JP2021521844A - 修飾アミノペプチダーゼｎ（ａｎｐｅｐ）遺伝子を有する病原体抵抗性動物 - Google Patents

修飾アミノペプチダーゼｎ（ａｎｐｅｐ）遺伝子を有する病原体抵抗性動物 Download PDF

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Abstract

アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む、家畜動物およびそれらの子孫が提供される。そのような修飾染色体配列を含有する動物細胞も提供される。動物、子孫、および細胞は、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）およびブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）を含む病原体に対する抵抗性が増加されている。動物、子孫、および細胞は、任意選択的に、ＣＤ１６３タンパク質および／またはＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列をさらに含むことができる。病原体抵抗性非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための方法も提供される。
【選択図】図３８

Description

電子的に提出された配列表の参照
配列表の公式コピーは、２０１９年４月２６日に作成され、３１８．７キロバイトのサイズを有する「２０１９年４月２６日に提出された配列表（１６ＵＭＣ００２−ＷＯ）」という名前のファイルを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む、家畜動物およびそれらの子孫に関する。本発明はさらに、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む動物細胞に関する。動物および細胞は、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）およびブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）を含む病原体に対する抵抗性を増加させた。本発明はさらに、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子に少なくとも１つの修飾染色体配列を含み、またＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列および／またはＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む、家畜動物、子孫、および動物細胞に関する。本発明はさらに、病原体抵抗性非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための方法に関する。
コロナウイルスによって引き起こされる呼吸器および腸内感染は、ヒトおよび動物の健康に重要な影響を与える。免疫学的にナイーブな新生児ブタの、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）またはブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）への感染は、１００％に近い死亡率の損失を生じ得、腸細胞のウイルス媒介性破壊によって引き起こされる脱水の結果、吸収不良性下痢および脱水をもたらす（Ｍａｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｓａｉｆ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＴＧＥＶは、１９４０年代に米国で初めて出現した（Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｇｓ．，１９４６）。２０１３年にブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）が最近出現したことは、ブタ産生における推定１０％の損失である、米国での７００万頭近いブタの死亡の原因であった（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ＴＧＥＶはまた、１００％の新生児死亡率を引き起こす可能性がある。高齢のブタでは、ＴＧＥＶまたはＰＥＤＶによる感染は、軽度の臨床徴候のみをもたらし、その後完全に回復する。
ヒト、イヌ、およびネココロナウイルスとともに、ＰＥＤＶおよびＴＧＥＶは、コロナウイルス科におけるアルファコロナウイルス属に属する（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）もまた、アルファコロナウイルスであり、ＴＧＥＶと密接に関連する。ＰＲＣＶは、一般に、亜臨床感染または軽度の呼吸器疾患を引き起こすが、重度の症例が記載されており、ブタがＰＲＣＶおよびブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）などの別のウイルスの両方に二重に感染すると、疾患の重症度を悪化させ得るという証拠がある（Ｋｉｌｌｏｒａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６、Ｖａｎ Ｒｅｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。さらに、一部の国ではＰＲＣＶ陽性の動物を輸入しないため、群れのＰＲＣＶ陽性状態は、経済的影響を及ぼし得る。
コロナウイルスは、エンベロープ一本鎖プラス鎖ＲＮＡウイルスであり、ニドウイルス目の下に位置する。ニドウイルスの特徴的な特徴は、サブゲノムｍＲＮＡのネストされたセットの合成である。コロナウイルスの独自の構造的特徴は、ビリオンの表面から突出するスパイクタンパク質によって形成される「コロナ」である。ウイルススパイクタンパク質は、すべてのコロナウイルスの一次受容体タンパク質であるにもかかわらず、対応する細胞表面受容体は変化する（Ｌｉ，２０１５）。Ｄｅｌｍａｓらは、ＴＧＥＶの候補受容体としてブタアミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ、ＡＰＮ、またはＣＤ１３）を最初に特徴付けた（Ｄｅｌｍａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。ブタＡＮＰＥＰは、腸内の消化中にタンパク質基質からＮ末端アミノ酸を除去する役割を果たすＩＩ型膜メタロペプチダーゼである。
ＡＮＰＥＰは、小腸および腎管状上皮細胞、顆粒球、マクロファージを含む、様々な細胞型および組織内、ならびにシナプス膜上で発現される。ＡＮＰＥＰは、小腸の上皮細胞（腸細胞）内で豊富に発現される。ＡＮＰＥＰは、組織血管形成中、例えば、内皮維持、腫瘍形成（Ｂｈａｇｗａｔ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｇｕｚｍａｎ−Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、および乳腺形成で高度に発現される。
小腸の上皮細胞は、ＰＥＤウイルス臨床感染の主な部位であるように見えるが、肺胞マクロファージなどの他の部位も感染し得る（Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｓｈｉｎ，２０１４）。実際、肺胞マクロファージからの深い配列決定データは、ＡＮＰＥＰについてのメッセージを同定した（未公開）。他の感染部位が持続性感染のためのリザーバーとして機能し得ることが提案されている（Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｓｈｉｎ，２０１４）。
ＡＮＰＥＰは、非置換Ｎ末端残基を中性側鎖で加水分解する膜結合亜鉛依存性メタロプロテアーゼである。腎近位小管内のその唯一の既知の基質は、アンジオテンシンＩＩＩであり、アンジオテンシンＩＶに切断される。また、エンケファリンおよびエンドルフィンも代謝する。最後に、シグナル伝達、細胞周期制御、および分化において機能する。
ある特定のコロナウイルスの受容体としてのその役割に加えて、ＡＮＰＥＰはまた、ペプチド代謝、細胞運動および接着、疼痛感覚、血圧調節、腫瘍血管新生および転移、免疫細胞走化性、精子運動、細胞間接着、および気分調節を含む多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。
ブタおよびヒトＡＮＰＥＰは、高い配列同一性、ならびに区別不能な生化学的特性および動態特性を共有する（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＡＮＰＥＰ遺伝子は、ブタの第７染色体上に位置し、少なくとも３つのスプライス変異体を有する。ＡＮＰＥＰの２つのプロモーターは、骨髄系／線維芽細胞および腸上皮細胞において同定されている（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。それらは約８ｋｂ離れており、様々な５´非コード領域を有する転写物をもたらす。上皮プロモーターは、コード領域に近い位置にあり、一方、骨髄系プロモーターは、遠位にある（Ｓｈａｐｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＡＮＰＥＰ遺伝子に関連する３つの公的に許容される転写物／スプライス変異体が存在する：Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３。変異体Ｘ１は、２０個のエクソンを有し、１０１７アミノ酸タンパク質をコードする。変異体Ｘ２およびＸ３の両方は、２１個のエクソンを有し、各々９６３アミノ酸タンパク質をコードする。成熟ＡＮＰＥＰタンパク質は、そのＮ末端付近に２４アミノ酸疎水性セグメントを有し、膜挿入のシグナルとして機能する。大きな細胞外Ｃ末端ドメインは、亜鉛結合メタロプロテイナーゼスーパーファミリードメイン様領域、細胞質Ｓｅｒ／Ｔｈｒリッチ接合部、および遷移状態安定剤を含有する。
前述から理解され得るように、動物におけるＴＧＥＶおよびＰＲＣＶなどの関連ウイルスに対する抵抗性を誘導するための戦略の開発に対する必要性が、当該技術分野に存在する。
北米、欧州、およびアジアにおいて経済的に重要なブタの別の疾患は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）であり、北米の生産者は年間およそ６億ドルを費やしている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）による感染によって引き起こされる臨床疾患症候群は、１９８７年に米国で最初に報告され（Ｋｅｆｆａｂｅｒ，１９８９）、その後１９９０年に欧州で報告された（Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１）。ＰＲＲＳＶによる感染は、咳および発熱、妊娠後期の生殖不全、および成長能力の低減を含む呼吸器疾患をもたらす。ウイルスはまた、生涯にわたる亜臨床感染を維持しながら、様々な多菌疾患症候群相互作用にも関与する（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。損失は、若いブタにおける呼吸器疾患、成長能力の不良、生殖不全、および子宮内感染の結果である（Ｋｅｆｆａｂｅｒ，１９８９）。
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、マウス乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス、サル出血熱ウイルス、およびウマ動脈炎ウイルスとともにアルテリウイルス科に属する。構造的には、アルテリウイルスは、トガウイルスに類似するが、コロナウイルスと同様に、共通のリーダーおよびポリＡ尾部を有するサブゲノムｍＲＮＡのネストされた３´共末端セットを介して複製する。アルテリウイルスは、マクロファージの屈性、重症疾患および持続性感染を引き起こす能力を含む、ウイルス病原性に関連する重要な特性を共有する（Ｐｌａｇｅｍａｎｎ，１９９６）。北米ウイルスと欧州ウイルスとの間の分子比較は、すべてのＰＲＲＳＶ分離株を、それぞれ２型または１型の２つの遺伝子型のうちの１つに配置する。２つの遺伝子型は、ヌクレオチドレベルで約７０％の同一性のみを有するが（Ｎｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、両方ともＣＤ１６３陽性細胞に対する屈性を共有し、長期感染を確立し、同様の臨床徴候を生じる。
ＣＤ１６３は、膜貫通ドメインおよび短い細胞質尾部とともに、９つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメインおよび２つのスペーサードメインからなる１３０ｋＤａの１型膜タンパク質である（Ｆａｂｒｉｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ブタＣＤ１６３は、ペプチドシグナル配列をコードする１７個のエクソン、続いて９個のＳＲＣＲドメイン、２つのリンカードメイン（ＳＲＣＲ６およびＳＲＣＲ９の後に位置するプロリンセリンスレオニン（ＰＳＴ）ドメインとも称される）、ならびに細胞質ドメイン、続いて短い細胞質尾部を含有する。ＣＤ１６３の表面発現は、単球−マクロファージ系統の細胞に限定される。ＣＤ１６３は、ウイルス受容体として機能することに加えて、正常な恒常性を維持することに関連するいくつかの重要な機能を示す。例えば、感染または組織損傷に続いて、ＣＤ１６３は、スカベンジャー分子として機能し、血液からハプトグロビン−ヘモグロビン複合体を除去する（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。結果として生じるヘム分解生成物は、関連する炎症反応を調節する（Ｆａｂｒｉｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００５）。ＨｂＨｐスカベンジングは、ＣＤ１６３の主要な機能であり、ＳＲＣＲ３に位置する（Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＨｂＨｐ分解に続いてマクロファージによって放出される代謝生成物は、ビリルビン、ＣＯ、および遊離鉄を含む。ＣＤ１６３の１つの重要な機能は、遊離ヘモグロビンから生じる酸化毒性の防止である（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｓｏａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
Ｃ１６３の他の重要な機能としては、赤芽球付着（ＳＲＣＲ２）、ＴＷＥＡＫ（腫瘍壊死因子様弱アポトーシス誘導因子）受容体（ＳＲＣＲ１〜４および６〜９）であること、細菌受容体（ＳＲＣＲ５）であること、およびアフリカブタウイルス受容体であることが挙げられる（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００３）。ＣＤ１６３はまた、免疫調節物質としての潜在的な役割も有する（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．２０１０で論じられている）。
ＣＤ１６３は、最初にＣａｌｖｅｒｔ ｅｔ．ａｌ．（２００７）によってＰＲＲＳＶの受容体として説明された。サル、ヒト、イヌ、およびマウスを含む様々な種からのＣＤ１６３ ｃＤＮＡによる非許容細胞株のトランスフェクションは、ＰＲＲＳＶ感染に対して細胞を許容させることができる（Ｃａｌｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＣＤ１６３に加えて、第２の受容体タンパク質であるＣＤ１６９（シアロアドヘシンまたはＳＩＧＬＥＣ１としても既知である）は、ビリオンの表面上の主要タンパク質であるＧＰ５−マトリックス（Ｍ）ヘテロ二量体との初期相互作用の形成に関与する一次ＰＲＲＳＶ受容体であると同定された（Ｄｅｌｐｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００２）。このモデルでは、エンドソーム区画内のＣＤ１６３とＧＰ２、３、４ヘテロ三量体とのその後の相互作用は、ウイルスゲノムの細胞質への脱殻および放出を媒介する（Ｖａｎ Ｂｒｅｅｄａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ａｌｌｅｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。これらの結果は、表面ＣＤ１６９およびＣＤ１６３を欠くＰＲＲＳＶ抵抗性細胞株が、ＣＤ１６３プラスミドでのトランスフェクション後にウイルス複製をサポートしたことを示す以前のインビトロ研究をサポートした（Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
ＰＲＲＳＶの別の受容体は、同定され、精製され、配列決定され、ＳＩＧＬＥＣ１、ＣＤ１６９、またはシアロアドヘシンと名付けられている（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３、Ｗｉｓｓｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＳＩＧＬＥＣ１は、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチンのファミリーに属する膜貫通タンパク質である。これは、造血組織およびリンパ系組織のマクロファージ上のヒツジ赤血球結合受容体として最初に説明された（Ｄｅｌｐｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＳＩＧＬＥＣタンパク質は、シアル酸結合部位を含有するＮ末端Ｖセットドメイン、続いて可変数のＣ２セットドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部を含有する。他のＳＩＧＬＥＣタンパク質とは対照的に、ＳＩＧＬＥＣ１は、細胞質尾部にチロシン系モチーフを有しない（Ｏｅｔｋｅ ｅｔ ａｌ．，２００６）。マクロファージ上で発現されるＳＩＧＬＥＣ１は、赤血球、好中球、単球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびいくつかの細胞傷害性Ｔ細胞上のシアル酸リガンドの結合を介して、細胞間相互作用において機能する。ＳＩＧＬＥＣ１−シアル酸相互作用は、適応免疫のいくつかの態様、例えば、抗原処理およびＴ細胞への提示、ならびにＢ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞の活性化に関与する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｏｍａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１２およびＯ´Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１３において概説される）。
ＳＩＧＬＥＣ１上の無傷のＮ末端ドメインは、培養マクロファージによるＰＲＲＳＶ結合および内部移行に必要かつ十分であることが示唆されている（Ａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｄｅｌｐｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００７）。ＳＩＧＬＥＣ１によるＰＫ−１５などのＳＩＧＬＥＣ１陰性細胞のトランスフェクションは、ウイルス内部移行を媒介するのに十分である。抗ＳＩＧＬＥＣ１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）によるＰＲＲＳＶ許容細胞のインキュベーションは、ＰＲＲＳＶ結合および内部移行をブロックする（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ Ｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ウイルス側では、ビリオンの表面からのシアル酸の除去、またはシアル酸特異的レクチンによるウイルスのプレインキュベーションは、感染をブロックする（Ｄｅｌｐｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｄｅｌｐｕｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｖａｎ Ｂｒｅｅｄａｍ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
ＰＲＲＳＶの病因（特に分子レベルで）および動物流行病学の両方の多くの特徴は理解されておらず、したがって制御努力を困難にする。現在、生産者はしばしば、修飾された生の弱毒化株または不活化ウイルスワクチンでブタにＰＲＲＳＶに対するワクチン接種を行うが、現在のワクチンはしばしば、満足のいく保護を提供しない。これは、株の変異および免疫系の不十分な刺激の両方に起因する。利用可能なＰＲＲＳＶワクチンの有効性に関する懸念に加えて、現在使用されている修飾された生ワクチンが、個々のブタおよびブタの群れにおいて持続し、突然変異を蓄積し得るという強力な証拠があり（Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．１９９９）、これは、ブタの実験感染後の毒性の野生分離株で実証されている（Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。さらに、ワクチンウイルスは、ワクチン接種された雄ブタの精液中で流出することが示されている（Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ワクチン接種の代替として、一部の専門家は、繁殖群れにおける「試験および除去」戦略を提唱している（Ｄｅｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。この戦略の成功的使用は、ＰＲＲＳＶに急性または持続的に感染しているすべてのブタの除去、続いてウイルスの再導入を防止するための厳格な制御に依存する。この戦略に関連する困難性および多くの費用は、持続性ＰＲＲＳＶ感染の病因についてほとんど知られておらず、したがって、持続的に感染したブタを特定するための信頼できる技術が存在しないことである。
したがって、動物におけるＰＲＲＳＶに対する抵抗性を誘導する必要性も、当該技術分野に存在する。同じ動物においてＰＲＲＳＶならびにＴＧＥＶおよび／またはＰＲＣＶ抵抗性を誘導することもまた有益であろう。
家畜動物およびそれらの子孫が提供される。動物および子孫は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む。
動物細胞も提供される。動物細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む。
さらなる家畜動物およびそれらの子孫が提供される。動物および子孫は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、を含む。
さらなる動物細胞が提供される。動物細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、を含む。
追加の家畜動物およびそれらの子孫が提供される。動物および子孫は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、を含む。
追加の動物細胞が提供される。動物細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、を含む。
さらなる家畜動物およびそれらの子孫が提供される。動物および子孫は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、を含む。
さらなる動物細胞が提供される。動物細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、を含む。
非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための方法が提供される。動物または系統は、病原体に対する感受性を低減した。この方法は、卵母細胞または精子細胞を修飾して、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、卵母細胞および精子細胞のうちの少なくとも１つに導入し、卵母細胞を精子細胞で受精させて、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含有する受精卵を作成することを含む。この方法はさらに、受精卵を代理雌動物に移入することを含み、妊娠および正期産によって子孫動物を産生する。この方法は、追加として、病原体に対する感受性について子孫動物をスクリーニングすることと、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含まない動物と比較して、病原体に対する感受性を低減した子孫動物を選択することと、を含む。
非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための別の方法が提供される。動物または系統は、病原体に対する感受性を低減した。この方法は、受精卵を修飾して、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、受精卵に導入することを含む。この方法はさらに、受精卵を代理雌動物に移入することを含み、妊娠および正期産によって子孫動物を産生する。この方法は、追加として、病原体に対する感受性について子孫動物をスクリーニングすることと、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含まない動物と比較して、病原体に対する感受性を低減した子孫動物を選択することと、を含む。
病原体による感染に対する家畜動物の抵抗性を増加させる方法が提供される。この方法は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列を修飾することを含み、それによりＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない家畜動物におけるＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性と比較して低減される。
家畜動物の集団が提供される。集団は、本明細書に記載される家畜動物および／またはそれらの子孫のうちのいずれか２つ以上を含む。
別の動物集団が提供される。集団は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって作製される２匹以上の動物および／またはそれらの子孫を含む。
核酸分子が提供される。核酸分子は、
（ａ）配列番号１３５の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、ヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１３２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、ヌクレオチド配列、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
他の目的物および特徴は、部分的には明らかであり、部分的には以下で指摘される。
ＣＤ１６３を修飾するために使用される標的化ベクターおよびＣＲＩＳＰＲ。パネルＡは、ＣＲＩＳＰＲを使用する修飾のために標的とされたＣＤ１６３遺伝子の野生型エクソン７、８、および９を示す。パネルＢは、ブタエクソン７（ＣＤ１６３のブタドメインＳＲＣＲ５）を、ＣＤ１６３ＬのヒトＳＲＣＲ８をコードするＤＮＡに置き換えるように設計された標的化ベクターを示す。この標的化ベクターを、Ｇ４１８による薬物選択を伴うトランスフェクションに使用した。ロングレンジ、左アーム、および右アームアッセイのためのＰＣＲプライマーは、１２３０、３７５２、８７９１、７７６５、および７７７５について矢印で標識される。パネルＣは、パネルＢに示されるものと同一であるが、Ｎｅｏカセットが除去された標的化ベクターを示す。この標的化ベクターを使用して、既にネオマイシン抵抗性であった細胞中のＣＤ１６３を標的とした。小欠失アッセイに使用されるプライマーを矢印で示し、ＧＣＤ１６３ＦおよびＧＣＤ１６３Ｒと標識する。パネルＤは、ＣＲＩＳＰＲによって標的とされるエクソンを強調する。ＣＲＩＳＰＲ１０、１３１、２５６、および２８２の位置は、エクソン７上の下向きの矢印によって表される。ＣＲＩＳＰＲ番号は、イントロン６およびエクソン７のイントロン−エクソン接合部からの塩基対の数を表す。 ＣＤ１Ｄを修飾するために使用される標的化ベクターおよびＣＲＩＳＰＲ。パネルＡは、ＣＲＩＳＰＲによる修飾のために標的とされたＣＤ１Ｄ遺伝子の野生型エクソン３、４、５、６、および７を示す。パネルＢは、エクソン３を選択可能なマーカーＮｅｏに置き換えるように設計された標的化ベクターを示す。この標的化ベクターをＣＲＩＳＰＲと組み合わせてＣＤ１Ｄを修飾した。ロングレンジ、左アーム、および右アームアッセイのためのＰＣＲプライマーを、３９９１、４３６３、７３７３、および１２８０６について矢印で標識する。パネルＣは、ＣＲＩＳＰＲによって標的とされるエクソンを示す。ＣＲＩＳＰＲ４８００、５３５０、５６２０、および５６２６の位置は、エクソン３上の下向き矢印によって表される。小欠失アッセイに使用されるプライマーを矢印で例示し、ＧＣＤ１ＤＦおよびＧＣＤ１ＤＲと標識する。 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＳＣＮＴによるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄノックアウトブタの生成。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡによるトランスフェクション後の体細胞中のＣＤ１６３の標的欠失。野生型（ＷＴ）遺伝子型は、６５４５塩基対（ｂｐ）バンドをもたらす。レーン１〜６は、Ｃａｓ９およびＮｅｏを含有するドナーＤＮＡを伴うＣＲＩＳＰＲ１０による単一トランスフェクションからの６つの異なるコロニーを表す。レーン１、４、および５は、１５００〜２０００ｂｐの大きなホモ接合欠失を示す。レーン２は、より小さいホモ接合欠失を表す。レーン３および６は、ＷＴアレル、ならびに両方のアレルの小欠失または両アレル修飾のいずれかを表す。各コロニーの正確な修飾は、ＳＣＮＴに使用されるコロニーの配列決定によってのみ決定された。いくつかのレーンにおける薄いＷＴバンドは、隣接するＷＴコロニーからの胎児線維芽細胞の交差汚染を表し得る。ＮＴＣ＝テンプレート対照なし。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびドナーＤＮＡによるトランスフェクション後の体細胞中のＣＤ１Ｄの標的欠失。ＷＴ遺伝子型は、８７２９ｂｐバンドをもたらす。レーン１〜４は、ＣＤ１Ｄの５００〜２０００ｂｐの欠失を有するコロニーを表す。レーン４は、ＷＴコロニーであるように見える。ＮＴＣ＝テンプレート対照なし。Ｃ）研究中にＳＣＮＴによって産生されたＣＤ１６３ノックアウトブタの画像。この雄ブタは、ＣＤ１６３のホモ接合性１５０６ｂｐの欠失を含有する。Ｄ）研究中に産生されたＣＤ１Ｄブタの画像。これらの子ブタは、ＣＤ１Ｄの１６５３ｂｐの欠失を含有する。Ｅ）ＣＤ１６３の１５０６ｂｐの欠失を含む２匹のＳＣＮＴ同腹子の遺伝子型。レーン１〜３（同腹子６３）およびレーン１〜４（同腹子６４）は、各同腹子からの各子ブタの遺伝子型を表す。経産ブタは、ＳＣＮＴ胚のレシピエント雌を示し、ＷＴは、ＷＴ対照を表す。ＮＴＣ＝テンプレート対照なし。Ｆ）ＣＤ１Ｄの１６５３ｂｐの欠失を含む２匹のＳＣＮＴ同腹子の遺伝子型。レーン１〜７（同腹子１５８）およびレーン１〜４（同腹子１５９）は、各子ブタの遺伝子型を表す。 ブタ胚におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の効果。Ａ）異なる濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を接合体に注入した後の胚盤胞形成の頻度。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の毒性は、１０ｎｇ／μＬで最低であった。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、接合体に導入されると、胚盤胞におけるｅＧＦＰの発現を正常に妨害することができる。元の倍率×４。Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して生成されるｅＧＦＰ上の突然変異の種類：ＷＴ遺伝子型（配列番号１６）、＃１（配列番号１７）、＃２（配列番号１８）、および＃３（配列番号１９）。 ブタ胚における標的化ＣＤ１６３中のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の効果。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によってＣＤ１６３上で生成された突然変異の例：ＷＴ遺伝子型（配列番号２０）、＃１−１（配列番号２１）、＃１−４（配列番号２２）、および＃２−２（配列番号２３）。ＤＮＡ配列決定によって検査したすべての胚は、ＣＤ１６３に突然変異を示した（１８／１８）。ＣＲＩＳＰＲ１３１は、太字で強調表示される。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって引き起こされるホモ接合欠失の配列決定読み取り。画像は、ＣＤ１６３の２ｂｐの欠失を有するパネルＡからの＃１〜４を表す。 ２種類のＣＲＩＳＰＲで導入した場合のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の効果。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を接合体として注入した胚盤胞におけるＣＤ１６３のＰＣＲ増幅。レーン１、３、６、および１２は、２つの異なるＣＲＩＳＰＲ間の設計された欠失を示す。Ｂ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を接合体として注入した胚盤胞におけるＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅。ＣＤ１Ｄは、ＣＤ１６３（３／２３）と比較して、ゲル電気泳動によって決定されるように欠失頻度が低かった；レーン１、８、および１５は、ＣＤ１Ｄにおける明らかな欠失を示す。Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、ＣＤ１６３およびｅＧＦＰを標的とする２つのＣＲＩＳＰＲをシステムに提供したとき、２つの遺伝子を標的とすることに成功した。ＣＤ１６３およびｅＧＦＰの修飾を示す：ＣＤ１６３ ＷＴ（配列番号２４）、ＣＤ１６３＃１（配列番号２５）、ＣＤ１６３＃２（配列番号２６）、ＣＤ１６３＃３（配列番号２７）、ｅＧＦＰ ＷＴ（配列番号２８）、ｅＧＦＰ＃１−１（配列番号２９）、ｅＧＦＰ＃１−２（配列番号３０）、ｅＧＦＰ＃２（配列番号３１）、およびｅＧＦＰ＃３（配列番号３２）。 接合体に注入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生成されたＣＤ１６３ノックアウトブタ。Ａ）ノックアウトブタからのＣＤ１６３のＰＣＲ増幅；同腹子６７−２および６７−４において欠失の明確な兆候が検出された。Ｂ）代理母を伴うＣＤ１６３ノックアウトブタの画像。すべての動物は健康であり、異常の兆候を示さない。Ｃ）ＣＤ１６３ノックアウトブタの遺伝子型。野生型（ＷＴ）配列を配列番号３３として示す。２匹の動物（同腹子６７−１（配列番号３４）および６７−３（配列番号３７）由来）は、ＣＤ１６３にホモ接合欠失または挿入を担持している。他の２匹の動物（同腹子６７−２および６７−４由来）は、ＣＤ１６３の両アレル修飾を担持している：＃６７−２ Ａ１（配列番号３５）、＃６７−２ Ａ２（配列番号３６）、＃６７−４ Ａ１（配列番号３８）、および＃６７−４ ａ２（配列番号３９）。欠失は、Ｃａｓ９系とともに２つの異なるＣＲＩＳＰＲを導入することによって引き起こされた。ＣＤ１６３の接合体注入からの動物は、モザイク遺伝子型を示さなかった。 接合体に注入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって生成されたＣＤ１Ｄノックアウトブタ。Ａ）ノックアウトブタ由来のＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅；１６６−１は、ＣＤ１Ｄのモザイク遺伝子型を示す。１６６−２、１６６−３、および１６６−４は、増幅子のサイズの変化を示さないが、増幅子の配列決定により、修飾が明らかになった。ＷＴ ＦＦ＝野生型胎児線維芽細胞。Ｂ）ロングレンジアッセイのＰＣＲ増幅は、子ブタ１６６−１および１６６−２における１つのアレルの明確な欠失を示した。Ｃ）代理母を伴うＣＤ１Ｄノックアウトブタの画像。Ｄ）ＣＤ１Ｄノックアウトブタ、ＷＴ（配列番号４０）、＃１６６−１．１（配列番号４１）、＃１６６−１．２（配列番号４２）、＃１６６−２（配列番号４３）、＃１６６−３．１（配列番号４４）、＃１６６−３．２（配列番号４５）、および＃１６６−４（配列番号４６）の配列データ。エクソン３におけるａｔｇ開始コドンは、太字、また小文字で示される。 急性ＰＲＲＳＶ感染中の臨床徴候。ＣＤ１６３＋／＋（ｎ＝６）およびＣＤ１６３−／−（ｎ＝３）の呼吸徴候および発熱の有無を日次評価した結果。 急性ＰＲＲＳＶ感染中の肺組織病理。野生型およびノックアウトブタ由来のＨおよびＥ染色組織の代表的な顕微鏡写真。左パネルは、単核細胞の浮腫および浸潤を示す。ノックアウトブタの右パネルは、正常な肺の肺構造を示す。 様々な遺伝子型におけるウイルス血症。ＣＤ１６３−／−子ブタデータは、Ｘ軸に沿って配置されていることに留意されたい。 ヌル、野生型、および特徴付けられていないアレルブタにおける抗体産生。 個々のブタにおけるＣＤ１６３の細胞表面発現。特徴付けられていないＡ、特徴付けられていないＢ、およびＣＤ１６３＋／＋パネルの右側に現れる線は、ＣＤ１６３抗体を表し、一方、これらのパネルの左側に現れる線は、無抗体対照（バックグラウンド）である。ＣＤ１６３−／−動物において、ＣＤ１６３染色は、バックグラウンド対照と重複し、特徴付けられていないアレルにおけるＣＤ１６３染色は、ＷＴレベルとバックグラウンドとの間のおよそ半分であることに留意されたい（これは対数尺度であるため、約１０％未満であることにも留意されたい）。 ３匹の代表的なブタおよび無抗体対照由来の肺胞マクロファージ上のＣＤ１６９のレベル（ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１６９）。 様々な遺伝子型におけるウイルス血症。Δ４３アミノ酸子ブタデータは、Ｘ軸に沿っていることに留意されたい。 参照配列（配列番号４７）として使用される野生型ＣＤ１６３エクソン７〜１０のゲノム配列。配列は、エクソン７の上流からエクソン１０の最後の塩基まで３０００ｂｐを含む。下線付き領域は、それぞれエクソン７、８、９、および１０の位置を示す。 ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）上の表面ＣＤ１６３のレベルによって測定されるように、いくつかのＣＤ１６３染色体修飾、各修飾についての予測タンパク質生成物、および各修飾についての相対的マクロファージ発現を示すＣＤ１６３修飾の図。黒色領域は、イントロンを示し、白色領域は、エクソンを示す。斜線領域は、ブタエクソン７のホモログであるｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１模倣物を示す。灰色領域は、ＰＧＫ Ｎｅｏ構築物を有する合成イントロンを示す。 ブタＣＤ１６３タンパク質および遺伝子配列の図。Ａ）ＣＤ１６３タンパク質ＳＲＣＲ（楕円）およびＰＳＴ（四角）ドメイン、ならびに対応する遺伝子エクソン。Ｂ）ブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５（配列番号１２０）とヒトＣＤ１６３Ｌ１ ＳＲＣＲ８（配列番号１２１）ホモログとの比較。 野生型およびＣＤ１６３修飾ブタ由来のＰＡＭ上のＣＤ１６３およびＣＤ１６９の表面発現の代表的な結果。パネルＡ〜Ｅは、図１７に例示されるＣＤ１６３修飾の結果を示す。ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）のプールデータをパネルＤに示す。 野生型およびＣＤ１６３修飾ブタにおける血清ハプトグロビンレベル。 野生型およびＨＬ１１ｍ ＰＡＭの、２型ＰＲＲＳＶ分離株による感染に対する相対的寛容性。 １型および２型ＰＲＲＳＶ分離株によるＣＤ１６３修飾ブタの感染。 ２型ウイルスに感染したＷＴおよびＣＤ１６３修飾ブタのウイルス負荷。 ＳＩＧＬＥＣ１ノックアウト戦略。パネルＡは、２１個のエクソンを含有し、およそ２０ｋｂにまたがるブタＳＩＧＬＥＣ１の組織を示す（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＵ４６７６０９）。パネルＢは、相同組み換えに使用される標的構築物を示す。ＰＣＲ増幅およびクローニングのためのプライマー配列は、標識された（Ｆ）および（Ｒ）である。「上アーム」ＤＮＡ断片は、エクソン１の上流約３．５ｋｂｐであり、エクソン１の一部（開始コドン後）を含む。シアル結合ドメインは、エクソン２内に位置する。「下アーム」ＤＮＡ断片は、エクソン４、５、６、およびエクソン７の一部を含む。エクソン１のほとんど、ならびにエクソン２および３のすべては、ＰＧＫプロモーターの制御下でネオマイシン（ｎｅｏ）カセットで置換された。チミジンキナーゼ（ＴＫ）カセットは、下アームのすぐ下流で入手可能であったが、選択には使用されなかった。フレーム停止コドン中の３つ（ｓｓｓ）は、領域を増幅するために使用されるアンチセンスおよびセンスＰＣＲプライマーにそれらを含めることによって、上アームおよび下アームの末端に導入された。パネルＣは、相同組み換え後の突然変異ＳＩＧＬＥＣ１遺伝子を示す。水平矢印は、スクリーニングに使用されるＰＣＲプライマーの位置を示す（プライマー配列については、表１７を参照）。 トランスジェニックファウンダーブタにおける野生型および標的ＳＩＧＬＥＣ１＋／−アレルのＰＣＲスクリーニング。ＰＣＲプライマー、「ｃ」および「ｄ」（図２４の標識矢印を参照）を使用して、雄４−１８クローンに由来する８匹のファウンダーブタ由来のゲノムＤＮＡを増幅した。パネルＡは、ＫＷ２細胞（トランスフェクションに使用される初期細胞）、標的化プラスミド、標的細胞４〜１８（２つのバンド、約２，４００および約２，９００ｂｐに留意されたい）、非標的線維芽細胞、および陰性ＰＣＲ対照としての水ブランクからのＤＮＡを示す。矢印は、４−１８クローンのためのかすかな２，９００ｂｐバンドの位置を示す。パネルＢは、８匹のＦ０トランスジェニックブタの結果を示す。各子ブタの２つのバンド（約２，４００および２，９００ｂｐ）の存在に留意されたい。野生型４−１８クローン、１１−１、および標的化プラスミドは、単一バンドのみを示す。分子サイズマーカーからのいくつかの断片サイズが示される。 Ｆ２同腹子＃５２におけるノックアウトブタのサザンブロット同定。上矢印は、野生型バンドの位置（７，８９２ｂｐ）を指し、下矢印は、遺伝子ノックアウトの予測位置（７，２０４ｂｐ）を同定する。分子サイズ標準を示す（ＳＴＤ）。ＳＩＧＬＥＣ１（−／−）ブタに加えて、野生型（＋／＋）、およびヘテロ接合性（＋／−）ブタの例も示される。 ＰＡＭ細胞表面上のＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９）およびＣＤ１６３の発現。新鮮なＰＡＭ細胞を、ＣＤ１６９（ｍＡｂ ３Ｂ１１／１１）またはＣＤ１６３（ｍＡｂ ２Ａ１０／１１）について染色した。ＦＩＴＣコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧのみで染色したＰＡＭ細胞を、バックグラウンド対照として含めた。 参照配列（配列番号１３５）として使用される野生型ＡＮＰＥＰエクソン２〜４のゲノム配列。配列は、イントロン２における最後の７７３塩基対、エクソン２、イントロン３、エクソン３、イントロン４、エクソン４、およびイントロン５の８１塩基対を含む。下線付き領域は、それぞれエクソン２、３、および４の位置を示す。エクソン２を標的化するＣＲＩＳＰＲガイド２および３（表２０）は、各々太字および二重下線である。 修飾ＡＮＰＥＰアレルを検出するＳＣＮＴ由来胎児の例示的なＰＣＲ結果。 修飾ＡＮＰＥＰアレルを検出する接合体注入胎児の例示的なＰＣＲ結果。 修飾ＡＮＰＥＰアレルを検出する接合体注入から生まれた生きたブタの例示的なＰＣＲ結果。 修飾ＡＮＰＥＰアレルを検出する接合体注入から生まれた生きたブタの例示的なＰＣＲ結果。 ＴＧＥＶおよびＰＥＤＶ曝露研究で使用される動物に存在する野生型および修飾ＡＮＰＥＰアレルの概略図。 野生型ブタ（＋／＋）、２つのヌルＡＮＰＥＰアレル（−／−）を有するブタ、または９塩基対（３アミノ酸欠失、−／ｄ９）もしくは１２塩基対（４アミノ酸、−／ｄ１２）フレーム内欠失を有するアレルと組み合わせたヌルＡＮＰＥＰアレルからの回腸のＡＮＰＥＰ染色についての例示的な免疫組織化学結果。 性成熟時にＡＮＰＥＰの修飾染色体配列を有するブタ１５８−１の写真。 ＰＥＤＶへの曝露の０、７、および９日後に測定した、野生型ブタおよびＡＮＰＥＰ中でノックアウトまたはフレーム内欠失を有するブタの血清および糞便中のＰＥＤＶウイルスのレベルを測定する例示的なＰＣＲ結果。 ＰＥＤＶへの初期曝露の９日後の、野生型ブタおよびＡＮＰＥＰ中にノックアウト（ＫＯ）またはフレーム内欠失を有するブタからの回腸のＰＥＤＶ抗原染色の例示的な免疫組織化学結果。 ＴＧＥＶへの曝露の０、３、６、および７日後に測定した、野生型ブタおよびＡＮＰＥＰ中にノックアウトまたはフレーム内欠失を有するブタの糞便中のＴＧＥＶウイルスのレベルを測定する例示的なＰＣＲ結果。 ウイルスへの初期曝露の９日後の、野生型ブタおよびＡＮＰＥＰ中にノックアウト（ＫＯ）またはフレーム内欠失を有するブタからの回腸のＴＧＥＶ抗原染色の例示的な免疫組織化学結果。 野生型ブタおよびＡＮＰＥＰ中にノックアウト（ＫＯ）またはフレーム内欠失を有するブタにおけるＴＧＥＶ特異的抗体の存在または非存在を示す例示的なＥＬＩＳＡアッセイデータ。 ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、および／またはＳＩＧＬＥＣ１について修飾染色体配列を有するブタを交配することによって生成される動物の同腹子における修飾ＣＤ１６３アレル（パネルＡ）、ＡＮＰＥＰアレル（パネルＢ）、およびＳＩＧＬＥＣ１アレル（パネルＣ）を示す例示的なＰＣＲ結果。ＡＮＰＥＰ修飾を、サンガー配列決定によってパネルＢから確認した（パネルＤ）。 ＡＮＰＥＰ−／−（ＫＯ、パネルＡ）および野生型（ＷＴ、パネルＢ）動物から得られたブタ肺胞細胞の例示的な蛍光顕微鏡画像。細胞を、示されるように、ＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ、およびＰＥＤＶに感染させた。核種をヨウ化プロピジウムで染色した（パネルＡおよびＢの左列）。ウイルス感染細胞を、ＦＩＴＣ標識コロナウイルス抗Ｎタンパク質抗体を使用して検出した（パネルＡおよびＢの中央列）。マージした画像をパネルＡおよびＢの右列に示す。
本発明は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む、家畜動物およびそれらの子孫を対象とする。本発明はさらに、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む動物細胞に関する。動物および細胞は、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）およびブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）を含む病原体に対する抵抗性を増加させた。
動物および細胞は、ＡＮＰＥＰ遺伝子活性を不活性化する、または他の方法で調節する染色体修飾（例えば、挿入、欠失、もしくは置換）を有する。ＡＮＰＥＰは、細胞へのＴＧＥＶの侵入に関与する。したがって、不活性化ＡＮＰＥＰ遺伝子を有する動物または細胞は、曝露されると、ＴＧＥＶに対する抵抗性を示す。動物および細胞は、遺伝子編集を利用するものを含む、任意の数のプロトコルを使用して作成することができる。
アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列に加えて、動物、子孫、および動物は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列および／またはＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列をさらに含むことができる。そのような動物は、好適には、追加の病原体、例えばブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する抵抗性を増加させた。
本明細書に記載される動物のうちのいずれかの集団もまた提供される。
本発明はさらに、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を導入することを含む、病原体抵抗性非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための方法を対象とする。
本方法は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ系、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、またはメガヌクレアーゼなどの遺伝子編集方法を使用して、動物細胞または卵母細胞または胚に、細胞の染色体標的部位に特異的に結合し、それらの中のＡＮＰＥＰ遺伝子またはタンパク質の二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こすか、または他の方法で不活性化もしくは低減する薬剤を導入することを含み得る。
１つ以上の特定のＡＮＰＥＰ遺伝子座を、ＡＮＰＥＰ遺伝子座内の特定の核酸配列の切断および／または組み込みをもたらすことができるポリペプチドと並行して使用することもまた、本明細書に記載される。ＡＮＰＥＰ遺伝子座の切断および／または組み込みをもたらすことができるポリペプチドまたはＲＮＡと並行してＡＮＰＥＰ遺伝子座を使用する例としては、ジンクフィンガータンパク質、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬドメイン、ＴＡＬＥＮ、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリコンビナーゼ、ロイシンジッパー、および当業者に既知の他のものからなる群から選択されるポリペプチドが挙げられる。特定の例としては、部位特異的ＤＮＡ結合ドメインポリペプチドおよび切断ドメインポリペプチド（例えば、ヌクレアーゼ）を含むキメラ（「融合」）タンパク質、例えば、ジンクフィンガーポリペプチドおよびＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチドを含むＺＦＮタンパク質が挙げられる。ＡＮＰＥＰ遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドが、本明細書に記載される。そのようなポリペプチドはまた、ヌクレアーゼ（切断）ドメインもしくはハーフドメイン（例えば、修飾ＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼを含むホーミングエンドヌクレアーゼ）、および／またはリガーゼドメインを含み得、その結果、ポリペプチドは、標的二本鎖破断を誘導し得、かつ／または破断部位における目的の核酸の組み換えを促進し得る。ＡＮＰＥＰ遺伝子座を標的とするＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡを切断する機能ドメインであり得る。前述のポリペプチドを使用して、１つ以上のＡＮＰＥＰ遺伝子座における宿主生物（例えば、動物種）のゲノム中に外因性核酸を導入することができる。ＤＮＡ結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガー（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上のジンクフィンガー）を有するジンクフィンガータンパク質を含むことができ、これは、ＡＮＰＥＰ遺伝子内の任意の配列に結合するように操作される（非天然に存在する）。本明細書に記載されるジンクフィンガータンパク質のうちのいずれも、標的遺伝子のコード配列内または隣接する配列（例えば、プロモーターもしくは他の発現エレメント）内の標的部位に結合し得る。ジンクフィンガータンパク質は、ＡＮＰＥＰ遺伝子内の標的部位に結合することができる。
定義
本発明の要素またはその好ましい実施形態（複数可）を導入する場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」という冠詞は、１つ以上の要素が存在することを意味することが意図される。
「および／または」という用語は、項目のうちのいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、またはこの用語が関連付けられるすべての項目を意味する。
「結合タンパク質」は、別の分子に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合、それはそれ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）、かつ／または異なるタンパク質（複数可）の１つ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は、２種以上の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、およびタンパク質結合活性を有する。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、包括的であることが意図され、列挙された要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。
用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復」を表す。ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｉ型、ＩＩ型、およびＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系を含む。
「Ｃａｓ」という用語は、「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」を指す。Ｃａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９ファミリーメンバータンパク質、Ｃａｓ６ファミリーメンバータンパク質（例えば、Ｃｓｙ４およびＣａｓ６）、ならびにＣａｓ５ファミリーメンバータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
「Ｃａｓ９」という用語は、概して、野生型Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。例示的なＣａｓ９配列は、米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６によって提供される。米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６は、ここで参照により本明細書に組み込まれる。「Ｃａｓ９」は、（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の）野生型Ｃａｓ９ポリペプチドと最大で約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。「Ｃａｓ９」は、欠失、挿入、置換、変異体、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる、Ｃａｓ９タンパク質の野生型または修飾形態を指し得る。
「Ｃａｓ５」という用語は、概して、野生型の例示的なＣａｓ５ポリペプチド（例えば、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のＣａｓ５）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。例示的なＣａｓ５配列が、米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の図４２に提供される。米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の図４２は、ここで参照により本明細書に組み込まれる。「Ｃａｓ５」は、概して、野生型Ｃａｓ５ポリペプチド（例えば、Ｄ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のＣａｓ５）と最大で約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。「Ｃａｓ５」は、欠失、挿入、置換、変異体、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる、Ｃａｓ５タンパク質の野生型または修飾形態を指し得る。
「Ｃａｓ６」という用語は、概して、野生型の例示的なＣａｓ６ポリペプチド（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ６）と少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。例示的なＣａｓ６配列が、米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の図４１に提供される。米国特許公開第２０１６／００４６９６３号の図４１は、ここで参照により本明細書に組み込まれる。「Ｃａｓ６」は、概して、野生型Ｃａｓ６ポリペプチド（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）と最大で約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の配列同一性および／または配列類似性を有するポリペプチドを指し得る。「Ｃａｓ６」は、欠失、挿入、置換、変異体、突然変異、融合、キメラ、またはそれらの任意の組み合わせなどのアミノ酸変化を含むことができる、Ｃａｓ６タンパク質の野生型または修飾形態を指し得る。
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系」という用語は、Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体、ならびにＣａｓ９のＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の機能を提供し得る１つ以上の非コードＲＮＡを含む、遺伝子操作のためのプログラム可能なヌクレアーゼ系を指す。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、個別に使用することができるか、または「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）を産生するために組み合わせることができる。ｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡは、ゲノム標的に相補的な配列を提供する。
「疾患抵抗性」は、動物の特徴であり、動物は、ブタ動物とＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ、またはＰＲＲＳＶとの相互作用などの動物病原体相互作用の結果である疾患症状を回避する。すなわち、病原体は、動物疾患および関連する疾患症状を引き起こすことを防止するか、または代替的に、臨床徴候の発生率および／もしくは重症度を低減する、または臨床症状を低減する。当業者は、本明細書に開示される組成物および方法が、病原体発作から動物を保護するための当該技術分野で入手可能な他の組成物および方法とともに使用され得ることを理解するであろう。
「コードする」または「コードされる」とは、特定の核酸に関して、特定のタンパク質への翻訳のための情報を含むことを意味する。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に介在配列（例えば、イントロン）を含んでもよく、またはそのような介在する非翻訳配列を（例えば、ｃＤＮＡ中のように）欠いてもよい。タンパク質がコードされる情報は、コドンの使用によって指定される。典型的には、アミノ酸配列は、「普遍的」遺伝子コードを使用して核酸によってコードされる。核酸が合成的に調製または改変されるとき、核酸が発現される意図される宿主の既知のコドン選好を利用することができる。
本明細書で使用される場合、「遺伝子編集する」、「遺伝子編集された」、「遺伝的に編集された」、および「遺伝子編集エフェクター」は、「分子ハサミ」、「ホーミングエンドヌクレアーゼ」、または「標的化エンドヌクレアーゼ」とも称される、天然に存在するまたは人工的に操作されたヌクレアーゼを有するホーミング技術の使用を指す。ヌクレアーゼは、ゲノム中の所望の位置で特異的な二本鎖染色体切断（ＤＳＢ）を作成し、場合によっては、細胞の内因性機構を利用して、相同組み換え（ＨＲ）および／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の天然プロセスによる誘導された切断を修復する。遺伝子編集エフェクターとしては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）、およびメガヌクレアーゼ（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼとして再操作されたメガヌクレアーゼ）が挙げられる。この用語はまた、例えば、変化が欠失または比較的小さい挿入（典型的には２０ｎｔ未満）であり、かつ／または外来種からＤＮＡを導入しない場合を含む、トランスジェニック手順および技術の使用も含む。この用語はまた、初期遺伝子編集動物からの性交または無性増殖によって作成されたものなどの子孫動物も包含する。
「ゲノム操作する」、「遺伝子操作する」、「遺伝子操作された」、「遺伝子改変された」、「遺伝子改変」、「ゲノム修飾」、「ゲノム修飾」、および「ゲノム修飾された」という用語は、特定の核酸配列を欠失、挿入、突然変異、または置換することによってゲノムを改変することを指し得る。改変は、遺伝子または位置特異的であり得る。ゲノム操作は、ヌクレアーゼを使用して核酸を切断し、それによって改変のための部位を生成することができる。非ゲノム核酸の操作も企図される。ヌクレアーゼドメインを含有するタンパク質は、核酸標的化核酸と複合体を形成することによって標的核酸に結合し、切断することができる。一例では、切断は、標的核酸中に二本鎖切断を導入することができる。核酸は、例えば、内因性非相同末端結合（ＮＨＥＪ）機構によって修復することができる。さらなる例では、核酸片を挿入することができる。核酸標的化核酸および部位特異的ポリペプチドの修飾は、ゲノム操作のために使用される新しい機能を導入することができる。
本明細書で使用される場合、「ホーミングＤＮＡ技術」、「ホーミング技術」、および「ホーミングエンドヌクレアーゼ」は、指定された分子が、ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）を含む指定されたＤＮＡ配列を標的とすることを可能にする任意の機序を含む。
本明細書における「抵抗性の増加」および「感受性の低減」という用語は、限定されないが、病原体による感染に関連する臨床徴候または臨床症状の発生率および／または重症度の統計的に有意な低減を意味する。例えば、「抵抗性の増加」または「感受性の低減」は、未修飾染色体配列を有する対照動物と比較して、ＣＤ１６３遺伝子タンパク質中の修飾染色体配列を含む動物におけるＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ、またはＰＲＲＳＶによる感染に関連する臨床徴候または臨床症状の発生率および／または重症度の統計的に有意な低減を指し得る。「臨床症状の統計的に有意な低減」という用語は、限定されないが、修飾された対象群における少なくとも１つの臨床症状の発生率が、感染性薬剤による曝露後の非修飾対照群よりも少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％低いことを意味する。
「ノックアウト」とは、遺伝子の構造または調節機構の破壊を意味する。ノックアウトは、標的化ベクター、置換ベクター、もしくはヒット・アンド・ランベクターの相同組み換え、または遺伝子トラップベクターのランダム挿入によって生成されてもよく、遺伝子機能の完全、部分的、または条件付きの喪失をもたらす。
「家畜動物」という用語は、家畜農業において伝統的に飼育されている任意の動物、例えば、有蹄類（例えば、偶蹄目）、鳥類動物（例えば、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、またはひな鳩）、ウマ動物（例えば、ウマまたはロバ）を含む。偶蹄目としては、限定されないが、ブタ動物（例えば、ブタ）、ウシ動物（例えば、乳牛の肉）、ヒツジ動物、ヤギ動物、バッファロー、ラクダ、ラマ、アルパカ、およびシカが挙げられる。「家畜動物」という用語は、ラット、マウス、または他の齧歯類を含まない。
本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、野生型配列と比較した、例えば、遺伝子またはコードＤＮＡ配列（ＣＤＳ）などのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の改変を含む。この用語は、限定されないが、置換、挿入、フレームシフト、欠失、反転、転座、重複、スプライスドナー部位突然変異、点突然変異などを含む。
本明細書において、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低減」または「臨床症状の低減」とは、限定されないが、野生型感染と比較して、群内の感染対象の数を低減すること、感染の臨床徴候を示す対象の数を低減もしくは排除すること、または１つ以上の対象に存在する任意の臨床徴候の重症度を低減することを意味する。例えば、これらの用語は、感染症の任意の臨床徴候、肺病理学、ウイルス血症、抗体産生、病原体負荷の低減、病原体の脱落、病原体伝達の低減、またはＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ、もしくはＰＲＲＳＶの症状である任意の臨床徴候の低減を包含する。好ましくは、これらの臨床徴候は、ＣＤ１６３遺伝子に修飾を有しない、感染した対象と比較して、本発明の１匹以上の動物において少なくとも１０％低減される。より好ましくは、本発明の対象において、臨床徴候は少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％低減される。
本明細書におけるヌクレオチドｘからヌクレオチドｙまでのヌクレオチド配列における欠失への言及は、範囲内のすべてのヌクレオチド（ｘおよびｙを含む）が欠失されていることを意味する。したがって、例えば、「配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３９７からヌクレオチド１，５７８までの１８２塩基対の欠失」という語句は、ヌクレオチド１，３９７および１，５７８を含むヌクレオチド１，３９７〜１，５７８の各々が欠失していることを意味する。
動物の疾患に対する「抵抗性」は、動物の特徴であり、動物は、ブタ動物とＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ、またはＰＲＲＳＶとの相互作用などの動物病原体相互作用の結果である疾患症状を回避する。すなわち、病原体は、動物疾患および関連する疾患症状を引き起こすことを防止するか、または代替的に、臨床徴候の発生率および／もしくは重症度を低減する、または臨床症状を低減する。当業者は、本明細書に開示される方法が、病原体発作から動物を保護するための当該技術分野で入手可能な他の組成物および方法とともに使用され得ることを理解するであろう。
「ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥ反復配列と少なくともいくらかの配列相同性を示す。ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、所定のヌクレオチド配列に結合するように、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識らせん領域の操作（１つ以上のアミノ酸の改変）を介して「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、非天然に存在するタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的な基準から生じる、自然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な基準は、既存のＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を記憶するデータベース内の情報を処理するための置換ルールおよびコンピューター化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号、および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。またＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、１つ以上のジンクフィンガーを通じて配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインであり、これは、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略される。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、自然に見出されないタンパク質であり、その産生は、主にファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選択などの経験過程から生じる。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号、米国特許第５，９２５，５２３号、米国特許第６，００７，９８８号、米国特許第６，０１３，４５３号、米国特許第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、および米国公開第２０１１０３０１０７３号を参照されたい。
以下に、様々な他の用語が定義される。
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を有する動物および細胞
本明細書に記載されるのは、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列、例えば、病原体（例えば、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）もしくはブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ））による感染に対する改善されたまたは完全な抵抗性を付与する挿入または欠失（「ＩＮＤＥＬ」）を含む、家畜動物およびそれらの子孫、ならびに動物細胞である。
全長ブタＡＮＰＥＰ遺伝子（配列番号１３２）は、ほぼ３０，０００塩基対長であり、少なくとも３つのスプライス変異体を有する。スプライス変異体に応じて、ブタＡＮＰＥＰ遺伝子は、２０個または２１個のエクソンを含有する。しかしながら、３つのスプライス変異体は、本明細書に記載される遺伝子編集された動物の大部分を作製するために標的とされた領域であるエクソン２にわたって事実上同一である。参照を容易にするために、エクソン２のコード領域、開始コドン前の１０００ヌクレオチド、およびエクソン２の終了後の１０００ヌクレオチドを含む、参照配列（配列番号１３５）が提供される。開始コドンがエクソン２内に生じるため、参照配列の配列番号１３５は、イントロン２、エクソン２、イントロン３、エクソン３、イントロン４、エクソン４における最後の７７３塩基対、およびイントロン５の８１塩基対を含有する。参照配列の配列番号１３５の注釈付きバージョンを図２８に提供する。図２８において、エクソン２、３、および４の位置は、下線付きテキストでマークされ、開始コドンは、太字小文字テキスト（「atg」）で示される。
スプライス変異体Ｘ２およびＸ３によってコードされる全長野生型ブタＡＮＰＥＰタンパク質（９６３アミノ酸、配列番号１３４）およびスプライス変異体Ｘ１によってコードされる全長野生型ブタＡＮＰＥＰタンパク質（１０１７アミノ酸、配列番号１３３）のアミノ酸配列と同様に、全長野生型ブタＡＮＰＥＰ（配列番号１３２）のヌクレオチド配列も提供される。スプライス変異体Ｘ２およびＸ３は、同一のアミノ酸配列を産生する。
表１は、３つのスプライス変異体の各々について配列番号１３２のエクソンの位置を提供する。
Figure 2021521844
アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む、家畜動物およびそれらの子孫が提供される。
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む動物細胞もまた提供される。
修飾染色体配列は、ＴＧＥＶおよび／またはＰＲＣＶ感染に関連するＡＮＰＥＰタンパク質機能が損なわれる、低減される、または排除されるように改変される配列であり得る。したがって、本明細書に記載される動物および細胞は、「ノックアウト」動物または細胞と称され得る。
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない家畜動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性と比較して、動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性を低減する。
修飾は、好ましくは、動物、子孫、または細胞の病原体に対する感受性を実質的に排除する。修飾は、より好ましくは、動物、子孫、または細胞の病原体に対する感受性を完全に排除し、その結果、動物は、病原体への曝露後にいかなる疾患の臨床徴候も示さない。
例えば、動物がブタ動物であり、病原体がＴＧＥＶである場合、修飾を有するブタ動物は、ＴＧＥＶへの曝露後にいかなるＴＧＥＶ感染症の臨床徴候（例えば、嘔吐、下痢、脱水、過度の口渇）も示さない。加えて、修飾を有するブタ動物において、ＴＧＥＶ核酸は、糞便または血清中で検出することができず、ＴＧＥＶ抗原は、回腸中で検出することができず、血清は、ＴＧＥＶ特異的抗体に対して陰性である。
同様に、病原体に曝露される修飾を有する細胞は、病原体に感染しない。
病原体は、ウイルスを含むことができる。例えば、病原体は、コロナウイルス科ウイルス、例えば、コロナウイルス亜科ウイルスを含むことができる。
ウイルスは、好ましくは、コロナウイルス（例えば、アルファコロナウイルス属ウイルス）を含む。
ウイルスがアルファコロナウイルス属ウイルスを含む場合、アルファコロナウイルス属ウイルスは、好ましくは伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）を含む。
例えば、伝染性胃腸炎ウイルスは、ＴＧＥＶ Ｐｕｒｄｕｅ株を含むことができる。
代替的にまたは追加として、ウイルスは、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）を含むことができる。
家畜動物または子孫は、有蹄類、鳥類動物、またはウマ動物を含むことができる。細胞は、有蹄類、鳥類動物、またはウマ動物に由来し得る。
動物または子孫が鳥類動物である場合、または細胞が鳥類動物に由来する細胞である場合、鳥類動物は、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、またはひな鳩を含むことができる。
動物または子孫がウマ動物である場合、または細胞がウマ動物に由来する細胞である場合、ウマ動物は、ウマまたはロバを含むことができる。
動物または子孫が有蹄類である場合、または細胞が有蹄類に由来する細胞である場合、有蹄類は、偶蹄類を含むことができる。例えば、偶蹄類は、ブタ動物（例えば、ブタ）、ウシ動物（例えば、肉牛または乳牛）、ヒツジ動物、ヤギ動物、バッファロー、ラクダ、ラマ、アルパカ、またはシカを含むことができる。
動物または子孫は、好ましくはブタ動物を含む。細胞は、好ましくはブタ動物由来の細胞を含む。
動物または子孫は、胚、幼若体、または成体であり得る。
同様に、細胞は、胚細胞、幼若体動物由来の細胞、または成体動物由来の細胞を含むことができる。
例えば、細胞は、胚細胞を含むことができる。
細胞は、幼若体動物由来の細胞を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してヘテロ接合性であり得る。
動物、子孫、または細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してホモ接合性であり得る。
