CN103622952A - 牛蒡子苷元在制备抗感染免疫药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明请求保护牛蒡子苷元用于制备感染性疾病药物中的用途,属于医药领域。牛蒡子苷元为从传统中药牛蒡中提取的天然单体,发明人发现其能够显著提高免疫低下患者的廓清指数和吞噬指数,改善患者的非特异性免疫,其对由寄生虫、细菌、病毒引发的感染均具有很好的治疗效果,特别对于革兰氏阳性细菌引发的感染性疾病治疗效果较佳。牛蒡子苷元用于感染性疾病治疗时,疗效确切,毒副作用小,有广阔的医疗应用前景。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,具体涉及牛蒡子苷元在制备抗感染免疫药物中的应用。
背景技术
感染性疾病是由病原微生物引起的疾病的统称,其主要包括细菌感染、病毒感染、真菌感染、寄生虫感染等,其中尤以细菌感染和病毒感染最为常见。感染性疾病在临床上很普遍,也是各科医生经常面临的问题。如病人在治病期间由于体质和抵抗病菌能力较差,而被感染其它疾病。像刚做过手术的人,不注意对刀口消毒和保护,容易被感染而不易愈合。还有的病人由于动了大手术,在愈合期间,引起肺炎。随着微生物耐药性的增强和新的微生物的出现,感染性疾病的诊治与预防正不断面临新的变化,但是,目前对感染性疾病的诊治也较普遍地存在着误区,使得临床中的感染问题变得愈发复杂和严重。近70年来,抗感染药物临床的应用为人类防治感染性疾病作出了巨大贡献,但同时存在的病原微生物耐药性、引发严重毒副作用和过敏反应等一系列问题,仍是临床医学、药学及药物流行病学工作者面临的共同课题。近年来人们逐渐寻找其他的治疗方式来对抗感染性疾病,而通过免疫系统的改善同时又不增加细菌或病毒的耐药性的治疗药物或手段则成为治疗首选。
抗感染免疫包括先天性和获得性免疫两大类。先天性免疫是机体在种系发育进化过程中逐渐建立起来的一系列天然防御功能,是经遗传获得,能传给下一代,其作用并非针对某种病原体故称非特异性免疫,由屏障结构,吞噬细胞及正常体液和组织免疫成分构成。获得性免疫是出生后经主动或被动免疫方式而获得的,是在生活过程中接触某种病原体及其产物而产生的特异性免疫,故称获得性免疫。
牛蒡子为菊科植物牛蒡的干燥成熟果实,是常用中药,具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽的功能,用于风热感冒、咳嗽痰多、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痒腮丹毒、痈肿疮毒。该中药含有木脂素类化合物,主要是牛蒡苷(arctiin)和牛蒡子苷元(arctigenin)等。现已有证据证明牛蒡子苷元比牛蒡苷具有更强的生物活性,比如显著的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗PAF受体及钙拮抗活性,但是现有技术尚没有报道牛蒡子苷元在制备抗感染免疫药物中的应用。
发明内容
为了增强免疫功能低下以及儿童等人群的免疫能力,以免该类人群被传染上感染性疾病,本发明提供一种抗感染免疫药物。该药物以牛蒡子苷元为唯一活性成分,其用于免疫功能低下的相关人群时,可以激活机体的巨噬细胞以及白介素15的数量,有效增加机体体液免疫的能力,对机体IgG抗体的产生有显著的增强作用。
本发明涉及牛蒡子苷元的一种新的医药用途,即牛蒡子苷元用于制备感染性疾病药物中的用途。本发明中牛蒡子苷元可以显著增强机体的免疫功能,从而增强了机体抵抗病原体诸如细菌、病毒、寄生虫的能力。机体免疫能力的提高对于免疫低下患者或者重大疾病患者具有重要的意义。
本发明实施例15-18证实牛蒡子苷元可以显著增强机体的免疫能力。作为优选,牛蒡子苷元可以增强免疫低下患者的免疫能力能力以及肿瘤患者化疗后的非特异免疫能力。本发明实施例15中牛蒡子苷元药物制剂对免疫低下小鼠模型的免疫能力功能的影响实验中证实牛蒡子苷元可以显著提高免疫低下小鼠的廓清指数和吞噬指数,其对免疫功能的增强能力不仅显著强于牛蒡复方组,也优于现有的人参皂苷组。本发明实施例16中牛蒡子苷元对荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影响实验证实牛蒡子苷元可以改善荷瘤小鼠的免疫能力,其不仅显著提高荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数,更能显著升高荷瘤小鼠的廓清指数和吞噬活性。本发明实施例18证实,与对照组相比,牛蒡子苷元各组T细胞数量均有不同程度的增加,其中牛蒡子苷元高剂量组(100μg/ml)的T细胞数量与对照组相比具有极显著性差异(P<0.01),牛蒡子苷元低剂量组(10μg/ml)的T细胞数量与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),这表明牛蒡子苷元可以促进DC刺激T细胞增殖的作用,并且这种促进作用呈现剂量依赖性。
