portadora deu à luz seis leitões machos normais no dia 115 de gestação. Uma cesárea foi realizada na segunda portadora no dia 117 de gestação, resultando em dois leitões machos normais. Três transferências de embriões também foram realizadas com as células femininas (658 embriões), mas nenhuma estabeleceu uma gravidez. A Figura 25 mostra os resultados para PCRs realizados com DNA genômico extraído dos oito clones de leitão macho (F0) gerados a partir da linhagem de fibroblasto fetal direcionada 4-18. Para detectar ambos os alelos, uma PCR foi realizada com os iniciadores “c” e “d” (Figura 24, painel C). Os tamanhos de produto de PCR previstos foram de ~ 2.400 pb para o alelo de tipo selvagem e ~ 2.900 pb para o alelo direcionado. Os resultados da PCR com os iniciadores “c” e “d” são mostrados na Figura 25. Todos os porcos testaram positivo para a presença dos alelos de 2.400 pb de tipo selvagem e de 2.900 pb direcionados (Figura 25, painel B). PCRs de controle incorporando DNA da linhagem celular usada para clonagem, da linhagem celular de fibroblasto 4-18 direcionada e da linhagem celular 4-18 não direcionada produziram os produtos previstos (Figura 25, painel A). A presença da mutação direcionada foi ainda confirmada pela amplificação de regiões com pares de iniciadores identificados pelas setas cinza claro e pretas na Figura 24, painel C, que foram previstas para produzir produtos de ~ 4.500 e ~ 5.000 pb, respectivamente. Os resultados mostraram a presença de ambos os produtos nos oito porcos fundadores (dados não mostrados).

[0630] Cinco dos machos F0 foram usados para cruzar com fêmeas do tipo selvagem que resultou em 67 progênie F1 (40 machos e 27 fêmeas), 39 (58%) dos quais eram SIGLEC1+/-. Um dos machos F 1 foi cruzado com uma das fêmeas F 1 (ninhada 52) para produzir uma ninhada de 12 porcos, 11 dos quais permaneceram viáveis até o desmame. A identificação de alelos de tipo selvagem e direcionados na progênie foi feita por Southern blotting de DNA genômico. Os resultados na Figura 26 mostram quatro animais F2 SIGLEC1 +//+, três SIGLEC1 +/- e quatro SIGLEC1 - /-.

EXPRESSÃO DE CD169 (SIGLEC1) E CD163 EM CÉLULAS PAM.

[0631] As células para a coloração de anticorpos foram obtidas a partir de porcos no final do estudo. Como mostrado na Figura 27, mais de 90% das células PAM de porcos SIGLEC1 +//+ e SIGLEC1+/- foram duplamente positivos para CD169 e CD163. Em contraste, todos os porcos SIGLEC1-/- foram negativos para a expressão de superfície de CD169, mas permaneceram positivos para CD163. Os resultados mostraram a ausência de expressão de CD169 nas células de todos os porcos SIGLEC1 -/-. A ausência de expressão de superfície de CD169 não alterou a expressão do co-receptor de PRRSV, CD163.

EXEMPLO 5: USO DE UM SISTEMA CRISPR/CAS9 PARA PRODUZIR PORCOS COM

MODIFICAÇÕES CROMOSSÔMICAS EM ANPEP A PARTIR DE OÓCITOS E EMBRIÕES DERIVADOS IN-VITRO MATERIAIS E MÉTODOS PRODUTOS QUÍMICOS E REAGENTES

[0632] Salvo indicação em contrário, todos os produtos químicos usados neste estudo foram adquiridos da Sigma, St. Louis, MO.

PROJETO DE GRNAS PARA CONSTRUIR CRISPRS COM ANPEP ESPECÍFICO

[0633] A sequência genômica de comprimento completo de ANPEP (SEQ ID NO: 132) foi usada para projetar RNAs guia de CRISPR. Esta transcrição tem 30.000 pares de bases e três variantes de splice (X1, X2 e X3).

X1 tem 20 éxons e codifica um produto de proteína de 1017 aminoácidos (SEQ ID NO: 133). X2 e X3 diferem em um sítio de splice que ocorre antes do códon de iniciação no éxon 2 e ambos codificam o mesmo produto de 963 aminoácidos (SEQ ID NO: 134).

[0634] Os RNAs guia (gRNA) foram projetados para regiões dentro do éxon 2 do gene ANPEP porque o códon de iniciação está dentro do éxon 2. Para facilidade de referência, uma sequência de referência que compreende uma porção da sequência de ANPEP de comprimento completo é fornecida aqui (SEQ ID NO: 135). A sequência de referência SEQ ID NO: 135 compreende uma porção do íntron 2, éxon 2, íntron 3, éxon 3, íntron 4, éxon 4 e uma porção do íntron 4. Esta sequência de referência (SEQ ID NO: 135) compreende 1000 nucleotídeos precedendo o códon de iniciação dentro do éxon 2, a região de codificação do éxon 2, e 1000 nucleotídeos após o final do éxon 2. Uma versão anotada desta sequência aparece na Figura 28. Na Figura 28, os éxons 2, 3 e 4 estão sublinhados. O éxon 2 começa no nucleotídeo 775 na Figura 28, consistente com as variantes X1 e X2 (a variante X3 começa no éxon 2 no nucleotídeo 778). Esta diferença não tem efeito sobre o produto proteico, uma vez que ocorre antes do códon de iniciação (o códon de iniciação está nos nucleotídeos 1001-1003 da SEQ ID NO: 135 e é mostrado em letra minúscula em negrito na Figura 28). Portanto, os éxons 2, 3 e 4 na SEQ ID NO: 135 codificam os primeiros 294 aminoácidos nos dois produtos de proteína codificados entre as três variantes (SEQ ID NO: 133 ou SEQ ID NO: 134). Para facilidade de referência, cada um dos INDELs descritos abaixo neste Exemplo e no Exemplo 6 são descritos em referência à sequência de referência SEQ ID NO: 135. Quando se referem a sequências de aminoácidos, são feitas referências à proteína de 963 aminoácidos codificada por variantes de splice X2 e variantes de splice X3 (SEQ ID NO: 134). No entanto, o técnico no assunto será prontamente capaz de determinar onde as inserções ou deleções ocorrem na sequência de aminoácidos codificada pela variante de splice X1 (SEQ ID NO: 133). Uma lista dos nucleotídeos correspondente aos íntrons e éxons incluídos na referência SEQ ID NO: 135 que aparece na Figura 28 é fornecido na Tabela 19 abaixo.

TABELA 19: LOCALIZAÇÕES DE ÍNTRONS/ ÉXONS NA FIGURA 28 Intervalo de nucleotídeos Localização/ Qualificador

1...774 Fim do íntron 2

775...1599 Éxon 2 (códon de iniciação (atg) no nt 1001)

1600...2109 Íntron 3

2110...2251 Éxon 3

2252...2378 Íntron 4

2379...2518 Éxon 4

2519...2599 Início do íntron 5

[0635] Todos os RNAs guia foram projetados após o códon de iniciação, de modo que as INDELs seriam mais propensas a resultar em um deslocamento e códon de iniciação prematuro. Os seis alvos selecionados eram adjacentes a um motivo adjacente de protoespaçador (PAM) S. pyogenes (Spy) (Ran et al. 2015) e estão listados na Tabela 20 abaixo. O PAM é identificado pelos parênteses em cada gRNA. Os guias 2 e 3 também são identificados em negrito e sublinhado duplo na SEQ ID NO: 135 na Figura 28. A especificidade dos crRNAs projetados foi confirmada pela pesquisa de sequências porcinas semelhantes no GenBank.

TABELA 20: GUIAS ANPEP CRISPR Alvo Sequência SEQ ID NO. Guia ANPEP 1 CTTCTACCGCAGCGAGTACA(TGG) 136 Guia ANPEP 2 TACCGCAGCGAGTACATGGA(GGG) 137 Guia ANPEP 3 CCTCCTCGGCGTGGCGGCCG(TGG) 138 Guia ANPEP 4 CACCATCATCGCTCTGTCTG(TGG) 139 Guia ANPEP 5 TACCTCACTCCCAACGCGGA(TGG) 140 Guia ANPEP 6 AGCTCAACTACACCACCCAG(GGG). 141

[0636] Oligonucleotídeos direto (F) e reverso (R) correspondentes a cada alvo ANPEP, listado na Tabela 21 abaixo, foram recombinados em baixa temperatura e clonados no vetor p330X que contém dois cassetes de expressão, um S. pyogenes (hSpy) Cas9 códon-otimizado humano e o RNA guia quimérico. O P330X foi digerido com BbsI (New England Biolabs) seguindo o protocolo do laboratório de Zhang (disponível em http://www.addgene.org/crispr/zhang/; ver também Cong et al., 2013 e Hsu et al., 2013). O sucesso da clonagem de cada guia foi confirmado pelo sequenciamento de Sanger pela unidade central de DNA da Universidade de Missouri. Os plasmídeos que foram clonados com sucesso foram propagados em células eletrocompetentes TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e preparações de plasmídeo em grande escala foram realizadas com kits Qiagen Plasmid Maxi (Qiagen, Germantown, MD). Os plasmídeos foram congelados a -20°C até o uso para molde de transcrição in vitro ou para transfecção.

TABELA 21: CRRNAS PROJETADOS PARA EDIÇÃO ANPEP.

SEQ ID Nome do iniciador Sequência (5’-3’) NO. Guia ANPEP 1 Iniciador 1 (Direto) CACCGCTTCTACCGCAGCGAGTACA 142 Guia ANPEP 1 Iniciador 2 (Reverso) AAACTGTACTCGCTGCGGTAGAAGC 143 Guia ANPEP 2 Iniciador 1 (Direto) CACCGTACCGCAGCGAGTACATGGA 144

SEQ ID Nome do iniciador Sequência (5’-3’) NO. Guia ANPEP 2 Iniciador 2 (Reverso) AAACTCCATGTACTCGCTGCGGTAC 145 Guia ANPEP 3 Iniciador 1 (Direto) CACCGCCTCCTCGGCGTGGCGGCCG 146 Guia ANPEP 3 Iniciador 2 (Reverso) AAACCGGCCGCCACGCCGAGGAGGC 147 Guia ANPEP 4 Iniciador 1 (Direto) CACCGCACCATCATCGCTCTGTCTG 148 Guia ANPEP 4 Iniciador 2 (Reverso) AAACCAGACAGAGCGATGATGGTGC 149 Guia ANPEP 5 Iniciador 1(Direto) CACCGTACCTCACTCCCAACGCGGA 150 Guia ANPEP 5 Iniciador 2 (Reverso) AAACTCCGCGTTGGGAGTGAGGTAC 151 Guia ANPEP 6 Iniciador 1 (Direto) CACCGAGCTCAACTACACCACCCAG 152 Guia ANPEP 6 Iniciador 2 (Reverso) AAACCTGGGTGGTGTAGTTGAGCTC 153

COLETA DE FIBROBLASTO FETAL

[0637] Fetos porcinos foram coletados no dia 35 de gestação para criar linhagens celulares para transfecção. Uma linhagem celular de fibroblasto fetal de tipo selvagem macho e uma de tipo selvagem fêmea foram estabelecidas a partir de um grande cruzamento doméstico branco.

Fibroblastos fetais foram coletados conforme descrito anteriormente com pequenas modificações (Lai e Prather., 2003a); tecido picado da parte de trás de cada feto foi digerido em 20 ml de meio de digestão (meio Eagles modificado de Dulbecco contendo L-glutamina, 1 g/l de D-glicose (Cellgro, Manassas, VA) e 200 unidades/ml de colagenase e 25 unidades Kunitz/ ml DNaseI) durante 5 horas a 38,5 °C. Após a digestão, as células de fibroblastos fetais foram lavadas e cultivadas com DMEM contendo 15% de soro fetal bovino (SFB) e 40 μg/ml de gentamicina. Após a cultura de um dia para outro, as células foram tripsinizadas e congeladas lentamente a -80°C em alíquotas em FBS com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenadas a longo prazo em nitrogênio líquido.

TRANSFECÇÃO COM GRNAS DE ANPEP CRISPR

[0638] As condições de transfecção foram semelhantes aos protocolos relatados anteriormente (Ross et al., 2010; Whitworth et al., 2014).

Resumidamente, seis guias ANPEP foram testados em diferentes combinações em 17 transfecções. A concentração total do guia CRISPR foi de 2 μg/ transfecção. Linhagens celulares de fibroblastos fetais de número de passagem semelhante (2-4) foram cultivadas por dois dias e crescidas até 75-85% de confluência em meio Eagles modificado de Dulbecco contendo L-glutamina e 1 g/l D-glicose (Cellgro, Manassas, VA; DMEM) suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS), 2,5 ng/ml de fator de crescimento de fibroblasto básico (Sigma), 10 mg/ml de gentamicina e 25 μg/ml de FUNGIZONA (anfotericina B).

As células de fibroblastos foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS; Life Technologies, Austin, TX) e tripsinizadas. Assim que as células se separaram, as células foram enxaguadas com um meio de eletroporação (75% de citosais (KCl 120 mM, CaCl2 0,15 mM, K2HPO4 10 mM; pH 7,6, MgCl2 5 mM)) (Yanez et al., 2016) e 25% de OPTI-MEM (Life Technologies). As células foram contadas usando um hemocitômetro. As células foram peletizadas a 600 x g durante 5 minutos e ressuspensas a uma concentração de 1 x 106/ ml em meio de eletroporação. Cada eletroporação usou 200 μl (0,2 x 106 células totais) de células em cubetas de lacuna de 2 mm com três (1 mseg) pulsos de onda quadrada administrados através de um sistema de eletroporação BTX ECM 2001 a 250 volts. Após a eletroporação, as células foram ressuspensas em meio DMEM descrito acima. As colônias foram coletadas no dia 14 após a transfecção. Fibroblastos fetais foram colocados em placas a 50 células/placa (Beaton e Wells 2014). Colônias de fibroblastos fetais foram coletadas selando cilindros de clonagem autoclavados de 10 mm ao redor de cada colônia. As colônias foram enxaguadas com PBS e colhidas via tripsina e, em seguida, ressuspensas em meio de cultura DMEM. Uma parte (1/3) da colônia ressuspensa foi transferida para uma placa de PCR de 96 poços para genotipagem e o restante (2/3) das células foram cultivadas em um poço de uma placa de 24 poços para propagação celular e subsequente transferência nuclear de células somáticas (SCNT). Os péletes celulares foram ressuspensos em 6 µl de tampão de lise (Tris 40 mM, pH 8,9, 0,9% de Triton X- 100, 0,4 mg/ml de proteinase K; New England Biolabs), incubados a 65 °C por 30 minutos para lise celular, seguido por 85 °C por 10 minutos para inativar a proteinase K. Os lisados celulares foram então usados para genotipagem via PCR.

TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULAS S OMÁTICAS (SCNT)

[0639] Para produzir embriões de SCNT, oócitos derivados de porcas foram adquiridos da Desoto Biosciences LLC (Seymour, NT). Os oócitos derivados de porcas foram transportados de um dia para outro em meio de maturação (TCM199 com HEPES 2,9 mM, 5 µg/ml de insulina, 10 ng/ml de EGF, 0,5µg/ml de p-FSH, piruvato 0,91 mM, cisteína 0,5 mM, fluido folicular suíno a 10%, 25 ng/ml de gentamicina) e transferidos para meio fresco após 24 horas. Após 40-42 horas de maturação, as células de cúmulos foram removidas dos oócitos por vórtex na presença de hialuronidase a 0,1%. Durante o SCNT, os oócitos foram colocados em meio de manipulação (TCM199 com NaHCO 3 0,6 mM, Hepes 2,9 mM, NaCl 30 mM, 10 ng/ml de gentamicina e 3 mg/ml de BSA, e osmolaridade de 305) suplementado com 7,0 µg/ml de citocalasina B. O corpo polar juntamente com uma porção do citoplasma adjacente, presumivelmente contendo a placa metafásica II, foi removido e uma célula doadora foi colocada no espaço perivitelino usando um capilar de vidro fino (Lai e Prather, 2003b). Os embriões reconstruídos foram então fundidos em um meio de fusão (manitol 0,3 M, CaCl2 0,1 mM, MgCl 2 0,1 mM, HEPES 0,5 mM) com dois pulsos de CC (intervalo de 1 segundo) a 1,2 kV/cm por 30 µs usando um BTX Eletro Cell Manipulator (Harvard Apparatus). Após a fusão, os embriões fundidos foram quimicamente ativados com timerosal 200 μM por 10 minutos no escuro e ditiotreitol 8 mM por 30 minutos

(Machaty et al., 1997). Os embriões foram então incubados em meio de zigoto suíno modificado PZM3-MU1 (Bauer et al., 2010; Yoshioka et al., 2002) com Scriptaid 0,5 µM (Sigma-Aldrich, S7817), um inibidor de histona desacetilase, por 14-16 horas, conforme descrito anteriormente (Whitworth et al., 2011; Zhao et al., 2010; Zhao et al., 2009).

FERTILIZAÇÃO I N V ITRO (IVF)

[0640] Para IVF, ovários de leitoas pré-púberes foram obtidos de um matadouro (Farmland Foods Inc., Milan, MO). Oócitos imaturos foram aspirados de folículos de tamanho médio (3-6 mm) usando uma agulha hipodérmica de calibre 18 acoplada a uma seringa de 10 ml .

Oócitos com citoplasma homogênio e membrana plasmática e células de cúmulos circundantes intactas foram então selecionados para maturação.

