CN103638018A

CN103638018A - 一种复方氨基酸注射液18aa-ⅶ药物组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN103638018A
Application number: CN201310643021.0A
Authority: CN
Inventors: 蒋李娟; 李国伟; 程福军; 赵璨
Original assignee: Liaoning Haisco Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shenyang Hisco Pharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2013-12-03
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2033-12-03
Also published as: CN103638018B

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物及其制备方法，高支链氨基酸含量是该复方氨基酸注射液的重要特点。该药物组合物以迷迭香酸同时作抗氧剂和螯合剂的方法，代替现有技术中惯常使用的以亚硫酸盐作抗氧剂、乙二胺四乙酸盐作螯合剂的方法，不但增强复方氨基酸的稳定性，更提高了本品临床使用的安全性。

Description

一种复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物及其制备方法

技术领域

本发明是属于医药技术领域，具体涉及一种复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物及其制备方法。

背景技术

氨基酸是生物体内构成蛋白质分子的基本单位，与生物的生命活动有着密切的关系，是生物体内不可缺少的营养成分之一，蛋白质在机体内的消化和吸收是通过氨基酸来完成，人体对蛋白质的需要实际上是对氨基酸的需要，氨基酸在蛋白质的合成与分解过程中起维持氮平衡的作用。低蛋白血症是各种原因所致负氮平衡的结果，其主要病因有：蛋白摄入不足或吸收不良，各种原因引起的食欲不振及厌食；蛋白质合成障碍，各种原因的肝损害使肝脏蛋白合成能力减低，血浆蛋白质合成减少；长期大量蛋白质丢失；蛋白质分解加速等。必需氨基酸、半必需氨基酸和非必需氨基酸按适当配比，再加上碳水化合物、电解质等组成氨基酸制剂，可以促进体内蛋白质代谢正常，纠正其负氮平衡。

在创伤、饥饿等应激状态下，机体主要通过骨骼肌蛋白的分解来获取一些必需氨基酸以满足肝脏合成重要生命蛋白质的需要，同时通过生糖和生酮作用为机体供应能量。支链氨基酸（BCAA）约占肌肉蛋白质中必需氨基酸的35%左右，因此其在蛋白质合成和能量代谢中占重要的地位。在消化道术后胃肠道不能充分利用的情况下，通过一定时间的静脉营养支持是必要的。一直以来，完全胃肠外营养支持（TPN）中的氨基酸是根据经口营养或食物中的氨基酸构成比来给予的，即必需氨基酸/非必需氨基酸（EAA/NEAA）之比为1:1左右，BCAA含量20%左右。近年来，对支链氨基酸的研究表明，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸主要在肌肉内代谢，可作为能量底物、糖元异生底物和肌蛋白调节剂。改变支链氨基酸输入百分率，可影响氮平衡及肌肉内氨基酸流向，支链氨基酸可在外周被氧化提供能量，而不增加肝脏负担。动物实验也证实，创伤后支链氨基酸、精氨酸及天冬氨酸等具有抗氧化作用和免疫调节作用的氨基酸含量明显降低，而使用富含支链氨基酸的氨基酸注射液1周后，上述氨基酸浓度明显上升，且有利于机体免疫力上升及机体伤口的愈合。Kishi等将高BCAA溶液输给大鼠，发现氮平衡明显改善，血浆白蛋白浓度增加，提示蛋白合成增加。因此，术后使用复方支链氨基酸注射液可提高患者肌肉和血浆蛋白水平，改善机体应激的免疫抑制状态，对改善患者免疫力，促进患者恢复十分重要。近年来，BCAA强化的营养支持方案在实验和临床上得到充分的肯定，特别是在创伤等应激状态下，其可促进肝脏蛋白合成、抑制肌肉蛋白分解，具有良好的节氮效应。Cerra等应用含50%BCAA的复方氨基酸与含15%的BCAA复方氨基酸液进行对比性研究，在同样的TPN条件下，应用高浓度支链注射液的术后患者，术后第3天即出现正氮平衡；应用低支链注射液的患者，术后第6天出现正氮平衡。可见，在供给足够热量的情况下，输注适量的氨基酸液都能使机体进入正氮平衡状态，但输注不同种类的氨基酸液，所取得的正氮平衡的效果有差别，高支链注射液能促进机体早日进入正氮平衡阶段。

