CN101234134B - 复方板蓝根制剂在制备防治内毒素血症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

一种由板蓝根及大青叶组成的复方板蓝根制剂在制备防治内毒素血症药物中的应用。经多项药效学评价实验，板蓝根颗粒显示出广泛的体内外抗内毒素活性——它能够直接中和、降解内毒素；显著拮抗内毒素所致动物的发热、致死攻击及DIC生物效应。同时，分子生物学实验表明其可以抑制内毒素刺激机体重要组织moesin mRNA的表达，减轻P38 MAPK升高的程度。另外，板蓝根颗粒可抑制内毒素诱导的炎症介质合成与释放，降低LPO水平、升高SOD活性，减轻机体经自由基攻击所致损伤，有利于抑制过度炎性反应，从而有效控制病情及死亡率。

Description

复方板蓝根制剂在制备防治内毒素血症药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，确切地说就是复方板蓝根颗粒剂在制备防治内毒素血症药物中的新用途。

背景技术

内毒素血症除存在于各种感染性疾病之外，如严重创伤、烧伤、休克、大手术和癌症放、化疗等都是内毒素血症的主要诱因。细菌内毒素(endotoxin)是革兰阴性菌生长时释放或死亡时裂解出来的细胞壁脂多糖成分(lipopolysaccharide，LPS)，进入机体后与宿主细胞相互作用表现出广泛的生物活性，是介导机体免疫和炎症反应的关键致病因子。内毒素血症即是由于内源性及外源性内毒素过量进入血循环，激发机体免疫细胞大量释放多种细胞因子，破坏机体炎症反应平衡，导致微循环障碍和组织损伤，进一步造成脓毒性休克、多脏器功能衰竭等高危性疾病。

因此，针对内毒素血症及其所致多脏器功能衰竭的抗内毒素药物治疗方法是当今国内外学者研究的重大课题之一，但一直未见突破性成果，一些初步实验证实有疗效的药物也处于实验室阶段，临床尚未广泛推广应用。目前，研究目标多转向中药、天然药物的开发研究，尤以清热解毒中药为主。根据传统中医理论，中医“毒”的含义甚广，清热解毒中药所称之“毒”为火热壅盛所致的“热毒”或“火毒”。传统清热解毒方药具有清泄热毒或火毒的作用，主要用于温热病及热毒炽盛症。

板蓝根与大青叶分别来源于十字花科植物菘蓝Isatis indigoticaFort.的根与叶，二者临床多同时配伍使用，临床用于热毒发斑、丹毒、咽喉肿痛、口舌生疮、疮痈肿毒等症，故前人认为它能解心胃热毒，尤常用于流行性乙性脑炎等。

复方板蓝根颗粒剂(标准编号WS₃-B-2377-97)由板蓝根与大青叶按2∶3比例经水提、醇沉、浓缩制成，其作为一种传统清热解毒的典型代表，用于温病发热，出斑，风热感冒，咽喉肿烂，流行性乙型脑炎，肝炎，腮腺炎，其用量巨大，患者口碑良好，市场前景广阔。

发明内容

本发明的目的就在于提供复方板蓝根制剂在防治内毒素血症方面的新用途，进一步拓展其在临床实践中的新用途，以期更好地造福广大患者。

一种由板蓝根及大青叶组成的复方板蓝根制剂在制备防治内毒素血症药物中的应用。

所述的板蓝根与大青叶可以按复方板蓝根颗粒标准，即按2∶3的重量比进行提取。

由于板蓝根通常为栽培，而不同的栽培方式得到的板蓝根原药材品质不同，因此，比较优选的是，上述的板蓝根及大青叶是采用如下方法栽培得到：

(1)选地与整地：选择三年或以上未种植过板蓝根的沙壤地，深翻25～35厘米，每亩施用腐熟的堆肥或厩肥1500～2000千克，或每亩施入腐植酸生物有机肥100～120千克，然后耙细、整平，做成畦。

(2)育苗：先将菘蓝种子用40℃～50℃质量浓度为2～4％的高锰酸钾浸种11～13小时，捞出晒干后拌细沙或草木灰撒播，撒播后覆盖3～5cm的土。

(3)田间管理：在苗高6～10cm时进行间苗和补苗，同时进行中耕除草，封行后禁止除草；干旱及时浇水，雨季应注意清沟排水，防止畦间积水烂根和感染病害；生长过程中施药防治病虫害；生长期追施有机肥1～3次。

