CN103601799B - 亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法，包括以下步骤：（1）、获取重组蛋白Htt（1‑90）：a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWIN1‑htt的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α‑htt的构建；d、重组蛋白的表达；（2）、重组蛋白Htt（1‑90）的纯化；（3）、SPPS方法获得磷酸化修饰的Htt（Cys‑K92‑K158）多肽；（4）Htt（Cys‑K92‑K158）多肽的纯化；（5）Htt（Cys‑K92‑K158）多肽与重组蛋白Htt（1‑90）经过偶联获得经磷酸化修饰目的蛋白Htt（1‑158）；（6）经磷酸化修饰目的蛋白Htt（1‑158）的纯化。经磷酸化修饰后的亨廷顿蛋白的凝聚性降低，凝聚时间、凝聚后的长度和高度都有所改善，明显延缓了蛋白质的凝聚性，很好的阻碍了亨廷顿蛋白对神经细胞的毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质的化学修饰，具体涉及一种亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法。
背景技术
蛋白质修饰是一个复杂的过程，在真核生物中修饰类型很多，常见的有糖基化、乙酰化、泛素化、磷酸化和SUMO化，蛋白质修饰能够改变蛋白质的活性、定位或功能。蛋白质的磷酸化作为蛋白质翻译后修饰的重要方式，是调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍也是最重要的机制。蛋白质的磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(Thr)和色氨酸(Ser)，另一种是酪氨酸。蛋白质的磷酸化影响蛋白质的折叠和凝聚，从而影响其三级结构，进而影响蛋白质的功能，尤其是对一些激酶(多是磷酸化蛋白)。因此研究蛋白质的磷酸化对人类生命健康有重要的意义。
亨廷顿舞蹈病(Huntington disease，HD)是一种常染色体显性遗传的神经变性疾病，HD基因编码一个由3144个氨基酸组成的亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)，从Htt氨基酸末端第17位开始有一段重复的谷氨酰胺(CAG)序列。CAG重复序列将产生两个直接结果：一是使野生型亨廷顿蛋白(wild huntingtin，wHtt)缺失，二是产生突变型亨廷顿蛋白(mutant Htt，mHtt)。随着多聚谷氨酰胺的过度延长，Htt蛋白会在转谷氨酰胺酶的作用下发生交联而形成聚集体，在主链和侧链酰胺基之间氢键连接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，称为多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ长度小于35个，而HD患者的PolyQ长度会超过37个。这些异常蛋白质积聚成块，损坏部分脑细胞，特别是那些与肌肉控制有关的细胞，导致患者神经系统逐渐退化，神经冲动弥散，动作失调，出现不可控制的颤搐，并能发展成痴呆，甚至死亡。临床表现主要为舞蹈样不自主动作、精神障碍和进行性痴呆。
没有修饰的亨廷顿蛋白显示出比较容易凝聚等，目前国内还没有研究所或者机构对亨廷顿蛋白进行化学修饰。通过对亨廷顿蛋白磷酸化化学修饰显示出蛋白的凝聚性降低，凝聚时间、凝聚后的长度和高度都有所改善，明显延缓了蛋白质的凝聚性，很好的阻碍了亨廷顿蛋白对神经细胞的毒副作用。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种亨廷顿蛋白的磷酸修饰方法，通过对亨廷顿蛋白的磷酸化化学修饰，显示出经磷酸化修饰后的亨廷顿蛋白的凝聚性降低，凝聚时间、凝聚后的长度和高度都有所改善，明显延缓了蛋白质的凝聚性，很好的阻碍了亨廷顿蛋白对神经细胞的毒副作用。
本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法，包括以下步骤：(1)、获取重组蛋白Htt(1-90)：a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWIN1-htt的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α-htt的构建；d、重组蛋白的表达；(2)、重组蛋白Htt(1-90)的纯化；(3)、SPPS方法获得磷酸化修饰的Htt(Cys-K92-K158)多肽；(4)Htt(Cys-K92-K158)多肽的纯化；(5)Htt(Cys-K92-K158)多肽与重组蛋白Htt(1-90)经过偶联获得经磷酸化修饰目的蛋白Htt(1-158)；(6)经磷酸化修饰目的蛋白Htt(1-158)的纯化。