Cerca de 50 complexos de oócitos de cúmulos foram colocados em um poço contendo 500 µl de meio de maturação (TCM 199 (Invitrogen, Grand Island, NY) com glicose 3,05 mM, piruvato de sódio 0,91 mM, cisteína 0,57 mM, 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico (EGF), 0,5 µg/ml de hormônio luteinizante (LH), 0,5 µg/ml de hormônio folículo-estimulante (FSH), 10 ng/ml de gentamicina (APP Pharm, Schaumburg, IL) e álcool polivinílico a 0,1% (PVA)) por 42 a 44 horas a 38,5 °C, 5% de CO 2, em ar umidificado. Após a maturação, as células de cúmulos circundantes foram removidas dos oócitos por vórtex durante 3 minutos na presença de hialuronidase a 0,1%. Oócitos maturados in vitro foram colocados em gotículas de 50 µl de meio IVF (meio tamponado com Tris modificado (mTBM) contendo NaCl 113,1 mM, KCl 3 mM, CaCl 2 7,5 mM, glicose 11 mM, Tris 20 mM, cafeína 2 mM, piruvato de sódio 5 mM e 2 mg/ml de BSA) em grupos de 25 a 30 oócitos. Um pélete congelado de 100 µl de sêmen de tipo selvagem foi descongelado em 3 ml de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) suplementado com BSA a 0,1%. O sêmen foi lavado em percoll a 60% por 20 minutos a 650 × g e em mTBM por 10 minutos por centrifugação. O pélete de sêmen foi então ressuspenso com meio IVF a 0,5 × 10 6 células/ml. Cinquenta µl da suspensão de sêmen foram introduzidos nas gotículas com os oócitos. Os gametas foram co- incubados por 5 horas a 38,5 °C em uma atmosfera de 5% de CO 2 em ar.

Após a fertilização, os embriões foram incubados em PZM3-MU1 (Bauer et al. 2010; Yoshioka et al. 2002) a 38,5 °C, 5% de CO 2 em atmosfera de ar.

S ÍNTESE I N V ITRO DE RNA PARA SISTEMA CRISPR/C AS9

[0641] O gRNA para injeção de zigoto foi preparado conforme descrito anteriormente (Whitworth et al., 2017). O DNA guia de modelo foi sintetizado pela primeira vez pela Integrated DNA Technologies na forma de um gBlock. Uma sequência do promotor T7 foi adicionada a montante do guia para a transcrição in vitro (sublinhado na Tabela 22).

Cada gBlock foi diluído para a concentração final de 0,1 ng/μl e amplificado por PCR com os iniciadores diretos de transcrição in vitro (IVT) (exclusivos para cada guia CRISPR) e o mesmo iniciador reverso (gRNA Rev1) listado na Tabela 22. As condições de PCR incluíram um desnaturação inicial de 98 °C por 1 minuto seguido por 35 ciclos de 98 °C(10 segundos), 68 °C(30 segundos) e 72 °C(30 segundos). Cada gBlock amplificado por PCR foi purificado usando um kit de purificação QIAGEN PCR. Os amplicons de gBlock purificados foram então usados como moldes para a transcrição in vitro usando o kit de transcrição MEGASHORTSCRIPT (Ambion). A qualidade do RNA foi visualizada em um gel de agarose livre de RNA a 2,0%. As concentrações e as razões 260:280 foram determinadas por espectrofotometria NANODROP. O mRNA de Cas9 coberto e poliadenilado foi adquirido na Sigma. O RNA foi diluído para uma concentração final de 20 ng/μl (tanto gRNA quanto Cas9), distribuído em alíquotas de 3 μl e armazenado a -80 °C até a injeção.

TABELA 22: I NICIADORES USADOS PARA AMPLIFICAR O DNA MOLDE PARA

TRANSCRIÇÃO I N V ITRO

SE Identificação do Guia de Q Sequência (5’-3’)

IVT ID NO. Guia ANPEP 1 (Direto) TTAATACGACTCACTATAGGCTTCTACCGCAGCGAGTAC 154

A Guia ANPEP 2 (Direto) TTAATACGACTCACTATAGGTACCGCAGCGAGTACATGG 155

A Guia ANPEP 3 (Direto) TTAATACGACTCACTATAGGCCTCCTCGGCGTGGCGGC 156

CG Guia ANPEP 4 (Direto) TTAATACGACTCACTATAGGCACCATCATCGCTCTGTCT 157

G Guia ANPEP 5 (Direto) TTAATACGACTCACTATAGGCACCATCATCGCTCTGTCT 158

G Guia ANPEP 6 (Direto) TTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAACTACACCACCCA 159

G gRNA Rev 1 AAA AGC ACC GAC TCG GTG CC 160 INJEÇÃO DE ZIGOTO DO SISTEMA ANPEP CRISPR/CAS9 EM ZIGOTOS

[0642] O mRNA de Cas9 foi adquirido da Sigma Aldrich (St.

Louis, MO) e foi misturado com ANPEP gRNA 2 e 3 (Tabela 20). O gRNA 2 foi escolhido porque tinha a maior eficiência de edição após a transfecção de fibroblasto fetal. O gRNA 3 foi escolhido como controle negativo porque não tinha capacidade de edição após a transfecção de fibroblastos fetais. Este projeto foi escolhido para ver se uma taxa de edição semelhante seria observada entre os dois métodos, transfecção de fibroblasto fetal e injeção de zigoto. A mistura de gRNA 2 e gRNA 3 (20 ng/μl) e mRNA de Cas9 (20 ng/μl) foi co-injetada no citoplasma de oócitos fertilizados 14 horas após a fertilização (zigotos presumíveis) usando um microinjetor FEMTOJET (Eppendorf; Hamburgo, Alemanha). A microinjeção foi realizada em meio de manipulação (TCM199 com NaHCO3 0,6 mM, HEPES 2,9 mM, NaCl 30 mM, 10 ng/ml de gentamicina e 3 mg/ml de BSA; e osmolaridade de 305) na platina aquecida de um microscópio invertido Nikon (Nikon Corporation; Tóquio, Japão). Os zigotos injetados foram então transferidos para o PZM3-MU1 com 10 ng/ml de ps48 até a transferência do embrião ou deixados desenvolver até o estágio de blastocisto para confirmação do genótipo.

ENSAIOS DE GENOTIPAGEM

[0643] O DNA genômico foi usado para avaliar o genótipo por PCR, eletroforese em gel de agarose e subsequente sequenciamento de DNA de Sanger. A PCR foi realizada com os iniciadores específicos de ANPEP listados na Tabela 23 abaixo usando um protocolo padrão e LA Taq (Takara, Mountain View, CA). As condições de PCR consistiram em 96 °C por 2 minutos e 35 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 50 °C por 40 segundos e 72 °C por 1 minuto, seguido por uma extensão de 72 °C por 2 minutos. Um amplicon de 965 pb foi então separado em um gel de agarose a 2,0% para determinar inserções ou deleções óbvias. Os amplicons também foram submetidos ao sequenciamento de Sanger para determinar a localização exata da modificação. Os amplicons de porcos vivos foram clonados com TOPO e o DNA sequenciado para determinar a modificação exata de ambos os alelos.

TABELA 23: INICIADORES ESPECÍFICOS DA ANPEP PARA PCR Iniciador Sequência SEQ ID NO. ANPEP Direto ACGCTGTTCCTGAATCT 161 ANPEP Reverso GGGAAAGGGCTGATTGTCTA 162

TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÃO

[0644] Os embriões gerados para produzir porcos editados ANPEP foram transferidos para leitoas receptoras para nascimento a termo. Para embriões injetados com zigoto de IVF e SCNT, os embriões foram cultivados de um dia para outro e transferidos para o oviduto de uma leitoa no dia 1 do ciclo estral (SCNT) ou cultivados por cinco dias e depois transferidos para o oviduto de uma leitoa no dia 4, 5, ou 6 do ciclo estral (IVF e SCNT). Todos os embriões foram transportados para o sítio cirúrgico em PZM3-MU1 (Bauer et al. 2010) na presença de 10 ng/ml de ps48 (ácido 5-(4-cloro-fenil)-3-fenil-pent-2-enóico; Stemgent, Inc.,

Cambridge, MA). Independentemente do estágio de desenvolvimento, todos os embriões foram transferidos cirurgicamente para a junção ampular-ístmica do oviduto da leitoa receptora (Lee et al. 2013). Houve um total de quatro transferências de embriões (ETs) realizadas com embriões de SCNT e seis ETs realizadas com embriões injetados com zigoto. As duas primeiras transferências de embriões para SCNT foram realizadas usando células doadoras das colônias originais isoladas após a transfecção. As células doadoras para as duas segundas ETs para SCNT foram isoladas a partir do dia 35 de fetos coletados das duas primeiras ETs.

I MUNOHISTOQUÍMICA

[0645] A imunohistoquímica para detectar a presença de ANPEP no íleo de porcos modificados foi realizada usando procedimentos padrão. Após a coleta, os tecidos intestinais foram imediatamente colocados em formalina tamponada a 10%. Após o processamento, as seções embebidas em parafina foram montadas em lâminas. As seções foram desparafinadas com Leica BOND Dewax Solution (uma solução de desparafinização à base de solvente) e a recuperação de antígeno foi realizada usando Leica BOND Epitope Retrieval Solution 1 (uma solução de recuperação de epítopo de pH 6,0 à base de citrato para a recuperação de epítopo induzida por calor de tecido embebido em parafina e fixado em formalina) por 20 minutos a 100 °C. As lâminas foram incubadas com peróxido de hidrogênio a 3% por 5 minutos em temperatura ambiente e visualizadas usando um procedimento automatizado em um NexES IHC Staining Module (Ventana Medical). Um anticorpo policlonal de coelho anti - CD13 (APN) (Abcam) preparado contra um peptídeo cobrindo os aminoácidos 400 a 500 de CD13 humana foi usado para a detecção do antígeno APN. O anticorpo foi diluído 1:3200 em diluente de anticorpo primário Leica BOND (contendo solução salina tamponada com Tris, tensoativo, estabilizador de proteína e PROCLIN 950 a 0,35% (solução de 2-metil-4-isotiazolin-3-ona)) e incubado em lâminas por 15 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas e o anticorpo ligado detectado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) anti-IgG de coelho. A atividade de HRP foi visualizada com 3,3’-diaminobenzidina (DAB) e as lâminas foram contrastadas com hematoxilina.

RESULTADOS TRANSFECÇÕES COM PLASMÍDEO GUIA ANPEP CRISPR

[0646] Um total de 17 transfecções foi realizado para determinar qual guia CRISPR editaria eficientemente o gene ANPEP, bem como para isolar linhagens celulares primárias com edições ANPEP induzidas por CRISPR para uso em SCNT. A eficiência de transfecção em cada experimento está resumida na Tabela 24 abaixo. O guia ANPEP 2 resultou no maior número de colônias editadas quando transfectadas isoladamente. Houve um total de quatro transfecções com o guia ANPEP 2 e a eficiência de edição variou de 0 a 23,3%. Uma colônia era considerada editada se houvesse uma diferença de tamanho observável do amplicon de PCR após a eletroforese de DNA. Apenas os porcos e fetos resultantes foram sequenciados para determinar a localização precisa e o tamanho das edições. O guia ANPEP 1 foi o segundo guia mais eficiente, com uma taxa de edição variando de 0 a 7,1% em quatro transfecções. Curiosamente, quando os guias ANPEP 1 e 2 foram misturados e cotransfectados, a taxa de edição foi de 0% nas três transfecções. Os guias ANPEP 3 e 4 não resultaram em edições (duas transfecções cada) e os guias ANPEP 5 e 6 resultaram em 2,9% e 4,2% de edição, mas apenas uma única transfecção foi realizada para cada guia. As colônias E9, F7, D11 transfectada s com guia ANPEP 2 e a colônia A10 transfectada com guia ANPEP 1 foram selecionadas para SCNT.

TABELA 24: E FICIÊNCIA DE TRANSFECÇÃO DE GUIAS CRISPR Número Número Média de Porcentage Númer Transfecçã de de colônia m de Tratamento Sexo o de o colônia colônias s colônias placas s / placa editada editadas s ANPEP 1 1 Masculin 42 17 2,47 3 7,1 o ANPEP 2 2 Masculin 31 12 2,58 1 3,2 o Mistura de ANPEP 3 Masculin 23 19 1,21 0 0,0 1+2 o ANPEP 1 4 Feminino 27 10 2,70 1 3,7 ANPEP 2 5 Feminino 30 10 3,00 7 23,3a Mistura de ANPEP 6 Feminino 14 10 1,40 0 0,0 1+2 ANPEP 1 7 Masculin 46 10 4,60 0 0,0 o ANPEP 2 8 Masculin 36 10 3,60 0 0,0 o ANPEP 3 9 Masculin 40 10 4,00 0 0,0 o ANPEP 4 10 Masculin 35 10 3,50 0 0,0 o ANPEP 1 11 Masculin 41 10 4,10 1 2,4b o ANPEP 2 12 Masculin 21 10 2,10 3 14,3c o Mistura de ANPEP 13 Masculin 34 10 3,40 0 0,0 1+2 o ANPEP 3 14 Feminino 28 10 2,80 0 0,0 ANPEP 4 15 Feminino 33 10 3,30 0 0,0 ANPEP 5 16 Feminino 35 10 3,50 1 2,9 ANPEP 6 17 Feminino 24 10 2,40 1 4,2 a Células usadas para SCNT (E9, F7); b Células usadas para SCNT (A10); c células usadas para SCNT (D11)

TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULAS S OMÁTICAS DE CÉLULAS EDITADAS POR ANPEP

[0647] As células da colônia E9, F7, D11 e A10 foram usadas para SCNT. Um número igual de embriões foi reconstruído a partir de cada grupo de células, mas os embriões foram misturados em um único porco durante a ET. Duas transferências de embriões foram realizadas com essas células da colônia primária e ambos os porcos resultaram em gestações. As gestações foram interrompidas no dia 35 para coleta do feto.

Dez fetos foram coletados do porco O279, dos quais três continham edições bialélicas no gene ANPEP. Cinco fetos foram coletados do porco O307, dos quais três continham edições bialélicas no gene ANPEP. Cada feto foi genotipado e os genótipos resultantes estão listados na Tabela 25 abaixo.

[0648] A Figura 29 mostra um gel de agarose representativo mostrando os amplicons de PCR através dos quatro genótipos observados a partir de ET nos receptores O279 e O307. A faixa 1 é uma deleção de 182 pb/ sem WT, a faixa 2 é uma deleção de 9 pb/ sem WT, a faixa 3 é do tipo selvagem, a faixa 4 é uma deleção de 867 pb (banda leve em direção ao fundo do gel)/ sem WT, e a faixa 5 é do tipo selvagem. Muitos dos fetos eram bialélicos (ou seja, tinham dois alelos modificados). Em cada caso, eles tinham um alelo caracterizado (por exemplo, deleção de 182 pb) e um alelo não do tipo selvagem. O segundo alelo não do tipo selvagem não foi sequenciado ou identificado. Ácido nucleico de tipo selvagem e água foram usados como controles positivos e negativos, respectivamente.

[0649] Linhagens celulares de fibroblastos fetais foram criadas a partir de cada feto e três linhagens fetais foram então usadas para SCNT para dois SCNT e ET adicionais. Nenhuma das porcas receptoras engravidou das novas linhagens celulares fetais estabelecidas (Tabela 25).

TABELA 25: DADOS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES A PARTIR DE TRANSFERÊNCIA NUCLEAR DE CÉLULAS SOMÁTICAS DE EMBRIÕES EDITADOS POR ANPEP. Taxa de Dias # Fetos Identificaçã # Embriões Resultado do Linhagem* fusão após o coletados o do porco transferidos Genótipo (%) estro (dia 35) Deleção de 182 pb, sem WT (bialélico) ANPEP E9, Deleção de 9 pb, F7, A11, D10 213 sem WT (bialélico) O279 Linhagens 82,8 (Estágio de 1 1 10 Deleção de 867 primárias de célula) pb, sem WT transfecções (bialélico)

WT

WT Deleção de 182 pb, sem WT ANPEP E9, (bialélico) F7, A11, D10 213 Deleção de 9 pb, O307 Linhagens 86,5 (Estágio de 1 2 5 sem WT (bialélico) primárias de célula) Deleção de 867 transfecções pb, sem WT (bialélico) ANPEP FF 53 (estágio Ciclado de volta O380 de O279, 75 de mórula/ 5 N/A 20 dias após a ET O307 blastocisto) ANPEP FF 50 (estágio Ciclado de volta O394 de O279, 75,5 de mórula/ 6 N/A 15 dias após a ET O307 blastocisto) * As linhagens celulares primárias foram derivadas diretamente das transfecções. As linhagens ANPEP FF foram derivadas dos fetos coletados de Porcos O279 e O307.

INJEÇÃO DE ZIGOTO

[0650] Seis ETs foram tentadas com zigotos de IVF injetados com ANPEP gRNA. Os dados de transferência de embriões estão resumidos na Tabela 26 abaixo. As primeiras três ETs resultaram em duas gestações. Uma porca não engravidou. Um receptor (porco O345) foi sacrificado no dia 35 e seis fetos foram coletados. Dos seis fetos, quatro continham uma edição do gene ANPEP, conforme resumido na Tabela 26. A Figura 30 fornece resultados de PCR representativos que representam os alelos presentes nesses seis fetos. A faixa marcada como “água” é um controle negativo sem molde. A faixa marcada como “controle WT” é um controle positivo de tipo selvagem contendo DNA de fibroblastos fetais não transfectados. As faixas 1 a 6 fornecem resultados de PCR para os seis fetos, que apresentaram as seguintes edições genéticas: (1) faixa 1: inserção de 1 par de base/ sem tipo selvagem; (2) faixa 2: inserção de 2 pares de bases/ tipo selvagem; (3) faixa 3: tipo selvagem; (4) faixa 4: tipo selvagem; (5) faixa 5: inserção de 3 pares de bases, deleção de 9 pares de bases e deleção de 267 pares de bases (mosaico); e (6) faixa 6: deleção de 9 pares de bases/ tipo selvagem. Quando uma descrição genotípica inclui a frase “sem WT” ou “sem tipo selvagem”, isso significa que o feto tinha um segundo alelo não caracterizado e não sequenciado (mas não do tipo selvagem). Os alelos modificados nomeados foram sequenciados e são descritos a seguir.

[0651] Um terceiro porco pariu quatro leitões, dos quais três foram editados. Os genótipos desta ninhada (“ninhada 4”) foram determinados usando clonagem TOPO e sequenciamento de Sanger e estão resumidos na Tabela 27. Resultados de PCR representativos mostrando cada alelo ANPEP desses quatro leitões em comparação com o tipo selvagem (WT) ou sem controle de molde (NTC) são mostrados na Figura 4. As faixas 1 a 4 na Figura 31 correspondem a: (1) leitão 4-1, possuindo uma deleção de 9 pares de bases no éxon 2 no alelo 1 e sequência de tipo selvagem no alelo 2; (2) leitão 4-2, possuindo uma inserção de 1 par de bases no éxon 2 no alelo 1 e uma inserção de 2 pares de bases no éxon 2 no alelo 2; (3) leitão 4-3, com sequência de tipo selvagem em ambos os alelos; e (4) leitão 4-4, possuindo uma deleção de 9 pares de bases no éxon 2 no alelo 1 e sequência de tipo selvagem no alelo 2. Os alelos modificados foram sequenciados e são descritos abaixo (Tabelas 29 e 30). Uma fêmea desta ninhada (4-2) foi usada como animal fundador para a criação de leitões para os desafios de PEDV e TGEV descritos no Exemplo 6 abaixo.