申请人通过大量体外实验和体内实验证实牛蒡子苷元对于革兰氏阳性细菌引发的感染具有很好的治疗作用,基于此,本发明上述医药用途的优选,牛蒡子苷元用于制备治疗革兰氏阳性细菌引发的感染性疾病中用途。作为进一步优选,所述的感染性疾病为皮肤溃疡、前列腺炎、尿路感染、以及肺炎的一种。本发明实施例17考察了牛蒡子苷元对家兔皮肤溃疡愈合的影响,实验证实牛蒡子苷元对于金黄色葡萄球菌所引发的感染具有很好的治疗效果,其对家兔的肛温有很好的控制作用,并能发挥其抗炎作用,促进伤口快速愈合。本发明实施例18证实牛蒡子苷元对大多数的致病菌均具有很好的抑菌效果,但其对革兰氏阳性细菌的抑制作用(稀释度为1:128或1:256)要显著优于对革兰氏阴性细菌的抑制作用(稀释度为1:32或1:64)。本发明实施例20结果显示,与万古霉素组或牛蒡复方组相比,牛蒡 子苷元各剂量组的治疗效果最佳,其大鼠尿中白细胞数目和细菌数目均显著或极显著少于万古霉素组或牛蒡复方组,特别是牛蒡子苷元高剂量组的白细胞数目和细菌数目均为0,体现出了优异的治疗效果。这表明牛蒡子苷元在治疗金黄色葡萄球菌引发的慢性尿路感染具有十分显著的治疗效果,且治疗效果具有剂量依赖性。本发明实施例21显示,与万古霉素组或牛蒡复方组相比,牛蒡子苷元各剂量组的治疗效果最佳,其大鼠前列腺组织中白细胞数目均显著或极显著少于万古霉素组或牛蒡复方组,卵磷脂小体数目则显著高于特别是万古霉素组或牛蒡复方组。其中牛蒡子苷元高剂量组在降低白细胞数量和升高卵磷脂小体数目方面效果最为显著。这表明牛蒡子苷元在治疗金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌引发的前列腺炎具有十分显著的治疗效果,且治疗效果具有剂量依赖性。本发明实施例22证实,与模型组比较,给药组的细菌浓度对数均有不同程度减小。结果表明,青霉素组、牛蒡子苷元高剂量组、牛蒡子苷元低剂量组能明抑制肺炎链球菌感染的肺炎,与模型组比较细菌浓度对数明显降低(P<0.05)。与青霉素组相比,牛蒡子苷元高、低剂量组细菌浓度对数均明显减小,牛蒡子苷元各剂量组在抑制肺炎链球菌感染的肺炎方面与青霉素组相比,具有显著性或极显著性差异。
本发明中牛蒡子苷元用于抗感染免疫时,给药对象可以为动物或人,给药途径可以采用口服、注射或者涂抹给药等方式给药,牛蒡子苷元的给药量会随给药对象或给药途径不同而发生变化,本发明中牛蒡子苷元用于抗感染免疫且适用对象为人时,牛蒡子苷元的用量为0.01mg/kg·d~100mg/kg·d,进一步优选牛蒡子苷元的用量为0.1mg/kg·d~10mg/kg·d。其他动物的给药剂量可以根据人与动物的体表面积比进行换算得到,这对于本领域技术人员来说是容易得到的。
本发明还提供适用于上述医药用途的包含牛蒡子苷元的药物制剂。具体地说,所述包含牛蒡子苷元的药物制剂可以为口服制剂、注射剂、外用制剂。口服制剂如片剂、胶囊剂、颗粒剂、舌下片、缓释片等,注射剂如粉针剂、注射液。外用制剂如搽剂、喷雾剂、凝胶剂等。上述药物制剂均可采用所属剂型常规制备工艺制备得到。
本发明适用上述药物用途的药物制剂中,所述牛蒡子苷元注射剂可以适用多种给药途径,包括皮内、皮下、肌内、腹腔、局部或静脉内给药,进一步优选为皮下给药。
作为本发明所优选的一种实施方式,发明人提供了一种适用于皮下注射给药的牛蒡子苷元注射剂的配方,该皮下注射剂由如下重量份的组分组成:
牛蒡子苷元 5-50份
助溶剂 2-5份
0.9%氯化钠溶液或注射用水 适量
其中所述助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的一种或几种,优选为PEG-400。本发明提供的牛蒡子苷元的注射剂的pH值为2.5-6.5,优选为3.0-4.0。本发明提供的调节牛蒡子苷元注射剂pH值的物质为柠檬酸。
本发明使用牛蒡子苷元用于抗感染免疫药物,与现有技术相比具有如下优势:
1、本发明实施例15-18证实牛蒡子苷元能够显著提高患者的免疫能力,治疗范围广,对由寄生虫、细菌、病毒引发的感染均具有很好的治疗效果,其治疗效果优于牛蒡复方和人参皂苷。
2、本发明实施例19-22证实牛蒡子苷元对革兰氏阳性细菌引发的感染性疾病具有很好的治疗效果,其在细菌引发的前列腺炎、尿路感染、肺炎、皮肤溃疡等疾病的治疗过程中,治疗效果显著由于现有一线用药的抗生素以及牛蒡复方,且不产生耐药性。
3、牛蒡子苷元为从传统中药牛蒡子中提取的天然药物单体,不仅疗效确切,而且毒副作用很低,可以显著提高患者的用药依从性和提高治疗效果。
4、牛蒡子苷元对于免疫低下患者以及化疗引起的免疫功能受影响的肿瘤患者的治疗效果更佳,其可以提高患者的机体免疫能力,促进身体康复。
5、牛蒡子苷元便宜且容易生产,与现有的生物制剂相比成本低,具有价格优势。
具体实施方式
以下通过具体实施例进一步描述本发明,但本领域技术人员应该知晓,本发明实施例并不以任何方式限制本发明。
