CN103622955A - 鞣花酸在治疗和预防人体真菌感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鞣花酸在治疗和预防人体真菌感染的药物中的应用，本发明研究了鞣花酸对23株真菌的体外抑真菌活性，并测定了MIC值。鞣花酸对真菌的体外活性结果显示，鞣花酸对6种皮肤癣菌的MIC值范围为6.25-50μg/ml，鞣花酸对临床常见的浅部致病真菌具有较强的抑制作用，尤其对红色毛癣菌最为敏感。鞣花酸对6种临床常见念珠菌的MIC值范围为25-200μg/ml。本发明采用以鞣花酸内服、外用对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型进行治疗，以注射方式对鞣花酸单一给药或与氟康唑共同给药对小鼠真菌感染模型的治疗作用进行研究。其结果表明，鞣花酸内服、外用均对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型有一定疗效。

Description

鞣花酸在治疗和预防人体真菌感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及鞣花酸在制备治疗和预防人体真菌感染疾病药物中的应用。

背景技术

鞣花酸的分子式C14H6O8，英文名：ellagic acid，化学名：2,3,7,8-tetrahydroxybenzopyrano-5,4,3-cde benzopyran-5,10-dione。微溶于水、醇，溶于碱、吡啶，不溶于醚。

鞣花酸可由地锦草、斑地锦、黑莓、覆盆子、草莓、蔓越莓、山核桃、石榴、枸杞等植物中提取制得，也可由化学合成制得。

随着社会进步和人们生活水平的提高，人们愈来愈关注健康和生活的质量，真菌感染疾病是一种常见病、多发病，近年来呈逐渐上升的趋势，然而随着抗真菌剂的广泛应用，临床耐药菌株不断增多，加之致病真菌对现有药物的耐药性日趋严重，使得真菌感染易于发生并难于控制。目前临床上应用的抗真菌药物在一定程度上起到了控制致病真菌感染的作用，但还存在很多不足，如两性霉素B具有严重的肾毒性；氮唑类药物在抑制真菌的同时对哺乳动物的细胞色素P450系统也具有抑制作用，进而产生毒副反应，少数使用者还可出现严重的肝毒性；酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等均有引起肝坏死或肝毒性致死的报道。目前，在天然活性成分中寻找新的高效低毒抗真菌新药物已成为近年来抗真菌药物研究的热点和趋势。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鞣花酸在治疗和预防人体真菌和细菌感染的药物中的应用，本发明采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》（M38-A），以特比萘酚、氟康唑为阳性对照药，研究了鞣花酸对23株真菌的体外抑真菌活性，并测定了MIC值。鞣花酸对真菌的体外活性结果显示，鞣花酸对6种皮肤癣菌的MIC值范围为6.25～50μg/ml，鞣花酸对临床常见的浅部致病真菌具有较强的抑制作用，尤其对红色毛癣菌最为敏感。鞣花酸对6种临床常见念珠菌的MIC值范围为25～200μg/ml。本发明采用以鞣花酸内服、外用对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型进行治疗，以注射方式对鞣花酸单一给药或与氟康唑共同给药对小鼠真菌感染模型的治疗作用进行研究。其结果表明，鞣花酸内服、外用均对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型有一定疗效，通过苏木精-伊红(HE)染色，碘酸-雪夫（PAS）染色及真菌镜检转阴、治愈率可达88.90%。以注射方式对小鼠真菌感染模型的治疗中鞣花酸单一给药时小鼠死亡率最高为25.0%，最低为8.3%，当与氟康唑合用注射给药时死亡率可控制在0%～16.7%以内。鞣花酸给药方式适用于内服、外用、注射给药，且鞣花酸可用于单一成分入药或与其它药物组合入药，经体内外试验均表明本品抗真菌作用显著。本发明鞣花酸的开发对抗真菌药物临床前景更显重要。