[0652] As três ETs restantes foram realizadas com oócitos que foram maturados em meio contendo fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2), fator inibidor de leucemia (LIF) e fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF1) (a 40 ng/ml, 20 ng/ml e 20 ng/ml, respectivamente). Esses fatores de crescimento (chamados coletivamente de FLI) foram mostrados por Yuan e colegas para melhorar a qualidade da maturação do oócito (Yuan et al., 2017). Destas três transferências de embriões FLI, duas receptoras não engravidaram e uma receptora deu à luz nove leitões. Dos nove leitões, sete continham edições na ANPEP e dois eram do tipo selvagem. Os genótipos desta ninhada (“ninhada 158”) foram determinados usando clonagem TOPO e sequenciamento de Sanger e estão resumidos na Tabela 28 abaixo. Os resultados de PCR representativos que representam cada alelo ANPEP destes leitões em comparação com o tipo selvagem (WT) ou sem controle de molde (NTC) são mostrados na Figura 32. Uma fêmea desta ninhada (158-1) e um macho desta ninhada (158-9) foram usados como animais fundadores para criar leitões para os desafios de PEDV e TGEV descritos no Exemplo 6 abaixo.

TABELA 26: DADOS DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES DE ZIGOTOS DERIVADOS DE FERTILIZAÇÃO IN VITRO, INJETADOS DIRETAMENTE COM RNA-GUIA ANPEP. Identifi # Fetos/ Dias cação # Embriões Porcos Linhagem após o Resultado do Genótipo do transferidos Coletados / estro porco Paridos O345 ANPEP 52 (estágio 5 6 (fetos no Deleção de 1 pb, sem WT Injetado de mórula/ dia 35) (bialélico) blastocisto) Deleção de 2 pb, WT (monoalélico) Deleção de 2 pb, deleção de 9 pb, WT (mosaico)

Identifi # Fetos/ Dias cação # Embriões Porcos Linhagem após o Resultado do Genótipo do transferidos Coletados / estro porco Paridos Deleção de 9 pb, WT (monoalélico)

WT O432 ANPEP 68 (estágio 4 – Ciclado de volta 30 dias Injetado de mórula/ após a ET blastocisto) O448 ANPEP 60 (estágio 5 4 leitões Deleção de 9 pb, WT Injetado de mórula/ vivos (monoalélico), 2 porcos blastocisto) Inserção de 1 pb, inserção de 2 pb (bialélico)

WT O606 ANPEP 63 (estágio 5 – Ciclado de volta 30 dias Injetado* de mórula/ após a ET blastocisto) O642 ANPEP 60 (estágio 5 9 leitões Inserção de 1 pb, inserção Injetado* de mórula/ vivos de 12 pb, deleção de 9 pb, blastocisto) WT (mosaico) Inserção de 1 pb, deleção de 1 pb, deleção de 25 pb, incompatibilidade de 2 pb (mosaico) Deleção de 8 pb, incompatibilidade de 2 pb (bialélico) Inserção de 1 pb, inserção de 2 pb (bialélico) Deleção de 9 pb, incompatibilidade de 1 pb (bialélico) Inserção de 1 pb, inserção de 2 pb (bialélico) Deleção de 661 pb + inserção de 8 pb, deleção de 7 pb + adição de 3 pb (bialélico) WT, 2 porcos O533 ANPEP 70 estágio de 4 – Nunca ciclado de volta, Injetado* mórula/ não estava grávida blastocisto) * Indica que os oócitos foram cultivados em meio tratado com FLI (Yuan et al., 2017)

TABELA 27: GENÓTIPOS DA NINHADA “4” Identificação Sexo Alelo 1 Alelo 2 Genótipo do porco 4-1 F Deleção de 9 pb no WT ANPEP+/-9pb éxon 2 4-2 F Inserção de 1 pb no Inserção de 2 pb no éxon 2 ANPEP -/- éxon 2 4-3 M WT WT ANPEP +/+ 4-4 M Deleção de 9 pb no WT ANPEP +/-9pb éxon 2 TABELA 28: GENÓTIPOS DA NINHADA “158” Identificação Sexo Alelo 1 Alelo 2 Genótipo do porco Deleção de 1 pb no éxon 158-1* F Deleção de 12 pb no éxon 2 ANPEP-/- mosaico 2 Inserção de 1 pb no éxon 158-2# F Deleção de 25 pb no éxon 2 ANPEP -/- mosaico 2 158-3 F WT WT ANPEP +/+ Deleção de 8 pb no éxon Incompatibilidade GT/CA no 158-4 F ANPEP -/+ 2 éxon 2 Inserção de 1 pb no éxon 158-5 F Inserção de 2 pb no éxon 2 ANPEP -/- 2 158-6 F WT WT ANPEP +/+ Deleção de 9 pb no éxon Incompatibilidade C/T no 158-7 M ANPEP +/-9pb 2 éxon 2 Inserção de 1 pb no éxon 158-8 M Adição de 2 pb no éxon 2 ANPEP -/- 2 Deleção de 661 pb + Deleção de 7 pb, inserção de 158-9 M ANPEP -/- adição de 8 pb no éxon 2 3 pb no éxon 2 * 158-1 era mosaico para o alelo 1, alelo 2, uma inserção de 1 pb no éxon 2, um alelo de tipo selvagem e uma deleção de 9 pb no éxon 2. # 158-2 era mosaico para o alelo 1, alelo 2, uma deleção de 1 pb no éxon 2, uma incompatibilidade de 2 pb no éxon 2 e uma deleção de 26 pb no éxon 2.

G ENOTIPAGEM E CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE INSERÇÃO -DELEÇÕES (INDEL S)

[0653] Cada um dos alelos modificados identificados nas Tabelas 25 a 28 foi identificado com base no sequenciamento de produtos de PCR amplificados do DNA genômico flanqueando o éxon 2. O efeito esperado desses alelos na tradução e fenótipo da proteína foi determinado pela tradução do RNA representativo de animais modificados a sequências de aminoácidos. Cada alelo é resumido em detalhes nas Tabelas 29 e 30 abaixo.

[0654] Três porcos das duas ninhadas vivas (158-1, 158-9 e 4-2) foram escolhidos como animais fundadores para os estudos de doenças descritos no Exemplo 6 abaixo. A cada alelo foi atribuído uma designação de letra, A – H, com o alelo A sendo o tipo selvagem. Cada alelo modificado e o alelo ANPEP de tipo selvagem são diagramados na Figura 33, juntamente com o fenótipo previsto. Na Figura 33, os retângulos pretos representam a região de codificação e as áreas cinza representam inserções. Os números indicam os locais onde ocorreram as inserções e/ou deleções.

[0655] O varrão modificado ANPEP (158-9) e uma fêmea com cria modificada possuíam edições nulas bialélicas, consistindo nos alelos B e C (varrão) ou alelos D e E (fêmea com cria). A segunda fêmea com cria modificada (158-1) era um mosaico para uma combinação de alelos do tipo selvagem (A), nulo (H), nulo (D) e outros alelos editados (F e G). O alelo B tem uma deleção de 661 pares de bases que inclui deleção do códon de iniciação e a sequência deletada é substituída com uma inserção de 8 pares de bases. Assim, o alelo B resulta em uma perda completa de proteína. O alelo C resulta de uma deleção de 8 pares de bases, em que a sequência deletada é substituída por uma inserção de 3 pares de bases, causando uma edição de deslocamento com codificação incorreta começando no aminoácido 194 e um códon de terminação prematuro no aminoácido 223. Os dois nulos alelos, D e E, também continham edições de deslocamento, o resultado de inserções de 1 ou 2 pares de bases, respectivamente. Especificamente, as inserções de 1 e 2 pb no éxon 2 resultaram em codificação incorreta no aminoácido 194 para ambos os alelos e um códon de terminação prematuro no aminoácido 220 para a inserção de 1 par de bases e no aminoácido 225 para a inserção de 2 pares de bases. O alelo H continha uma deleção de um único par de bases que também resultou em codificação incorreta no aminoácido 194 e um códon de terminação prematuro no aminoácido 224. Os alelos F e G possuíam deleções de 9 e 12 pares de base, respectivamente, o que não causou uma edição de deslocamento; em vez disso, isso resultou na remoção das sequências de peptídeos, 194-M-E-G e 194-M-E-G-N, respectivamente, em comparação com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem (SEQ ID NO: 134). O alelo G também tinha uma única substituição de aminoácido de V198I em comparação com a sequência de aminoácidos de tipo selvagem (SEQ ID NO: 134).

[0656] Para facilidade de referência, a Tabela 29 abaixo descreve cada edição identificada nos fetos coletados dos experimentos de SCNT e IVF (Figuras 29 e 30). A Tabela 30 abaixo descreve cada edição encontrada nos porcos vivos das ninhadas 4 (Figura 31) e 158 (Figura 32), incluindo aqueles nos animais fundadores (alelos A – H). Quando aplicável, alelos idênticos aos alelos A – H encontrados nos animais não fundadores (ou fetos) são identificados.

[0657] O fenótipo de cada edição nos animais fundadores (alelos A – H) foi confirmado por imunohistoquímica (IHC) para a expressão de ANPEP (CD13) no íleo de porcos modificados (Figura 34). A Figura 34 mostra imagens de IHC representativas do íleo de porcos com dois alelos A (tipo selvagem, +/+), dois alelos nulos (E/B; -/-) ou um alelo nulo em combinação com o alelo F (deleção de 9 pares de bases/ 3 aminoácidos; B/F; -/d9) ou G (deleção de 12 pares de bases/ 4 aminoácidos; B/G ou C/G; -/d12). A imagem marcada como -/d12 na Figura 34 é representativa dos resultados obtidos com o genótipo B/G ou C/G.

[0658] Para gerar os resultados mostrados na Figura 34, seções de tecido embebidas em parafina foram coradas com uma diluição de 1:32.000 de anticorpo policlonal de coelho anti-CD13 (Abcam) preparado contra um peptídeo que cobre os aminoácidos 400-500 de CD13 humano. O anticorpo ligado foi detectado com uma IgG anti-coelho marcada com peroxidase de rábano silvestre e a atividade de HRP foi visualizada com 3,3’-diaminobenzidina (DAB). Forte imunorreatividade para ANPEP foi observada no íleo de animais com dois alelos de tipo selvagem, enquanto nenhuma imunorreatividade para ANPEP foi observada nos animais com dois alelos nulos. Fenotipicamente, porcos possuindo o alelo F ou G apresentaram imunorreatividade para ANPEP, exceto para imunorreatividade mais fraca na edição de deleção de quatro aminoácidos.

[0659] Os animais fundadores (158-1, 158-9 e 4-2) foram observados diariamente para quaisquer efeitos fenotípicos das mutações.

A Figura 35 mostra uma fotografia do porco 158-1 na maturidade sexual.

Todos os animais pareciam ser saudáveis e nenhuma observação adversa foi observada para qualquer um dos animais. Em particular, nenhum problema notável com a lactação foi observado. A porca fundadora 158-1 (um animal mosaico com alelos do tipo selvagem) deu leite normalmente. A porca fundadora 4-2 não ordenou bem com sua primeira ninhada, mas isso não é incomum para porcas de primeira paridade. A porca fundadora 4-2 deu leite normalmente com sua segunda ninhada. Assim, a mamogênese e a lactação pareceram normais. No momento do depósito, os porcos 158 -1 e 158-9 tinham aproximadamente 2,5 anos e o porco 4-2 tinha cerca de 3 anos, e nenhuma observação adversa tinha sido observada.

[0660] Todos os animais usados nos estudos de desafio de vírus descritos no Exemplo 6 abaixo também foram monitorados diariamente para quaisquer efeitos fenotípicos das mutações. Os animais contendo os alelos ANPEP modificados não mostraram quaisquer sinais de infecção por TGEV e pareciam ser saudáveis.

TABELA 29: EDIÇÕES EM FETOS DE EXPERIMENTOS DE SCNT E IVF (FIGURAS 29 E 30) Descrição em comparação com a Tradução da sequência de proteína em INDEL # ácido FETO/ comparação Descrição nucleico de NOTAS SEQ ID NO. PORCO com ANPEP de tipo selvagem tipo selvagem (sequência de (SEQ ID: 134) referência SEQ ID NO: 135) Deleção de Deleção in- 182 pb do nt frame de 1.397 ao nt substituições 1.578; a Feto Deleção de AA129–167 e sequência (FIGUR 182 pb, 174–193 e deletada é 1 A 29) inserção de Y171V, E172P e substituída 163 Genótip 5 pb M173S. com uma o1 Nenhum códon inserção de 5 de terminação pba prematuro. começando no nt 1.397 Deleção in- Feto frame de (FIGUR AA192, 193, Deleção de 9 Deleção de 2 A 29) 194 (E-Y-M). pb do nt 1.574 9 pb 164 Genótip Nenhum códon ao nt 1.582 o2 de terminação prematuro. Nenhuma Feto proteína Deleção de (FIGUR Deleção de traduzida. A 867 pb do nt 3 A 29) 867 pb deleção remove 819 ao nt 165 Genótip o códon de 1.685. o4 iniciação. Codificação

IGUAL Feto incorreta Inserção de 1 AO (FIGUR começa em Inserção de pb entre o nt ALELO 4 A 30) AA194 (M->I) 1 pb 1.581 e o nt D 166 Genótip com o códon de

1.582.b (Tabela oI terminação 30) prematuro em

Descrição em comparação com a Tradução da sequência de proteína em INDEL #

ácido FETO/ comparação Descrição nucleico de NOTAS SEQ ID NO.

PORCO com ANPEP de tipo selvagem tipo selvagem (sequência de (SEQ ID: 134) referência SEQ ID NO: 135) AA220. Codificação incorreta IGUAL Feto começa em Inserção de 2 AO (FIGUR Inserção de AA194 (M->I) pb entre o nt ALELO 5 A 30) 2 pb com o códon de 1.581 e o nt E 167 Genótip terminação 1.582.c (Tabela o2 prematuro em 30) AA225. Codificação incorreta IGUAL Feto começa em Inserção de 2 AO (FIGUR Inserção de AA194 (M->I) pb entre o nt ALELO 6 A 30) 2 pb com o códon de 1.581 e o nt E (e 167 Genótip terminação 1.582.c INDEL o 5a prematuro em 5) AA225. Deleção in- Feto frame de (FIGUR AA192–194 (E- Deleção de 9 IGUAL Deleção de 7 A 30) Y-M). pb do nt 1.574 À 9 pb 164 Genótip Nenhum códon ao nt 1.582. INDEL 2 o 5b de terminação prematuro.

Deleção in- Feto frame de Deleção de (FIGUR 267 bp AA108–196. 267 pb do nt 8 A30) deletion Nenhum códon 1.321 ao nt 168 Genótip de terminação 1.587. o 5c prematuro.

Deleção in- Feto frame de (FIGUR AA192–194 (E- Deleção de 9 IGUAL Deleção de 9 A 30) Y-M). pb do nt 1.574 À 9 pb 164 Genótip Nenhum códon ao nt 1.582. INDEL 2 o6 de terminação prematuro. a A inserção é CCCTC (SEQ ID NO: 169)

b A inserção é um único resíduo de timina (T). c A sequência inserida é AT.

TABELA 30: EDIÇÕES EM PORCOS VIVOS DAS NINHADAS 4 E 158 (FIGURAS 31 E 32) Descrição em Tradução da comparação com proteína em a sequência de INDEL #

SEQ FETO/ comparação ácido nucleico de Descrição NOTAS ID PORCO com ANPEP de tipo selvagem NO: tipo selvagem (sequência de (SEQ ID: 134) referência SEQ ID NO: 135) Deleção in- frame de AA194–196 (M- Deleção de 9 pb do Deleção de ALELO 10 4-1 E-G). Nenhum nt 1.581 ao nt 170 9 pb F códon de 1.589. terminação prematuro. 11 Inserção de Codificação Inserção de 1 pba ALELO 166 1 pb incorreta em entre o nt 1.581 e o D AA194 (M->I). nt 1.582. 12 Códon de 167 Inserção de terminação Inserção de 2 pbb ALELO 2 pb prematuro em entre o nt1.581 e o E AA220 nt 1.582. 4-2* Codificação incorreta em AA194 (M-> I). Códon de terminação prematuro em AA 225 Deleção in- frame de AA194–196 (M- Deleção de 9 pb do Deleção de ALELO 13 4-4 E-G). Nenhum nt 1.581 ao nt 170 9 pb F códon de 1.589. terminação prematuro. 14 158-1* Deleção de Codificação Deleção de 1 pb do ALELO 171 1 pb incorreta em nt 1.581. H AA194 (M-->R). 15 Códon de 166 Inserção de terminação Inserção de 1 pba ALELO 1 pb prematuro em entre o nt 1.581 e o D

Descrição em Tradução da comparação com proteína em a sequência de INDEL #

SEQ FETO/ comparação ácido nucleico de Descrição NOTAS ID PORCO com ANPEP de tipo selvagem NO: tipo selvagem (sequência de (SEQ ID: 134) referência SEQ ID NO: 135) 16 224. nt 1.582. 170 Deleção de Codificação Deleção de 9 pb do ALELO 17 9 pb incorreta em nt 1.581 ao nt F 172 AA194 (M->I). 1.589. Códon de Deleção de terminação ALELO 12 pb prematuro em Deleção de 12 pb G AA220 do nt 1.582 ao nt

1.593 Deleção in- frame de AA194-196. (M- E-G). Nenhum códon de terminação prematuro.

Deleção in- frame de AA194–197 (M- E-G-N) e substituição de aminoácidos V198I. 18 158-2 Inserção de Codificação Inserção de 1 pba ALELO 166 1 pb incorreta em entre o nt 1.581 e o D AA194 (M->I). nt 1.582. 19 Códon de 173 Deleção de terminação Deleção de 25 pb 25 pb prematuro em do nt 1.561 ao nt AA220. 1.585.