目前国内外生产的氨基酸制剂品种繁多，各制剂中氨基酸的种类、含量和数量各不相同，由此而用于不同的适应症患者。复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ是必需氨基酸和非必需氨基酸的复方制剂，它含有18种氨基酸，其中支链氨基酸的含量比率为35.9%，必需氨基酸（EAA）的量为45.0g/L，非必需氨基酸（NEAA）的量为14.0g/L，总氮量为8.1mg/ml，EAA与NEAA比为3.21，是适用于低蛋白血症、低营养状态和手术前后等状态时的氨基酸补充的氨基酸混合液。高支链氨基酸的TPN，不仅是一种营养支持，更是一种有力的治疗措施。EAA与NEAA的比例（E/N比例）适当能保证氨基酸制剂中氨基酸的有效利用。

由于氨基酸在溶液中很不稳定（特别是色氨酸和半胱氨酸），极易被氧化而产生一系列复杂的对人体有害的降解物质，因此需要加入抗氧剂。目前，国内外大部分复方氨基酸注射液普遍采用亚硫酸盐（如亚硫酸氢钠）作抗氧化剂。近年来，人们开始认识到亚硫酸盐类物质的毒副作用，临床上最常见的有关副反应是亚硫酸盐过敏，症状是支气管痉挛，喘鸣，呼吸困难，恶性喉部水肿、低血压、休克、甚至死亡。研究发现亚硫酸盐与脱氧核糖核酸(DNA)、腺嘌呤核苷酸、维生素K-3、尿嘧啶、胞嘧啶及蛋白质中的双硫键均会发生不可逆反应，这可能是亚硫酸盐毒副作用的根本原因所在。因此，寻找毒副作用小、抗氧化性能优良的抗氧剂代替亚硫酸盐是复方氨基酸注射液产品一个亟待解决的问题。

复方氨基酸注射液中氨基酸被氧化降解还与体系中存在金属离子的催化作用密切相关，为了更好地控制氨基酸不被氧化，注射液中加入金属离子螯合剂也是必不可少的。

CN101439036、CN101439031公开了一种以盐酸半胱氨酸作抗氧剂、柠檬酸作螯合剂的方法；CN102626409A公开的抗氧剂和螯合剂选自柠檬酸及其盐、乙二胺四乙酸钠钙、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸、氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、酒石酸及其盐；CN102861011A、CN102861012A则以富马酸、硫代山梨醇、EDTA、盐酸半胱氨酸或马来酸作抗氧剂和螯合剂。这些公开的方法中抗氧化作用还有待提升，且所采用的螯合剂又引入了新的毒副作用成分，如EDTA这一类乙二胺四乙酸盐会与血液及骨胳中的钙形成水溶性螯合物，被排出体外，引起低血钙症或骨钙流失。因此，进一步探索研制不含亚硫酸盐的复方氨基酸注射液制剂仍然十分必要。

发明内容

鉴于上述情况，本发明人经过系统研究、反复试验，最后发现，向复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ体系中加入特定剂量的迷迭香酸，可大大增强体系抗氧化性能的同时将金属离子完全螯合，从而能显著提高氨基酸的稳定性。迷迭香酸起到了抗氧化和螯合金属离子的双重作用，充分抑制了氨基酸被氧化降解以及后续副反应的发生。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物，其每1000ml注射液中含有：

进一步地，该组合物每1000ml注射液中含有：

进一步地，该组合物每1000ml注射液中含有：

进一步地，该组合物每1000ml注射液中含有：

进一步地，该组合物每1000ml注射液中含有：

本发明还提供该复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物的制备方法，具体包括以下步骤：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸30～55分钟；

（2）当注射用水的温度降至88～92℃时，在充氮保护下加入1/2处方量的迷迭香酸，搅拌溶解后，依次加入处方量的亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸，充分搅拌使其完全溶解；

（3）降温至68～82℃时，在充氮保护下依次加入醋酸赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸及剩余的1/2处方量亚硫酸氢钠充分搅拌使其完全溶解；

（4）药液降温至45～54℃时，在充氮保护下加入冰醋酸适量，调节药液pH至6.8～7.8，加入0.03%（W/V）的药用活性炭，搅拌15分钟，冷却水降温，待药液温度降至40℃以下时，钛棒脱炭；