本发明所述的一种鞣花酸在制备治疗和预防人体真菌感染疾病的药物中的应用。

鞣花酸用药的纯度为50-100%。

鞣花酸为单一成分入药或与其它药物组合入药。

鞣花酸入药的临床人日使用量为1μg-20g之间。

鞣花酸药物的给药方式为内服、外用和注射。

本发明通过研究鞣花酸对小鼠、豚鼠真菌感染模型的治疗作用，并进行体外对临床常见真菌的最低抑菌浓度（MIC）测定，证实了鞣花酸体内外抗真菌效果显著。

本发明研究了鞣花酸对小鼠真菌感染模型的治疗作用，通过建立小鼠真菌感染模型，采用腹腔注射给药7天，进行一般状况观察、测定体重，计算死亡率，测定小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。结果显示，各给药组对小鼠真菌感染模型均有一定治疗作用，真菌感染小鼠死亡率最高为25.0%，最低为8.3%，且鞣花酸高剂量（8mg/mL）与模型组相比死亡率显著降低，鞣花酸单用起效剂量为4mg/mL。鞣花酸与临床常用抗真菌药物氟康唑合用，当氟康唑:鞣花酸2:1时可明显改善造模小鼠的一般症状，体重比模型组显著增加，死亡率为0%，SOD活性及MDA含量与正常小鼠接近。鞣花酸与氟康唑合用起效剂量为氟康唑:鞣花酸=2mg/mL:2mg/mL，综上，鞣花酸单用或与氟康唑合用均可显著降低小鼠真菌感染死亡率、改善其症状。

另外，通过建立豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型，采用外用、口服给药7天，以皮肤病变程度、治愈率和真菌镜检转阴率为评价指标，观察鞣花酸以与对豚鼠皮肤癣菌感染模型的治疗作用。结果显示，鞣花酸外用高剂量组（0.4g软膏/cm²）治愈率为88.90%，中剂量（0.2g软膏/cm²）为87.50%，低剂量（0.1g软膏/cm²）为77.80%。鞣花酸灌胃高剂量组（15mg/kg）治愈率为88.90%，中剂量（7.5mg/kg）为77.78%，低剂量（3.75mg/kg）为66.67%，病理观察鞣花酸外用与灌胃高、中剂量可明显改善感染组织皮肤毛囊生长情况，综上，鞣花酸对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染治疗效果显著。

体外试验采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释法抗真菌药物敏感性试验方案》（M38-A），以特比萘酚、氟康唑为阳性对照药，研究了鞣花酸对23株真菌的体外抑真菌活性，并测定了最低抑菌浓度（MIC）值。鞣花酸对真菌的体外活性结果显示，鞣花酸对6种皮肤癣菌的MIC值范围为6.25～50μg/ml，而临床常用抗真菌药物氟康唑对这6种皮肤癣菌的MIC值范围也为6.25～50μg/ml。由此可见，鞣花酸对临床常见的浅部致病真菌具有较强的抑制作用，尤其对红色毛癣菌最为敏感，作用于氟康唑相当。鞣花酸对6种临床常见念珠菌的MIC值范围为25～200μg/ml，而氟康唑对念珠菌的MIC值范围为12.5～50μg/ml，但氟康唑临床在治疗念珠菌感染时周期较长，副作用较大，临床上有引起肝坏死或肝毒性致死的报道，该类抗生素很易出现耐药性，天然耐药菌株不断增加，因此，鞣花酸的开发对抗真菌药物临床前景更显重要。

附图说明

图1为本发明各组豚鼠造模后一般观察与皮肤镜检图；

图2为本发明各组豚鼠治疗后光镜下形态学图(HE,×400)图；

图3为本发明各组豚鼠治疗后光镜下形态学图(PAS,×400)图。

具体实施方式

实施例

鞣花酸体内外抗真菌作用的实验研究：

（一）鞣花酸体外抗真菌实验研究：

摘要目的：对鞣花酸进行体外抗真菌实验，测定其最小抑菌浓度（MIC）值。方法：采用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》，即M38-A方案。在此方案的基础上测定鞣花酸对17株临床常见皮肤癣菌以及6株念珠菌的MIC值。结果：鞣花酸对皮肤癣菌中不同菌种的MIC值范围为6.25-100μg/ml；对念珠菌中不同菌种的MIC值范围为25-200μg/ml。结论：鞣花酸体外具有显著抗真菌作用。