Codificação incorreta em AA188 (F->A). Códon de terminação prematuro em AA 216

SEQ FETO/ comparação ácido nucleico de Descrição NOTAS ID PORCO com ANPEP de tipo selvagem NO: tipo selvagem (sequência de (SEQ ID: 134) referência SEQ ID NO: 135) 20 Deleção de Codificação Deleção de 8 pb do 174 8 pb incorreta em nt 1.575 ao nt AA192 (E->G). 1.582. 21 Códon de 175 Incompatibi terminação lidade de 2 prematuro em Substituição de 2 pb AA217. pb de TG ao AC no nt 1.581 e o nt 158-4 Substituição 1.582. M194N que provavelmente não confere resistência à doença, mas não é do tipo selvagem. 22 Inserção de Codificação Inserção de 1 pbc 176 1 pb incorreta em entre o nt 1.579 e o AA194 (M-->N). nt 1.580. 23 Códon de 167 Inserção de terminação Inserção de 2 pbb 2 pb prematuro em entre o nt 1.581 e o

220. nt 1.582. 158-5

ALELO Codificação

E incorreta em AA194 (M-> I). Códon de terminação prematuro em AA 225. Deleção in- frame de AA194-196. (M- Deleção de 9 pb do Deleção de ALELO 24 158-7# E-G). Nenhum nt 1.581 ao nt 170 9 pb F códon de 1.589. terminação prematuro. 25 Inserção de Codificação Inserção de 1 pba ALELO 166 158-8 1 pb incorreta em entre o nt 1.581 e o D AA194 (M->I). nt 1.582.

SEQ FETO/ comparação ácido nucleico de Descrição NOTAS ID PORCO com ANPEP de tipo selvagem NO: tipo selvagem (sequência de (SEQ ID: 134) referência SEQ ID NO: 135) 26 Códon de 167 Inserção de terminação Inserção de 2 pbb ALELO 2 pb prematuro em entre o nt 1.581 e o E AA220. nt 1.582.

Codificação incorreta em AA194 (M-> I). Códon de terminação prematuro em AA 225 27 Deleção de Sem tradução Deleção de 661 pb ALELO 177 661 pb, (o códon de do nt 940 ao nt B inserção de iniciação foi 1.600; a sequência 8 pb deletado)/ deletada é 28 substituída com 178 uma inserção de 8 ALELO Deleção de Codificação pbd começando no C 7 pb e incorreta em nt 940. 158-9* inserção de AA194 (M->S). 3 pb Códon de Deleção de 8 pb do terminação nt 1.580 ao nt prematuro em 1.587; a sequência AA223. deletada é substituída com uma inserção de 4 pbe começando no nt 1.580. a A inserção é um único resíduo de timina (T). b A sequência inserida é AT. c A inserção é um único resíduo de adenina (A). d A sequência inserida é GGGGCTTA (SEQ ID NO: 179) e A sequência inserida é TCGT (SEQ ID NO: 180) # Este porco também tinha uma incompatibilidade de 1 pb (C-> T) que foi identificada como um polimorfismo não relacionado às modificações CRISPR

* Porcos fundadores EXEMPLO 6: RESISTÊNCIA AUMENTADA AO TGEV EM SUÍNOS POSSUINDO UMA

SEQUÊNCIA CROMOSSÔMICA MODIFICADA EM UM GENE QUE CODIFICA UMA PROTEÍNA ANPEP

[0661] No presente exemplo, porcos com uma sequência cromossômica modificada em ANPEP foram desafiados com vírus de diarreia epidêmica suína (PEDV) ou vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) e monitorados para avaliar sua resistência à infecção. A falta de ANPEP resultou em uma resistência aumentada ao TGEV, mas não ao PEDV, conforme medido pelos títulos de viremia e outros marcadores.

MATERIAIS E MÉTODOS PORCOS REPRODUTORES PARA ESTUDOS DE PEDV

[0662] Para estudos de PEDV, duas leitoas (4-2 e 158-1) foram sincronizadas por alimentação de 6,8 ml contendo 15 mg do produto altrenogest, MATRIX (Intervet Inc. Millsboro, DE) a cada dia durante 14 dias.

As leitoas 4-2 e 158-1 entraram no cio cinco dias após o altrenogest ter sido interrompido e foram cruzadas por inseminação artificial (AI) com sêmen coletado do varrão 158-9. A leitoa 4-2 não engravidou. Após 117 dias de gestação, a porca 158-1 deu à luz 8 leitões saudáveis. Um leitão foi esmagado pela porca.

PORCOS REPRODUTORES PARA O DESAFIO DE TGEV

[0663] Os porcos F1 editados por ANPEP foram novamente cruzados para criar ninhadas de porcos editados por ANPEP para o desafio de TGEV. As mesmas duas leitoas (4-2 e 158-1) foram sincronizadas pelo mesmo método descrito acima e foram cruzadas por inseminação artificial (AI) com sêmen coletado do varrão 158-9. Ambas as porcas 158-1 e 4-2 engravidaram. A porca 158-1 deu à luz quatro leitões (ninhada 127). Três leitões eram saudáveis e um leitão tinha uma estrutura de perna traseira deficiente e foi sacrificado. A porca 4-2 deu à luz 13 leitões (ninhada 20); 11 eram saudáveis.

Um leitão não foi amamentado e morreu e outro leitão tinha uma estrutura de perna traseira deficiente. Dois dos outros leitões foram posteriormente esmagados pela porca.

VÍRUS

[0664] PEDV KS13-09 foi propagado em células VERO76 mantidas em MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Sigma), 1% de Pen-Strep (Gibco) e 0,25 μg/ml de FUNGIZONA (anfotericina B). As células foram infectadas em meio contendo 2% de Caldo Fosfato Triptose (Sigma) e 1 μg/ml de L-1-Tosilamida-2-feniletil clorometil cetona (TPCK; Sigma). Para titulação de vírus, células VERO76 em placas de 96 poços foram infectadas com diluições em série 1:10 de vírus em octuplicatas a 37 °C com 5% de CO2. Após 3 horas, o meio de cultura de células foi substituído com meio de infecção fresco. Às 18 horas, as células foram fixadas com uma mistura de acetona: metanol (na razão de 3:2) por 30 minutos a 4 °C e reagiram com uma diluição de 1:500 de anticorpo policlonal de coelho dirigido contra a proteína PEDV M (Genscript). Após lavagem com PBS, IgG de cabra anti-coelho conjugado com FITC (Jackson ImmunoResearch) foi adicionado como o anticorpo secundário. A concentração de vírus foi calculada como TCID50/ml usando o método de Reed e Muench (Reed e Muench, 1938).

[0665] A cepa TGEV Purdue foi cultivada em células testiculares de suíno (ST) mantidas em meio MEM-FBS a 10%, o mesmo que descrito para PEDV. Para titulação, o vírus foi diluído em série 1:10 em quadruplicatas em células ST confluentes em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços (BD Falcon). Após 3 dias de incubação a 37 °C e 5% de CO2, os poços foram examinados quanto à presença de efeito citopático (CPE). O último poço mostrando CPE foi usado como o ponto final de titulação e a dose infecciosa de 50% da cultura de tecidos (TCID50) por ml foi calculada conforme descrito em Reed e Muench, 1938.

INFECÇÃO COM PEDV/ TGEV

[0666] Os experimentos envolvendo animais e vírus foram realizados de acordo com o Guia da Federação das Sociedades de Ciência Animal para o Cuidado e Uso de Animais Agrícolas em Pesquisa e Ensino, o Ato de Bem-Estar Animal do USDA e Regulamentos de Bem-Estar Animal, e foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Biossegurança e Institucionais de Cuidados com Animais da Universidade Estadual do Kansas e da Universidade de Missouri. Durante os desafios, todos os porcos WT e ANPEP- modificados infectados foram alojados juntos em uma única sala no grande centro de recursos animais. Portanto, todos os porcos editados por ANPEP receberam exposição contínua aos vírus expelido pelos irmãos infectados de tipo selvagem. Para infecção, os porcos receberam uma dose inicial de PEDV preparada a partir de um homogenato de tecido intestinal positivo para PCR de porcos infectados experimentalmente (Niederwerder et al., 2016). Quatro dias depois, os porcos foram infectados uma segunda vez com um isolado derivado de cultura de tecidos, PEDV KS13-09, que foi administrado por via oral como uma dose única de 10 ml contendo 106 TCID50 de vírus. Para o TGEV, os porcos receberam a mesma quantidade de vírus administrada por via oral.

[0667] Swabs fecais foram coletados diariamente de cada animal começando um dia antes do desafio com PEDV até o término do estudo. Cada swab foi colocado em um tubo cônico de 15 ml contendo 1 ml de MEM com 1% de Pen-Strep e 1% de FUNGIZONA. O tubo foi agitado em vórtex brevemente para misturar o conteúdo do swab, aliquotado em criotubos de 1,5 ml e então armazenado a -80°C.

[0668] Os soros foram coletados nos dias 3, 7 e 9 após a exposição inicial. Fezes e soros foram examinados usando RT-PCR para detectar ácido nucleico de PEDV ou TGEV. Após nove dias, os animais foram sacrificados e foi realizada imunohistoquímica (IHC) em intestino embebido em parafina (íleo) para detecção antígeno de PEDV ou TGEV.

RT-PCR PARA A DETECÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO VIRAL

[0669] O RNA total foi extraído de amostras fecais e de soro usando um kit de isolamento de RNA total MAGMAXTM-96 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante em um instrumento KINGFISHER (Thermo Scientific). O ácido nucleico de PEDV foi amplificado usando um kit de RT-PCR de uma etapa SUPERSCRIPT III com Taq DNA polimerase PLATINUM e os iniciadores listados na Tabela 31 em um volume total de 50 µl.

A PCR foi realizada da seguinte forma: transcrição reversa inicial a 58 °C por 30 minutos seguida de desnaturação a 94 °C por 2 minutos; e então 40 ciclos de 94 °C por 15 segundos, 48 °C por 30 segundos e 68 °C por 90 segundos.

Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 1%. Os resultados foram registrados com base na intensidade da coloração com brometo de etídio.

[0670] O ácido nucleico de TGEV foi amplificado usando um procedimento em tempo real (Vemulapalli R., 2016). Iniciadores diretos e reversos e uma sonda TAQMAN (BHQ-1) incluídos na mistura TAQMAN Fast Virus 1-Step Master Mix (Thermo Fisher) estão listados na Tabela 31. RT-PCR incluiu transcrição reversa a 50 °C por 30 minutos, transcrição reversa a 95 °C por 15 minutos seguido por 45 ciclos de 95 °C por 15 segundos, 56 °C por 30 segundos e 72 °C por 15 segundos. A PCR foi realizada em um sistema de PCR em tempo real CFX-96 (Bio-Rad) em um formato de 96 poços e o resultado para cada amostra é relatado como um valor Ct.

TABELA 31: INICIADORES PARA RT-PCR DE ÁCIDO NUCLEICO VIRAL Iniciador Sequência (5’-3’) SEQ ID NO. PEDV (F) ATGGCTTCTGTCAGTTTTCAG 181 PEDV (R) TTAATTTCCTGTGTCGAAGAT 182

Iniciador Sequência (5’-3’) SEQ ID NO. TGEV (F) TCTGCTGAAGGTGCTATTATATGC 183 TGEV (R) CACAATTTGCCTCTGAATTAGAAG 184 Sonda BHQ1 YAAGGGCTCACCACCTACTACCACCA 185 IMUNOHISTOQUÍMICA (IHC) PARA DETECÇÃO DE ANTÍGENO VIRAL EM TECIDOS

[0671] A imunohistoquímica para detectar os níveis de antígeno de PEDV e TGEV no intestino (íleo) de animais infectados foi realizada como um teste de diagnóstico de rotina pelos laboratórios de diagnóstico veterinário da Universidade Estadual do Kansas e da Universidade de Missouri usando métodos semelhantes aos descritos acima no Exemplo 5 para a detecção do antígeno ANPEP em porcos modificados. O anticorpo monoclonal anti-proteína spike foi usado para detectar o antígeno de PEDV (Cao et al., 2013). O antígeno de TGEV foi detectado usando o anticorpo anti-coronavírus de peritonite infecciosa felina.

DETECÇÃO DE ANTICORPO ESPECÍFICO PARA TGEV NO SORO

[0672] ELISA de bloqueio e anticorpo de imunofluorescência indireta (IFA) foram usados para detectar anticorpos específicos para TGEV no soro. Para IFA, células ST confluentes em placas de 96 poços foram infectadas com 200 TCID50/ml de TGEV Purdue. Após 3 dias de incubação a 37 °C e 5% de CO2, as células foram fixadas com 80% de acetona. O soro de cada porco foi diluído em série em PBS com 5% de soro de cabra (PBS-GS). Uma amostra de soro obtida de cada porco antes da infecção serviu como controle negativo.

Após incubação durante 1 hora a 37 °C, as placas foram lavadas e o anticorpo secundário adicionado a cada poço. IgG de cabra anti-suíno Alexa-Fluor-488 AffiPure (Cat #114-545-003, Jackson ImmunoResearch) foi diluído 1:400 de diluição em PBS-GS. As placas foram incubadas durante 1 hora a 37 °C, lavadas com PBS e visualizadas no microscópio de fluorescência. Os ensaios de bloqueio foram realizados com o kit SVANOVIR TGEV/PRCV, da Sanova. Os ensaios foram realizados de acordo com as instruções do kit e os resultados relatados como inibição percentual da ligação do anticorpo específico para TGEV marcado.

RESULTADOS REPRODUÇÃO DE PORCOS E INFECÇÃO COM PEDV

[0673] A classificação genotípica de cada leitão de progênie da ninhada usada para o desafio de PEDV está resumida na Tabela 32 abaixo. Os leitões que foram desafiados incluíram três porcos heterozigotos para o alelo ANPEP de tipo selvagem, dois porcos possuindo a deleção de quatro aminoácidos, um único porco com a deleção de três aminoácidos e um único porco knockout. Cinco porcos de tipo selvagem de uma ninhada separada foram usados como controles não modificados e não estão incluídos na tabela.

TABELA 32: GENÓTIPO DE CADA ALELO DE LEITÕES F2 QUE FORAM DESAFIADOS

COM PEDV ANP Marcas Sex Genóti Classificação do Alelo 1 Alelo 2 EP auriculares o po genótipo 121- Varr ANPEP Deleção de 8 pb, adição 126 +/- WT A/C 1 ão de 4 pb 121- Varr ANPEP Deleção de 8 pb, adição Esmagado +/- WT A/C 2 ão de 4 pb 121- Varr ANPEP Deleção de Deleção de 8 pb, adição 133 -/- H/C 3 ão 1 pb de 4 pb 121- Varr ANPEP Deleção de Deleção de 661 pb, 125 -12/- G/B 4 ão 12 pb adição de 8 pb 121- Leito ANPEP Deleção de Deleção de 8 pb, adição 136 -12/- G/C 5 a 12 pb de 4 pb 121- Leito ANPEP Deleção de 8 pb, adição 131 +/- WT A/C 6 a de 4 pb 121- Leito ANPEP Deleção de 661 pb, 134 +/- WT A/B 7 a adição de 8 pb 121- Leito ANPEP Deleção de Deleção de 661 pb, 130 -9/- F/B 8 a 9 pb adição de 8 pb

[0674] Em três semanas, os leitões foram expostos a PEDV como descrito acima e as fezes e soros foram coletados para caracterização com RT-PCR. A Figura 36 mostra a quantidade normalizada de ácido nucleico de PEDV nas fezes e soro de cada porco infectado, exceto aqueles heterozigotos para o alelo WT, nos dias 0, 7 e 9. Cada porco foi classificado com base em seu genótipo: tipo selvagem (preto), knockout/ nulo (branco), deleção de 3 aa (deleção de 9 pb, cinza) e deleção de 4 aa (deleção de 12 pb, listrado). Os resultados para a quantificação de PEDV por PCR e IHC para todos os porcos são apresentados na Tabela 33. A quantificação de PEDV em termos do produto de RT-PCR está representada na Figura 36 como medida de coloração com brometo de etídio; de (3+) para coloração intensa a (Neg.) para nenhum produto de PCR detectável. Todos os porcos foram fortemente positivos para ácido nucleico de PEDV nas fezes, começando sete dias após a infecção (Tabela 33; Figura 36). Pelo menos um porco de cada um dos grupos (nulo, deleção de três aminoácidos, deleção de quatro aminoácidos e WT) também foram positivos no soro no dia 7 (Tabela 33; Figura 36). Além disso, a IHC confirmou que todos os porcos possuíam antígeno em enterócitos (Tabela 33; Figura 37). A Figura 37 mostra imagens representativas do íleo em porcos do tipo selvagem (painel A), knockout (painel B), deleção de 3 aa (painel C) e deleção de 4 aa (painel D) corados para o antígeno PEDV (preto). Assim, a ausência de ANPEP não impediu a infecção por PEDV.

TABELA 33: RESUMO DOS RESULTADOS DE PCR E IHC DE PEDV *1 Dia após a infecção Nº do Porco Genótipo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

F F F S F F F F S F F S IHC Porcos do tipo selvagem 127 +/+ - - - - - - +++ +++ - - +++ - +++ 128 +/+ - - - - - - +++ +++ ++ +++ +++ ++ +++ 129 +/+ - - - - - + +++ +++ - +++ +++ - +++ 132 +/+ - - - - - - ++ +++ - +++ +++ - +++ 135 +/+ - - - - - - ++ +++ - +++ +++ - +++ Porcos geneticamente modificados 126 -/+ - - - - - + +++ +++ - +++ +++ - +++ 131 -/+ - - - - - +++ +++ +++ - +++ +++ - +++ 134 -/+ - - - - - +++ +++ +++ - +++ +++ - +++ 125 -/d12* 2 - - - - - +++ +++ +++ - +++ +++ - +++ 136 -/d12 - - - - - +++ +++ +++ +/- +++ +++ - +++ 130 -/d9* 2 - - - - - ++ +++ +++ + - +++ - +++ 133 -/- - - - - - +++ +++ +++ + +++ +++ - +++

Dia após a infecção Nº do Porco Genótipo1 2 3 4 5 6 7 8 9

F F F S F F F F S F F S IHC 1 * Os porcos foram infectados com o vírus nos dias 1 e 4. As amostras para PCR incluem fezes (F) e soro (S). A imunohistoquímica (IHC) foi realizada em intestino embebido em parafina (íleo). Os resultados de PCR e IHC são apresentados como: -, negativo; +, fracamente positivo; ++, positivo; +++, fortemente positivo. *2 O gene ANPEP mutado possuía deleções de 9 ou 12 pb no éxon 2, o que não alterou o quadro de leitura.

