CN103610690A

CN103610690A - 一种羽藻多糖的应用

Info

Publication number: CN103610690A
Application number: CN201310663943.8A
Authority: CN
Inventors: 王晶; 张全斌; 张虹; 牛锡珍
Original assignee: NANTONG OCEAN SCIENCE AND TECHNOLOGY RESEARCH DEVELOPMENT CENTER INSTITUTE OF OCEANOLOGY CHINESE ACADEMY OF SCIENCES; Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: NANTONG OCEAN SCIENCE AND TECHNOLOGY RESEARCH DEVELOPMENT CENTER INSTITUTE OF OCEANOLOGY CHINESE ACADEMY OF SCIENCES; Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2033-12-10
Also published as: CN103610690B

Abstract

本发明提供了一种羽藻多糖在抗补体药物中的应用。所述羽藻多糖具有补体活性，所述羽藻多糖的应用是指具有补体活性的羽藻多糖在制备抗补体药物或/和抗补体保健品中的应用。本发明首次发现羽藻多糖对经典途径和旁路途径补体活性有显著的抑制作用，并公开了将羽藻多糖应用于制备抗补体药物和保健品，能够抑制补体系统的过度激活，从而对由于补体系统过度激活而导致的统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病有一定的预防和治疗作用。

Description

一种羽藻多糖的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有补体活性的羽藻多糖的应用。

背景技术

补体系统是人体重要的免疫防御系统之一，在消灭外来微生物、维持机体的平衡等生理过程中起着重要作用。抑制补体系统的过度激活对统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病有一定的预防和治疗作用。目前对此类疾病尚无理想的治疗药物，因此临床上急需高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。

海洋是地球上所占面积最大的区域，因此开发海洋药物越来越受到重视，而海洋物质提取在制备和开发抗补体药物和保健品方面有着不可估计的社会和经济效益。

藓羽藻(Bryopsis hypnoides)是一种多核单细胞绿藻，属于绿藻门，绿藻纲，羽藻目，羽藻科，是单细胞而且多核的大型绿藻，每单株羽藻中都有大量的原生质体和数个细胞核，实验结果显示单株羽藻挤出的原生质体可以团聚形成数个团聚体，这些团聚体可以以较高的成活率发育成新的羽藻个体。对羽藻的研究主要集中在其叶绿体基因、原生质体以及组织培养方面，而对于羽藻的营养成分以及羽藻多糖的研究还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种具有补体活性的羽藻多糖在制备抗补体药物和保健品中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种羽藻多糖的应用，所述羽藻多糖具有补体活性，所述羽藻多糖的应用是指具有补体活性的羽藻多糖在制备抗补体药物或/和抗补体保健品中的应用。

其中，所述的羽藻多糖分子量范围为5~350kD。

其中，所述的羽藻多糖主要组成单糖为半乳糖、阿拉伯糖，两者的摩尔比例为1~3：1，硫酸基含量为5%~35%。

其中，所述羽藻多糖按照以下方法制备：采用热水提取法提取，过滤，将提取液透析脱盐，将透析截留液浓缩，将浓缩液喷雾干燥、冷冻干燥或乙醇沉淀法制得羽藻多糖。

其中，所述的羽藻多糖来源于绿藻门，绿藻纲，羽藻目，羽藻科。

本发明公开了所述羽藻多糖通过经典途径或旁路途径进行抗补体活性测定有显著的抗补体活性。

上述经典途径测定抗补体活性的方法是：取100 μL 用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 样品液加入试管；再加入100 μL 以葡萄糖明胶巴比妥缓冲盐水按1：100稀释的正常豚鼠血清和100 μL 致敏的绵羊红细胞(5×10⁸ 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1 mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值。

上述替代途径测定抗补体活性的方法是：取100μL 用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 的样品液加入试管；再加入等体积用GVB-Mg-EGTA(2×) 缓冲液( 含5 mMC巴比妥钠，0.14 mol/LNaCl，0.1％明胶，4 mmol/L 氯化镁，16 mmol/L EGTA，pH 7.4)，按1:2稀释的正常豚鼠血清和100 μL 兔红细胞悬液(1.5×10⁸ 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1 mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；

采用上述方法对羽藻多糖进行抗补体活性测定，得到以下结果：羽藻多糖经典途径抗补体活性的CH₅₀值是0.0018-0.0109 mg/mL，与阳性药肝素0.0206 mg/mL 相比，表现出非常好的抗补体活性；旁路途径抗补体活性的AP₅₀ 值是0.0065-0.0855 mg/mL，比阳性药肝素0.0887 mg/mL 的活性强。

本发明首次发现羽藻多糖对经典途径和旁路途径补体活性有显著的抑制作用，并公开了将羽藻多糖应用于制备抗补体药物和保健品，能够抑制补体系统的过度激活，从而对由于补体系统过度激活而导致的统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病有一定的预防和治疗作用。

附图说明

图1羽藻多糖经典途径的抗补体活性。其结果以平均值 ±SD表示。

图2羽藻多糖旁路途径的抗补体活性。其结果以平均值 ±SD表示。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

实施例1，藓羽藻(Bryopsis hypnoides)多糖（BF）的制备

取藓羽藻干品50g，用2000mL 自来水在高压锅中于115℃提取3 小时，筛绢过滤分离藻渣，硅藻土助滤，过滤提取液，滤液浓缩后装入截留分子量为3500 Da的透析袋中透析，自来水透析48 小时，蒸馏水透析24 小时，浓缩至小体积后冷冻干燥，即得水提取的羽藻多糖样品(BF)，得率为0.75%。