关键词：鞣花酸；体外抗真菌作用；最小抑菌浓度；

1.材料与仪器

1.1 实验菌种：菌种来源：本实验所采用皮肤癣菌菌株均来自新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库。念珠菌菌株均由新疆维吾尔自治区中医院皮肤科检验室提供。

以上共计23株，菌株名称、来源及编号见附录A。

1.2 实验材料：鞣花酸（上海源叶生物科技有限公司，YY13933）。二甲基亚砜（DMSO）(天津永晟精细化工有限公司，20110330)。特比萘芬（TBF）由（上海诚优国际贸易有限公司，20090101）提供。氟康唑氯化钠注射液（河北天成药业股份有限公司，B12070605）。马铃薯培养基(PDA)（碧迪医疗器械有限公司，2263097）；RPMI-1640液基（Invitrogen公司，31800-022）。

1.3 实验仪器：DM2500显微镜（德国LEICA）；FM型生化培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；BHC-1300ⅡA型生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；LDZX-75KBS（内循环）立式蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；BS224S型精密电子天平(德国Sartorious)。

菌种活化：皮肤癣菌：将来自菌种保藏库的菌株挑取直径约3mm菌丝体，以点接种法接种于新制备的马铃薯培养基(PDA)试管斜面中央，温度28℃培养7-14d后进行药敏实验。实验所需菌株：红色毛癣菌6株，石膏样毛癣菌6株，紫色毛癣菌1株，许兰毛癣菌1株，疣状毛癣菌1株，犬小孢子菌1株，须状毛癣菌1株。均由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心菌种保藏库提供。

念珠菌：将来自菌种保藏库的菌株挑取1-2个菌落，以划线接种法接种于新制备的马铃薯培养基(PDA)试管斜面中央，温度36℃培养，时间48h后进行药敏实验。白色念珠菌1株，光滑念珠菌1株，近平滑念珠菌1株，热带念珠菌3株。均由新疆维吾尔自治区中医院皮肤科检验室提供。

2.实验方法

根据NCCLS《产孢丝状真菌的液基稀释抗真菌药敏试验参考方案》（M38-P）方案在测定鞣花酸对17株临床常见皮肤癣菌以及6株念珠菌的最低抑菌浓度（MIC）值。

2.1 抗真菌药物储备液、稀释液的制备

称取鞣花酸标准品50.0mg，用1mL DMSO溶解，制成浓度为50000μg·mL^-1的储备液，存于温度-70℃冰箱备用；称取TBF8mg，用1mL DMSO溶解，制成浓度为8000μg·mL^-1的储备液，存于温度-70℃冰箱备用。

临用前将鞣花酸和TBF储备液，分别用RPMI-1640培养基倍比稀释成2倍试验终浓度，鞣花酸的2倍终浓度由高向低依次为：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μg/ml；TBF的2倍终浓度由高向低依次为0.16、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.0025、0.000625μg/ml，氟康唑的2倍终浓度由高向低依次为：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μg/ml。

2.2 菌接种液的制备：

皮肤癣菌：将受试的皮肤癣菌接种于马铃薯培养基斜面上，温度28℃培养7-14d，吸取2mL无菌的0.85%的NaCl溶液，轻轻冲洗菌落表面的菌丝和孢子，吸取菌液转移至无菌试管中，振荡器上振荡15s，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数，将其浓度调至0.4×10⁶～5×10⁶cfu·mL^-1之间，用RPMI-1640培养基稀释50倍至2倍终浓度。

念珠菌：将受试的念珠菌接种于马铃薯培养基斜面上，温度36℃培养48h，挑取菌落，加入2mL无菌的0.85%的NaCl溶液中，用0.5#McFarland standard比浊管比浊，用RPMI-1640液基稀释100倍后再稀释20倍至2倍终浓度。