REPRODUÇÃO DE PORCOS PARA INFECÇÃO COM TGEV

[0675] A classificação genotípica de cada leitão de progênie usado para o desafio de TGEV está resumida na Tabela 34 (para a ninhada 20) e 35 (para a ninhada 127) abaixo. Ao todo, seis leitões da ninhada 20 e dois leitões da ninhada 127 foram desafiados com TGEV. Destes, sete foram nulos para ANPEP e um apresentou deleção de três aminoácidos. Sete porcos de tipo selvagem de uma ninhada separada foram usados como controles positivos.

TABELA 34: GENÓTIPOS DE LEITÕES DA NINHADA 20 DA PORCA 4-2 QUE FORAM

DESAFIADOS COM TGEV Identificaç Classificaç Marca Sexo Genótip ão de Alelo 1 Alelo 2 ão do auricular * o* estudo# Genótipo Leito ANPEP- Inserção de 2 Deleção de 661 pb + adição 20-1 144 /- B/E a pb de 8 pb Leito - ANPEP Inserção de 1 Deleção de 8 pb, adição de 4 20-2 147 /- C/D a pb pb Leito ANPEP- Inserção de 2 Deleção de 8 pb, adição de 4 20-3 142 /- C/E a pb pb Varrã - ANPEP Inserção de 1 Deleção de 8 pb, adição de 4 20-4 151 /- C/D o pb pb Varrã - ANPEP Inserção de 2 Deleção de 661 pb+adição 20-5 146 /- B/E o pb de 8 pb Varrã - ANPEP Inserção de 1 Deleção de 8 pb, adição de 4 20-6 149 /- C/D o pb pb 20-7 Varrã - ANPEP Inserção de 2 Deleção de 8 pb, adição de 4 NC /- C/E (morto) o pb pb Varrã ANPEP- Inserção de 1 Deleção de 8 pb, adição de 4 20-8 NC /- C/D o pb pb Varrã - ANPEP Inserção de 2 Deleção de 8 pb, adição de 4 20-9 NC /- C/E o pb pb Varrã ANPEP- Inserção de 2 Deleção de 661 pb + adição 20-10 NC /- B/E o pb de 8 pb

Identificaç Classificaç Marca Sexo Genótip ão de Alelo 1 Alelo 2 ão do auricular # * o* estudo Genótipo 20-11 não Deleção de 661 pb + adição

NC ND ND (morto) genotipado de 8 pb 20-12 não Deleção de 661 pb + adição

NC ND ND (morto) genotipado de 8 pb 20-13 não Deleção de 8 pb, adição de 4

NC ND ND (morto) genotipado pb #NC: Não desafiado; *ND: Não determinado TABELA 35: GENÓTIPOS DE LEITÕES DA NINHADA 127 DA PORCA 158-1 QUE FORAM

DESAFIADOS COM TGEV Marca Identifica Sexo Genóti Alelo 1 Alelo 2 Classifica auricular ção de po ção do estudo# Genótipo 127-1 NC Varr ANPEP Inserção de Deleção de 8 pb, adição de C/D ão -/- 1 pb 4 pb 127-2 140 Leito ANPEP Deleção de 9 Deleção de 661 pb + adição B/F a -9/- pb de 8 pb 127-3 153 Leito ANPEP Deleção de 1 Deleção de 8 pb, adição de C/H a -/- pb 4 pb 127-4 NC Leito ANPEP WT Deleção de 661 pb + adição A/B a +/- de 8 pb #NC: Não desafiado

RESULTADO DO DESAFIO DE TGEV

[0676] Quando os leitões tinham três semanas de idade, eles foram desafiados com TGEV Purdue conforme descrito acima, usando a mesma via, dose e condições de alojamento como para o desafio de PEDV.

Um porco de tipo selvagem (WT) e um knockout (KO) foram removidos do estudo e sacrificados no dia 4 para teste. Um ensaio comercial de RT-PCR foi usado para detectar a presença de vírus nas fezes e soros, e IHC foi usado para detectar o antígeno TGEV no íleo. Os resultados de PCR para vírus nas fezes nos dias 0, 3, 6 e 7 após a exposição inicial ao TGEV são fornecidos na Figura 38. Os resultados são apresentados como valores Ct. Os círculos pretos representam porcos WT, que foram positivos para a presença de ácido nucleico de TGEV nas fezes a partir do dia 3. O ácido nucleico viral não foi detectado nas fezes do único porco possuindo o alelo F (deleção de três aminoácidos, círculo cinza) ou em qualquer um dos sete porcos knockout (KO) (círculos brancos) durante a primeira semana de infecção (Figura 38). Observe que apenas 6 animais WT e KO são plotados para os dias 6 e 7 porque um porco WT e um porco KO foram removidos do estudo no dia 4 para imunohistoquímica (abaixo). Todos os porcos eram RT-PCR negativos no final do estudo de 13 dias (dados não mostrados).

[0677] A Figura 39 mostra imagens de imunohistoquímica representativas do íleo corado para o antígeno TGEV de porcos de tipo selvagem (WT, Painel A), porcos knockout (KO, Painel B) ou porcos com um alelo nulo e um alelo contendo a deleção de três aa (KO/-d3; Painel C). A coloração do antígeno TGEV em tecidos intestinais foi realizada em um único porco WT e KO removido do estudo 4 dias após a infecção, durante um período de tempo em que a maior quantidade de ácido nucleico viral estava presente nas fezes. O porco WT foi positivo para a presença de antígeno TGEV no íleo (Figura 39, Painel A), enquanto o porco ANPEP KO foi negativo (Figura 39, Painel B). O tecido intestinal do porco possuindo a deleção de três aminoácidos (o alelo F) foi corado para o antígeno TGEV 13 dias após a infecção. Os resultados mostraram coloração de anticorpo positiva para antígeno viral no íleo (Figura 39, painel C).

[0678] Os soros obtidos no final do estudo foram testados quanto à presença do anticorpo específico para TGEV usando ensaios de ELISA de bloqueio e de imunofluorescência (IFA). Tanto o ensaio de imunofluorescência (IFA) quanto o ensaio de ELISA de bloqueio mostraram que os porcos WT e do alelo F eram positivos para a presença de anticorpo específico para TGEV; ao passo que nenhum anticorpo específico para TGEV foi detectado nos porcos ANPEP KO (Figura 40). Na Figura 40, a linha horizontal mostra o corte para um resultado positivo/ negativo. Os símbolos mais e menos mostram os resultados das medições de anticorpos usando IFA indireto. Mesmo que o porco possuindo a deleção de três aminoácidos fosse negativo para o ácido nucleico de TGEV nas fezes, a coloração positiva para o antígeno TGEV no íleo e uma resposta positiva do anticorpo confirmaram que este porco foi infectado produtivamente. Observe que o número de porcos na Figura 40 reflete o número de porcos restantes após a remoção de um porco WT e KO para IHC no dia 4.

[0679] Esses dados estabelecem que a presença de ANPEP é necessária para a infecção de porcos com TGEV. Eles também sugerem que a redução da função ANPEP (por exemplo, como no caso do alelo F) pode fornecer um resultado benéfico, medido pelos níveis virais reduzidos nas fezes.

EXEMPLO 7: GERAÇÃO DE ANIMAIS HETEROZIGOTOS PARA MODIFICAÇÕES

CROMOSSÔMICAS EM PELO MENOS DOIS GENES SELECIONADOS A PARTIR DE ANPEP, SIGLEC1 E CD163

MATERIAIS E MÉTODOS REPRODUÇÃO

[0680] Uma leitoa outcross (14-1) que portava um alelo com uma edição ANPEP (uma inserção de 1 pb, alelo D, SEQ ID NO: 166), e um alelo de tipo selvagem (WT) foi criada por inseminação artificial com uma leitoa outcross que era heterozigoto para edições no gene CD163 e no gene SIGLEC1 (Tabela 36). A edição no gene CD163 foi a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 4, de modo que o gene CD163 compreendia a SEQ ID NO: 112. A edição no gene SIGLEC1 foi uma deleção de 1.247 pares de bases do nucleotídeo 4.279 ao nucleotídeo 5.525 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 122, em que a sequência deletada foi substituída com um cassete de gene de neomicina, de modo que o gene SIGLEC1 compreendia SEQ ID NO: 123.

[0681] A porca deu à luz 10 leitões saudáveis sem múmias ou fetos natimortos. Todos os leitões pareciam saudáveis no nascimento. Dois leitões foram sacrificados porque apenas um alelo foi editado. Os leitões restantes continuam saudáveis e, no momento do depósito, tinham quase 2 meses de idade.

TABELA 36: COMBINAÇÃO DE REPRODUÇÃO QUE PRODUZIU A NINHADA 144 Porco Sexo Genótipo Alelo 1 Alelo 2 14-1 Leitoa ANPEP +/- Inserção de 1 pb SEQ ID NO: 166 WT (outcross) 193-2 (P156) Varrão CD163+/- Deleção de 1387 pb SEQ ID NO: 112 WT (outcross) 193-2 (P156) Varrão SIGLEC+/- Neo inserida SEQ ID NO: 123 WT (outcross)

GENOTIPAGEM

[0682] Isolamento de DNA: Os lisados de DNA genômico foram preparados digerindo um pequeno pedaço do rabo cortado em 250 μl de tampão de lise (Tris 40 mM, pH 8,9, 0,9% de Triton X-100, 0,4 mg/ml de proteinase K, (NEB)) e incubando a 56 °C por 12 horas para lise celular seguida de incubação a 85 °C por 10 minutos para inativar a proteinase K. O DNA genômico do lisado do rabo foi usado diretamente como molde para PCR.

[0683] CD163: DNA genômico foi usado para avaliar o genótipo por PCR e eletroforese em gel de agarose. A PCR foi realizada com o iniciador direto específico CD163 “TTGTTGGAAGGCTCACTGTCCTTG” (SEQ ID NO: 68, Tabela 3) e o iniciador reverso “ACAACTAAGGTGGGGCAAAG” (SEQ ID NO: 69, Tabela 3) usando o protocolo padrão e LA Taq (Takara, Mountain View, CA). As condições de PCR foram 95 °C por 2 minutos e 33 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 50 °C por 30 segundos e 68 °C por 7 minutos, seguido por uma extensão final de 72 °C por 2 minutos. Um amplicon de 6358 pb foi então separado em um gel de agarose a 1,25%. A deleção de 1387 pb foi visível após a eletroforese e não foi sequenciada. A sequência exata era conhecida dos animais fundadores.

[0684] ANPEP: DNA genômico foi usado para avaliar o genótipo por PCR e eletroforese em gel de agarose e subsequente sequenciamento de DNA de Sanger. A PCR foi realizada com o iniciador direto específico ANPEP “ACGCTGTTCCTGAATCT” (SEQ ID NO: 161, Tabela 23) e o iniciador reverso “GGGAAAGGGCTGATTGTCTA” (SEQ ID NO: 162, Tabela 23) usando o protocolo padrão e LA Taq (Takara, Mountain View, CA). As condições de PCR foram 96 °C por 2 minutos e 35 ciclos de 95 °C por 30 segundos, 50 °C por 40 segundos e 72 °C por 1 minuto, seguido por uma extensão de 72 °C por 2 minutos. Um amplicon de 965 pb foi então separado em um gel de agarose a 2,0%. Os amplicons foram purificados por PCR e sequenciados por sequenciamento de Sanger no Centro de DNA da Universidade de Missouri. Se a inserção de 1 pb estivesse presente, o alelo era classificado como editado por ANPEP.

[0685] SIGLEC1: DNA genômico foi usado para avaliar o genótipo por PCR e eletroforese em gel de agarose. A PCR foi realizada com o seguinte iniciador direto específico SIGLEC1 “GCATTCCTAGGCACAGC” (SEQ ID NO: 128, Tabela 17) e iniciador reverso “CTCCTTGCCATGTCCAG” (SEQ ID NO: 129, Tabela 17) usando o protocolo padrão e LA Taq (Takara, Mountain Ver, CA). As condições de PCR foram 94 °C por 2 minutos e 35 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 50 °C por 10 segundos e 72 °C por 2,5 minutos, seguido por uma extensão final de 72 °C por 5 minutos. Os iniciadores flanqueavam a inserção de Neo. Um amplicon SIGLEC de tipo selvagem tem

2.000 pb. Se Neo for inserida, o amplicon tem 2600 pb. SIGLEC1+/- da ninhada 144 teria dois amplicons no gel, 2.000 pb e 2600 pb.

RESULTADOS

[0686] A genotipagem de leitões da ninhada 144 resultou em 1 leitão fêmea (144-7) que teve todas as três modificações (Tabela 37). Dois leitões machos (144-3, 144-4) carregaram edições ANPEP e CD163, mas não a edição SIGLEC1. Os porcos foram genotipados por PCR e os resultados são mostrados na Figura 41. A deleção de 1387 pb em CD163 foi ilustrada por um amplicon menor além do tipo selvagem (Figura 41, painel A). A inserção de 1 pb no gene ANPEP não era visível após a eletroforese em gel e o amplicon foi sequenciado para determinar a presença da inserção de 1 pb (Figura 41 painéis B e D). A inativação de SIGLEC1 foi alcançada pela inserção de um cassete de neomicina (Neo) e, portanto, um tamanho aumentado no amplicon indica uma inativação (Figura 41, painel C).

TABELA 37: GENÓTIPOS DA NINHADA 144 Leitã Sex ANPEP ANPEP CD163 CD163 SIGLEC1 SIGLEC o o Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2 144- Inserção de 1 Tipo Tipo SIGLEC- Tipo 1 M pb selvagem Tipo selvagem selvagem (Neo) selvagem 144- Tipo Tipo Tipo SIGLEC- Tipo 2 M selvagem selvagem Tipo selvagem selvagem (Neo) selvagem 144- Inserção de Tipo Deleção de Tipo Tipo Tipo 3 M 1 pb selvagem 1387 pb selvagem selvagem selvagem 144- Inserção de Tipo Deleção de Tipo Tipo Tipo 4 M 1 pb selvagem 1387 pb selvagem selvagem selvagem 144- Inserção de 1 Tipo Tipo SIGLEC- Tipo 5 M pb selvagem Tipo selvagem selvagem (Neo) selvagem 144- Inserção de 1 Tipo Tipo Tipo Tipo 6 M pb selvagem Tipo selvagem selvagem selvagem selvagem 144- Inserção de Tipo Deleção de Tipo SIGLEC- Tipo 7 F 1 pb selvagem 1387 pb selvagem (Neo) selvagem 144- Tipo Tipo Deleção de Tipo Tipo Tipo 8 F selvagem selvagem 1387 pb selvagem selvagem selvagem 144- Inserção de 1 Tipo Tipo SIGLEC- Tipo 9 F pb selvagem Tipo selvagem selvagem (Neo) selvagem 144- Tipo Tipo Deleção de Tipo Tipo Tipo 10 F selvagem selvagem 1387 pb selvagem selvagem selvagem E XEMPLO 8: GERAÇÃO DE P ORCOS HOMOZIGOTOS PARA MODIFICAÇÕES

CROMOSSÔMICAS EM DOIS OU MAIS GENES SELECIONADOS A PARTIR DE ANPEP, SIGLEC1 E CD163, E T ESTE DE TAIS P ORCOS PARA RESISTÊNCIA A

TGEV E PRRSV

[0687] Uma vez que atingem a maturidade sexual, os porcos gerados conforme descrito acima no Exemplo 7 serão usados para criar porcos que são homozigotos para as modificações cromossômicas ANPEP e CD163, ou todos os três ANPEP, CD163 e SIGLEC1. Isso será feito reproduzindo a fêmea contendo todas as três modificações (144-7) com os dois machos possuindo modificações para ANPEP e CD163 (144-3, 144-4).

Este cruzamento deve resultar em progênie que são homozigotos para ANPEP (-/-) e CD163 (-/-), mas são apenas heterozigotos para SIGLEC1 (+/-). Para gerar animais contendo inativações homozigóticas de todos os três alelos (ANPEP, CD163 e SIGLEC), essa progênie (geração F 1) será retrocruzada com progênie heterozigótica tripla adicional gerada como no Exemplo 7. Alternativamente, ou em conjunto, a reprodução descrita no Exemplo 7 será repetida para criar linhagens heterozigóticas triplas masculinas e femininas que serão cruzadas para gerar progênie homozigótica tripla. Assim, a geração de animais knockout triplo homozigoto levará no mínimo duas gerações, mas provavelmente exigirá gerações adicionais para estabelecer linhagens heterozigotas triplas masculinas e femininas.

[0688] Uma vez que os animais knockout homozigotos duplos (ANPEP -/-/CD163 -/-) e triplos (ANPEP-/-/CD163 -/-/SIGLEC1 -/-) são feitos, eles serão testados quanto à resistência ao TGEV usando os métodos descritos acima no Exemplo 6 e quanto à resistência a PRRSV usando os métodos descritos acima no Exemplo 2. Espera-se que ambos os animais knockout duplo e triplo sejam resistentes a ambos TGEV e PRRSV.

[0689] Em vista do acima exposto, será visto que os vários objetivos da invenção são alcançados e outros resultados vantajosos obtidos.

[0690] Como várias alterações podem ser feitas nos produtos e métodos acima sem se afastar do escopo da invenção,

pretende-se que toda a matéria contida na descrição acima e mostrada nos desenhos anexos seja interpretada como ilustrativa e não como um sentido limitante.

E XEMPLO 9: INFECÇÃO IN V ITRO DE CÉLULAS ANPEP KO E WT COM TGEV, PRCV E PEDV.