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。
例えば、修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失を含むことができる。
欠失は、フレーム内欠失を含むことができる。
修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入を含むことができる。
挿入、欠失、置換、またはそれらのいずれかの組み合わせは、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおけるミスコードをもたらし得る。
挿入、欠失、置換、またはそれらのいずれかの組み合わせが、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおけるミスコードをもたらす場合、ミスコードは、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける未成熟終止コドンをもたらし得る。
修飾染色体配列が欠失を含む場合、欠失は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルの開始コドンの欠失を含むことができる。開始コドンが欠失されると、ＡＮＰＥＰタンパク質は産生されない。
修飾染色体配列が欠失を含む場合、欠失は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルの全体コード配列の欠失を含むことができる。
修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換を含むことができる。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、好ましくは、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を欠く動物、子孫、または細胞におけるＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性と比較して、ＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性を低減させる。
好ましくは、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、動物、子孫、または細胞による機能性ＡＮＰＥＰタンパク質の産生を実質的にもたらさない。「実質的に機能性ＡＮＰＥＰタンパク質がない」とは、動物、子孫、または細胞内のＡＮＰＥＰタンパク質のレベルが検出不可能であるか、または検出可能である場合、修飾染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞内で観察されるレベルよりも少なくとも約９０％低い、好ましくは少なくとも約９５％低い、より好ましくは少なくとも約９８％低い、およびさらにより好ましくは少なくとも約９９％低いことを意味する。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれについても、動物、子孫、または細胞は、好ましくは、ＡＮＰＥＰタンパク質を産生しない。
動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン４、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２もしくはエクソン４と連続するイントロン、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける修飾を含む。
修飾染色体配列は、好適に、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における修飾、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのイントロン１における修飾、またはそれらの組み合わせを含む。
一例として、修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのイントロン１で始まり、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２で終わる欠失を含むことができる。
修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における挿入または欠失を含むことができる。例えば、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における挿入または欠失は、開始コドンの下流であり得る。
修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における欠失を含むことができる。
修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２内の欠失を含む場合、欠失は、エクソン２におけるフレーム内欠失を含むことができる。
例えば、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２におけるフレーム内欠失は、ＡＮＰＥＰタンパク質のアミノ酸１９４〜１９６の欠失をもたらし得る。
代替的に、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２におけるフレーム内欠失は、ＡＮＰＥＰタンパク質のアミノ酸１９４〜１９７の欠失をもたらし得る。フレーム内欠失は、さらに、ＡＮＰＥＰタンパク質の１９８位のバリン残基を別のアミノ酸、例えば、イソロイシン残基で置換することをもたらし得る。
修飾染色体配列は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における挿入を含むことができる。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３９７からヌクレオチド１，５７８までの１８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，３９７から始まる５塩基対の挿入で置き換えられる）、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７４からヌクレオチド１，５８２までの９塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７７からヌクレオチド１，５８５までの９塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド８１９からヌクレオチド１，６８５までの８６７塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド８８２からヌクレオチド１，６８８までの８６７塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１とヌクレオチド１，５８２との間の１塩基対の挿入、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０とヌクレオチド１，５８１との間の１塩基対の挿入、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７９とヌクレオチド１，５８０との間の１塩基対の挿入、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１とヌクレオチド１，５８２との間の２塩基対の挿入、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３２１からヌクレオチド１，５８７までの２６７塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３２３からヌクレオチド１，５８９までの２６７塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８２からヌクレオチド１，５９３までの１２塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５６１からヌクレオチド１，５８５までの２５塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５６０からヌクレオチド１，５８４までの２５塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７５からヌクレオチド１，５８２までの８塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７４からヌクレオチド１，５８１までの８塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含み得る。
例えば、動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８２からヌクレオチド１，５９３までの１２塩基対の欠失、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含み得る。
動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３９７からヌクレオチド１，５７８までの１８２塩基対の欠失を含み得る（欠失した配列は、ヌクレオチド１，３９７から始まる５塩基対の挿入で置き換えられる）。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３９７からヌクレオチド１，５７８までの１８２塩基対の欠失を含む場合（欠失した配列は、ヌクレオチド１，３９７から始まる５塩基対の挿入で置き換えられる）、５塩基対の挿入は、配列ＣＣＣＴＣ（配列番号１６９）を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７４からヌクレオチド１，５８２までの９塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７７からヌクレオチド１，５８５までの９塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド８１９からヌクレオチド１，６８５までの８６７塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド８８２からヌクレオチド１，６８８までの８６７塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間に１塩基対の挿入を含む場合、挿入は、単一のチミン（Ｔ）残基を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０と１，５８１との間の１塩基対の挿入を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０と１，５８１との間に１塩基対の挿入を含む場合、挿入は、単一のチミン（Ｔ）残基または単一のアデニン（Ａ）残基を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７９と１，５８０との間の１塩基対の挿入を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７９と１，５８０との間に１塩基対の挿入を含む場合、挿入は、単一のアデニン（Ａ）残基を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入を含む場合、２塩基対の挿入は、ＡＴジヌクレオチドを含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３２１からヌクレオチド１，５８７までの２６７塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３２３からヌクレオチド１，５８９までの２６７塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８２からヌクレオチド１，５９３までの１２塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５６１からヌクレオチド１，５８５までの２５塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５６０からヌクレオチド１，５８４までの２５塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７５からヌクレオチド１，５８２までの８塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７４からヌクレオチド１，５８１までの８塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失を含み得る（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失を含む場合（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、８塩基対の挿入は、配列ＧＧＧＧＣＴＴＡ（配列番号１７９）を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失を含み得る（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失を含む場合（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、４塩基対の挿入は、配列ＴＣＧＴ（配列番号１８０）を含み得る。
動物におけるＡＮＰＥＰ遺伝子は、本明細書に記載される修飾染色体配列のうちのいずれかの任意の組み合わせを含み得る。
例えば、動物、子孫、または細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列はヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、およびＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入を含み得る。
動物、子孫、または細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、およびＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入を含み得る。
動物、子孫、または細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、およびＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失を含み得る。
動物、子孫、または細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、およびＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入を含み得る。
動物、子孫、または細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、およびＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失を含み得る。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド１７，２３５〜２２，４２２を含む領域内に修飾を含む。
例えば、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド１７，２３５〜２２，０１６を含む領域内に修飾を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４４６〜２１，５３７を含む領域内に修飾を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４７９〜２１，５２９を含む領域内に修飾を含み得る。
例えば、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４７９からヌクレオチド２１，５２９までの５１塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４７９〜２１，５２３を含む領域内に修飾を含み得る。
例えば、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４７９からヌクレオチド２１，５２３までの４５塩基対の欠失を含み得る。
さらなる例として、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，５０９からヌクレオチド２１，５１１までの３塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，５３８〜２２，４２２を含む領域内に修飾を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２２，０１７〜２２，４２２を含む領域内に修飾を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２２，０５４〜２２，２５６を含む領域内に修飾を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２２，０５４〜２２，１２６を含む領域内に修飾を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド１７，２３５〜２２，４２２を含む領域内の任意の場所に修飾を含む場合、修飾染色体配列は、挿入または欠失を含み得る。
例えば、修飾染色体配列は、欠失を含み得る。欠失は、任意選択的に、フレーム内欠失を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド１７，２３５〜２２，４２２を含む領域内の任意の場所に修飾を含む場合、修飾染色体配列は、置換を含み得る。
例えば、置換は、異なるアミノ酸をコードするコドンを産生するために、配列番号１３２のヌクレオチド２１，５０９〜２１，５１１におけるＡＣＣコドン内のヌクレオチドのうちの１つ以上を異なるヌクレオチドで置換することを含み得る。
置換が、異なるアミノ酸をコードするコドンを産生するために、配列番号１３２のヌクレオチド２１，５０９〜２１，５１１におけるＡＣＣコドン内のヌクレオチドのうちの１つ以上を異なるヌクレオチドで置換することを含む場合、１つ以上のヌクレオチドの置換は、配列番号１３４のアミノ酸７３８におけるトレオニン（Ｔ）または配列番号１３３のアミノ酸７９２におけるトレオニン（Ｔ）の、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）残基での置換をもたらし得る。
例えば、置換は、配列番号１３４のアミノ酸７３８におけるトレオニン（Ｔ）または配列番号１３３のアミノ酸７９２におけるトレオニン（Ｔ）の、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）残基での置換をもたらす。
置換は、好適には、配列番号１３４のアミノ酸７３８におけるトレオニン（Ｔ）または配列番号１３３のアミノ酸７９２におけるトレオニン（Ｔ）の、バリン（Ｖ）またはアルギニン（Ｒ）残基での置換をもたらす。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、修飾染色体配列は、イントロン−エクソンスプライス領域を破壊することができる。イントロン−エクソンスプライス領域の破壊は、イントロン−エクソンスプライス領域の下流のスプライシングの欠如、ならびに得られるｍＲＮＡにおける追加の下流エクソンに起因して、エクソンスキッピングまたはイントロン包含をもたらし得る。
イントロン−エクソンスプライス領域を破壊するために、スプライシングに必要な任意のヌクレオチドを改変することができる。例えば、ほとんどのイントロンは、配列「ＡＧ」で終わる。この配列中のグアニン（Ｇ）残基が異なる塩基で置き換えられる場合、スプライスは、この部位では生じず、代わりに次の下流ＡＧジヌクレオチドで生じる。
イントロン−エクソンスプライス領域は、イントロンの開始時に配列を修飾することによって破壊することもできる。ほとんどのイントロンは、コンセンサス配列ＲＲＧＴＲＲＲＹ（配列番号１８６）から始まり、式中、「Ｒ」は、任意のプリンであり、「Ｙ」は、任意のピリミジンである。この配列中のグアニン（Ｇ）残基が修飾される場合、および／または他の塩基のうちの２つ以上が修飾される場合、イントロンは、機能しないようにレンダリングされ得、スプライスしない。
イントロン−エクソンスプライス領域はまた、当該技術分野で既知の任意の他の方法によって破壊され得る。
本明細書に記載されるＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれも、欠失、挿入、または置換からなり得る。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５と少なくとも８０％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５と少なくとも８５％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５と少なくとも９０％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５と少なくとも９５％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５と少なくとも９８％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５と少なくとも９９％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５と少なくとも９９．９％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５と１００％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３２と少なくとも８０％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３２と少なくとも８５％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３２と少なくとも９０％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３２と少なくとも９５％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３２と少なくとも９８％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３２と少なくとも９９％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３２と少なくとも９９．９％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３２と１００％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含むことができる。
動物、子孫、または細胞のうちのいずれも、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、または１７８を含む染色体配列を含むことができる。
例えば、動物、子孫、または細胞のうちのいずれも、配列番号１７７、１７８、１６６、１６７、１７０、１７２、または１７１を含む染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞のうちのいずれも、配列番号１７７、１７８、１６６、１６７、または１７１を含む染色体配列を含むことができる。
ＡＮＰＥＰをコードする遺伝子内に修飾染色体配列を有し、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列をさらに含む動物および細胞
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む家畜動物、子孫、または細胞のうちのいずれも、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列をさらに含むことができる。
ＣＤ１６３は、１７個のエクソンを有し、タンパク質は、９個のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン、膜貫通セグメント、および短い細胞質尾部を有する細胞外領域で構成される。いくつかの異なる変異体は、単一遺伝子の差次的スプライシングから生じる（Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９ａ、Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９９ｂ）。この変異の多くは、細胞質尾部の長さによって説明される。
ＣＤ１６３は、ハプトグロビン−ヘモグロビンスカベンジャー受容体として作用することを含む、いくつかの重要な機能を有する。血液中の遊離ヘモグロビンの排除は、ヘム基が非常に毒性であり得るため、ＣＤ１６３の重要な機能である（Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００１）。ＣＤ１６３は、エンドサイトーシスを促進する細胞質尾部を有する。この尾部の突然変異は、ハプトグロビン−ヘモグロビン複合体の取り込みの減少をもたらす（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６）。Ｃ１６３の他の機能としては、赤芽球付着（ＳＲＣＲ２）、ＴＷＥＡＫ受容体（ＳＲＣＲ１〜４および６〜９）であること、細菌受容体（ＳＲＣＲ５）であること、アフリカブタウイルス受容体（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．２００３）であること、および免疫調節物質としての潜在的な役割が挙げられる（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．２０１０で論じられている）。
ＣＤ１６３は、スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、細胞内ドメインおよび９個の細胞外ＳＲＣＲドメインを有する。ヒトでは、ＳＲＣＲ３を介したＣＤ１６３媒介ヘモグロビン−ヘム取り込みのエンドサイトーシスは、細胞を酸化ストレスから保護する（Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６ａ、Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６ｂ、Ｓｃｈａｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６ｃ）。ＣＤ１６３はまた、腫瘍壊死因子様弱アポトーシス誘導因子の受容体（ＴＷＥＡＫ：ＳＲＣＲ１〜４および６〜９）、病原体受容体（アフリカブタ熱ウイルス、細菌：ＳＲＣＲ２）、および赤血球芽球結合（ＳＲＣＲ２）としても機能する。
ＣＤ１６３は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、ならびに多くの他の病原体による感染において役割を果たす。したがって、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を有する動物、子孫、および細胞は、ＰＲＲＳＶ感染に対する感受性を低減し得るとともに、細胞への侵入、または細胞内での後の複製および／もしくは持続のためにＣＤ１６３に依存する他の病原体による感染に対する感受性を低減し得る。ＰＲＲＳＶの感染プロセスは、肺胞マクロファージの表面上のヘパラン硫酸塩への初期結合から始まる。次いで、ウイルスは、クラスリン媒介エンドサイトーシスを介して内部移行する。次いで、別の分子ＣＤ１６３は、エンドソーム内のウイルスの脱殻を促進する（Ｖａｎ Ｂｒｅｅｄａｍ ｅｔ ａｌ．２０１０）。ウイルスゲノムが放出され、細胞が感染する。
本明細書に記載されるのは、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列、例えば、動物に対する病原体（例えば、ＰＲＲＳＶ）による感染に対する改善された抵抗性または完全な抵抗性を付与する挿入または欠失（「ＩＮＤＥＬ」）を含む、動物およびそれらの子孫、ならびに細胞である。出願人は、ＣＤ１６３がＰＲＲＳＶ感染における重要な遺伝子であり、ファウンダー抵抗性動物および株を作成したことを実証した（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０２３５７０号および米国特許出願公開第２０１７／００３５０３５号を参照、これらの内容は参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
したがって、動物、子孫、または細胞が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列の両方を含む場合、動物、子孫、または細胞は、複数の病原体への感染に抵抗性である。例えば、動物または子孫がブタ動物である場合、または細胞がブタ細胞である場合、動物、子孫、または細胞は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に起因してＴＧＥＶによる感染に抵抗性であり、またＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に起因してＰＲＲＳＶによる感染にも抵抗性となる。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性と比較して、動物、子孫、または細胞の病原体（例えば、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）などのウイルス）による感染に対する感受性を低減する。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、好ましくは、動物、子孫、または細胞の病原体に対する感受性を実質的に排除する。修飾は、より好ましくは、動物、子孫、または細胞の病原体に対する感受性を完全に排除し、その結果、動物は、病原体への曝露後にいかなる疾患の臨床徴候も示さない。
例えば、動物がブタ動物であり、病原体がＰＲＲＳＶである場合、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を有するブタ動物は、ＰＲＲＳＶに曝露した後のＰＲＲＳＶ感染の任意の臨床徴候（例えば、呼吸困難、食欲不振、倦怠感、発熱、妊娠後期の生殖不全）を示さない。加えて、修飾を有するブタ動物において、ＰＲＲＳＶ核酸は血清中で検出できず、ＰＲＲＳＶ特異的抗体を産生しない。
病原体は、ウイルスを含むことができる。
ウイルスは、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含むことができる。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する動物、子孫、または細胞の感受性を低減することができる。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＮＶＳＬ９７−７８９５、ＫＳ０６−７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ−ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２−０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３−１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３−１０５９、０３−１０６０、ＳＤ０１−０８、４３５３ＰＺ、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する動物、子孫、または細胞の感受性を低減することができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してヘテロ接合性であり得る。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してホモ接合性であり得る。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含む動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、修飾染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。
例えば、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失を含むことができる。
代替的にまたは追加として、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入を含むことができる。
欠失、置換、またはそれらのいずれかの組み合わせは、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおけるミスコードをもたらし得る。
挿入、欠失、置換、またはミスコードは、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける未成熟終止コドンをもたらし得る。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、好ましくは、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を欠如する動物、子孫、または細胞におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比較して、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性を低減させる。
好ましくは、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、動物、子孫、または細胞による機能性ＣＤ１６３タンパク質の産生を実質的にもたらさない。「実質的に機能性ＣＤ１６３タンパク質がない」とは、動物、子孫、または細胞内のＣＤ１６３タンパク質のレベルが検出不可能であるか、または検出可能である場合、修飾染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞内で観察されるレベルよりも少なくとも約９０％低い、好ましくは少なくとも約９５％低い、より好ましくは少なくとも約９８％低い、およびさらにより好ましくは少なくとも約９９％低いことを意味する。
動物、子孫、または細胞が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含む場合、動物、子孫、または細胞は、好ましくはＣＤ１６３タンパク質を産生しない。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含む動物または子孫は、ブタ動物を含むことができる。
同様に、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含む細胞は、ブタ細胞を含むことができる。
動物または子孫がブタ動物を含む場合、または細胞がブタ細胞を含む場合、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン８、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７もしくはエクソン８と連続するイントロン、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける修飾を含むことができる。
例えば、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７における修飾を含むことができる。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７における修飾は、挿入を含むことができる。
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７における修飾は、欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞がＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失を含む場合、欠失は、フレーム内欠失を任意選択的に含むことができる。
動物または子孫がブタ動物を含む場合、または細胞がブタ細胞を含む場合、ＣＤ１６３をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、同じアレル上の参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間の１塩基対の挿入、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのエクソン７にさらなる１２９塩基対の欠失が存在する）、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対の欠失、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含み得る。
配列番号４７は、野生型ブタＣＤ１６３の部分ヌクレオチド配列を提供する。配列番号４７は、野生型ブタＣＤ１６３遺伝子のエクソン７の上流の３０００塩基対（ｂｐ）で始まり、この遺伝子のエクソン１０の最後の塩基までの領域を含む。配列番号４７を本明細書の参照配列として使用し、図１６に示す。
例えば、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、同じアレル上の参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、同じアレル上の参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、同じアレル上の参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失を含む場合、２塩基対の挿入は、ジヌクレオチドＡＧを含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間の１塩基対の挿入を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間の１塩基対の挿入を含む場合、１塩基対の挿入は、単一のアデニン残基を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８と３，１４９との間の７塩基対の挿入を含み得る。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入を含む場合、７塩基対の挿入は、配列ＴＡＣＴＡＣＴ（配列番号１１５）を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失を含み得る（欠失した配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、参照配列の配列番号４７と比較してエクソン７にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対の欠失が存在する）。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失を含み、欠失した配列が、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、参照配列の配列番号４７と比較してエクソン７中にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対の欠失が存在する場合、１２塩基対の挿入は、配列ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号１１６）を含むことができる。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失を含み得る（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）。
修飾染色体配列が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失を含む場合（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、１１塩基対の挿入は、配列ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（配列番号１１７）を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対の欠失を含み得る。
修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対の欠失を含み得る。
動物、子孫、または細胞におけるＣＤ１６３遺伝子は、本明細書に記載される修飾染色体配列のうちのいずれかの任意の組み合わせを含み得る。
例えば、動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、および参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失を含むことができ、欠失した配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失とともに、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してエクソン７中にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対の欠失が存在する）、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失とともに、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してエクソン７中にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対の欠失が存在する）、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１とヌクレオチド３，８９７との間の１４６７塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失とともに、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１とヌクレオチド３，８９７との間の１４６７塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１１塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失とともに、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対の欠失、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対の欠失を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失とともに、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失とともに、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、およびＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失を含むことができる。
本明細書に記載されるＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれも、欠失、挿入、または置換からなり得る。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも８０％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも８５％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも９０％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも９８％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも９９％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と１００％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞のうちのいずれも、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１９を含む染色体配列を含むことができる。
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子およびＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の両方に修飾染色体配列を含む動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、動物、子孫、または細胞は、本明細書に記載されるＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれかと、本明細書に記載されるＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれかとの任意の組み合わせを含むことができる。
例えば、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入を含むことができ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失を含むことができる。
ＡＮＰＥＰをコードする遺伝子内に修飾染色体配列を有し、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列をさらに含む動物および細胞
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む動物、子孫、または細胞のうちのいずれも、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列をさらに含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してヘテロ接合性であり得る。
動物、子孫、または細胞は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してホモ接合性であり得る。
ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換、またはそれらのいずれかの組み合わせを含むことができる。
例えば、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失を含むことができる。
ＳＩＧＬＥＣタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失を含む場合、欠失は、フレーム内欠失を含むことができる。
ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入を含むことができる。
ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換を含むことができる。
欠失、置換、またはそれらのいずれかの組み合わせは、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおけるミスコードをもたらし得る。
挿入、欠失、置換、またはミスコードは、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける未成熟終止コドンをもたらし得る。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、好ましくは、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を欠如する動物、子孫、または細胞におけるＳＩＧＬＥＣ１タンパク質産生または活性と比較して、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質産生または活性を低減させる。
好ましくは、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、動物、子孫、または細胞による機能性ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質の産生を実質的にもたらさない。「実質的に機能性ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質がない」とは、動物、子孫、または細胞内のＳＩＧＬＥＣ１タンパク質のレベルが検出不可能であるか、または検出可能である場合、修飾染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞内で観察されるレベルよりも少なくとも約９０％低い、好ましくは少なくとも約９５％低い、より好ましくは少なくとも約９８％低い、およびさらにより好ましくは少なくとも約９９％低いことを意味する。
動物、子孫、または細胞が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含む場合、動物、子孫、または細胞は、好ましくはＳＩＧＬＥＣ１タンパク質を産生しない。
ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含む動物または子孫は、ブタ動物を含むことができる。
同様に、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含む細胞は、ブタ細胞を含むことができる。
動物または子孫がブタ動物を含む場合、または細胞がブタ細胞を含む場合、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン１、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン３、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン１、エクソン２もしくはエクソン３と連続するイントロン、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける修飾を含むことができる。
例えば、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン１、エクソン２、および／またはエクソン３における欠失を含むことができる。
ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、エクソン１の一部、ならびにＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２および３のすべての欠失を含むことができる。
例えば、修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１２２と比較してヌクレオチド４，２７９からヌクレオチド５，５２５までの１，２４７塩基対の欠失を含む。
配列番号１２２は、野生型ブタＳＩＧＬＥＣ１の部分ヌクレオチド配列を提供する。配列番号１２２は、エクソン１の上流に４，２３６ヌクレオチドを開始し、エクソン７までのすべてのイントロンおよびエクソンを含み、エクソン７の終了後に１，００８ヌクレオチドを含む。配列番号１２２は、本明細書において参照配列として使用される。
ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が欠失を含む場合、欠失した配列は、任意選択的にネオマイシンカセットで置き換えることができる。例えば、動物、子孫、または細胞は、配列番号１２３を含む染色体配列を含むことができる。配列番号１２３は、部分ヌクレオチド配列を提供し、参照配列の配列番号１２２と比較してヌクレオチド４，２７９から５，５２５までの１，２４７塩基対の欠失があり、欠失した配列は、配列番号１２２と比較して反対方向に配向される１，８５５塩基対ネオマイシン選択可能カセットで置き換えられる。この挿入／欠失は、ＳＩＧＬＥＣ１遺伝子のエクソン１の部分、ならびにエクソン２および３のすべての喪失をもたらす。
本明細書に記載されるＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれも、欠失、挿入、または置換からなり得る。
本明細書に記載される動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と少なくとも８５％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と少なくとも９５％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と少なくとも９８％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と少なくとも９９％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と少なくとも９９．９％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
動物、子孫、または細胞は、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と１００％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に染色体配列を含むことができる。
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子およびＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子の両方に修飾染色体配列を含む動物、子孫、または細胞のうちのいずれにおいても、動物、子孫、または細胞は、本明細書に記載されるＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれかと、本明細書に記載されるＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれかとの任意の組み合わせを含むことができる。
例えば、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入を含むことができ、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１２２と比較してヌクレオチド４，２７９からヌクレオチド５，５２５までの１，２４７塩基対の欠失を含むことができる。
ＡＮＰＥＰをコードする遺伝子内に修飾染色体配列を有し、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列と、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列とをさらに含む動物および細胞
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む動物、子孫、または細胞のうちのいずれも、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列と、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの修飾染色体配列とをさらに含むことができる。
動物、子孫、または細胞が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列、およびＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を含む場合、動物、子孫、または細胞は、本明細書に記載されるＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれか、本明細書に記載されるＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれか、および本明細書に記載されるＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列のうちのいずれかの任意の組み合わせを含むことができる。
例えば、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入を含むことができ、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号１２２と比較してヌクレオチド４，２７９からヌクレオチド５，５２５までの１，２４７塩基対の欠失を含むことができ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列は、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失を含むことができる。
遺伝子編集された動物および細胞
本明細書に記載される動物または子孫のうちのいずれも、遺伝子編集された動物であり得る。
同様に、本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、遺伝子編集された細胞であり得る。
動物、子孫、または細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して編集された動物、子孫、または細胞であり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、天然に存在するエンドヌクレアーゼであってもよいが、好ましくは、エンドヌクレアーゼがＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の染色体配列を標的とするように設計されたＤＮＡ認識配列を有する合理的に設計された非天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼである。
したがって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、設計されたホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含み得る。
ホーミングヌクレアーゼは、好ましくはＣＲＩＳＰＲ系を含む。本明細書に記載される方法で使用するための雌ブタ動物を作成するために使用することができるＣＲＩＳＰＲ系の例としては、限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ５、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ６が挙げられる。
遺伝子編集された動物を生成するための、ＣＲＩＳＰＲ系およびＴＡＬＥＮを含む様々なホーミングエンドヌクレアーゼの使用は、以下でさらに論じられる。
編集された染色体配列は、（１）不活性化されてもよく、（２）修飾されてもよく、または（３）ヌル突然変異をもたらす統合配列を含んでもよい。編集染色体配列がＡＮＰＥＰ遺伝子内にある場合、不活性化染色体配列は、ＴＧＥＶおよび／またはＰＲＣＶ感染に関連するＡＮＰＥＰタンパク質機能が損なわれる、低減される、または排除されるように改変される。編集染色体配列がＣＤ１６３遺伝子内にある場合、不活性化染色体配列は、ＰＲＲＳＶ感染に関連するＣＤ１６３タンパク質機能が損なわれる、低減される、または排除されるように改変される。したがって、不活性化染色体配列を含む遺伝子編集された動物は、「ノックアウト」または「条件付きノックアウト」と称され得る。同様に、組み込まれた配列を含む遺伝子編集された動物は、「ノックイン」または「条件付きノックイン」と称され得る。さらに、修飾染色体配列を含む遺伝子編集された動物は、改変されたタンパク質生成物が産生されるように標的点突然変異（複数可）または他の修飾を含み得る。簡潔に述べると、このプロセスは、標的ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子、および任意選択的に、少なくとも１つのアクセサリーポリヌクレオチドを胚または細胞に導入することを含むことができる。この方法は、胚または細胞をインキュベートして、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現を可能にすることをさらに含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって標的染色体配列に導入される二本鎖切断は、エラーが生じやすい非相同末端結合ＤＮＡ修復プロセスまたは相同性指向ＤＮＡ修復プロセスによって修復される。標的ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して生殖細胞系発達に関連するタンパク質をコードする染色体配列を編集する方法は、迅速、正確、かつ非常に効率的である。
代替的に、このプロセスは、ゲノム配列を修飾するためにＣＲＩＳＰＲ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）を使用することを含むことができる。Ｃａｓ９を使用してゲノム配列を編集するために、タンパク質を細胞に直接送達することができる。代替的に、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを細胞に送達することができるか、またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの発現を提供する遺伝子を細胞に送達することができる。加えて、標的特異的ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのいずれかは、細胞に直接送達することができ、または標的特異的ｇＲＮＡ（複数可）は、細胞に送達することができる（これらのＲＮＡは、代替的に、これらのＲＮＡを発現するように構築された遺伝子によって産生することができる）。標的部位の選択およびｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡの設計は、当該技術分野で周知である。ｇＲＮＡの構築およびクローニングの考察は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１４／０５／ＣＲＩＳＰＲ−Ｒｅａｇｅｎｔ−Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖ２０１４０５０９．ｐｄｆにおいて見出すことができる。
少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座を、部位特異的編集の標的部位として使用することができる。部位特異的編集は、外因性核酸（例えば、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）の挿入または遺伝子座からの核酸の欠失を含むことができる。例えば、外因性核酸の組み込みおよび／またはゲノム核酸の一部の欠失は、破壊された（すなわち、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１タンパク質の活性が低減した）ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子を産生するように遺伝子座を修飾することができる。
細胞型
本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、生殖細胞または配偶子を含むことができる。
例えば、本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、精子細胞を含むことができる。
代替的に、本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、卵細胞（例えば、受精卵）を含むことができる。
本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、体細胞を含むことができる。
例えば、本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、線維芽細胞（例えば、胎児線維芽細胞）を含むことができる。
本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、胚細胞を含むことができる。
本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、幼若体動物に由来する細胞を含むことができる。
本明細書に記載される細胞のうちのいずれも、成体動物に由来する細胞を含むことができる。
病原体に対する感受性を低減した動物および系統を産生するための方法
病原体に対する感受性を低減した非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための方法が提供される。この方法は、卵母細胞または精子細胞を修飾して、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、卵母細胞および精子細胞のうちの少なくとも１つに導入し、卵母細胞を精子細胞で受精させて、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含有する受精卵を作成することを含む。この方法はさらに、受精卵を代理雌動物に移入することを含み、妊娠および正期産によって子孫動物を産生する。この方法は、追加的に、病原体に対する感受性について子孫動物をスクリーニングすることと、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含まない動物と比較して、病原体に対する感受性を低減した子孫動物を選択することと、を含む。
病原体に対する感受性を低減した非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための別の方法が提供される。この方法は、受精卵を修飾して、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、受精卵に導入することを含む。この方法は、受精卵を代理雌動物に移入することをさらに含み、妊娠および正期産によって子孫動物を産生する。この方法は、追加的に、病原体に対する感受性について子孫動物をスクリーニングすることと、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含まない動物と比較して、病原体に対する感受性を低減した子孫動物を選択することと、を含む。
これらの方法のうちのいずれかにおいて、動物は、家畜動物を含むことができる。
卵母細胞、精子細胞、または受精卵を修飾するステップは、卵母細胞、精子細胞、または受精卵の遺伝子編集を含むことができる。
卵母細胞、精子細胞、または受精卵は、修飾染色体配列に対してヘテロ接合性であり得る。
卵母細胞、精子細胞、または受精卵は、修飾染色体配列に対してホモ接合性であり得る。
受精は、人工授精を含むことができる。
病原体に対する感受性を低減した非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための方法のうちのいずれにおいても、方法は、卵母細胞、精子細胞、または受精卵を修飾して、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、卵母細胞、精子細胞、または受精卵に導入することをさらに含むことができる。
代替的にまたは追加として、病原体に対する感受性を低減した非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生するための方法のうちのいずれにおいても、方法は、卵母細胞、精子細胞、または受精卵を修飾して、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、卵母細胞、精子細胞、または受精卵に導入することをさらに含むことができる。
病原体による感染に対する家畜動物の抵抗性を増加させる方法が提供される。この方法は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの染色体配列を修飾することを含み、それによりＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない家畜動物におけるＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性と比較して低減される。
本方法は、任意選択的に、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの染色体配列を修飾することをさらに含み得、それによりＣＤ１６３タンパク質産生または活性は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない家畜動物におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比較して低減される。
代替的にまたは追加として、方法は、任意選択的に、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの染色体配列を修飾することをさらに含み得、それによりＳＩＧＬＥＣ１タンパク質産生または活性は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない家畜動物におけるＳＩＧＥＬＣ１タンパク質産生または活性と比較して低減される。
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの染色体配列を修飾するステップは、染色体配列の遺伝子編集を含むことができる。
遺伝子編集を含む本明細書に記載される方法のうちのいずれにおいても、遺伝子編集は、ホーミングエンドヌクレアーゼの使用を含むことができる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、天然に存在するエンドヌクレアーゼであってもよいが、好ましくは、エンドヌクレアーゼがＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の染色体配列を標的とするように設計されたＤＮＡ認識配列を有する合理的に設計された非天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼである。
したがって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、設計されたホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含み得る。
ホーミングヌクレアーゼは、好ましくはＣＲＩＳＰＲ系を含む。限定されないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ５、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ６を含むＣＲＩＳＰＲ系の例。
本明細書に記載される方法のうちのいずれも、本明細書に記載される動物のうちのいずれかを産生することができる。
本明細書に記載される方法のうちのいずれも、動物をファウンダー動物として使用することをさらに含むことができる。
動物の集団
動物の集団も本明細書に提供される。
家畜動物の集団が提供される。集団は、本明細書に記載される家畜動物および／またはそれらの子孫のうちのいずれか２つ以上を含む。
別の動物集団が提供される。集団は、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって作製される２匹以上の動物および／またはそれらの子孫を含む。
したがって、集団内の動物はすべて、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含む。集団内の動物はまた、任意選択的に、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内および／またはＳＩＧＥＬＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含むことができる。
集団は、病原体による感染に抵抗性である。
病原体は、ウイルスを含むことができる。例えば、病原体は、コロナウイルス科ウイルス、例えば、コロナウイルス亜科ウイルスを含むことができる。
ウイルスは、好ましくは、コロナウイルス（例えば、アルファコロナウイルス属ウイルス）を含む。
ウイルスがアルファコロナウイルス属ウイルスを含む場合、アルファコロナウイルス属ウイルスは、好ましくは伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）を含む。
例えば、伝染性胃腸炎ウイルスは、ＴＧＥＶ Ｐｕｒｄｕｅ株を含むことができる。
代替的にまたは追加として、ウイルスは、ブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）を含むことができる。
集団内の動物がＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列も含む場合、集団はまた、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）（例えば、１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶウイルス、もしくは１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方、ならびに／またはＮＶＳＬ９７−７８９５、ＫＳ０６−７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ−ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２−０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３−１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３−１０５９、０３−１０６０、ＳＤ０１−０８、４３５３ＰＺ、およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ分離株）による感染に対して抵抗性となる。
核酸
核酸分子もまた、本明細書に提供される。
核酸分子が提供される。核酸分子は、
（ａ）配列番号１３５の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、ヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１３２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、ヌクレオチド配列、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
核酸分子のうちのいずれも、単離された核酸分子であり得る。
核酸分子は、配列番号１３２と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３２と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３２と少なくとも８７．５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３２と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３２と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３２と少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３２と比較して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３２と少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３２と少なくとも９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３５と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３５と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３５と少なくとも８７．５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３５と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３５と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３５と少なくとも９８％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３５と少なくとも９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