2.3 接种：

将100μl的2倍终浓度的药液，由第1孔至第10孔分别由高浓度到低浓度加入无菌96孔细胞培养板中；

第11孔为生长对照孔（仅加菌接种液100μl和RPMI-1640培养基100μl）；

第12孔为空白对照孔（只加RPMI-1640培养基200μl）；

将调好的菌接种液100μl，分别加入相应的微孔内，这将使每一梯度的抗真菌药物和菌接种液（2倍终浓度）分别被1:1稀释到终浓度。

2.4 培养条件和结果判定：

皮肤癣菌于温度28℃孵育7-14天读结果；念珠菌于温度36℃孵育48小时读结果。

读取MIC值时，应在不搅动的情况下与对照孔按比较，溶液清晰透明视为真菌完全不生长，取完全不生长管最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

3.实验结果：

表1 鞣花酸、氟康唑和TBF对23株真菌的药物敏感性

表中可见，鞣花酸对红色毛癣菌的平均MIC为18.75μg/ml，对T.m的平均MIC为32.29μg/ml，对其它5株不同皮肤癣菌的平均MIC为35.0μg/ml，对6株不同念珠菌的平均MIC为116.67μg/ml。

特比萘芬（TBF）对红色毛癣菌的平均MIC为0.01μg/ml，对T.m的平均MIC为0.02μg/ml，对其它5株不同皮肤癣菌的平均MIC为0.054μg/ml，对6株不同念珠菌的平均MIC均大于0.08μg/ml。

氟康唑对红色毛癣菌的平均MIC为14.58μg/ml，对T.m的平均MIC为10.42μg/ml，对其它5株不同皮肤癣菌的平均MIC为17.5μg/ml，对6株不同念珠菌的平均MIC为33.33μg/ml。

4.讨论：

同时测定了阳性对照药特比萘芬对17株皮肤癣菌及6株念珠菌的体外抗真菌活性，从结果可知，特比萘芬对常见皮肤癣菌MIC值在0.01～0.16μg/ml之间，平均MIC值在0.01～0.054μg/ml之间。对念珠菌MIC值大于0.16μg/ml。

（二）鞣花酸对小鼠真菌感染模型的治疗作用研究：

摘要目的：研究鞣花酸及其与氟康唑组合入药时对小鼠真菌感染模型的治疗作用。方法：建立小鼠真菌感染模型，根据鞣花酸体外抗白色念珠菌最小抑菌浓度（MIC）值确定最佳给药剂量，分别给予阳性药氟康唑（2mg/mL），鞣花酸高剂量（8mg/mL），低剂量（4mg/mL），氟康唑与鞣花酸组合用药1:2、1:1、2:1剂量组，分别腹腔给药7d后，进行一般状况观察、测定体重，计算死亡率，测定小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA）含量。结果：各给药组对小鼠深部真菌感染模型均有一定治疗作用，其中氟康唑：鞣花酸2:1时组合用药可明显改善造模小鼠的一般症状，体重比模型组显著增加，死亡率明显低于模型组，超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）含量最为接近正常小鼠。结论：氟康唑与鞣花酸协同作用对小鼠系统性真菌感染有明显的治疗作用。

关键词：鞣花酸；真菌感染；抗真菌作用：

本发明通过建立小鼠真菌感染模型，以鞣花酸以及其与氟康唑组合入药腹腔给药后，观察其治疗作用。

1.实验材料：

1.1 实验菌种：白色念珠菌，由新疆维吾尔自治区中医院皮肤科检验室提供。

1.2 动物：昆明种小鼠96只，雌雄各半，6周龄，体重25g左右，由新疆动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCKK（新）2011-0001。

1.3 药物：鞣花酸（上海源叶生物科技有限公司，YY13933），氟康唑氯化钠注射液（河北天成药业股份有限公司，B12070605），环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，12091625)。