实施例1牛蒡子苷元注射剂
处方:
牛蒡子苷元 10g
PEG-400 2L
0.9%氯化钠溶液 加至10L
制备工艺:
将处方量的PEG-400加入牛蒡子苷元,搅拌溶解,加入处方量的0.9%氯化钠溶液,搅拌均匀,柠檬酸调PH到3,加入0.5%针用活性炭,搅拌,脱炭,即得。
实施例2牛蒡子苷元注射剂
处方:
牛蒡子苷元 10g
PEG-400 3L
0.9%氯化钠溶液 加至10L
制备工艺:
将处方量的PEG-400加入牛蒡子苷元,搅拌溶解,加入0.9%氯化钠溶液至10L,搅拌均匀,柠檬酸调PH到4,加入0.5%针用活性炭,搅拌,脱炭,即得。
实施例3牛蒡子苷元注射剂
处方:
牛蒡子苷元 10g
PEG-400 1L
注射用水 加至10L
制备工艺:
将处方量的PEG-400加入牛蒡子苷元,搅拌溶解,加入注射用水至10L,搅拌均匀,柠檬酸调PH到6.5,加入0.5%针用活性炭,搅拌,脱炭,即得。
实施例4牛蒡子苷元注射剂
处方:
牛蒡子苷元 20g
PEG-400 4L
注射用水 加至10L
制备工艺:
将处方量的PEG-400加入牛蒡子苷元,搅拌溶解,加入注射用水至10L,搅拌均匀,柠檬酸调PH到2.5,加入0.5%针用活性炭,搅拌,脱炭,即得。
实施例5牛蒡子苷元注射剂
处方:
牛蒡子苷元 10g
PEG-400 3.3L
注射用水 加至10L
制备工艺:
将处方量的PEG-400加入牛蒡子苷元,搅拌溶解,加入注射用水至10L,搅拌均匀,柠檬酸调PH到3,加入0.5%针用活性炭,搅拌,脱炭,即得。
实施例6牛蒡子苷元舌下含片
制备工艺:将主药及各辅料成分烘干、粉碎过筛预处理,将主药与糖分、乳糖、羧甲基纤维素钠混匀,以纯水作为粘合剂将混匀的物料制备软材,过20目筛制粒并于60度下干燥制备干颗粒,将硬脂酸镁加入到上述干颗粒总混,压片即得。
实施例7牛蒡子苷元舌下缓释片
制备工艺:上述组分烘干、粉碎过筛预处理后混匀直接压片制得。
实施例8牛蒡子苷元凝胶剂的制备
将45份(重量比)的丙烯酸己酯与55份(重量比)的2-羟乙基(甲基)丙烯酸酯共聚制备的聚合物溶于乙酸乙酯得到含有固体34%(重量比)的基质溶液,5份(重量比)牛蒡子苷元和3份甘油醇单油酸酯加到100份(重量比)的基质溶液中,得到的混合物于溶解器中充分搅拌,得到含有微晶状态的牛蒡子苷元的均匀分散液。该分散液涂布于45μ m厚的聚对苯二甲酸乙二醇酯隔离层上,在吉尔老化恒温箱中于65℃干燥25分钟形成含药层,然后将含药层移至10μm厚的聚对苯二甲酸乙二醇酯膜上,得到带有含药层的胶布。含药层含有10%(重量比)的牛蒡子苷元,以微晶状态分散分布,并含有5%(重量比)的甘油醇单油酸酯,其厚度为80μm。
实施例9牛蒡子苷元搽剂
加蒸馏水至1000ml,同时用适量10%氢氧化钠溶液调节PH至6.5。
制备工艺:在常温常压下,称取牛蒡子苷元10g,溶于适量的蒸馏水中,再按照处方中各组分的配比分别加入其中,即丙三醇350g,尿素10g,5%苯扎溴铵溶液16ml(或苯扎溴铵0.8g),氯化钠5g。最后加入适量的蒸馏水至1000ml,充分混匀,同时用适量10%氢氧化钠溶液调节PH至6.5。
实施例10牛蒡子苷元胶囊剂
制备工艺:按胶囊剂常规制备工艺制备而成。
实施例11牛蒡子苷元泡腾片
制备工艺:按常规泡腾片的制备工艺制备成所需的泡腾片即可。
实施例12牛蒡子苷元缓释片剂
制备工艺:按缓释片的制备工艺制备成缓释片即可。
实施例13牛蒡子苷元喷雾剂
制备方法:在常温常压下,称量牛蒡子苷元20mg,溶于适量的蒸馏水中,再按照处方中各组分的配比分别加入其中,即丙三醇400mg,苯扎溴铵2mg,最后加蒸馏水至10ml,充分混匀,罐装,封口,检验得成品。
实施例14牛蒡子苷元的气雾剂
制备工艺:将处方量的牛蒡子苷元、尿素溶于无菌蒸馏水中,加入乙醇后砂芯漏斗过滤,用无菌蒸馏水加至1000ml,分剂量罐装,封接剂量阀门系统,分别再加压注入二氯二氟甲烷,即得。
实施例15牛蒡子苷元药物制剂对免疫低下小鼠模型的免疫功能的影响
环磷酰胺为临床常用的化疗药,但其在杀伤癌细胞的同时,也对人体产生不同程度的副作用,其中主要有骨髓抑制和免疫功能低下。参一胶囊的有效成分为人参皂苷,临床上主要配合化疗用药,具有提高机体免疫功能、其可以改善肿瘤患者的气虚症状,并有助于提高原发性肺癌、肝癌的疗效,因此本实验中将人参皂苷作为阳性对照药物。本实验采用环磷酰胺复制化疗所致免疫低下小鼠模型,研究牛蒡子苷元药物制剂对免疫低下小鼠免疫功能的影响
1、动物造模及给药
选取体重范围在18-22g之间的ICR小鼠70只,小鼠随机分成7组:正常对照组、模型组、人参皂苷组(50mg/kg)、牛蒡复方组(10mg/kg)、牛蒡子苷元高剂量组(50mg/kg)、牛蒡子苷元中剂量组(10mg/kg)、牛蒡子苷元低剂量组(1mg/kg),每组10只。除前两组外,每组每日分别灌胃给药喂服牛蒡子苷元溶液1次,连续给药7天。除正常组外其他各治疗组动物均于第4天皮下注射环磷酰胺40mg/kg制造免疫低下模型;于给药后第8天经尾静脉注射印度墨汁0.05ml/10g,于lmin和5min后分别经眼眶静脉取血20ml,加入0.1%Na2CO3中摇匀,于680rim下比色读取吸光度。按下式计算廓清指数K和吞噬指数a:
K=(1gOD1-lgOD2)/(t2-t1),a=K1/3×体重/肝脾重
统计学方法数据以均数±标准差(±s)表示。组间比较采用组间t检验。以P<0.05为差异有显著性,P<0.01为差异有非常显著性。
2、实验结果及分析
表1各组及不同剂量下廓清指数(K)与吞噬指数(a)比较(x±s,n=10)
组别 | K | a |
正常对照组 | 0.0617±0.0227 | 7.41±0.64 |
模型组 | 0.0384±0.0186** | 7.12±0.58** |
人参皂苷组 | 0.0612±0.0201## | 7.45±0.62## |
牛蒡复方组 | 0.0615±0.0168## | 7.35±0.54## |
[0097]
牛蒡子苷元低剂量组 | 0.0642±0.0146## | 7.48±0.74## |
牛蒡子苷元中剂量组 | 0.0746±0.0108##▲◆ | 7.65±0.62##▲◆ |
牛蒡子苷元高剂量组 | 0.0788±0.1462##▲◆ | 7.95±0.71##▲◆ |
与正常组相比,**P<0.01;与模型组相比,##P<0.01;
与人参皂苷组相比,▲P<0.05;与牛蒡复方组相比,◆P<0.05;
由表1结果显示模型小鼠的廓清指数K和吞噬指数有明显下降,表明免疫低下模型造模成功。而人参皂苷组、牛蒡复方组以及牛蒡子苷元各剂量组均可非常明显地增强免疫能力功能,主要表现为可以升高免疫低下小鼠的廓清指数K和吞噬指数a。其中牛蒡子苷元高、中剂量组的廓清指数K和吞噬指数a与人参皂苷组或牛蒡复方组相比具有显著性差异,这表明牛蒡子苷元对免疫低下模型的特异性免疫提高优于人参皂苷和牛蒡复方,牛蒡子苷元对特异性免疫的升高作用强度呈剂量依赖关系。
实施例16牛蒡子苷元对荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影响
1、试验动物:
ICR小鼠120只,6周龄,体重18-23g。将小鼠随机分成6组,每组20只,雌雄各半,各给药组给药剂量参见表2。各组小鼠自由饮水,正常饲喂。
2、试验方法:
无菌条件下,抽取小鼠H22腹水,生理盐水清洗5遍,去除蛋白等杂质,离心后,将上述腹水计数,生理盐水配制成A浓度为0.5×106个/ml,用生理盐水配制成B浓度为6×105个/ml,-20℃冷藏备用。
各组皮下注射本发明实施例1制备的牛蒡子苷元注射剂9天,并于给药的第3天、第6天和第9天对空白组之外的5组用A进行免疫,方法为将备用的A液0.2ml/只注入小鼠尾静脉。停止给药3天后用B给各组小鼠接种H22肿瘤,方法为将备用的B液0.2ml/只接种于小鼠腋下,然后观察10天。
试验结束最后一天于尾静脉注射墨汁0.1ml/10g,眼眶取血20μl,于1.5min测光密度值,并称体重、胸腺及脾脏重,计算胸腺指数、脾脏指数、吞噬活性a及廓清指数K。
分组与给药剂量见表2:
表2:分组与给药剂量
组别 | 给药剂量 |
空白组 | / |
[0111]
模型组 | 赋形剂 |
牛蒡子苷元1组 | 10mg/kg |
牛蒡子苷元2组 | 2.5mg/kg |
牛蒡子苷元3组 | 0.5mg/kg |
牛蒡子苷元4组 | 0.1mg/kg |
3、试验结果见表3
表3牛蒡子苷元对荷瘤小鼠免疫吞噬功能的影响
*与空白组相比,p<0.05;**与空白组相比,p<0.01;
#与模型组相比,p<0.05;##与模型组相比,p<0.01。
由表3结果可见,牛蒡子苷元可显著增加脾和胸腺指数,对廓清指数K及吞噬活性a影响也较明显,与模型组比较具有显著性差异。本实验通过ICR小鼠肿瘤免疫模型证明了牛蒡子苷元注射剂提高肿瘤患者的免疫能力,给以牛蒡子苷元后各给药组均有显著免疫增强作用,可增加吞噬活性a,廓清指数K及胸腺脾脏指数,其中牛蒡子苷元低剂量组(0.5mg/kg)效果尤为显著。
实施例17牛蒡子苷元对家兔皮肤溃疡愈合的影响
1、家兔皮肤溃疡模型制作方法及分组
选择体重为1.8-2.5kg重的Ⅱ级同龄新西兰家兔12只,在家兔左侧臀部剪去3cm×3cm的毛,再用8%的硫化钠将毛脱尽,常规消毒后,用2%利多卡因局部麻醉,手术切除直径 2cm×2cm的皮肤全层l块,用金黄色葡萄球菌(含50亿个/mL)感染创面,术后第3天溃疡形成后,切取局部组织在显微镜下观察,均见炎性渗出物及坏死组织,坏死达肌层。
将造模成功的家兔随机分为牛蒡子苷元治疗组(皮下注射牛蒡子苷元,给药剂量为0.1mg/kg)、红霉素组(皮下注射红霉素,给药剂量为8mg/kg)和空白对照组(皮下注射给予同体积生理盐水),每组4只,各给药组每天给药一次,连续给药3天后停止给药。观察家兔皮肤溃疡面愈合情况,并分别于停止给药后第2天、第4天、第6天测定家兔肛温,于停止给药后第6天取血测定各给药组家兔的血常规。