(4)、采收与加工：

在菘蓝种植当年的11月份采收大青叶，在采收大青叶后7～14天挖根，去净芦头和泥土，进行晒干。

所述的复方板蓝根制剂可以为片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、口服液、茶剂或注射剂。

为了更好地理解本发明技术，以下采用复方板蓝根颗粒剂的抗内毒素活性评价实验，说明其在制药领域中的新用途。

具体实施方式

为了更好地理解本发明技术，以下采用复方板蓝根颗粒剂对其抗内毒素活性进行评价实验，说明其在制药领域中的新用途。复方板蓝根颗粒剂是按WS₃-B-2377-97标准生产。

在下面实验中，板蓝根颗粒剂A批所用的广州白云山和记黄埔中药有限公司GAP药材产品，是指按下述方法栽培得到的板蓝根原生药材：

(1)选地与整地：选择三年或以上未种植过板蓝根的沙壤地，深翻25～35厘米，每亩施用腐熟的堆肥或厩肥1500～2000千克，或每亩施入腐植酸生物有机肥100～120千克，然后耙细、整平，做成畦。

(2)育苗：先将菘蓝种子用40℃～50℃质量浓度为2～4％的高锰酸钾浸种11～13小时，捞出晒干后拌细沙或草木灰撒播，撒播后覆盖3～5cm的土。

(3)田间管理：在苗高6～10cm时进行间苗和补苗，同时进行中耕除草，封行后禁止除草；干旱及时浇水，雨季应注意清沟排水，防止畦间积水烂根和感染病害；生长过程中施药防治病虫害；生长期追施有机肥1～3次。

(4)、采收与加工：

在菘蓝种植当年的11月份采收大青叶，在采收大青叶后7～14天挖根，去净芦头和泥土，进行晒干。

复方板蓝根颗粒剂B批为广州白云山和记黄埔中药有限公司提供的非GAP药材产品，是按照一般的栽培方法生产的原生药材。其栽培方法与GAP栽培方法主要体现在非GAP方法未用高锰酸钾浸种，且菘蓝根是与大青叶同时采收。

一、复方板蓝根颗粒剂的抗内毒素活性评价

(一)复方板蓝根颗粒剂的体外抗内毒素活性评价

1.材料与仪器

1.1药物

复方板蓝根颗粒剂(广州白云山和记黄埔中药有限公司，为GAP产品，批号20070615)，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏水中，必要时过滤残渣，依次配制成浓度为1、0.5、0.25g·mL^-1的水溶液，热压灭菌后贮存于4℃冰箱中备用。

1.2试剂

细菌内毒素工作标准品(20EU/支，中国药品生物制品检定所，批号：010203)；动态比浊法鲎试剂(KTA鲎试剂，灵敏度0.06EU·mL^-1，厦门鲎试剂厂，批号：001123)；细菌内毒素检查用水(BET水，5mL/支，湛江安度斯生物有限公司，批号：001222)；稀释液(II)(4mL/支，湛江安度斯生物有限公司，批号：010430)；Tris缓冲液(pH 7.2，500mL/瓶，批号：001112)，小牛血清(10mL/瓶，批号：010210)，脂多糖(LPS，5mg/支，69H4022)，以上产品均购于美国Sigma公司，其余试剂均为分析纯。

1.3仪器

EDS-98细菌内毒素测定仪(北京金山川科技发展有限公司)；RE-10E-100型旋转蒸发仪(日本SIBATA公司)；XW-80A型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；硼硅酸盐反应试管(湛江安度斯生物有限公司)；H-600型透射电镜(日本日立公司)；可调微量移液管；CS10C型电热恒温干燥箱。

2.方法与结果

2.1动态浊度法测定复方板蓝根颗粒剂的体外抗内毒素作用

2.1.1标准曲线的绘制

以内毒素浓度(C)的对数值为横坐标，临界时间(T_a)均值的对数为纵坐标，作标准曲线，回归分析得方程：logT_a＝2.7116-0.3048logC，r＝-0.9986。结果表明，内毒素浓度在0.1～10.0EU·mL^-1范围内其对数值与临界时间对数呈线性关系。

2.1.2复方板蓝根颗粒剂抗内毒素作用的定量测定

分别取供试药液各0.1mL，并以不含复方板蓝根的空白颗粒剂的无菌水溶液为对照，均采用稀释液(II)作40倍稀释；取稀释后各组溶液0.4mL，加入0.1mL内毒素标准溶液(20EU·mL^-1)于37℃下孵育1h，使药液与内毒素充分作用；吸取孵育后的混合液0.1mL于反应试管中，加入0.1mL KTA鲎试剂，迅速插入内毒素仪检测孔内测定临界时间，每组供试品平行作6管，将药物组与空白对照组作t检验比较，并以临界时间均值参照标准曲线计算内毒素经作用后的浓度及相应的降解率，结果见表1。