1.4 仪器：DM2500显微镜（德国LEICA）；FM型生化培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；BHC-1300ⅡA型生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；LDZX-75KBS（内循环）立式蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；BS224S型精密电子天平(德国Sartorious)。

2.实验方法：

2.1 菌种活化并测定鞣花酸MIC值同实验一。

2.2 动物模型建立：

昆明小鼠随机分为8组，每组12只，即空白组、模型组、阳性药氟康唑组（2mg/ml）、鞣花酸高（8mg/ml）、低（4mg/ml）剂量组、氟康唑：鞣花酸1:2组、氟康唑：鞣花酸1:1组、氟康唑：鞣花酸2:1组。

2.2.1 实验小鼠造模前3天腹腔注射0.4ml/20g环磷酰胺（100mg/kg）；

2.2.2 将白念珠菌菌株挑取1-2个菌落，以划线接种法接种于新制备的马铃薯培养基(PDA)试管斜面中央，温度36℃培养48h，吸取2mL无菌的0.9%的NaCl溶液，轻轻冲洗菌落表面的菌丝和孢子，吸取菌液转移至无菌试管中，振荡器上振荡15s，将含有菌丝和孢子的冲洗液用血细胞计数板记数，将其浓度调至0.4×10⁶～5×10⁶cfu/mL之间。

2.2.3 正常对照组，前3天，接种当天开始连续7天腹腔无菌注射0.4ml/20g生理盐水。

2.2.4 模型组，前3天，接种当天及接种后第2天，第4天每天腹腔无菌注射0.4ml/20g（100mg/kg·d）环磷酰胺，第4天即接种当天腹腔无菌注射0.4×10⁶～5×10⁶cfu/mL白色念珠菌菌悬液1mL，第5天开始连续7天腹腔无菌注射0.4ml/20g生理盐水。

2.2.5 给药组，前3天，接种当天及接种后第2天，第4天每天腹腔无菌注射0.4ml/20g（100mg/kg.d）环磷酰胺，第4天即接种当天腹腔无菌注射0.4×10⁶～5×10⁶cfu/mL白色念珠菌菌悬液1mL，第5天开始连续7天腹腔无菌注射以下浓度各组药物。其中氟康唑与鞣花酸组合用药时，将两者按一下比例混合后给药，见表2。

表2 鞣花酸为单一成分或与氟康唑组合入药给药剂量

2.3 观察各组小鼠一般状况及死亡情况，每天记录动物体重变化、饲料消耗量，记录存活时间，计算存活率，真菌感染小鼠尸体全部浇乙醇火烧处理。

2.4 最后一次给药结束24小时后，称体重，计算死亡率。取血、离心，测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）含量。

3.实验结果

3.1 正常对照组小鼠实验过程中均较活泼，毛色光亮，饮食正常，行动自如。模型组接种白色念珠菌后第2d开始出现皮毛不整、无光泽，倦缩驼背，活动减少，进食量减少，精神不振、相互撕咬，体重下降等现象。阳性药氟康唑组和鞣花酸单一给药组及氟康唑与鞣花酸组合给药组，各组小鼠生长状况给药5d后症状有所改善，其中氟康唑：鞣花酸组合给药2:1时小鼠状况最为接近正常对照组，无死亡现象。模型组动物体重明显低于正常对照组，死亡率33.3%；给药结束，氟康唑、鞣花酸高剂量组、氟康唑：鞣花酸=2:1、氟康唑：鞣花酸=1:2组动物体重明显升高，死亡率降低，其中氟康唑：鞣花酸=2:1效果优于阳性药氟康唑单独用药。结果见表3。

表3 各组小鼠脏器系数比较(±s)

注：*P<0.05,**P<0.01vs正常组；#P<0.05,##P<0.01vs模型组

3.2 小鼠取血、离心，测定超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量，各组SOD、MDA值表明，鞣花酸高、低剂量，氟康唑与鞣花酸组合用药时对小鼠深部真菌感染均有一定治疗作用。其中氟康唑：鞣花酸=2:1时SOD、MDA最为接近正常小鼠，治疗效果最佳，见表4；