（5）在充氮保护下补加注射用水至全量，精滤，充氮，灌装，压胶塞，轧盖；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。

进一步地，该制备方法具体包括以下步骤：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸45分钟；

（2）当注射用水的温度降至90℃时，在充氮保护下加入1/2处方量的迷迭香酸，搅拌溶解后，依次加入处方量的亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸，充分搅拌使其完全溶解；

（3）降温至75℃时，在充氮保护下依次加入醋酸赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸及剩余的1/2处方量亚硫酸氢钠充分搅拌使其完全溶解；

（4）药液降温至45～50℃时，在充氮保护下加入冰醋酸适量，调节药液pH至7.3，加入0.03%（W/V）的药用活性炭，搅拌15分钟，冷却水降温，待药液温度降至40℃以下时，钛棒脱炭；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。

本发明的复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物中各组份含量可照高效液相色谱法（中国药典2010年版二部附录ⅤD）测定：

色谱条件：色谱柱AccQ-Tag^TM柱（3.9mm×150mm，4μm）；柱温：37℃；检测波长：248nm；进样量：5μL；流速：1.0mL/min。流动相A：取乙酸钠（三水合乙酸钠）19.04g，加1000mL水溶解，用体积分数50%的磷酸溶液调至pH5.2，加入EDTA工作液（100mgEDTA加水至100mL）1.0mL，加入2.37mL（1.72g）三乙胺，用体积分数50%的磷酸溶液调至pH4.95，0.45μm滤膜滤过并脱气20s，即可；流动相B：乙腈；流动相C：超纯水；按下表1进行梯度洗脱。

表1梯度洗脱表

标准曲线的求取：

取105℃干燥3h的18种氨基酸对照品，按照处方量分别精密称定，加6mol/L盐酸溶液溶解，制成含总氨基酸浓度为250μmol/L的贮备液。精密量取对照品贮备液适量，用超纯水稀释成含总氨基酸为5μmol/L的对照品溶液。

精密量取对照品溶液10μL，置0.4cm×5cm的小管中，加硼酸盐缓冲液（pH8.8）70μL，混匀，加入衍生试剂AQC溶液（AQC试剂1瓶加AQC稀释液1mL，置55℃烘箱中使溶解，即得）20μL，混匀，置55℃烘箱中10min，即可。分别精密量取1.0、2.0、5.0、10.0、15.0μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积（A）对质量浓度（ρ）进行线性回归计算，得到18种氨基酸的回归方程。

样品测定：

精密量取样品适量，稀释成含总氨基酸5μmol/L的溶液。按上述试验的条件，精密量取5.0μL进样测定，记录色谱图；另取上述对照品溶液，同法测定，按外标法以峰面积计算，即得。

复方氨基酸注射液中，氨基酸的氧化降解和相关副反应的发生会使注射液发生性状上的变化，如颜色由无色变为微黄色至黄色，透光率降低，pH度改变等。可按《国家食品药品监督管理局药品标准》WS1-(X-324)-2010Z，检测样品的外观性状、透光率和pH值。

本发明提供的该复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物及其制备方法具有以下优点：

1）本发明迷迭香酸的使用，解决了复合氨基酸注射液现有技术以亚硫酸盐作抗氧剂、乙二胺四乙酸盐作螯合剂产生的毒副作用问题，提高了产品质量和临床用药的安全性。

2）本发明中迷迭香酸既用作抗氧剂又用作螯合剂，因而减少了复方氨基酸注射液组合物现有技术中辅料种类的使用，降低了制剂成本，提高了产品质量可控性和临床用药的安全性。

3）本发明提供的复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物制备方法简便，易于实现工业化。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1

处方：

制备方法：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸45分钟；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。

实施例2

处方：

制备方法：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸35分钟；

（2）当注射用水的温度降至88℃时，在充氮保护下加入1/2处方量的迷迭香酸，搅拌溶解后，依次加入处方量的亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸，充分搅拌使其完全溶解；

（3）降温至70℃时，在充氮保护下依次加入醋酸赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸及剩余的1/2处方量亚硫酸氢钠充分搅拌使其完全溶解；

（4）药液降温至45～50℃时，在充氮保护下加入冰醋酸适量，调节药液pH至7.0，加入0.03%（W/V）的药用活性炭，搅拌15分钟，冷却水降温，待药液温度降至40℃以下时，钛棒脱炭；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。