核酸分子は、配列番号１３５と少なくとも９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むことができ、ヌクレオチド配列は、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む。
置換、挿入、または欠失は、置換、挿入、または欠失を含まない核酸と比較して、ＡＮＰＥＰタンパク質の産生または活性を低減または排除する。
核酸分子は、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、または１７８を含むことができる。
例えば、核酸分子は、配列番号１７７、１７８、１６６、１６７、または１７１を含むことができる。
親和性タグ
「親和性タグ」は、ペプチド親和性タグまたは核酸親和性タグのいずれかであり得る。「親和性タグ」という用語は、概して、分子に結合し得る（例えば、小分子、タンパク質、または共有結合によって結合し得る）タンパク質または核酸配列を指す。親和性タグは、非天然配列であり得る。ペプチド親和性タグは、ペプチドを含むことができる。ペプチド親和性タグは、分割系の一部となり得るものであり得る（例えば、２つの不活性ペプチド断片は、トランスで一緒に結合して、活性親和性タグを形成することができる）。核酸親和性タグは、核酸を含むことができる。核酸親和性タグは、（例えば、ハイブリダイゼーションを通じて）既知の核酸配列に選択的に結合することができる配列であり得る。核酸親和性タグは、タンパク質に選択的に結合することができる配列であり得る。親和性タグは、天然タンパク質に融合され得る。親和性タグは、ヌクレオチド配列に融合され得る。
場合によっては、１つ、２つ、または複数の親和性タグを天然タンパク質またはヌクレオチド配列に融合することができる。インビトロまたはインビボ転写の方法を使用して、親和性タグを核酸標的化核酸に導入することができる。核酸親和性タグは、例えば、化学タグ、ＲＮＡ結合タンパク質結合配列、ＤＮＡ結合タンパク質結合配列、親和性タグ付きポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な配列、合成ＲＮＡアプタマー、または合成ＤＮＡアプタマーを含み得る。化学核酸親和性タグの例としては、限定されないが、ビオチン、蛍光染料、およびジゴキセギニンを含有するリボヌクレオトリホスフェートが挙げられる。タンパク質結合核酸親和性タグの例としては、限定されないが、ＭＳ２結合配列、Ｕ１Ａ結合配列、ステムループ結合タンパク質配列、ｂｏｘＢ配列、ｅＩＦ４Ａ配列、またはＲＮＡ結合タンパク質によって認識される任意の配列が挙げられる。核酸親和性タグ付きオリゴヌクレオチドの例としては、限定されないが、ビオチン化オリゴヌクレオチド、２，４−ジニトロフェニルオリゴヌクレオチド、フルオレセインオリゴヌクレオチド、および一次アミン共役オリゴヌクレオチドが挙げられる。
核酸親和性タグは、ＲＮＡアプタマーであり得る。アプタマーとしては、テオフィリン、ストレプトアビジン、デキストランＢ５１２、アデノシン、グアノシン、グアニン／キサンチン、７−メチル−ＧＴＰに結合するアプタマー、アルギニン、シトルリン、バリン、トリプトファン、シアノコバラミン、Ｎ−メチルメソポルフィリンＩＸ、フラビン、ＮＡＤに結合するアプタマーなどのアミノ酸アプタマー、およびトブラマイシン、ネオマイシン、リビドマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン、ビオマイシン、およびクロラムフェニコールに結合するアプタマーなどの抗生物質アプタマーが挙げられる。
核酸親和性タグは、部位特異的ポリペプチドによって結合することができるＲＮＡ配列を含むことができる。部位特異的ポリペプチドは、条件的に酵素的に不活性であり得る。ＲＮＡ配列は、Ｉ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーによって結合することができる配列を含み得る。ＲＮＡ配列は、ＲＡＭＰファミリーメンバータンパク質によって結合することができる。ＲＮＡ配列は、Ｃａｓ９ファミリーメンバータンパク質、Ｃａｓ６ファミリーメンバータンパク質（例えばＣｓｙ４、Ｃａｓ６）によって結合することができる。ＲＮＡ配列は、Ｃａｓ５ファミリーメンバータンパク質（例えば、Ｃａｓ５）によって結合することができる。例えば、Ｃｓｙ４は、高親和性（Ｋｄ約５０ｐＭ）で特定のＲＮＡヘアピン配列に結合することができ、ヘアピンに対する部位３´においてＲＮＡを切断することができる。
核酸親和性タグは、部位特異的ポリペプチドによって結合することができるＤＮＡ配列を含むことができる。部位特異的ポリペプチドは、条件的に酵素的に不活性であり得る。ＤＮＡ配列は、Ｉ型、ＩＩ型、および／またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーによって結合することができる配列を含むことができる。ＤＮＡ配列は、アルゴノートタンパク質によって結合することができる。ＤＮＡ配列は、ジンクフィンガードメイン、ＴＡＬＥドメイン、または任意の他のＤＮＡ結合ドメインを含有するタンパク質によって結合することができる。
核酸親和性タグは、リボザイム配列を含むことができる。好適なリボザイムとしては、ペプチジルトランスフェラーゼ２３ ＳｒＲＮＡ、ＲｎａｓｅＰ、グループＩイントロン、グループＩＩイントロン、ＧＩＲ１分岐リボザイム、リードザイム、ヘアピンリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ＨＤＶリボザイム、ＣＰＥＢ３リボザイム、ＶＳリボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ＣｏＴＣリボザイム、および合成リボザイムが挙げられる。
ペプチド親和性タグは、追跡または精製に使用することができるタグ（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなどの蛍光タンパク質；Ｈｉｓタグ（例えば、６ＸＨｉｓタグ）；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ；ＧＳＴタグ；ＭＢＰタグ；キチン結合タンパク質タグ；カルモジュリンタグ；Ｖ５タグ；ストレプトアビジン結合タグなど）を含むことができる。
核酸およびペプチド親和性タグの両方は、ビオチンまたはジギトキシンなどの小分子タグ、および例えば、フルオロセイン、ローダミン、アレクサフルオロ色素、シアニン３色素、シアニン５色素などの蛍光標識タグを含むことができる。
核酸親和性タグは、核酸（例えば、核酸標的化核酸）に対して５´に位置することができる。核酸親和性タグは、核酸に対して３´に位置することができる。核酸親和性タグは、核酸に対して５´および３´に位置することができる。核酸親和性タグは、核酸内に位置することができる。ペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＮ末端に位置することができる。ペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＣ末端に位置することができる。ペプチド親和性タグは、ポリペプチド配列に対してＮ末端およびＣ末端に位置することができる。複数の親和性タグは、核酸および／またはポリペプチド配列に融合することができる。
捕捉剤
本明細書で使用される場合、「捕捉剤」は、一般に、ポリペプチドおよび／または核酸を精製することができる薬剤を指し得る。捕捉剤は、生物学的に活性な分子または物質であり得る（例えば、自然にまたは合成に見出される任意の生物学的物質であり、限定されないが、細胞、ウイルス、細胞下粒子、タンパク質が挙げられ、より具体的には、抗体、免疫グロブリン、抗原、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質複合体、（ストレプト）アビジン−ビオチン複合体、リガンド、受容体、または小分子、アプタマー、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド核酸、オリゴ糖、多糖、脂質多糖、細胞代謝物、ハプテン、薬理学的に活性な物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、および糖を含む）。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、親和性タグを含むことができる。いくつかの実施形態では、捕捉剤は、目的の標的ポリペプチドまたは核酸に優先的に結合することができる。捕捉剤は、混合物中に自由に浮遊することができる。捕捉剤は、粒子（例えば、ビーズ、マイクロビーズ、ナノ粒子）に結合することができる。捕捉剤は、固体表面または半固体表面に結合することができる。いくつかの場合において、捕捉剤は、標的に不可逆的に結合される。他の場合において、捕捉剤は、標的に可逆的に結合する（例えば、標的が溶出可能である場合、またはイミダゾールなどの化学物質の使用によって）。
ＣＤ１６３遺伝子座における核酸の標的組み込み
ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座における外因性核酸の部位特異的組み込みは、当業者に既知の任意の技法によって達成され得る。例えば、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座における外因性核酸の組み込みは、細胞（例えば、単離された細胞または組織もしくは生物中の細胞）を外因性核酸を含む核酸分子と接触させることを含むことができる。そのような核酸分子は、核酸分子と少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座との間の相同組み換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列を含むことができる。相同組み換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列は、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座の内因性ヌクレオチドに相補的であり得る。代替的に、相同組み換えを促進する外因性核酸に隣接するヌクレオチド配列は、以前に組み込まれた外因性ヌクレオチドに相補的であり得る。複数の外因性核酸は、遺伝子スタッキング中など、１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座に組み込むことができる。
ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座における核酸の組み込みは、例えば限定されないが、内因性ＤＮＡおよび内因性リコンビナーゼ酵素などの宿主細胞の内因性細胞機構によって促進され得る（例えば、触媒され得る）。代替的に、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座における核酸の組み込みは、宿主細胞に提供される１つ以上の因子（例えば、ポリペプチド）によって促進され得る。例えば、ヌクレアーゼ（複数可）、リコンビナーゼ（複数可）、および／またはリガーゼポリペプチドは、ポリペプチドを宿主細胞と接触させることによって、または宿主細胞内でポリペプチドを発現させることによって（独立して、またはキメラポリペプチドの一部として）提供され得る。したがって、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座において部位特異的に組み込まれる核酸と同時にまたは連続して宿主細胞に導入され得、少なくとも１つのヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドは、宿主細胞内のヌクレオチド配列から発現される。
ＤＮＡ結合ポリペプチド
部位特異的組み込みは、例えば、宿主生物のゲノムにおいて、特定のヌクレオチド配列を認識し、それに結合することが可能な因子を使用することによって達成することができる。例えば、多くのタンパク質は、部位特異的な方法でＤＮＡを認識し、それに結合することが可能なポリペプチドドメインを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドによって認識されるＤＮＡ配列は、「標的」配列と称され得る。部位特異的な方法でＤＮＡを認識し、それに結合することが可能なポリペプチドドメインは、ドメインが元々単離されたタンパク質以外のポリペプチドで発現しても、概して正しく折り畳まれ、部位特異的な方法でＤＮＡに結合するように独立して機能する。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドによる認識および結合のための標的配列は、特に標的配列が位置する部位が可溶性細胞タンパク質（例えば、遺伝子）にアクセス可能であることが既知である部位である場合に、大きなＤＮＡ構造（例えば、染色体）に存在する場合でも、概して、そのようなポリペプチドによって認識および結合することができる。
天然に存在するタンパク質から同定されるＤＮＡ結合ポリペプチドは、典型的には、別個のヌクレオチド配列またはモチーフ（例えば、コンセンサス認識配列）に結合するが、異なるヌクレオチド配列またはモチーフを認識するために多くのそのようなＤＮＡ結合ポリペプチドを修飾するための方法が存在し、当該技術分野において既知である。ＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、限定されないが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ロイシンジッパー、ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４、ＴＡＬ、ＬｅｘＡ、Ｔｅｔリプレッサー、ＬａｃＩ、およびステロイドホルモン受容体が挙げられる。
例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ジンクフィンガーであり得る。個々のジンクフィンガーモチーフは、ロングレンジのＤＮＡ部位のいずれかを標的とし、特異的に結合するように設計することができる。正準Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２（および非正準Ｃｙｓ３Ｈｉｓ）ジンクフィンガーポリペプチドは、標的ＤＮＡ二重らせんの主要溝にαらせんを挿入することによってＤＮＡに結合する。ジンクフィンガーによるＤＮＡの認識はモジュラーであり、各フィンガーは、主に標的における３つの連続する塩基対、およびポリペプチド媒介認識におけるいくつかの重要な残基と接触する。標的化エンドヌクレアーゼに複数のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含めることによって、標的化エンドヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性がさらに増加し得る（したがって、それによって付与される任意の遺伝子調節効果の特異性も増加し得る）。例えば、Ｕｒｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ ４３５：６４６−５１を参照されたい。したがって、宿主細胞に導入される標的化エンドヌクレアーゼが宿主細胞のゲノム内で固有であるＤＮＡ配列と相互作用するように、１つ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチドを操作し、利用してもよい。
好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択される標的部位に結合するように操作されるという点で非天然に存在する。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５−１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３−３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６−６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２−６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１−４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、および米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法としては、限定されないが、合理的な設計および様々なタイプの選択が挙げられる。合理的な設計は、例えば、三重鎖（または四重鎖）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することを含み、各三重鎖または四重鎖ヌクレオチド配列は、特定の三重鎖または四重鎖配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上のアミノ酸配列と会合する。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
ファージディスプレイおよび２つのハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，４１０，２４８号、同第６，１４０，４６６号、同第６，２００，７５９号、および同第６，２４２，５６８号、ならびにＷＯ９８／３７１８６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／８８１９７、およびＧＢ２，３３８，２３７に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または多指ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。例示的なリンカー配列６アミノ酸長以上については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
標的部位の選択：ＺＦＰおよび融合タンパク質（およびそれらをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者に既知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号、同第７８９，５３８号、同第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第５，９２５，５２３号、同第６，００７，９８８号、同第６，０１３，４５３号、同第６，２００，７５９号、ＷＯ９５／１９４３１、ＷＯ９６／０６１６６、ＷＯ９８／５３０５７、ＷＯ９８／５４３１１、ＷＯ００／２７８７８、ＷＯ０１／６０９７０、ＷＯ０１／８８１９７、ＷＯ０２／０９９０８４、ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６、およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
加えて、これらおよび他の参考文献に開示されるように、ジンクフィンガードメインおよび／または多指ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む任意の好適なリンカー配列を使用して一緒に連結されてもよい。例示的なリンカー配列６アミノ酸長以上については、米国特許第６，４７９，６２６号、同第６，９０３，１８５号、および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されるタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の好適なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。
本明細書に記載されるような動物または細胞が、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して遺伝子編集されている場合、動物または細胞は、標的ジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つのＲＮＡ分子、および任意選択的に、少なくとも１つのアクセサリーポリヌクレオチドを胚または細胞に導入することを含むプロセスを使用して作成することができる。この方法は、胚または細胞をインキュベートして、ジンクフィンガーヌクレアーゼの発現を可能にすることをさらに含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって標的染色体配列に導入される二本鎖切断は、エラーが生じやすい非相同末端結合ＤＮＡ修復プロセスまたは相同性指向ＤＮＡ修復プロセスによって修復される。標的ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用して生殖細胞系発達に関連するタンパク質をコードする染色体配列を編集する方法は、迅速、正確、かつ非常に効率的である。
代替的に、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＧＡＬ４由来のＤＮＡ結合ドメインである。ＧＡＬ４は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるモジュラートランスアクチベーターであるが、他の多くの生物においてトランスアクチベーターとしても機能する。例えば、Ｓａｄｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３５：５６３−４を参照されたい。この調節系において、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるガラクトース代謝経路の酵素をコードする遺伝子の発現は、利用可能な炭素源によって厳密に調節される。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９８７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５１：４５８−７６。これらの代謝酵素の転写制御は、陽性調節タンパク質ＧＡＬ４と、ＧＡＬ４が特異的に結合する１７ｂｐの対称ＤＮＡ配列（上流活性化配列（ＵＡＳ））との間の相互作用によって媒介される。
天然ＧＡＬ４は、９９ｋＤａの分子量を有する８８１アミノ酸残基からなる。ＧＡＬ４は、機能的に自律的なドメインを含み、その組み合わせられた活性が、インビボでのＧＡＬ４の活性を説明する。Ｍａ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ（１９８７）Ｃｅｌｌ ４８：８４７−５３）、Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ（１９８５）Ｃｅｌｌ ４３（３ Ｐｔ２）：７２９−３６。ＧＡＬ４のＮ末端６５アミノ酸は、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを含む。Ｋｅｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：６９９−７０４、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３５３−５。配列特異的結合は、ＤＮＡ結合ドメイン内に存在する６つのＣｙｓ残基によって配位される二価カチオンの存在を必要とする。配位カチオン含有ドメインは、ＤＮＡらせんの主要溝との直接接触を介して、１７ｂｐ ＵＡＳの各末端で保存されたＣＣＧ三重鎖と相互作用し、認識する。Ｍａｒｍｏｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６：４０８−１４。タンパク質のＤＮＡ結合機能は、活性化ドメインが転写を指向することができるように、プロモーターの近傍にＣ末端転写活性化ドメインを位置付ける。
使用することができる追加のＤＮＡ結合ポリペプチドとしては、例えば、限定されないが、ＡＶＲＢＳ３誘導性遺伝子由来の結合配列、ＡＶＲＢＳ３誘導性遺伝子由来のコンセンサス結合配列、またはそこから操作された合成結合配列（例えば、ＵＰＡ ＤＮＡ結合ドメイン）、ＴＡＬ、ＬｅｘＡ（例えば、Ｂｒｅｎｔ＆Ｐｔａｓｈｎｅ（１９８５）、上記）、ＬａｃＲ（例えば、Ｌａｂｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３３４３−５６、Ｂａｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８（１２）：５０７２−６を参照）、ステロイドホルモン受容体（Ｅｌｌｉｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１５１７−１２１）、Ｔｅｔリプレッサー（米国特許第６，２７１，３４１号）、およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の非存在下ではなく存在下でｔｅｔオペレーター配列に結合する突然変異したＴｅｔリプレッサー、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合ドメイン、ならびにＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１（１７）：８１８０−４に記載される調節系の成分（ＧＡＬ４、ホルモン受容体、およびＶＰ１６の融合体を利用する）が挙げられる。
本明細書に記載される方法および組成物に使用されるヌクレアーゼのうちの１つ以上のＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するかまたは操作された（非天然に存在する）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照されたい。
代替的に、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ系を含むことができる。例えば、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含むことができる。
（ＣＲＩＳＰＲ関連）系は、ウイルス攻撃から防御するための適応免疫系として細菌および古細菌において進化した。ウイルスに曝露すると、ウイルスＤＮＡの短いセグメントがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。ＲＮＡは、ウイルス配列を含むＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の一部分から転写される。ウイルスゲノムに相補的な配列を含有するそのＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）のウイルスゲノム内の配列への標的化を媒介する。Ｃａｓタンパク質は切断し、それによってウイルス標的をサイレンシングする。最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、真核細胞におけるゲノム編集に適合されている。部位特異的二本鎖切断（ＤＳＢ）の導入は、２つの内因性ＤＮＡ修復機序−非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同性指向修復（ＨＤＲ）のいずれかのうちの１つを介して標的配列の改変を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系はまた、標的配列を改変することなく、転写抑制および活性化を含む遺伝子調節に使用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に基づく標的遺伝子調節は、例えば、酵素的に不活性なＣａｓ９（触媒能のないＣａｓ９としても既知である）を使用することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、系のＲＮＡ成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復）遺伝子座、およびタンパク質をコードするＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座を含む（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１５６５−１５７５、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：４８２−４９６、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２００６．Ｂｉｏｌ．Ｄｉｒｅｃｔ １：７、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，２００５．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．１：ｅ６０）。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃａｓ遺伝子の組み合わせ、ならびにＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡ要素を含有する。
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けられる系のうちの１つであり、４つの連続的なステップで天然の標的ＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ、およびｔｒａｃｒＲＮＡを、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写する。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの反復領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの処理を媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識の追加の要件である、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にある標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対合を介してＣａｓ９を標的ＤＮＡに指向する。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作成する。
標的挿入および欠失を作成するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の使用のために、２つの非コードＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびＴｒａｃｒＲＮＡ）は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と称される単一のＲＮＡによって置き換えられ得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップからなる：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を防止するための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの外因性ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連タンパク質の発現、ならびにアレイの発現および処理、続いて（ｉｉｉ）外来核酸に対するＲＮＡ媒介性干渉。細菌細胞において、いくつかのＣａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の自然な機能に関与し、外来ＤＮＡの挿入等の機能において役割を果たす。
Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であり得る。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通の定性的生物学的特性を有する化合物である。「機能性誘導体」としては、限定されないが、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物活性を有することを条件として、天然配列の断片、天然配列ポリペプチドの誘導体、およびその断片が挙げられる。本明細書で企図される生物活性は、ＤＮＡ基質を断片に加水分解する機能性誘導体の能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体、共有結合的修飾、およびそれらの融合体の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の好適な誘導体としては、限定されないが、Ｃａｓタンパク質またはその断片の突然変異体、融合体、共有結合的修飾が挙げられる。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得ることができるか、または化学的に合成されるか、またはこれら２つの手順の組み合わせによって得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するか、もしくは外因性導入核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であってもよく、この核酸は、内因性Ｃａｓと同じであるか、または異なるＣａｓをコードする。いくつかの場合において、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
本明細書に記載されるような動物または細胞が、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して遺伝子編集されている場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用して、動物または細胞を生成することができる。Ｃａｓ９を使用してゲノム配列を編集するために、タンパク質を細胞に直接送達することができる。代替的に、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡを細胞に送達することができるか、またはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡの発現を提供する遺伝子を細胞に送達することができる。加えて、標的特異的ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのいずれかは、細胞に直接送達することができ、または標的特異的ｇＲＮＡ（複数可）は、細胞に送達することができる（これらのＲＮＡは、代替的に、これらのＲＮＡを発現するように構築された遺伝子によって産生することができる）。標的部位の選択およびｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡの設計は、当該技術分野で周知である。ｇＲＮＡの構築およびクローニングの考察は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｗｐ−ｃｏｎｔｅｎｔ／ｕｐｌｏａｄｓ／２０１４／０５／ＣＲＩＳＰＲ−Ｒｅａｇｅｎｔ−Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｒｅｖ２０１４０５０９．ｐｄｆにおいて見出すことができる。
ＤＮＡ結合ポリペプチドは、宿主生物のゲノム核酸内に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、それに結合することができる。標的ヌクレオチド配列の任意の数の別個のインスタンスは、いくつかの実施例において、宿主ゲノム中に見出され得る。標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム内で希少であり得る（例えば、標的配列の約１０個未満、約９個未満、約８個未満、約７個未満、約６個未満、約５個未満、約４個未満、約３個未満、約２個未満、または約１個のコピー（複数可）がゲノム内に存在し得る）。例えば、標的ヌクレオチド配列は、生物のゲノム内の固有部位に位置し得る。標的ヌクレオチド配列は、例えば、限定されないが、互いに関連してゲノム全体にランダムに分散してもよく、ゲノム内の異なる連結基内に位置してもよく、同じ連結基内に位置してもよく、異なる染色体上に位置してもよく、同じ染色体上に位置してもよく、生物内の同様の条件下で発現される部位でゲノム内に位置してもよく（例えば、同じ、または実質的に機能的に同一の調節因子の制御下で）、ゲノム内で互いに密接に位置してもよい（例えば、標的配列は、ゲノム遺伝子座で連結体として組み込まれた核酸内に含まれてもよい）。
標的化エンドヌクレアーゼ
標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、それに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドは、キメラポリペプチド上の標的配列への特異的結合を付与するように、キメラポリペプチド内に含まれ得る。実施例では、そのようなキメラポリペプチドは、例えば限定されないが、これらのポリペプチドが上述されるように、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドを含み得る。ＤＮＡ結合ポリペプチドならびにヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、および／またはリガーゼポリペプチドを含むキメラポリペプチドはまた、例えば限定されないが、キメラタンパク質中の機能性ポリペプチド間に位置するスペーサー配列、リーダーペプチド、融合タンパク質をオルガネル（例えば、核）に標的とするペプチド、細胞酵素によって切断されるポリペプチド、ペプチドタグ（例えば、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなど）、ならびにキメラポリペプチドの機能を妨げない他のアミノ酸配列などの他の機能性ポリペプチドモチーフおよび／またはドメインを含んでもよい。
キメラポリペプチド中の機能性ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）は、作動可能に連結され得る。キメラポリペプチドの機能性ポリペプチドは、キメラタンパク質をコードするキメラ遺伝子を作成するように、少なくともフレーム内で互いにライゲーションされた機能性ポリペプチドをコードする単一のポリヌクレオチドからのそれらの発現によって作動可能に連結され得る。代替的に、キメラポリペプチドの機能性ポリペプチドは、他の手段、例えば、独立して発現したポリペプチドの架橋によって作動可能に連結することができる。
標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、それに結合するＤＮＡ結合ポリペプチド、またはガイドＲＮＡは、天然の単離されたタンパク質（またはその突然変異体）内に含まれ得、天然の単離されたタンパク質またはその突然変異体はまた、ヌクレアーゼポリペプチドを含む（またリコンビナーゼおよび／またはリガーゼポリペプチドも含み得る）。そのような単離されたタンパク質の例としては、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、Ｔｒｅ、およびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、およびメガヌクレアーゼが挙げられる。
本明細書で使用される場合、「標的化エンドヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼポリペプチドを含む天然または操作された単離されたタンパク質およびその突然変異体、ならびにＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡおよびヌクレアーゼを含むキメラポリペプチドを指す。ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座内に含まれる標的ヌクレオチド配列を特異的に認識し、それに結合するＤＮＡ結合ポリペプチドまたはガイドＲＮＡを含む任意の標的化エンドヌクレアーゼ（例えば、標的配列が、遺伝子座における天然配列内に含まれるため、または標的配列が、例えば、組み換えによって遺伝子座内に導入されているためのいずれか）を使用することができる。
好適なキメラポリペプチドのいくつかの例としては、限定されないが、以下のポリペプチドの組み合わせが挙げられる：ジンクフィンガーＤＮＡ結合ポリペプチド；ＦｏｋＩヌクレアーゼポリペプチド；ＴＡＬＥドメイン；ロイシンジッパー；転写因子ＤＮＡ結合モチーフ；例えば限定されないが、ＴＡＬＥＮ、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ、Ｈｉｎ、ＲｅｃＡ、Ｔｒｅ、およびＦＬＰリコンビナーゼ）、ＲＮＡ誘導ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、メガヌクレアーゼから単離されたＤＮＡ認識および／または切断ドメイン、ならびに当業者に既知の他のドメイン。特定の例としては、部位特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチドを含むキメラタンパク質が挙げられる。キメラポリペプチドは、キメラポリペプチドを目的の特定のヌクレオチド配列に標的とするように、キメラポリペプチド内に含まれるＤＮＡ結合ポリペプチドの認識配列を改変するために当業者に既知の方法によって操作され得る。
キメラポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガー、ＴＡＬエフェクタードメインなど）、およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含むことができる。切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼからの切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼからの切断ドメインに対して異種であり得る。異種切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインを誘導することができる例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２−２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．、およびＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９−３３８８を参照されたい。ＤＮＡを切断する追加の酵素が既知である（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮＡｓｅ Ｉ、マイクロコッカルヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３を参照）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１つ以上を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体化を必要とする、上述の任意のヌクレアーゼまたはその一部分に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、切断には２つの融合タンパク質が必要である。代替的に、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得るか、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質の標的部位は、好ましくは互いに関連して配置され、それにより２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、互いに空間的配向で切断ハーフドメインを配置し、これが例えば二量体化によって、切断ハーフドメインが機能的切断ドメインを形成することを可能にする。したがって、標的部位の近縁は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドによって分離され得る。しかしながら、任意の整数のヌクレオチド、またはヌクレオチド対は、２つの標的部位間（例えば、２〜５０ヌクレオチド対以上）に介在することができる。一般に、切断部位は、標的部位間にある。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、例えば、１つ以上の外因性配列（ドナー／導入遺伝子）が結合（標的）部位またはその付近に組み込まれるように、結合部位またはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド、他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドで、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２７５−４２７９、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２７６４−２７６８、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３−８８７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。したがって、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）と、操作されても操作されなくてもよい、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインと、を含むことができる。
切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素は、Ｆｏｋ Ｉである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のために、開示される融合タンパク質に使用されるＦｏｋ Ｉ酵素の部分は、切断ハーフドメインと見なされる。したがって、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合体を使用した細胞配列の標的二本鎖切断および／または標的置換のために、各々がＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性切断ドメインを再構築することができる。代替的に、ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持するか、または機能的切断ドメインを形成するために多量体化（例えば、二量体化）する能力を保持するタンパク質の任意の部分であり得る。
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、米国特許公開第２００７／０１３４７９６号に記載されている。追加の制限酵素はまた、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これらは本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照されたい。
切断ドメインは、例えば、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００６／０１８８９８７号、および同第２００８／０１３１９６２号に記載されるように、ホモ二量体化を最小化または防止する１つ以上の操作された切断ハーフドメイン（二量体化ドメイン突然変異体とも称される）を含むことができる。
代替的に、ヌクレアーゼは、いわゆる「分割酵素」技術を使用して、核酸標的部位でインビボで組み立てられ得る（例えば、米国特許公開第２００９００６８１６４号を参照）。そのような分割酵素の成分は、別個の発現構築物上で発現されてもよく、または、個々の成分が、例えば、自己切断２ＡペプチドまたはＩＲＥＳ配列によって分離される１つのオープンリーディングフレーム内で連結され得る。成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメインまたはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインであり得る。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
キメラポリペプチドは、外因性核酸またはドナーＤＮＡが組み込まれ得る標的部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断を送達するように設計され得る、カスタム設計のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含むことができる（米国特許公開第２０１０／０２５７６３８号を参照）。ＺＦＮは、制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）からの非特異的切断ドメインおよびジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインポリペプチドを含有するキメラポリペプチドである。例えば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．１５：４８１−９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：３６１６−２０、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１１５６−６０、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８３−７、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７ｂ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：１２８７５−９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７ｃ）Ｇｅｎｅ ２０３：４３−９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７９：４８９−９５、Ｎａｈｏｎ ａｎｄ Ｒａｖｅｈ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：１２３３−９、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：６７４−８１を参照されたい。ＺＦＮは、非正準ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むことができる（米国特許公開第２００８／０１８２３３２号を参照）。ＤＮＡを切断し、二本鎖切断を導入するために、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインを介して二量体化しなければならない。したがって、そのようなエンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインを含有するＺＦＮはまた、標的ＤＮＡを切断するためにヌクレアーゼドメインの二量体化を必要とする。Ｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３４：１１９１−７、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：３３６１−９。ＺＦＮの二量体化は、２つの隣接する、反対に配向されたＤＮＡ結合部位によって促進することができる。Ｉｄ。
宿主の少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座への外因性核酸の部位特異的組み込みのための方法は、宿主の細胞にＺＦＮを導入することを含み得、ＺＦＮは、標的ヌクレオチド配列を認識してそれに結合し、標的ヌクレオチド配列は、宿主の少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座内に含まれる。ある特定の例では、標的ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座以外の任意の他の位置で宿主のゲノム内に含まれない。例えば、ＺＦＮのＤＮＡ結合ポリペプチドは、（例えば、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座を配列決定することによって）少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座内で同定された標的ヌクレオチド配列を認識し、それに結合するように操作され得る。宿主の細胞にＺＦＮを導入することを含む、宿主の少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１性能遺伝子座への外因性核酸の部位特異的組み込みのための方法はまた、細胞に外因性核酸を導入することを含んでもよく、少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座を含む宿主の核酸への外因性核酸の組み換えは、ＺＦＮの標的配列への部位特異的認識と結合（およびその後のＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座を含む核酸の切断）によって促進される。
ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座における組み込みのための任意選択の外因性核酸
ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座における組み込みのための外因性核酸としては、少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座における部位特異的組み込みのための外因性核酸、例えば限定されないが、ＯＲＦ、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、および前述のいずれかまたは両方のうちの少なくとも１つを含むベクターが挙げられる。したがって、特定の核酸は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、構造的ヌクレオチド配列、および／またはＤＮＡ結合ポリペプチド認識および結合部位を含む。
部位特異的統合のための任意選択の外因性核酸分子
上述のように、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入は、例えば、ポリペプチドの発現、突然変異体遺伝子の補正、または野生型遺伝子の発現の増加のために提供される。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかになるであろう。ドナー配列は、目的の場所で効率的な相同性指向性修復（ＨＤＲ）を可能にするために、相同性の２つの領域に隣接する非相同性配列を含有することができる。追加的に、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域と相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性のいくつかの不連続領域を含有することができる。例えば、通常、目的の領域に存在しない配列の標的挿入のために、当該配列は、ドナー核酸分子内に存在し、目的の領域内の配列と相同性の領域に隣接することができる。
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖状または環状形態で細胞に導入することができる。例えば、米国特許公開第２０１０／００４７８０５号、同第２０１１／０２８１３６１号、同第２０１１／０２０７２２１号、および同第２０１３／０３２６６４５号を参照されたい。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の３´末端に付加され、かつ／または自己相補性オリゴヌクレオチドが一方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９−４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、限定されないが、末端アミノ基（複数可）の付加、および例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間結合の使用が挙げられる。
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、および抗生物質抵抗性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞内に導入することができる。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として導入され得るか、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化された核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠陥レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
ドナーは、概して、その発現が組み込み部位における内因性プロモーター、すなわち、ドナーが組み込まれる内因性遺伝子（例えば、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１）の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように組み込まれる。しかしながら、ドナーは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、または誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含んでもよいことが明らかとなる。
さらに、発現には必要ではないが、外因性配列はまた、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。
ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座を修飾するために、部位特異的に少なくとも１つのＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座に組み込まれ得る外因性核酸としては、例えば限定されないが、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、農学的遺伝子を含む核酸、ＲＮＡｉ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、またはＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子を破壊する核酸が挙げられる。
外因性核酸は、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座を修飾するために、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座に組み込むことができ、核酸は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、それによりそのヌクレオチド配列は、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子座からの宿主内で発現される。いくつかの実施例では、目的のポリペプチド（例えば、外来タンパク質）は、市販量の目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から発現されている。そのような実施例では、目的のポリペプチドは、宿主細胞、組織、またはバイオマスから抽出され得る。
標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子
標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、標的化エンドヌクレアーゼ内に含まれるポリペプチドをコードする天然ヌクレオチド配列の操作（例えば、ライゲーション）によって操作され得る。例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むタンパク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドに対応する遺伝子のヌクレオチド配列を同定するために検査され得、そのヌクレオチド配列は、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列のエレメントとして使用され得る。代替的に、例えば、遺伝子コードの変性に従って、標的化エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を使用して、標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を推定してもよい。
標的化エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む例示的な核酸分子において、ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列の最後のコドン、およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の第１のコドンは、例えば、イントロンまたは「ＳＴＯＰ」をコードすることなく、任意の数のヌクレオチド三重鎖によって分離され得る。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列の最後のコドン、およびヌクレアーゼポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の第１のコドンは、任意の数のヌクレオチド三重鎖によって分離されてもよい。ヌクレアーゼポリペプチドをコードする第１のポリヌクレオチド配列、およびＤＮＡ結合ポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド配列の最後のコドン（すなわち、核酸配列中の３´末端）は、位相レジスタにおいて、それに直接連続するさらなるポリヌクレオチドコード配列の第１のコドンと融合され得るか、または合成ヌクレオチドリンカー（例えば、融合を達成するために使用され得るヌクレオチドリンカー）によってコードされるような短いペプチド配列以下のペプチド配列によって分離され得る。そのようなさらなるポリヌクレオチド配列の例として、例えば限定されないが、タグ、標的化ペプチド、および酵素切断部位が挙げられる。同様に、第１および第２のポリヌクレオチド配列の５´末端（核酸配列中）の第１のコドンは、位相レジスタにおいて、それに直接隣接するさらなるポリヌクレオチドコード配列の最後のコドンと融合されてもよく、または短いペプチド配列だけでそこから分離されてもよい。
標的化エンドヌクレアーゼにおける機能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ結合ポリペプチドおよびヌクレアーゼポリペプチド）を分離する配列は、例えば、任意の配列からなり得、その結果、コードされるアミノ酸配列は、標的化エンドヌクレアーゼの翻訳を著しく改変する可能性が低い。既知のヌクレアーゼポリペプチドおよび既知のＤＮＡ結合ポリペプチドの自律性のため、介在する配列は、これらの構造のそれぞれの機能を干渉しない。
他のノックアウト方法
当該技術分野で既知の様々な他の技法を使用して、ノックアウト動物を作製するために遺伝子を不活性化する、および／または核酸構築物を動物に導入してファウンダー動物を産生し、ノックアウトまたは核酸構築物がゲノムに組み込まれる動物株を作製することができる。そのような技法としては、限定されないが、原核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）、生殖細胞株へのレトロウイルス媒介遺伝子移入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２，６１４８−１６５２）、胚幹細胞への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ ５６，３１３−３２１）、胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３，１８０３−１８１４）、精子媒介遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９，１４２３０−１４２３５、Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．１８，１９−２３）、および体細胞、例えば、卵丘もしくは乳房細胞、または成体、胎児、もしくは胚幹細胞のインビトロ形質転換、続いて核移植（Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８５，８１０−８１３およびＷａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９４，３６９−３７４）が挙げられる。原核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子移入、および体細胞核移入は、特に有用な技法である。ゲノム修飾された動物は、その生殖系細胞を含むすべての細胞が修飾を有する動物である。その修飾においてモザイクである動物を産生する方法を使用する場合、動物は、近交系であってもよく、ゲノム修飾された子孫が選択されてもよい。クローニングは、例えば、その細胞が胚盤胞状態で修飾される場合にモザイク動物を作製するために使用され得るか、または単一細胞が修飾される場合にゲノム修飾が行われ得る。性的に成熟しないように修飾された動物は、使用される特定のアプローチに応じて、修飾のためにホモ接合またはヘテロ接合であり得る。特定の遺伝子がノックアウト修飾によって不活性化される場合、ホモ接合性が通常必要となる。特定の遺伝子がＲＮＡ干渉または優性陰性戦略によって不活性化される場合、ヘテロ接合性は、しばしば十分である。
典型的には、胚／接合体マイクロインジェクションでは、核酸構築物またはｍＲＮＡが受精卵に導入され、１つまたは２つの細胞受精卵が、精子頭からの遺伝子材料を含有する核構造として使用され、卵子は、原形質内で可視である。原核段階受精卵は、インビトロまたはインビボで得ることができる（すなわち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される）。インビトロ受精卵は、以下のように産生することができる。例えば、ブタ卵巣は、屠場で収集し、輸送中２２〜２８℃で維持することができる。卵巣は、濾胞吸引のために洗浄および単離することができ、４〜８ｍｍの範囲の濾胞は、１８ゲージ針を使用し、真空下で５０ｍＬの円錐形遠心管に吸引することができる。濾胞液および吸引された卵母細胞は、市販のＴＬ−ＨＥＰＥＳ（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ、Ｖｅｒｏｎａ、Ｗｉｓ．）で予備フィルターを通して洗い流すことができる。コンパクトな卵丘に囲まれた卵母細胞を選択し、３８．７℃および５％のＣＯ２で加湿空気中でおよそ２２時間、０．１ｍｇ／ｍＬのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの表皮成長因子、１０％のブタ卵胞液、５０μＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍｇ／ｍＬのｃＡＭＰ、それぞれ１０ＩＵ／ｍＬの妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）、およびヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）が補充されたＴＣＭ−１９９卵母細胞成熟培地（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，Ｗｉｓ．）に配置することができる。その後、卵母細胞を、ｃＡＭＰ、ＰＭＳＧ、またはｈＣＧを含有しない新鮮なＴＣＭ−１９９成熟培地に移動させ、さらに２２時間インキュベートすることができる。成熟卵母細胞は、０．１％ヒアルロニダーゼ中で１分間ボルテックスすることによって、それらの卵丘細胞を除去することができる。
ブタの場合、成熟卵母細胞は、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ５ウェル受精皿中の５００μＬのＭｉｎｉｔｕｂｅ ＰＯＲＣＰＲＯ ＩＶＦ培地系（Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，Ｗｉｓ．）において受精することができる。インビトロ受精（ＩＶＦ）の準備として、採取したばかりの雄ブタ精液または凍結した雄ブタ精液を洗浄し、ＰＯＲＣＰＲＯ ＩＶＦ培地中で４０万個の精子に再懸濁させることができる。精子濃度は、コンピューター支援精液分析（ＳＰＥＲＭＶＩＳＩＯＮ、Ｍｉｎｉｔｕｂｅ，Ｖｅｒｏｎａ，Ｗｉｓ．）によって分析することができる。最終インビトロ授精は、雄ブタに応じて、およそ４０の運動精子／卵母細胞の最終濃度で１０μＬ体積で実施できる。すべての受精卵母細胞は、５．０％のＣＯ２雰囲気中３８．７℃で６時間インキュベートすることができる。授精の６時間後、推定接合体をＮＣＳＵ−２３中で２回洗浄し、０．５ｍＬの同じ培地に移動させることができる。このシステムは、１０〜３０％の多精子受精率で、ほとんどの雄ブタにわたって日常的に２０〜３０％の胚盤胞を産生することができる。
直鎖状核酸構築物またはｍＲＮＡは、原核の１つにまたは細胞質に注入することができる。次いで、注入された卵をレシピエント雌に（例えば、レシピエント雌の卵管に）移し、レシピエント雌において発育させて、トランスジェニックまたは遺伝子編集動物を産生することができる。特に、インビトロ受精卵は、１５，０００×ｇで５分間遠心分離して堆積脂質に分離することができ、原核の可視化を可能にする。胚は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＦＥＭＴＯＪＥＴインジェクターを使用して注入することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚切断および胚盤胞形成の速度および品質を記録することができる。
胚は、非同期レシピエントの子宮に外科的に移入することができる。典型的には、１００〜２００個（例えば、１５０〜２００個）の胚は、５．５インチのＴＯＭＣＡＴ（登録商標）カテーテルを使用して卵管の膨大部−峡部接合部に堆積することができる。手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査を実施することができる。
体細胞核移入において、胚芽細胞、胎児線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、または上記の核酸構築物を含む顆粒球細胞などのトランスジェニックまたは遺伝子編集細胞を切除卵母細胞に導入して、複合細胞を確立することができる。卵母細胞は、極性体付近の部分的透明帯切開法によって、次いで解離領域で細胞質を押し出すことによって切除することができる。典型的には、鋭い傾斜した先端を有する注入ピペットを使用して、減数分裂２で停止した切除卵母細胞にトランスジェニックまたは遺伝子編集細胞を注入する。いくつかの記法において、減数分裂２で停止した卵母細胞は、卵子と称される。ブタまたはウシ胚を産生した後（例えば、卵母細胞を融合および活性化することによって）、胚は、活性化の約２０〜２４時間後にレシピエント雌の卵管に移される。例えば、Ｃｉｂｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０，１２５６−１２５８および米国特許第６，５４８，７４１号、同第７，５４７，８１６号、同第７，９８９，６５７号、または同第６，２１１，４２９号を参照されたい。ブタについては、レシピエント雌は、胚の移入のおよそ２０〜２１日後に妊娠を確認することができる。
標準的な繁殖技法を使用して、初期のヘテロ接合ファウンダー動物から不活性化された遺伝子に対してホモ接合性である動物を作成することができる。しかしながら、ホモ接合性は必要とされない場合がある。本明細書に記載される遺伝子編集ブタは、目的の他のブタと繁殖させることができる。
遺伝子編集動物が生成されると、内因性核酸の不活性化は、標準的な技法を使用して評価することができる。初期スクリーニングは、不活性化が行われたか否かを決定するためにサザンブロット分析によって達成することができる。サザン分析の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ；Ｎ．Ｙ．のセクション９．３７〜９．５２を参照されたい。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法はまた、初期スクリーニングＰＣＲにおいて使用することができ、ＰＣＲは、標的核酸が増幅される手順または技法を指す。一般に、目的の領域の末端またはそれ以降の配列情報を用いて、増幅されるテンプレートの反対側の鎖と配列が同一であるかまたは類似するオリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲは、ＤＮＡならびにＲＮＡ（全ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ由来の配列を含む）からの特定の配列を増幅するために使用することができる。プライマーは、典型的には１４〜４０ヌクレオチド長であるが、１０ヌクレオチド〜数百ヌクレオチド長の範囲であってもよい。ＰＣＲは、例えば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続的配列複製、または核酸配列に基づく増幅によって増幅することもできる。例えば、Ｌｅｗｉｓ（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ １２，１、Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４、およびＷｅｉｓｓ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１２９２を参照されたい。胚盤胞段階では、胚を、ＰＣＲ、サザンハイブリダイゼーション、およびスプリンケレットＰＣＲによる分析のために個々に処理することができる（例えば、Ｄｕｐｕｙ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００２）９９：４４９５を参照）。
干渉ＲＮＡ
様々な干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）系が既知である。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、相同遺伝子転写産物の配列特異的分解を誘導する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）は、ｄｓＲＮＡを小２１〜２３ヌクレオチド低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に代謝する。ＲＩＳＣは、二本鎖ＲＮＡｓｅ（ｄｓＲＮＡｓｅ、例えば、Ｄｉｃｅｒ）およびｓｓＲＮＡｓｅ（例えば、Ａｒｇｏｎａｕｔ ２またはＡｇｏ２）を含有する。ＲＩＳＣは、切断可能な標的を見出すためのガイドとしてアンチセンス鎖を利用する。ｓｉＲＮＡおよびｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の両方が既知である。遺伝子編集された動物における遺伝子を不活性化する方法は、標的遺伝子および／または核酸の発現が低減されるように、標的遺伝子および／または核酸に対するＲＮＡ干渉を誘導することを含む。
例えば、外因性核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対してＲＮＡ干渉を誘導することができる。例えば、標的ＤＮＡに相同な二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用して、そのＤＮＡの発現を低減することができる。ｓｉＲＮＡのための構築物は、例えば、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：８０６、Ｒｏｍａｎｏ ａｎｄ Ｍａｓｉｎｏ（１９９２）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６：３３４３、Ｃｏｇｏｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．１５：３１５３、Ｃｏｇｏｎｉ ａｎｄ Ｍａｓｉｎｏ（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ３９９：１６６、Ｍｉｓｑｕｉｔｔａ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４５１、およびＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌ ａｎｄ Ｃａｒｔｈｅｗ（１９９８）Ｃｅｌｌ ９５：１０１７に記載されるように産生され得る。ｓｈＲＮＡの構築物は、ＭｃＩｎｔｙｒｅ ａｎｄ Ｆａｎｎｉｎｇ（２００６）ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１によって記載されるように産生することができる。一般に、ｓｈＲＮＡは、相補領域を含有する一本鎖ＲＮＡ分子として転写され、短いヘアピンをアニールして形成することができる。