表1经复方板蓝根颗粒剂作用后的内毒素含量测定结果(n＝6)

组别	临界时间均值(s)	孵育后内毒素浓度(EU·mL-1)	内毒素降解率
				复方板蓝根颗粒剂0.25g·mL-1复方板蓝根颗粒剂0.50g·mL-1复方板蓝根颗粒剂1.00g·mL-1空白对照	553±68*577±58**668±39**417±54	0.810.720.391.75	56％64％72％---

注：与空白对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，与空白对照组比较，内毒素经不同剂量复方板蓝根颗粒剂供试药液孵育作用后有了不同程度的中和降解，其中复方板蓝根颗粒剂高剂量组对于内毒素的降解率最大，与空白对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)，显示其体外直接抗内毒素作用活性最强；并且抗内毒素活性与药物剂量之间呈剂量依赖性。据研究，观察大青叶不同化学部位对放线菌素D敏化小鼠内毒素致死攻击的保护作用。并以内毒素制备家兔发热模型，测定其肛温变化。结果表明，大青叶IV部位能直接中和降解内毒素，显著降低内毒素的致热性和致死性，说明其具有显著的体内外抗内毒素活性。

(二)复方板蓝根颗粒剂的体内抗内毒素活性评价

1.材料与仪器

1.1药物  复方板蓝根颗粒剂(广州白云山和记黄埔中药有限公司，为GAP产品，批号20070615)，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏水中，依次配制成浓度为2、1、0.5g·mL^-1的水溶液，热压灭菌后贮存于4℃冰箱中备用。

1.2动物  KM小鼠，雄性，体重18～22g；日本大耳白兔，雌雄各半，体重2～2.5kg，以上由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

1.3试剂  放线菌素D(ACTD，0.2mg/支，上海新亚药业有限公司，000402)；D-氨基半乳糖[D(+)-galactosamine，D-GalN，Sigma公司，023K0703]；脂多糖(LPS，5mg/支，Sigma公司，69H4022)；阿司匹林肠溶片：河北神威药业有限公司，批号0504121；其余试剂均为分析纯。

1.4仪器  RE-10E-100型旋转蒸发仪(日本SIBATA公司)；CS10C型电热恒温干燥箱。

2.方法与结果

2.1对D-氨基半乳糖敏化小鼠内毒素致死攻击的影响

昆明种小鼠60只，按表2随机分成5组，每组12只。药物组按10g·mL^-1ig给药，2h后重复一次；空白对照组给予相同体积的复方板蓝根颗粒剂阴性对照溶液；阳性对照组按10mg·kg^-1剂量ig给予地塞米松；给药1h后按600mg·kg^-1剂量ip D-GalN致敏；2h后按0.5mg·kg^-1剂量ip LPS，3d内观察动物死亡情况，计算动物死亡率，并与空白对照组比较，作χ²检验。结果见表2。

表2对D-氨基半乳糖敏化小鼠内毒素致死攻击的影响

组别	动物数/只	动物死亡数/只	死亡率	P值
					空白对照组复方板蓝根颗粒剂2.0g·mL-1复方板蓝根颗粒剂1.0g·mL-1复方板蓝根颗粒剂0.5g·mL-1地塞米松	1212121212	114744	92％33％58％33％33％	P＜0.05P＜0.05P＜0.05

结果表明，相对于空白对照组，复方板蓝根颗粒剂高、低剂量组能够显著降低D-GalN敏化小鼠的死亡率，有效地保护小鼠免受内毒素的致死攻击；结果表明复方板蓝根颗粒剂在动物体内也具有拮抗内毒素毒害生物效应的活性，但其活性与作用强度不呈显著依赖性。

2.2对放线菌素D敏化小鼠内毒素致死攻击的影响

昆明小鼠60只，按表3随机分成5组，每组12只。药物组按10g·mL^-1ig给药，2h后重复一次；空白对照组给予相同体积的复方板蓝根颗粒剂阴性对照溶液；阳性对照组按10mg·kg^-1剂量给予地塞米松；1h后按2mg·kg^-1剂量腹腔注射ACTD致敏；2h后按1mg·kg^-1剂量尾静脉注射LPS，3d内观察动物死亡情况，计算动物死亡率，计算死亡率，并与空白对照组比较，作χ²检验。结果见表3。