（根据下述对比试验的需要，可制备不加迷迭香酸的实施例1样品，按上述步骤去掉迷迭香酸的加入即制得。）

实施例3

处方：

制备方法：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸40分钟；

（3）降温至80℃时，在充氮保护下依次加入醋酸赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸及剩余的1/2处方量亚硫酸氢钠充分搅拌使其完全溶解；

（4）药液降温至51～54℃时，在充氮保护下加入冰醋酸适量，调节药液pH至7.5，加入0.03%（W/V）的药用活性炭，搅拌15分钟，冷却水降温，待药液温度降至40℃以下时，钛棒脱炭；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。

实施例4

处方：

制备方法：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸30分钟；

（3）降温至68℃时，在充氮保护下依次加入醋酸赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸及剩余的1/2处方量亚硫酸氢钠充分搅拌使其完全溶解；

（4）药液降温至45℃时，在充氮保护下加入冰醋酸适量，调节药液pH至6.8，加入0.03%（W/V）的药用活性炭，搅拌15分钟，冷却水降温，待药液温度降至40℃以下时，钛棒脱炭；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。

实施例5

处方：

制备方法：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸55分钟；

（2）当注射用水的温度降至92℃时，在充氮保护下加入1/2处方量的迷迭香酸，搅拌溶解后，依次加入处方量的亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸，充分搅拌使其完全溶解；

（3）降温至82℃时，在充氮保护下依次加入醋酸赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸及剩余的1/2处方量亚硫酸氢钠充分搅拌使其完全溶解；

（4）药液降温至54℃时，在充氮保护下加入冰醋酸适量，调节药液pH至7.8，加入0.03%（W/V）的药用活性炭，搅拌15分钟，冷却水降温，待药液温度降至40℃以下时，钛棒脱炭；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。

试验例（稳定性考察）—加速试验

试验方法：取实施例1～5样品及按CN101439031A实施例1制备的对比样品，置于温度30℃±2℃条件下放置，在放置满1、2、3、6个月时均取样分析，测定各样品中各类维生素成分的含量，以初始0天的检测结果为100％作为参比，计算放置后样品中各种氨基酸的含量。下表2是上述样品经加速试验满6个月时各氨基酸成分的含量测定结果：

表2经加速试验6个月后样品中各氨基酸的含量（以0天时的检测结果为100％）

上述结果表明：本发明样品在加速试验6个月内包括色氨酸和半胱氨酸在内的各种氨基酸含量均无明显变化，与CN101439031A实施例1样品比较，明显表现出更好的抗氧化性能。本发明样品各氨基酸成分的稳定性整体优于CN101439031A实施例1样品。

不加迷迭香酸按实施例1的方法制备的样品在室温放置6个月后注射液由无色变为黄色，稍显浑浊，透光率降至约70%，pH度升至8.6；实施例1～5样品经上述加速试验6个月后仍然为无色澄明的液体，透光率均在99%以上，pH度均无明显变化。由此可见，迷迭香酸对于该复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物稳定性的保持作用显著。