表4 各组小鼠血清中SOD活性、MDA含量比较(±s)

注：*P<0.05,**P<0.01vs正常组；#P<0.01vs,##P<0.01vs模型组

4.小结：

随着社会进步和人们生活水平的提高，人们愈来愈关注健康和生活的质量，真菌感染疾病是一种常见病、多发病，近年来呈逐渐上升的趋势，且随着抗生素、激素和免疫抑制剂的广泛应用以及其他某些因素的影响，真菌病的发病率在国内外也均有明显增高的趋势。在临床上应用的抗真菌药物在一定程度上起到了控制致病真菌感染的作用，但还存在很多不足，如两性霉素B具有严重的肾毒性；氮唑类药物在抑制真菌P45014DM的同时对哺乳动物的P450系统也具有抑制作用，进而产生毒副反应，少数使用者还可出现严重的肝毒性；酮康唑、氟康唑、伊曲康唑等均有引起肝坏死或肝毒性致死的报道。目前，在天然活性成分中寻找新的高效低毒抗真菌新药物已成为近年来抗真菌药物研究的热点和趋势。

鞣花酸高剂量组可明显改善真菌感染小鼠的一般症状，体重比模型组显著增加，死亡率明显低于模型组。当氟康唑与鞣花酸组合用药时，起到一定的协同作用，且效果明显，使真菌感染小鼠症状改善显著，降低模型死亡率，可升高模型动物血清SOD、降低MDA。

（三）鞣花酸对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型的治疗作用：

摘要目的：评价地鞣花酸对红色毛癣菌感染豚鼠皮肤模型的治疗作用。方法：建立豚鼠皮肤癣菌感染模型，实验前24h剪除实验动物背部毛发，面积2.5cm×2.5cm。用无菌粗砂纸轻轻磨破豚鼠背部皮肤，以观察到点状渗血为宜，将红色毛癣菌外用于豚鼠皮肤表面。造模成功后，病变部位分别外用鞣花酸乳膏低剂量（0.1g/cm²）、中剂量（0.2g/cm²）、高剂量（0.4g/cm²）、灌胃低剂量（1.0ml/d）、中剂量（2.0ml/d）、高剂量（4.0ml/d）、阳性药特比萘芬乳膏（0.2g/cm²），以皮肤病变程度、治愈率和真菌镜检转阴率为评价指标，观察鞣花酸对豚鼠皮肤癣菌感染模型的治疗作用。结果：与模型组比较，鞣花酸对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染治疗效果显著，其中鞣花酸外用高剂量组（0.4g/cm²）治愈率为88.90%，中剂量（0.2g/cm²）为87.50%，低剂量（0.1g/cm²）为77.80%。鞣花酸灌胃高剂量组（4.0ml/d）治愈率为88.90%，中剂量（2.0ml/d）为77.78%，低剂量（1.0ml/d）为66.67%。通过病理切片观察外用与灌胃高、中剂量可明显改善感染组织皮肤毛囊生长情况。结论：鞣花酸外用、灌胃对豚鼠皮肤红色毛癣菌感染有一定的治疗作用，其中鞣花酸外用效果优于灌胃。

关键词：鞣花酸；红色毛癣菌；豚鼠。

本发明通过建立豚鼠皮肤红色毛癣菌感染模型，鞣花酸灌胃、外用给药后，观察其治疗作用。

1 材料与仪器：

1.1 药物：鞣花酸（上海源叶生物科技有限公司，YY13933）。

1.2 试剂：地塞米松（湖南润弘制药股份有限公司，批号；H41020330）；醋酸曲安奈德（浙江仙琚制药股份公司产品，批号；H38020762）；特比萘芬乳膏（通药制药集团股份有限公司，批号；H320066125）。