特定の遺伝子に指向された単一の個々の機能的ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを見出す確率は高い。例えば、ｓｉＲＮＡの特定の配列の予測可能性は、約５０％であるが、それらのうちの少なくとも１つが有効であることを十分に確信して、いくつかの干渉ＲＮＡを作製してもよい。
インビトロ細胞、インビボ細胞、またはＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１をコードする遺伝子に対して指向されるＲＮＡｉを発現する家畜動物などの遺伝子編集された動物を使用することができる。ＲＮＡｉは、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＲＩＳＣ、およびｍｉＲＮＡからなる群から選択され得る。
誘導系
誘導系を使用して、ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子を不活性化することができる。遺伝子の不活性化の空間的および時間的制御を可能にする様々な誘導系が既知である。いくつかは、ブタ動物においてインビボで機能することが証明されている。
誘導系の一例は、核酸の転写を調節するために使用することができるテトラサイクリン（ｔｅｔ）−オンプロモーター系である。この系において、突然変異したＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）は、単純ヘルペスウイルスＶＰ １６トランス活性化タンパク質の活性化ドメインに融合して、ｔｅｔまたはドキシサイクリン（ｄｏｘ）によって調節されるテトラサイクリン制御転写活性化剤（ｔＴＡ）を作成する。抗生物質の非存在下では、転写は最小限であるが、ｔｅｔまたはｄｏｘの存在下では、転写が誘導される。代替の誘導系としては、エクジソン系またはラパマイシン系が挙げられる。エクジソンは、その産生がエクジソン受容体のヘテロ二量体および超音波遺伝子（ＵＳＰ）の生成物によって制御される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソンまたはムリステロンＡなどのエクジソンの類似体での処置によって誘導される。誘導系を誘発するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
テトラサイクリン誘導系およびＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（構成的または誘導性のいずれか）は、より一般的に使用される誘導系のうちにある。テトラサイクリン誘導系は、テトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡ）／リバースｔＴＡ（ｒｔＴＡ）を伴う。インビボでこれらの系を使用する方法は、遺伝子編集された動物の２つの系統を生成することを伴う。１つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下でアクチベーター（ｔＴＡ、ｒｔＴＡ、またはＣｒｅリコンビナーゼ）を発現する。別の系統の動物は、目的の遺伝子（または改変される遺伝子）の発現が、ｔＴＡ／ｒｔＴＡトランスアクチベーターの標的配列の制御下にある（またはｌｏｘＰ配列に隣接している）アクセプターを発現する。動物のうちの２匹を交配させることで、遺伝子発現の制御をもたらす。
テトラサイクリン依存性調節系（ｔｅｔ系）は、２つの成分、すなわち、テトラサイクリン依存性様式で下流ｃＤＮＡの発現を制御するテトラサイクリン制御トランスアクチベーター（ｔＴＡまたはｒｔＴＡ）およびｔＴＡ／ｒｔＴＡ依存性プロモーターに依存する。テトラサイクリンまたはその誘導体（ドキシサイクリンなど）が存在しない場合、ｔＴＡは、ｔｅｔＯ配列に結合し、ｔＴＡ依存性プロモーターの転写活性化を可能にする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、ｔＴＡは、その標的と相互作用することができず、転写は生じない。テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが転写下方制御を可能にするため、ｔＴＡを使用するｔｅｔ系は、ｔｅｔ−ＯＦＦと称される。テトラサイクリンまたはその誘導体の投与は、インビボでの導入遺伝子発現の時間的制御を可能にする。ｒｔＴＡは、ドキシサイクリンの不在下では機能しないが、トランス活性化のためのリガンドの存在を必要とするｔＴＡの変異体である。したがって、このｔｅｔ系は、ｔｅｔ−ＯＮと呼ばれる。ｔｅｔ系は、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、またはシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかの導入遺伝子の誘導性発現のためにインビボで使用されている。
Ｃｒｅ／ｌｏｘ系は、２つの遠隔Ｃｒｅ認識配列、すなわちｌｏｘＰ部位間の交差による部位特異的組み換えを触媒する、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用する。２つのｌｏｘＰ配列間に導入されるＤＮＡ配列（ｆｌｏｘｅｄ ＤＮＡと称される）は、Ｃｒｅ媒介組み換えによって切除される。（組織もしくは細胞特異的プロモーターを用いた）空間制御、または（誘導系を用いた）時間制御のいずれかを使用して、トランスジェニックおよび／または遺伝子編集動物におけるＣｒｅ発現の制御は、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡ切除の制御をもたらす。１つの用途は、コンディショナル遺伝子不活性化（コンディショナルノックアウト）のためである。別のアプローチは、タンパク質過剰発現のためのアプローチであり、ｆｌｏｘｅｄ停止コドンは、プロモーター配列と目的のＤＮＡとの間に挿入される。遺伝子編集された動物は、Ｃｒｅが発現されるまで導入遺伝子を発現せず、ｆｌｏｘｅｄ停止コドンの切除につながる。この系は、Ｂリンパ球における組織特異的発癌および制御された抗原受容体発現に適用されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼも開発されている。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Ｃｒｅリコンビナーゼは、元のＣｒｅリコンビナーゼおよび特異的リガンド結合ドメインを含有する融合タンパク質である。Ｃｒｅリコンビナーゼの機能活性は、融合タンパク質中のこの特異的ドメインに結合することができる外部リガンドに依存する。
インビトロ細胞、インビボ細胞、または誘導系の制御下でＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、またはＳＩＧＬＥＣ１遺伝子を含む家畜動物などの遺伝子編集された動物を使用することができる。動物の染色体修飾は、ゲノムまたはモザイクであり得る。誘導系は、例えば、Ｔｅｔ−Ｏｎ、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ、Ｃｒｅ−ｌｏｘ、およびＨｉｆ１αからなる群から選択され得る。
ベクターおよび核酸
ノックアウト目的のため、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、または他の目的のために、様々な核酸を細胞に導入してもよい。本明細書で使用される場合、核酸という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸類似体、ならびに二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）である核酸を含む。核酸類似体は、塩基部分、糖部分、またはリン酸骨格で修飾されて、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解性を改善することができる。塩基部分における修飾は、デオキシチミジンの場合デオキシウリジン、ならびにデオキシシチジンの場合５−メチル−２´−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２´−ドキシシチジンを含む。糖部分の修飾は、リボース糖の２´ヒドロキシルの修飾を含み、２´−Ｏ−メチルまたは２´−Ｏ−アリル糖を形成する。デオキシリボースホスフェート骨格は、モルホリノ核酸を産生するように修飾することができ、各塩基部分は、６員のモルホリノ環またはペプチド核酸に連結され、デオキシリン酸骨格が偽ペプチド骨格に置き換えられ、４つの塩基が保持される。Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｅｒ（１９９７）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．７（３）：１８７、およびＨｙｒｕｐ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４：５を参照されたい。加えて、デオキシリン酸塩骨格は、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、またはアルキルホスホトリエステル骨格と置き換えることができる。
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結され得る。調節領域は、ブタ調節領域であり得るか、または他の種由来であり得る。本明細書で使用される場合、作動可能に連結されるとは、標的核酸の転写を可能にするかまたは容易にするような方法で、核酸配列に対する調節領域の位置付けを指す。
任意のタイプのプロモーターは、標的核酸配列に作動可能に連結され得る。プロモーターの例としては、限定されないが、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、および特定の刺激に応答性または非応答性のプロモーターが挙げられる。好適な組織特異的プロモーターは、β細胞における核酸転写物の優先発現をもたらし得、例えば、ヒトインスリンプロモーターを含む。他の組織特異的プロモーターは、例えば、肝細胞または心臓組織において優先的な発現をもたらし得、それぞれ、アルブミンまたはα−ミオシン重鎖プロモーターを含み得る。有意な組織または時間的特異性を有しない核酸分子の発現を促進するプロモーターを使用することができる（すなわち、構成的プロモーター）。例えば、βアクチンプロモーター、例えば、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニＣＡＧプロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）プロモーター、または３−リン酸グリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ならびにウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを使用することができる。例えば、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとＣＭＶエンハンサーとの融合は、プロモーターとして使用することができる。例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５６３、およびＫｉｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７：８２１を参照されたい。
核酸構築物において有用であり得る追加の調節領域としては、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列（例えば、内部リボソーム侵入セグメント、ＩＲＥＳ）、エンハンサー、誘導性エレメント、またはイントロンが挙げられるが、これらに限定されない。そのような調節領域は、転写、ｍＲＮＡの安定性、翻訳効率などに影響を与えることによって発現を増加させ得るが、必要ではない場合がある。そのような調節領域は、所望に応じて核酸構築物に含まれて、細胞（複数可）における核酸の最適な発現を得ることができる。しかしながら、そのような追加の要素なしに、十分な発現を得ることができる場合がある。
シグナルペプチドまたは選択可能なマーカーをコードする核酸構築物が使用され得る。シグナルペプチドは、コードされたポリペプチドが特定の細胞位置（例えば、細胞表面）に指向されるように使用することができる。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ、Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、ヒグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、およびキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が挙げられる。そのようなマーカーは、培養物中の安定した形質転換体を選択するのに有用である。他の選択可能なマーカーとしては、緑色蛍光タンパク質または黄色蛍光タンパク質などの蛍光ポリペプチドが挙げられる。
選択可能なマーカーをコードする配列は、例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐなどのリコンビナーゼの認識配列に隣接することができる。例えば、選択可能なマーカーを、ｌｏｘＰ認識部位（Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される３４ｂｐ認識部位）またはＦＲＴ認識部位に隣接させて、選択可能なマーカーを構築物から切り出すことができる。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術のレビューについては、Ｏｒｂａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２）８９：６８６１およびＢｒａｎｄ ａｎｄ Ｄｙｍｅｃｋｉ，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ（２００４）６：７を参照されたい。選択可能なマーカー遺伝子によって中断されたＣｒｅまたはＦｌｐ活性化導入遺伝子を含有するトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件付き発現を有する動物を得ることもできる。例えば、マーカー／導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、Ｆ０動物（例えば、ブタ）におけるマーカーのユビキタスまたは組織特異的発現をもたらすであろうユビキタスまたは組織特異的のいずれかであり得る。導入遺伝子の組織特異的活性化は、例えば、マーカー中断導入遺伝子をユビキタスに発現するブタを、組織特異的様式でＣｒｅもしくはＦｌｐを発現するブタに交配することによって、またはマーカー中断導入遺伝子を組織特異的様式で発現するブタを、ＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼをユビキタスに発現するブタに交配することによって達成することができる。導入遺伝子の制御された発現またはマーカーの制御された切除は、導入遺伝子の発現を可能にする。
外因性核酸は、ポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドをコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドの後続の操作を容易にする（例えば、局在化または検出を容易にする）ように設計された「タグ」をコードするタグ配列を含むことができる。タグ配列は、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかに位置するように、ポリペプチドをコードする核酸配列に挿入され得る。符号化タグの非限定的な例としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびＦＬＡＧ（商標）タグ（Ｋｏｄａｋ，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．）が挙げられる。
核酸構築物は、ＳｓｓＩ ＣｐＧメチラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓ．）を使用してメチル化することができる。一般に、核酸構築物は、緩衝液中のＳ−アデノシルメチオニンおよびＳｓｓＩ ＣｐＧ−メチラーゼとともに３７℃でインキュベートすることができる。ハイパーメチル化は、１単位のＨｉｎＰ１Ｉエンドヌクレアーゼで１時間、３７℃でインキュベートし、アガロースゲル電気泳動によってアッセイすることによって確認することができる。
核酸構築物は、様々な技法を使用して、例えば、卵母細胞または卵子などの生殖細胞、前駆細胞、成体幹細胞または胚幹細胞、原始生殖細胞、ＰＫ−１５細胞などの腎臓細胞、島細胞、β細胞、肝臓細胞、または真皮線維芽細胞などの線維芽細胞を含む、任意のタイプの胚細胞、胎児細胞、または成体動物細胞に導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾン系、細胞に感染し得る組み換えウイルス、あるいは細胞に核酸を送達することができるリポソーム、またはエレクトロポレーション、マイクロインジェクション、もしくはリン酸カルシウム沈殿などの他の非ウイルス方法の使用が挙げられる。
トランスポゾン系において、核酸構築物の転写単位、すなわち、外因性核酸配列に作動可能に連結された調節領域は、トランスポゾンの反転反復に隣接している。核酸をマウス、ヒト、およびブタ細胞を含む細胞に導入するために、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（米国特許第６，６１３，７５２号および米国公開第２００５／０００３５４２号を参照）、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ（Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：６８７３）、Ｔｏｌ２（Ｋａｗａｋａｍｉ（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ７、Ｍｉｎｏｓ（Ｐａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ２）、Ｈｓｍａｒ１（Ｍｉｓｋｅｙ ｅｔ ａｌ．（２００７））Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２７：４５８９）、およびＰａｓｓｐｏｒｔを含むいくつかのトランスポゾン系が開発された。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンが特に有用である。トランスポサーゼは、タンパク質として送達することができる、外因性核酸と同じ核酸構築物上でコードすることができる、別個の核酸構築物上に導入することができる、またはｍＲＮＡ（例えば、インビトロで転写され、キャップされたｍＲＮＡ）として提供することができる。
インスレーター配列はまた、外因性核酸の発現を維持し、宿主遺伝子の望ましくない転写を阻害するために、核酸構築物に含まれてもよい。例えば、米国公開第２００４／０２０３１５８号を参照されたい。典型的には、インスレーター配列は、転写ユニットの各側面に隣接し、トランスポゾンの逆方向反復の内部にある。インスレーター配列の非限定的な例としては、マトリックス結合領域（ＭＡＲ）型インスレーター配列およびボーダー型インスレーター配列が挙げられる。例えば、米国特許第６，３９５，５４９号、同第５，７３１，１７８号、同第６，１００，４４８号、および同第５，６１０，０５３号、ならびに米国公開第２００４／０２０３１５８号を参照されたい。
核酸をベクターに組み込むことができる。ベクターは、担体から標的ＤＮＡに移動するように設計された任意の特定のＤＮＡセグメントを含む広義用語である。ベクターは、エピソーム、プラスミド、またはさらにはウイルス／ファージＤＮＡセグメントなどのゲノムまたは他の標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ挿入をもたらすために必要な成分のセットである、発現ベクターまたはベクター系と称され得る。動物における遺伝子送達に使用されるウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、および組み込みファージウイルス）、ならびに非ウイルスベクター（例えば、トランスポゾン）などのベクター系は、２つの基本的成分を有する：１）ＤＮＡ（またはｃＤＮＡに逆転写されるＲＮＡ）で構成されるベクター、ならびに２）トランスポサーゼ、リコンビナーゼ、またはベクターおよびＤＮＡ標的配列の両方を認識し、ベクターを標的ＤＮＡ配列に挿入する他のインテグラーゼ酵素。ベクターは、最も多くの場合、１つ以上の発現制御配列を含む１つ以上の発現カセットを含有し、発現制御配列は、別のＤＮＡ配列またはｍＲＮＡの転写および／または翻訳をそれぞれ制御および調節するＤＮＡ配列である。
多くの異なるタイプのベクターが既知である。例えば、プラスミドおよびウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターは、既知である。哺乳類発現プラスミドは、典型的には、複製起点、好適なプロモーターおよび任意のエンハンサー、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終結配列、ならびに５´隣接非転写配列を有する。ベクターの例としては、プラスミド（別のタイプのベクターの担体であってもよい）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス（例えば、修飾ＨＩＶ−１、ＳＩＶ、またはＦＩＶ）、レトロウイルス（例えば、ＡＳＶ、ＡＬＶ、またはＭｏＭＬＶ）、およびトランスポゾン（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｐ要素、Ｔｏｌ−２、Ｆｒｏｇ Ｐｒｉｎｃｅ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、核酸という用語は、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡ、ならびに天然に存在するおよび化学的に修飾された核酸、例えば、合成塩基または代替骨格を含む、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方を指す。核酸分子は、二本鎖または一本鎖（すなわち、センスまたはアンチセンス一本鎖）であり得る。
ファウンダー動物、動物系統、形質、および生殖
ファウンダー動物は、本明細書に記載されるクローニングおよび他の方法によって産生され得る。ファウンダーは、接合体または初代細胞がホモ接合修飾を受ける場合のように、遺伝子改変のためにホモ接合性であり得る。同様に、ヘテロ接合性であるファウンダーを作製することもできる。ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む動物の場合、ファウンダーは、好ましくはヘテロ接合性である。ファウンダーは、ゲノム修飾されてもよく、つまり、ゲノム内のすべての細胞が修飾を受けていることを意味する。ファウンダーは、典型的には胚盤胞段階で、ベクターが胚内の複数の細胞のうちの１つに導入されるときに起こり得るように、修飾のためのモザイクであり得る。モザイク動物の子孫を試験して、ゲノム修飾された子孫を同定してもよい。動物系統は、修飾を一貫して発現する異種またはホモ接合子孫を有する、性的にまたは補助生殖技法によって再現することができる動物のプールが作成されたときに確立される。
家畜において、多くのアレルは、生産形質、体型形質、作業性形質、および他の機能性形質などの様々な形質に関連付けられることが既知である。熟練者は、これらの形質をモニターし、定量化することに慣れている。例えば、Ｖｉｓｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，４０（１９９４）１２３−１３７、米国特許第７，７０９，２０６号、ＵＳ２００１／００１６３１５、ＵＳ２０１１／００２３１４０、およびＵＳ２００５／０１５３３１７。動物系統は、生産形質、体型形質、作業性形質、繁殖形質、母性形質、および疾患抵抗性形質からなる群の形質から選択される形質を含み得る。さらなる形質としては、組み換え遺伝子産物の発現が挙げられる。
所望の形質（複数可）を有する動物は、それらの性成熟を防止するように修飾され得る。動物は成熟するまで無菌であるため、動物の発散を制御する手段として性成熟を調節することが可能である。したがって、１つ以上の形質を有するように繁殖または修飾された動物は、レシピエントが動物を繁殖させ、その形質の価値を自身に充当するリスクを低減したレシピエントに提供することができる。例えば、動物のゲノムを修飾することができ、修飾は、性成熟遺伝子の不活性化を含み、野生型動物における性成熟遺伝子は、性成熟に対して選択的な因子を発現する。動物は、化合物を投与して、遺伝子の発現の喪失によって引き起こされる欠損を修復して、動物における性成熟を誘導することによって治療することができる。
性成熟を誘導するために化合物の投与を必要とする動物の繁殖は、治療施設で有利に達成され得る。処置施設は、一貫した動物を効率的に産生するために、十分に制御されたストックに対して標準化されたプロトコルを実装することができる。動物の子孫は、飼育される複数の位置に分散され得る。したがって、農場および農家（牧場および牧場主を含む用語）は、特定の範囲の年齢および／または重量および／または形質を有する所望の数の子孫を注文し、所望の時間および／または場所にそれらを送達させることができる。レシピエント、例えば、農家は、次いで、動物を飼育し、それらを所望に応じて市場に送達することができる。
不活性化性成熟遺伝子を有する遺伝子編集された家畜動物は、（例えば、１つ以上の位置に、複数の農場に）送達することができる。動物は、約１日〜約１８０日の間の年齢を有することができる。動物は、１つ以上の形質（例えば、所望の形質もしくは高値形質もしくは新規形質もしくは組み換え形質を発現する形質）を有することができる。
本発明を詳細に説明した後、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、修飾および変形が可能であることが明らかであろう。
本発明をさらに例示するために、以下の非限定的な実施例が提供される。
実施例１〜３は、それらのＣＤ１６３遺伝子に修飾染色体配列を有するブタの生成、およびそのようなブタのＰＲＲＳＶ感染に対する抵抗性を説明する。実施例４は、ＳＩＧＬＥＣ１ノックアウトブタの生成を説明する。実施例５および６は、それらのＡＮＰＥＰ遺伝子に修飾染色体配列を有するブタの生成、ならびにそのようなブタのＴＧＥＶに対する抵抗性を説明する。実施例７は、ＣＤ１６３、ＳＩＧＬＥＣ１、およびＡＮＰＥＰから選択される少なくとも２つの遺伝子における染色体修飾のためにヘテロ接合性のブタの生成を説明する。実施例８は、実施例７で生成されたブタが、ＣＤ１６３、ＳＩＧＬＥＣ１、およびＡＮＰＥＰから選択される少なくとも２つの遺伝子において染色体修飾に対してホモ接合性の動物を生成するためにどのように使用されるか、ならびにそのような動物が、ＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶに対する抵抗性についてどのように試験されるかを説明する。
実施例１：インビトロ由来卵母細胞および胚から遺伝子操作されたブタを産生するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ９）系内の成分などのホーミングエンドヌクレアーゼを説明する最近の報告は、ブタにおける遺伝子操作（ＧＥ）が現在、より効率的であり得ることを示唆している。標的ホーミングエンドヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置で二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導し得、ドナーＤＮＡが提供される場合、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるランダム突然変異または相同組み換え（ＨＲ）の刺激のいずれかを引き起こすことができる。ＨＲを介したゲノムの標的修飾は、ドナーＤＮＡが標的化ヌクレアーゼとともに提供される場合、ホーミングエンドヌクレアーゼで達成することができる。体細胞に特定の修飾を導入した後、これらの細胞を使用して、ＳＣＮＴを介して様々な目的のＧＥブタを産生した。したがって、ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＧＥブタを生成する際に有用なツールである。異なるホーミングエンドヌクレアーゼの中で、それが防御機構として使用される原核生物から適合されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系は、有効なアプローチであるように見える。自然において、Ｃａｓ９系は、３つの成分、標的配列に相補的な領域（シス抑制ＲＮＡ［ｃｒＲＮＡ］）、ｃｒＲＮＡに相補的な領域（トランス活性化ｃｒＲＮＡ［ｔｒａｃｒＲＮＡ］）を含有するＲＮＡ、およびこの複合体中の酵素タンパク質成分Ｃａｓ９を含有するＲＮＡ（約２０塩基）を必要とする。単一のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を構築して、塩基対のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの役割を果たすことができる。ｇＲＮＡ／タンパク質複合体は、ゲノムを走査し、ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡに相補的な領域でＤＳＢを触媒することができる。他の設計ヌクレアーゼとは異なり、目的の遺伝子を標的とするために必要な試薬を構築するように短いオリゴマーのみを設計する必要がある一方で、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮを組み立てるために一連のクローニングステップが必要である。
遺伝子破壊のための現在の標準的な方法とは異なり、設計されたヌクレアーゼの使用は、ＧＥの出発物質として接合体を使用する機会を提供する。家畜における遺伝子破壊のための標準的な方法は、培養細胞におけるＨＲ、およびその後の体細胞核移入（ＳＣＮＴ）による胚の再構築を伴う。ＳＣＮＴを介して産生されたクローン動物は、発達不良の兆候を示すことがあるため、ＳＣＮＴ／ＧＥファウンダーの子孫は、典型的には、ファウンダー動物が実験に使用された場合に生じる可能性のある混乱するＳＣＮＴ異常および表現型を避けるために研究に使用される。齧歯類と比較して妊娠期間が長く、ブタの住居コストが高くなることを考慮すると、繁殖の必要性が低減するために時間とコストのメリットがある。最近の報告書は、ブタ接合体へのＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの直接注入が、内因性遺伝子を破壊し、所望の突然変異を有する子ブタを産生する可能性があることを実証した。しかしながら、約１０％の子ブタのみが、標的遺伝子の両アレル修飾を示し、一部の子ブタは、モザイク遺伝子型を呈した。最近の記事は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が、発生中の胚における突然変異を誘発し、ＺＦＮまたはＴＡＬＥＮよりも高い効率でＧＥブタを産生することができることを実証した。しかしながら、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系から産生されたＧＥブタは、モザイク遺伝子型も有した。加えて、上記の研究はすべて、実験のためにインビボ由来の接合体を使用し、これは十分な数の接合体を得るために労働集約および多数の経産ブタを必要とする。
本実施例は、インビトロ由来の接合体の注入および体細胞の修飾に続くＳＣＮＴの両方を介してＧＥブタを生成する際にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用するための効率的なアプローチを説明する。２つの内因性遺伝子（ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ）および１つの導入遺伝子（ｅＧＦＰ）を標的とし、それぞれＳＣＮＴまたはＲＮＡ注入にはインビトロ由来の卵母細胞または接合体のみを使用した。ＣＤ１６３は、ブタ産業に著しい経済損失をもたらすことが既知であるウイルスである、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスによる生産的感染に必要であると思われる。ＣＤ１Ｄは、非古典的な主要組織適合性複合体タンパク質と見なされ、不変のナュラルキラーＴ細胞への脂質抗原の提示に関与する。これらの遺伝子を欠くブタは、農業および生物医学のモデルとなるように設計された。ｅＧＦＰ導入遺伝子を、事前の概念実証および方法の最適化の標的として使用した。
材料および方法
化学物質および試薬。別段の記載がない限り、本研究で使用される化学物質はすべて、Ｓｉｇｍａから購入された。
特定のＣＲＩＳＰＲを構築するためのｇＲＮＡの設計
ガイドＲＮＡを、野生型ＣＤ１６３に固有であり、ドメインスワップ標的化ベクター（後述）中に存在しないＣＤ１６３のエクソン７内の領域に対して設計し、それによりＣＲＩＳＰＲは、野生型ＣＤ１６３内でＤＳＢをもたらすが、ドメインスワップ標的化ベクター中ではＤＳＢをもたらさない。標的化ベクターが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐｙ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を改変する単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を導入する４つの場所のみが存在した。以下を含む４つの標的すべてを選択した：
Figure 2021521844
 ＰＡＭは、各ｇＲＮＡにおける太字フォントによって同定することができる。
ＣＤ１Ｄ突然変異について、ＣＲＩＳＰＲ標的の検索は、一次転写物の最初の１０００ｂｐ以内のコード鎖に任意に限定された。しかしながら、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ［２６］（「Ｐｉｇ」反復ライブラリ）は、一次転写物の塩基９４３から始まる反復要素を同定した。次いで、ＣＲＩＳＰＲ標的の検索は、一次転写物の最初の９４２ｂｐに限定された。最後のＳｐｙ ＰＡＭが塩基８７３に位置するため、検索は、一次転写物の最初の８７３ｂｐにさらに限定された。第１の標的（ＣＲＩＳＰＲ４８００）は、それが、一次転写物（
Figure 2021521844
 （配列番号５））中の塩基４２に位置する開始コドンと重複するために選択された。任意に選択された領域（
Figure 2021521844
 （配列番号６）および
Figure 2021521844
 （配列番号７））内の第１の選択に対して最も遠位であったため、２つの追加の標的（ＣＲＩＳＰＲ５６２０および５６２６）を選択した。これらの標的は重複する。開始コドンに関連して、最も近位のＳｐｙ ＰＡＭは、視覚的評価によって決定されるように、広範囲にホモポリマー配列を含有する単純な配列に位置した。第４の標的（ＣＲＩＳＰＲ５３５０）を選択したのは、第１の標的選択と関連して、広範なホモポリマー領域（
Figure 2021521844
 （配列番号８））を含有しない最も近位の標的であったためである。設計されたｃｒＲＮＡの特異性は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて類似のブタ配列を検索することによって確認された。オリゴヌクレオチド（表２）をアニールし、２つの発現カセット、ヒトコドン最適化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｈＳｐｙ）Ｃａｓ９、およびキメラガイドＲＮＡを含有するｐ３３０Ｘベクターにクローニングした。Ｐ３３０Ｘを、ＢｂｓＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で、Ｚｈａｎｇ実験プロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｚｈａｎｇ／）に従って消化した。
ｅＧＦＰを標的とするために、ｅＧＦＰコード配列を標的とする２つの特異的ｇＲＮＡを、ｅＧＦＰ開始コドンの最初の６０ｂｐ内で設計した。ｅＧＦＰ１およびｅＧＦＰ２ ｇＲＮＡの両方が、アンチセンス鎖上にあり、ｅＧＦＰ１は、開始コドンを直接標的とした。ｅＧＦＰ１ ｇＲＮＡ配列は、
Figure 2021521844
 （配列番号９）であり、ｅＧＦＰ２ ｇＲＮＡ配列は、
Figure 2021521844
 （配列番号１０）であった。
Figure 2021521844
ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ遺伝子のドナーＤＮＡの合成
ブタＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの両方を、後のトランスフェクションのために使用されるであろう胎児線維芽細胞から単離されたＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、標的化ベクターとトランスフェクションされた細胞株との間の同種適合を確実にした。簡潔には、順方向プライマーＣＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＣＴＴ（配列番号１１）および逆方向プライマーＴＡＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＴＧＧＣＣＡＧＴＣ（配列番号１２）を使用するＬＡ Ｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ＣＤ１６３の９５３８ｂｐ断片を増幅した。断片をＤＮＡ配列で検証し、ドメインスワップ標的化ベクターを構築するために使用した（図１）。このベクターは、エクソン１１由来のヒトＣＤ１６３Ｌと同じアミノ酸配列をコードするように、エクソン７内に３３個の点突然変異を含んでいた。置換エクソンは、３１５ｂｐであった。加えて、後続のイントロンを、Ｃｒｅ−リコンビナーゼ（Ｃｒｅ）で除去することができ、保持されたｌｏｘＰ部位を内包するときに以前に正常なスプライシングを実証した選択可能なマーカー遺伝子を収容した修飾ミオスタチンイントロンＢで置き換えた（Ｗｅｌｌｓ、未発表の結果）。構築物の長アームは、３４６９ｂｐであり、ドメインスワップＤＳエクソンを含んでいた。短アームは、１５７８ｂｐであり、エクソン７および８を含んでいた（図１、パネルＢ）。このプラスミドを使用して、第１のトランスフェクション実験におけるエクソン７のコード領域の置き換えを試み、選択可能なマーカー（Ｇ４１８）を介した標的化事象の選択を可能にした。標的化が生じる場合、Ｃｒｅ−リコンビナーゼによりマーカーを欠失させることができる。次いで、ＣＤ１６３ ＤＳ標的化ベクターを、Ｃｒｅ欠失できないＮｅｏで破壊されたＳＩＧＬＥＣ１遺伝子を既に含有する細胞株とともに使用するように修飾した。この標的化ベクターでは、Ｎｅｏカセット、ｌｏｘＰおよびミオスタチンイントロンＢを除去し、ＤＳエクソンのみをＷＴ長および短アームで残した（図１、パネルＣ）。
ブタＣＤ１Ｄのゲノム配列を、順方向プライマーＣＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＣＴＴ（配列番号１３）および逆方向プライマーＧＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＡ（配列番号１４）を使用してＬＡタグで増幅し、８７２９ｂｐ断片を得た。断片をＤＮＡ配列決定し、図２に示される標的化ベクターを構築するために使用した。Ｎｅｏカセットは、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にあり、選択のために導入されたｌｏｘＰ配列に隣接している。構築物の長アームは４８３２ｂｐであり、短アームは３５６３ｂｐであり、エクソン６および７を含んでいた。成功したＨＲが発生した場合、エクソン３、４、および５が除去され、Ｎｅｏカセットに置き換えられる。ＮＨＥＪ修復が誤って発生した場合、エクソン３は中断される。
胎児線維芽細胞収集
ブタ胎児組織を妊娠３５日目に収集して、細胞株を作成した。大きな白色家畜雑種から、２つの野生型（ＷＴ）雄および雌胎児線維芽細胞株を確立した。これらの研究には、Ｎｅｏカセット（ＳＩＧＬＥＣ１−／−遺伝子）を含有するように以前に修飾された雄および雌胎児線維芽細胞も使用した。胎児線維芽細胞を、わずかな修飾を加えて記載のとおりに収集し、各胎児からの組織ミンチを、２０ｍＬの消化培地（２００単位／ｍＬのコラーゲナーゼおよび２５Ｋｕｎｉｔｚ単位／ｍＬのＤＮＡｓｅＩが補充された、Ｌ−グルタミンおよび１ｇ／ＬのＤ−グルコース［Ｃｅｌｌｇｒｏ］を含有するダルベッコ改変イーグル培地［ＤＭＥＭ］）中、３８．５℃で５時間消化した。消化後、胎児線維芽細胞を洗浄し、ＤＭＥＭ、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および４０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンで培養した。一晩培養後、細胞をトリプシン処理し、１０％ジメチルスルホキシドでＦＢＳ中のアリコート中−８０℃で凍結して、液体窒素中に保存した。
細胞トランスフェクションおよび遺伝子型決定
トランスフェクション条件は、実質的に、以前に報告されたとおりであった。ドナーＤＮＡを、常に１μｇの一定量で、様々な量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミド（以下に列挙する）とともに使用した。トランスフェクションの前に、ドナーＤＮＡをＭＬＵＩ（ＣＤ１６３）（ＮＥＢ）またはＡＦＬＩＩ（ＣＤ１Ｄ）（ＮＥＢ）で直鎖状にした。確立された細胞株の性別は、トランスフェクションの前に先に記載されたＰＣＲによって決定した。雄細胞株および雌細胞株の両方をトランスフェクトし、トランスフェクション間で一緒にゲノム修飾データを分析した。同様の継代数（２〜４）の胎児線維芽細胞株を２日間培養し、１５％のＦＢＳ、２．５ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子、および１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンが補充された、Ｌ−グルタミンおよび１ｇ／ＬのＤ−グルコース（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含有するＤＭＥＭ中で７５％〜８５％の培養密度に成長させた。線維芽細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、トリプシン化した。細胞が分離するとすぐに、細胞をエレクトロポレーション培地（７５％細胞塩［１２０ｍＭのＫＣｌ、０．１５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．６、５ＭｍのＭｇＣｌ２］）および２５％のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗い流した。細胞濃度は、血球測定器を使用して定量化した。細胞を６００×ｇで５分間ペレット化し、１×１０６の濃度でエレクトロポレーション培地に再懸濁した。各エレクトロポレーションは、２５０ＶでＢＴＸ ＥＣＭ２００１を通じて投与される３つの（１ミリ秒）矩形波パルスを有する２ｍｍギャップキュベット中の２００μＬの細胞を使用した。エレクトロポレーション後、細胞を上述のＤＭＥＭ中に再懸濁した。選択のために、トランスフェクションの２４時間後に６００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、培地を７日目に変更した。トランスフェクション後、１４日目にコロニーを採取した。Ｇ４１８選択を使用した場合、胎児線維芽細胞を１０，０００細胞／プレートで、Ｇ４１８選択を使用しなかった場合、５０細胞／プレートで播種した。胎児線維芽細胞コロニーを、オートクレーブ真空グリースによって各コロニーの周囲に密封された１０ｍｍのオートクレーブクローニングシリンダーを適用することによって収集した。コロニーをＰＢＳで洗い流し、トリプシンを介して収穫し、次いでＤＭＥＭ培養培地に再懸濁した。再懸濁したコロニーの一部（１／３）を９６ウェルＰＣＲプレートに移し、残りの（２／３）細胞を２４ウェルプレートのウェル内で培養した。細胞ペレットを６μＬの溶解緩衝液（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．９、０．９％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ［ＮＥＢ］）に再懸濁し、細胞溶解のために６５℃で３０分間インキュベートし、続いて８５℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化した。
ＤＳならびに大小の欠失についてのＰＣＲスクリーニング
ＨＲ指向性修復の検出。ロングレンジＰＣＲを使用して、ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄのいずれかの突然変異を同定した。３つの異なるＰＣＲアッセイを使用して、ＨＲ事象を同定した。ドナーＤＮＡ内のＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄ配列から右側または左側の内因性ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄ配列に及ぶ領域のＰＣＲ増幅、ならびに設計されたドナーＤＮＡを包含するＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄの大領域を増幅したロングレンジＰＣＲ。外因性Ｎｅｏ配列の付加から生じる、１．８ｋｂ（ＣＤ１Ｄ）または３．５ｋｂ（ＣＤ１６３）のいずれかのＰＣＲ生成物のサイズの増加は、遺伝子のＨＲ指向性修復の証拠とみなされた。すべてのＰＣＲ条件には、９５℃で２分間の初期変性、続いて９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および６８℃で７〜１０分の３３サイクルが含まれた。製造者の推奨に従って、すべてのアッセイにＬＡ ｔａｑを使用した。プライマーを表３に示す。
Figure 2021521844
小欠失アッセイ（ＮＨＥＪ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって導入された突出切断部位に隣接するＣＤ１６３またはＣＤ１ＤのＰＣＲ増幅によって、小さな欠失を決定した。アンプリコンのサイズは、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄについてそれぞれ４３５ｂｐおよび１２４４ｂｐであった。胚および胎児線維芽細胞の両方からの溶解物を、ＬＡ ｔａｑでＰＣＲ増幅した。アッセイのＰＣＲ条件は、９５℃で２分間の初期変性、続いて９４℃で３０秒、５６℃で３０秒、および７２℃で１分の３３サイクルであった。トランスフェクト細胞の遺伝子型決定のために、アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲアンプリコンを分離することによって、挿入および欠失（ＩＮＤＥＬ）を同定した。胚遺伝子型決定のために、結果として生じるＰＣＲ生成物をその後、ＰＣＲで使用される順方向プライマーを使用して小欠失を同定するためにＤＮＡ配列決定した。プライマー情報を表４に示す。
Figure 2021521844
体細胞核移入（ＳＣＮＴ）
ＳＣＮＴ胚を産生するために、地域の屠場からの経産ブタ由来卵母細胞（ＡＲＴ，Ｉｎｃ．）または未経産ブタ由来卵母細胞のいずれかを使用した。経産ブタ由来卵母細胞を、成熟培地（２．９ｍＭのＨｅｐｅｓ、５μｇ／ｍＬのインスリン、１０ｎｇ／ｍＬの表皮成長因子［ＥＧＦ］、０．５μｇ／ｍＬのブタ卵胞刺激ホルモン［ｐ−ＦＳＨ］、０．９１ｍＭのピルビン酸塩、０．５ｍＭのシステイン、１０％のブタ卵胞液、および２５ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むＴＣＭ−１９９）中で一晩出荷し、２４時間後に新鮮な培地に移した。４０〜４２時間の成熟後、卵丘細胞を、０．１％ヒアルロニダーゼの存在下でボルテックスすることによって卵母細胞から除去した。インビトロ受精（ＩＶＦ）のために、以下に記載されるように、未経産ブタ由来卵母細胞を成熟させた。操作中、卵母細胞を、７．０μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢが補充された操作培地（０．６ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭのＨｅｐｅｓ、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＴＣＭ−１９９［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］（浸透圧濃度３０５ｍＯｓｍ））中に配置した。おそらく第２分裂中期プレートを含有する隣接細胞質の一部分とともに極性体を除去し、ドナー細胞を薄いガラス毛細管を使用してペリビテリン空間内に配置した。次いで、再構築された胚を、ＢＴＸ電気細胞マニピュレータ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、１．２ｋＶ／ｃｍの２つのＤＣパルス（１秒間隔）で３０秒間、融合培地（０．３Ｍのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭのＨｅｐｅｓ）中で融合させた。融合後、融合胚を２００μＭのチメロサールで１０分間暗闇で、および８ｍＭのジチオスレイトールで３０分間完全に活性化した。次いで、前述のように、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である０．５μＭのＳｃｒｉｐｔａｉｄ（Ｓ７８１７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、胚を修飾ブタ接合培地ＰＺＭ３−ＭＵ１中で１４〜１６時間インキュベートした。
体外受精（ＩＶＦ）
ＩＶＦについては、思春期前の未経産ブタ由来の卵巣を屠場（Ｆａｒｍｌａｎｄ Ｆｏｏｄｓ Ｉｎｃ．）から得た。１０ｍＬのシリンジに取り付けられた１８ゲージの皮下針を使用して、中サイズ（３〜６ｍｍ）の卵胞から未成熟卵母細胞を吸引した。次いで、均等に暗い細胞質を有する卵母細胞および無傷の周囲の卵丘細胞を、成熟のために選択した。約５０個の卵丘卵母細胞複合体を、加湿空気中、３．０５ｍＭのグルコース、０．９１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５７ｍＭのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．５μｇ／ｍＬの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、０．５μｇ／ｍＬのＦＳＨ、１０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍ）、および０．１％のポリビニルアルコールを含む、５００μＬの成熟培地、ＴＣＭ−１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するウェル中に４２〜４４時間、３８．５℃、５％のＣＯ２で配置した。成熟の終わりに、０．１％のヒアルロニダーゼの存在下で３分間ボルテックスすることによって、周囲の卵丘細胞を卵母細胞から除去した。次いで、インビトロで成熟した卵母細胞を、２５〜３０個の卵母細胞群のＩＶＦ培地（１１３．１ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、７．５ｍＭのＣａＣｌ２、１１ｍＭのグルコース、２０ｍＭのトリス、２ｍＭのカフェイン、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］を含有する修飾トリス緩衝培地）の５０μＬ液滴に入れた。１００μＬの冷凍精液ペレットを、０．１％のＢＳＡが補充された３ｍＬのダルベッコＰＢＳ中で解凍した。冷凍ＷＴまたは新鮮なｅＧＦＰ精液のいずれかを、６０％のＰｅｒｃｏｌｌ中で２０分間、６５０３ｇで洗浄し、遠心分離によって１０分間修飾トリス緩衝培地中で洗浄した。いくつかの場合において、以前に記載されたｅＧＦＰ導入遺伝子のために採取したばかりのヘテロ接合精液を、ＰＢＳ中で３回洗浄した。次いで、精液ペレットをＩＶＦ培地で０．５×１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。５０マイクロリットルの精液懸濁液を、卵母細胞を有する液滴に導入した。配偶子を、空気中の５％のＣＯ２の雰囲気中３８．５℃で５時間、共インキュベートした。受精後、胚をＰＺＭ３−ＭＵ１中３８．５℃および空気中５％のＣＯ２でインキュベートした。
胚移入
ＧＥ ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄブタを産生するために生成された胚を、最初の発情後の１日目（ＳＣＮＴ）または６日目（接合体注入）のいずれかで代理母に移入した。６日目の移入について、接合体を、１０ｎｇ／ｍＬのｐｓ４８（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．）の存在下でＰＺＭ３−ＭＵ１中でさらに５日間培養した。胚を、代理母の卵管の膨大部−狭部接合部に外科的に移入した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のＲＮＡのインビトロ合成
インビトロ転写のためのテンプレートＤＮＡを、ＰＣＲを使用して増幅した（表５）。細胞トランスフェクション実験に使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドは、ＰＣＲのテンプレートとして機能した。接合体においてＣａｓ９を発現させるために、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ Ｕｌｔｒａキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用してＣａｓ９のｍＲＮＡを産生した。次いで、ポリ（Ａ）テーリングキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、ポリＡシグナルをＣａｓ９ ｍＲＮＡに添加した。ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ）によって産生した。合成されたＲＮＡの品質を１．５％アガロースゲル上で可視化し、次いで１０ｎｇ／μＬの最終濃度（ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方）まで希釈し、３μＬのアリコートに分配した。
Figure 2021521844
接合体における設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のマイクロインジェクション
Ｃａｓ９およびｇＲＮＡをコードするメッセンジャーＲＮＡを、ＦｅｍｔｏＪｅｔマイクロインジェクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を使用して、受精後１４時間の受精した卵母細胞の細胞質（推定接合体）に注入した。Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の加熱したステージ上の操作培地でマイクロインジェクションを実施した。次いで、注入した接合体を、さらなる使用まで１０ｎｇ／ｍＬのｐｓ４８でＰＺＭ３−ＭＵ１に移した。
統計解析
修飾ゲノムを有するコロニーの数を１として分類し、ゲノムの修飾のないコロニーを０として分類した。Ｐ値０．０５が有意であると見なされるＰＲＯＣ ＧＬＭ（ＳＡＳ）を使用することによって、差異を決定した。平均を最小二乗平均として計算した。データは、数値平均±ＳＥＭとして提示される。
結果
体細胞におけるＣＤ１６３およびＣＤ１ＤのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウト
ＣＤ１６３を標的とする４つの異なるＣＲＩＳＰＲプラスミド（ガイド１０、１３１、２５６、および２８２）の効率を、２μｇ／μＬのドナーＤＮＡの量で試験した（表６）。ＣＲＩＳＰＲ２８２は、ＣＲＩＳＰＲ１０および２５６処置よりも有意に多くの平均コロニー形成をもたらした（Ｐ＜０．０５）。上記のロングレンジＰＣＲアッセイから、当初意図されていたとおりのＤＳ〜ＨＲの代わりに、５０３ｂｐ〜最大１５０６ｂｐの範囲の大きな欠失が見出された（図３、パネルＡ）。これは、他のＤＮＡ編集系を用いた以前の報告では、ブタにおいてＺＦＮを使用して６〜３３３ｂｐのはるかに小さな欠失を示したため、予想されなかった。ＣＲＩＳＰＲ１０および４つすべてのＣＲＩＳＰＲの混合物は、ＣＲＩＳＰＲ２５６および２８２よりも修飾ゲノムを有するコロニーの数が多かった（表６、Ｐ＜０．００２）。ＣＲＩＳＰＲ１０およびＮｅｏを含有するがＣＤ１６３と相同性がないプラスミドによるトランスフェクションは、大きな欠失を提示するコロニーをもたらさなかった。興味深いことに、ドナーＤＮＡをいかなるＣＲＩＳＰＲも伴わずに導入したときに、１つのモノアレル欠失も検出された。このアッセイは、トランスフェクトされた体細胞内のアガロースゲル上で検出できなかった配列決定による任意の潜在的な小さな欠失がスクリーニングされなかったため、突然変異速度の過小評価を表す可能性が高い。
Figure 2021521844
最初の目標は、ＣＤ１６３のＨＲによるドメインスワップ（ＤＳ）標的化イベントを得ることであったが、ＣＲＩＳＰＲは、ＣＤ１６３を標的化する効率を増加させなかった。この標的化ベクターの種々の組み合わせは、従来のトランスフェクションによってＨＲによりＣＤ１６３を修飾するために使用されており、３３９９コロニーをスクリーニングした後に標的化事象をもたらさなかったことに留意されたい（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｐｒａｔｈｅｒ、非公開結果）。ＣＲＩＳＰＲ１０およびＤＳ標的化ベクターをドナーＤＮＡとしてトランスフェクションすることによって導入しようとした３３個すべての突然変異を含有するＨＲから生じる完全ＤＳを用いて、２匹のブタを得た。
次に、薬物選択なしのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘発突然変異の効率を試験した。本研究で使用される胎児線維芽細胞株は、Ｎｅｏ抵抗性カセットの組み込みおよびＳＩＧＬＥＣ１のノックアウトを既に有していた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９とドナーＤＮＡの比率が、ゲノム修飾を増加させるか、または高濃度で毒性効果をもたらすかどうかも試験した。前の実験では、それが多数の総コロニーおよび修飾ゲノムを有するコロニーのパーセンテージの増加をもたらしたため、この試験のためにＣＲＩＳＰＲ１３１を選択した。ＣＲＩＳＰＲ１３１ ＤＮＡの量を３：１から２０：１に増加させることは、胎児線維芽細胞生存率に有意な影響を及ぼさなかった。ＮＨＥＪによって修飾されたゲノムを有するコロニーのパーセントは、様々なＣＲＩＳＰＲ濃度間で有意差はなかったが、１０：１の比率で最も多くのＮＨＥＪを有した（表７、Ｐ＝０．３３）。ドナーＤＮＡに対するＣＲＩＳＰＲ ＤＮＡの最も高い比率（２０：１）であっても、ＨＲは観察されなかった。
Figure 2021521844
 この経験に基づいて、体細胞におけるＣＤ１Ｄの標的破壊が試みられた。４つの異なるＣＲＩＳＰＲを設計し、雄細胞および雌細胞の両方において試験した。ＣＤ１Ｄの修飾は、適用されたＣＲＩＳＰＲのうちの３つから検出することができるが、ＣＲＩＳＰＲ５３５０の使用は、アガロースゲル電気泳動によって検出するのに十分な大きさの欠失を有するＣＤ１Ｄの修飾をもたらさなかった（表８）。興味深いことに、ドナーＤＮＡが提供されたが、ＨＲを通じて遺伝的変化は得られなかった。しかしながら、ＣＤ１６３ノックアウト実験と同様の大きな欠失が観察された（図３、パネルＢ）。ドナーＤＮＡとともにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用しなかった場合、大きな欠失を伴うＣＤ１Ｄの標的修飾は検出されなかった。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９誘導標的化からのＣＤ１Ｄの修飾は、細胞の雄コロニーおよび雌コロニーにおいてそれぞれ４／１２１および３／２８であった。トランスフェクションデータには、アガロースゲル電気泳動によって検出可能なＩＮＤＥＬのみが含まれた。
Figure 2021521844
ＧＥ細胞を使用したＳＣＮＴによるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄブタの産生
ＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄの修飾を提示する細胞をＳＣＮＴに使用して、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄノックアウトブタを産生した（図３）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系でトランスフェクトした雄および雌胎児線維芽細胞からのＳＣＮＴ胚を用いて、７回の胚移入（ＣＤ１６３ 表９）、６回の胚移入（ＣＤ１６３−Ｎｅｏなし）、および５回の胚移入（ＣＤ１Ｄ）をレシピエント未経産ブタに実施した。レシピエント未経産ブタのうち６匹（ＣＤ１６３）、２匹（ＣＤ１６３−Ｎｅｏなし）、および４匹（ＣＤ１Ｄ）（表１０）は、期間まで妊娠したままであり、妊娠率は８５．７％であった。それぞれ３３．３％および８０％である。ＣＤ１６３レシピエントのうち、５匹は帝王切開で健康な子ブタを分娩した。１匹（Ｏ０４４）は、自然に分娩した。同腹子の大きさは、１〜８であった。生後成長障害のため、４匹のブタを安楽死させた。重篤な口蓋裂のため、１匹の子ブタを安楽死させた。残りのすべての子ブタは、健康に見える（図３、パネルＣ）。図３、パネルＢに記載されるＣＲＩＳＰＲ１０およびドナーＤＮＡでトランスフェクトした胎児線維芽細胞から得られた雄子ブタの２同腹子は、ＣＲＩＳＰＲ１０に隣接するエクソン７において３０ｂｐの欠失、および前のイントロンの追加の１４７６ｂｐの欠失を有し、したがって、ＣＤ１６３のイントロン６／エクソン７接合部を除去した（図３、パネルＥ）。遺伝子型および予測される翻訳を表１１に要約する。以前に修飾されたＳＩＧＬＥＣ１細胞のＣＤ１６３−Ｎｅｏなしトランスフェクションから１匹の雄子ブタおよび１匹の雌同腹子（４匹の子ブタ）を得た。ＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３については、５匹すべての子ブタをダブルノックアウトした。雄子ブタは、ＣＤ１６３の両アレル修飾を有し、一方のアレル上のエクソン７に２８ｂｐの欠失、およびエクソン７の部分欠失ならびにエクソン８の完全欠失を含む他方のアレルおよび進行するイントロン上に１３８７ｂｐの欠失を有したため、イントロンエクソン接合部を除去した。雌子ブタは、一方のアレル上に１１ｂｐの挿入を伴う１３８２ｂｐの欠失および他方のアレル上に１７２０ｂｐのＣＤ１６３の欠失を含む、ＣＤ１６３の両アレル突然変異を有した。ＣＤ１６３修飾および予測翻訳の要約は、表１１に見出すことができる。ＣＲＩＳＰＲ修飾によるＣＤ１Ｄ修飾および予測翻訳の要約は、表１２に見出すことができる。簡潔に述べると、１匹の雌および２匹の雄同腹子が生まれ、１３匹の子ブタが生まれた。一匹の子ブタは、生後すぐに死亡した。１３匹の子ブタのうちの１２匹は、ＣＤ１Ｄの両アレル欠失またはホモ接合欠失のいずれかを含有した（図３、パネルＦ）。１匹の子ブタは、ＷＴであった。
Figure 2021521844
Figure 2021521844
Figure 2021521844
Figure 2021521844
Figure 2021521844
ブタ接合体におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の効率
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用した体細胞におけるＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの標的破壊に基づいて、このアプローチをブタ胚発生に適用した。まず、発生中の胚におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の有効性を試験した。ｅＧＦＰを標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、ｅＧＦＰ導入遺伝子に対してヘテロ接合性の雄ブタ由来の精液で受精した接合体に導入した。注入後、ｅＧＦＰを発現する後続の胚をモニターした。様々な濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を試験し、送達されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の細胞毒性を観察した（図４、パネルＡ）；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入後の胚発生は、対照と比較して低かった。しかしながら、検査したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のすべての濃度は、ｅＧＦＰ発現を有する胚がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入群において見出されなかったため、ｅＧＦＰの修飾の生成に有効であった（図４、パネルＢ）；非注入対照胚のうち、６７．７％は緑色であり、ｅＧＦＰの発現を示した。個々の胚盤胞を遺伝子型決定した場合、ＣＲＩＳＰＲ結合部位付近の小さな突然変異を同定することが可能であった（図４、パネルＣ）。毒性および有効性に基づいて、１０ｎｇ／μＬのｇＲＮＡおよびＣａｓ９ ｍＲＮＡを以下の実験に使用した。
ＣＤ１６３を標的とするように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を推定接合体に導入したところ、後続の胚盤胞における遺伝子の標的編集が観察された。ＣＤ１６３の突然変異について個々の胚盤胞を遺伝子型決定したところ、すべての胚に特異的な突然変異が認められた（１００％ＧＥ効率）。より重要なことに、ホモ接合または両アレル修飾で胚が見出され得る一方で（それぞれ８／１８および３／１８）（図５）、モザイク（単一アレル修飾）遺伝子型も検出された（４／１８胚）。プールからのいくつかの胚（８／１０）に、２ｎｇ／μＬのＣａｓ９および１０ｎｇ／μＬのＣＲＩＳＰＲを注入し、突然変異誘発の効率に差は見出されなかった。次に、インビトロ結果に基づいて、異なるｇＲＮＡを表す２つのＣＲＩＳＰＲを導入して、胚発生中にＣＤ１６３またはＣＤ１Ｄを破壊し、標的遺伝子の特異的欠失を誘導した。その結果、２つのガイドを導入することによって、ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの設計された欠失を誘導することに成功することができた。設計された欠失は、導入された２つのガイド間のゲノム配列を除去する欠失として定義される。ＣＤ１６３を標的とする２つのＣＲＩＳＰＲを受けた胚のうち、１つを除くすべての胚は、ＣＤ１６３の標的修飾をもたらした。加えて、１３個の胚のうち５個は、ＣＤ１６３上に設計された欠失を有することが見出され（図６、パネルＡ）、１３個の胚のうち１０個は、ホモ接合または両アレル様式のいずれかでＣＤ１６３の修飾を有するように見えた。すべての胚（２３／２３）がＣＤ１Ｄの修飾を示したため、２つのＣＲＩＳＰＲを用いたＣＤ１Ｄの標的化も有効であった。しかしながら、ＣＤ１Ｄの設計された欠失は、２つの胚においてのみ見出すことができた（２／２３）（図６、パネルＢ）。２３個のうち５個は、モザイク遺伝子型を有することも見出されたが、残りの胚は、ＣＤ１Ｄのホモ接合または両アレル修飾のいずれかを有した。最後に、同じ胚内のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系によって複数の遺伝子を標的とすることができるかどうかを試験した。この目的のために、ＣＤ１６３およびｅＧＦＰの両方を標的とすることを、ヘテロ接合ｅＧＦＰ精液で受精した接合体において実施した。注入した胚からの胚盤胞をＣＤ１６３およびｅＧＦＰについて遺伝子型決定したところ、胚発生中にＣＤ１６３およびｅＧＦＰが正常に標的とされたことが見出された。配列決定結果は、複数のＣＲＩＳＰＲをＣａｓ９とともに導入することによって、複数の遺伝子を標的とすることができることを実証した（図６、パネルＣ）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入接合体からのＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄ突然変異体の産生
前回のインビトロ試験の成功に基づいて、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入された接合体を産生し、レシピエントあたり４６〜５５個の胚盤胞を移入した（この数は、インビトロ由来の胚からブタを産生するのに有効であることが示されているため）。４つの胚移入を実施し（ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄについて各々２つ）、各修飾については妊娠を得た。ＣＤ１６３上に修飾を有する４匹の健康な子ブタを産生した（表９）。すべての子ブタ、レシピエント経産ブタＩＤ Ｏ０８３からの同腹子６７は、ＣＤ１６３のホモ接合または両アレル修飾のいずれかを示した（図７）。２匹の子ブタは、送達された２つのＣＲＩＳＰＲによるＣＤ１６３の設計された欠失を示した。すべての子ブタは健康であった。ＣＤ１Ｄに関して、１回の妊娠はまた、４匹の子ブタ（レシピエント経産ブタ識別番号Ｏ１６５からの同腹子１６６）、１匹の雌および３匹の雄も産生した（表１０）。１匹の子ブタ（１６６−１）は、開始コドンを含有するエクソン３を完全に除去した３６２ｂｐの欠失を含む、ＣＤ１Ｄのモザイク突然変異を担持した（図８）。１匹の子ブタは、一方のアレルに２ｂｐのミスマッチを伴う６ｂｐの挿入を含み、他方のアレルに大きな欠失を伴っていた。追加の２匹の子ブタは、両アレル単一ｂｐの挿入を有した。ＣＤ１６３について、モザイク突然変異は検出されなかった。
考察
ＧＥブタの産生効率の向上は、農業およびバイオ医療のためにより多くのＧＥブタを提供することによって広範な影響を与える可能性がある。上述のデータは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用することにより、特異的突然変異を有するＧＥブタを高効率で産生できることを示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を、体細胞および移植前胚の両方において遺伝子を編集するために適用することに成功した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を体細胞に導入した場合、ＮＨＥＪによる標的遺伝子の標的破壊を誘導することに成功したが、ＨＲによる標的化能力を増加させなかった。体細胞における個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的化効率は可変であり、これは、ガイドの設計が標的化効率に影響を及ぼし得ることを示した。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ５３５０およびＣａｓ９を体細胞に導入したとき、ＣＤ１Ｄの標的修飾を見つけることは不可能であった。これは、ブタを産生する前に複数のｇＲＮＡを設計し、それらの効率を検証することが有益であり得ることを示唆している。ドナーＤＮＡの存在によるＨＲ指向性修復が欠如している理由はまだ不明である。ＣＲＩＳＰＲおよびドナーＤＮＡでトランスフェクトした８８６コロニー（ＣＤ１６３およびＣＤ１Ｄの両方）をスクリーニングした後、１つのコロニーのみが部分的ＨＲ事象の証拠を有した。結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系が導入されたドナーＤＮＡと連携して標的遺伝子に予期しない大きな欠失を引き起こしたが、これらの２つの特定の標的化ベクターのＨＲ効率を増加させなかったことを実証した。しかしながら、大きな欠失観察のための具体的な機序は既知ではない。我々のグループからの以前の報告では、ドナーＤＮＡをＺＦＮで効果的に使用して、ＨＲ指向性修復を誘導できることが示唆された。同様に、ドナーＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系で使用した場合、標的化効率の増加が見られたが、完全なＨＲ指向性修復は観察されなかった。ＺＦＮを使用する以前の研究では、ＺＦＮによって誘導されたＤＳＢの後に導入されたドナーＤＮＡの部分的な組み換えが見出されたため、標的修飾は、ＨＲおよびＮＨＥＪの組み合わせを通じて生じ得ることが観察された。１つの説明は、ＨＲおよびＮＨＥＪ経路が独立していないが、ホーミングエンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＳＢ後に修復プロセスを完了するために一緒に作用することができることであり得る。より高い濃度のＣＲＩＳＰＲは、体細胞における標的化効率を向上させることができるが、これらの実験結果において統計学的差異は見出されなかった。これは、ＣＲＩＳＰＲがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系における制限因子であることを示唆し得るが、さらなる検証が必要である。標的細胞を使用して、ＳＣＮＴを介してＧＥブタを産生することに成功した。これはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の適用が、クローニングされる細胞の能力に影響を与えないことを示す。健康上の問題のため、数匹の子ブタを安楽死させたが、これはＳＣＮＴ由来の子ブタでは珍しくない。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を接合体注入によって発生中の胚に導入すると、ほぼ１００％の胚およびブタが標的遺伝子にＩＮＤＥＬを含有し、この技術が胚発生中に非常に有効であることを実証した。この研究中に観察された効率は、胚発生中にホーミングエンドヌクレアーゼを利用した他の研究で報告された頻度を上回る。胚盤胞段階に到達する胚の数の減少は、本研究で導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の濃度が胚に毒性を有する可能性があることを示唆した。送達系のさらなる最適化は、胚の生存能を増加させ、したがって、プロセスの全体的な効率を改善し得る。ここで観察されるほぼ１００％の突然変異誘発率は、ブタにおけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウトにおける以前の報告とは異なっていたが、試験間の効率の差は、選択されたガイドと標的との組み合わせであり得る。本研究では、より低い濃度のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（各１０ｎｇ／μＬ）が、胚の発生およびＧＥブタの産生における突然変異の生成に有効であった。この濃度は、ブタ接合体において以前に報告された濃度よりも低い（Ｃａｓ９は１２５ｎｇ／μＬおよびＣＲＩＳＰＲは１２．５ｎｇ／μＬ）。より低いＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分の濃度は、発生中の胚に過剰量の核酸を導入することが毒性となり得るため、発生中の胚に有益であり得る。いくつかのモザイク遺伝子型は、インビトロアッセイからＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９注入胚に見られたが、アプローチを通して産生された１匹の子ブタのみがモザイク遺伝子型を有した。潜在的には、モザイク遺伝子型が、接合体においてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用する主なハードルであると考えられたため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を含む注入は、他のホーミングエンドヌクレアーゼの導入よりも有効であり得る。本結果によって実証されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を使用する別の利点は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を注入したＩＶＦ由来の接合体から産生されたＣＤ１６３ノックアウトブタが失われなかったことであるが、ＳＣＮＴから得られた数匹の子ブタは、数日後に安楽死された。これは、ノックアウトブタを生成する際にＳＣＮＴの必要性を回避するだけでなく、ＳＣＮＴに関連する一般的な健康問題を克服する可能性があることを示唆している。接合体へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの注入が最適化されたので、今後の実験にはドナーＤＮＡの同時注入も含まれるであろう。