2、实验结果及分析
表4牛蒡子苷元对家兔皮肤溃疡愈合的影响
与空白组对比,*P<0.05,**P<0.01;与红霉素组相比,#P<0.05;
由表4可以看出,停止给与药物后,空白组家兔的肛温持续升高,同时表现为给药后第6天的白细胞(WBC)、中性粒细胞(NEU)以及单核细胞(MONO)数量升高。红霉素组虽然对家兔的肛温以及血液中的炎症细胞数量与空白组相比具有显著性差异(P<0.05),同时其停药2、4、6天的肛温结果显示红霉素对大鼠炎症具有一定的治疗结果,但其治疗效果不佳。牛蒡子苷元组的肛温和血液中的炎症细胞数量不但与空白组具有极显著性差异,与红霉素组相比也具有显著性差异;更难能可贵的是停药2、4、6天后家兔肛温逐渐下降,停药6天后的炎症细胞也下降到正常范围之内,这提示牛蒡子苷元对于金黄色葡萄球菌所致的感染具有相当好的治疗效果。
实施例18药物处理后DC刺激的T细胞增殖反应
树突状细胞(Dendritic cell,DC)是功能最强的抗原递呈细胞(APC),能有效地激活初始T细胞(naive T cell)进行增殖,是DC与其他APC最主要的区别。DC是免疫应答的启动者,由于其在CD4+,CD8+T细胞免疫应答反应中所起的关键作用,DC已成为当今免疫学研究热点之一,目前主要集中研究DC在肿瘤疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反应 以及抗感染中的防治作用。
1.1人外周血树突状细胞的分离培养
取人外周血白细胞层,用0.01mol/L PBS等倍稀释。用淋巴细胞分层液常规分离PBMC,以完全RPMI1640培养液调整细胞浓度至3×106ml-1,加入6孔板中,3mlP孔,5%CO2,37℃培养箱中培养2小时,以PBS洗去非粘附细胞,共3次,加入含IL-4(100U/ml)、GM-CSF(150ng/ml)和TNF-α(500U/ml)的培养液常规培养,隔日半量换液,培养8天后供鉴定和实验用。
1.2T细胞的制备
用方法1.1分离人PBMC层,贴壁法除巨噬细胞,用尼龙毛柱法除去B细胞,获得的T细胞调整细胞浓度至1×106个/ml。
1.3DC的制备
将纯度为99%的成熟DC离心,加入RPMI1640调整细胞浓度为1×105,4×104,2×104个/ml,加入96孔板中,100μl/孔。分别加入牛蒡子苷元(100,10,1μg/ml),共同培养2天。
1.4T细胞增殖实验(MLR)
在上述加药组DC中加入T细胞,100μl/孔。5%CO2,37℃培养箱中培养72小时,培养结束前6小时每孔轻轻吸出100μl培养液,加入MTT(5mg/ml)10μl,放入培养箱中继续培养6小时后,加入0.01mol/L HCl-10%SDS100μl,放37℃过夜,用酶标仪测A570nm值示T细胞增殖水平。
2实验结果及分析
表5牛蒡子苷元对DC刺激T细胞增殖作用的影响
与对照组相比,*P<0.05,**P<0.01
由表5可以看出,与对照组相比,牛蒡子苷元各组T细胞数量均有不同程度的增加,其中牛蒡子苷元高剂量组(100μg/ml)的T细胞数量与对照组相比具有极显著性差异(P <0.01),牛蒡子苷元低剂量组(10μg/ml)的T细胞数量与对照组相比具有显著性差异(P<0.05),这表明牛蒡子苷元可以促进DC刺激T细胞增殖的作用,并且这种促进作用呈现剂量依赖性。
实施例19牛蒡子苷元对常见致病细菌的体外抑菌实验
1、实验材料及方法
本实验所使用的菌种及培养基分别为溶血性链球菌、肺炎链球菌、大肠埃希氏菌、普通变形杆菌、甲型副伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧金黄色葡萄球菌、流感杆菌以及粪肠球菌,营养琼脂培养基(中国药品生物制品检定所);比浊管(中国细菌浊度标准,中国药品生物制晶检定所)。
体外抑菌实验:①制备含药琼脂平板。将受试物按倍比稀释配制不同药物浓度的培养基,加热,调制各自所需pH值,121℃灭菌30min,冷至45℃。倾注成无菌平板(平皿d=65mm,10ml/平皿),最终使培养基中含受试物原液(2g/ml)的稀释倍数分别为l:2,1:4……1:1024。同时做各自的空白对照培养基。②接种。取传至第三代的幼龄菌,分别用0.9%氯化钠溶液按标准比浊管校正浓度为108cfu/ml的待检菌液,分别接种于不同倍比稀释的各自含药琼脂表面,同时接种平行点3点,使每点含2一菌液。每一接种点的液滴直径为5-8mm。待接种点干燥后,翻转平板于36℃恒温培养箱培养20h观察结果(同时做空白对照)。③判定标准。以不出现菌落的琼脂平板上的最低稀释受试物浓度为其最低抑菌浓度(MIC)。本实验中牛蒡子苷元对各致病菌株的最小抑菌浓度如表6所示。
2、实验结果及分析
表6牛蒡子苷元对常见致病菌住的最小抑菌浓度测定结果