BF的化学组分分析、单糖比例分析、硫酸根含量、分子量测定结果见表1。IR谱图结果表明BF为硫酸多糖在1242 cm^-1和845 cm^-1左右出现硫酸基特征吸收峰。其单糖组成主要是半乳糖和阿拉伯糖，还有岩藻糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖。

实施例2，极大羽藻(Bryopsis maxima)多糖（MF）的制备

取极大羽藻干品50g，用2000mL 自来水在高压锅中于115℃提取3 小时，筛绢过滤分离藻渣，硅藻土助滤，过滤提取液，滤液浓缩后装入截留分子量为3500 Da的透析袋中透析，自来水透析48 小时，蒸馏水透析24 小时，浓缩至小体积后冷冻干燥，即得水提取的羽藻多糖样品(MF)，得率为1.33%。

MF的化学组分分析、单糖比例分析、硫酸根含量、分子量测定结果见表1。IR谱图结果表明MF为硫酸多糖在1246 cm^-1和843 cm^-1左右出现硫酸基特征吸收峰。其单糖组成主要是半乳糖和阿拉伯糖，还有岩藻糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖。

实施例3，假根羽藻(Bryopsis corticulans)多糖（CF）的制备

取假根羽藻干品50g，用2000mL 自来水在高压锅中于115℃提取3 小时，筛绢过滤分离藻渣，硅藻土助滤，过滤提取液，滤液浓缩后装入截留分子量为3500 Da的透析袋中透析，自来水透析48 小时，蒸馏水透析24 小时，浓缩至小体积后冷冻干燥，即得水提取的羽藻多糖样品(CF)，得率为2.33%。

CF的化学组分分析、单糖比例分析、硫酸根含量、分子量测定结果见表1。IR谱图结果表明CF为硫酸多糖，在1243 cm^-1和844 cm^-1左右出现硫酸基特征吸收峰。其单糖组成主要是半乳糖和阿拉伯糖，还有岩藻糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖。

表1. 羽藻多糖的化学分析

实验例4，实施例1、2和3中的BF、MF、CF样品经典途径的抗补体活性作用

本试验通过经典途径抗补体活性来反映样品对补体作用大小，来说明其在抗补体活性方面的作用。

测试样品：实施例1、2和3中的羽藻多糖BF、MF、CF

试验方法：取100 μL 用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 样品液加入试管；再加入100 μL 以葡萄糖明胶巴比妥缓冲盐水按1：100稀释的正常豚鼠血清和100 μL 致敏的绵羊红细胞(5×10⁸ 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1 mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。

结果：上述经典途径测定结果显示（图1），羽藻多糖在低浓度时就表现出对于补体溶血活性的良好抑制作用，BF、MF和CF的CH₅₀值（血清总补体50%溶血活性）分别为0.0109、0.0018、0.0042 mg/mL，与对照品阳性药肝素CH₅₀值为0.0206 mg/mL相比，本实验样品的CH₅₀值远远低于阳性对照样品肝素，说明羽藻多糖在较低浓度时即具有抗补体作用。随着羽藻多糖浓度的增大，BF、MF和CF的抑制作用还有所增加。

实施例5，实施例1、2和3 中BF、MF、CF样品旁路途径的抗补体活性作用

本试验通过旁路途径抗补体活性来反映样品对补体作用大小，来说明其在抗补体活性方面的作用。

测试样品：实施例1、2和3中的羽藻多糖BF、MF、CF

试验方法：取100μL 用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 的样品液加入试管；再加入等体积用GVB-Mg-EGTA(2×) 缓冲液( 含5 mMC巴比妥钠，0.14 mol/LNaCl，0.1％明胶，4 mmol/L 氯化镁，16 mmol/L EGTA，pH 7.4)，按1:2稀释的正常豚鼠血清和100 μL 兔红细胞悬液(1.5×10⁸ 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1 mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。

结果：如图2所示，羽藻多糖在低浓度时就表现出对于旁路途径补体溶血活性的良好抑制作用，BF、MF和CF的AP₅₀ 值（旁路途径50%溶血活性）分别为0.0855、0.0065、0.0275 mg/mL，与对照品阳性药肝素AP₅₀ 值为0.0887 mg/mL相比，本实验样品的AP₅₀ 值远远低于阳性对照样品肝素，说明羽藻多糖在较低浓度时即具有抗补体作用。随着羽藻多糖浓度的增大，BF、MF和CF的抑制作用还有所增加。

经典途径和旁路途径补体溶血活性的测定是最常用的两种测定样品抗补体活性的模型，羽藻多糖对这两种途径的补体溶血活性具有明显的抑制作用，表明它可以用于抗补体药物和保健品的制备。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1. 一种羽藻多糖的应用，其特征在于，所述羽藻多糖具有补体活性，所述羽藻多糖的应用是指具有补体活性的羽藻多糖在制备抗补体药物或/和抗补体保健品中的应用。

2. 根据权利要求1所述羽藻多糖的应用，其特征在于，所述的羽藻多糖分子量范围为5~350kD。

3. 根据权利要求1所述羽藻多糖的应用，其特征在于，所述的羽藻多糖主要组成单糖为半乳糖、阿拉伯糖，两者的摩尔比例为1~3：1，硫酸基含量为5%~35%。

4. 根据权利要求1所述羽藻多糖的应用，其特征在于，所述羽藻多糖按照以下方法制备：采用热水提取法提取，过滤，将提取液透析脱盐，将透析截留液浓缩，将浓缩液喷雾干燥、冷冻干燥或乙醇沉淀法制得羽藻多糖。

5. 根据权利要求4所述羽藻多糖的应用，其特征在于：所述的羽藻多糖来源于绿藻门，绿藻纲，羽藻目，羽藻科。