[0691] Macrófagos alveolares suínos (PAMs) foram coletados de um porco ANPEP KO (porco 20-10, Tabela 34) e de um porco WT por excisão dos pulmões e realização de uma lavagem pulmonar com ~ 100 ml de solução salina tamponada com fosfato fria. Após cultura por duas semanas em MEM suplementado com 7% de soro fetal bovino (FBS) e antibióticos, surgiu uma população de células de fibroblastos. As células semelhantes a fibroblastos foram infectadas em uma multiplicidade de infecção (moi) = 1 com isolados de TGEV, PRCV e PEDV. A preparação de isolados de TGEV e PEDV é descrita no Exemplo 6. O isolado de PRCV foi preparado cultivando o vírus em células ST. Após incubação por 24 horas, as células foram fixadas com 80% de acetona e secas. As células infectadas com vírus foram detectadas usando anticorpos anti-proteína N de coronavírus marcados com FITC. TGEV e PRCV foram detectados com mAb anti-FIPV3-70. O PEDV foi detectado por um anticorpo monoclonal preparado internamente. Os núcleos foram corados com iodeto de propídio.

As células foram vistas em um microscópio de fluorescência.

[0692] A Figura 42 mostra imagens fluorescentes representativas de células infectadas com os três vírus diferentes. As células ANPEP KO mostraram resistência clara à infecção por TGEV e PCRV, mas eram suscetíveis à infecção por PEDV (Figura 42, painel A).

Todas as células WT mostraram infecção clara com todos os três vírus (Figura 42, painel B). Assim, a perda da proteína ANPEP pode conferir resistência tanto ao PRCV quanto ao TGEV em populações suscetíveis.

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TABELA DE SEQUÊNCIAS

SEQ TIPO DESCRIÇÃO SEQ ID NO:1 nucleotídeo CRISPR 10 SEQ ID NO:2 nucleotídeo CRISPR 131 SEQ ID NO:3 nucleotídeo CRISPR 256 SEQ ID NO:4 nucleotídeo CRISPR 282 SEQ ID NO:5 nucleotídeo CRISPR 4800 SEQ ID NO:6 nucleotídeo CRISPR 5620 SEQ ID NO:7 nucleotídeo CRISPR 5626 SEQ ID NO:8 nucleotídeo CRISPR 5350 SEQ ID NO:9 nucleotídeo eGFP1 SEQ ID NO:10 nucleotídeo eGFP2 SEQ ID NO:11 nucleotídeo fragmento do iniciador direto 9538 SEQ ID NO:12 nucleotídeo fragmento do iniciador reverso 9538 SEQ ID NO:13 nucleotídeo fragmento do iniciador direto 8729 SEQ ID NO:14 nucleotídeo fragmento do iniciador direto 8729 SEQ ID NO:15 nucleotídeo TIPO SELVAGEM CD163 SEQ ID NO:16 nucleotídeo Figura 4, painel C WT SEQ ID NO:17 nucleotídeo Figura 4, painel C #1 SEQ ID NO:18 nucleotídeo Figura 4, painel C #2 SEQ ID NO:19 nucleotídeo Figura 4, painel C #3 SEQ ID NO:20 nucleotídeo Figura 5, painel A WT SEQ ID NO:21 nucleotídeo Figura 5, painel A #1-1 SEQ ID NO:22 nucleotídeo Figura 5, painel A #1-4 SEQ ID NO:23 nucleotídeo Figura 5, painel A #2-2 SEQ ID NO:24 nucleotídeo Figura 6, painel C CD163 WT

SEQ ID NO:25 nucleotídeo Figura 6, painel C CD163 #1 SEQ ID NO:26 nucleotídeo Figura 6, painel C CD163 #2 SEQ ID NO:27 nucleotídeo Figura 6, painel C CD163 #3 SEQ ID NO:28 nucleotídeo Figura 6, painel C eGFP WT SEQ ID NO:29 nucleotídeo Figura 6, painel C eGFP #1-1 SEQ ID NO: 30 nucleotídeo Figura 6, painel C eGFP #1-2 SEQ ID NO:31 nucleotídeo Figura 6, painel C eGFP #2 SEQ ID NO:32 nucleotídeo Figura6, painel C eGFP #3 SEQ ID NO:33 nucleotídeo Figura 7, painel C WT SEQ ID NO:34 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-1 SEQ ID NO:35 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-2 a1 SEQ ID NO:36 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-2 a2 SEQ ID NO:37 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-3 SEQ ID NO:38 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-4 a1 SEQ ID NO:39 nucleotídeo Figura 7, painel C #67-4 a2 SEQ ID NO:40 nucleotídeo Figura 8, painel D WT SEQ ID NO:41 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-1.1 SEQ ID NO:42 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-1.2 SEQ ID NO:43 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-2 SEQ ID NO:44 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-3.1 SEQ ID NO:45 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-3.2 SEQ ID NO:46 nucleotídeo Figura 8, painel D #166-4 SEQ ID NO:47 nucleotídeo Figura 16 WT CD163 parcial SEQ ID NOs. 48–67 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 2) SEQ ID NOs. 68–79 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 3) SEQ ID NOs. 80–85 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 4) SEQ ID NOs. 86–97 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 5) SEQ ID NO: 98 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 1506 pb SEQ ID NO: 99 nucleotídeo Alelo CD163 com inserção de 7 pb SEQ ID NO: 100 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 1280 pb SEQ ID NO: 101 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 1373 pb SEQ ID NO: 102 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 11 pb SEQ ID NO: 103 nucleotídeo Alelo CD163 com inserção de 2 pb e deleção de 377 pb SEQ ID NO: 104 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 124 pb SEQ ID NO: 105 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 123 pb SEQ ID NO: 106 nucleotídeo Alelo CD163 com inserção de 1 pb SEQ ID NO: 107 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 130 pb SEQ ID NO: 108 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 132 pb SEQ ID NO: 109 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 1467 pb SEQ ID NO: 110 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 1930 pb no éxon 6, deleção de 129 pb no éxon 7, e inserção de 12 pb SEQ ID NO: 111 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 28 pb SEQ ID NO: 112 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 1387 pb SEQ ID NO: 113 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 1382 pb e inserção de 11 pb SEQ ID NO: 114 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 1720 pb SEQ ID NO: 115 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ ID NO: 99 SEQ ID NO: 116 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ ID NO:110 SEQ ID NO: 117 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ ID NO:113 SEQ ID NO: 118 nucleotídeo Sequência de troca de domínio SEQ ID NO: 119 nucleotídeo Alelo CD163 com deleção de 452 pb SEQ ID NO: 120 peptídeo SRCR 5 de CD163 porcino SEQ ID NO: 121 peptídeo Homólogo SRCR 8 de CD163L1 humano SEQ ID NO: 122 nucleotídeo Sequência de referência WT parcial SIGLEC1 SEQ ID NO: 123 nucleotídeo Alelo SIGLEC1 com deleção de

1.247 pb e inserção de neo SEQ ID NO: 124–129 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 17) SEQ ID NO: 130–131 nucleotídeo Sequências de oligonucleotídeos (Tabela 18) SEQ ID NO: 132 nucleotídeo Sequência ANPEP de comprimento completo SEQ ID NO: 133 peptídeo ANPEP suíno (homólogo X1) SEQ ID NO: 134 peptídeo ANPEP suíno (homólogo X2, X3) SEQ ID NO: 135 nucleotídeo Sequência de referência WT parcial ANPEP (FIGURA 28) SEQ ID NO: 136 nucleotídeo Guia CRISPR 1 para direccionamento de ANPEP SEQ ID NO: 137 nucleotídeo Guia CRISPR 2 para direccionamento de ANPEP SEQ ID NO: 138 nucleotídeo Guia CRISPR 3 para direccionamento de ANPEP SEQ ID NO: 139 nucleotídeo Guia CRISPR 4 para direccionamento de ANPEP SEQ ID NO: 140 nucleotídeo Guia CRISPR 5 para direccionamento de ANPEP SEQ ID NO: 141 nucleotídeo Guia CRISPR 6 para direccionamento de ANPEP SEQ ID NO: 142 nucleotídeo Guia ANPEP 1 Iniciador (Direto)

SEQ ID NO: 143 nucleotídeo Guia ANPEP 1 Iniciador (Reverso) SEQ ID NO: 144 nucleotídeo Guia ANPEP 2 Iniciador (Direto) SEQ ID NO: 145 nucleotídeo Guia ANPEP 2 Iniciador (Reverso) SEQ ID NO: 146 nucleotídeo Guia ANPEP 3 Iniciador (Direto) SEQ ID NO: 147 nucleotídeo Guia ANPEP 3 Iniciador (Reverso) SEQ ID NO: 148 nucleotídeo Guia ANPEP 4 Iniciador (Direto) SEQ ID NO: 149 nucleotídeo Guia ANPEP 4 Iniciador (Reverso) SEQ ID NO: 150 nucleotídeo Guia ANPEP 5 Iniciador (Direto) SEQ ID NO: 151 nucleotídeo Guia ANPEP 5 Iniciador (Reverso) SEQ ID NO: 152 nucleotídeo Guia ANPEP 6 Iniciador (Direto) SEQ ID NO: 153 nucleotídeo Guia ANPEP 6 Iniciador (Reverso) SEQ ID NO: 154–160 nucleotídeo Iniciadores para amplificação de RNA (Tabela 22) SEQ ID NO: 161-162 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 23) SEQ ID NO: 163 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 182 pb e inserção de 5 pb SEQ ID NO: 164 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 9 pb SEQ ID NO: 165 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 867 pb SEQ ID NO: 166 nucleotídeo Alelo ANPEP com inserção de 1 pb (Alelo D) SEQ ID NO: 167 nucleotídeo Alelo ANPEP com inserção de 2 pb (Alelo E) SEQ ID NO: 168 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 267 pb SEQ ID NO: 169 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ NO: 163 SEQ ID NO: 170 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 9 pb (Alelo F) SEQ ID NO: 171 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 1 pb (Alelo H) SEQ ID NO: 172 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 12 pb (Alelo G) SEQ ID NO: 173 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 25 pb SEQ ID NO: 174 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 8 pb SEQ ID NO: 175 nucleotídeo Alelo ANPEP com incompatibilidade de 2 pb SEQ ID NO: 176 nucleotídeo Alelo ANPEP com inserção de 1 pb SEQ ID NO: 177 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 661 pb e inserção de 8 pb (Alelo B) SEQ ID NO: 178 nucleotídeo Alelo ANPEP com deleção de 8 pb e inserção de 4 pb (Alelo C) SEQ ID NO: 179 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ ID NO:177

SEQ ID NO: 180 nucleotídeo Sequência inserida para SEQ ID NO: 178 SEQ ID NO: 181–185 nucleotídeo Sequências de iniciador (Tabela 31) SEQ ID NO: 186 nucleotídeo Sequência consenso de íntron

FORMAS DE REALIZAÇÃO

[0862] Para ilustração adicional, formas de realização adicionais não limitativas da presente invenção são estabelecidas abaixo.

[0863] A forma de realização 1 é um animal de criação ou progênie do mesmo ou uma célula animal que compreende pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP).

[0864] A forma de realização 2 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 1, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP reduz a susceptibilidade do animal, progênie ou célula à infecção por um patógeno, em comparação com a susceptibilidade de um animal de criação, progênie ou célula que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP à infecção pelo patógeno.

[0865] A forma de realização 3 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 2, em que o patógeno compreende um vírus.

[0866] A forma de realização 4 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 3, em que o vírus compreende um vírus da família Coronaviridae.

[0867] A forma de realização 5 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 4, em que o vírus compreende um vírus da subfamília Coronavirinae.

[0868] A forma de realização 6 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 5, em que o vírus compreende um coronavírus.

[0869] A forma de realização 7 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 6, em que o coronavírus compreende um vírus do gênero Alphacoronavirus.

[0870] A forma de realização 8 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 7, em que o vírus do gênero Alphacoronavirus compreende um vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) ou um coronavírus respiratório suíno (PRCV).

[0871] A forma de realização 9 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 8, em que o TGEV compreende a cepa TGEV Purdue.

[0872] A forma de realização 10 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 9, em que o animal de criação é selecionado a partir do grupo que consiste em um ungulado, um animal aviário e um animal equino; ou em que a célula é derivada de um animal selecionado a partir do grupo que consiste em um ungulado, um animal aviário e um animal equino.

[0873] A forma de realização 11 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 10, em que o animal aviário compreende uma galinha, um peru, um pato, um ganso, uma galinha d'angola ou um pombo; ou em que o animal equino compreende um cavalo ou um burro.

[0874] A forma de realização 12 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 10, em que o ungulado compreende um artiodáctilo.

[0875] A forma de realização 13 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 11, em que o artiodáctilo compreende um animal porcino, um animal bovino, um animal ovino, um animal caprino, um búfalo, um camelo, uma lhama, uma alpaca, ou um veado.

[0876] A forma de realização 14 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 13, em que o animal bovino compreende gado de corte ou vaca leiteira.

[0877] A forma de realização 15 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 13, em que o artiodáctilo compreende um animal porcino.

[0878] A forma de realização 16 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 15, em que o animal porcino compreende um porco.

[0879] A forma de realização 17 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 16, em que o animal ou progênie é um embrião, um jovem ou um adulto, ou em que a célula compreende uma célula embrionária, uma célula derivada de um animal jovem ou uma célula derivada de um animal adulto.

[0880] A forma de realização 18 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 17, em que o animal, progênie ou célula é heterozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

[0881] A forma de realização 19 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 17, em que o animal, progênie ou célula é homozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

[0882] A forma de realização 20 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 19, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[0883] A forma de realização 21 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 20, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0884] A forma de realização 22 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 21, em que a deleção compreende uma deleção in-frame.

[0885] A forma de realização 23 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 20 a 22, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0886] A forma de realização 24 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 20, 21 e 23, em que a inserção, a deleção, a substituição ou a combinação de qualquer uma das mesmas resulta em uma codificação incorreta no alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0887] A forma de realização 25 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 20, 21, 23 e 24, em que a inserção, a deleção, a substituição ou a codificação incorreta resulta em um códon de terminação prematuro no alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0888] A forma de realização 26 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 20, 21 e 23, em que a deleção compreende uma deleção do códon de iniciação do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0889] A forma de realização 27 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 20, 21, 23 e 26, em que a deleção compreende uma deleção de toda a sequência de codificação do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0890] A forma de realização 28 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 20 a 26, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0891] A forma de realização 29 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 28, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP faz com que a produção ou atividade da proteína ANPEP seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína ANPEP em um animal, progênie ou célula que carece da sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

[0892] A forma de realização 30 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 29, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP resulta na produção de substancialmente nenhuma proteína ANPEP funcional pelo animal, progênie ou célula.

[0893] A forma de realização 31 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 30, em que o animal, progênie ou célula não produz a proteína ANPEP.

[0894] A forma de realização 32 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 31, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação em: éxon 2 de um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; éxon 4 de um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; um íntron que é contíguo ao éxon 2 ou éxon 4 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0895] A forma de realização 33 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 32, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, uma modificação no íntron 1 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, ou uma combinação das mesmas.

[0896] A forma de realização 34 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 32 ou 33, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção que começa no íntron 1 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP e termina no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0897] A forma de realização 35 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 32 ou 33, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma inserção ou uma deleção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0898] A forma de realização 36 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 35, em que a inserção ou deleção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP está a jusante do códon de iniciação.

[0899] A forma de realização 37 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 32, 33, 36 e 37, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0900] A forma de realização 38 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 37, em que a deleção compreende uma deleção in-frame no éxon 2.

[0901] A forma de realização 39 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 38, em que a deleção in-frame no éxon 2 resulta na deleção dos aminoácidos 194 a 196 da proteína ANPEP.

[0902] A forma de realização 40 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 38, em que a deleção in-frame no éxon 2 resulta na deleção dos aminoácidos 194 a 197 da proteína ANPEP.

[0903] A forma de realização 41 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 40, em que a deleção in-frame resulta ainda na substituição do resíduo de valina na posição 198 da proteína ANPEP com um resíduo de isoleucina.

[0904] A forma de realização 42 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 32 a 41, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma inserção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0905] A forma de realização 43 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 32 a 42, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma deleção de 182 pares de bases do nucleotídeo 1.397 ao nucleotídeo 1.578, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 5 pares de bases começando no nucleotídeo 1.397; - uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.574 ao nucleotídeo 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.577 ao nucleotídeo 1.585, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135;

- uma deleção de 867 pares de bases do nucleotídeo 819 ao nucleotídeo 1.685, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 867 pares de bases do nucleotídeo 882 ao nucleotídeo 1.688, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.580 e

1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.579 e

1.580, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 267 pares de bases do nucleotídeo 1.321 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 267 pares de bases do nucleotídeo 1.323 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 12 pares de bases do nucleotídeo 1.582 ao nucleotídeo 1.593, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 25 pares de bases do nucleotídeo 1.561 ao nucleotídeo 1.585, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135;

- uma deleção de 25 pares de bases do nucleotídeo 1.560 ao nucleotídeo 1.584, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.575 ao nucleotídeo 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.574 ao nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; - uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; - e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0906] A forma de realização 44 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 43, em que: - a modificação compreende a deleção de 182 pares de bases do nucleotídeo 1.397 ao nucleotídeo 1.578, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 5 pares de bases começando no nucleotídeo 1.397, e a inserção de 5 pares de bases compreende a sequência CCCTC (SEQ ID NO: 169); - a modificação compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, e a inserção compreende um único resíduo de timina (T);

- a modificação compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.580 e 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, e a inserção compreende um único resíduo de timina (T) ou um único resíduo de adenina (A); - a modificação compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.579 e 1.580, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, e a inserção compreende um único resíduo de adenina (A); - a modificação compreende a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, e a inserção compreende um dinucleotídeo AT; - a modificação compreende a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940, e a inserção de 8 pares de bases compreende a sequência GGGGCTTA (SEQ ID NO: 179); ou - a modificação compreende a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580, e a inserção de 4 pares de bases compreende a sequência TCGT (SEQ ID NO: 180).