表3复方板蓝根颗粒剂对放线菌素D敏化小鼠内毒素致死攻击的影响

组别	动物数(只)	动物死亡数(只)	死亡率
				空白对照组复方板蓝根颗粒剂2.0g·mL-1复方板蓝根颗粒剂1.0g·mL-1复方板蓝根颗粒剂0.5g·mL-1地塞米松	1212121212	112465	92％17％*34％50％42％*

注：与生理盐水组比较^*P＜0.05

结果表明，复方板蓝根颗粒剂高剂量组和地塞米松(传统糖皮质激素药)的抗内毒素活性相对于生理盐水组具有显著性差异(P＜0.05)。其能够显著降低ACTD敏化小鼠的死亡率，并延长其生存时间，使之免受内毒素的致死攻击；结果表明复方板蓝根颗粒剂在动物体内也具有拮抗内毒素生物效应的活性，其不同剂量呈量效正相关性。

2.3复方板蓝根颗粒剂对内毒素诱导家兔发热的抑制作用

选择健康家兔，每日测肛温2次，连续3d，使其逐步适应；体温范围应在38.0～39.6℃内，且体温波动不超过0.3℃。根据动物体温预测定结果，筛选出体温合格家兔54只，随机分成9组，每组6只。复方板蓝根颗粒剂(A批为广州白云山和记黄埔中药有限公司GAP药材产品，B批为广州白云山和记黄埔中药有限公司提供的非GAP药材产品、C批为非广州白云山和记黄埔中药有限公司产品)高、中、低剂量组分别按6.0、3.0、1.5g·kg^-1灌胃给予药物，模型组给予同体积蒸馏水，阳性对照组以200mg·kg^-1灌服阿司匹林。除阳性对照组外，其余各组每日给药1次，连续5d。末次给药后1.5h，测定家兔基础体温，共3次，取其均值。1h后，耳缘静脉注射LPS 200ng·kg^-1，于内毒素攻击后0.5、1、2、3、6h测定家兔体温，观察其变化情况，并与基础体温相比较，计算出最大温差(ΔT)、时间体温反应指数(TRI₄，以梯形法求得温度时间曲线下面积)，以TRI₄为依据计算发热抑制百分率。将药物组与模型组进行t检验比较，结果见表4。

表4对内毒素诱导家兔发热效应的影响

组别	剂量(g/kg)	动物数	ΔT(℃)	TRI4	抑制率
						模型组阿司匹林组复方板蓝根A高剂量复方板蓝根A中剂量复方板蓝根A低剂量复方板蓝根B高剂量复方板蓝根B中剂量复方板蓝根B低剂量复方板蓝根C中剂量	0.26.03.01.56.03.01.53.0	666666666	1.14±0.301.07±0.361.02±0.331.06±0.420.87±0.341.05±0.231.13±0.471.28±0.271.05±0.39	3.67±1.202.51±1.441.06±0.84**2.55±1.421.88±1.57*2.85±1.563.39±1.124.21±0.933.12±1.05	/31.64％71.06％30.58％48.90％22.31％7.65％-14.72％15.06％

注：与模型组比较  ^*P＜0.05 ^**P＜0.01

由表4结果，与模型组比较，复方板蓝根颗粒剂A批高、低剂量组能够显著抑制时间体温反应指数TRI₄的急剧升高，降低内毒素致热效应的程度(P＜0.05或P＜0.01)。但是，各组对最大温差ΔT的降低程度与模型组比较未见显著性差异，表明其对内毒素诱导的家兔发热效应的强度无显著性影响。从发热抑制率而言，复方板蓝根颗粒剂B批呈现剂量依赖性抑制内毒素发热效应，而复方板蓝根颗粒剂A批无显著相关性，抑制活性强度为复方板蓝根颗粒剂A批＞复方板蓝根颗粒剂C批＞复方板蓝根颗粒剂B批。

结论：(1)复方板蓝根颗粒剂A批能够显著抑制内毒素诱导的家兔发热效应，其活性强度相对较高；(2)复方板蓝根颗粒剂对于内毒素诱导家兔发热效应的程度(TRI₄)具有一定拮抗效应，但对于其发热强度(ΔT)控制能力稍弱；(3)从抗内毒素效应分析，白云山复方板蓝根不同批次产品间存在一定差异，但其优质产品(复方板蓝根颗粒剂A批)效应强度显著高于市场同类产品。