1.3 仪器：DM2500显微镜，德国LEICA；BS224S型精密电子天平，德国Sartorious；FM型生化培养箱，上海福玛实验设备有限公司；ISM40型全自动雪花制冰机，常熟市雪科电器有限公司；BHC-1300ⅡA型生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司。

1.4 动物：健康豚鼠100只，雌雄各半，普通级，体重250-300g，新疆维吾尔自治区医学实验动物研究中心提供，动物生产许可证号：SCKK（新）2011-0002。

1.5 实验菌种：红色毛癣菌，由新疆医科大学真菌与真菌病研究中心提供。

2.实验方法：

2.1 菌种活化并测定鞣花酸MIC值同实验一。

2.2 实验动物分组普通级健康豚鼠90只，雌雄各半，体重250-300g，每组10只，按体重、性别随机分为9组，包括空白对照组、模型对照组、阳性药组、鞣花酸外用低、中、高剂量组、鞣花酸灌胃、中、高剂量组。

2.2 剂量设计鞣花酸乳膏处方组成：鞣花酸1.6克，羊毛脂60克，液体石蜡20克，白凡士林700克，氮酮20克，羟甲基苯甲酸乙酯0.2克，共801.8克，每g乳膏相当于鞣花酸2mg。

2.3 动物模型的建立实验动物预处理：除空白对照组外，接种前3d开始，每日1次股部肌肉注射给予曲安奈德注射液20mg/kg·d。

接种用真菌悬液制备：将红色毛癣菌菌株接种于马铃薯培养基培养基，10d后轻轻刮取表面菌落，移至无菌的PBS，无菌研钵内研磨成菌丝段（含分生孢子）悬液，调整菌丝段/孢子浓度为1×10⁸cfu/mL待用。

接种：实验前24h剪除实验动物背部毛发，面积2.5cm×2.5cm。无菌生理盐水冲洗，电吹风吹干。24h后用75％酒精擦拭脱毛部位，待脱毛部位残余酒精挥发干燥后，用无菌粗砂纸轻轻磨破豚鼠背部皮肤，以观察到点状渗血为宜，涂布菌悬液，空白对照组涂无菌生理盐水。

接种后处理：除空白对照组外的各组动物马上腹腔注射给予地塞米松注射液7.5mg/kg，隔日重复注射1次，共3-4次。每日观察实验动物接种处皮肤红肿、渗出、鳞片样改变、脱屑、结痂和毛发生长变化。

真菌镜检：接种后第4d开始刮取少许动物背部接种处皮屑进行10％氢氧化钾常规镜检，隔日进行1次，至接种后第8天，同时接种于含氯霉素和放线菌酮的马铃薯培养基培养基，以镜检和培养阳性为造模成功。

2.4 给药及观察造模成功后48h内开始实验治疗，每日一次，空白对照组和模型对照组不给药。共给药一周。按体表面积计算，鞣花酸软膏低剂量（0.1g/cm²）、中剂量（0.2g/cm²）、高剂量（0.4g/cm²）、鞣花酸灌胃液低剂量（3.75mg/kg）、中剂量（7.5mg/kg）、高剂量（15mg/kg），每日一次；阳性对照盐酸特比奈芬乳膏组每次用药量为0.2g/cm²，每日一次。局部涂搽各种药物时，至少应超过皮损边缘0.5cm，共给药一周。空白对照组14天内不作任何处理，模型对照组给予基质，受试物组前7天每天1次于感染区涂受试物，后7天停止涂药，阳性对照组前7天每天1次于感染区涂受试物，后7天停止涂药，观察并比较受试物和对照组的结果。

2.5 病理形态学各组豚鼠处死后，取病变部位皮肤一分为二，其中一块10%甲醛溶液中固定72h后，石蜡包埋，切片厚3μm，进行常规苏木精-伊红(HE)染色后镜检；与此同时，另外一部分皮肤用Carnoy固定液固定，进行过碘酸-雪夫（PAS）染色后镜检。