本研究は、２つのＣＲＩＳＰＲとＣａｓ９を接合体に導入することにより、発生中の胚における染色体欠失を誘導し、意図される欠失、すなわち、２つのＣＲＩＳＰＲガイド間の特異的欠失を有するブタを産生することができることを実証する。この設計された欠失は、ＮＨＥＪによって引き起こされるランダムな事象に依存するのではなく、欠失のサイズを指定することが可能であるため、有益であり得る。具体的には、ホーミングエンドヌクレアーゼによって引き起こされる３の倍数のヌクレオチドの挿入／欠失が存在する場合、突然変異はむしろ、フレームシフトが発生しないため、低形質突然変異をもたらし得る。しかしながら、２つのＣＲＩＳＰＲを導入することによって、より大きな欠失を引き起こすことが可能であり、これがより高い確率で非機能性タンパク質を生成する。興味深いことに、ＣＤ１Ｄ ＣＲＩＳＰＲは、ＣＤ１６３よりもゲノム内のより大きな面積にわたって設計され、ＣＤ１６３ ＣＲＩＳＰＲ１０と１３１との間に１２４ｂｐの距離があり、ＣＤ１ＤについてはＣＲＩＳＰＲ４８００と５３５０との間に５５０ｂｐの距離があった。ＣＲＩＳＰＲ間のより長い距離は、研究において示されるように、欠失の生成にあまり有効ではなかった。しかしながら、本研究は、限られた数の観察のみを含み、ここでは取り上げない個々のＣＲＩＳＰＲの有効性を考慮する必要があるため、ＣＲＩＳＰＲ間の距離と意図された欠失を引き起こす確率との間の関係を検証する必要がある。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系はまた、同じ胚内の２つの遺伝子を同時に標的化するのにも有効であり、唯一の追加のステップは、ｃｒＲＮＡを有する１つの追加のＣＲＩＳＰＲの導入であった。これは、他のホーミングエンドヌクレアーゼと比較して、複数の遺伝子を破壊する容易さを示す。これらの結果は、この技術が補償効果を有し得る遺伝子クラスターまたは遺伝子ファミリーを標的とするために使用され得ることを示唆し、したがって、すべての遺伝子が破壊されない限り、個々の遺伝子の役割を決定することが困難であることを証明する。結果は、体細胞における遺伝子標的化の効率を増加させることによって、および直接接合体注入によって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術をＧＥブタの生成に適用することができることを実証する。
実施例２：ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子において修飾染色体配列を有するブタにおけるＰＲＲＳＶに対する抵抗性の増加
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）は、世紀の最後の四半世紀にわたってブタ業界を蹂躙してきた。本実施例において、ＣＤ１６３ヌル動物が、ＰＲＲＳＶ感染のすべての特徴である感染、肺病理、ウイルス血症、または抗体産生の臨床的徴候を示さないことが示されている。ＰＲＲＳＶ侵入メディエーターが確認されているだけでなく、同様に作成された動物が食品供給に入ることが許された場合、著しい経済的損失および動物の苦痛を防ぐための戦略が説明されている。
材料および方法
遺伝子型決定
遺伝子型決定は、ＤＮＡ配列決定およびｍＲＮＡ配列決定の両方に基づいた。雄親の遺伝子型は、一方のアレルにおいて１１ｂｐの欠失を有し、これを翻訳すると、ドメイン５に４５個のアミノ酸を予測し、結果としてアミノ酸６４で未成熟終止コドンをもたらした。他方のアレルにおいて、エクソン７に２ｂｐの付加およびエクソン７の前のイントロンに３７７ｂｐの欠失が存在し、これは翻訳されると、ドメイン５の最初の４９個のアミノ酸を予測し、結果としてアミノ酸８５で未成熟終止コードをもたらした。１匹の経産ブタは、一方のアレルにおいて７ｂｐの付加を有し、これを翻訳すると、ドメイン５の最初の４８個のアミノ酸を予測し、結果としてアミノ酸７０で未成熟終止コドンをもたらした。他方のアレルは、特徴付けられておらず（Ａ）、これは、ＰＣＲまたはロングレンジ６．３ｋｂのＰＣＲのいずれによってもエクソン７からのバンドが存在しなかったためであった。他の３匹の経産ブタはクローンであり、エクソン７における１２９ｂｐの欠失を有し、ドメイン５由来の４３アミノ酸の欠失をもたらすと予測される。他方のアレルは、特徴付けられていなかった（Ｂ）。
培養下のＰＲＲＳＶの成長およびブタの感染のためのウイルス接種源の産生は、認可されたＩＢＣ適用９７３に含められている。
ＰＲＲＳＶの基準株、分離株ＮＶＳＬ９７−７８９５（ＧｅｎＢａｎｋ＃ ＡＦ３２５６９１ ２００１−０２−１１）を認可されたＩＢＣプロトコル９７３に記載されるように増殖させた。この研究室分離株は、実験研究において約２０年間使用されてきた（Ｌａｄｉｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。第２の分離株を、前に記載されるように（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）、第２試行、ＫＳ０６−７２１０９に使用した。
ＰＲＲＳＶによるブタの感染
ＰＲＲＳＶのための標準化感染プロトコルを、ブタの感染のために使用した。３週齢の子ブタに、筋肉内（ＩＭ）および鼻腔内（ＩＮ）経路によって投与されたおよそ１０４のＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳウイルスを接種した。ブタを毎日モニターし、病気の症状を呈するものを、ＣＭＧ獣医師の推奨に従って処置する。重篤な窮迫を示し、感染に屈する危険にあるブタは人道的に安楽死させ、試料を収集する。スタッフおよび獣医は、評価または治療における偏りを排除するために、ブタの遺伝的状態について知らされていなかった。ＰＲＲＳＶは、感染中に体液中に存在するため、血液試料を収集し、各ブタにおいてウイルス血症の量または程度を決定するために測定するまで−８０℃で保存した。実験の終わりに、ブタの体重を測定し、人道的に安楽死させ、組織を収集し、１０％緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、理事会認定病理学者による病理組織診断のために処理した。
曝露させたブタの表現型スコアリング
ブタの表現型を、毎日以下のように盲検的にスコア化した：ブタの態度は？態度スコア：０：ＢＡＲ、１：ＱＡＲ、２：わずかに抑うつ、３：抑うつ、４：瀕死。ブタの体調は？体調スコア：１：やせ衰えた、２：やせた、３：理想、４：太った、５：脂肪過多／肥満。ブタの直腸温度は？正常体温１０１．６〜１０３．６°Ｆ（発熱と考えられる≧１０４°Ｆ）。跛行があるか（グレード）？どの肢？関節腫張れおよび蹄病変について肢を評価する（蹄の底部および側面をチェックする）。跛行スコア：１：跛行なし、２：歩くときわずかに不均等、一部の関節に拘縮が見られるが跛行なし、３：軽度の跛行、歩行中のわずかな足のひきずり、４：中度の跛行、つま先接触する不自由さを含む明らかな足のひきずり、５：重度の跛行、肢への体重負担なし、立つ／歩くために激励が必要である。呼吸困難があるか（グレード）？口を開けた呼吸があるか？鼻汁があるか（鼻汁の色、鼻汁の量：軽度／中度／重度）？動物の咳に気付いたか？眼漏があるか？呼吸スコア：０：正常、１：ストレスを受けたとき（取り扱われるとき）軽度の呼吸困難および／または頻呼吸、２：安静時に軽度の呼吸困難および／または頻呼吸、３：ストレスを受けたとき（取り扱いを受けたとき）中度の呼吸困難および／または頻呼吸、４：安静時に中度の呼吸困難および／または頻呼吸、５：ストレスを受けたとき（取り扱われるとき）重度の呼吸困難および／または頻呼吸、６：安静時に重度の呼吸困難および／または頻呼吸。下痢（グレード）または嘔吐の証拠はあるか？血液または粘液があるか？下痢スコア：０：気付ける糞便なし、１：正常便、２：軟便であるが形あり（ソフトクリームヨーグルト稠度、牛糞形成）、３：微粒子糞便物質を有する褐色／黄褐色の液体下痢、４：微粒子糞便物質のない褐色／黄褐色の液体下痢、５：水と同様に見える液体下痢。
このスコアリングシステムは、Ｄｒ．Ｍｅｇａｎ ＮｉｅｄｅｒｗｅｒｄｅｒによってＫＳＵで開発され、以下の刊行物に基づく（Ｈａｌｂｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５、Ｍｅｒｃｋ、Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｐａｔｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｈａｃｋｅｒ，１９８９、Ｗｉｎｃｋｌｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｌｅｎ，２００１）。スコアおよび温度を、処理として遺伝子型に基づき分離したＡＮＯＶＡを用いることにより分析した。
ＰＲＲＳＶウイルス血症の測定
ウイルス血症は、２つのアプローチによって決定した。ウイルス滴定を、１：１０段階希釈の血清を９６ウェルプレート中のコンフルエントＭＡＲＣ−１４５細胞に添加することによって実施した。血清を、前に記載されるように、８％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびアンホテリシンＢが補充されたイーグル最小必須培地中で希釈した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。細胞を、４日のインキュベーション後に、細胞変性効果の存在について、顕微鏡を使用することにより検査した。細胞変性効果を示す最高希釈を滴定終点としてスコア化した。全ＲＮＡを、ウイルス核酸を測定するためにＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭａｇＭＡＸ−９６ウイルスＲＮＡ単離キットを使用することにより、血清から単離した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を、Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ製のＥＺ−ＰＲＲＳＶ ＭＰＸ４．０キットを使用することにより、ＣＦＸ−９６リアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、製造者の説明書に従い実施した。各反応物（２５μＬ）は、５．８μＬの血清由来のＲＮＡを含んだ。検量線をキット（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ）で供給したＲＮＡ対照の段階希釈を調製することによって構築した。ＰＣＲあたりのテンプレートの数を報告する。
ＰＡＭ細胞のＳＩＧＬＥＣ１およびＣＤ１６３染色
肺を切除し、約１００ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩水で満たすことにより、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を収集した。リン酸緩衝生理食塩水洗浄液を回収した後、細胞をペレット化し、５ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させ、氷上で保存した。およそ１０７のＰＡＭを、５ｍＬの様々な抗体（抗ブタＣＤ１６９（クローン３Ｂ１１／１１；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）；抗ブタＣＤ１６３（クローン２Ａ１０／１１；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ））が希釈されたリン酸緩衝生理食塩水中で５％のウシ胎児血清および０．１％のナトリウムアジドとともに、３０分間氷上でインキュベートした。細胞を洗浄し、１／１００希釈の、染色バッファー中で希釈させたフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、３０分間氷上でインキュベートした。少なくとも１０４の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用することにより分析した。
ＰＲＲＳＶ特異的Ｉｇの測定
ＰＲＲＳＶ特異的Ｉｇを測定するために、組み換えＰＲＲＳＶ Ｎタンパク質を細菌中で発現させ（Ｔｒｉｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１２）、磁性Ｌｕｍｉｎｅｘビーズにキット（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用することによりコンジュゲートさせた。Ｎタンパク質結合ビーズを、１０％のヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中で２，５００ビーズ／５０μＬまで希釈し、９６ウェル丸底ポリスチレンプレートのウェルに入れた。血清を、１０％のヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中１：４００で希釈し、５０μＬを２連のウェルに添加し、３０分間穏やかに振盪しながら、室温でインキュベートした。次に、プレートを１０％のヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（３×）、５０μＬのビオチン−ＳＰコンジュゲートアフィニティ精製ヤギ抗ブタ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）またはビオチン標識アフィニティ精製ヤギ抗ブタＩｇＭ（ＫＰＬ）（１０％ヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中２μｇ／ｍｌまで希釈されている）を添加した。３０分のインキュベーション後、プレートを洗浄し（３×）、その後、５０μＬのストレプトアビジン−コンジュゲートフィコエリトリン（１０％のヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中、２μｇ／ｍＬ（Ｍｏｓｓ，Ｉｎｃ．））を添加した。プレートを３０分後に洗浄し、ミクロスフェアを１００μＬの１０％のヤギ血清を含むリン酸緩衝生理食塩水中に再懸濁させ、ＭＡＧＰＩＸおよびＬｕｍｉｎｅｘ ｘＰＯＮＥＮＴ４．２ソフトウェアを使用することにより分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を報告する。
結果
ＣＤ１６３における突然変異をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、実施例１において以上で記載されるとおりに作成した。いくらかのファウンダー動物を接合体注入および体細胞核移入から産生した。これらのファウンダーのいくらかを交配させ、研究のための子孫を作成した。単一のファウンダー雄を２つの遺伝子型を有する雌と交配させた。ファウンダー雄（６７−１）は、１つのアレル上のエクソン７における１１ｂｐの欠失および他のアレルのエクソン７における２ｂｐの付加（および前のイントロンにおける３７７ｂｐの欠失）を有し、ヌル動物（ＣＤ１６３−／−）であることが予測された。１匹のファウンダー雌（６５−１）は１つのアレルにおけるエクソン７における７ｂｐの付加および特徴付けられていない対応するアレルを有し、よって、ノックアウトについてヘテロ接合性であることが予測された（ＣＤ１６３−／？）。第２のファウンダー雌遺伝子型（クローンである３匹の動物）は、まだ特徴付けられていないアレルおよびエクソン７における１２９ｂｐの欠失を有するアレルを含んだ。この欠失は、ドメイン５における４３アミノ酸の欠失となると予測される。これらの動物間の交配により、すべての子ブタが雄ブタ由来のヌルアレルおよび雌ブタ由来の４３アミノ酸欠失または特徴付けられていないアレルの１つのいずれか受け継ぐと言う結果となった。ウイルス曝露についての陽性対照として機能した野生型子ブタに加えて、これにより４つの追加の遺伝子型が産生された（表１３）。
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離乳時に、遺伝子編集された子ブタおよび野生型同年齢子ブタを、ＰＲＲＳＶ曝露のためにＫａｎｓａｓ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに輸送した。ＰＲＲＳＶ曝露を前に記載されるように行った（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。子ブタを３週齢で曝露施設に持ち込み、単一群として維持した。すべての実験を動物使用およびバイオセイフティ委員会の認可後に開始した。順化後、ブタを、ＭＡＲＣ−１４５細胞上で増殖させた（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、ＰＲＲＳＶ分離株、ＮＶＳＬ９７−７８９５（Ｌａｄｉｎｉｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）に曝露させた。ブタを、およそ１０５のＴＣＩＤ５０のウイルスに曝露させた。接種材料の半分を筋肉内に送達させ、残りを鼻腔内に送達させた。すべての感染ブタを単一群として維持し、これにより、同じおりの感染した個体からのウイルスの連続曝露が可能になった。血液試料を、感染後３５日までの様々な日および終了、３５日目に収集した。ブタを剖検し、組織を１０％の緩衝ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、病理組織診断のために処理した。感染の過程で記録されたＰＲＲＳＶ関連の臨床徴候には、呼吸困難、不快感、倦怠感、および発熱が含まれた。研究期間にわたる臨床徴候についての結果を図９にまとめて示す。予想どおり、野生型Ｗｉｌｄ Ｔｙｐｅ（ＣＤ１６３＋／＋）ブタは、ＰＲＲＳＶ感染の初期徴候を示し、これは、５日目と１４日目との間でピークとなり、研究の残りの間、群内で存続した。発熱ブタのパーセンテージは、約１０日目にピークとなった。対照的に、ヌル（ＣＤ１６３−／−）子ブタは、研究期間全体にわたって臨床徴候の証拠を示さなかった。急性ＰＲＲＳＶ感染中の呼吸徴候は、肺における著しい組織病理学的変化に反映される（表１４）。野生型ブタの感染は、単核細胞の浸潤を伴う間質性浮腫を含むＰＲＲＳと一致する組織病理を示した（図１０）。対照的に、ヌル（ＣＤ１６３−／−）ブタには、肺変化の証拠はなかった。様々な遺伝子型の試料サイズは小さいが、それでも、平均スコアは、野生型では３．８５（ｎ＝７）、特徴付けられていないＡでは１．７５（ｎ＝４）、特徴付けられていないＢでは１．３３（ｎ＝３）、ならびにヌル（ＣＤ１６３−／−）では０（ｎ＝３）であった。
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ピーク臨床徴候は、血液中のＰＲＲＳＶのレベルと相関した。ウイルス核酸の測定を、血清からの全ＲＮＡの単離、続いて市販の逆転写酵素リアルタイムＰＲＲＳＶ ＰＣＲ試験（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用することによるＰＲＲＳＶ ＲＮＡの増幅により実施した。検量線を、ＲＴ−ＰＣＲキットにおいて供給されるＰＲＲＳＶ ＲＮＡ対照の段階希釈を調製することによって生成し、結果をテンプレート数／５０μＬのＰＣＲ反応として標準化した。ＰＲＲＳＶ分離株は、野生型ＣＤ１６３＋／＋ブタにおいて、ＰＲＲＳＶウイルス血症についての過程に従った（図１１）。ウイルス血症は４日目に明らかになり、１１日目にピークに達し、研究の終わりまで減少した。対照的にウイルスＲＮＡは、ＣＤ１６３−／−ブタにおいて、研究期間中のどの時点でも検出されなかった。ウイルス血症と一致して、ヌルおよび特徴付けられていないアレルブタによる抗体産生は１４まで検出可能であり、２８日目まで増加した。ヌル動物においては、抗体産生はなかった（図１２）。まとめると、これらのデータにより、野生型ブタはＰＲＲＳＶ複製をサポートし、ＰＲＲＳと一致する臨床徴候が生じたことが示される。対照的に、ノックアウトされたブタは、ブタが接種され、常に同じおりの感染した個体に曝露されても、ウイルス血症および臨床徴候を生じなかった。
研究の終わりに、ブタ肺胞マクロファージを肺洗浄により除去し、前に記載されるように、ＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９、クローン３Ｂ１１／１１）およびＣＤ１６３（クローン２Ａ１０／１１）の表面発現のために染色した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。相対的に高いレベルのＣＤ１６３発現が、ＣＤ１６３＋／＋野生型動物上で検出された（図１３）。対照的に、ＣＤ１６３−／−ブタは、バックグラウンドレベルの抗ＣＤ１６３染色を示したにすぎず、よって、ノックアウト表現型が確認された。別のマクロファージマーカーＣＤ１６９についての発現レベルは、野生型およびノックアウトブタの両方について同様であった（図１４）。ＭＨＣ ＩＩおよびＣＤ１７２を含む他のマクロファージ表面マーカーは、両方の遺伝子型について同じであった（データ示さず）。
試料サイズは小さかったが、他の３つの遺伝子型のブタ（特徴付けられていないＡ １．３２ｋｇ±０．１７、ｎ＝４；特徴付けられていないＢ １．２０ｋｇ±０．１６、ｎ＝３；ヌル１．２１ｋｇ±０．１６、ｎ＝３）に対して、野生型ブタは、実験の過程にわたって体重が増えにくい傾向にあった（１日あたりの平均体重増加０．８１ｋｇ±０．３３、ｎ＝７）。
第２の試行では、６匹の野生型、６匹のΔ４３アミノ酸、および６匹の、特徴付けられていないアレル（Ｂ）を有するブタを、ＫＳ０６−７２１０９を使用して、子ブタに接種することを除き、以上で記載されるとおりに曝露させた。ＮＶＳＬデータと同様に、野生型および特徴付けられていないＢ子ブタは、ウイルス血症を発症した。しかしながら、Δ４３アミノ酸ブタでは、ＫＳ０６は、ウイルス血症という結果にならなかった（図１５、表８）。
意味と結論
ブタ産業にとって最も臨床的に関連する疾患はＰＲＲＳである。ワクチン接種プログラムは、ほとんどのブタ病原体を防止または寛解することに成功しているが、ＰＲＲＳＶはより挑戦的であることが分かっている。ここでは、ＣＤ１６３がこのウイルス株に対する侵入メディエーターとして同定されている。ファウンダー雄ブタが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を接合体に注入することによって作成されたため（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、導入遺伝子は存在しない。追加的に、経産ブタ（これもＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用することにより作成される）由来のアレルの１つは導入遺伝子を含まない。したがって、子ブタ＃４０は、一方のアレルにおいて７ｂｐの付加および他のアレルにおいて１１ｂｐの欠失を保有するが、導入遺伝子を保有しない。ＣＤ１６３のこれらのウイルス抵抗性アレルは、ブタゲノムが約２８億ｂｐであることを考えると小さなゲノム編集を表す（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。同様に作成された動物が食物供給に導入されると、著しい経済的損失を防ぐことができる。
実施例３：ヒトＣＤ１６３様相同性ＳＲＣＲドメイン８と置き換えられたＣＤ１６３ ＳＲＣＲドメイン５を有するブタにおける遺伝子型１ブタ繁殖・ＰＲＲＳウイルスに対する増加した抵抗性
ＣＤ１６３は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）の主要受容体であると考えられる。この研究では、ブタを以下の遺伝子型の１つを有するように遺伝子編集（ＧＥ）した：ＣＤ１６３の完全ノックアウト（ＫＯ）、ＣＤ１６３スカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン５内欠失、またはＳＲＣＲドメイン５の、ヒトＣＤ１６３様（ｈＣＤ１６３Ｌ１）ＳＲＣＲ８ドメインのホモログをコードする合成エクソンによる置き換え（ドメインスワップ）。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）の免疫表現型検査により、ＫＯまたはＳＲＣＲドメイン５欠失を有するブタは、ＣＤ１６３を発現せず、ＰＡＭは、ＰＲＲＳＶ感染をサポートしなかったことが示された。ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８ホモログを有するブタ由来のＰＡＭは、ＣＤ１６３を発現し、２型の複製をサポートしたが、１型遺伝子型ウイルスをサポートしなかった。代表的な１型および２型ウイルスによるＣＤ１６３修飾ブタの感染でも同様の結果が得られた。１型および２型ウイルスは、受容体としてのＣＤ１６３を必要とすることを含み、いくつかのレベルでは、遺伝学的におよび表現型的に同様であると考えられるとしても、結果から、ＣＤ１６３分子の認識においてＰＲＲＳＶ遺伝子型の間には明確な差があることが示される。
材料および方法
ブタＣＤ１６３遺伝子のゲノム修飾
動物およびウイルスが関与する実験を、動物科学協会連盟研究および教育における農業動物のケアと使用のためのガイド（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｉｎｇ）、ＵＳＤＡ動物福祉法および動物福祉規則に従って実施し、Ｋａｎｓａｓ Ｓｔａｔｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ動物実験委員会およびバイオセイフティ委員会の認可を受けた。本研究で使用されるＣＤ１６３における突然変異を、前の実施例において上術したように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して作成した。突然変異を図１７に図示する。図１７に示される、図示されたゲノム領域は、ブタＣＤ１６３遺伝子のイントロン６からイントロン８の配列に及ぶ。図１７に図示されるイントロンおよびエクソンは、縮尺どおりに描かれていない。予測されるタンパク質生成物は、各ゲノム構造の右に例示される。ＰＡＭ上の表面ＣＤ１６３のレベルにより測定される相対マクロファージ発現は、図１７の右端に示される。黒色領域は、イントロンを示し；白色領域は、エクソンを示し；斜線領域は、ｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１模倣物、ブタエクソン７のホモログを示し；灰色領域は、図１７に示されるようにＰＧＫ Ｎｅｏ構築物を有する合成イントロンを示す。
図１７に示されるＣＤ１６３遺伝子構築物ＫＯ−ｄ７（１１）は、エクソン７においてヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失を有する。ＣＤ１６３遺伝子構築物ＫＯ−ｉ７（２）は、エクソン７においてヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入、ならびにエクソン７の上流のイントロンにおいて、ヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失を有する。これらの編集は、フレームシフト突然変異および未成熟終止コドンを引き起こすと予測され、ＳＲＣＲ５の部分翻訳のみおよびＫＯ表現型という結果となる。他の３つの突然変異は、エクソン７における欠失を生じた。まず、ｄ７（１２９）は、エクソン７においてヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までの１２９塩基対の欠失を有する。ｄ７（１２９）コンストラクトはまた、エクソン６においてヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの欠失を有し、欠失した配列は、１２ｂｐの挿入で置き換えられる。他の２つの欠失構築物、ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）は、図１７で例示されるようにエクソン７および８の完全欠失を有する。ｄ７（１４６７）は、ヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対の欠失を有し、ｄ７（１２８０）は、ヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失を有する。これらの欠失構築物について、他のＣＤ１６３エクソンは無傷のままであった。
図１７に示される最後の構築物、ＨＬ１１ｍを、エクソン７を欠失させ、これを、ヒトＣＤ１６３様１タンパク質のＳＲＣＲ８のホモログをコードする合成エクソンで置き換えるターゲティングイベントを使用して産生した（ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８は、ｈＣＤ１６３Ｌ１エクソン１１によってコードされる）。ＳＲＣＲ８ペプチド配列を、ブタエクソン７配列において３３ヌクレオチドを変化させることによって作成した。ネオマイシンカセットを、修飾のためのスクリーニングを可能にするために合成エクソンに含めた。配列番号１１８は、参照配列の配列番号４７の同じ領域に対応する領域においてＨＬ１１ｍ構築物のヌクレオチド配列を提供する。
ブタＣＤ１６３タンパク質および遺伝子の図が図１８に提供される。ＣＤ１６３タンパク質ＳＣＲＣ（楕円）およびＰＳＴ（四角）ドメインが、対応する遺伝子エクソンとともに、図１８のパネルＡで示される。ブタＣＤ１６３ ＳＲＣＲ５（配列番号１２０）およびヒトＣＤ１６３ ＳＲＣＲ８ホモログ（配列番号１２１）についてのペプチド配列比較を図１８のパネルＢに示す。図は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ３１１７１６（ブタＣＤ１６３）およびＧＱ３９７４８２（ｈＣＤ１６３−Ｌ１）に基づく。
ウイルス
この実施例で使用されるウイルスのパネルを表１５に列挙する。分離株をＭＡＲＣ−１４５細胞上で増殖させ、滴定した（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。滴定のために、各ウイルスを、７％のＦＢＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（それぞれ８０単位／ｍＬおよび８０μｇ／ｍＬ）、３μｇ／ｍＬのＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（アンホテリシンＢ）、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳが補充されたＭＥＭ中、１：１０で段階希釈した。希釈試料を４連で、９６ウェルプレートにおいてコンフルエントＭＡＲＣ−１４５細胞に、２００μＬ／ウェルの最終体積まで添加し、４日間３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。滴定終点は、細胞変性効果（ＣＰＥ）を有する最後のウェルとして同定した。５０％組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）を、前述の方法（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）を使用して計算した。
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肺胞マクロファージの感染
マクロファージの調製および感染は、前述のように実施した（Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ，ｅｔ ａｌ．，２００９およびＰａｔｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，２００８）。安楽死させたブタから肺を除去し、１００ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を気管に注ぎ込むことによって洗浄した。気管をクランプし、肺を穏やかにマッサージした。肺胞内容物を５０ｍＬの遠心管に注ぎ入れ、氷上で保存した。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を、１２００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離によって沈降させた。ペレットを冷滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させ、１回洗浄した。細胞ペレットを、４５％のＲＰＭＩ１６４０、４５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結培地中に再懸濁させ、使用するまで液体窒素中で保存した。凍結細胞を氷上で解凍し、カウントし、培地（１０％のＦＢＳ、ＰｅｎＳｔｒｅｐ、およびＦＵＮＧＩＺＯＮＥで補充されたＲＰＭＩ１６４０；ＲＰＭＩ−ＦＢＳ）中で５×１０５細胞／ｍＬに調整した。およそ１０３ ＰＡＭ／ウェルを９６ウェルプレートに添加し、一晩、３７℃で５％ＣＯ２においてインキュベートした。細胞を軽く洗浄して、非付着細胞を除去した。ウイルスの１：１０段階希釈物を、３連ウェルに添加した。一晩のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、１０分間８０％アセトンで固定した。乾燥後、ウェルを、１％魚ゼラチンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−ＦＧ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）中１：１０００で希釈したＰＲＲＳＶ Ｎ−タンパク質特異的ＳＤＯＷ−１７ｍＡｂ（Ｒｕｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．）で染色した。３７℃での３０分のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ−ＦＧ中１：２００で希釈したＡＬＥＸＡＦＬＵＯＲ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。プレート３０分間、暗闇で３７℃にてインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）／ｍＬを、前に記載される方法に従って計算した（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ １９３８）。
ＰＡＭ上のＣＤ１６９およびＣＤ１６３表面発現の測定
ＣＤ１６９およびＣＤ１６３の表面発現の染色を、前述のように実施した（Ｐｒａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。およそ１×１０６のＰＡＭを１２ｍｍ×７５ｍｍのポリスチレンフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）管に入れ、Ｆｃ受容体をブロックするために１０％正常マウス血清を有する、１ｍｌのＰＢＳ中で、１５分間室温でインキュベートした。細胞を遠心分離によってペレット化し、５μＬのＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗ブタＣＤ１６９ｍＡｂ（クローン３Ｂ１１／１１；ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）および５μＬのＰＥコンジュゲートマウス抗ブタＣＤ１６３ ｍＡｂ（クローン：２Ａ１０／１１、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）中に再懸濁させた。３０分のインキュベーション後、細胞を２回、１％ウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ（ＢＳＡ Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ；Ｈｙｃｌｏｎｅ）で洗浄し、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ５ソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて直ちに分析した。各試料について、少なくとも１０，０００個の細胞を分析した。
ＰＲＲＳウイルス血症の測定
ＲＮＡを、５０μＬの血清から、Ａｍｂｉｏｎ ＭａｇＭＡＸ９６ウイルス単離キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製造者の指示に従って単離した。ＰＲＲＳＶ ＲＮＡを、製造者の指示に従って実施される、ＥＺ−ＰＲＲＳＶ ＭＰＸ４．０ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ標的特異的試薬（Ｔｅｔｒａｃｏｒｅ）を用いて定量した。各プレートは、ＲＴ−ＰＣＲ試薬とともに使用するために設計されＴｅｔｒａｃｏｒｅ定量化標準および対照セットを含んだ。ＰＣＲを、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９６ウェルフォーマットで、推奨されるサイクリングパラメータを使用して実行した。ＰＣＲアッセイ結果を、ｌｏｇ１０ ＰＲＲＳＶ ＲＮＡコピー数／５０μＬ反応体積として報告し、これは、コピー数／ｍＬの血清に近似する。時間に伴うウイルス血症のための曲線下面積（ＡＵＣ）をＷｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６．００を使用して計算した。
ＰＲＲＳＶ抗体の測定
ＰＲＲＳＶヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質に対する抗体の検出のためのミクロスフェア蛍光イムノアッセイ（ＦＭＩＡ）を、前に記載されるように実施した（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。組み換えＰＲＲＳＶ Ｎタンパク質を、カルボキシル化Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＬＥＸポリスチレンミクロスフェアビーズに、製造者の指示に従って結合させた。ＦＭＩＡでは、１０％ヤギ血清を有する５０μＬ ＰＢＳ（ＰＢＳ−ＧＳ）中に懸濁させたおよそ２５００の抗原コートビーズを９６ウェルポリスチレン丸底プレートの各ウェルに入れた。血清をＰＢＳ−ＧＳ中１：４００で希釈し、５０μＬを各ウェルに添加した。プレートを箔で包み、３０分間、室温で穏やかに振盪させながらインキュベートした。プレートを磁石上に起き、ビーズを３回、１９０μＬのＰＢＳ−ＧＳで洗浄した。ＩｇＧの検出のために、５０μＬのビオチン−ＳＰコンジュゲートアフィニティ精製ヤギ抗ブタ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳ−ＧＳ中２μｇ／ｍＬまで希釈し、１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で３０分間インキュベートし、３回洗浄し、続いて、５０μＬのストレプトアビジンコンジュゲートフィコエリトリン（ＰＢＳ−ＧＳ中２μｇ／ｍＬ；ＳＡＰＥ）を添加した。３０分後、ミクロスフェアを洗浄し、１００μＬのＰＢＳ−ＧＳ中に再懸濁させ、ＭＡＧＰＩＸ機器（ＬＵＭＩＮＥＸ）およびＬＵＭＩＮＥＸ ｘＰＯＮＥＮＴ４．２ソフトウェアを使用して分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）を最低１００のミクロスフェアビーズで計算した。
ハプトグロビン（ＨＰ）の測定
血清中のＨｐの量を、ブタ特異的Ｈｐ ＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｗａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して測定し、工程は製造者の説明書に従って実施した。血清試料を、１Ｘ希釈剤溶液中１：１０，０００で希釈し、プレコート抗ブタＨｐ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上２連でピペット操作し、室温で１５分間インキュベートし、その後、３回洗浄した。抗Ｈｐ−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを各ウェルに添加し、暗闇で室温にて１５分間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μＬ発色基質溶液を各ウェルに添加した。暗闇で１０分間インキュベートした後、１００μＬの停止液を各ウェルに添加した。プレートを、Ｆｌｕｏｓｔａｒ Ｏｍｅｇａフィルターベースマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）上で４５０ｎｍにて読み取った。
結果
ＣＤ１６３修飾ブタ由来のＰＡＭの表現型特性
肺洗浄材料における細胞の前方および側方散乱特性を使用して、細胞の単核亜集団についてゲートした。図１７に示される異なる染色体修飾の代表的なＣＤ１６９およびＣＤ１６３染色結果を図１９に示す。図１９のパネルＡに提示される代表例では、ＷＴブタ由来の９１％超のＰＡＭが、ＣＤ１６９およびＣＤ１６３の両方に対して陽性であった。この研究で使用された１２匹のＷＴブタに対する結果は、平均８５＋／−８％の二重陽性細胞を示した。図１９のパネルＢに示されるように、ＣＤ１６３ ＫＯブタ由来のＰＡＭは、ＣＤ１６３の証拠を示さなかったが、正常表面レベルのＣＤ１６９を保持した。ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）欠失遺伝子型に由来するＣＤ１６３ポリペプチドは、ＰＡＭ表面に固定された修飾ＣＤ１６３ポリペプチドを産生するはずであると予測されたが、免疫染色結果は、ＣＤ１６３の表面発現を示さなかった（図１９、パネルＤを参照）。ＭＡｂ ２Ａ１０は、最初の３つのＳＲＣＲドメインに位置するエピトープを認識するため、検出なしは、免疫反応性エピトープの欠失の結果ではなかった。ｄ７（１２９）遺伝子型は、ＳＲＣＲ５において４３アミノ酸欠失を有すると予測された（図１７を参照）。図１９のパネルＣに提示される実施例では、２．４％の細胞のみが二重陽性象限に含まれた。本研究で使用した９匹のｄ７（１２９）ブタ由来のＰＡＭの分析は、０％〜３．６％（平均＝０．９％）の範囲の二重陽性細胞のパーセンテージを示した。ＣＤ１６９の表面発現は、ＷＴ ＰＡＭと同様のままであった。本研究の目的のために、ＫＯ、ｄ７（１４６７）、ｄ７（１２８０）、およびｄ７（１２９）遺伝子型を有するブタをすべて、ＣＤ１６３−ヌル表現型を有するものとして分類した。
ｈＣＤ１６３Ｌ１ドメイン８ペプチド配列ＨＬ１１ｍを含むＣＤ１６３修飾は、ＰＡＭ上でＣＤ１６３＋およびＣＤ１６９＋の二重発現を示した（図１９のパネルＥ）。しかしながら、本研究で分析したすべてのＨＬ１１ｍブタにおいて、ＣＤ１６３の表面発現は、ＷＴ ＰＡＭと比べて著しく低減された。ＣＤ１６３のレベルは、連続する発現上に位置し、検出不能ＣＤ１６３から中レベルのＣＤ１６３を有するブタまでの範囲となった。図１９のパネルＥに示される例では、およそ６０％の細胞が二重陽性象限にあり、４０％の細胞は、ＣＤ１６９についてのみ染色された。合計２４匹のＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭの分析は、３８＋／−１２％のＰＡＭ細胞がＣＤ１６９についてのみ陽性であり、５４＋／−１４％が二重陽性（ＣＤ１６９＋ＣＤ１６３＋）であったことを示した。
ＷＴおよびＣＤ１６３修飾ブタにおける循環ハプトグロビンレベル
捕捉分子として、ＣＤ１６３は、ＨｂＨｐ複合体を血液から除去する役割を果たす（Ｆａｂｒｉｅｋ，ｅｔ ａｌ．，２００５、Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１、およびＭａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）。血清中のＨｐのレベルは、ＣＤ１６３発現マクロファージの全機能特性を決定するための好都合な方法を提供する。ＷＴ、ＨＬ１１ｍおよびＣＤ１６３ヌルブタ由来の血清中のＨｐレベルを、３〜４週齢で、ＰＲＲＳＶの感染直前に測定した。図２０に提示される結果は、ＷＴブタ由来の血清が最低量のＨｂを有したことを示した（平均Ａ４５０＝２３＋／−０．１８、ｎ＝１０）。各群の平均および標準偏差は、ＷＴ、０．２３＋／−０．１８、ｎ＝１０；ＨＬ１１ｍ、１．６３＋／−０．８、ｎ＝１１；および２．０６＋／−０．５７、ｎ＝９、ヌル群であった。ヌル群は、ＣＤ１６３を発現しなかった遺伝子型から構成された（ＣＤ１６３ヌル表現型ブタ）。Ｈｐ測定を単一のＥＬＩＳＡプレート上で行った。同じ文字を持つ群では、有意な差はなかった（ｐ＞０．０５、ダネットの事後検定を用いたクラスカル・ウォリスの一元配置分散分析）。ＷＴブタに対する平均Ａ４５０値は、ＨＬ１１ｍおよびＣＤ１６３−ヌルブタのものと有意に異なった（ｐ＜０．０５）。ＨＬ１１ｍ群の平均Ａ４５０値は、ＣＤ１６３−ヌル群と比べて低かったが（Ａ４５０＝１．６＋／０．８対２．１＋／−０．６）、この差は統計的に有意ではなかった。ＨｂＨｐとＣＤ１６３との間の相互作用は、ＳＲＣＲ３を介して起こるため（Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００４）、ＷＴブタと比較してＨＬ１１ｍブタでの増加した循環Ｈｐは、Ｈｂ／Ｈｐに対するＣＤ１６３の親和性の低減の結果である可能性は低いが、ＣＤ１６３＋マクロファージの数の低減、ならびに、残りのマクロファージ上のＣＤ１６３発現の低減という結果の帰結であった（図１９のパネルＥを参照）。
１型および２型ウイルスによるＰＡＭの感染
ＰＲＲＳＶについてのＣＤ１６３修飾ブタの寛容性を最初に、ＰＡＭ細胞をインビトロで６の１型および９の２型ＰＲＲＳＶ分離株の一団に感染させることにより評価した（ウイルスのリストについては、表１５を参照）。一団内のウイルスは、異なる遺伝子型、ならびにヌクレオチドおよびペプチド配列、病態形成、および単離の年における違いを表す。表１６に提示されるデータは、各ＣＤ１６３遺伝子型群について３匹のブタ由来のＰＡＭを使用した実験の結果を示す。列挙されるウイルスは、表１５に列挙されるＰＲＲＳＶ分離株に対応する。結果は、感染したＰＡＭのパーセントの平均＋／−標準偏差として示される。ＣＤ１６３−ヌルＰＡＭは、ｄ７（１２９）アレルを発現するブタ由来であった（ＰＡＭ上のＣＤ１６３遺伝子構築物およびＣＤ１６３発現については、それぞれ図１７および図１９を参照）。
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予想どおり、ＷＴ ＰＡＭはすべてのウイルスに感染した。対照的に、ＣＤ１６３−ヌル表現型ブタは、すべてのウイルスによる感染に対して陰性であった。ＨＬ１１ｍブタからのＰＡＭの応答において、顕著な差が観察された。１型ウイルスのいずれもＨＬ１１ｍ ＰＡＭに感染することができなかったが、２型の一団のすべてのウイルスは、ＷＴ ＰＡＭと比較してはるかに低いパーセンテージではあるものの、ＨＬ１１ｍ ＰＡＭに感染した。
寛容性もまた、同じ２型ウイルスについて、ＷＴとＨＬ１１ｍ ＰＡＭの間のウイルス滴定終点を比較することにより評価した。その結果を、２匹のＷＴおよび２匹のＨＬ１１ｍブタについて示す（図２１）。ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０値は、同じウイルス試料によるマクロファージ培養物の感染に基づいて計算した。感染結果は、各遺伝子型から２匹の異なるブタを表す。感染のために使用したウイルスを表１５に列挙する。ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭについてのｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０値は、同じウイルスに感染したＷＴ ＰＡＭと比較して１〜３ｌｏｇ低かった。唯一の例外は、修飾生ウイルスワクチン株による感染であった。まとめると、結果は、ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭが、２型ウイルスへの感染に対して低減した感受性または寛容性を有することを示唆している。
ＣＤ１６３修飾ブタの１型および２型ウイルスの感染
ＷＴ（丸）、ＨＬ１１ｍ（四角）、およびＣＤ１６３−ヌル（三角）ブタを、代表的な１型（ＳＤ１３−１５）（図２２、パネルＡ、左グラフ）および２型（ＮＶＳＬ９７−７８９５）（図２２、パネルＡ、右グラフ）ウイルスにより感染させた。ヌル表現型ブタは、ＫＯおよびｄ（１５６７）アレルに由来した（図１７を参照）。同じウイルスを接種された３つの遺伝子型からのブタを１つのおり内で混ぜ合わせ、これによりＣＤ１６３修飾ブタをＷＴ同じおりの個体から排出されたウイルスへの連続曝露が可能になった。代表的な１型ウイルスに感染したブタの数は、ＷＴ（ｎ＝４）、ＨＬ１１ｍ（ｎ＝５）、およびヌル（ｎ＝３）；ならびに２型ウイルス：ＷＴ（ｎ＝４）、ＨＬ１１ｍ（ｎ＝４）、およびヌル（ｎ＝３）。図２２に示されるように、１型または２型ウイルスのいずれかに感染したＣＤ１６３ヌルブタは、すべての時点でウイルス血症に対して陰性であり、血清変換しなかった。予想どおり、ＷＴブタは増殖性感染され、両方のウイルスについて感染後７日に１０６テンプレート／５０μＬのＰＣＲ反応に到達する平均ウイルス血症レベルを有した。１４日までに、すべてのＷＴブタは血清変換された（図２２、パネルＢを参照）。ＰＡＭ感染結果と一致して（表１６）、１型ウイルスに感染した５匹のＨＬ１１ｍブタは、ウイルス血症またはＰＲＲＳＶ抗体の証拠を示さなかった。２型分離株ＮＶＳＬに感染したすべてのＨＬ１１ｍブタは、感染をサポートし、血清変換された（図２２、パネルＢ）。ＨＬ１１ｍブタの低減された許容値の存在は不明であった。４匹のＨＬ１１ｍブタのうち３匹の平均ウイルス血症は、ＷＴブタと同様であった。しかしながら、１匹のＨＬ１１ｍブタ、＃１０１（図２２、パネルＡ右グラフの白四角）については、ウイルス血症はＨＬ１１ｍ遺伝子型群の他のブタと比較して著しく低減した。ブタ＃１０１についてのウイルス血症の３〜４ｌｏｇ低減についての説明は明らかにならなかったが、いくらかのＨＬ１１ｍブタはＰＲＲＳＶに対してより寛容でなくなる可能性があることが示唆され、インビトロＰＡＭ感染結果をサポートする観察となった（表１６）。すべてのブタに同じ量のウイルスを接種し、ＷＴブタと混ぜ合わせたままであったため、ブタ＃１０１におけるより低いウイルス血症は、より低い量のウイルスを受けたまたはより低いウイルスへの曝露の結果ではなかった。マクロファージのフローサイトメトリーは、ブタ＃１０１のＣＤ１６３発現が他のＨＬ１１ｍブタに匹敵したことを示した（データ示さず）。エクソン１１模倣配列において配列の差はなかった。
ＮＶＳＬ９７−７８９５およびＫＳ０６−７２１０９の２つのウイルスを使用して、追加のウイルス感染試験を行った。その結果を図２３に示す。感染後３５日間、ブタを追跡し、感染後３、７、１１、１４、２１、２８、および３５日に行ったウイルス血症測定に対する曲線下面積（ＡＵＣ）としてデータを報告した。図２３に示されるように、ＮＶＳＬでは、ＮＶＳＬに感染した７匹のＷＴブタの平均ＡＵＣ値は１６８＋／−８であり、７匹のＨＬ１１ｍブタでは１６５＋／−１５であった。ＫＳ０６では、６匹のＷＴおよび６匹のＨＬ１１ｍブタの平均ＡＵＣ値は、それぞれ１５６＋／−９および１６３＋／−１３であった。両方のウイルスについて、ＷＴとＨＬ１１ｍブタとの間に統計的に有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。まとめると、結果は、ＨＬ１１ｍブタが１型ＰＲＲＳＶによる感染をサポートできなかったが、２型ウイルスによる感染に対する寛容性を維持したことを示した。インビトロで２型分離株に感染させたＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭのＰＲＲＳＶ寛容性が低減しても、この差はブタには変換されなかった。図２３に示される結果では、ウイルス量は、３５日の感染期間にわたって各ブタの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによって決定した。ＡＵＣ計算は、感染後０、４、７、１０、１４、２１、２８、および３５日に行ったｌｏｇ１０ＰＣＲウイルス血症測定値を用いて実施した。水平線は、平均および標準偏差を示す。キー：ＷＴ＝野生型ブタ、ＨＬ１１＝ＨＬ１１ｍ遺伝子型ブタ、Ｎｕｌｌ＝ＣＤ１６３−ヌル遺伝子型。
考察
ＣＤ１６３は、血液から過剰なＨｂを捕捉し、組織損傷に応じて炎症を調節するために重要なマクロファージ表面タンパク質である。これはまた、ウイルス受容体としても機能する。ＣＤ１６３は、炎症促進応答および抗炎症応答の両方に関与する（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＣＤ１６３陽性マクロファージは、代替的活性化Ｍ２群のマクロファージ（高い食作用性および抗炎症を有するものと一般に説明される）内に入れられる。Ｍ２マクロファージは、機械的組織損傷または感染後の浄化および修復に関与する（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。抗炎症能力において、ＣＤ１６３発現は、ＩＬ−１０などの抗炎症タンパク質によって上方調節される（Ｓｕｌａｈｉａｎ，ｅｔ ａｌ．，２００２）。炎症中、ＣＤ１６３は、血液からの循環ヘムを除去することによって酸化を低減することにより炎症を減少させる。ビルベルディン、ビリルビン、および一酸化炭素などのヘム分解生成物は、強力な抗炎症分子である（Ｓｏａｒｅｓ ａｎｄ Ｂａｃｈ，２００９およびＪｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，２００２）。炎症促進性能力では、マクロファージ表面上のＣＤ１６３の抗ＣＤ１６３抗体または細菌による架橋により、炎症性サイトカイン、例えばＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦαおよびＩＬ−１βの局所放出が起こる（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９およびＦａｂｒｉｅｋ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
ＣＤ１６３を欠くＧＥブタは、２型ＰＲＲＳＶ分離株の複製をサポートできない（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。この研究では、インビトロ感染試験は、ＣＤ１６３ヌル表現型マクロファージの、１型および２型ＰＲＲＳＶ分離株の広範な一団に対する抵抗性を実証し、さらに潜在的に、すべてのＰＲＲＳＶ分離株を含むように抵抗性が拡大される（表１６）。ＣＤ１６３−ヌル表現型マクロファージの、１型および２型ウイルスに対する抵抗性をインビボで確認した（図２２および図２３）。これらの結果に基づいて、文献において前に記載された他のＰＲＲＳＶ受容体の寄与（Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｙｏｏ，２０１５）を排除することができる。例えば、Ｓｈａｎｍｕｋｈａｐｐａ ｅｔ ａｌ．（２００７）は、ＣＤ１５１プラスミドでトランスフェクトした非寛容性ＢＨＫ細胞が、ＰＲＲＳＶ複製をサポートする能力を獲得し、ポリクローナル抗ＣＤ１５１抗体とのインキュベーションが、ＭＡＲＣ−１４５細胞の感染を著しく低減することを示した。加えて、元々ブタインフルエンザウイルスの増殖に使用するために開発されたサル細胞株ＳＪＰＬは、ＰＲＲＳＶ複製をサポートすることが以前に示された（Ｐｒｏｖｏｓｔ，ｅｔ ａｌ．，２０１２）。ＳＪＰＬ細胞株の重要な特性には、ＣＤ１５１の存在、ならびにシアロアドヘシンおよびＣＤ１６３の欠如が含まれた。まとめると、これらのデータは、ＣＤ１５１の存在だけでＰＲＲＳＶ複製をサポートするのに十分であるという説得力のある証拠を提供した。ＣＤ１６３ヌル表現型を有するマクロファージおよびブタにおけるＰＲＲＳＶ感染の欠如を示す本研究の結果は、ＰＲＲＳＶの代替受容体としてのＣＤ１５１が生物学的に関連しないことを示す。
ＰＲＲＳＶ表面上でＧＰ２ａ、ＧＰ３、ＧＰ４ヘテロ三量体複合体の一部を形成するウイルスタンパク質ＧＰ２ａおよびＧＰ４は、プルダウンアッセイにおいて、ＧＰ２およびＧＰ４プラスミドでトランスフェクトされた細胞からＣＤ１６３と共沈させることができる（Ｄａｓ，ｅｔ ａｌ．，２００９）。おそらく、ＧＰ２およびＧＰ４は、１つ以上のＣＤ１６３ ＳＲＣＲドメインとの相互作用を形成する。ブタＳＲＣＲ５とｈＣＤ１６３−Ｌ１ ＳＲＣＲ８由来のホモログとの間のドメインスワップを含むブタＣＤ１６３ ｃＤＮＡ骨格を組み込んだインビトロ感染性アッセイはさらに、１型ウイルスによって利用される領域をＳＲＣＲ５に限局させた（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ，ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＧＰ２／ＧＰ４とＣＤ１６３との間の安定した相互作用がＳＲＣＲ５を介して起こることを推測するのは興味深い。ＧＰ３およびＧＰ５などの追加のウイルス糖タンパク質は、ウイルス−受容体複合体をさらに安定化させ得るか、または共受容体分子として機能し得る。ＳＲＣＲ５に対する要求を、この研究ではＨＬ１１ｍアレル（ブタエクソン７において３３ｂｐの置換を作製することによりＣＤ１６３Ｌ１ ＳＲＣＲ８ドメインスワップを再構築した）を有するマクロファージおよびブタに感染させることによって調査した。ＨＬ１１ｍアレルには、遺伝子改変について陽性の細胞を選択するためにネオマイシンカセットも含まれた（図１７）。ＷＴ ＰＡＭと比べて低減したレベルではあるが、ＨＬ１１ｍブタは、ＰＡＭ上でＣＤ１６３を発現した（図１９、パネルＡおよびパネルＥを比較）。低減された発現は、おそらくネオマイシンカセットの存在のためであり、それは、エクソン１１模倣物と続くイントロンの間に位置した。ＨＬ１１ｍブタは、１型ウイルスの感染に対して寛容ではなく、ＳＲＣＲ５の重要性を確認した。しかしながら、ＨＬ１１ｍマクロファージおよびＨＬ１１ｍブタは、２型ウイルスによる感染をサポートした。ウイルス滴定および感染率結果に基づいて、ＨＬ１１ｍブタ由来のＰＡＭは、ＷＴマクロファージと比べてウイルスに対する寛容性の全体的な減少を示した（表１６および図１７）。寛容性の減少は、修飾ＣＤ１６３タンパク質に対するウイルスの親和性の低減とともに、ＨＬ１１ｍマクロファージ上のＣＤ１６３のレベルの低減に起因し得る。２型ウイルスがＳＲＣＲ５の要件を有し、Ｌ１ ＳＲＣＲ８が好適な置換物として機能することができると仮定すると、より低い親和性は、ヒトＳＲＣＲ８とブタＳＲＣＲ５との間のペプチド配列の差によって説明され得る（図１８、パネルＢを参照）。しかしながら、ＰＡＭの寛容性の低減は、ブタには変換されなかった。ＨＬ１１ｍブタの平均ウイルス血症は、ＷＴブタと比べて有意に異ならなかった（図２３）。ＰＡＭに加えて、血管内、中隔、およびリンパ系組織マクロファージのＰＲＲＳＶ感染は、ウイルス血症に寄与する（Ｌａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７およびＭｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。ＨＬ１１ｍブタにおける全体的なウイルス量を維持する際の、これらのおよび他のＣＤ１６３陽性細胞集団の潜在的寄与は、さらなる研究に値する。
ＳＲＣＲドメインの欠失を有するＣＤ１６３プラスミドが、ＨＥＫ細胞において安定して発現されるにもかかわらず（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、ｄ７（１４６７）およびｄ７（１２８０）におけるエクソン７および８の欠失は、ＣＤ１６３の検出可能な表面発現の欠如をもたらした（図１９、パネルＤ）。フローサイトメトリーに使用される２Ａ１０ｍＡＢは、３つのＮ末端ＳＲＣＲドメイン（Ｖａｎ Ｇｏｒｐ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、かつおそらく７番目および８番目のドメイン（Ｓａｎｃｈｅｚ，ｅｔ ａｌ．，１９９９）を認識するため、検出なしは、突然変異タンパク質中の２Ａ１０エピトープの除去によるものではなかった。少量のＣＤ１６３発現が一部のｄ７（１２９）ブタ由来のＰＡＭ上で検出できたが（図１９、パネルＣを参照されたい）、発現されたタンパク質の量は、ＰＡＭまたはブタにおいてＰＲＲＳＶ感染をサポートするには十分ではなかった。エクソン７および８欠失突然変異体におけるＣＤ１６３発現の不在は、完全には理解されていないが、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質分解の結果である可能性が高い。
２００３年に、ＣＤ１６３は、アフリカブタ熱ウイルスの受容体として同定された（ＡＳＦＶ；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００３）。この結論は、感染したマクロファージが成熟ＣＤ１６３陽性表現型を有し、２Ａ１０などの抗ＣＤ１６３抗体がインビトロでマクロファージのＡＳＦＶ感染をブロックするという観察に基づいた。ＣＤ１６３−ヌルブタがＡＳＦＶ感染に抵抗性があるかどうかは決定されていない。
ＰＲＲＳＶ受容体への修飾を組み込む細胞培養モデルは、ＰＲＲＳＶ侵入、複製、および病態形成の機序に関する貴重な洞察を提供した。この研究の独自の一態様は、受容体修飾ブタを使用するインビボでの並行実験の実施であった。この研究は、世界のブタ産業がこれまでに直面した中で最も深刻な疾患のうちの１つに対する予防的療法を開発する可能性に重要な影響を与える。
実施例４：ＳＩＧＬＥＣノックアウトブタの生成
以下の実施例は、ＳＩＧＬＥＣ１ノックアウトブタの生成について説明する。
材料および方法
別段の記載がない限り、本研究で使用される化学物質はすべて、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのものであった。
ブタＳＩＧＬＥＣ１遺伝子の標的破壊
動物およびウイルスの使用は、ミズーリ大学および／またはカンザス州立大学の大学動物愛護およびバイオセイフティ委員会によって承認された。相同組み換えを組み込んで、ＳＩＧＬＥＣ１からタンパク質コードエクソン２および３を除去し、未成熟終止コドンを導入して、残りのコード配列の発現を排除した（図２４）。ブタＳＩＧＬＥＣ１ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ２１４３４６）は、５，１９３塩基のｍＲＮＡ転写物由来の２１０−ｋＤａタンパク質をコードする（Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＳＩＧＬＥＣ１の周囲の領域からのゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＵ４６７６０９）を使用して、標的化構築物の生成のために、高忠実度ＰＣＲ（ＡｃｃｕＴａｑ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によってゲノム断片を増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを調製した。マウスおよびヒトゲノム配列との比較に基づいて、ブタＳＩＧＬＥＣ１は、２１個のエクソンを有すると予測された。加えて、エクソン２は、ブタ、マウス、およびヒトの間で保存される。ペプチド配列アライメントは、シアル酸結合と関与することが既知であるマウスＳＩＧＬＥＣ１におけるエクソン２コード領域内の６つのアミノ酸が、ブタＳＩＧＬＥＣ１内で保存されることを明らかにした。１つの断片、「上アーム」は、第１のコードエクソンの一部を表し、開始コドンから上流に３，３０４ｂｐを表した。第２の断片、または「下アーム」の長さは４，７５３ｂｐであり、第３のコードエクソンの下流にあるイントロンの大部分を表し、第６のイントロン（第４、第５、および第６のコードエクソンを含む）に伸長した。下アームと上アームとの間には、反対方向に挿入され、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下に配置されたｎｅｏカセットがあった。
参照を容易にするために、部分野生型ＳＩＧＬＥＣ１配列は、本明細書において配列番号１２２として提供される。参照配列は、エクソン１の上流に４，２３６ヌクレオチドを開始し、エクソン７までのすべてのイントロンおよびエクソンと、エクソン７の終了後に１，００８ヌクレオチドとを含む。配列番号１２３は、図２４のパネルＣに例示されるように、本明細書に記載される修飾を含有する部分ＳＩＧＬＥＣ１配列を提供する。部分野生型配列（配列番号１２２）と比較して、配列番号１２３において、ヌクレオチド４，２７９から５，５２５までの１，２４７塩基対の欠失があり、欠失した配列は、配列番号１２２と比較して反対方向に配向される１，８５５塩基対ネオマイシン選択可能カセットで置き換えられる。この挿入／欠失は、ＳＩＧＬＥＣ１遺伝子のエクソン１の部分、ならびにエクソン２および３のすべての喪失をもたらす。
妊娠３５日目から雄および雌胎児線維芽細胞初代細胞株を、大きな市販の白色ブタ（Ｌａｎｄｒａｃｅ）から単離した。細胞を培養し、５ｍＭのグルタミン、重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／リットル）、ペニシリン−ストレプトマイシン、および１ｇ／リットルのＤ−グルコースを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間、８０％コンフルエントになるまで成長させ、これには、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙ−Ｃｌｏｎｅ）、１０ｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および２．５ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子がさらに補充された。トランスフェクションの４時間前に培地を除去し、置き換えた。線維芽細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ｍＬで洗浄し、１ｍＬの０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む７５ｃｍ２フラスコから持ち上げた。
細胞をＤＭＥＭ中に再懸濁し、６００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集し、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、６００×ｇで１０分間再び遠心分離した。細胞塩（７５％の細胞塩［１２０ｍＭのＫＣｌ、０．１５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．６、５ｍＭのＭｇＣｌ２］および２５％のＯｐｔｉ−ＭＥＭ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］）を使用してペレットを再懸濁した（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。細胞を血球計でカウントし、１×１０６／ｍＬに調整した。細胞のエレクトロポレーションを、１×１０６細胞／ｍＬを含有する２００μＬのトランスフェクション培地中で０．７５〜１０ｇの二本鎖または一本鎖標的化ＤＮＡ（熱変性によって達成）で実施した。細胞を、２５０Ｖの３つの１−ｍｓパルスを使用することによってＢＴＸ ＥＣＭ２００１電気細胞マニピュレータ中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、１０，０００／１３ｃｍプレートでＤＭＥＭ−ＦＢＳ塩基性線維芽細胞増殖因子中で希釈し、選択的圧力なしで一晩培養した。翌日、培地をＧ４１８（ＧＥＮＴＩＣＩＮ、０．６ｍｇ／ｍＬ）を含有する培地で置き換えた。選択から１０日後、Ｇ４１８抵抗性コロニーを単離し、２４ウェルプレートに移して拡大した。ＰＣＲを使用して、ＳＩＧＬＥＣ１の標的化が成功したかどうかを判定した。ＰＣＲプライマー「ｆ」および「ｂ」ならびにＰＣＲプライマー「ａ」および「ｅ」（表１７、図２４）を使用して、両方のアームの標的化の成功を判定した。プライマー「ｆ」および「ｅ」は、各標的化アームの領域の外側でアニールされる。ＰＣＲプライマー「ｃ」および「ｄ」を使用して、無傷のｎｅｏ遺伝子の挿入を決定した。
体細胞核移入
ブタ卵母細胞を、ＡＲ Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入し、サプライヤーの指示に従って成熟させた。インビトロ成熟の４２〜４４時間後、卵母細胞を、０．５ｍｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ中で穏やかにボルテックスすることによって卵丘細胞から除去した。良好な形態および可視極性体（第２分裂中期）を有する卵母細胞を選択し、核移入まで３８．５℃で操作培地（０．６ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭのＨｅｐｅｓ、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＴＣＭ−１９９［Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］、モル浸透圧濃度３０５ｍＯｓｍ）中に保持した。
倒立顕微鏡を使用して、７．５ｇ／ｍＬのサイトカラシンＢを補充し、鉱物油で覆われた操作培地の滴下で、保持マイクロピペットを用いて無卵丘卵母細胞を保持した。透明帯を、第１の極性体付近の微細ガラス注入マイクロピペットで貫通し、第１の極性体および第２分裂中期染色体を含有する隣接細胞質をピペット中に吸引した。ピペットを引き出し、内容物を廃棄した。滑らかな表面を有する単一の丸く明るいドナー細胞を選択し、卵母細胞膜に隣接するペリビテリン空間に移した（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２００６およびＬａｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。核移入複合体（卵母細胞＋線維芽細胞）を、低カルシウム濃度（０．３Ｍのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ）の融合培地中で融合させた。次いで、融合した卵母細胞を、２００Ｍのチメロサールで１０分間暗闇で処理することによって活性化し、洗い流し、８ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）で３０分間処理し、卵母細胞を再び洗い流し、残りのＤＴＴを除去した（Ｍａｃｈａｔｙ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｍａｃｈａｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。融合および活性化後、卵母細胞を、４ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンを補充したブタ接合体培養培地３で３回洗浄し（Ｉｍ ｅｔ ａｌ．，２００４）、３８．５℃で、５％のＯ２、９０％のＮ２、および５％のＣＯ２の加湿雰囲気中で３０分間培養した。融合に成功したこれらの複合体を、外科的胚移入まで１５〜２１時間培養した。
胚移入
発情サイクルの段階に依存するスキームに従って１４日間、１８〜２０ｍｇのＲＥＧＵ−ＭＡＴＥ（アルトレノゲスト、２．２ｍｇ／ｍＬ；Ｉｎｔｅｒｖｅｔ，Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＤＥ）を飼料中に混合して投与することによって、代理未経産ブタを同期させた。最後のＲＥＧＵ−ＭＡＴＥ処置（１０５時間）後、１，０００単位のヒト絨毛性ゴナドトロピンを筋肉内注射して、発情を誘導した。スタンディング発情の日（０日目）またはスタンディング発情後の最初の日に代理ブタを使用した（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２００２）。代理動物を無菌的に調製し、生殖管を曝露するために尾腹部切開を行った。胚を卵巣采を通して１つの卵管に移入した。ブタを、３０日目前後に腹部超音波検査によって妊娠について検査し、次いで、妊娠１１４日目に出産するまで、妊娠期間を通して週１回検査した。
トランスジェニック子ブタにおけるＰＣＲおよびサザンブロット確認
ＰＣＲおよびサザンブロットアッセイについて、ゲノムＤＮＡを尾部組織から単離した。簡潔に述べると、組織を、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、および０．５％のＳＤＳ中の０．１ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で一晩５５℃で消化した。物質を中和したフェノールおよびクロロホルムで順次抽出し、ＤＮＡをエタノールで沈殿させた（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。野生型および標的ＳＩＧＬＥＣ１アレルの両方の検出を、ＳＩＧＬＥＣ１の標的領域に隣接するＤＮＡにアニールしたプライマーを用いてＰＣＲによって実施した。プライマーを以下の表１７に列挙する。３対のプライマーを使用して、それぞれ、チミジンキナーゼ（ＴＫ）下アーム領域（「ａ」順方向および「ｅ」逆方向、図２４の黒色の矢印）、上アームＮｅｏ領域（「ｆ」順方向および「ｂ」逆方向、図２４の薄灰色の矢印）、ならびにエクソン１およびｎｅｏ遺伝子（「ｃ」順方向および「ｄ」逆方向、図２４の濃灰色の矢印）を増幅した。プライマー「ｃ」および「ｄ」（図２４の濃灰色の矢印）の組み込みは、それぞれ約２，４００および約２，９００ｂｐの野生型アレルおよび標的アレルをもたらすように設計された。
Figure 2021521844
サザンブロットアッセイについて、ゲノムＤＮＡをＳｃａＩおよびＭｆｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）で３７℃で消化した。ＭｆｅＩのための部位は、翻訳開始部位の上流のゲノム領域およびイントロン６に存在する。ＳｃａＩ部位は、ｎｅｏカセット内に存在する。消化したＤＮＡをアガロースゲル上で分離し、毛管作用によってナイロン膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＮＹ＋、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、ＵＶ架橋によって固定化した（Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。イントロン４ならびにエクソン４および５の部分を含有するゲノム断片を、以下の表１８に列挙されるオリゴヌクレオチドを使用してＰＣＲによって増幅し、製造者のプロトコル（Ｒｏｃｈｅ）に従ってジゴキシゲニンで標識した。ハイブリダイゼーション、洗浄、およびシグナル検出を、製造者の推奨に従って実施した（Ｒｏｃｈｅ）。野生型および標的ＳＩＧＬＥＣ１遺伝子の予測サイズは、それぞれ７，８９２ｂｐおよび７，２０４ｂｐであった。
Figure 2021521844
ＰＡＭ細胞のＳＩＧＬＥＣ１（ＣＤ１６９）およびＣＤ１６３表面染色
肺洗浄により、ＰＡＭ細胞（ブタ肺胞マクロファージ）を収集した。簡潔に述べると、切除した肺におよそ１００ｍＬの冷ＰＢＳを充填した。単回洗浄後、ペレットをおよそ５ｍＬの冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、氷上で保存した。およそ１０７のＰＡＭ細胞を、５％のＦＢＳおよび０．１％のナトリウムアジド（ＰＢＳ−ＦＢＳ）を含む、５ｍＬのＰＢＳに希釈した２０μｇ／ｍＬの抗ブタＣＤ１６９（クローン３Ｂ１１／１１、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）または抗ブタＣＤ１６３（クローン２Ａ１０／１１、ＡｂＤ Ｓｅｒｏｔｅｃ）抗体中で３０分間、氷上でインキュベートした。細胞を遠心分離し、洗浄し、染色バッファーに希釈した１／１００フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁し、３０分間氷上でインキュベートした。少なくとも１０４の細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターおよびＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。
結果
ＳＩＧＬＥＣ１ノックアウトブタの作成
図２４に図示される、使用されるノックアウト戦略は、エクソン２および３が排除され、突然変異遺伝子から機能性タンパク質が得られないことが予想されるように、ＳＩＧＬＥＣ１の劇的な改変をもたらすことに焦点を当てた。加えて、遺伝子のさらなる破壊は、エクソン１の一部ならびにエクソン２および３のすべてを、反対方向に配向されるネオマイシン選択可能カセットで置き換えることによって達成された（Ｍａｎｓｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。様々なプラスミド調製物（０．７５〜１０μｇ／μＬ、単鎖構築物および二本鎖構築物の両方、ならびに中サイズ構築物および大サイズ構築物の両方）で３４回のトランスフェクションを行った。５つの異なるブタ胎児細胞株を表す雄細胞および雌細胞も含まれた。２，０００を超えるコロニーを、ｎｅｏカセットの標的挿入の存在についてスクリーニングした。ＰＣＲプライマー対「ｆ」＋「ｂ」および「ａ」＋「ｅ」（図２４、パネルＢおよびパネルＣ）を使用して、構築物の上アームおよび下アームの標的化が成功したかどうかを確認した。２つのコロニー（雄１および雌１）を試験したところ、正しい挿入の存在について陽性であった（データ示さず）。