2.4复方板蓝根颗粒剂对内毒素性DIC家兔肾小球微血栓形成的影响

健康家兔50只，按表5随机分为5组。药物组按10g·mL^-1ig给药，每天2次，连续灌服5d。模型组灌服相同体积复方板蓝根颗粒剂阴性对照溶液。阳性对照组按10mg·kg^-1剂量给予地塞米松，于实验第3d开始给药，连续3d，每天2次。第4d除正常对照组外，各组动物均间隔24h静脉注射内毒素两次，剂量分别为15μg·kg^-1、35μg·kg^-1，复制DIC模型。第二次注射内毒素后12h，处死动物，取右肾固定于100mL·L^-1福尔马林溶液中。将固定好的肾组织切片，作Mallary纤维素染色，行光镜检查，按Latour氏法，每只动物观察50个肾小球，统计含微血栓肾小球数；同时将每个肾小球分为8个象限，计算含微血栓密度。计算结果用t检验处理，结果见表5。

表5对内毒素性DIC家兔肾小球微血栓形成的影响

组别	DIC发生率	含微血栓肾小球的形成百分率	肾小球含微血栓的密度
				模型组复方板蓝根颗粒剂0.5g·mL-1复方板蓝根颗粒剂2.0g·mL-1地塞米松正常对照组	80.0％40.0％50.0％25.0％0％	75.0±4.650.4±3.7*63.9±9.1*42.2±6.5**0	73.2±10.853.4±12.667.5±14.348±6.20

注：与模型组比较  ^*P＜0.05 ^**P＜0.01

结果表明，复方板蓝根颗粒剂能有效降低内毒素性DIC家兔肾小球微血栓形成百分率，与模型组比较具有统计学差异，且具有一定量效依赖性，但其效果尚不如阳性对照药地塞米松，故对于所形成肾小球微血栓的密度无实质性改变。

(三)复方板蓝根颗粒剂抗内毒素活性部位的作用机制研究

1.材料和仪器

1.1药材  复方板蓝根颗粒剂(广州白云山和记黄埔中药有限公司，为GAP产品，批号20070415)，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏水中，依次配制成浓度为2、1、0.5g·mL^-1的水溶液，封存于安瓿中，流通蒸汽灭菌0.5h，作为供试品溶液。

1.2试剂  脂多糖(LPS，E.Coli O₂₆B₆，5mg/支，批号69H4022，Sigma公司)；卡介苗(BCG，50mg/支，上海生物制品研究所，批号990901，使用前用注射用水稀释成5mL)；moesin mRNA原位杂交试剂盒(武汉博士德生物公司)，多聚甲醛(天津科密欧化学试剂有限公司)。小牛血清(上海浦东开发区兽医站)；γ-³²P-ATP(Dupont公司)；P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)多克隆抗体(Sigma公司)；髓磷脂碱性蛋白(MBP，Sigma公司)；其他试剂为分析纯。

1.3动物：KM小鼠18～20g，♀♂各半，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。BALB/C小鼠，♀，14-19g，由华中科技大学同济医学院器官移植研究所提供。

1.4仪器：MK₃型酶联免疫检测仪(Labsystern Dragon公司)；1815TC型CO₂培养箱(Shel-Lab公司)；液体闪烁仪(Labsystern Dragon公司)

2.方法与结果

2.1复方板蓝根颗粒剂对内毒素诱导P38MAPK活性的影响

(1)单核细胞液的制备

取卡介苗粉针(BCG50mg)，加入无菌生理盐水5mL溶解，使之浓度为10mg/mL，按100mg/kg剂量腹腔注射卡介苗，饲养7d后，将30只经BCG敏化的BALB/C小鼠，随机分为5组，每组6只，用乙醚麻醉后，取出腹腔液，1500rpm离心，弃去上清，用Hank’s液充分洗涤3次，每次5min，弃去上清液，用DMEM细胞培养液调单核细胞浓度为5×10⁶个/mL，转移至60孔培养板中，每份样品平行作2孔，各孔中体积相同，于CO₂培养箱中培养2h。向培养板40个单核细胞液孔中分别加入不同浓度复方板蓝根颗粒剂供试品溶液作为药物组，每组10孔，使其终浓度依次为20、10、5、2.5mg/mL，于CO₂培养箱培养0.5h后，各孔分别加入等体积浓度为100μg/mL LPS溶液，使其终浓度为100μg/mL；阳性对照组的10孔中直接加入LPS液，使其终浓度同样为100μg/mL；阴性对照组10孔中直接加入复方板蓝根颗粒剂供试品溶液，使其终浓度为20mg/mL。各组同时于CO₂培养箱中培养6h。培养后的单核细胞用磷酸盐缓冲液洗涤后进行P38MAPK活性测定。P38MAPK活性以每分钟每毫克蛋白掺入³²P的pmol数(pmol·mg^-1·min^-1)表示，结果见表6。