结果显示,牛蒡子苷元对大多数的致病菌均具有很好的抑菌效果,但其对革兰氏阳性细菌的抑制作用(稀释度为1:128或1:256)要显著优于对革兰氏阴性细菌的抑制作用(稀释度为1:32或1:64)。上述实验结果提示牛蒡子苷元可能对于革兰氏阳性细菌引发的感染性疾病具有很好的治疗效果。
实施例20牛蒡子苷元药物制剂对大鼠模型慢性尿路感染的治疗作用
1、慢性尿路感染模型建立及给药
雄性wista大鼠,实验前1d禁水禁食16h,用10%水合氯醛麻醉、固定、下腹壁去毛,正中切开正腹壁1.5cm,暴露腹腔,然后向膀胱内注射0.8mL金黄色葡萄球菌液(浓度为5×108个/mL),当见到菌液从尿道口流出时即停止注射(假手术组不注入菌液,其他操作均一致),缝合切口,恢复饮水和喂饲料。
将造模后大鼠随机分为6组:正常对照组、模型组、万古霉素组(50mg/kg)、牛蒡复方组(10mg/kg)、牛蒡子苷元高剂量组(50mg/kg)、牛蒡子苷元中剂量组(10mg/kg)、牛蒡子苷元低剂量组(1mg/kg),每组10只。造模后次日给药,连续灌胃给药4周,给药前各药物用等量的赋形剂溶解,正常组和模型组给予等量的赋形剂。给药4周后处死大鼠,处死前1d各组大鼠分别置代谢笼收集24h尿液,取尿液涂片后于40倍高倍镜下检测尿中白细胞数量和尿中细菌数。
2、实验结果及分析
表7牛蒡子苷元对大鼠模型慢性尿路感染的治疗作用
注:表中数字代表每个高倍视野中白细胞或细菌的数目,“+”表示检出为阳性,“-”表示检出为阴性。与正常组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01;与万古霉素组相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与牛蒡复方组相比,◆P<0.05,◆◆P<0.01。
由上表可以看出,模型组大鼠尿中的白细胞数目和细菌数目与正常对照组具有显著性差异,造模成功。万古霉素组、牛蒡复方组以及牛蒡子苷元各剂量组对金黄色葡萄球菌引发的尿路感染均体现出了显著的治疗作用。其中万古霉素治疗组的治疗组用略好于牛蒡复方组。牛蒡子苷元各剂量组的治疗效果最佳,其大鼠尿中白细胞数目和细菌数目均显著或极显著少于万古霉素组或牛蒡复方组,特别是牛蒡子苷元高剂量组的白细胞数目和细菌数目均为0,体现出了优异的治疗效果。病理切片结果显示:空白对照组肾间质水肿,髓质出血,牛蒡子苷元高剂量组少量间质水肿和炎性细胞浸润无髓质出血。空白对照组膀胱上皮固有层炎症浸润,水肿,充血,牛蒡子苷元高剂量组炎性浸润较少,水肿,充血较清。其他治疗组的病理切片结果介于空白对照组和牛蒡子高剂量组之间。这表明牛蒡子苷元在治疗金黄色葡萄球菌引发的慢性尿路感染具有十分显著的治疗效果,且治疗效果具有剂量依赖性。同时表明牛蒡子苷元对革兰氏阳性细菌所导致的疾病具有显著治疗效果。
实施例21牛蒡子苷元对耐甲氧金黄色葡萄球菌所致的大鼠细菌性前列腺炎的治疗作用
1、模型制作及给药
取210g~240g大鼠60只,随机均分为6组:正常对照组、模型组、万古霉素组(50mg/kg)、牛蒡复方组(10mg/kg)、牛蒡子苷元高剂量组(50mg/kg)、牛蒡子苷元中剂量组(10mg/kg)、牛蒡子苷元低剂量组(1mg/kg),每组10只。按戴氏法以0.1ml耐甲氧金黄色葡萄球菌(2.0×107/m1)致炎(方法同上),致炎前96、72、48、24、1h及致炎后24、48、72h给药8次,末次给药后1h断髓处死大鼠,分别无菌取前列腺50mg加入白细胞稀释液200μl和生理盐水200μl中,镜检,记录白细胞数及卵磷质小体密度。另取前列腺液10μl加入5ml生理盐水,于半固体培养基中培养48h,记录菌落数。
2、实验结果及分析
表8牛蒡子苷元对耐甲氧金黄色葡萄球菌所致的大鼠细菌性前列腺炎的治疗作用
与正常组相比,**P<0.01;与模型组相比,#P<0.05,##P<0.01;
与万古霉素组相比,▲P<0.05,▲▲P<0.01;与牛蒡复方组相比,◆P<0.05,◆◆P<0.01。
由上表可以看出,模型组大鼠前列腺组织中的白细胞数目和卵磷脂小体数目与正常对照组具有显著性差异,造模成功。万古霉素组、牛蒡复方组以及牛蒡子苷元各剂量组对耐甲氧金黄色葡萄球菌引发的尿路感染均体现出了显著的治疗作用。其中牛蒡复方组的治疗组用略好于万古霉素治疗组,猜测可能是由于耐甲氧金黄色葡萄球菌对万古霉素产生一定耐受所致。牛蒡子苷元各剂量组的治疗效果最佳,其大鼠前列腺组织中白细胞数目均显著或极显著少于万古霉素组或牛蒡复方组,卵磷脂小体数目则显著高于特别是万古霉素组或牛蒡复方组。其中牛蒡子苷元高剂量组在降低白细胞数量和升高卵磷脂小体数目方面效果最为显著。这表明牛蒡子苷元在治疗金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性细菌引发的前列腺炎具有十分显著的治疗效果,且治疗效果具有剂量依赖性。
实施例22牛蒡子苷元对小鼠肺炎链球菌感染的肺炎模型的治疗作用