雄クローン由来の細胞（４−１８）を、体細胞核移入および代理動物への６６６個の胚の移入に使用した。クローニングされた胚を２つの代理動物に移入することにより、合計８匹の子ブタが産生された。１匹の代理動物は、妊娠１１５日目に６匹の正常な雄子ブタを分娩した。妊娠１１７日目に第２の代理動物で帝王切開を行い、２匹の正常な雄子ブタをもたらした。３回の胚移入もまた、雌細胞（６５８個の胚）を用いて行ったが、いずれも妊娠を確立しなかった。図２５は、４−１８標的胎児線維芽細胞株から生成された８匹の雄子ブタクローン（Ｆ０）から抽出されたゲノムＤＮＡを用いて実施したＰＣＲの結果を示す。両方のアレルを検出するために、プライマー「ｃ」および「ｄ」を用いてＰＣＲを実施した（図２４、パネルＣ）。予測ＰＣＲ生成物サイズは、野生型アレルについて約２，４００ｂｐ、および標的アレルについて約２，９００ｂｐであった。プライマー「ｃ」および「ｄ」を用いたＰＣＲの結果を図２５に示す。すべてのブタを試験したところ、野生型２，４００ｂｐおよび標的２，９００ｂｐアレルの存在について陽性であった（図２５、パネルＢ）。クローニングに使用される細胞株、標的４−１８線維芽細胞株、および非標的４−１８細胞株由来のＤＮＡを組み込んだ対照ＰＣＲは、予測生成物を産生した（図２５、パネルＡ）。標的突然変異の存在は、図２４、パネルＣの薄灰色の矢印および黒色の矢印によって同定されたプライマー対を有する領域を増幅することによってさらに確認され、これらは、それぞれ約４，５００ｂｐおよび約５，０００ｂｐの生成物をもたらすことが予測された。結果は、８匹のファウンダーブタにおける両方の生成物の存在を示した（データ示さず）。
Ｆ０雄のうちの５匹を野生型雌との交配に使用し、６７匹のＦ１子孫（４０匹の雄および２７匹の雌）をもたらし、そのうちの３９匹（５８％）は、ＳＩＧＬＥＣ１＋／−であった。Ｆ１雄のうちの１匹をＦ１雌のうちの１匹（同腹子５２）と交配させて、１２匹のブタの同腹子を得、そのうちの１１匹は断乳するまで生存したままであった。子孫における野生型および標的アレルの同定は、ゲノムＤＮＡのサザンブロットによって行った。図２６の結果は、４匹のＳＩＧＬＥＣ１＋／＋、３匹のＳＩＧＬＥＣ１＋／−、および４匹のＳＩＧＬＥＣ１−／− Ｆ２動物を示す。
ＰＡＭ細胞上のＣＤ１６９（ＳＩＧＬＥＣ１）およびＣＤ１６３の発現。
抗体染色のための細胞を、研究の終わりにブタから得た。図２７に示されるように、ＳＩＧＬＥＣ１＋／／＋およびＳＩＧＬＥＣ１＋／−ブタ由来のＰＡＭ細胞の９０％超が、ＣＤ１６９およびＣＤ１６３に対して二重陽性であった。対照的に、ＳＩＧＬＥＣ１−／−ブタのすべては、ＣＤ１６９の表面発現に対して陰性であったが、ＣＤ１６３に対しては陽性のままであった。結果は、すべてのＳＩＧＬＥＣ１−／−ブタ由来の細胞上のＣＤ１６９発現の不在を示した。ＣＤ１６９表面発現の不在は、ＰＲＲＳＶ共受容体ＣＤ１６３の発現を改変しなかった。
実施例５：インビトロ由来卵母細胞および胚からＡＮＰＥＰにおいて染色体修飾を有するブタを産生するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の使用
材料および方法
化学物質および試薬
別段の記載がない限り、本研究で使用される化学物質はすべて、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入された。
ＡＮＰＥＰ特異的ＣＲＩＳＰＲを構築するためのｇＲＮＡの設計
ＡＮＰＥＰ（配列番号１３２）の全長ゲノム配列を使用して、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを設計した。この転写物は、３０，０００塩基対および３つのスプライス変異体（Ｘ１、Ｘ２、およびＸ３）を有する。Ｘ１は、２０個のエクソンを有し、１０１７個のアミノ酸タンパク質生成物（配列番号１３３）をコードする。Ｘ２およびＸ３は、エクソン２における開始コドン前に生じるスプライス部位において異なり、両方とも同じ９６３アミノ酸生成物（配列番号１３４）をコードする。
開始コドンがエクソン２内にあるため、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をＡＮＰＥＰ遺伝子のエクソン２内の領域に対して設計した。参照を容易にするために、全長ＡＮＰＥＰ配列の部分を含む参照配列を本明細書（配列番号１３５）に提供する。参照配列の配列番号１３５は、イントロン２、エクソン２、イントロン３、エクソン３、イントロン４、エクソン４の部分およびイントロン４の部分を含む。この参照配列（配列番号１３５）は、エクソン２内の開始コドン前の１０００ヌクレオチド、エクソン２のコード領域、およびエクソン２の終了後の１０００ヌクレオチドを含む。この配列の注釈付きバージョンが図２８に示される。図２８において、エクソン２、３、および４は下線が引かれている。エクソン２は、変異体Ｘ１およびＸ２と一致する、図２８のヌクレオチド７７５で開始する（変異体Ｘ３は、ヌクレオチド７７８でエクソン２を開始する）。この差は、開始コドンの前に生じるため、タンパク質生成物に影響を及ぼさない（開始コドンは、配列番号１３５のヌクレオチド１００１〜１００３においてであり、図２８において小文字太字で示される）。したがって、配列番号１３５のエクソン２、３、および４は、３つの変異体（配列番号１３３または配列番号１３４）の間でコードされる２つのタンパク質生成物中の最初の２９４アミノ酸をコードする。参照を容易にするために、本実施例および実施例６で以下に記載されるＩＮＤＥＬの各々は、参照配列の配列番号１３５を参照して記載される。アミノ酸配列を指す場合、スプライス変異体Ｘ２およびＸ３変異体（配列番号１３４）によってコードされる９６３アミノ酸タンパク質に言及される。しかしながら、当業者は、挿入または欠失がスプライス変異体Ｘ１（配列番号１３３）によってコードされるアミノ酸配列内のどこで生じるかを容易に決定することができるであろう。図２８に示す参照配列の配列番号１３５に含まれるイントロンおよびエクソンに対応するヌクレオチドのリストを、以下の表１９に提供する。
Figure 2021521844
すべてのガイドＲＮＡは、開始コドンの後に設計され、それによりＩＮＤＥＬがフレームシフトおよび早期開始コドンをもたらす可能性がより高くなった。選択された６つの標的は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐｙ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接しており（Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）、以下の表２０に列挙される。ＰＡＭは、各ｇＲＮＡにおける括弧によって同定される。ガイド２およびガイド３はまた、図２８の配列番号１３５において太字および二重下線で同定される。設計されたｃｒＲＮＡの特異性は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて類似のブタ配列を検索することによって確認された。
Figure 2021521844
以下の表２１に列挙される各ＡＮＰＥＰ標的に対応する順方向（Ｆ）および逆方向（Ｒ）オリゴヌクレオチドをアニールし、２つの発現カセット、ヒトコドン最適化Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ｈＳｐｙ）Ｃａｓ９、およびキラメガイドＲＮＡを含有するｐ３３０Ｘベクターにクローニングした。Ｐ３３０Ｘを、ＢｂｓＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い、Ｚｈａｎｇ実験プロトコル（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｚｈａｎｇ／において入手可能、Ｃｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３およびＨｓｕ ｅｔ ａｌ．，２０１３を参照）に従って消化した。各ガイドのクローニング成功は、ミズーリ大学ＤＮＡ中核施設によってサンガー配列決定によって確認された。クローニングに成功したプラスミドをＴＯＰ１０エレクトロコンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）を用いて大規模プラスミド調製を実施した。インビトロ転写テンプレートのために、またはトランスフェクションのために使用するまで、プラスミドを−２０℃で凍結した。
Figure 2021521844
胎児線維芽細胞収集
ブタ胎児を妊娠３５日目に収集して、トランスフェクションのための細胞株を作成した。大きな白色家畜雑種から、１つの野生型雄および１つの野生型雌胎児線維芽細胞株を確立した。胎児線維芽細胞を、わずかな修飾を加えて以前に記載されるように収集し（Ｌａｉ ａｎｄ Ｐｒａｔｈｅｒ．，２００３ａ）、各胎児の背中からの組織ミンチを、２０ｍＬの消化培地（Ｌ−グルタミン、１ｇ／ＬのＤ−グルコース（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、および２００単位／ｍＬのコラーゲナーゼ、および２５Ｋｕｎｉｔｚ単位／ｍＬのＤＮＡｓｅＩを含有するダルベッコ改変イーグル培地）中、３８．５℃で５時間消化した。消化後、胎児線維芽細胞を洗浄し、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および４０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭで培養した。一晩培養した後、細胞をトリプシン処理し、１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＦＢＳ中のアリコート中で−８０℃にゆっくり凍結して、液体窒素中で長期保存した。
ＡＮＰＥＰ ＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡによるトランスフェクション
トランスフェクション条件は、以前に報告されたプロトコルと類似していた（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。簡潔に述べると、６つのＡＮＰＥＰガイドを、１７トランスフェクションにわたって異なる組み合わせで試験した。総ＣＲＩＳＰＲガイド濃度は、２μｇ／トランスフェクションであった。同様の継代数（２〜４）の胎児線維芽細胞株を２日間培養し、１５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２．５ｎｇ／ｍＬの塩基性線維芽細胞増殖因子（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および２５μｇ／ｍＬのＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（アンホテリシンＢ）が補充された、Ｌ−グルタミンおよび１ｇ／ＬのＤ−グルコース（Ｃｅｌｌｇｒｏ，Ｍａｎａｓｓａ，ＶＡ、ＤＭＥＭ）を含有するダルベッコ改変イーグル培地中で７５〜８５％のコンフルエントになるまで成長させた。線維芽細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）で洗浄し、トリプシン処理した。細胞が分離するとすぐに、細胞をエレクトロポレーション培地（７５％細胞塩（１２０ｍＭのＫＣｌ、０．１５ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．６、５ｍＭのＭｇＣｌ２））（Ｙａｎｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６）および２５％のＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗い流した。細胞は、血球計算盤を使用してカウントした。細胞を６００×ｇで５分間ペレット化し、１×１０６／ｍＬの濃度でエレクトロポレーション培地に再懸濁した。各エレクトロポレーションは、２５０ボルトでＢＴＸ ＥＣＭ２００１エレクトロポレーションシステムを通じて投与される３つの（１ミリ秒）矩形波パルスを有する２ｍｍギャップキュベット中の２００μＬ（０．２Ｘ１０６の総細胞）の細胞を使用した。エレクトロポレーション後、細胞を上述のＤＭＥＭ培地に再懸濁した。トランスフェクション後、１４日目にコロニーを採取した。胎児線維芽細胞を、５０細胞／プレートで播種した（Ｂｅａｔｏｎ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ ２０１４）。胎児線維芽細胞コロニーを、各コロニーの周囲に１０ｍｍのオートクレーブクローニングシリンダーを密封することによって収集した。コロニーをＰＢＳで洗い流し、トリプシンを介して収穫し、次いでＤＭＥＭ培養培地に再懸濁した。再懸濁したコロニーの一部（１／３）を、遺伝子型決定のために９６ウェルＰＣＲプレートに移し、残り（２／３）の細胞を、細胞増殖および後に続く体細胞核移入（ＳＣＮＴ）のために２４ウェルプレートのウェル内で培養した。細胞ペレットを、６μＬの溶解緩衝液（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．９、０．９％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に再懸濁し、細胞溶解のために６５℃で３０分間インキュベートし、続いて８５℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化した。次いで、細胞溶解物を、ＰＣＲを介した遺伝子型決定に使用した。
体細胞核移入（ＳＣＮＴ）
ＳＣＮＴ胚を産生するために、経産ブタ由来卵母細胞をＤｅｓｏｔｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＬＣ（Ｓｅｙｍｏｕｒ，ＮＴ）から購入した。経産ブタ由来卵母細胞を、成熟培地（２．９ｍＭのＨＥＰＥＳ、５μｇ／ｍＬのインスリン、１０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、０．５μｇ／ｍＬのｐ−ＦＳＨ、０．９１ｍＭのピルビン酸塩、０．５ｍＭのシステイン、１０％のブタ卵胞液、２５ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むＴＣＭ１９９）中で一晩出荷し、２４時間後に新鮮な培地に移した。４０〜４２時間の成熟後、卵母細胞を、０．１％のヒアルロニダーゼの存在下でボルテックスすることによって卵母細胞から除去した。ＳＣＮＴ中、卵母細胞を、７．０μｇ／ｍＬのサイトカラシンＢが補充された操作培地（０．６ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭのＨＥＰＥＳ、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＴＣＭ１９９；浸透圧濃度３０５）中に配置した。おそらく第２分裂中期プレートを含有する隣接細胞質の部分とともに極性体を除去し、ドナー細胞を薄いガラス毛細管を使用してペリビテリン空間内に配置した（Ｌａｉ ａｎｄ Ｐｒａｔｈｅｒ．，２００３ｂ）。次いで、再構築された胚を、ＢＴＸ電気細胞マニピュレータ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、１．２ｋＶ／ｃｍの２つのＤＣパルス（１秒間隔）で３０μ秒にわたって、融合培地（０．３Ｍのマンニトール、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、０．１ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ）中で融合させた。融合後、融合胚を２００μＭのチメロサールで１０分間暗闇で、および８ｍＭのジチオスレイトールで３０分間、化学的に活性化した（Ｍａｃｈａｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。次いで、胚を、前述のように、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤である０．５μＭのＳｃｒｉｐｔａｉｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ７８１７）を用いて、修飾ブタ接合培地ＰＺＭ３−ＭＵ１（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．，２００２）中で１４〜１６時間インキュベートした（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
体外受精（ＩＶＦ）
ＩＶＦのために、思春期前の未経産ブタ由来の卵巣を屠場（Ｆａｒｍｌａｎｄ Ｆｏｏｄｓ Ｉｎｃ．，Ｍｉｌａｎ，ＭＯ）から得た。１０ｍＬのシリンジに取り付けられた１８ゲージの皮下針を使用して、中サイズ（３〜６ｍｍ）の卵胞から未成熟卵母細胞を吸引した。次いで、均質な細胞質を有する卵母細胞および無傷の形質膜および周囲の卵丘細胞を、成熟のために選択した。約５０個の卵丘卵母細胞複合体を、加湿空気中、５００μＬの成熟培地（３．０５ｍＭのグルコース、０．９１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．５７ｍＭのシステイン、１０ｎｇ／ｍＬの表皮成長因子（ＥＧＦ）、０．５μｇ／ｍＬの黄体形成ホルモン（ＬＨ）、０．５μｇ／ｍＬの卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、１０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン（ＡＰＰ Ｐｈａｒｍ，Ｓｃｈａｕｍｂｕｒｇ，ＩＬ）、および０．１％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）と一緒にＴＣＭ１９９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ））を含有するウェル中に４２〜４４時間、３８．５℃、５％のＣＯ２で配置した。成熟に続いて、０．１％のヒアルロニダーゼの存在下で３分間ボルテックスすることによって、周囲の卵丘細胞を卵母細胞から除去した。インビトロで成熟した卵母細胞を、２５〜３０個の卵母細胞群のＩＶＦ培地（１１３．１ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＫＣｌ、７．５ｍＭのＣａＣｌ２、１１ｍＭのグルコース、２０ｍＭのトリス、２ｍＭのカフェイン、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する修飾トリス緩衝培地（ｍＴＢＭ））の５０μＬの液滴に入れた。１００μＬの野生型精液の１つの冷凍ペレットを、０．１％のＢＳＡが補充された３ｍＬのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で解凍した。精液を、６０％パーコール中で２０分間、６５０×ｇで洗浄し、ｍＴＢＭ中で１０分間、遠心分離によって洗浄した。次いで、精液ペレットをＩＶＦ培地で０．５×１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。５０μＬの精液懸濁液を、卵母細胞を有する液滴中に導入した。配偶子を、空気中の５％のＣＯ２の雰囲気中３８．５℃で５時間、共インキュベートした。受精後、胚を、空気雰囲気下３８．５℃、５％のＣＯ２でＰＺＭ３−ＭＵ１中でインキュベートした（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０、Ｙｏｓｈｉｏｋａ ｅｔ ａｌ．２００２）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のＲＮＡのインビトロ合成
接合体注入のためのｇＲＮＡを、以前に記載されているように調製した（Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。テンプレートガイドＤＮＡを、最初にｇＢｌｏｃｋの形態で統合ＤＮＡ技術によって合成した。インビトロ転写のためのガイドの上流にＴ７プロモーター配列を付加した（表２２において下線を引いた）。各ｇＢｌｏｃｋを、最終濃度０．１ｎｇ／μＬに希釈し、表２２に列挙されるインビトロ転写（ＩＶＴ）順方向プライマー（各ＣＲＩＳＰＲガイドに対して固有）および同一の逆方向プライマー（ｇＲＮＡ Ｒｅｖ１）でＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ条件には、９８℃で１分間の初期変性、続いて９８℃（１０秒）、６８℃（３０秒）、および７２℃（３０秒）の３５サイクルが含まれた。各ＰＣＲ増幅ｇＢｌｏｃｋを、ＱＩＡＧＥＮ ＰＣＲ精製キットを使用することによって精製した。次いで、精製したｇＢｌｏｃｋアンプリコンを、ＭＥＧＡＳＨＯＲＴＳＣＲＩＰＴ転写キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、インビトロ転写のためのテンプレートとして使用した。ＲＮＡの品質を、２．０％のＲＮＡを含まないアガロースゲル上で可視化した。濃度および２６０：２８０比を、ＮＡＮＯＤＲＯＰ分光光度法を介して決定した。キャップ形成およびポリアデニル化されたＣａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｓｉｇｍａから購入した。ＲＮＡを２０ｎｇ／μＬの最終濃度まで希釈し（ｇＲＮＡおよびＣａｓ９の両方）、３μＬのアリコートに分配し、注入まで−８０℃で保管した。
Figure 2021521844
接合体におけるＡＮＰＥＰ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の接合体注入
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、ＡＮＰＥＰ ｇＲＮＡ２および３と混合した（表２０）。ｇＲＮＡ２は、胎児線維芽細胞トランスフェクション後に最も高い編集効率を有したため、選択された。ｇＲＮＡ３は、胎児線維芽細胞トランスフェクション後に編集能力を有しなかったため、陰性対照として選択された。この設計は、胎児線維芽細胞トランスフェクションおよび接合体注入という２つの方法間で同様の編集速度が観察されるかどうかを確認するために選択された。ｇＲＮＡ２およびｇＲＮＡ３（２０ｎｇ／μＬ）とＣａｓ９ ｍＲＮＡ（２０ｎｇ／μＬ）との混合物を、ＦＥＭＴＯＪＥＴマイクロインジェクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ；Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって、受精後１４時間に受精した卵母細胞の細胞質（推定接合体）に共注入した。Ｎｉｋｏｎ倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の加熱したステージ上の操作培地（０．６ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．９ｍＭのＨＥＰＥＳ、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｎｇ／ｍＬのゲンタマイシン、および３ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを有するＴＣＭ１９９、モル浸透圧濃度３０５）中でマイクロインジェクションを行った。次いで、注入した接合体を、胚移入まで１０ｎｇ／ｍＬのｐｓ４８でＰＺＭ３−ＭＵ１中に移入するか、または遺伝子型確認のために胚盤胞段階まで発達させた。
遺伝子型決定アッセイ
ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲ、アガロースゲル電気泳動、およびその後のサンガーＤＮＡ配列決定による遺伝子型を評価した。標準プロトコルおよびＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して、以下の表２３に列挙されるＡＮＰＥＰ特異的プライマーを用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲ条件は、９６℃で２分間、および９５℃で３０秒間、５０℃で４０秒間、および７２℃で１分間の３５サイクル、続いて７２℃で２分間の伸長からなっていた。次いで、９６５ｂｐのアンプリコンを、２．０％のアガロースゲル上で分離して、明らかな挿入または欠失を決定した。アンプリコンをサンガー配列決定に供して、修飾の正確な位置を決定した。生きたブタ由来のアンプリコンを、ＴＯＰＯクローニングし、ＤＮＡ配列決定して、両方のアレルの正確な修飾を決定した。
Figure 2021521844
胚移入
ＡＮＰＥＰ編集ブタを産生するために生成された胚を、正期産のためにレシピエント未経産ブタに移入した。ＳＣＮＴおよびＩＶＦ接合体を注入した胚について、胚を一晩培養し、発情サイクルの１日目に未経産ブタの卵管に移入するか（ＳＣＮＴ）、または５日間培養した後、発情サイクルの４、５、または６日目に未経産ブタの卵管に移入するか（ＩＶＦおよびＳＣＮＴ）のいずれかであった。すべての胚を、１０ｎｇ／ｍＬのｐｓ４８（５−（４−クロロ−フェニル）−３−フェニル−ペンタ−２−エノイン酸、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）の存在下でＰＺＭ３−ＭＵ１（Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１０）中の外科部位に輸送した。発達の段階にかかわらず、すべての胚を、レシピエント未経産ブタの卵管の膨大部−狭部接合部に外科的に移入した（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１３）。ＳＣＮＴ胚を用いて実施された胚移入（ＥＴ）は合計４回、接合子注入胚を用いて実施されたＥＴは６回であった。トランスフェクション後に単離された元のコロニーからのドナー細胞を使用して、ＳＣＮＴの最初の２つの胚移入を実施した。ＳＣＮＴのための第２の２つのＥＴのドナー細胞を、最初の２つのＥＴから収集された３５日目の胎児から単離した。
免疫組織化学
修飾ブタの回腸中のＡＮＰＥＰの存在を検出するための免疫組織化学を、標準手順を使用して実施した。収集の際、腸組織を直ちに１０％の緩衝ホルマリン中に配置した。処理後、パラフィン包埋切片をスライド上に載置した。切片をＬｅｉｃａ ＢＯＮＤ脱ワックス溶液（溶媒系脱パラフィン化溶液）で脱ワックスし、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤエピトープ賦活化溶液１（ホルマリン固定パラフィン包埋組織の熱誘導エピトープ賦活化のためのクエン酸塩系ｐＨ６．０エピトープ賦活化溶液）を使用して、１００℃で２０分間抗原賦活化を実施した。スライドを３％の過酸化水素により室温で５分間インキュベートし、ＮｅｘＥＳ ＩＨＣ染色モジュール（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ）上で自動手順を使用することによって可視化した。ヒトＣＤ１３のアミノ酸４００〜５００をカバーするペプチドに対して調製したウサギ抗ＣＤ１３（ＡＰＮ）ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）を、ＡＰＮ抗原の検出に使用した。抗体を、Ｌｅｉｃａ ＢＯＮＤ一次抗体希釈液中（トリス緩衝生理食塩水、界面活性剤、タンパク質安定剤、および０．３５％のＰＲＯＣＬＩＮ９５０（２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン溶液）を含有する）、１：３２００で希釈し、スライド上で１５分間、室温でインキュベートした。スライドを洗浄し、結合した抗体を、抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用いて検出した。ＨＲＰ活性を３，３´−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で可視化し、スライドをヘマトキシリンで対染色した。
結果
ＡＮＰＥＰ ＣＲＩＳＰＲガイドプラスミドによるトランスフェクション
合計１７回のトランスフェクションを実施し、どのＣＲＩＳＰＲガイドがＡＮＰＥＰ遺伝子を効率的に編集するかを決定するとともに、ＳＣＮＴで使用するためのＣＲＩＳＰＲ誘導ＡＮＰＥＰ編集で初代細胞株を単離した。各実験におけるトランスフェクション効率を、以下の表２４に要約する。ＡＮＰＥＰガイド２は、単独でトランスフェクトした場合、最も多くの編集コロニーをもたらした。ＡＮＰＥＰガイド２を用いて合計４回のトランスフェクションを行い、編集効率は０〜２３．３％の範囲であった。ＤＮＡ電気泳動後にＰＣＲアンプリコンの観察可能なサイズ差が存在する場合、コロニーが編集されたとみなされた。得られたブタおよび胎児のみを配列決定して、編集の正確な位置およびサイズを決定した。ＡＮＰＥＰガイド１は、４回のトランスフェクションにわたって０〜７．１％の範囲の編集率を有する二番目に効率的なガイドであった。興味深いことに、ＡＮＰＥＰガイド１および２を混合し、共トランスフェクトしたとき、編集率は、３回のトランスフェクションにわたって０％であった。ＡＮＰＥＰガイド３および４は、編集（各々２回のトランスフェクション）をもたらさず、ＡＮＰＥＰガイド５および６は、２．９％および４．２％の編集をもたらしたが、各ガイドに対して単一のトランスフェクションのみを実施した。ＡＮＰＥＰガイド２でトランスフェクトされたコロニーＥ９、Ｆ７、Ｄ１１、およびＡＮＰＥＰガイド１でトランスフェクトされたコロニーＡ１０を、ＳＣＮＴのために選択した。
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ＡＮＰＥＰ編集細胞の体細胞核移入
コロニーＥ９、Ｆ７、Ｄ１１、およびＡ１０由来の細胞をＳＣＮＴに使用した。各細胞群から等しい数の胚を再構築したが、胚をＥＴ中に単一のブタにおいて混合した。これらの初代コロニー細胞を用いて２つの胚移入を実施し、結果として両方のブタが妊娠した。胎児収集のために、妊娠を３５日目に終了させた。１０匹の胎児をブタＯ２７９から収集し、そのうちの３匹は、ＡＮＰＥＰ遺伝子中に両アレル編集を含有した。５匹の胎児をブタＯ３０７から収集し、そのうちの３匹は、ＡＮＰＥＰ遺伝子中に両アレル編集を含有した。各胎児を遺伝子型決定し、結果として生じた遺伝子型を以下の表２５に列挙する。
図２９は、ＥＴからレシピエントＯ２７９およびＯ３０７に観察された４つの遺伝子型にわたるＰＣＲからのアンプリコンを示す代表的なアガロースゲルを示す。レーン１は、１８２ｂｐの欠失／ＷＴなしであり、レーン２は、９ｂｐの欠失／ＷＴなしであり、レーン３は、野生型であり、レーン４は、ａ８６７ｂｐの欠失（ゲルの底に向かう明帯）／ＷＴなしであり、レーン５は、野生型である。胎児の多くは、両アレルであった（すなわち、２つの修飾アレルを有した）。各場合において、それらは、特徴付けられたアレル（例えば、１８２ｂｐの欠失）および非野生型アレルを有した。第２の非野生型アレルは、配列決定または同定されなかった。野生型核酸および水を、それぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。
各胎児から胎児線維芽細胞株を作成し、次いで２つの追加のＳＣＮＴおよびＥＴについて、３つの胎児株をＳＣＮＴに使用した。いずれのレシピエントブタも、新たに確立された胎児細胞株から妊娠しなかった（表２５）。
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接合体注入
ＡＮＰＥＰ ｇＲＮＡを注入したＩＶＦ接合体で６回のＥＴを試みた。胚移入データを以下の表２６に要約する。最初の３回のＥＴは、２回の妊娠をもたらした。１匹のブタは、妊娠しなかった。１匹のレシピエント（ブタＯ３４５）を３５日目に安楽死させ、６匹の胎児を収集した。６匹の胎児のうち、４匹は、表２６に要約されるようなＡＮＰＥＰ遺伝子の編集を含有した。図３０は、これら６匹の胎児に存在するアレルを示す代表的なＰＣＲ結果を提供する。「水」とマークされたレーンは、陰性のテンプレートなし対照である。「ＷＴ対照」とマークされたレーンは、非トランスフェクト胎児線維芽細胞由来のＤＮＡを含有する野生型陽性対照である。レーン１〜６は、以下の遺伝子編集を有することが見出された６匹の胎児のＰＣＲ結果を提供する：（１）レーン１：１塩基対の挿入／野生型なし；（２）レーン２：２塩基対の挿入／野生型；（３）レーン３：野生型；（４）レーン４：野生型；（５）レーン５：３塩基対の挿入、９塩基対の欠失、および２６７塩基対の欠失（モザイク）；ならびに（６）レーン６：９塩基対の欠失／野生型。遺伝子型記述が「ＷＴなし」または「野生型なし」という語句を含む場合、これは、胎児が特徴付けられておらず、配列決定されていない（但し野生型ではない）第２のアレルを有していたことを意味する。命名された修飾アレルを配列決定し、以下に記載する。
３匹目のブタは、４匹の子ブタを出産し、そのうち３匹が編集された。この同腹子（「同腹子４」）の遺伝子型を、ＴＯＰＯクローニングおよびサンガー配列決定を使用して決定し、表２７に要約する。これら４匹の子ブタ由来の各ＡＮＰＥＰアレルを、野生型（ＷＴ）またはテンプレートなし対照（ＮＴＣ）と比較して示す代表的なＰＣＲ結果を図４に示す。図３１のレーン１〜４は、以下に対応する。（１）アレル１のエクソン２における９塩基対の欠失およびアレル２における野生型配列を有する子ブタ４−１、（２）アレル１のエクソン２における１塩基対の挿入およびアレル２のエクソン２における２塩基対の挿入を有する子ブタ４−２、（３）両方のアレルに野生型配列を有する子ブタ４−３、ならびに（４）アレル１のエクソン２における９塩基対の欠失およびアレル２における野生型配列を有する子ブタ４−４。修飾アレルを配列決定し、本明細書において以下に記載する（表２９および３０）。この同腹子（４−２）の雌１匹を、以下の実施例６に記載されるＰＥＤＶおよびＴＧＥＶ曝露のためのブタを作成するためにファウンダー動物として使用した。
残りの３回のＥＴを、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、およびインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）（それぞれ４０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、および２０ｎｇ／ｍＬ）を含有する培地中で成熟させた卵母細胞で実施した。これらの増殖因子（総称してＦＬＩ）は、卵母細胞成熟の質を改善するために、Ｙｕａｎおよび同僚によって示された（Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これら３回のＦＬＩ胚移入のうち、２匹のレシピエントは妊娠せず、１匹のレシピエントは９匹の子ブタを産んだ。９匹の子ブタのうち、７匹はＡＮＰＥＰの編集を含み、２匹は野生型であった。この同腹子（「同腹子１５８」）の遺伝子型を、ＴＯＰＯクローニングおよびサンガー配列決定を使用して決定し、以下の表２８に要約する。これらの子ブタ由来の各ＡＮＰＥＰアレルを、野生型（ＷＴ）またはテンプレートなし対照（ＮＴＣ）と比較して示す代表的なＰＣＲ結果を図３２に示す。この同腹子からの雌１匹（１５８−１）およびこの同腹子からの雄１匹（１５８−９）をファウンダー動物として使用して、以下の実施例６に記載されるＰＥＤＶおよびＴＧＥＶ曝露のための子ブタを作成した。
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挿入−欠失（ＩＮＤＥＬ）の遺伝子型決定および表現型特徴付け
表２５〜２８に同定される各修飾アレルは、ゲノムＤＮＡ隣接エクソン２から増幅されたＰＣＲ生成物の配列決定に基づいて同定された。タンパク質翻訳および表現型に対するこれらのアレルの予想される効果は、代表的なＲＮＡを修飾動物からアミノ酸配列に翻訳することによって決定した。各アレルは、以下の表２９および３０に詳細に要約される。
以下の実施例６に記載される疾患研究のためのファウンダー動物として、２匹の生きた同腹子から３匹のブタ（１５８−１、１５８−９、および４−２）を選択した。各アレルには、Ａ〜Ｈという文字表記が割り当てられ、アレルＡは野生型であった。各修飾アレルおよび野生型ＡＮＰＥＰアレルを、予測表現型とともに図３３に図示する。図３３において、黒色の矩形はコード領域を表し、灰色の領域は挿入を表す。数字は、挿入および／または欠失が発生した場所を示す。
ＡＮＰＥＰ修飾雄ブタ（１５８−９）および１匹の修飾雌親は、ＢおよびＣアレル（雄ブタ）またはＤおよびＥアレル（雌親）からなる両アレルヌル編集を有した。第２の修飾雌親（１５８−１）は、野生型（Ａ）、ヌル（Ｈ）、ヌル（Ｄ）、および他の編集されたアレル（ＦおよびＧ）の組み合わせについてモザイクであった。Ｂアレルは、開始コドンの欠失を含む６６１塩基対の欠失を有し、欠失した配列は、８塩基対の挿入で置き換えられる。したがって、Ｂアレルは、タンパク質の完全な喪失をもたらす。Ｃアレルは、８塩基対の欠失から生じ、欠失した配列は、ａおよび３塩基対の挿入によって置き換えられ、アミノ酸１９４から始まるミスコードによるフレームシフト編集、およびアミノ酸２２３での未熟終止コドンを引き起こす。２つのヌルアレルＤおよびＥはまた、それぞれ１または２塩基対の挿入の結果であるフレームシフト編集も含有した。具体的には、エクソン２における１および２ｂｐの挿入は、両方のアレルについてアミノ酸１９４でミスコードをもたらし、１塩基対の挿入についてはアミノ酸２２０で、２塩基対の挿入についてはアミノ酸２２５で未成熟終止コドンをもたらした。アレルＨは、単一塩基対の欠失を含有し、これはまた、アミノ酸１９４でミスコードをもたらし、アミノ酸２２４で未成熟終止コドンをもたらした。ＦおよびＧアレルは、それぞれフレームシフト編集を引き起こさなかった９および１２塩基対の欠失を有し、むしろこれらは、野生型アミノ酸配列（配列番号１３４）と比較して、それぞれ、ペプチド配列１９４−Ｍ−Ｅ−Ｇおよび１９４−Ｍ−Ｅ−Ｇ−Ｎの除去をもたらした。アレルＧはまた、野生型アミノ酸配列（配列番号１３４）と比較してＶ１９８Ｉの単一アミノ酸置換を有した。
参照を容易にするために、以下の表２９は、ＳＣＮＴおよびＩＶＦ実験から収集した胎児において同定された各編集を説明する（図２９および図３０）。以下の表３０は、同腹子４（図３１）および１５８（図３２）からの生きたブタにおいて見出される各編集、例えば、ファウンダー動物（アレルＡ〜Ｈ）における編集を説明する。該当する場合、非ファウンダー動物（または胎児）において見出されるアレルＡ〜Ｈと同一のアレルが同定される。
ファウンダー動物（アレルＡ〜Ｈ）における各編集の表現型は、修飾ブタの回腸におけるＡＮＰＥＰ（ＣＤ１３）の発現について免疫組織化学（ＩＨＣ）によって確認された（図３４）。図３４は、２つのＡアレル（野生型、＋／＋）、２つのヌルアレル（Ｅ／Ｂ、−／−）、またはヌルアレルを、アレルＦ（９塩基対／３アミノ酸欠失、Ｂ／Ｆ、−／ｄ９）またはＧ（１２塩基対／４アミノ酸欠失、Ｂ／ＧもしくはＣ／Ｇ、−／ｄ１２）と組み合わせて有するブタの回腸の代表的なＩＨＣ画像を示す。図３４において−／ｄ１２とラベル付けされた画像は、Ｂ／ＧまたはＣ／Ｇ遺伝子型のいずれかで得られた結果を表す。
図３４に示される結果を生成するために、パラフィン包埋組織切片を、ヒトＣＤ１３のアミノ酸４００〜５００をカバーするペプチドに対して調製したウサギ抗ＣＤ１３ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ）の１：３２，０００希釈で染色した。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧで検出し、ＨＲＰ活性を３，３´−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で可視化した。２つの野生型アレルを有する動物からの回腸において、ＡＮＰＥＰに対する強い免疫反応性が観察されたが、２つのヌルアレルを有する動物において、ＡＮＰＥＰ免疫反応性は観察されなかった。現象的には、ＦまたはＧアレルのいずれかを有するブタは、４つのアミノ酸欠失編集におけるより弱い免疫反応性を除いて、ＡＮＰＥＰに対する免疫反応性を示した。
ファウンダー動物（１５８−１、１５８−９、および４−２）を、突然変異の任意の表現型効果について毎日観察した。図３５は、性成熟時のブタ１５８−１の写真を示す。これらの動物はすべて健康であるように見え、いずれの動物についても有害な観察は認められなかった。特に、授乳に関する顕著な問題は観察されなかった。ファウンダー雌ブタ１５８−１（野生型アレルを有するモザイク動物）は、正常に授乳した。ファウンダー雌ブタ４−２は、最初の同腹子にうまく授乳できなかったが、これは最初のパリティの雌ブタでは珍しいことではない。ファウンダー雌ブタ４−２は、２番目の同腹子には正常に授乳した。したがって、乳腺形成および授乳は正常であるように見えた。出願の時点で、ブタ１５８−１および１５８−９はおよそ２．５歳であり、ブタ４−２は約３歳であり、有害な観察は認められなかった。
以下の実施例６に記載されるウイルス曝露研究で使用されるすべての動物はまた、突然変異の任意の表現型効果について毎日モニターした。修飾ＡＮＰＥＰアレルを含有する動物は、ＴＧＥＶ感染の兆候を一切示さず、健康であるように見えた。
Figure 2021521844
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実施例６：ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を有するブタにおけるＴＧＥＶに対する抵抗性の増加
本実施例では、ＡＮＰＥＰ中に修飾染色体配列を有するブタを、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）または伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に曝露し、モニターして、それらの感染に対する抵抗性を評価した。ＡＮＰＥＰの欠如は、ウイルス血症力価および他のマーカーによって測定されるように、ＰＥＤＶではなくＴＧＥＶに対する抵抗性の増加をもたらした。
材料および方法
ＰＥＤＶ研究のためのブタの繁殖
ＰＥＤＶ研究のために、１５ｍｇのａｌｔｒｅｎｏｇｅｓｔ生成物、ＭＡＴＲＩＸ（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ Ｉｎｃ．Ｍｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＤＥ）を含有する６．８ｍＬを１４日間毎日供給することによって、２匹の未経産ブタ（４−２および１５８−１）を同期させた。未経産ブタ４−２および１５８−１は、ａｌｔｒｅｎｏｇｅｓｔを停止した後５日以内に発情し、雄ブタ１５８−９から収集した精液を用いた人工授精（ＡＩ）によって繁殖させた。未経産ブタ４−２は妊娠しなかった。妊娠１１７日後、雌ブタ１５８−１は、８匹の健康な子ブタを出産した。１匹の子ブタは、雌ブタによって押しつぶされた。
ＴＧＥＶ曝露のためのブタの繁殖
ＡＮＰＥＰ編集Ｆ１ブタを再び繁殖させて、ＴＧＥＶ曝露のためにＡＮＰＥＰ編集ブタの同腹子を作成した。同じ２匹の未経産ブタ（４−２および１５８−１）を上述の同じ方法によって同期させ、雄ブタ１５８−９から採取した精液を用いた人工授精（ＡＩ）によって繁殖させた。雌ブタ１５８−１および４−２の両方が妊娠した。雌ブタ１５８−１は、４匹の子ブタ（同腹子１２７）を出産した。３匹の子ブタは健康であり、１匹の子ブタは、後足の構造が不良であり、安楽死された。雌ブタ４−２は、１３匹の子ブタ（同腹子２０）を出産した。１１匹は健康であった。１匹の子ブタは、乳を飲まず死亡し、別の子ブタは、後足の構造が不良であった。他の子ブタのうちの２匹は、後に雌ブタに押しつぶされた。
ウイルス
ＰＥＤＶ ＫＳ１３−０９を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ）、１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ）、および０．２５μｇ／ｍＬのＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（アンホテリシンＢ）が補充されたＭＥＭ中で維持されたＶＥＲＯ７６細胞上で増殖させた。細胞を、２％のトリプトースリン酸ブロス（Ｓｉｇｍａ）および１μｇ／ｍＬのＬ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ、Ｓｉｇｍａ）を含有する培地中で感染させた。ウイルス滴定のために、９６ウェルプレート中のＶＥＲＯ７６細胞を、ウイルスの１：１０段階希釈物で３７℃で５％のＣＯ２で８連で感染させた。３時間後、細胞培養培地を新鮮な感染培地に置き換えた。１８時間で、細胞を４℃で３０分間、アセトン：メタノール混合物（３：２比）で固定し、ＰＥＤＶ Ｍタンパク質（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に対して指向される、１：５００希釈のウサギポリクローナル抗体で反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を二次抗体として添加した。ウイルス濃度を、Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，１９３８）を使用して、ＴＣＩＤ５０／ｍＬとして計算した。
ＴＧＥＶ Ｐｕｒｄｕｅ株を、ＰＥＤＶについて記載されるのと同じ、ＭＥＭ−ＦＢＳ培地１０％で維持されたブタ精巣（ＳＴ）細胞上で培養した。滴定のために、ウイルスを、９６ウェル組織培養プレート（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）中のコンフルエントＳＴ細胞上４連で、１：１０で段階希釈した。３７℃および５％のＣＯ２での３日のインキュベーション後、ウェルを細胞変性効果（ＣＰＥ）の存在について検査した。ＣＰＥを示す最後のウェルを滴定エンドポイントとして使用し、１ｍｌあたりの５０％の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）を、（Ｒｅｅｄ ａｎｄ Ｍｕｅｎｃｈ，１９３８に記載されるように計算した。
ＰＥＤＶ／ＴＧＥＶによる感染
動物およびウイルスが関与する実験を、動物科学協会連盟研究および教育における農業動物のケアと使用のためのガイド（Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｅａｃｈｉｎｇ）、ＵＳＤＡ動物福祉法および動物福祉規則に従って実施し、Ｋａｎｓａｓ Ｓｔａｔｅ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｓｓｏｕｒｉ実験動物委員会およびバイオセイフティ委員会の認可を受けた。曝露の間、すべての感染したＷＴおよびＡＮＰＥＰ修飾ブタを、大動物資源センター内の単一の部屋に一緒に収容した。したがって、すべてのＡＮＰＥＰ編集されたブタは、感染した野生型同腹子によって流出されたウイルスへの連続曝露を受けた。感染のために、ブタは、実験的に感染したブタからＰＣＲ陽性腸組織ホモジネートから調製されたＰＥＤＶの初回用量を受けた（Ｎｉｅｄｅｒｗｅｒｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。４日後、ブタを組織培養由来分離株、ＰＥＤＶ ＫＳ１３−０９に２回感染させ、これを、１０６ ＴＣＩＤ５０のウイルスを含有する単回１０ｍＬ用量として経口投与した。ＴＧＥＶに関して、ブタは、同じ量のウイルスを経口投与された。
ＰＥＤＶによる曝露の１日前から研究の終了まで、各動物から毎日糞便スワブを収集した。各スワブを、１％のＰｅｎ−Ｓｔｒｅｐおよび１％のＦＵＮＧＩＺＯＮＥとともに１ｍＬのＭＥＭを含有する１５ｍＬの円錐管に入れた。この管を短時間ボルテックスして、スワブの内容物を混合し、１．５ｍＬの冷結保存バイアルに等分し、次いで−８０℃で保存した。
初回曝露後、３日目、７日目、および９日目に血清を収集した。糞便および血清の両方をＲＴ−ＰＣＲを使用して検査し、ＰＥＤＶまたはＴＧＥＶ核酸を検出した。９日後、動物を屠殺し、パラフィン包埋腸（回腸）上で免疫組織化学（ＩＨＣ）を行って、ＰＥＤＶまたはＴＧＥＶ抗原を検出した。
ウイルス核酸の検出のためのＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、ＭＡＧＭＡＸＴＭ−９６総ＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、糞便および血清試料から、ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ器具（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上の製造者の指示に従って抽出した。ＰＥＤＶ核酸を、ＰＬＡＴＩＮＵＭ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび表３１に列挙されるプライマーを合計体積５０μＬで有するＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ ＩＩＩワンステップＲＴ−ＰＣＲキットを使用して増幅した。ＰＣＲを、以下のように実施した。５８℃で３０分間の初期逆転写、続いて９４℃で２分間の変性、次いで９４℃で１５秒間、４８℃で３０秒間、および６８℃で９０秒間の４０サイクル。ＰＣＲ生成物を、１％のアガロースゲル上で可視化した。結果は、臭化エチジウム染色の強度に基づいて記録した。
ＴＧＥＶ核酸をリアルタイム手順を使用して増幅した（Ｖｅｍｕｌａｐａｌｌｉ Ｒ．，２０１６）。ＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ Ｖｉｒｕｓ １ステップマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）に含まれる順方向および逆方向プライマー、ならびにＴＡＱＭＡＮプローブ（ＢＨＱ−１）を表３１に列挙する。ＲＴ−ＰＣＲには、５０℃で３０分の逆転写、９５℃で１５分の逆転写、続いて９５℃で１５秒間、５６℃で３０秒間、および７２℃で１５秒間の４５サイクルが含まれた。ＰＣＲをＣＦＸ−９６リアルタイムＰＣＲシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で９６ウェルフォーマットで実施し、各試料についての結果をＣｔ値として報告する。
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組織内のウイルス抗原の検出のための免疫組織化学（ＩＨＣ）
感染動物の腸（回腸）中のＰＥＤＶおよびＴＧＥＶ抗原のレベルを検出するための免疫組織化学を、修飾ブタにおけるＡＮＰＥＰ抗原の検出のための実施例５に上述される同様の方法を使用して、カンザス州立大学およびミズーリ大学獣医診断研究所によって日常的な診断試験として実施した。抗スパイクタンパク質モノクローナル抗体を使用して、ＰＥＤＶ抗原を検出した（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。抗ネコ感染性腹膜炎コロナウイルス抗体を使用して、ＴＧＥＶ抗原を検出した。
血清中のＴＧＥＶ特異的抗体の検出
ブロッキングＥＬＩＳＡおよび間接免疫蛍光抗体（ＩＦＡ）を使用して、血清中のＴＧＥＶ特異的抗体を検出した。ＩＦＡについて、９６ウェルプレート上のコンフルエントＳＴ細胞を、２００ＴＣＩＤ５０／ｍＬのＴＧＥＶ Ｐｕｒｄｕｅで感染させた。３７℃および５％のＣＯ２での３日間のインキュベーション後、細胞を８０％のアセトンで固定した。各ブタ由来の血清を、５％のヤギ血清を有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＧＳ）中で連続希釈した。感染の前に各ブタから得られた血清試料は、陰性対照の役割を果たした。３７℃で１時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、二次抗体を各ウェルに添加した。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ−４８８ ＡｆｆｉＰｕｒｅヤギ抗ブタＩｇＧ（カタログ番号１１４−５４５−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をＰＢＳ−ＧＳ中１：４００希釈で希釈した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光顕微鏡下で観察した。ブロッキングアッセイは、Ｓａｎｏｖａ製のキットＳＶＡＮＯＶＩＲ ＴＧＥＶ／ＰＲＣＶを使用して実施した。キット説明書に従ってアッセイを実施し、標識されたＴＧＥＶ特異的抗体の結合の阻害パーセントとして結果を報告した。
結果
ブタの繁殖およびＰＥＤＶによる感染
ＰＥＤＶ曝露に使用される同腹子由来の各子孫子ブタの遺伝子型分類を、以下の表３２に要約する。曝露した子ブタには、野生型ＡＮＰＥＰアレルにヘテロ接合性の３匹のブタ、４つのアミノ酸欠失を有する２匹のブタ、３つのアミノ酸欠失を有する単一のブタ、および単一のノックアウトブタが含まれた。別個の同腹子からの５匹の野生型ブタは、無修飾対照として使用され、表に含まれない。
Figure 2021521844
３週目に、子ブタを上述のようにＰＥＤＶに曝露し、ＲＴ−ＰＣＲでの特徴付けのために糞便および血清を収集した。図３６は、ＷＴアレルに対してヘテロ接合性のものを除き、０日目、７日目、および９日目の各感染ブタの糞便および血清中のＰＥＤＶ核酸の正規化された量を示す。各ブタを、その遺伝子型：野生型（黒色）、ノックアウト／ヌル（白色）、３ａａ欠失（９ｂｐの欠失、灰色）、および４ａａ欠失（１２ｂｐの欠失、縞模様）に基づいて分類した。すべてのブタについてのＰＣＲおよびＩＨＣによるＰＥＤＶ定量化の結果を表３３に示す。ＲＴ−ＰＣＲ生成物の観点からのＰＥＤＶ定量は、強烈な染色の（３＋）から検出可能なＰＣＲ生成物がない（Ｎｅｇ．）までの臭化エチジウム染色の尺度として図３６に示される。すべてのブタは、感染の７日後から開始する糞便中のＰＥＤＶ核酸に対して強く陽性であった（表３３、図３６）。各群からの少なくとも１つのブタ（ヌル、３つのアミノ酸欠失、４つのアミノ酸欠失、およびＷＴ）もまた、７日目の血清中で陽性であった（表３３、図３６）。加えて、ＩＨＣは、すべてのブタが腸細胞内に抗原を有することを確認した（表３３、図３７）。図３７は、ＰＥＤＶ抗原（黒色）について染色した野生型（パネルＡ）、ノックアウト（パネルＢ）、３ａａ欠失（パネルＣ）、および４ａａ欠失（パネルＤ）ブタにおける回腸の代表的な画像を示す。したがって、ＡＮＰＥＰの非存在は、ＰＥＤＶ感染を防止しなかった。
Figure 2021521844
ＴＧＥＶによる感染のためのブタの繁殖
ＴＧＥＶ曝露に使用される各子孫子ブタの遺伝子型分類を、以下の表３４（同腹子２０について）および３５（同腹子１２７について）に要約する。すべてにおいて、同腹子２０からの６匹の子ブタおよび同腹子１２７からの２匹の子ブタを、ＴＧＥＶに曝露した。これらのうち、７匹はＡＮＰＥＰについてヌルであり、１匹は３つのアミノ酸欠失を有した。別個の同腹子からの７匹の野生型ブタを、陽性対照として使用した。
Figure 2021521844
Figure 2021521844
ＴＧＥＶ曝露の成果
子ブタが３週齢であったとき、ＰＥＤＶ曝露と同じ経路、用量、および住居条件を使用して、上述のようにＴＧＥＶ Ｐｕｒｄｕｅに曝露した。野生型（ＷＴ）およびノックアウト（ＫＯ）ブタを、各々研究から除去し、試験のために４日目に安楽死させた。市販のＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して、糞便および血清中のウイルスの存在を検出し、ＩＨＣを使用して、回腸中のＴＧＥＶ抗原を検出した。ＴＧＥＶへの初期曝露後の０、３、６、および７日目の糞便中のウイルスのＰＣＲ結果を図３８に提供する。結果をＣｔ値として示す。黒丸は、３日目に開始した糞便中のＴＧＥＶ核酸の存在に対して陽性であったＷＴブタを表す。ウイルス核酸は、Ｆアレルを有する単一ブタの糞便（３つのアミノ酸欠失、灰色の丸）中、または感染の最初の週の間に、７つのノックアウト（ＫＯ）ブタ（白色の丸）のうちのいずれにおいても検出されなかった（図３８）。１匹のＷＴおよび１匹のＫＯブタを、４日目に免疫組織化学のために研究から除去したため、６日目および７日目に６匹のＷＴおよびＫＯ動物のみをプロットすることに留意されたい（以下）。すべてのブタは、１３日の研究の終わりまでにＲＴ−ＰＣＲ陰性であった（データ示さず）。
図３９は、野生型ブタ（ＷＴ、パネルＡ）、ノックアウトブタ（ＫＯ、パネルＢ）、またはヌルアレルおよび３つのａａ欠失を含むアレルを有するブタからのＴＧＥＶ抗原について染色された回腸の代表的な免疫組織化学画像を示す（ＫＯ／−ｄ３、パネルＣ）。腸組織上のＴＧＥＶ抗原染色を、感染の４日後、最大量のウイルス核酸が糞便中に存在する期間中に、研究から除去された単一のＷＴおよびＫＯブタに対して実施した。ＷＴブタは、回腸中のＴＧＥＶ抗原の存在について陽性であったが（図３９、パネルＡ）、ＡＮＰＥＰ ＫＯブタは陰性であった（図３９、パネルＢ）。３つのアミノ酸欠失（Ｆアレル）を有するブタ由来の腸組織を、感染後１３日にＴＧＥＶ抗原について染色した。結果は、回腸内のウイルス抗原について陽性抗体染色を示した（図３９、パネルＣ）。
研究の終わりに得られた血清を、免疫蛍光（ＩＦＡ）およびブロッキングＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＴＧＥＶ特異的抗体の存在について試験した。免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）およびブロッキングＥＬＩＳＡアッセイの両方は、ＷＴおよびＦアレルブタが、ＴＧＥＶ特異的抗体の存在に対して陽性であることを示したが、一方で、ＡＮＰＥＰ ＫＯブタにおいてＴＧＥＶ特異的抗体は検出されなかった（図４０）。図４０において、水平線は、陽性／陰性結果のカットオフを示す。プラス記号およびマイナス記号は、間接ＩＦＡを使用した抗体測定の結果を示す。３つのアミノ酸欠失を有するブタは、糞便中のＴＧＥＶ核酸に対して陰性であったが、回腸中のＴＧＥＶ抗原に対する陽性染色および陽性抗体応答は、このブタが増殖的に感染したことを確認した。図４０におけるブタの数は、４日目におけるＩＨＣのＷＴおよびＫＯブタの除去後に残存するブタの数を反映することに留意されたい。
これらのデータは、ＡＮＰＥＰの存在が、ＴＧＥＶによるブタの感染のために必要であることを確立する。また、ＡＮＰＥＰ機能の低減（例えば、Ｆアレルの場合のように）は、糞便中のウイルスレベルの低減によって測定されるような有益な転帰をもたらし得ることも示唆する。
実施例７：ＡＮＰＥＰ、ＳＩＧＬＥＣ１、およびＣＤ１６３から選択される少なくとも２つの遺伝子における染色体修飾のためのヘテロ接合性動物の生成
材料および方法
繁殖
ＡＮＰＥＰ編集（１ｂｐの挿入、アレルＤ、配列番号１６６）を有する１つのアレル、および野生型（ＷＴ）アレルを担持した異系交雑未経産ブタ（１４−１）を、ＣＤ１６３遺伝子およびＳＩＧＬＥＣ１遺伝子の両方において編集にヘテロ接合性であった異系交雑未経産ブタを用いた人工授精によって繁殖させた（表３６）。ＣＤ１６３遺伝子における編集は、参照配列の配列番号４と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失であり、それによりＣＤ１６３遺伝子は、配列番号１１２を含んでいた。ＳＩＧＬＥＣ１遺伝子における編集は、参照配列の配列番号１２２と比較してヌクレオチド４，２７９からヌクレオチド５，５２５までの１，２４７塩基対の欠失であり、欠失した配列は、ＳＩＧＬＥＣ１遺伝子が配列番号１２３を含むようにネオマイシン遺伝子カセットで置き換えられた。
雌ブタは、１０匹の健康な子ブタを出産し、ミイラまたは死産の胎児はなかった。子ブタはすべて、出生時に健康であったように見えた。１匹のアレルのみを編集したため、２匹のブタを安楽死させた。残りの子ブタは、健康であり続け、出願の時点で、ほぼ２ヶ月であった。
Figure 2021521844
遺伝子型決定
ＤＮＡ単離：ゲノムＤＮＡ溶解物を、切り取った尾部の小片を２５０μＬの溶解バッファー（４０ｍＭのトリス、ｐＨ８．９、０．９％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ、（ＮＥＢ））中で消化し、細胞溶解のために５６℃で１２時間インキュベートし、続いて８５℃で１０分間インキュベートしてプロテイナーゼＫを不活性化することによって調製した。尾部溶解物ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲのテンプレートとして直接使用した。
ＣＤ１６３：ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動により遺伝子型を評価した。ＰＣＲを、ＣＤ１６３特異的順方向プライマー「ＴＴＧＴＴＧＧＡＡＧＧＣＴＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＧ」（配列番号６８、表３）、および逆方向プライマー「ＡＣＡＡＣＴＡＡＧＧＴＧＧＧＧＣＡＡＡＧ」（配列番号６９、表３）を用いて、標準プロトコルおよびＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用することによって実施した。ＰＣＲ条件は、９５℃で２分間、および９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および６８℃で７分間の３３サイクル、続いて７２℃で２分間の最終伸長であった。次いで、６３５８ｂｐのアンプリコンを１．２５％アガロースゲル上で分離した。１３８７ｂｐの欠失は、電気泳動後に可視であり、配列決定されなかった。正確な配列は、ファウンダー動物から既知であった。
ＡＮＰＥＰ：ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲアガロースゲル電気泳動およびその後のサンガーＤＮＡ配列決定によって遺伝子型を評価した。ＰＣＲを、ＡＮＰＥＰ特異的順方向プライマー「ＡＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＴＣＴ」（配列番号１６１、表２３）、および逆方向プライマー「ＧＧＧＡＡＡＧＧＧＣＴＧＡＴＴＧＴＣＴＡ」（配列番号１６２、表２３）を用いて、標準プロトコルおよびＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用することによって実施した。ＰＣＲ条件は、９６℃で２分間、および９５℃で３０秒間、５０℃で４０秒間、および７２℃で１分間の３５サイクル、続いて７２℃で２分間の伸長であった。次いで、９６５ｂｐのアンプリコンを２．０％アガロースゲル上で分離した。アンプリコンをＰＣＲ精製し、ミズーリ大学ＤＮＡ Ｃｏｒｅでのサンガー配列決定によって配列決定した。１ｂｐの挿入が存在する場合、アレルをＡＮＰＥＰ編集されたものとして分類した。
ＳＩＧＬＥＣ１：ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲおよびアガロースゲル電気泳動により遺伝子型を評価した。ＰＣＲを、以下のＳＩＧＬＥＣ１特異的順方向プライマー「ＧＣＡＴＴＣＣＴＡＧＧＣＡＣＡＧＣ」（配列番号１２８、表１７）および逆方向プライマー「ＣＴＣＣＴＴＧＣＣＡＴＧＴＣＣＡＧ」（配列番号１２９、表１７）を用いて、標準プロトコルおよびＬＡ Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して実施した。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間、および９４℃で３０秒間、５０℃で１０秒間、および７２℃で２．５分間の３５サイクル、続いて７２℃で５分間の最終伸長であった。プライマーは、Ｎｅｏ挿入物に隣接していた。野生型ＳＩＧＬＥＣアンプリコンは、２０００ｂｐである。Ｎｅｏが挿入されている場合、アンプリコンは２６００ｂｐである。同腹子１４４からのＳＩＧＬＥＣ１＋／−は、ゲル上に２つのアンプリコン、２０００ｂｐおよび２６００ｂｐを有するであろう。
結果
同腹子１４４子ブタの遺伝子型決定は、３つすべての修飾を有する１匹の雌子ブタ（１４４−７）をもたらした（表３７）。２匹の雄子ブタ（１４４−３、１４４−４）は、ＡＮＰＥＰおよびＣＤ１６３編集の両方を担持したが、ＳＩＧＬＥＣ１編集は担持しなかった。ブタをＰＣＲによって遺伝子型決定し、結果を図４１に示す。ＣＤ１６３中の１３８７ｂｐの欠失は、野生型に加えて小さいアンプリコンによって例示された（図４１、パネルＡ）。ＡＮＰＥＰ遺伝子内の１ｂｐの挿入は、ゲル電気泳動後には見えず、アンプリコンを配列決定して、１ｂｐの挿入の存在を決定した（図４１パネルＢおよびパネルＤ）。ＳＩＧＬＥＣ１ノックアウトは、ネオマイシンカセット（Ｎｅｏ）の挿入によって達成され、したがって、アンプリコン中の増加したサイズは、ノックアウトを示す（図４１パネルＣ）。
Figure 2021521844
実施例８：ＡＮＰＥＰ、ＳＩＧＬＥＣ１、およびＣＤ１６３から選択される２つ以上の遺伝子における染色体修飾に対してホモ接合性のブタの生成、ならびにＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶに対する抵抗性についてのそのようなブタの試験
それらが性成熟に達すると、実施例７において上述されるように生成されたブタを使用して、ＡＮＰＥＰおよびＣＤ１６３の両方、またはＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、およびＳＩＧＬＥＣ１の３つすべての染色体修飾に対してホモ接合性であるブタを作成する。これは、３つすべての修飾を含む雌（１４４−７）を、ＡＮＰＥＰおよびＣＤ１６３に対する修飾を有する２匹の雄（１４４−３、１４４−４）と繁殖させることによって行われる。この交雑は、ＡＮＰＥＰ（−／−）およびＣＤ１６３（−／−）に対してホモ接合性であるが、ＳＩＧＬＥＣ１（＋／−）に対してのみヘテロ接合性である子孫をもたらすはずである。３つすべてのアレル（ＡＮＰＥＰ、ＣＤ１６３、およびＳＩＧＬＥＣ）のホモ接合性ノックアウトを含有する動物を生成するために、これらの子孫（Ｆ１生成）を、実施例７と同様に生成された追加のトリプルヘテロ接合性子孫と戻し交雑する。代替として、またはそれと併せて、実施例７に記載される繁殖を繰り返して、雄および雌トリプルヘテロ接合株を作成し、これを交雑させてトリプルホモ接合性子孫を生成する。したがって、ホモ接合性トリプルノックアウト動物の生成には少なくとも２世代かかるが、雄および雌トリプルヘテロ接合株を確立するために追加の世代が必要となる可能性がある。
ホモ接合性ダブル（ＡＮＰＥＰ−／−／ＣＤ１６３−／−）およびトリプル（ＡＮＰＥＰ−／−／ＣＤ１６３−／−／ＳＩＧＬＥＣ１−／−）ノックアウト動物が作製されると、それらは、実施例６において上述される方法を使用してＴＧＥＶに対する抵抗性について、および実施例２において上述される方法を使用してＰＲＲＳＶに対する抵抗性について試験される。ダブルおよびトリプルノックアウト動物の両方が、ＴＧＥＶおよびＰＲＲＳＶの両方に抵抗性であることが予想される。
上記を考慮すると、本発明のいくつかの目的が達成され、他の有利な結果が達成されることが分かる。
本発明の範囲から逸脱することなく、上記の生成物および方法において様々な変更を行うことができるため、上記の説明に含まれ、添付の図面に示されるすべての事項は、限定的な意味ではなく例示的であると解釈されることが意図される。
実施例９：ＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ、およびＰＥＤＶによるＡＮＰＥＰ ＫＯおよびＷＴ細胞のインビトロ感染
肺を切除し、約１００ｍＬの冷リン酸緩衝生理食塩水で肺洗浄を行うことにより、ＡＮＰＥＰ ＫＯブタ（ブタ２０−１０、表３４）およびＷＴブタからブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）を収集した。７％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）および抗生物質が補充されたＭＥＭ中で２週間培養した後、線維芽細胞の集団が出現した。線維芽細胞様細胞を、ＴＧＥＶ、ＰＲＣＶ、およびＰＥＤＶ分離株により感染の多重性（ｍｏｉ）＝１で感染させた。ＴＧＥＶおよびＰＥＤＶ分離株の調製は、実施例６に記載されている。ＰＲＣＶ分離株を、ＳＴ細胞上でウイルスを増殖させることによって調製した。２４時間のインキュベーション後、細胞を８０％のアセトンで固定し、乾燥した。ウイルス感染細胞を、ＦＩＴＣ標識コロナウイルス抗Ｎタンパク質抗体を使用して検出した。ＴＧＥＶおよびＰＲＣＶを、抗ＦＩＰＶ３−７０ｍＡｂで検出した。ＰＥＤＶは、社内で調製したモノクローナル抗体によって検出した。ヨウ化プロピジウムを使用して核を染色した。細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。
図４２は、３つの異なるウイルスに感染した細胞の代表的な蛍光画像を示す。ＡＮＰＥＰ ＫＯ細胞は、ＴＧＥＶおよびＰＣＲＶ感染に対する明確な抵抗性を示したが、ＰＥＤＶ感染に感受性であった（図４２、パネルＡ）。すべてのＷＴ細胞は、３つすべてのウイルスによる明確な感染を示した（図４２、パネルＢ）。したがって、ＡＮＰＥＰタンパク質の喪失は、感受性集団におけるＰＲＣＶならびにＴＧＥＶに対する抵抗性を付与し得る。
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Ｃｏｎｇ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ８１９−８２３，Ｖｏｌｕｍｅ ３３９．
Ｄａｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｌｐｈａ１，３−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｃｌｏｎｅｄ Ｐｉｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００２，Ｐａｇｅｓ ２５１−２５５，Ｖｏｌｕｍｅ ２０，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｄａｓ，Ｐ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍｉｎｏｒ Ｅｎｖｅｌｏｐｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ ＧＰ２ａ ａｎｄ ＧＰ４ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１６３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｐａｇｅｓ １７３１−１７４０，Ｖｏｌｕｍｅ ８４，Ｎｕｍｂｅｒ ４．
Ｄｅｅ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｕｓｉｎｇ Ａ Ｔｅｓｔ ａｎｄ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｔｈｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｃｏｒｄ，１９９８，Ｐａｇｅｓ ４７４−４７６，Ｖｏｌｕｍｅ １４３，Ｎｕｍｂｅｒ １７．
Ｄｅｌｍａｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ ｉｓ ａ Ｍａｊｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｅｎｔｅｒｏ−Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ＴＧＥＶ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，Ｐａｇｅｓ ４１７−４２０，Ｖｏｌｕｍｅ ３５７．
Ｄｅｌｍａｓ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｄｅ ｗｉｔｈｉｎ ａ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ−Ｎ ｔｈａｔ ｉｓ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｓｉｔｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ａｕｇｕｓｔ １９９４，Ｐａｇｅｓ ５２１６−５２２４，Ｖｏｌｕｍｅ ６８，Ｎｕｍｂｅｒ ８．
Ｄｅｌｐｕｔｔｅ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００４，Ｐａｇｅｓ １７９−１８８，Ｖｏｌｕｍｅ １０２，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｄｅｌｐｕｔｔｅ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ ｔｏ Ａ Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００２，Ｐａｇｅｓ ４３１２−４３２０，Ｖｏｌｕｍｅ ７６，Ｎｕｍｂｅｒ ９．
Ｄｅｌｐｕｔｔｅ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｔｏ ｔｈｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ ｉｓ Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００７，Ｐａｇｅｓ ９５４６−９５５０，Ｖｏｌｕｍｅ ８１，Ｎｕｍｂｅｒ １７．
Ｄｅｌｐｕｔｔｅ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００４，Ｐａｇｅｓ ８０９４−８１０１，Ｖｏｌｕｍｅ ７８，Ｎｕｍｂｅｒ １５
Ｄｏｙｌｅ，Ｌ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ ｉｎ Ｐｉｇｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９４６，Ｐａｇｅｓ ２５７−２５９，Ｖｏｌｕｍｅ １０８．
Ｅｔｚｅｒｏｄｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍａ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ ｉｎ Ｍｉｃｅ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ＣＤ１６３ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ＆ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ２２５４−２２６３，Ｖｏｌｕｍｅ １８，Ｎｕｍｂｅｒ １７．
Ｅｔｚｅｒｏｄｔ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＤ１６３ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｓｐｅｃｔｓ，Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ ＆ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ２３５２−２３６３，Ｖｏｌｕｍｅ １８，Ｎｕｍｂｅｒ １７．
Ｆａｂｒｉｅｋ，Ｂ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１６３，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，Ｐａｇｅｓ １５３−１６０，Ｖｏｌｕｍｅ ２１０，Ｎｕｍｂｅｒｓ ２−４．
Ｆａｂｒｉｅｋ，Ｂ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１６３ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａｎ Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｅｎｓｏｒ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｂｌｏｏｄ，２００９，Ｐａｇｅｓ ８８７−８９２，Ｖｏｌｕｍｅ １１３，Ｎｕｍｂｅｒ ４．
Ｇａｊ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，ＺＦＮ，ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ３９７−４０５，Ｖｏｌｕｍｅ ３１，Ｎｕｍｂｅｒ ７．
Ｇａｕｄｒｅａｕｌｔ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｆａｃｔｏｒｓ Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００９，Ｐａｇｅｓ １３３−１３６，Ｖｏｌｕｍｅ １５４，Ｎｕｍｂｅｒ １．
Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ，Ｊ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１６３ ｉｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ Ｈｉｇｈｌｙ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１２，Ｐａｇｅｓ １５５０−１５５８，Ｖｏｌｕｍｅ ２０，Ｎｕｍｂｅｒ ８．
Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．