表6对LPS诱导P38MAPK活性的抑制作用

组别	药液浓度(mg/mL)	LPS终浓度(μg·mL-))	P38MAPK活性(pmol·mg-1·min-1)	抑制率(％)
					药物组阳性对照组阴性对照组	20.010.05.02.5/20.0	100100100100100/	2191.4±337.7**3029.2±405.2**4156.3±370.1*4580.4±544.6*5285.8±308.92089.3±311.1	97.5472.4743.3820.55//

注：经t检验，与阳性组比^*P＜0.05 ^**P＜0.01

结果表明，阳性对照组即内毒素可显著诱导单核细胞P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)活性增加，而经不同浓度的复方板蓝根颗粒剂供试品溶液预处理后的单核细胞，经内毒素诱导作用后，其P38MAPK活性虽然相对阴性对照组有所增加，但与阳性对照组比较，其活性降低程度具有显著性差异，并且P38MAPK活性的降低与复方板蓝根颗粒剂供试药液浓度呈一定的依赖性。

2.2复方板蓝根颗粒剂对内毒素刺激鼠组织moesin mRNA表达的影响

2.2.1组织标本制备

18只小鼠，♀♂各半，随机分为3组，每组6只。实验前一周以100mg/kg剂量腹腔注射卡介苗，实验前12h禁食不禁水，药物组分别按5g/kg剂量ig给予复方板蓝根颗粒供试品溶液，正常组和模型组给予等体积的生理氯化钠溶液。30min后，药物组、模型组的小鼠均按40μg/kg剂量尾静脉注射内毒素，9h后乙醚麻醉，处死后取其肝、脾、肾组织，立即用4％多聚甲醛固定，备用。按常规操作，作moesin mRNA原位杂交，用苏木素复染，充分水洗。以酒精脱水，

二甲苯透明，封片。镜下观察胞浆着色呈棕黄色者为阳性。

2.1.2统计学分析

图像分析采用北航医学图像处理系统给予原位杂交显色强度计分。计量资料用t检验，计数资料用χ²检验，结果见表7。

表7对内毒素刺激小鼠肝、脾、肾内moesin mRNA表达的影响

组别	肝	肾	脾	平均值(分)	抑制率(％)
						正常组模型组药物组	18.5±0.5128.2±10.124.1±15.3*	10.7±3.3123.9±25.420.8±12.7*	6.3±0.488.5±12.110.4±4.2*	12.3±5.4113.6±30.415.4±7.4*	93.6

注：与模型组相比，^*P＜0.05

结果表明，与内毒素模型组比较，5g/kg剂量的复方板蓝根颗粒剂可抑制LPS刺激小鼠各重要组织的moesin mRNA表达，具有统计学差异，且对于不同组织的抑制程度有所差异。

(四)针对炎性细胞因子、氧自由基等设计的药效学试验

1.材料和仪器

1.1药材  复方板蓝根颗粒剂(广州白云山和记黄埔中药有限公司，为GAP产品，批号20070415)，实验前粉碎，过100目筛，溶于新鲜蒸馏水中，配制成浓度为0.5g·mL^-1的水溶液，封存于安瓿中，流通蒸汽灭菌0.5h，作为供试品溶液，备用。

1.2细胞及动物  HL-60细胞株，由华中科技大学同济医学院分子生物学开放实验室提供。KM小鼠18～20g，♀♂各半，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证编号为(鄂)医动字第19-024号。

1.3试剂  脂多糖(LPS，5mg/支，Sigma公司，批号：111K4078)；新生小牛血清(NBS，华美生物工程公司，批号：030306)；噻唑蓝(MTT，Duchefa公司，批号：021208A)；RPMI-1640细胞培养液(Gibco公司，批号：021217)；TNF-α试剂盒(北京邦定泰克生物有限公司)；IL-8试剂盒(Sigma公司，批号：022101-A)。卡介苗(BCG，50mg/支，上海生物制品研究所，批号990901，使用前用注射用水稀释成5mL)；N-1萘乙二胺盐酸盐(分析纯，天津化学试剂研究所)；NaNO2(西德，湖北大学化工厂分装)；对氨基苯磺胺(分析纯，北京芳草医药化工研究公司)。

1.4仪器  Model 450酶标仪(Bio-Rad公司)；MCO-17AC型CO₂培养箱(三洋公司)；XW-80型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；UV-265FW型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；LD4-2A型医用离心机(北京医用离心机厂)；MK3型酶联免疫检测仪(LabsysternDragon公司)；1815TC型CO2培养箱(Shel-Lab公司)；SF-542型低温冰箱(德国西门子公司)。