肺炎指由不同病原体或其他因素导致的肺部炎症,细菌性肺炎是最常见的肺炎。肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌均可导致肺炎,其中尤以肺炎链球菌感染的肺炎最为常见。在抗生素出现之前,罹患肺炎者大约有1/3的人将难免一死。抗生素的出现曾经使肺炎的死亡率明显下降,但近年来,尽管应用强力的抗菌药物和有效的疫苗,肺炎的总死亡率不再降低,甚至有所上升,因此有效的肺炎治疗药物的研制仍需医药工作者的不懈努力。
1、实验方法:
1.1动物肺炎模型的建立:
选用肺炎链球菌2000099-1作为体内试验用细菌,造模前1天密集划线于MH血琼脂培养基,35℃、5%CO2培养箱中过夜培养,造模当天用2mL生理盐水冲洗菌苔,通过2次离心洗去色素及杂质,之后用生理盐水稀释浓度到1.5×1010CFU·mL-1。采用免疫力正常 的雌性昆明鼠(20~22g),10%的水合氯醛400mg·kg-1腹腔麻醉后,仰面固定,酒精消毒后自颈部正中切开皮肤,钝性分离肌肉暴露气管。用微量注射器取30μL菌液直接气管内注射,然后直立位摇晃3min,使细菌尽量均匀分布于两肺。接种细菌后6h随机选取小鼠,取双肺,10%甲醛固定,石蜡包埋后切片,经H-E染色后行病理检查,可见肺泡膈增宽,炎性细胞浸润,肺泡内多量红细胞,小血管扩张、充血。
1.2分组、给药方法及标本采集
将小鼠随机分为4组,分别为:①对照组:12只,接种细菌后,不给予药物治疗;②青霉素组:18只,接种细菌后90min第一次腹腔注射青霉素0.6mg·kg-1,以后以相同剂量1h给药1次;③牛蒡子苷元低剂量组:18只,接种细菌后90min腹腔注射牛蒡子苷元5mg·kg-11次;④牛蒡子苷元高剂量组:18只,接种细菌后90min腹腔注射牛蒡子苷元20mg·kg-11次。
对照组分别在接种细菌后即刻(0h)及接种后6h采集肺组织,每个时间点取6只小鼠;青霉素组、牛蒡子苷元低剂量组、牛蒡子苷元高剂量组分别在接种细菌后即刻(0h)及接种后2,4,6h采集肺组织。采集方法为:将小鼠麻醉固定后,开胸取出双侧肺组织,每个标本均加入等量的1mL生理盐水,置于玻璃匀浆器中研磨15min,制成肺组织匀浆,用于细菌计数。将研磨好的肺组织匀浆立即用生理盐水10倍比稀释,选取不同浓度的匀浆100μL均匀涂布于M-H血琼脂培养基,35℃、5%CO2培养箱中过夜培养,选取菌落数在30~300之间的平板进行菌落计数。每一个实验组均在接种细菌后即刻(0h)及之后2,4,6h取出肺组织标本制成匀浆测定细菌浓度,计算细菌浓度对数。
1.3统计与计算
2、结果:
表9牛蒡子苷元对小鼠肺炎链球菌肺炎模型的作用
注:与模型对照组相比,#p<0.05,##p<0.01;与青霉素组相比,&p<0.05;&&p<0.01。
由表9结果可知:
(1)与模型组比较,给药组的细菌浓度对数均有不同程度减小。结果表明,青霉素组、牛蒡子苷元高剂量组、牛蒡子苷元低剂量组能明抑制肺炎链球菌感染的肺炎,与模型组比较细菌浓度对数明显降低(P<0.05)。
(2)与青霉素组相比,牛蒡子苷元高、低剂量组细菌浓度对数均明显减小,牛蒡子苷元各剂量组在抑制肺炎链球菌感染的肺炎方面与青霉素组相比,具有显著性或极显著性差异。
Claims (11)
1.牛蒡子苷元在制备治疗感染性疾病药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的感染性疾病为细菌引发的感染性疾病,优选为革兰氏阳性细菌引发的感染性疾病。
3.如权利要求2所述的用途,其特征在于所述的革兰氏阳性细菌为溶血性链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧金黄色葡萄球菌、粪肠球菌中的一种或多种。
4.如权利要求2所述的用途,其特征在于,所述的感染性疾病为前列腺炎、尿路感染、皮肤溃疡、肺炎中的一种。
5.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,牛蒡子苷元的适用对象为免疫功能低下者或接受化疗的肿瘤患者。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,牛蒡子苷元为其口服制剂、注射制剂、外用制剂。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,牛蒡子苷元的口服制剂为其片剂、胶囊剂、颗粒剂;所述牛蒡子苷元的注射制剂为其粉针剂、注射液;所述牛蒡子苷元的外用制剂为其搽剂、喷雾剂或凝胶剂。
8.如权利要求7所述的用途,其特征在于,所述注射制剂适用于皮下注射,所述注射制剂由如下组分组成:
牛蒡子苷元 5-50份
助溶剂 2-5份
0.9%氯化钠溶液或注射用水 适量。
9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述助溶剂选自吐温-80、丙二醇、甘油、乙醇和PEG-400中的一种或几种。