[0907] A forma de realização 45 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 43 ou 44, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: - a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940;

- a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; - a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - a deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - a deleção de 12 pares de bases do nucleotídeo 1.582 ao nucleotídeo 1.593, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - a deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0908] A forma de realização 46 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 45, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: - a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; - a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; - a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - a deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0909] A forma de realização 47 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 43 a 46, em que o animal, progênie ou célula compreende: (a) a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; e - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; (b) a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; e - a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP;

(c) a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; e - a deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; (d) a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; e - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; ou (e) a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; e - a deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135 no outro alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

[0910] A forma de realização 48 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 31, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 17.235 ao 22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0911] A forma de realização 49 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 48, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 17.235 ao 22.016 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0912] A forma de realização 50 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 48 ou 49, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 21.446 ao 21.537 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0913] A forma de realização 51 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48 a 50, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 21.479 ao 21.529 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0914] A forma de realização 52 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48 a 51, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 21.479 ao 21.523 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0915] A forma de realização 53 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 52, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 21.538 ao 22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0916] A forma de realização 54 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 48 ou 53, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 22.017 ao 22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0917] A forma de realização 55 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48, 53 e 54, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 22.054 ao 22.256 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0918] A forma de realização 56 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48 e 53 a 55, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 22.054 ao 22.126 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0919] A forma de realização 57 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48 a 56, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma inserção ou deleção.

[0920] A forma de realização 58 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 57, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção.

[0921] A forma de realização 59 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 58, em que a deleção compreende uma deleção in-frame.

[0922] A forma de realização 60 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 32 a 59, em que a sequência cromossômica modificada interrompe uma região de splice de íntron-éxon.

[0923] A forma de realização 61 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48 a 60, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção de 51 pares de bases do nucleotídeo 21.479 ao nucleotídeo 21.529 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0924] A forma de realização 62 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48 a 60, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção de 45 pares de bases do nucleotídeo 21.479 ao nucleotídeo 21.523 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0925] A forma de realização 63 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48 a 60, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção de 3 pares de bases do nucleotídeo 21.509 ao nucleotídeo 21.511 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

[0926] A forma de realização 64 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 48 a 60, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma substituição.

[0927] A forma de realização 65 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 64, em que a substituição compreende uma substituição de um ou mais dos nucleotídeos no códon ACC nos nucleotídeos

21.509 ao 21.511 de SEQ ID NO: 132 com um nucleotídeo diferente, para produzir um códon que codifica um aminoácido diferente.

[0928] A forma de realização 66 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 65, em que a substituição do um ou mais nucleotídeos resulta na substituição da treonina (T) no aminoácido 738 de SEQ ID NO: 134 ou da treonina (T) no aminoácido 792 da SEQ ID NO: 133 com um resíduo de glicina (G), alanina (A), cisteína (C), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), prolina (P), fenilalanina (F), tirosina (Y), triptofano (W), ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E), asparagina (N), glutamina (Q), histidina (H), lisina (K), ou arginina (R).

[0929] A forma de realização 67 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 65 ou 66, em que a substituição resulta na substituição da treonina (T) no aminoácido 738 da SEQ ID NO: 134 ou da treonina (T) no amino ácido 792 da SEQ ID NO: 133 com um resíduo de glicina (G), alanina (A), cisteína (C), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), metionina (M), prolina (P), fenilalanina (F), triptofano (W), asparagina (N), glutamina (Q), histidina (H), lisina (K) ou arginina (R).

[0930] A forma de realização 68 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 65 a 67, em que a substituição resulta na substituição da treonina (T) no aminoácido 738 da SEQ ID NO: 134 ou da treonina (T) no aminoácido 792 da SEQ ID NO: 133 com um resíduo de valina (V) ou arginina (R).

[0931] A forma de realização 69 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 32 a 68, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP consiste na deleção, inserção ou substituição.

[0932] A forma de realização 70 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 20 a 69, em que o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP possuindo pelo menos 80%, pelo menos 85 %, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,9% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 ou 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0933] A forma de realização 71 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 70, em que o animal de criação, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica que compreende SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 177 ou 178.

[0934] A forma de realização 72 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 71, em que o animal de criação, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 177, 178, 166, 167, 170, 172 ou 171.

[0935] A forma de realização 73 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 71, em que o animal de criação, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 177, 178, 166, 167 ou 171.

[0936] A forma de realização 74 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 73, em que o animal de criação, progênie ou célula compreende ainda pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163.

[0937] A forma de realização 75 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 74, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 reduz a susceptibilidade do animal, progênie ou célula à infecção por um patógeno, em comparação com a susceptibilidade de um animal, progênie ou célula que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 à infecção pelo patógeno.

[0938] A forma de realização 76 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 75, em que o patógeno compreende um vírus.

[0939] A forma de realização 77 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 76, em que o vírus compreende um vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV).

[0940] A forma de realização 78 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 77, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 reduz a susceptibilidade do animal, progênie ou célula a um vírus PRRSV Tipo 1, um vírus PRRSV Tipo 2 ou a ambos os vírus PRRSV Tipo 1 e Tipo 2.

[0941] A forma de realização 79 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 78, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 reduz a susceptibilidade do animal, progênie ou célula a um isolado de PRRSV selecionado a partir do grupo que consiste em NVSL 97-7895, KS06-72109, P129, VR2332, CO90, AZ25, MLV-ResPRRS, KS62-06274, KS483 (SD23983), CO84, SD13-15, Lelystad, 03-1059, 03-1060, SD01-08, 4353PZ e combinações de qualquer um dos mesmos.

[0942] A forma de realização 80 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 79, em que o animal, progênie ou célula é heterozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163.

[0943] A forma de realização 81 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 79, em que o animal, progênie ou célula é homozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163.

[0944] A forma de realização 82 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 81, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreende uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163, uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163, uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína CD163 ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[0945] A forma de realização 83 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 82, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreende uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0946] A forma de realização 84 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 82 ou 83, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreende uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0947] A forma de realização 85 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 82 a 84, em que a inserção, a deleção, a substituição ou a combinação de qualquer uma das mesmas resulta em uma codificação incorreta no alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0948] A forma de realização 86 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 82 a 85, em que a inserção, a deleção, a substituição ou a codificação incorreta resulta em um códon de terminação prematuro no alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0949] A forma de realização 87 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 86, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 faz com que a produção ou atividade da proteína CD163 seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína CD163 em um animal, progênie ou célula que carece da sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163.

[0950] A forma de realização 88 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 87, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 resulta na produção de substancialmente nenhuma proteína CD163 funcional pelo animal, progênie ou célula.

[0951] A forma de realização 89 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 80, em que o animal, progênie ou célula não produz a proteína CD163.

[0952] A forma de realização 90 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 89, em que o animal de criação ou progênie compreende um animal porcino ou em que a célula compreende uma célula porcina.

[0953] A forma de realização 91 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 90, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreende uma modificação em: éxon 7 de um alelo do gene que codifica a proteína CD163; éxon 8 de um alelo do gene que codifica a proteína CD163; um íntron que é contíguo ao éxon 7 ou éxon 8 do alelo do gene que codifica a proteína CD163; ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0954] A forma de realização 92 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 91, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreende uma modificação no éxon 7 do alelo do gene que codifica a proteína CD163.

[0955] A forma de realização 93 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 92, em que a modificação no éxon 7 do alelo do gene que codifica a proteína CD163 compreende uma deleção.

[0956] A forma de realização 94 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 82 a 93, em que a deleção compreende uma deleção in-frame.

[0957] A forma de realização 95 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 92 a 94, em que a modificação no éxon 7 do alelo do gene que codifica a proteína CD163 compreende uma inserção.

[0958] A forma de realização 96 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 90 a 95, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - uma inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com uma deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no mesmo alelo; - uma deleção de 124 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - uma deleção de 123 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.146 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e

3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - uma deleção de 130 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.159 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - uma deleção de 132 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.161 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47;

- uma deleção de 1506 pares de bases do nucleotídeo 1.525 ao nucleotídeo 3.030 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47;

- uma inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47;

- uma deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47;

- uma deleção de 1373 pares de bases do nucleotídeo 2.724 ao nucleotídeo 4.096 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47;

- uma deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47;

- uma deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47;

- uma deleção de 28 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47;

- uma deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47;

- uma deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113; - uma deleção de 1720 pares de bases do nucleotídeo 2.440 ao nucleotídeo 4.160 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - uma deleção de 452 pares de bases do nucleotídeo 3.015 ao nucleotídeo 3.466 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0959] A forma de realização 97 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 96, em que: - a modificação compreende a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e 3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no mesmo alelo, e a inserção de 2 pares de bases compreende o dinucleotídeo AG; - a modificação compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 3.147 e 3.148 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, e a inserção de 1 par de bases compreende um único resíduo de adenina; - a modificação compreende a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, e a inserção de 7 pares de bases compreende a sequência TACTACT (SEQ ID NO: 115);

- a modificação compreende a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo

3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, e em que a inserção de 12 pares de bases compreende a sequência TGTGGAGAATTC (SEQ ID NO: 116); ou - a modificação compreende a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, e a inserção de 11 pares de bases compreende o sequência AGCCAGCGTGC (SEQ ID NO: 117).

[0960] A forma de realização 98 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 96, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: - a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no mesmo alelo; - a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47;

- a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113; - a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47; - e combinações de qualquer uma das mesmas.

[0961] A forma de realização 99 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 96 a 98, em que o animal, progênie ou célula compreende: (a) a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (b) a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (c) a deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e

- a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (d) a deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (e) a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (f) a deleção de 1930 pares de bases do nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 2.417 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 12 pares de bases começando no nucleotídeo 488, e em que há uma deleção adicional de 129 pares de bases no éxon 7 do nucleotídeo 3.044 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (g) a deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (h) a deleção de 1467 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (i) a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 2.431 ao nucleotídeo 3.897 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163;

(j) a deleção de 124 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e

- a deleção de 123 pares de bases do nucleotídeo 3.024 ao nucleotídeo 3.146 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163;

(k) a deleção de 130 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.159 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e

- a deleção de 132 pares de bases do nucleotídeo 3.030 ao nucleotídeo 3.161 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163;

(l) a deleção de 1280 pares de bases do nucleotídeo 2.818 ao nucleotídeo 4.097 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e

- a deleção de 1373 pares de bases do nucleotídeo 2.724 ao nucleotídeo 4.096 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163;

(m) a deleção de 28 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 3.172 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47 em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e

- a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO:

47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163;

(n) a deleção de 1.382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene que codifica a proteína CD163; e - a deleção de 1720 pares de bases do nucleotídeo 2.440 ao nucleotídeo 4.160 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene que codifica a proteína CD163; (o) a inserção de 7 pares de bases entre o nucleotídeo 3.148 e o nucleotídeo 3.149 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 em um alelo do gene CD163; e - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163; (p) a deleção de 1382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e - a inserção de 2 pares de bases entre os nucleotídeos 3.149 e

3.150 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, com a deleção de 377 pares de bases do nucleotídeo 2.573 ao nucleotídeo 2.949 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, no outro alelo do gene CD163; ou (q) a deleção de 1382 pares de bases do nucleotídeo 3.113 ao nucleotídeo 4.494 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 11 pares de bases começando no nucleotídeo 3.113, em um alelo do gene CD163; e

- a deleção de 11 pares de bases do nucleotídeo 3.137 ao nucleotídeo 3.147 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47 no outro alelo do gene CD163.

[0962] A forma de realização 100 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 82 a 99, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 consiste na deleção, inserção ou substituição.

[0963] A forma de realização 101 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 82 a 100, em que o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína CD163 possuindo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,9% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 47 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0964] A forma de realização 102 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 101, em que o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114 ou 119.

[0965] A forma de realização 103 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 74 a 102, em que: - a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; e

- a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreende a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo

3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0966] A forma de realização 104 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 103, em que o animal de criação, progênie ou célula compreende ainda uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

[0967] A forma de realização 105 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 104, em que o animal, progênie ou célula é heterozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0968] A forma de realização 106 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 104, em que o animal, progênie ou célula é homozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0969] A forma de realização 107 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 104 a 106, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1, uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1, uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1 ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

[0970] A forma de realização 108 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 107, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0971] A forma de realização 109 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 108, em que a deleção compreende uma deleção in-frame.

[0972] A forma de realização 110 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 107 a 109, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0973] A forma de realização 111 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 107 a 110, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0974] A forma de realização 112 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 107, 108, 110 e 111, em que a inserção, a deleção, a substituição ou a combinação de qualquer uma das mesmas resulta em uma codificação incorreta no alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0975] A forma de realização 113 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 107, 108 e 110 a 112, em que a inserção, a deleção, a substituição ou a codificação incorreta resulta em um códon de terminação prematuro no alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0976] A forma de realização 114 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 104 a 113, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 faz com que a produção ou atividade da proteína SIGLEC1 seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína SIGLEC1 em um animal, progênie ou célula que carece da sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0977] A forma de realização 115 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 104 a 114, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 resulta na produção de substancialmente nenhuma proteína SIGLEC1 funcional pelo animal, progênie ou célula.

[0978] A forma de realização 116 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 104 a 115, em que o animal, progênie ou célula não produz a proteína SIGLEC1.

[0979] A forma de realização 117 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 104 a 116, em que o animal ou progênie compreende um animal porcino ou em que a célula compreende uma célula porcina.

[0980] A forma de realização 118 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 117, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende uma modificação em: éxon 1 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1; éxon 2 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1; éxon 3 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1; um íntron que é contíguo ao éxon 1, éxon 2 ou éxon 3 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1; ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0981] A forma de realização 119 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 118, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende uma deleção no éxon 1, éxon 2 e/ou éxon 3 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0982] A forma de realização 120 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 118 ou 119, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende uma deleção de parte do éxon 1 e todos os éxons 2 e 3 de um alelo do gene que codifica a proteína SIGLEC1.

[0983] A forma de realização 121 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 118 a 120, em que a sequência cromossômica modificada compreende uma deleção de 1.247 pares de bases do nucleotídeo 4.279 ao nucleotídeo 5.525 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 122.

[0984] A forma de realização 122 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 119 a 121, em que a sequência deletada é substituída com um cassete de gene de neomicina.

[0985] A forma de realização 123 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 107 a 122, em que a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 consiste na deleção, inserção ou substituição.

[0986] A forma de realização 124 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 107 a 123, em que o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína SIGLEC1 possuindo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,9% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 122 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção ou da substituição.

[0987] A forma de realização 125 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 104 a 124, em que o animal, progênie ou célula compreende uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 123.

[0988] A forma de realização 126 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 121 a 125, em que: - a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP compreende a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; e - a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína SIGLEC1 compreende a deleção de 1.247 pares de bases do nucleotídeo 4.279 ao nucleotídeo 5.525 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 122.

[0989] A forma de realização 127 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 126, em que o animal, progênie ou célula compreende ainda uma sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163, a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 compreendendo a deleção de 1387 pares de bases do nucleotídeo 3.145 ao nucleotídeo 4.531 em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 47.

[0990] A forma de realização 128 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 127, em que o animal ou progênie compreende um animal ou progênie geneticamente editado ou em que a célula compreende uma célula geneticamente editada.

[0991] A forma de realização 129 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 128, em que o animal ou célula foi geneticamente editado usando uma endonuclease teleguiada.

[0992] A forma de realização 130 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 129, em que a endonuclease teleguiada compreende uma endonuclease teleguiada projetada.

[0993] A forma de realização 131 é o animal de criação, progênie ou célula da forma de realização 129 ou 130, em que a endonuclease teleguiada compreende um sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR), uma Nuclease Efetora Semelhante a Ativador de Transcrição (TALEN), uma Nuclease Dedo de Zinco (ZFN), uma proteína de fusão recombinase, uma meganuclease ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

[0994] A forma de realização 132 é o animal de criação, progênie ou célula de qualquer uma das formas de realização 128 a 131, em que o animal ou célula foi geneticamente editado usando um sistema CRISPR.

[0995] A forma de realização 133 é o animal de criação de qualquer uma das formas de realização 1 a 132.

[0996] A forma de realização 134 é a progênie de qualquer uma das formas de realização 1 a 132.

[0997] A forma de realização 135 é a célula de qualquer uma das formas de realização 1 a 132.

[0998] A forma de realização 136 é a célula da forma de realização 135, em que a célula compreende um espermatozóide.

[0999] A forma de realização 137 é a célula da forma de realização 135, em que a célula compreende um óvulo.

[01000] A forma de realização 138 é a célula da forma de realização 137, em que o óvulo compreende um óvulo fertilizado.

[01001] A forma de realização 139 é a célula da forma de realização 135, em que a célula compreende uma célula somática.

[01002] A forma de realização 140 é a célula da forma de realização 139, em que a célula somática compreende um fibroblasto.

[01003] A forma de realização 141 é a célula da forma de realização 141, em que o fibroblasto compreende um fibroblasto fetal.

[01004] A forma de realização 142 é a célula de qualquer uma das formas de realização 135, 139 e 140, em que a célula compreende uma célula embrionária ou uma célula derivada de um animal jovem.

[01005] A forma de realização 143 é um método para produzir um animal não humano ou uma linhagem de animais não humanos com susceptibilidade reduzida à infecção por um patógeno, em que o método compreende: - modificar um oócito ou um espermatozóide para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP) em pelo menos um dentre o oócito e o espermatozóide e fertilizar o oócito com o espermatozóide para criar um óvulo fertilizado contendo a sequência cromossômica modificada no gene que codifica uma proteína ANPEP; ou - modificar um óvulo fertilizado para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP no óvulo fertilizado; - transferir o óvulo fertilizado para uma fêmea portadora, em que a gestação e o parto a termo produzem animais de prole; - fazer a triagem dos animais de prole quanto à susceptibilidade ao patógeno; e - selecionar animais de prole que têm susceptibilidade reduzida ao patógeno em comparação com animais que não compreendem uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[01006] A forma de realização 144 é o método da forma de realização 143, em que o animal compreende um animal de criação.

[01007] A forma de realização 145 é o método da forma de realização 143 ou 144, em que a etapa de modificação do oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado compreende a edição genética do oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado.

[01008] A forma de realização 146 é o método de qualquer uma das formas de realização 143 a 145, em que o oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado é heterozigoto para a sequência cromossômica modificada.

[01009] A forma de realização 147 é o método de qualquer uma das formas de realização 143 a 145, em que o oócito, espermatozóide ou óvulo fertilizado é homozigoto para a sequência cromossômica modificada.

[01010] A forma de realização 148 é o método de qualquer uma das formas de realização 143 a 147, em que a fertilização compreende inseminação artificial.

[01011] A forma de realização 149 é um método para aumentar a resistência de um animal de criação à infecção por um patógeno, compreendendo modificar pelo menos uma sequência cromossômica em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP), de modo que a produção ou atividade da proteína ANPEP seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína ANPEP em um animal de criação que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

[01012] A forma de realização 150 é o método da forma de realização 149, em que a etapa de modificação da pelo menos uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP compreende a edição genética da sequência cromossômica.