2.方法与结果

2.1复方板蓝根颗粒剂对于炎性细胞因子的影响

2.1.1对内毒素致HL-60细胞释放TNF-α和IL-8的影响

取2×10⁵cell·mL^-1浓度的HL-60细胞溶液，1μg·mL^-1浓度的LPS溶液和8.00mg·mL^-1浓度供试药液，按以下三种方式进行处理：①供试液与LPS同时处理组(C组)：药液和LPS同时加入细胞溶液中；②LPS预刺激组(D组)：LPS处理HL-60细胞1h后加入药液；③供试液预刺激组(E组)：药液与细胞共育1h后加入LPS。另设只含细胞溶液的空白对照组(A组)和仅用LPS处理的LPS刺激组(B组)，每组设4个复孔。37℃5％CO₂温育24h后收集上清，ELISA法检测TNF-α、IL-8浓度，各药物组测定结果与细胞对照组作t检验比较，结果见表8。

表8三种给药方式对LPS刺激HL-60细胞产生TNF-α、IL-8的影响

组别	TNF-α浓度pg·mL-1	抑制率％	IL-8浓度pg·mL-1	抑制率％
					A组B组C组D组E组	12.35±2.43150.43±33.3627.17±4.87**78.29±13.44**86.36±8.25**	//85.0056.7752.31	43.35±4.45205.50±31.4370.05±9.33**113.43±18.41**130.03±22.75**	//67.1946.7838.98

注：与B组比较 ^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明：在三种情况下，复方板蓝根颗粒剂供试溶液均能显著抑制LPS诱导HL-60细胞过度释放TNF-α、IL-8。其中，供试药液与LPS同时处理(C组，共同作用)时，对HL-60细胞分泌TNF-α、IL-8的抑制作用最强。

2.2复方板蓝根颗粒剂对于氧自由基(LPO、SOD水平)的影响

家兔饲养3d适应后，按表9随机分成4组，每组5只。药物组按20、10g·kg^-1剂量ig给药，模型组及正常对照组给予相同体积的复方板蓝根颗粒剂阴性对照溶液，每日2次，一共5d。于第4d起，除正常对照组外，间隔24h分别于耳缘静脉注射内毒素16μg·kg^-1，30μg·kg^-1以复制DIC家兔模型；正常对照组则静注相同体积的无菌生理盐水，各组于第二次静注后12h经耳中动脉采血3mL，凝固后以3000r·min^-1离心20min，分离得血清，置4℃冰箱内待测。血清样本参照试剂盒说明书进行处理后，LPO含量测定采用硫代巴比妥酸显色法(TBA显色法)，以LPO之代谢终末产物——丙二醛(MDA)μmol·L^-1血清表示。SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法，以亚硝酸盐单位/升(1×10³NU·L^-1)血清表示。所得实验数据按t检验法统计处理，结果见表9。

表9内毒素性DIC家兔血清中MDA和SOD的水平

组别	MDA content/μmol·L-1	SOD activity/1×103NU·L-1
			模型组复方板蓝根颗粒剂1.0g·mL-1复方板蓝根颗粒剂2.0g·mL-1正常对照组	5.57±0.594.07±0.64**3.46±0.52**3.09±0.45**	85.56±10.45103.22±9.89*93.65±7.98*113.16±9.78**

注：与DIC组比较，^**P＜0.01 ^*P＜0.05

结果表明，复方板蓝根颗粒剂高、低剂量组可以显著降低内毒素性DIC家兔血清中MDA的含量，升高其血清SOD活力，与DIC组比较有显著性差异。同时，两药物组的MDA和SOD水平与正常对照组比较均无显著差别(P＞0.05)，表明其具有抑制内毒素大量释放氧自由基作用，保护机体组织受损。

2.1.2对内毒素致小鼠血清中NO和TNF-α释放的影响

取30只小鼠，按100mg/kg剂量ip卡介苗0.2mL，按常规饲养10d。实验前12h禁食不禁水，将小鼠随机分为3组，每组10只。药物组分别按5g/kg、2.5g/kg、1.25g/kg剂量ig给予复方板蓝根颗粒剂供试药液，正常组和模型组给予等体积的生理盐水。给药后0.5h，药物组和模型组按40μg/kg剂量分别于小鼠尾静脉iv LPS，9h后将小鼠乙醚麻醉，眼眶内取血，离心后取其血清，于低温冰箱内-20℃贮存，备用。TNF-α检测采用ELISA法，NO的含量测定采用Griess试剂法。小鼠经不同剂量的复方板蓝根颗粒剂供试溶液处理后再给予同等剂量LPS，其血清中TNF-α和NO浓度及抑制百分率见表10。