3.结果：

3.1 造模后一般观察造模前各组豚鼠一切活动正常，造模后，豚鼠性情暴躁，时常相互间厮打，四肢及头部常见被抓伤，精神萎靡，毛发粗糙无光，反应迟钝，造模部位皮肤第四天大量脱白色鳞屑，后续几天陆续出现蔓延、红肿、渗出，病变逐渐向四周扩散，真菌镜检结果逐渐显阳性，至造模第七天菌丝和孢子浓度为0.4×10⁶～5×10⁶cfu·mL^-1之间可用于后续试验（图1）。

3.2 鞣花酸对豚鼠皮肤癣菌感染模型的治疗作用造模成功后48h内开始实验治疗，分别给予鞣花酸软膏低剂量（0.1g/cm²），中剂量（0.2g/cm²），高剂量（0.4g/cm²），鞣花酸灌胃液低剂量（3.75mg/kg）、中剂量（7.5mg/kg）、高剂量（15mg/kg），每日一次；阳性对照盐酸特比奈芬乳膏组每次用药量为0.2g/cm²，每日一次。给药一周后，外用、灌胃高剂量组与阳性药组病变部位皮肤恢复平整、光滑状，真菌镜检结果为阴性。而模型组与灌胃低剂量组皮肤仍呈现成块白色鳞屑状，真菌镜检结果为阳性。与阳性药盐酸特比奈芬乳膏对比灌胃、外用高剂量组治愈效果较好，治愈率接近盐酸特比奈芬乳膏，表5；

表5 鞣花酸对豚鼠皮肤癣菌感染模型治愈率

3.3 组织病理学变化光镜下观察，病理切片HE结果显示，除空白与阳性药组外，其余各组均具有不痛成都的皮炎和毛囊炎等病变，肌纤维间隙明显增大，肌细胞中有较多淋巴细胞、浆细胞等炎症细胞侵润。其中灌胃、外用高剂量组病变程度较小，其炎症在图片中清晰可见。PAS染色图中可见，模型组毛囊为红色，显示其糖组织被破坏，其余各组均具有较好的治疗效果，阳性药和高剂量外用、灌胃组，毛囊中未见菌丝，证明其作用效果良好，分别见图2，图3。

4 小结：

红色毛癣菌是一种人源的皮癣菌，引起常见的皮肤浅部真菌病，如手癣、足癣、头癣等。普通短毛的豚鼠是著名的实验动物，对红色毛癣菌较其它动物敏感，故选择豚鼠进行皮肤癣菌造模实验。

本实验过程与结果显示，造模第四天开始，豚鼠皮肤开始大量的脱屑，造模第六天与造模第七天红肿较严重，部分豚鼠皮肤表面出现渗出液，菌检结果图显示，豚鼠第三天开始，皮肤表面便可以检查到真菌存在，造模第四天到造模成功，皮肤皮屑均可以培养出红色毛癣菌，综合上述结果判定造模成功。给药第三天开始，皮屑减少较明显，并且皮肤逐渐恢复了平整，到给药第七天，镜检基本成阴性并且皮屑培养也基本上呈现阴性，提示鞣花酸作用效果良好。动物处死后，病理切片HE结果显示，除空白与阳性组外组外，其余各组均具有不痛成都的皮炎和毛囊炎等病变，其中阳性药组与外用、灌胃高剂量组病变程度较小，其余炎症在图片中清晰可见。PAS染色图中可见，模型组毛囊为红色，显示其糖组织被破坏，其余各给药组均具有较好的治疗效果，与阳性药对比高剂量外用、灌胃组毛囊中未见菌丝，证明鞣花酸作用效果良好。

本发明体外药敏试验所用菌株名称、来源及编号见附录：

附录：

Claims (5)

1.一种鞣花酸在制备治疗和预防人体真菌感染疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鞣花酸用药的纯度为50-100%。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鞣花酸为单一成分入药或与其它药物组合入药。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鞣花酸入药的临床人日使用量为1μg-20g之间。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于鞣花酸药物的给药方式为内服、外用、注射。

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