[01013] A forma de realização 151 é o método de qualquer uma das formas de realização 145 a 148 e 150, em que a edição genética compreende o uso de uma endonuclease teleguiada.

[01014] A forma de realização 152 é o método da forma de realização 151, em que a endonuclease teleguiada compreende uma endonuclease teleguiada projetada.

[01015] A forma de realização 153 é o método da forma de realização 151 ou 152, em que a endonuclease teleguiada compreende um sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR), uma Nuclease Efetora Semelhante a Ativador de Transcrição (TALEN), uma Nuclease Dedo de zinco (ZFN), uma proteína de fusão recombinase, uma meganuclease ou uma combinação dos mesmos.

[01016] A forma de realização 154 é o método de qualquer uma das formas de realização 145 a 148 e 150 a 153, em que a edição genética compreende o uso de um sistema CRISPR.

[01017] A forma de realização 155 é o método de qualquer uma das formas de realização 143 a 154, em que o método produz um animal de qualquer uma das formas de realização 1 a 153.

[01018] A forma de realização 156 é o método de qualquer uma das formas de realização 143 a 155, compreendendo ainda o uso do animal como um animal fundador.

[01019] A forma de realização 157 é uma população de animais de criação compreendendo dois ou mais animais de criação e/ou sua progênie de qualquer uma das formas de realização 1 a 133.

[01020] A forma de realização 158 é uma população de animais compreendendo dois ou mais animais feitos pelo método de qualquer uma das formas de realização 143 a 156 e/ ou sua progênie.

[01021] A forma de realização 159 é a população da forma de realização 157 ou 158, em que a população de animais é resistente à infecção por um patógeno.

[01022] A forma de realização 160 é a população da forma de realização 159, em que o patógeno compreende um vírus.

[01023] A forma de realização 161 é a população da forma de realização 160, em que o vírus compreende um vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) ou um coronavírus respiratório suíno (PRCV).

[01024] A forma de realização 162 é uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135; (b) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132; e (c) um cDNA de (a) ou (b).

[01025] A forma de realização 163 é a molécula de ácido nucleico da forma de realização 162, em que a molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico isolada.

[01026] A forma de realização 164 é a molécula de ácido nucleico da forma de realização 162 ou 163, em que o ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 87,5%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,9% de identidade com a SEQ

ID NO: 132 ou 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132 ou

135.

[01027] A forma de realização 165 é a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das formas de realização 162 a 164, em que a substituição, inserção ou deleção reduz ou elimina a produção ou atividade da proteína ANPEP, em comparação com um ácido nucleico que não compreende a substituição, inserção ou deleção.

[01028] A forma de realização 166 é a molécula de ácido nucleico de qualquer uma das formas de realização 162 a 165, em que o ácido nucleico compreende a SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 177 ou 178.

[01029] A forma de realização 167 é a molécula de ácido nucleico da forma de realização 166, em que o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 177, 178, 166, 167 ou 171.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. ANIMAL DE CRIAÇÃO ou progênie do mesmo ou uma célula animal, caracterizado por compreender pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP).

2. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP reduzir a susceptibilidade do animal, progênie ou célula à infecção por um patógeno, em comparação com a susceptibilidade de um animal de criação, progênie ou célula que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP à infecção pelo patógeno.

3. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo patógeno compreender um vírus.

4. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo vírus compreender um vírus do gênero Alphacoronavirus.

5. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo vírus do gênero Alphacoronavirus compreender um vírus da gastroenterite transmissível (TGEV) ou um coronavírus respiratório suíno (PRCV).

6. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo animal de criação compreender um animal porcino ou pela célula ser derivada de um animal porcino.

7. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo animal ou progênie ser um embrião, um jovem ou um adulto, ou pela célula compreender uma célula embrionária, uma célula derivada de um animal jovem, ou uma célula derivada de um animal adulto.

8. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo animal, progênie ou célula ser heterozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

9. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo animal, progênie ou célula ser homozigoto para a sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

10. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela sequência cromossômica modificada compreender uma inserção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, uma deleção em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, uma substituição em um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP ou uma combinação de qualquer uma das mesmas.

11. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela inserção, a deleção, a substituição ou a combinação de qualquer uma das mesmas resultar em uma codificação incorreta no alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

12. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pela deleção compreender: - uma deleção do códon de iniciação do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; ou - uma deleção de toda a sequência de codificação do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP.

13. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pela sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP fazer com que a produção ou atividade da proteína ANPEP seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína ANPEP em um animal, progênie ou célula que carece da sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP.

14. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pela sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína ANPEP resultar na produção de substancialmente nenhuma proteína ANPEP funcional pelo animal, progênie ou célula.

15. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela sequência cromossômica modificada compreender uma modificação em: éxon 2 de um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; éxon 4 de um alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; um íntron que é contíguo ao éxon 2 ou éxon 4 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP; ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

16. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela sequência cromossômica modificada compreender uma deleção no éxon 2 do alelo do gene que codifica a proteína ANPEP, a deleção compreendendo uma deleção in-frame no éxon 2.

17. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela deleção in-frame no éxon 2: - resultar na deleção dos aminoácidos 194 a 196 da proteína ANPEP; ou - resultar na deleção dos aminoácidos 194 a 197 da proteína ANPEP, em que a deleção in-frame resulta ainda, opcionalmente, na substituição do resíduo de valina na posição 198 da proteína ANPEP com um resíduo de isoleucina.

18. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela sequência cromossômica modificada compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: - uma deleção de 182 pares de bases do nucleotídeo 1.397 ao nucleotídeo 1.578, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 5 pares de bases começando no nucleotídeo 1.397; - uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.574 ao nucleotídeo 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.577 ao nucleotídeo 1.585, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 867 pares de bases do nucleotídeo 819 ao nucleotídeo 1.685, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 867 pares de bases do nucleotídeo 882 ao nucleotídeo 1.688, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135;

- uma inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.579 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 267 pares de bases do nucleotídeo 1.321 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 267 pares de bases do nucleotídeo 1.323 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 12 pares de bases do nucleotídeo 1.582 ao nucleotídeo 1.593, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 25 pares de bases do nucleotídeo 1.561 ao nucleotídeo 1.585, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 25 pares de bases do nucleotídeo 1.560 ao nucleotídeo 1.584, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.575 ao nucleotídeo 1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.574 ao nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135;

- uma deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; - uma deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com uma inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; - e combinações de qualquer uma das mesmas.

19. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela sequência cromossômica modificada compreender uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em: - a deleção de 661 pares de bases do nucleotídeo 940 ao nucleotídeo 1.600, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 8 pares de bases começando no nucleotídeo 940; - a deleção de 8 pares de bases do nucleotídeo 1.580 ao nucleotídeo 1.587, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135, em que a sequência deletada é substituída com a inserção de 4 pares de bases começando no nucleotídeo 1.580; - a inserção de 1 par de bases entre os nucleotídeos 1.581 e

1.582, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - a deleção de 9 pares de bases do nucleotídeo 1.581 ao nucleotídeo 1.589, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135;

- a deleção de 12 pares de bases do nucleotídeo 1.582 ao nucleotídeo 1.593, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - a deleção de 1 par de bases do nucleotídeo 1.581, em comparação com a sequência de referência SEQ ID NO: 135; - e combinações de qualquer uma das mesmas.

20. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pela sequência cromossômica modificada compreender uma modificação dentro da região que compreende os nucleotídeos 17.235 a 22.422 da sequência de referência SEQ ID NO: 132.

21. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 20, caracterizado pelo animal, progênie ou célula compreender uma sequência cromossômica no gene que codifica a proteína ANPEP possuindo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,9% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 135 ou 132 nas regiões da sequência cromossômica fora da inserção, da deleção, ou da substituição.

22. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo animal de criação, progênie ou célula compreender uma sequência cromossômica compreendendo SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 177 ou 178.

23. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo animal de criação, progênie ou célula compreender ainda pelo menos uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163.

24. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pela sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 reduzir a susceptibilidade do animal, progênie ou célula à infecção por um vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos (PRRSV), em comparação com a susceptibilidade de um animal, progênie ou célula que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína CD163 à infecção pelo vírus da síndrome respiratória e reprodutiva dos suínos.

25. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 24, caracterizado pela sequência cromossômica modificada no gene que codifica a proteína CD163 resultar na produção de substancialmente nenhuma proteína CD163 funcional pelo animal, progênie ou célula.

26. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo animal de criação, progênie ou célula compreender ainda uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína SIGLEC1.

27. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo animal ou progênie compreender um animal ou progênie geneticamente editado ou pela célula compreender uma célula geneticamente editada.

28. ANIMAL DE CRIAÇÃO, progênie ou célula, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo animal ou célula ter sido geneticamente editado usando uma endonuclease teleguiada (homing endonuclease), a endonuclease teleguiada compreendendo um sistema de Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR), uma Nuclease Efetora Semelhante a Ativador de Transcrição (TALEN), uma

Nuclease Dedo de zinco (ZFN), uma proteína de fusão recombinase, uma meganuclease ou uma combinação de qualquer um dos mesmos.

29. CÉLULA, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizada pela célula compreender um espermatozóide, um óvulo (opcionalmente, um óvulo fertilizado) ou uma célula somática (opcionalmente, um fibroblasto).

30. MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANIMAL NÃO HUMANO OU UMA LINHAGEM DE ANIMAIS NÃO HUMANOS com susceptibilidade reduzida à infecção por um patógeno, caracterizado pelo método compreender: - modificar um oócito ou um espermatozóide para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP) em pelo menos um dentre o oócito e o espermatozóide e fertilizar o oócito com o espermatozóide para criar um óvulo fertilizado contendo a sequência cromossômica modificada no gene que codifica uma proteína ANPEP; ou - modificar um óvulo fertilizado para introduzir uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP no óvulo fertilizado; - transferir o óvulo fertilizado para uma fêmea portadora, em que a gestação e o parto a termo produzem animais de prole; - fazer triagem dos animais de prole quanto à susceptibilidade ao patógeno; e - selecionar animais de prole que têm susceptibilidade reduzida ao patógeno em comparação com animais que não compreendem uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

31. MÉTODO PARA AUMENTAR A RESISTÊNCIA DE UM ANIMAL DE CRIAÇÃO À INFECÇÃO POR UM PATÓGENO, caracterizado por compreender modificar pelo menos uma sequência cromossômica em um gene que codifica uma proteína aminopeptidase N (ANPEP), de modo que a produção ou atividade da proteína ANPEP seja reduzida em comparação com a produção ou atividade da proteína ANPEP em um animal de criação que não compreende uma sequência cromossômica modificada em um gene que codifica uma proteína ANPEP.

32. POPULAÇÃO DE ANIMAIS DE CRIAÇÃO, caracterizada por compreender dois ou mais animais de criação e/ou sua progênie, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.

33. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, caracterizada por compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 135; (b) uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80% de identidade de sequência com a sequência da SEQ ID NO: 132, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132; e (c) um cDNA de (a) ou (b).

34. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo ácido nucleico compreender uma sequência de nucleotídeos possuindo pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 87,5%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos 99,9% de identidade com a SEQ ID NO: 132 ou 135, em que a sequência de nucleotídeos compreende pelo menos uma substituição, inserção ou deleção em relação à SEQ ID NO: 132 ou 135.

35. MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 34, caracterizada pelo ácido nucleico compreender a SEQ ID NO: 163, 164, 165, 166, 167, 168, 170, 171, 172, 173,

174, 176, 177 ou 178.

Figura 1 Éxons WT CD163 de tipo selvagem

Petição 870200132281, de 20/10/2020, pág. 625/673 Vetor de direcionamento de troca de domínio para CD163 Troca de domínio

Braço longo mNeo e Íntron Braço curto Íntron de CD163 poli(A) exógeno Éxons 8-10 de CD163 Codificação 3469 pb 1578 pb

Éxons WT 1/47

Vetor de direcionamento de troca de domínio para CD163 (sem Neo)

Codificação Projeto CRISPR CD163

Éxon 7 (direcionado para troca de domínio) Éxon 8 Éxon 9

ID de CRISPR

Figura 2

CD1D de tipo Éxons WT Éxons WT

Petição 870200132281, de 20/10/2020, pág. 626/673 selvagem

Vetor de direcionamento para CD1D 2/47

Braço longo mNeo e Braço curto Íntron de CD1D Éxons 6-7 de CD1D poli(A) 4363 pb 3672 pb

Projeto CRISPR CD1D

Éxon 3 (contém sítio de início ATG) Éxon 4 Éxon 5 e

ID de CRISPR e

Figura 3

Porca Porca

Ninhada 63 Ninhada 64

Ninhada 158 Ninhada 159 Porca Porca

Figura 4 blastocistos do dia 6 (%) Frequência média de

Controle

Campo brilhante Verde

Controle

CRISPR/Cas9 injetado pb pb pb pb Figura 5 pb pb pb Figura 6

Água

WT pb pb pb pb 67-4 67-3 67-2 67-1 Figura 7

Figura 8 Água 166-2 166-4 166-3

WT FF 166-1 Porca Petição 870200132281, de 20/10/2020, pág. 632/673 166-3 166-4 Água 166-2 166-1 Porca

WT FF 8/47 (- deleção de 632 pb) (- deleção de 27 pb) (- deleção de 24 pb) (Incompatibilidade de AG + 6 pb) (- deleção de 1598 pb) (+ 1 pb) (+ 1 pb) (+ 1 pb)

Figura 9

Sinais Respiratórios Febre Dia após a infecção

Figura 10

CD163+/+ CD163-/-

Dia do Desafio Não caracterizado A Não caracterizado B Tipo selvagem Figura 11

Vírus (Log10[(Moldes/Rxn])

Figura 12 Razão S / P de anticorpo N-específico

Não caracterizado A e B Tipo selvagem

Dia Após o Desafio

Figura 13 Contagem Contagem Contagem

CD163 Positivo Não caracterizado B

Contagem Contagem Contagem Continuação Figura 13 -

Figura 13 - Continuação

Não caracterizado A Contagem Contagem Contagem Contagem

Figura 13 - Continuação

Tipo Selvagem

Contagem Contagem Contagem Contagem Contagem

Fundo Contagem Contagem

Figura 14

Sem anticorpo

Tipo Selvagem

Não caracterizado A e B Contagem

Figura 15

Petição 870200132281, de 20/10/2020, pág. 642/673 18/47

Tipo selvagem Δ43 aminoácidos Não caracterizado B

Dia do Desafio

Figura 16 pb DEFINIÇÃO Gene CD163 de referência: 3000 pb pba montante do éxon 7 até a última base do éxon 10

ADESÃO

VERSÃO

FONTE ORGANISMO: porco

COMENTÁRIO COMENTÁRIO ApEinfo:metilado:1 CARACTERÍSTICAS Localização /Qualificadores misc_característica 1 . . 3000 /marcador=íntron 6 misc_característica 3001 . . 3315 /marcador=éxon 7 misc_característica 3316 . . 3412 /marcador=íntron 7 misc_característica 3413 . . 3727 /marcador=éxon 8 misc_característica 3728 . . 4501 /marcador=íntron 8 misc_característica 4502 . . 4594 /marcador=éxon 9 misc_característica 4595 . . 4676 /marcador=íntron 9 misc_característica 4676 . . 4989 /marcador=éxon 10

ORIGEM

Figura 16 - Continuação

Figura 17 Macrófago Modificação do Gene CD163 Produto previsto

Petição 870200132281, de 20/10/2020, pág. 645/673 Íntron Éxon Íntron Éxon Íntron

Solúvel Negativo

Solúvel Negativo 21/47

Negativo

Éxon Mimetizador HL8

Domínio citoplasmático Sequência sinal

Éxons Figura 18

Figura 19

Figura 19 - Continuação e

Figura 20

Nulo

Porco HL11 2 Porco HL11 1 Porco WT 2 Porco WT 1 Figura 21

Figura 22 Log10 Moldes/Rxn

Tipo 1 Tipo 2

Dia após a infecção

Tipo 1 Tipo 2

Nulo

Nulo Nulo Figura 23

Braço inferior Braço superior Figura 24 pb pb pb Branco Plasmídeo de direcionamento 11-1 (tipo selvagem)

13-2 13-1 Clones de porco

12-6 12-5 12-4

12-3 12-2

12-1

Branco de água 4-3 (genômico do fibroblasto não direcionado) 4-18 (genômico do fibroblasto direcionado) Plasmídeo de direcionamento KW2 (genônimo do tipo selvagem) Figura 25

Identificação do porco:

Genótipo: Figura 26

Controle de anticorpo secundário

Fluorescência

Contagem Figura 27

Figura 28 pb DEFINIÇÃO Gene ANPEP de referência: 1000 pb a montante do códon de iniciação no éxon 2, fim do íntron 2, todos os éxon 2, íntron 3, éxon 3, íntron 4, éxon 4 e 81 pb de íntron 5.

FONTE/ ORGANISMO: sus scrofa (porco).

ORIGEM

Figura 29 Controle WT Água pb

Figura 30 Controle WT Água pb pb

Ninhada 4 Figura 31 pb

Ninhada 158 Figura 32

Figura 33

Alelo ANPEP Edições de gene Fenótipo previsto

Íntron-1 Íntron-2 Tipo selvagem Éxon-2

Deleção de 661 pb Nulo Inserção de 8 pb Deleção de 8 pb Inserção de 4 pb

Nulo Inserção de 1 pb Nulo Inserção de 2 pb Nulo Deleção de 9 pb Deleção de 3 aminoácidos Deleção de 12 pb Deleção de 4 aminoácidos

Deleção de 1 pb Nulo

Figura 34

Figura 35

Figura 36

Petição 870200132281, de 20/10/2020, pág. 665/673 Deleção de 3 aa Dia após a Infecção Deleção de 4 aa

Dia 0 Dia 7 Dia 9 Fezes Soro Fezes Soro Fezes Soro 41/47

Figura 37

Figura 38

Petição 870200132281, de 20/10/2020, pág. 667/673 Deleção de 3 aa Dia após a Infecção

Dia 0 Dia 3 Dia 6 Dia 7 43/47

Figura 39

Deleção de 3 aa

Porcos Figura 40

% de Inibição

Figura 41

Água Água Água

Cromatografia de ANPEP

Fundido Vírus Núcleos Fundido Vírus Núcleos Figura 42