表10对LPS致小鼠血清TNF-α和NO的影响

组别	剂量(g/kg)	TNF-α(pg·mL-1)	抑制百分率(％)	NO(μg·mL-1)	抑制百分率(％)
						正常组药物组模型组	-5.02.51.25-	39.8±11.9**158.7±17.3**268.3±13.6*599.1±71.2753.7±200.7	-82.5666.5821.45-	7.1±3.3**8.1±1.7**27.9±11.5*61.9±8.978.1±27.2	-95.4372.5621.32-

注：与模型组比较：^*P＜0.05  ^**P＜0.01

结果表明，复方板蓝根颗粒剂对内毒素诱导小鼠体内释放TNF-α和NO具有显著的抑制作用，并且其抑制率在1.25～5.0g/kg范围内呈剂量依赖性。

总之，上述研究实验显示复方板蓝根颗粒具有广泛的体内外抗内毒素活性——它能够直接中和、降解内毒素，在电镜下使之网状结构解聚或碎裂崩解，破坏其正常结构；体外鲎试验表明可降低内毒素的总量，使其与鲎试剂反应水平降低；在体内可显著拮抗内毒素导致的DIC生物效应，降低重要器官组织的血栓形成率；抑制内毒素所致家兔发热效应以及对ACTD、D-GalN敏化小鼠内毒素致死攻击具有显著的保护作用。同时，在对复方板蓝根颗粒剂作用机制研究方面，结果表明其可以抑制内毒素刺激小鼠各重要组织膜结构伸展刺突蛋白(moesin)mRNA的表达，减轻内毒素诱导鼠体p38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)活性升高的程度。因此，相对于直接抗病原体、抗炎作用，复方板蓝根抗内毒素活性才是其清热解毒的重要途径。

另外，复方板蓝根颗粒剂可以抑制内毒素诱导的炎症介质(TNF-α、IL-6、IL-8、NO等)合成与释放，阻滞其级联反应，有利于控制过度的炎性反应，从而有效地控制病情，降低病死率。在拮抗氧自由基方面，复方板蓝根颗粒剂通过降低内毒素性DIC家兔血清中过氧化脂质(LPO)水平、升高超氧化物歧化酶(SOD)等氧自由基清除酶活性，提高了机体对氧自由基的清除能力，减轻了机体遭受自由基攻击所致损伤。

据研究，大青叶IV部位具有显著的体内外抗内毒素活性，可以确认为大青叶主要的抗内毒素活性部位。其药理活性强度与之所含的有机酸类、氨基酸类等化学成分密切相关。这些活性成分通过直接灭活细菌内毒素、抑制其毒性生物效应或者增强机体免疫机能抵御毒素侵袭从而发挥持久且有益的抗内毒素作用，

由此可见，复方板蓝根颗粒剂具有内毒素-炎症细胞因子-氧自由基兼治的特色，将其应用于防治内毒素血症的临床实践，具备了良好的应用基础和前景，有利于为内毒素所致感染性疾病的中医药防治提供新型有力的武器。

Claims (2)

1.一种由板蓝根及大青叶组成的复方板蓝根制剂在制备防治内毒素血症药物中的应用，其特征在于所述板蓝根是由下述方法栽培得到的菘蓝的根：

(1)选地与整地：选择三年或以上未种植过板蓝根的沙壤地，深翻25～35厘米，每亩施用腐熟的堆肥或厩肥1500～2000千克，或每亩施入腐植酸生物有机肥100～120千克，然后耙细、整平，做成畦；

(2)育苗：先将菘蓝种子用40℃～50℃质量浓度为2～4％的高锰酸钾浸种11～13小时，捞出晒干后拌细沙或草木灰撒播，撒播后覆盖3～5cm的土；

(3)田间管理：在苗高6～10cm时进行间苗和补苗，同时进行中耕除草，封行后禁止除草；干旱及时浇水，雨季应注意清沟排水，防止畦间积水烂根和感染病害；生长过程中施药防治病虫害；生长期追施有机肥1～3次；

(4)、采收与加工：在菘蓝种植当年的11月份采收大青叶，在采收大青叶后7～14天挖根，去净芦头和泥土，进行晒干。

2.如权利要求1所述的复方板蓝根制剂在制备防治内毒素血症药物中的应用，其特征在于：所述制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、茶剂或注射剂。