10.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述注射剂的pH为2.5-6.5,优选为3.0-4.0。
11.如权利要求1所述的用途,其特征在于,牛蒡子苷元的人用给药量为0.01mg/kg·d~100mg/kg·d,优选为0.1mg/kg·d~10mg/kg·d。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104435716A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-03-25 | 周连才 | 一种治疗慢性细菌性前列腺炎合并免疫低下的中药组合物 |
CN105147976A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-16 | 青岛云天生物技术有限公司 | 一种治疗急性咽喉炎合并口腔溃疡的中药组合物 |
CN105168484A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-23 | 青岛辰达生物科技有限公司 | 一种治疗女性慢性尿路感染合并盆腔疼痛的中药组合物 |
CN105250950A (zh) * | 2015-10-13 | 2016-01-20 | 青岛辰达生物科技有限公司 | 一种治疗抗生素耐药性的细菌性前列腺炎的中药组合物 |
CN111514132A (zh) * | 2019-02-01 | 2020-08-11 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种对疖痈具有防治作用的组合物 |
CN111671746A (zh) * | 2019-02-01 | 2020-09-18 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种对疣具有防治作用的组合物 |
CN113577090A (zh) * | 2021-09-08 | 2021-11-02 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 牛蒡子苷在制备前列腺增生药物中的应用 |
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Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
李大亮等: "牛蒡子水煎液及牛蒡苷、牛蒡苷元体外抗菌实验研究", 《黑龙江医药》 * |
祁公任等: "《现代实用临床中药学》", 31 May 2010 * |
Cited By (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104435716A (zh) * | 2014-12-22 | 2015-03-25 | 周连才 | 一种治疗慢性细菌性前列腺炎合并免疫低下的中药组合物 |
CN105147976A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-16 | 青岛云天生物技术有限公司 | 一种治疗急性咽喉炎合并口腔溃疡的中药组合物 |
CN105168484A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-23 | 青岛辰达生物科技有限公司 | 一种治疗女性慢性尿路感染合并盆腔疼痛的中药组合物 |
CN105250950A (zh) * | 2015-10-13 | 2016-01-20 | 青岛辰达生物科技有限公司 | 一种治疗抗生素耐药性的细菌性前列腺炎的中药组合物 |
CN111514132A (zh) * | 2019-02-01 | 2020-08-11 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种对疖痈具有防治作用的组合物 |
CN111671746A (zh) * | 2019-02-01 | 2020-09-18 | 鲁南制药集团股份有限公司 | 一种对疣具有防治作用的组合物 |
CN113577090A (zh) * | 2021-09-08 | 2021-11-02 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 牛蒡子苷在制备前列腺增生药物中的应用 |
CN113577090B (zh) * | 2021-09-08 | 2023-04-25 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 牛蒡子苷在制备前列腺增生药物中的应用 |
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