Ｇｒｏｅｎｅｎ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｐｉｇ Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｖｉｄｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ ｉｎｔｏ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｄｅｍｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，Ｐａｇｅｓ ３９３−３９８，Ｖｏｌｕｍｅ ４９１，Ｎｕｍｂｅｒ ７４２４．
Ｇｕｚｍａｎ−Ｒｏｊａｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ （ＣＤ１３） Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ Ｎｏｎｍａｌｉｇｎａｎｔ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２０１２，Ｐａｇｅｓ １６３７−１６４２，Ｖｏｌｕｍｅ １０９，Ｎｕｍｂｅｒ ５．
Ｈａｉ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｐｉｇｓ ｂｙ Ｚｙｇｏｔｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，Ｐａｇｅｓ ３７２−３７５，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｈａｌｂｕｒ，Ｐ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｗｏ ＵＳ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｅｌｙｓｔａｄ Ｖｉｒｕｓ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９５，Ｐａｇｅｓ ６４８−６６０，Ｖｏｌｕｍｅ ３２，Ｎｕｍｂｅｒ ６．
Ｈａｌｂｕｒ，Ｐ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｐｄａｔｅ ｏｎ Ａｂｏｒｔｉｏｎ Ｓｔｏｒｍｓ ａｎｄ Ｓｏｗ Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９９７，Ｐａｇｅ ７３，Ｖｏｌｕｍｅ ５，Ｎｕｍｂｅｒ ２．
Ｈａｍｍｅｒ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｓｈｅｅｐ ａｎｄ Ｐｉｇｓ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９８５，Ｐａｇｅｓ ６８０−６８３，Ｖｏｌｕｍｅ ３１５，Ｎｕｍｂｅｒ ６０２１．
Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ Ｂｉａｌｌｅｌｉｃ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｉｎ Ｐｉｇｓ Ｕｓｉｎｇ Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２０１１，Ｐａｇｅｓ １２０１３−１２０１７，Ｖｏｌｕｍｅ １０８，Ｎｕｍｂｅｒ ２９．
Ｈｏｌｔｋａｍｐ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ ｏｎ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｏｒｋ Ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ７２−８４，Ｖｏｌｕｍｅ ２１，Ｎｕｍｂｅｒ ２．
Ｈｓｕ Ｐ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ８２７−８３２，Ｖｏｌｕｍｅ ３１，Ｎｕｍｂｅｒ ９．
Ｈｗａｎｇ，Ｗ．Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｚｅｂｒａｆｉｓｈ Ｕｓｉｎｇ Ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ２２７−２２９，Ｖｏｌｕｍｅ ３１．
Ｉｍ，Ｇ．−Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｅｍｂｒｙｏｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｍｅｄｉａ ａｎｄ Ｇａｓ Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅｓ，Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，２００４，Ｐａｇｅｓ １１２５−１１３５，Ｖｏｌｕｍｅ ６１，Ｎｕｍｂｅｒ ６．
Ｊｅｎｅｙ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏ−Ｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｈｅｍｅ，Ｂｌｏｏｄ，２００２，Ｐａｇｅｓ ８７９−８８７，Ｖｏｌｕｍｅ １００，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｋａｍａｕ，Ａ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｍｉｎｏ Ｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ Ｄｏｍａｉｎ ＶＩＩ ｈａｓ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｅｎｔｒｙ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，Ｐａｇｅｓ １５０−１５７，Ｖｏｌｕｍｅ ２２７．
Ｋｅｆｆａｂｅｒ，Ｋ．Ｋ．，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｆａｉｌｕｒｅ ｏｆ Ｕｎｋｎｏｗｎ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ Ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒｓ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，１９８９，Ｐａｇｅｓ １−１０，Ｖｏｌｕｍｅ １．
Ｋｅｙ，Ｋ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＯＲＦ５ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ａｃｕｔｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｅｓ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，Ｐａｇｅｓ ２４９−２６３，Ｖｏｌｕｍｅ ８３，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｋｉｌｌｏｒｅｎ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｓｗｉｎｅ Ｈｅａｌｔｈ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ Ｓｅｃｕｒｉｔｙ ａｎｄ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ，２０１６．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｆｓｐｈ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｐｄｆ／ｓｈｉｃ−ｆａｃｔｓｈｅｅｔ−ｐｏｒｃｉｎｅ−ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ−ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．
Ｋｉｍ，Ｈ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＰＲＲＳ） Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ａ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＡ−１０４ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９３，Ｐａｇｅｓ ４７７−４８３，Ｖｏｌｕｍｅ １３３，Ｎｕｍｂｅｒｓ ３−４．
Ｋｏｌｂ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｓ Ｄｅｌａｙｅｄ ｉｎ Ｍｉｃｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｆｏｒ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ４２５−４３４，Ｖｏｌｕｍｅ ２２，Ｉｓｓｕｅ ２．
Ｋｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，Ｐａｇｅｓ １９８−２０１，Ｖｏｌｕｍｅ ４０９，Ｎｕｍｂｅｒ ６８１７．
Ｋｗｏｎ，Ｄ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉａｌｌｅｌｉｃ ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ Ｐｉｇｓ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，Ｐａｇｅ １９８１，Ｖｏｌｕｍｅ ３．
Ｌａｄｉｎｉｇ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｔｙｐｅ ２ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ Ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ｐｒｅｇｎａｎｔ Ｇｉｌｔｓ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５，Ｐａｇｅｓ ２４−３５，Ｖｏｌｕｍｅ ２０３．
Ｌａｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｐｈａ−１，３−Ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｐｉｇｓ ｂｙ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，Ｐａｇｅｓ １０８９−１０９２，Ｖｏｌｕｍｅ ２９５，Ｎｕｍｂｅｒ ５５５７．
Ｌａｉ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｅａｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｉｇｓ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００３，Ｐａｇｅ ８２，Ｖｏｌｕｍｅ １，Ｎｕｍｂｅｒ １．（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２００３ａ）．
Ｌａｉ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｐｉｇｓ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ａｓ Ｄｏｎｏｒｓ，Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００３，Ｐａｇｅｓ ２３３−２４１，Ｖｏｌｕｍｅ ５，Ｎｕｍｂｅｒ ４．（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２００３ｂ）．
Ｌａｉ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｌｏｎｅｄ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｉｇｓ Ｒｉｃｈ ｉｎ Ｏｍｅｇａ−３ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，Ｐａｇｅｓ ４３５−４３６，Ｖｏｌｕｍｅ ２４，Ｎｕｍｂｅｒ ４．
Ｌａｗｓｏｎ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｎｏｔｏｂｉｏｔｉｃ Ｐｉｇｓ： Ｓｉｔｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏ−Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＭＡＣ−３８７ Ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｔ ２１ Ｄａｙｓ Ｐｏｓｔ−Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，Ｐａｇｅｓ １０５−１１３，Ｖｏｌｕｍｅ ５１，Ｎｕｍｂｅｒ ２．
Ｌｅｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ｉＰＳ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｐｉｇｓ Ｗｉｔｈ Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＲＡＧ２ ａｎｄ Ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ Ｓｅｖｅｒｅ Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２０１４，Ｐａｇｅｓ ７２６０−７２６５，Ｖｏｌｕｍｅ １１１，Ｎｕｍｂｅｒ ２０．
Ｌｅｅ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｌｏｎｅｄ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗｉｔｈ ＧＭ−ＣＳＦ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１３，Ｐａｇｅｓ １４５−１５４，Ｖｏｌｕｍｅ ８０，Ｉｓｓｕｅ ２．
Ｌｉ，Ｂ．Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ ｉｓ ａ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＥＤＶ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００７，Ｐａｇｅｓ １６６−１７２，Ｖｏｌｕｍｅ ３６５，Ｉｓｓｕｅ １．
Ｌｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ ａｎｄ Ｒａｔ Ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ６８１−６８３，Ｖｏｌｕｍｅ ３１，Ｎｕｍｂｅｒ ８．
Ｌｉ，Ｆ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ： Ａ Ｄｅｃａｄｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１５，Ｐａｇｅｓ １９５４−１９６４，Ｖｏｌｕｍｅ ８９，Ｎｕｍｂｅｒ ４．
Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ ｉｓ ｎｏｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，Ｐａｇｅｓ ６−１３，Ｖｏｌｕｍｅ ２３５．
Ｌｉ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ ２ ｉｓ ａ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ＳＡＲＳ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２００３，Ｐａｇｅｓ ４５０−４５４，Ｖｏｌｕｍｅ ４２６．
Ｌｉｌｌｉｃｏ，Ｓ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅ Ｐｉｇｓ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｅｄ Ｚｙｇｏｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１３，Ｐａｇｅ ２８４７，Ｖｏｌｕｍｅ ３．
Ｌｉｎ，Ｃ．−Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ Ｓｔｒａｉｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１５，Ｐａｇｅｓ ３３３２−３３４２，Ｖｏｌｕｍｅ ８９，Ｎｕｍｂｅｒ ６．
Ｌｉｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｕｓａｇｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｅｎｔｒｙ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ ２０１５，Ｐａｇｅｓ ６１２１−６１２５，Ｖｏｌｕｍｅ ８９，Ｎｕｍｂｅｒ １１．
Ｍａｃｈａｔｙ Ｚ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｏｏｃｙｔｅｓ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９９７，Ｐａｇｅｓ １１２３−１１２７，Ｖｏｌｕｍｅ ５７，Ｎｕｍｂｅｒ ５．
Ｍａｄｓｅｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ−Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１６３．Ｌｉｇａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｒｉｃｈ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００４，Ｐａｇｅｓ ５１５６１−５１５６７，Ｖｏｌｕｍｅ ２７９，Ｎｕｍｂｅｒ ４９．
Ｍａｄｓｏｎ，Ｄ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｅ ＵＳ／Ｉｏｗａ／１８９８４／２０１３ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ １−Ｄａｙ−Ｏｌｄ Ｃｅｓａｒｅａｎ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ−Ｄｅｐｒｉｖｅｄ Ｐｉｇｌｅｔｓ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１６，Ｐａｇｅｓ ４４−５２，Ｖｏｌｕｍｅ ５３，Ｎｕｍｂｅｒ １．
Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｏｍａｒｅｓ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＤ１６９＋ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｔ ｔｈｅ Ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１２，Ｐａｇｅｓ ６６−７０，Ｖｏｌｕｍｅ ３３，Ｎｕｍｂｅｒ ２．
Ｍｅｎｇ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｐｈａｇｅ−Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ ｉｓ ａ Ｐｏｔｅｎｔ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＰＥＤＶ Ｅｎｔｒｙ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１４，Ｐａｇｅｓ ２０−２７，Ｖｏｌｕｍｅｓ ４５６−４５７．
Ｍｅｎｇｅｌｉｎｇ，Ｗ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｅｘｐｏｓｉｎｇ Ｐｒｅｇｎａｎｔ Ｇｉｌｔｓ ｔｏ Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＰＲＲＳ） Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｆｉｅｌｄ Ｃａｓｅｓ ｏｆ “Ａｔｙｐｉｃａｌ” ＰＲＲＳ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９８，Ｐａｇｅｓ １５４０−１５４４，Ｖｏｌｕｍｅ ５９，Ｎｕｍｂｅｒ １２．
Ｍｅｒｃｋ，Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｒｃｋｍａｎｕａｌｓ．ｃｏｍ／ｖｅｔ／ａｐｐｅｎｄｉｘｅｓ／ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿ｇｕｉｄｅｓ／ｎｏｒｍａｌ＿ｒｅｃｔａｌ＿ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＿ｒａｎｇｅｓ．ｈｔｍｌ．
Ｍｉａｏ，Ｙ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｎｔｒｏｓｏｍｅ Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｏｏｃｙｔｅ Ａｇｉｎｇ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，２００９，Ｐａｇｅｓ ６６６−６７１，Ｖｏｌｕｍｅ ５０，Ｎｕｍｂｅｒ ８．
Ｍｏｒｇａｎ，Ｓ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ Ｐｉｇｓ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｌｙ Ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｔｙｐｅ １ ＰＲＲＳ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｖａｒｙｉｎｇ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｔｒａｎｓｂｏｕｎｄ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１６，Ｐａｇｅｓ ２８５−２９５，Ｖｏｌｕｍｅ ６３，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｎｅｌｓｅｎ，Ｃ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ： Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｎ Ｔｗｏ Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｐａｇｅｓ ２７０−２８０，Ｖｏｌｕｍｅ ７３，Ｎｕｍｂｅｒ １．
Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｏｎ Ｓｗｉｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，２００５，Ｐａｇｅｓ ３８５−３９２，Ｖｏｌｕｍｅ ２２７，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｎｉｅｄｅｒｗｅｒｄｅｒ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｈｅｄｄｉｎｇ，Ｖｉｒｕｓ Ｃａｒｒｉａｇｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ａｎｄ Ａｅｒｏｓｏｌ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ４−ｗｅｅｋ−ｏｌｄ Ｆｅｅｄｅｒ Ｐｉｇｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１６，Ｐａｇｅｓ ６７１−６７８，Ｖｏｌｕｍｅ ２８，Ｉｓｓｕｅ ６．
Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１６３： Ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｔａｉｌ Ｖａｒｉａｎｔｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，Ｐａｇｅｓ ８３７−８４５，Ｖｏｌｕｍｅ ７９．
Ｎｉｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ Ｍｏｎｋｅｙ Ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｏｎｅ−Ｃｅｌｌ Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｃｅｌｌ，２０１４，Ｐａｇｅｓ ８３６−８４３，Ｖｏｌｕｍｅ １５６，Ｎｕｍｂｅｒ ４．
Ｏｅｔｋｅ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ Ｅｘｈｉｂｉｔ Ｓｕｂｔｌｅ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ Ｂ− ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｍ Ｌｅｖｅｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６，Ｐａｇｅｓ １５４９−１５５７，Ｖｏｌｕｍｅ ２６，Ｎｕｍｂｅｒ ４．
Ｏｈ，Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １５０ ｋＤａ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３，Ｐａｇｅｓ ２６９−２７５，Ｖｏｌｕｍｅ ４，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ａ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ − Ａ Ｍａｃｒｏｐｈａｓｅ−Ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｐａｇｅｓ １９８−２０７，Ｖｏｌｕｍｅ １３８，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｌａｔｈｒｉｎ− ａｎｄ Ｓｅｒｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｕｐｔａｋｅ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｏ Ｖｅｒｏ Ｃｅｌｌｓ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，Ｐａｇｅｓ ２１−２９，Ｖｏｌｕｍｅ １９１．
Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｓ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｉｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，Ｐａｇｅｓ １４３−１５２，Ｖｏｌｕｍｅ １９１．
Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｅ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１５，Ｐａｇｅｓ １０８−１１５，Ｖｏｌｕｍｅ １９７．
Ｐａｔｉｅｎｃｅ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｗｉｎｅ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｇｕｉｄｅ，１９８９，Ｐａｇｅｓ １４９−１７１，Ｓａｓｋａｔｏｏｎ，ＳＫ： Ｐｒａｉｒｉｅ Ｓｗｉｎｅ Ｃｅｎｔｒｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ，Ｓａｓｋａｔｏｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ．
Ｐａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１６３ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００９，Ｐａｇｅｓ １６１−１７１，Ｖｏｌｕｍｅ １４０，Ｉｓｓｕｅｓ １−２．
Ｐｌａｇｅｍａｎｎ，Ｐ．Ｇ．Ｗ．，Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ−Ｅｌｅｖａｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９６，Ｐａｇｅｓ １１０５−１１２０，Ｖｏｌｕｍｅ ３．
Ｐｒａｔｈｅｒ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎ Ｉｎｔａｃｔ Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ （Ｓｎ／ＳＩＧＬＥＣ１／ＣＤ１６９） ｉｓ ｎｏｔ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ／Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ９５３８−９５４６，Ｖｏｌｕｍｅ ８７，Ｎｕｍｂｅｒ １７．
Ｐｒｏｖｏｓｔ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａ Ｎｅｗ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ ｔｏ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ＭＡＲＣ−１４５ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１２，Ｐａｇｅ ２６７，Ｖｏｌｕｍｅ ９．
Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃａｓ９，Ｎａｔｕｒｅ，２０１５，Ｐａｇｅｓ １８６−１９１，Ｖｏｌｕｍｅ ５２０．
Ｒａｎｇｅｌ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐａｉｒｅｄ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ−Ｎｕｌｌ Ｍｉｃｅ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２００７，Ｐａｇｅｓ ４５８８−４５９３，Ｖｏｌｕｍｅ １０４，Ｎｕｍｂｅｒ １１．
Ｒｅｅｄ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ Ｆｉｆｔｙ Ｐｅｒ Ｃｅｎｔ Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙ １９３８，Ｐａｇｅｓ ４９３−４９７，Ｖｏｌｕｍｅ ２７，Ｉｓｓｕｅ ３．
Ｒｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ，ｔｈｅ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｐａｇｅｓ ２０２−２０６，Ｖｏｌｕｍｅ １５０，Ｉｓｓｕｅ １．
Ｒｉｔｔｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ＣＤ１６３ （Ｍ１３０） Ｇｅｎｅ： Ａ Ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−Ｒｉｃｈ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９９，Ｐａｇｅｓ ４６６−４７４，Ｖｏｌｕｍｅ ２６０，Ｎｕｍｂｅｒ ２．
Ｒｉｔｔｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１６３： Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｐａｇｅｓ ２５７−２６１，Ｖｏｌｕｍｅ ６７，Ｎｕｍｂｅｒｓ ５−６．
Ｒｅｎ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ Ｉｎｈｉｂｉｔ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１１，Ｐａｇｅｓ ２９９−３０６，Ｖｏｌｕｍｅ ４１０，Ｉｓｓｕｅ ２．
Ｒｏｓｓ，Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｑｕａｒｅ−Ｗａｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｆｅｔａｌ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，Ｐａｇｅｓ ６１１−６２０，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ４．
Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｒ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ： Ｑｕａｓｉｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ａ Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ ＶＲ−２３３２，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｐａｇｅｓ ２６２−２６６，Ｖｏｌｕｍｅ ２５９，Ｎｕｍｂｅｒ ２．
Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｒ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｒｏｐｉｓｍ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｄｕｒｉｎｇ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｇｓ Ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ Ｅｘｐｏｓｅｄ ｔｏ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎ ｕｔｅｒｏ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，Ｐａｇｅｓ ２１９−２３５，Ｖｏｌｕｍｅ ９６，Ｉｓｓｕｅ ３．
Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｒ．，Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｂｅｔｗｅｅｎ ＰＲＲＳＶ ａｎｄ ｔｈｅ Ｌａｔｅ Ｇｅｓｔａｔｉｏｎ Ｐｉｇ Ｆｅｔｕｓ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，Ｐａｇｅｓ １１４−１２２，Ｖｏｌｕｍｅ １５４，Ｎｕｍｂｅｒｓ １−２．
Ｒｏｗｌａｎｄ，Ｒ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＰＲＲＳ） Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１２，Ｐａｇｅ ２６０，Ｖｏｌｕｍｅ ３．
Ｓａｉｆ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３５，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ．
Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ ２Ａ１０ Ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ ＣＤ１６３ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｐａｇｅｓ ５２３０−５２３７，Ｖｏｌｕｍｅ １６２，Ｎｕｍｂｅｒ ９．
Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｔｏｒｒｅｓ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ ＣＤ１６３ ｏｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ／Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ Ａｆｒｉｃａｎ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３，Ｐａｇｅｓ ２３０７−２３２３，Ｖｏｌｕｍｅ １４８，Ｎｕｍｂｅｒ １２．
Ｓｃｈａｅｒ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｏｆ ＣＤ１６３ Ｍｅｄｉａｔｅｓ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ−Ｈｅｍｅ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ Ｎｏｎｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｔｏ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００６，Ｐａｇｅｓ ９４３−９５０，Ｖｏｌｕｍｅ ９９，Ｎｕｍｂｅｒ ｒ９．
Ｓｃｈａｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＤ１６３ ｉｓ ｔｈｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｎａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｈａｐｔｏｇｌｏｂｉｎ，Ｂｌｏｏｄ，２００６，Ｐａｇｅｓ ３７３−３８０，Ｖｏｌｕｍｅ １０７，Ｎｕｍｂｅｒ １．
Ｓｃｈａｅｒ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａ Ｍａｊｏｒ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍｅ Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓｅｐｓｉｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２００６，Ｐａｇｅｓ ４３２−４３６，Ｖｏｌｕｍｅ ７７，Ｎｕｍｂｅｒ ５．
Ｓｈａｎｍｕｋｈａｐｐａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ１５１，Ａ Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ，ｉｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００７，Ｐａｇｅ ６２，Ｖｏｌｕｍｅ ４．
Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｌ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｐａｒａｔｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ Ｇｅｎｅ ｉｎ Ｍｙｅｌｏｉｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１，Ｐａｇｅｓ １１９９９−１２００７，Ｖｏｌｕｍｅ ２６６，Ｎｕｍｂｅｒ １８．
Ｓｈｅａｈａｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｃｒｏｓｓ−Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ Ｚｏｏｎｏｔｉｃ Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００８，Ｐａｇｅｓ ８７２１−８７３２，Ｖｏｌｕｍｅ ８２，Ｎｕｍｂｅｒ １７．
Ｓｈｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ−Ｂａｓｅｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ，Ｄｅｍｏｇｒａｐｈｉｃａｌ，ａｎｄ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃａｌ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ２ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｐａｇｅｓ ８７００−８７１１，Ｖｏｌｕｍｅ ８４，Ｎｕｍｂｅｒ １７．
Ｓｈｉｍｏｚａｗａ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｃｌｏｎｅｄ Ｍｉｃｅ ａｒｅ ｎｏｔ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｇｅｎｙ，Ｇｅｎｅｓｉｓ，２００２，Ｐａｇｅｓ ２０３−２０７，Ｖｏｌｕｍｅ ３４，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｓｍｉｔ，Ａ．Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ Ｏｐｅｎ−３．０．１９９６−２０１０．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ： ｏｐｅｎ−４．０．５ （ＲＭＬｉｂ： ２０１４０１３１ ａｎｄ Ｄｆａｍ： １．２）．ｈｔｔｐ：／／ ｗｗｗ．ｒｅｐｅａｔｍａｓｋｅｒ．ｏｒｇ＆ｇｔ．ＣＤ１６３： ａｃｃｅｓｓｅｄ Ｊｕｌｙ ２５，２０１４； ＣＤ１Ｄ： ａｃｃｅｓｓｅｄ Ａｕｇｕｓｔ ２７，２０１３．
Ｓｏａｒｅｓ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｍｅ Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１： Ｆｒｏｍ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００９，Ｐａｇｅｓ ５０−５８，Ｖｏｌｕｍｅ １５，Ｎｕｍｂｅｒ ２．
Ｓｔｅｉｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ４ Ｐｏｔｅｎｔｌｙ Ｅｎｈａｎｃｅｓ Ｍｕｒｉｎｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｍａｎｎｏｓｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ： Ａ Ｍａｒｋｅｒ ｏｆ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９２，Ｐａｇｅｓ ２８７−２９２，Ｖｏｌｕｍｅ １７６，Ｎｕｍｂｅｒ １．
Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｅｒｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｏｍｍｏｎ Ｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｅｒａｌ Ｐｉｇｓ （Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ） ｉｎ Ｈａｗａｉｉ Ｂｅｔｗｅｅｎ ２００７ ａｎｄ ２０１０，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｗｉｌｄｌｉｆｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２０１５，Ｐａｇｅｓ ２３９−２４３，Ｖｏｌｕｍｅ ５１，Ｎｕｍｂｅｒ １．
Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｇ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｃ Ｄｉａｒｒｈｅａ Ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｓ，Ｌｅｓｉｏｎｓ，ａｎｄ Ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ６４９−６５４，Ｖｏｌｕｍｅ ２５，Ｎｕｍｂｅｒ ５．
Ｓｕｌａｈｉａｎ，Ｔ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＤ１６３，Ｗｈｉｃｈ ｉｓ Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＩＬ−１０ ａｎｄ Ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｔｏ ｐ１５５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，２０００，Ｐａｇｅｓ １３１２−１３２１，Ｖｏｌｕｍｅ １２，Ｉｓｓｕｅ ９．
Ｓｕｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ Ｃ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１２，Ｐａｇｅｓ ５３３−５３９，Ｖｏｌｕｍｅ ３４，Ｉｓｓｕｅ ３．
Ｔｅｒｎｓ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ−Ｂａｓｅｄ Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，Ｐａｇｅｓ ３２１−３２７，Ｖｏｌｕｍｅ １４，Ｉｓｓｕｅ ３．
Ｔｉａｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ ｏｆ Ｆａｔａｌ ＰＲＲＳＶ Ｖａｒｉａｎｔｓ： Ｕｎｐａｒａｌｌｅｌｅｄ Ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｏｆ Ａｔｙｐｉｃａｌ ＰＲＲＳ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｑｕｅ Ｈａｌｌｍａｒｋ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２００７，ｅ５２６，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｎｕｍｂｅｒ ６．
Ｔｒｉｂｌｅ，Ｂ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｐｓｉｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１２，Ｐａｇｅｓ １３５０８−１３５１４，Ｖｏｌｕｍｅ ８６，Ｎｕｍｂｅｒ ２４．
Ｔｕｓｅｌｌ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ，ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｓｅｖｅｒａｌ Ｇｒｏｕｐ １ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ Ｋｅｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｈｏｓｔ Ｒａｎｇｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００７，Ｐａｇｅｓ １２６１−１２７３，Ｖｏｌｕｍｅ ８１，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｄｉｅｔａｒｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ，２０１０，７ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．
Ｖａｎ Ｂｒｅｅｄａｍ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｐａｇｅｓ １６５９−１６６７，Ｖｏｌｕｍｅ ９１．
Ｖａｎ Ｂｒｅｅｄａｍ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｍ／ＧＰ（５） Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｂｉｎｄｓ ｔｈｅ Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｎ ａ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ，ＰｌｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，２０１０，Ｄｏｃｕｍｅｎｔ ｅ１０００７３０，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｎｕｍｂｅｒ １．
ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｕｖｅｌ，Ｍ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１６３ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ： Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ ｏｆ ＣＤ１６３ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，Ｐａｇｅｓ ８５８−８６６，Ｖｏｌｕｍｅ ６６，Ｉｓｓｕｅ ５．
ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｆｆ，Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｎ ‘Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ’ Ｂｕｆｆｅｒ Ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，Ｐａｇｅ ２９０２，Ｖｏｌｕｍｅ ２０，Ｎｕｍｂｅｒ １１．
Ｖａｎ Ｇｏｒｐ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｖｅｎｇｅｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＤ１６３，Ａ Ｊａｃｋ−ｏｆ−ａｌｌ−ｔｒａｄｅｓ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｐａｇｅｓ １６５０−１６６０，Ｖｏｌｕｍｅ ４７，Ｉｓｓｕｅｓ ７−８．
Ｖａｎ Ｇｏｒｐ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ１６３ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｏｍａｉｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｐａｇｅｓ ３１０１−３１０５，Ｖｏｌｕｍｅ ８４，Ｎｕｍｂｅｒ ６．
Ｖａｎ Ｒｅｅｔｈ，Ｄｕａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｆｅｅｄｅｒ Ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｏｒ Ｓｗｉｎｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ： Ａ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｙ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９６，Ｐａｇｅｓ ３２５−３３５，Ｖｏｌｕｍｅ ４８，Ｉｓｓｕｅｓ ３−４．
Ｖａｎｄｅｒｈｅｉｊｄｅｎ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ ｉｎ Ｅｎｔｒｙ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｏ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３，Ｐａｇｅｓ ８２０７−８２１５，Ｖｏｌｕｍｅ ７７，Ｎｕｍｂｅｒ １５．
Ｖｅｍｕｌａｐａｌｌｉ，Ｒ．，Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ，Ａｎｉｍａｌ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ １０，２０１６，Ｐａｇｅｓ １１５−１１９．
Ｖｉｊｇｅｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｘ Ｎｅｗ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２２９Ｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇｅｎｅ （Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ／ＣＤ１３），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００４，Ｐａｇｅｓ ２１７−２２２，Ｖｏｌｕｍｅ ８，Ｉｓｓｕｅ ４．
Ｗａｌｔｅｒｓ，Ｅ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｓｗｉｎｅ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ２１２−２１５，Ｖｏｌｕｍｅ １１０，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｗａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｅｌｌ，２０１３，Ｐａｇｅｓ ９１０−９１８，Ｖｏｌｕｍｅ １５３，Ｉｓｓｕｅ ４．
Ｗｅｌｃｈ，Ｓ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｂｒｉｅｆ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ＣＤ１６３ ａｎｄ ｉｔｓ Ｒｏｌｅ ｉｎ ＰＲＲＳＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，Ｐａｇｅｓ ９８−１０３，Ｖｏｌｕｍｅ １５４，Ｉｓｓｕｅｓ １−２．
Ｗｅｌｌｓ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｉｇｓ ｆｒｏｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１４，Ｐａｇｅｓ １−１３，Ｖｏｌｕｍｅ ９１，Ｉｓｓｕｅ ３．
Ｗｅｌｌｓ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ ＣＤ１６３ ＳＲＣＲ Ｄｏｍａｉｎ ５ ｗｉｔｈ ａ ＣＤ１６３−ｌｉｋｅ Ｈｏｍｏｌｏｇ Ｃｏｎｆｅｒｓ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｐｉｇｓ ｔｏ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ ｂｕｔ ｎｏｔ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ ２ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＰＲＲＳ） Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１８，Ｖｏｌｕｍｅ ９２，Ｉｓｓｕｅ ９．
Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｙｓｔｅｒｙ Ｓｗｉｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ： Ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｅｌｙｓｔａｄ Ｖｉｒｕｓ，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ，１９９１，Ｐａｇｅｓ １２１−１３０，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｉｓｓｕｅ ３．
Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ （ＣＤ１３） Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｉｃｅ ａｒｅ Ｉｎｆｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ−２２９Ｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５，Ｐａｇｅｓ １８５−１９７，Ｖｏｌｕｍｅ ３３５，Ｉｓｓｕｅ ２．
Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ−Ｅｄｉｔｅｄ Ｐｉｇｓ ａｒｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１６，Ｐａｇｅｓ ２０−２２，Ｖｏｌｕｍｅ ３４．
Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｏｏｃｙｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ａｆｆｅｃｔｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｐｉｇｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００９，Ｐａｇｅｓ ４９０−５００，Ｖｏｌｕｍｅ ７６，Ｉｓｓｕｅ ５．
Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ Ｆｅｗ Ａｂｅｒｒａｎｔｌｙ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｉｇ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｓｔａｇｅ Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，２０１１，Ｐａｇｅｓ １９１−２０４，Ｖｏｌｕｍｅ １３，Ｎｕｍｂｅｒ ３．
Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｄｏｅｓ ｎｏｔ Ａｌｔｅｒ Ａｂｎｏｒｍａｌ Ｐｌａｃｅｎｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｌｏｎｅｄ Ｐｉｇｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１０，Ｐａｇｅｓ １０１６−１０３０，Ｖｏｌｕｍｅ ７７，Ｉｓｓｕｅ １２．
Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｉｇｓ ｆｒｏｍ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｏｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１４，Ｐａｇｅｓ １−１３，Ａｒｔｉｃｌｅ ７８，Ｖｏｌｕｍｅ ９１，Ｉｓｓｕｅ ３．
Ｗｈｉｔｗｏｒｔｈ，Ｋ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｚｙｇｏｔｅ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＲＮＡ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｔｈｅ Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｄｅｌａｙｉｎｇ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｒ Ａｌｔｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｓｅｘ Ｒａｔｉｏ ｉｎ Ｐｉｇｓ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，Ｐａｇｅｓ ９７−１０７，Ｖｏｌｕｍｅ ２６，Ｉｓｓｕｅ １．
Ｗｈｙｔｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｉｇｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１１，Ｐａｇｅｓ ８７９−８９１，Ｖｏｌｕｍｅ ７８，Ｉｓｓｕｅ １０−１１．
Ｗｈｙｔｅ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｄｕｃｅ Ｃｌｏｎｅｄ ｅＧＦＰ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｐｉｇｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１１，Ｐａｇｅ ２，Ｖｏｌｕｍｅ ７８，Ｉｓｓｕｅ １．
Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ Ａｒｃｈａｅａ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２，Ｐａｇｅｓ ３３１−３３８，Ｖｏｌｕｍｅ ４８２．
Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｔ ｔｈｅ Ｍａｔｅｒｎａｌ／Ｆｅｔａｌ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｆｅｔｕｓ，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１６，Ｐａｇｅ ３８３，Ｖｏｌｕｍｅ １７．
Ｗｉｎｃｋｌｅｒ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａ Ｌａｍｅｎｅｓｓ Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｓ ａｎ Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ Ｗｅｌｆａｒｅ ｉｎ Ｄａｉｒｙ Ｃａｔｔｌｅ，Ａｃｔａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｅ Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ−Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，Ｐａｇｅｓ １０３−１０７，Ｖｏｌｕｍｅ ５１．
Ｗｉｓｓｉｎｋ，Ｅ．Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ａｌｖｅｏｌａｒ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｖｉｒｕｓ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００３，Ｐａｇｅｓ １７７−１８７，Ｖｏｌｕｍｅ １４８，Ｎｕｍｂｅｒ １．
Ｙａｎｅｚ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｉｎ Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｓａｌｍｏｎ（Ｓａｌｍｏ ｓａｌａｒ）： Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｗｉｌｄ ａｎｄ Ｆａｒｍｅｄ Ａｍｅｒｉｃａｎ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，２０１６，Ｐａｇｅｓ １００２−１０１１，Ｖｏｌｕｍｅ １６，Ｉｓｓｕｅ ４．
Ｙａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＰＡＲｇａｍｍａ Ｍｏｎｏ−Ａｌｌｅｌｉｃ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｐｉｇｓ ｖｉａ Ｚｉｎｃ−Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｐａｇｅｓ ９７９−９８２，Ｖｏｌｕｍｅ ２１．
Ｙｅａｇｅｒ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｎ ｉｓ ａ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２２９Ｅ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９２，Ｐａｇｅｓ ４２０−４２２，Ｖｏｌｕｍｅ ３５７．
Ｙｏｓｈｉｏｋａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｒｔｈ ｏｆ Ｐｉｇｌｅｔｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｚｙｇｏｔｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００２，Ｐａｇｅｓ １１２−１１９，Ｖｏｌｕｍｅ ６６，Ｉｓｓｕｅ １．
Ｙｕａｎ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｑｕａｄｒｕｐｌｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｉｇｓ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｏｃｙｔｅ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，２０１７，Ｐａｇｅｓ Ｅ５７９６−Ｅ５８０４，Ｖｏｌｕｍｅ １１４，Ｎｕｍｂｅｒ ２９．
Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＲＲＳ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｅｔｅｒｎａｒｙ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，Ｐａｇｅｓ ２２９−２４１，Ｖｏｌｕｍｅ １７７，Ｉｓｓｕｅ ３−４．
Ｚｈａｎｇ，Ｚｈａｎｇ Ｌａｂ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｃｒｉｓｐｒ／ｚｈａｎｇ／．
Ｚｈａｏ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｉｍｐｒｏｖｅ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｅｍｂｒｙｏｓ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ，２０１０，Ｐａｇｅｓ ７５−８３，Ｖｏｌｕｍｅ １２，Ｎｕｍｂｅｒ １．
Ｚｈａｏ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ａｎ Ｉｎｂｒｅｄ Ｍｉｎｉａｔｕｒｅ Ｐｉｇ ｂｙ Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００９，Ｐａｇｅｓ ５２５−５３０，Ｖｏｌｕｍｅ ８１，Ｉｓｓｕｅ ３．
Figure 2021521844
Figure 2021521844

Figure 2021521844

Figure 2021521844

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実施形態
さらなる例示のために、本開示の追加の非限定的な実施形態を以下に記載する。
実施形態１は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む、家畜動物もしくはその子孫、または動物細胞である。