Claims

1.一种复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物，其特征在于每1000ml注射液中含有：

异亮氨酸8.19 ~ 10.01 g，亮氨酸11.61 ~ 14.19 g，醋酸赖氨酸9.00 ~ 11.00 g，

甲硫氨酸3.96 ~ 4.84 g，苯丙氨酸6.30 ~ 7.70 g，苏氨酸6.75 ~ 8.25 g，

色氨酸1.17 ~ 1.43 g，缬氨酸12.60 ~ 15.40 g，丙氨酸6.39 ~ 7.81 g，

精氨酸8.10 ~ 9.90 g，门冬氨酸0.90 ~ 1.10 g，谷氨酸0.45 ~ 0.55 g，

组氨酸4.50 ~ 5.50 g，脯氨酸4.50 ~ 5.50 g，丝氨酸1.53 ~ 1.87 g，

酪氨酸0.36 ~ 0.44 g，甘氨酸6.30 ~ 7.70 g，半胱氨酸0.32 ~ 0.39 g，

迷迭香酸0.50 ~ 0.80 g，冰醋酸适量，调节pH至6.8 ~ 7.8。

2.根据权利要求1 所述的组合物，其特征在于每1000ml 注射液中含有：

异亮氨酸9.10 g，亮氨酸12.90 g，醋酸赖氨酸10.00 g，

甲硫氨酸4.40 g，苯丙氨酸7.00 g，苏氨酸7.50 g，

色氨酸1.30 g，缬氨酸14.00 g，丙氨酸7.10 g，

精氨酸9.00 g，门冬氨酸1.00 g，谷氨酸0.50g，

组氨酸5.00 g，脯氨酸5.00 g，丝氨酸1.70 g，

酪氨酸0.40 g，甘氨酸7.00 g，半胱氨酸0.35 g，

迷迭香酸0.65 g，冰醋酸适量，调节pH至6.8 ~ 7.8。

3.根据权利要求1 所述的组合物，其特征在于每1000ml 注射液中含有：

异亮氨酸9.10 g，亮氨酸12.90 g，醋酸赖氨酸10.00 g，

甲硫氨酸4.62 g，苯丙氨酸7.00 g，苏氨酸7.50 g，

色氨酸1.37 g，缬氨酸14.00 g，丙氨酸7.10 g，

精氨酸9.00 g，门冬氨酸1.00 g，谷氨酸0.50g，

组氨酸5.25 g，脯氨酸5.00 g，丝氨酸1.70 g，

酪氨酸0.40 g，甘氨酸7.00 g，半胱氨酸0.35 g，

迷迭香酸0.65 g，冰醋酸适量，调节pH至6.8 ~ 7.8。

4.根据权利要求1 所述的组合物，其特征在于每1000ml 注射液中含有：

异亮氨酸9.10 g，亮氨酸12.90 g，醋酸赖氨酸10.50 g，

甲硫氨酸4.62 g，苯丙氨酸7.00 g，苏氨酸7.88 g，

色氨酸1.37 g，缬氨酸14.70 g，丙氨酸7.46 g，

精氨酸9.45 g，门冬氨酸1.05 g，谷氨酸0.53g，

组氨酸5.25 g，脯氨酸5.25 g，丝氨酸1.79 g，

酪氨酸0.42 g，甘氨酸7.35 g，半胱氨酸0.35 g，

迷迭香酸0.70 g，冰醋酸适量，调节pH至6.8 ~ 7.8。

5.根据权利要求1 所述的组合物，其特征在于每1000ml 注射液中含有：

异亮氨酸10.01 g，亮氨酸14.19 g，醋酸赖氨酸11.00 g，

甲硫氨酸4.84 g，苯丙氨酸7.70 g，苏氨酸8.25 g，

色氨酸1.43 g，缬氨酸15.40 g，丙氨酸7.81 g，

精氨酸9.90 g，门冬氨酸1.10 g，谷氨酸0.55g，

组氨酸5.50 g，脯氨酸5.50 g，丝氨酸1.87 g，

酪氨酸0.44 g，甘氨酸7.70 g，半胱氨酸0.39 g，

迷迭香酸0.80 g，冰醋酸适量，调节pH至6.8 ~ 7.8。

6.权利要求1-5所述的复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ药物组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸30 ～ 55分钟；

（2）当注射用水的温度降至88 ～ 92℃时，在充氮保护下加入1/2处方量的迷迭香酸，搅拌溶解后，依次加入处方量的亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸，充分搅拌使其完全溶解；

（3）降温至68 ～ 82℃时，在充氮保护下依次加入醋酸赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、脯氨酸、丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、色氨酸、半胱氨酸及剩余的1/2处方量亚硫酸氢钠充分搅拌使其完全溶解；

（4）药液降温至45 ～ 54℃时，在充氮保护下加入冰醋酸适量，调节药液pH至6.8-7.8，加入0.03%（W/V）的药用活性炭，搅拌15分钟，冷却水降温，待药液温度降至40℃以下时，钛棒脱炭；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。

7.根据权利要求6所述的复方注射液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）取处方量90%的注射用水，通氮气煮沸45分钟；

（4）药液降温至45 ～ 50℃时，在充氮保护下加入冰醋酸适量，调节药液pH 至7.3，加入0.03%（W/V）的药用活性炭，搅拌15分钟，冷却水降温，待药液温度降至40℃以下时，钛棒脱炭；

（6）115℃水浴灭菌32min，即得。