実施形態２は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含まない家畜動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性と比較して、動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性を低減する、実施形態１に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３は、病原体がウイルスを含む、実施形態２に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４は、ウイルスが、コロナウイルス科ウイルスを含む、実施形態３に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５は、ウイルスが、コロナウイルス亜科ウイルスを含む、実施形態４に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６は、ウイルスが、コロナウイルスを含む、実施形態５に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７は、コロナウイルスが、アルファコロナウイルス属ウイルスを含む、実施形態６に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８は、アルファコロナウイルス属ウイルスが、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）またはブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）を含む、実施形態７に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９は、ＴＧＥＶが、ＴＧＥＶ Ｐｕｒｄｕｅ株を含む、実施形態８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０は、家畜動物が、有蹄類、鳥類動物、およびウマ動物からなる群から選択されるか、または細胞が、有蹄類、鳥類動物、およびウマ動物からなる群から選択される動物に由来する、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１は、鳥類動物が、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥、もしくはひな鳩を含むか、またはウマ動物が、ウマもしくはロバを含む、実施形態１０に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２は、有蹄類が、偶蹄類を含む、実施形態１０に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１３は、偶蹄類が、ブタ動物、ウシ動物、ヒツジ動物、ヤギ動物、バッファロー、ラクダ、ラマ、アルパカ、またはシカを含む、実施形態１１に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１４は、ウシ動物が、肉牛または乳牛を含む、実施形態１３に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１５は、偶蹄類が、ブタ動物を含む、実施形態１３に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１６は、ブタ動物がブタを含む、実施形態１５に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１７は、動物または子孫が、胚、幼若体、もしくは成体であるか、または細胞が、胚細胞、幼若体動物に由来する細胞、もしくは成体動物に由来する細胞を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１８は、動物、子孫、または細胞が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してヘテロ接合性である、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１９は、動物、子孫、または細胞が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してホモ接合性である、実施形態１〜１７のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２０は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、実施形態１〜１９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２１は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失を含む、実施形態２０に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２２は、欠失が、フレーム内欠失を含む、実施形態２１に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２３は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入を含む、実施形態２０〜２２のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２４は、挿入、欠失、置換、またはそれらのいずれかの組み合わせが、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおけるミスコードをもたらす、実施形態２０、２１、および２３のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２５は、挿入、欠失、置換、またはミスコードが、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける未成熟終止コドンをもたらす、実施形態２０、２１、２３、および２４のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２６は、欠失が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルの開始コドンの欠失を含む、実施形態２０、２１、および２３のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２７は、欠失が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのコード配列全体の欠失を含む、実施形態２０、２１、２３、および２６のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２８は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換を含む、実施形態２０〜２６のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態２９は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子における修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子における修飾染色体配列を欠く動物、子孫、または細胞におけるＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性と比較して、ＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性を低減させる、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３０は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、動物、子孫、または細胞による機能性ＡＮＰＥＰタンパク質の産生を実質的にもたらさない、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３１は、動物、子孫、または細胞が、ＡＮＰＥＰタンパク質を産生しない、実施形態１〜３０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３２は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン４、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２もしくはエクソン４と連続するイントロン、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける修飾を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３３は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における修飾、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのイントロン１における修飾、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態３２に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３４は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのイントロン１で開始し、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２で終了する欠失を含む、実施形態３２または３３に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３５は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における挿入または欠失を含む、実施形態３２または３３に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３６は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における挿入または欠失が、開始コドンの下流にある、実施形態３５に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３７は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２に欠失を含む、実施形態３２、３３、３６、および３７のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３８は、欠失が、エクソン２におけるフレーム内欠失を含む、実施形態３７に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態３９は、エクソン２におけるフレーム内欠失が、ＡＮＰＥＰタンパク質のアミノ酸１９４〜１９６の欠失をもたらす、実施形態３８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４０は、エクソン２におけるフレーム内欠失が、ＡＮＰＥＰタンパク質のアミノ酸１９４〜１９７の欠失をもたらす、実施形態３８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４１は、フレーム内欠失が、ＡＮＰＥＰタンパク質の１９８位におけるバリン残基のイソロイシン残基での置換をさらにもたらす、実施形態４０に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４２は、修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２における挿入を含む、実施形態３２〜４１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４３は、修飾染色体配列が、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３９７からヌクレオチド１，５７８までの１８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，３９７から始まる５塩基対の挿入で置き換えられる）、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７４からヌクレオチド１，５８２までの９塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７７からヌクレオチド１，５８５までの９塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド８１９からヌクレオチド１，６８５までの８６７塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド８８２からヌクレオチド１，６８８までの８６７塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０と１，５８１との間の１塩基対の挿入、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７９と１，５８０との間の１塩基対の挿入、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３２１からヌクレオチド１，５８７までの２６７塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３２３からヌクレオチド１，５８９までの２６７塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８２からヌクレオチド１，５９３までの１２塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５６１からヌクレオチド１，５８５までの２５塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５６０からヌクレオチド１，５８４までの２５塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７５からヌクレオチド１，５８２までの８塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７４からヌクレオチド１，５８１までの８塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、
およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、実施形態３２〜４２のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４４は、
修飾が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３９７からヌクレオチド１，５７８までの１８２塩基対の欠失を含み、欠失した配列が、ヌクレオチド１，３９７から始まる５塩基対の挿入で置き換えられ、５塩基対の挿入が、配列ＣＣＣＴＣ（配列番号１６９）を含み、
修飾が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入を含み、挿入が、単一のチミン（Ｔ）残基を含み、
修飾が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０と１，５８１との間の１塩基対の挿入を含み、挿入が、単一のチミン（Ｔ）残基または単一のアデニン（Ａ）残基を含み、
修飾が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７９と１，５８０との間の１塩基対の挿入を含み、挿入が、単一のアデニン（Ａ）残基を含み、
修飾が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入を含み、挿入が、単一のＡＴジヌクレオチドを含み、
修飾が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失を含み、欠失した配列が、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられ、８塩基対の挿入が、配列ＧＧＧＧＣＴＴＡ（配列番号１７９）を含み、
修飾が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失を含み、欠失した配列が、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられ、４塩基対の挿入が、配列ＴＣＧＴ（配列番号１８０）を含む、実施形態４３に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４５は、修飾染色体配列が、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８２からヌクレオチド１，５９３までの１２塩基対の欠失、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、
およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、実施形態４３または４４に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４６は、修飾染色体配列が、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入、
参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、
およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、実施形態４５に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４７は、動物、子孫、または細胞が、
（ａ）ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、および
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入、
（ｂ）ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、および
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入、
（ｃ）ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、および
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、
（ｄ）ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、および
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１から１，５８２までの２塩基対の挿入、または
（ｅ）ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、および
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失を含む、実施形態４３〜４６のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４８は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド１７，２３５〜２２，４２２を含む領域内に修飾を含む、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態４９は、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド１７，２３５〜２２，０１６を含む領域内に修飾を含む、実施形態４８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５０は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４４６〜２１，５３７を含む領域内に修飾を含む、実施形態４８または４９に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５１は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４７９〜２１，５２９を含む領域内に修飾を含む、実施形態４８〜５０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５２は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４７９〜２１，５２３を含む領域内の修飾を含む、実施形態４８〜５１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５３は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，５３８〜２２，４２２を含む領域内に修飾を含む、実施形態５２に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５４は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２２，０１７〜２２，４２２を含む領域内に修飾を含む、実施形態４８または５３に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５５は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２２，０５４〜２２，２５６を含む領域内に修飾を含む、実施形態４８、５３、および５４のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５６は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２２，０５４〜２２，１２６を含む領域内の修飾を含む、実施形態４８および５３〜５５のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５７は、修飾染色体配列が、挿入または欠失を含む、実施形態４８〜５６のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５８は、修飾染色体配列が、欠失を含む、実施形態５７に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態５９は、欠失が、フレーム内欠失を含む、実施形態５８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６０は、修飾染色体配列が、イントロン−エクソンスプライス領域を破壊する、実施形態３２〜５９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６１は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４７９からヌクレオチド２１，５２９までの５１塩基対の欠失を含む、実施形態４８〜６０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６２は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，４７９からヌクレオチド２１，５２３までの４５塩基対の欠失を含む、実施形態４８〜６０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６３は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド２１，５０９からヌクレオチド２１，５１１までの３塩基対の欠失を含む、実施形態４８〜６０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６４は、修飾染色体配列が、置換を含む、実施形態４８〜６０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６５は、配列番号１３２のヌクレオチド２１，５０９〜２１，５１１におけるＡＣＣコドン内のヌクレオチドのうちの１つ以上を異なるヌクレオチドで置換して、異なるアミノ酸をコードするコドンを産生することを含む、実施形態６４に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６６は、１つ以上のヌクレオチドの置換が、配列番号１３４のアミノ酸７３８におけるトレオニン（Ｔ）または配列番号１３３のアミノ酸７９２におけるトレオニン（Ｔ）の、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）残基での置換をもたらす、実施形態６５に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６７は、置換が、配列番号１３４のアミノ酸７３８におけるトレオニン（Ｔ）または配列番号１３３のアミノ酸７９２におけるトレオニン（Ｔ）の、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、またはアルギニン（Ｒ）残基での置換をもたらす、実施形態６５または６６に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６８は、置換が、配列番号１３４のアミノ酸７３８におけるトレオニン（Ｔ）または配列番号１３３のアミノ酸７９２におけるトレオニン（Ｔ）をバリン（Ｖ）またはアルギニン（Ｒ）残基で置き換えることをもたらす、実施形態６５〜６７のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態６９は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、欠失、挿入、または置換からなる、実施形態３２〜６８のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７０は、動物、子孫、または細胞が、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１３５または１３２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する染色体配列を、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に含む、実施形態２０〜６９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７１は、家畜動物、子孫、または細胞が、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、または１７８を含む染色体配列を含む、実施形態１〜７０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７２は、家畜動物、子孫、または細胞が、配列番号１７７、１７８、１６６、１６７、１７０、１７２、または１７１を含む染色体配列を含む、実施形態７１に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７３は、家畜動物、子孫、または細胞が、配列番号１７７、１７８、１６６、１６７、または１７１を含む染色体配列を含む、実施形態７１に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７４は、家畜動物、子孫、または細胞が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列をさらに含む、実施形態１〜７３のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７５は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性と比較して、動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性を低減する、実施形態７４に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７６は、病原体がウイルスを含む、実施形態７５に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７７は、ウイルスが、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）を含む、実施形態７６に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７８は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、１型ＰＲＲＳＶウイルス、２型ＰＲＲＳＶ、または１型および２型ＰＲＲＳＶウイルスの両方に対する動物、子孫、または細胞の感受性を低減する、実施形態７７に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態７９は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＮＶＳＬ９７−７８９５、ＫＳ０６−７２１０９、Ｐ１２９、ＶＲ２３３２、ＣＯ９０、ＡＺ２５、ＭＬＶ−ＲｅｓＰＲＲＳ、ＫＳ６２−０６２７４、ＫＳ４８３（ＳＤ２３９８３）、ＣＯ８４、ＳＤ１３−１５、Ｌｅｌｙｓｔａｄ、０３−１０５９、０３−１０６０、ＳＤ０１−０８、４３５３ＰＺ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるＰＲＲＳＶ分離株に対する動物、子孫、または細胞の感受性を低減する、実施形態７８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８０は、動物、子孫、または細胞が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してヘテロ接合性である、実施形態７４〜７９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８１は、動物、子孫、または細胞が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してホモ接合性である、実施形態７４〜７９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８２は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、実施形態７４〜８１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８３は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失を含む、実施形態８２に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８４は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入を含む、実施形態８２または８３に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８５は、挿入、欠失、置換、またはそれらのいずれかの組み合わせが、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおけるミスコードをもたらす、実施形態８２〜８４のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８６は、挿入、欠失、置換、またはミスコードが、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける未成熟終止コドンをもたらす、実施形態８２〜８５のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８７は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における修飾染色体配列を欠く動物、子孫、または細胞におけるＣＤ１６３タンパク質産生または活性と比較して、ＣＤ１６３タンパク質産生または活性を低減させる、実施形態７４〜８６のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８８は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、動物、子孫、または細胞による機能性ＣＤ１６３タンパク質の産生を実質的にもたらさない、実施形態７４〜８７のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態８９は、動物、子孫、または細胞が、ＣＤ１６３タンパク質を産生しない、実施形態７４〜８０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９０は、家畜動物または子孫がブタ動物を含むか、または細胞がブタ細胞を含む、実施形態７４〜８９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９１は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における修飾染色体配列が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン８、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７もしくはエクソン８と連続するイントロン、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける修飾を含む、実施形態９０に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９２は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７に修飾を含む、実施形態９１に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９３は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７における修飾が、欠失を含む、実施形態９２に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９４は、欠失が、フレーム内欠失を含む、実施形態８２〜９３のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９５は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン７における修飾が、挿入を含む、実施形態９２〜９４のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９６は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における修飾染色体配列が、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、同じアレル上の参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間の１塩基対の挿入、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド１，５２５からヌクレオチド３，０３０までの１５０６塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、参照配列の配列番号４７と比較してエクソン７にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対の欠失がある）、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０１５からヌクレオチド３，４６６までの４５２塩基対の欠失、
およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、実施形態９０〜９５のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９７は、
修飾が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、同じアレル上の参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失を含み、２塩基対の挿入が、ジヌクレオチドＡＧを含み、
修飾が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４７と３，１４８との間の１塩基対の挿入を含み、１塩基対の挿入が、単一のアデニン残基を含み、
修飾が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入を含み、７塩基対の挿入が、配列ＴＡＣＴＡＣＴ（配列番号１１５）を含み、
修飾が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失を含み、欠失した配列が、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、参照配列の配列番号４７と比較してエクソン７中にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対の欠失があり、１２塩基対の挿入が、配列ＴＧＴＧＧＡＧＡＡＴＴＣ（配列番号１１６）を含むか、または
修飾が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失を含み、欠失した配列が、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられ、１１塩基対の挿入が、配列ＡＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣ（配列番号１１７）を含む、実施形態９６に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９８は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子における修飾染色体配列が、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、同じアレル上の参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失、
およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、実施形態９６に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態９９は、動物、子孫、または細胞が、
（ａ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失、
（ｂ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、および
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおけるヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、
（ｃ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失、
（ｄ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失、および
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、
（ｅ）参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してエクソン７にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対の欠失がある）、および
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、
（ｆ）参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド４８８からヌクレオチド２，４１７までの１９３０塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド４８８から始まる１２塩基対の挿入で置き換えられ、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してエクソン７にヌクレオチド３，０４４からヌクレオチド３，１７２までのさらなる１２９塩基対の欠失がある）、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失、
（ｇ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対の欠失、および
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、
（ｈ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１４６７塩基対の欠失、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失、
（ｉ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４３１からヌクレオチド３，８９７までの１１塩基対の欠失、および
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、
（ｊ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４７までの１２４塩基対の欠失、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０２４からヌクレオチド３，１４６までの１２３塩基対の欠失、
（ｋ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１５９までの１３０塩基対の欠失、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，０３０からヌクレオチド３，１６１までの１３２塩基対の欠失、
（ｌ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，８１８からヌクレオチド４，０９７までの１２８０塩基対の欠失、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，７２４からヌクレオチド４，０９６までの１３７３塩基対の欠失、
（ｍ）ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド３，１７２までの２８塩基対の欠失、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失、
（ｎ）参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の一方のアレルにおけるヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、および
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，４４０からヌクレオチド４，１６０までの１７２０塩基対の欠失、
（ｏ）ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４８とヌクレオチド３，１４９との間の７塩基対の挿入、および
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、
（ｐ）参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおけるヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、および
参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４９と３，１５０との間の２塩基対の挿入とともに、ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド２，５７３からヌクレオチド２，９４９までの３７７塩基対の欠失、または
（ｑ）参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１１３からヌクレオチド４，４９４までの１３８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ＣＤ１６３遺伝子の一方のアレルにおけるヌクレオチド３，１１３から始まる１１塩基対の挿入で置き換えられる）、および
ＣＤ１６３遺伝子の他方のアレルにおける、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１３７からヌクレオチド３，１４７までの１１塩基対の欠失を含む、実施形態９６〜９８のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞。
実施形態１００は、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、欠失挿入または置換からなる、実施形態８２〜９９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０１は、動物、子孫、または細胞が、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号４７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有するＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の染色体配列を含む、実施形態８２〜１００のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０２は、動物、子孫、または細胞が、配列番号９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、または１１９を含む染色体配列を含む、実施形態７４〜１０１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０３は、
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間に１塩基対の挿入を含み、
ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失を含む、実施形態７４〜１０２のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０４は、家畜動物、子孫、または細胞が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列をさらに含む、実施形態１〜１０３のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０５は、動物、子孫、または細胞が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してヘテロ接合性である、実施形態１０４に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０６は、動物、子孫、または細胞が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列に対してホモ接合性である、実施形態１０４に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０７は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける挿入、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける置換、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、実施形態１０４〜１０６のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０８は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける欠失を含む、実施形態１０７に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１０９は、欠失が、フレーム内欠失を含む、実施形態１０８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１０は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレル内に挿入を含む、実施形態１０７〜１０９のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１１は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレル内に置換を含む、実施形態１０７〜１１０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１２は、挿入、欠失、置換、またはそれらのいずれかの組み合わせが、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおけるミスコードをもたらす、実施形態１０７、１０８、１１０、および１１１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１３は、挿入、欠失、置換、またはミスコードが、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルにおける未成熟終止コドンをもたらす、実施形態１０７、１０８、および１１０〜１１２のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１４は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子における修飾染色体配列を欠く動物、子孫、または細胞におけるＳＩＧＬＥＣ１タンパク質産生または活性と比較して、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質産生または活性を低減させる、実施形態１０４〜１１３のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１５は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、動物、子孫、または細胞による機能性ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質の産生を実質的にもたらさない、実施形態１０４〜１１４のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１６は、動物、子孫、または細胞が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質を産生しない、実施形態１０４〜１１５のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１７は、動物または子孫がブタ動物を含むか、または細胞がブタ細胞を含む、実施形態１０４〜１１６のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１８は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン１、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン２、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン３、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン１、エクソン２、もしくはエクソン３と連続するイントロン、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける修飾を含む、実施形態１１７に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１１９は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン１、エクソン２、および／またはエクソン３における欠失を含む、実施形態１１８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２０は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子のアレルのエクソン１の一部ならびにエクソン２および３のすべての欠失を含む、実施形態１１８または１１９に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２１は、修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１２２のヌクレオチド４，２７９からヌクレオチド５，５２５までの１，２４７塩基対の欠失を含む、実施形態１１８〜１２０のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２２は、欠失した配列が、ネオマイシン遺伝子カセットで置き換えられる、実施形態１１９〜１２１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２３は、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、欠失挿入または置換からなる、実施形態１０７〜１２２のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２４は、動物、子孫、または細胞が、挿入、欠失、または置換の外側の染色体配列の領域において、配列番号１２２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有するＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の染色体配列を含む、実施形態１０７〜１２３のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２５は、動物、子孫、または細胞が、配列番号１２３を含む染色体配列を含む、実施形態１０４〜１２４のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２６は、
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入を含み、
ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１２２と比較してヌクレオチド４，２７９からヌクレオチド５，５２５までの１，２４７塩基対の欠失を含む、実施形態１２１〜１２５のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２７は、動物、子孫、または細胞が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列をさらに含み、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列が、参照配列の配列番号４７と比較してヌクレオチド３，１４５からヌクレオチド４，５３１までの１３８７塩基対の欠失を含む、実施形態１２６に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２８は、動物または子孫が、遺伝子編集された動物または子孫を含むか、または細胞が、遺伝子編集細胞を含む、実施形態１〜１２７のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１２９は、動物または細胞が、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して遺伝子編集されている、実施形態１２８に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１３０は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、設計されたホーミングエンドヌクレアーゼを含む、実施形態１２９に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１３１は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、実施形態１２９または１３０に記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１３２は、動物または細胞が、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して遺伝子編集されている、実施形態１２８〜１３１のいずれか１つに記載の家畜動物、子孫、または細胞である。
実施形態１３３は、実施形態１〜１３２のいずれか１つに記載の家畜動物である。
実施形態１３４は、実施形態１〜１３２のいずれか１つに記載の子孫である。
実施形態１３５は、実施形態１〜１３２のいずれか１つに記載の細胞である。
実施形態１３６は、細胞が、精子細胞を含む、実施形態１３５に記載の細胞である。
実施形態１３７は、細胞が、卵細胞を含む、実施形態１３５に記載の細胞である。
実施形態１３８は、卵細胞が、受精卵を含む、実施形態１３７に記載の細胞である。
実施形態１３９は、細胞が、体細胞を含む、実施形態１３５に記載の細胞である。
実施形態１４０は、体細胞が、線維芽細胞を含む、実施形態１３９に記載の細胞である。
実施形態１４１は、線維芽細胞が、胎児線維芽細胞を含む、実施形態１４１に記載の細胞である。
実施形態１４２は、細胞が、胚細胞または幼若体動物に由来する細胞を含む、実施形態１３５、１３９、および１４０のいずれか１つに記載の細胞である。
実施形態１４３は、病原体による感染に対する感受性を低減した非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生する方法であって、この方法は、
卵母細胞または精子細胞を修飾して、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、卵母細胞および精子細胞のうちの少なくとも１つに導入し、卵母細胞を精子細胞で受精させて、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含有する受精卵を作成すること、または
受精卵を修飾して、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、受精卵に導入することと、
受精卵を代理雌動物に移入することであって、妊娠および正期産により子孫動物を産生する、移入することと、
病原体に対する感受性について子孫動物をスクリーニングすることと、
ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない動物と比較して、病原体に対する感受性を低減した子孫動物を選択することと、を含む。
実施形態１４４は、動物が、家畜動物を含む、実施形態１４３に記載の方法である。
実施形態１４５は、卵母細胞、精子細胞、または受精卵を修飾するステップが、卵母細胞、精子細胞、または受精卵の遺伝子編集を含む、実施形態１４３または１４４に記載の方法である。
実施形態１４６は、卵母細胞、精子細胞、または受精卵が、修飾染色体配列に対してヘテロ接合性である、実施形態１４３〜１４５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４７は、卵母細胞、精子細胞、または受精卵が、修飾染色体配列に対してヘテロ接合性である、実施形態１４３〜１４５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４８は、受精が、人工授精を含む、実施形態１４３〜１４７のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１４９は、家畜動物の病原体による感染に対する抵抗性を増加させる方法であって、この方法は、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの染色体配列を修飾することを含み、それによりＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない家畜動物におけるＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性と比較して低減される。
実施形態１５０は、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの染色体配列を修飾するステップが、染色体配列の遺伝子編集を含む、実施形態１４９に記載の方法である。
実施形態１５１は、遺伝子編集が、ホーミングエンドヌクレアーゼの使用を含む、実施形態１４５〜１４８および１５０のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５２は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、設計されたホーミングエンドヌクレアーゼを含む、実施形態１５１に記載の方法である。
実施形態１５３は、ホーミングエンドヌクレアーゼが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、実施形態１５１または１５２に記載の方法である。
実施形態１５４は、遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ系の使用を含む、実施形態１４５〜１４８および１５０〜１５３のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５５は、方法が、実施形態１〜１５３のいずれか１つに記載の動物を産生する、実施形態１４３〜１５４のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５６は、動物をファウンダー動物として使用することをさらに含む、実施形態１４３〜１５５のいずれか１つに記載の方法である。
実施形態１５７は、実施形態１〜１３３のいずれか１つに記載の２匹以上の家畜動物および／またはそれらの子孫を含む、家畜動物の集団である。
実施形態１５８は、実施形態１４３〜１５６のいずれか１つに記載の方法によって作製される２匹以上の動物および／またはそれらの子孫を含む、動物の集団である。
実施形態１５９は、動物の集団が、病原体による感染に抵抗性がある、実施形態１５７または１５８に記載の集団である。
実施形態１６０は、病原体が、ウイルスを含む、実施形態１５９に記載の集団である。
実施形態１６１は、ウイルスが、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）またはブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）を含む、実施形態１６０に記載の集団である。
実施形態１６２は、
（ａ）配列番号１３５の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、ヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号１３２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、このヌクレオチド配列が、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、ヌクレオチド配列、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子である。
実施形態１６３は、核酸分子が、単離された核酸分子である、実施形態１６２に記載の核酸分子である。
実施形態１６４は、核酸が、配列番号１３２または１３５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７．５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列が、配列番号１３２または１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、実施形態１６２または１６３に記載の核酸分子である。
実施形態１６５は、置換、挿入、または欠失が、置換、挿入、または欠失を含まない核酸と比較して、ＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性を低減または排除する、実施形態１６２〜１６４のいずれか１つに記載の核酸分子である。
実施形態１６６は、核酸が、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、または１７８を含む、実施形態１６２〜１６５のいずれか１つに記載の核酸分子である。
実施形態１６７は、核酸が、配列番号１７７、１７８、１６６、１６７、または１７１を含む、実施形態１６６に記載の核酸分子である。

Claims (35)

  1. アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列を含む、家畜動物もしくはその子孫、または動物細胞。
  2. 前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子内の前記修飾染色体配列が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子に修飾染色体配列を含まない家畜動物、子孫、または細胞の病原体による感染に対する感受性と比較して、前記動物、子孫、または細胞の前記病原体による感染に対する感受性を低減する、請求項１に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  3. 前記病原体が、ウイルスを含む、請求項２に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  4. 前記ウイルスが、アルファコロナウイルス属ウイルスを含む、請求項３に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  5. 前記アルファコロナウイルス属ウイルスが、伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）またはブタ呼吸器コロナウイルス（ＰＲＣＶ）を含む、請求項４に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  6. 前記家畜動物が、ブタ動物を含むか、または前記細胞が、ブタ動物に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  7. 前記動物または子孫が、胚、幼若体、もしくは成体であるか、または前記細胞が、胚細胞、幼若体動物に由来する細胞、もしくは成体動物に由来する細胞を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  8. 前記動物、子孫、または細胞が、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子内の前記修飾染色体配列に対してヘテロ接合性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  9. 前記動物、子孫、または細胞が、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子内の前記修飾染色体配列に対してホモ接合性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  10. 前記修飾染色体配列が、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子のアレルへの挿入、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子のアレルにおける欠失、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子のアレルにおける置換、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  11. 前記挿入、前記欠失、前記置換、または前記それらのいずれかの組み合わせが、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子の前記アレルにおけるミスコードをもたらす、請求項１０に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  12. 前記欠失が、
    前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子の前記アレルの開始コドンの欠失、または
    前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子の前記アレルのコード配列全体の欠失を含む、請求項１０に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  13. 前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子における前記修飾染色体配列が、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子における前記修飾染色体配列を欠く動物、子孫、または細胞におけるＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性と比較して、ＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性を低減させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  14. 前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子内の前記修飾染色体配列が、前記動物、子孫、または細胞による機能性ＡＮＰＥＰタンパク質の産生を実質的にもたらさない、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  15. 前記修飾染色体配列が、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子のアレルのエクソン２、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子のアレルのエクソン４、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子の前記アレルのエクソン２もしくはエクソン４と連続するイントロン、またはそれらのいずれかの組み合わせにおける修飾を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  16. 前記修飾染色体配列が、前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子の前記アレルのエクソン２における欠失を含み、前記欠失が、エクソン２におけるフレーム内欠失を含む、請求項１５に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  17. エクソン２における前記フレーム内欠失が、
    前記ＡＮＰＥＰタンパク質のアミノ酸１９４〜１９６の欠失をもたらすか、または
    前記ＡＮＰＥＰタンパク質のアミノ酸１９４〜１９７の欠失をもたらし、前記フレーム内欠失が、任意選択的に、前記ＡＮＰＥＰタンパク質の１９８位におけるバリン残基のイソロイシン残基での置換をさらにもたらす、請求項１６に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  18. 前記修飾染色体配列が、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３９７からヌクレオチド１，５７８までの１８２塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，３９７から始まる５塩基対の挿入で置き換えられる）、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７４からヌクレオチド１，５８２までの９塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７７からヌクレオチド１，５８５までの９塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド８１９からヌクレオチド１，６８５までの８６７塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド８８２からヌクレオチド１，６８８までの８６７塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０と１，５８１との間の１塩基対の挿入、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７９と１，５８０との間の１塩基対の挿入、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３２１からヌクレオチド１，５８７までの２６７塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，３２３からヌクレオチド１，５８９までの２６７塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８２からヌクレオチド１，５９３までの１２塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５６１からヌクレオチド１，５８５までの２５塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５６０からヌクレオチド１，５８４までの２５塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７５からヌクレオチド１，５８２までの８塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５７４からヌクレオチド１，５８１までの８塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、
    およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、請求項１５に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  19. 前記修飾染色体配列が、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド９４０からヌクレオチド１，６００までの６６１塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド９４０から始まる８塩基対の挿入で置き換えられる）、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８０からヌクレオチド１，５８７までの８塩基対の欠失（欠失した配列は、ヌクレオチド１，５８０から始まる４塩基対の挿入で置き換えられる）、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の１塩基対の挿入、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１と１，５８２との間の２塩基対の挿入、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１からヌクレオチド１，５８９までの９塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８２からヌクレオチド１，５９３までの１２塩基対の欠失、
    参照配列の配列番号１３５と比較してヌクレオチド１，５８１の１塩基対の欠失、
    およびそれらのいずれかの組み合わせからなる群から選択される修飾を含む、請求項１８に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  20. 前記修飾染色体配列が、参照配列の配列番号１３２のヌクレオチド１７，２３５〜２２，４２２を含む領域内に修飾を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  21. 前記動物、子孫、または細胞が、前記挿入、前記欠失、または前記置換の外側の前記染色体配列の領域において、配列番号１３５または１３２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、または１００％の配列同一性を有する染色体配列を前記ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子内に含む、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  22. 前記家畜動物、子孫、または細胞が、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、または１７８を含む染色体配列を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  23. 前記家畜動物、子孫、または細胞が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に少なくとも１つの修飾染色体配列をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  24. 前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする前記遺伝子内の前記修飾染色体配列が、ＣＤ１６３タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない動物、子孫、または細胞のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）による感染に対する感受性と比較して、前記動物、子孫、または細胞の前記ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルスによる感染に対する感受性を低減する、請求項２３に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  25. 前記ＣＤ１６３タンパク質をコードする前記遺伝子内の前記修飾染色体配列が、前記動物、子孫、または細胞による機能性ＣＤ１６３タンパク質の産生を実質的にもたらさない、請求項２３または２４に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  26. 前記家畜動物、子孫、または細胞が、ＳＩＧＬＥＣ１タンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列をさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  27. 前記動物または子孫が、遺伝子編集された動物もしくは子孫を含むか、または前記細胞が、遺伝子編集された細胞を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  28. 前記動物または細胞が、ホーミングエンドヌクレアーゼを使用して遺伝子編集されており、前記ホーミングエンドヌクレアーゼが、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）系、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、リコンビナーゼ融合タンパク質、メガヌクレアーゼ、またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、請求項２７に記載の家畜動物、子孫、または細胞。
  29. 前記細胞が、精子細胞、卵細胞（任意選択的に受精卵）、または体細胞（任意選択的に線維芽細胞）を含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の細胞。
  30. 病原体による感染に対する感受性を低減した非ヒト動物または非ヒト動物の系統を産生する方法であって、
    卵母細胞または精子細胞を修飾して、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、前記卵母細胞および前記精子細胞のうちの少なくとも１つに導入し、前記卵母細胞を前記精子細胞で受精させて、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする前記遺伝子内に前記修飾染色体配列を含有する受精卵を作成すること、または
    受精卵を修飾して、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内の修飾染色体配列を、前記受精卵に導入することと、
    前記受精卵を代理雌動物に移入することであって、妊娠および正期産により子孫動物を産生する、移入することと、
    前記病原体に対する感受性について前記子孫動物をスクリーニングすることと、
    ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない動物と比較して、前記病原体に対する感受性を低減した子孫動物を選択することと、を含む、方法。
  31. 家畜動物の病原体による感染に対する抵抗性を増加させる方法であって、アミノペプチダーゼＮ（ＡＮＰＥＰ）タンパク質をコードする遺伝子内の少なくとも１つの染色体配列を修飾することを含み、それによりＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性が、ＡＮＰＥＰタンパク質をコードする遺伝子内に修飾染色体配列を含まない家畜動物におけるＡＮＰＥＰタンパク質産生または活性と比較して低減される、方法。
  32. 請求項１〜２８のいずれか一項に記載の２匹以上の家畜動物および／またはそれらの子孫を含む、家畜動物の集団。
  33. （ａ）配列番号１３５の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、配列番号１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、ヌクレオチド配列、
    （ｂ）配列番号１３２の配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であって、配列番号１３２に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、ヌクレオチド配列、および
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）のｃＤＮＡからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  34. 前記核酸が、配列番号１３２または１３５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７．５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１３２または１３５に対して少なくとも１つの置換、挿入、または欠失を含む、請求項３３に記載の核酸分子。
  35. 前記核酸が、配列番号１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７６、１７７、または１７８を含む、請求項３３または３４のいずれか一項に記載の核酸分子。
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