作为优选，所述步骤(1)中：a、亨廷顿蛋白基因的获得：以质粒pcDNA3.1/myc-His为模板，设计合成含有EcoR I和Pst I限制酶切位点的上下游引物P1和P2，PCR扩增htt基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收，纯化处理后与载体pMD18-T连接，转入大肠杆菌JM109中，通过氨苄青霉素抗性筛选，得到重组质粒pMD18T-htt，送至上海生工生物工程有限公司测序。将验证后的重组质粒用EcoR I和Pst I双酶切处理，酶切产物纯化处理后置4℃冰箱保存；b、重组表达质粒pTWIN1-htt的构建：将原核表达载体pTWIN1用限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切，纯化处理后将线性pTWIN1质粒片段和htt基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定，得到重组质粒pTWIN1-htt；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α-htt的构建：用电转化法将重组质粒pTWIN1-htt转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，得到重组菌DH5α-htt。
将重组菌DH5α-htt接种至LB液体培养基，置37℃摇床过夜培养。吸取过夜培养菌体以5％接种量接种LB液体培养基，37℃摇床培养至OD600＝0.5～0.7，然后置20℃摇床培养加入1mmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白4～6h，离心收集菌体。在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L pH＝8.3的溶液中进行超声破碎。通过离心(23000×g，30min，40℃)将细胞碎片和上清液分离开来。粗Htt(1-90)多肽纯度为60％。
进一步地，所述的步骤(3)中合成Htt(Cys-K92-K158)多肽的过程分为三个片段合成：a、首先合成Cys-K92-I108片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；c、最后合成Cys-S138-K158片段；d、每个片段通过自然化学连接NCL或EPL方法连接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽。
进一步地，所述步骤(3)中磷酸化修饰位于亨廷顿外显子2或外显子3区域，即S95位点、T97位点、T107位点、S116位点、S120位点、S138位点和S143位点中的至少一个位点。
进一步地，合成Cys-K92-I108片段所用的固相载体是wang－树脂。
进一步地，合成Cys-E110-L136片段和Cys-S138-K158片段所用的固相载体是N-酰基-苯并咪唑酮树脂。
经磷酸化修饰的亨廷顿蛋白与野生型亨廷顿蛋白比较，具有以下优点：野生型亨廷顿蛋白的纤维聚集速度远大于经磷酸化修饰过的Htt1-158蛋白，即说明磷酸化修饰Htt1-158能够明显抑制蛋白质的凝聚；经磷酸化修饰后的亨廷顿凝聚时间、凝聚后的长度和高度都有所改善，明显延缓了蛋白质的凝聚性，很好的阻碍了亨廷顿蛋白对神经细胞的毒副作用。
附图说明
图1为获得Htt1-90重组蛋白的流程图；
图2为SPPS方法获得磷酸化的Htt(Cys-K92-K158)蛋白流程图；
图3为经磷酸化修饰目的蛋白Htt(1-158)的合成流程图；
图4：A为HttCys-K92-K158蛋白序列和合成片段；
B为Htt(Cys-K92-K158)多肽磷酸化修饰位点；
图5为TEM对野生型和修饰型Htt(1-158)蛋白凝聚反应检测；
图6为AFM对野生型和修饰型Htt(1-158)蛋白聚集反应检测；
图7所示：表示的是野生型和磷酸化修饰后的Htt蛋白的平均高度(左图)和长度(右图)分布情况；
图8表示的是HttWT和磷酸化修饰后的Htt1-158经过1h的培养，纤维物质的高度和直径数目比较情况；
图9表示的是野生型Htt-WT和磷酸化修饰后的Htt1-158经过7D的培养，纤维物质的高度和直径数目比较情况。
具体实施例
实施例1：获得重组蛋白Htt1-90
一)试验材料
(1)载体和菌株
质粒pcDNA3.1/myc-His由CHDI惠赠；表达载体pTWIN1购自NEB公司；质粒pMD18-T和大肠杆菌JM109、DH5α购自Takara生物科技有限公司。
(2)引物
P1：5-CCGGAATTCCTGCCGTGCC-3(EcoR I)
P2：5-AAAACTGCAGACAGCCGGGC-3(Pst I)
由上海生工生物工程有限公司合成。
二)实施方案
1.亨廷顿蛋白基因的获得
以质粒pcDNA3.1/myc-His为模板，设计合成含有EcoR I和Pst I限制酶切位点的上下游引物P1和P2，PCR扩增htt基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收，纯化处理后与载体pMD18-T连接，转入大肠杆菌JM109中，通过氨苄青霉素抗性筛选，得到重组质粒pMD18T-htt，送至上海生工生物工程有限公司测序。将验证后的重组质粒用EcoR I和Pst I双酶切处理，酶切产物纯化处理后置4℃冰箱保存。
2.重组表达质粒pTWIN1-htt的构建
将原核表达载体pTWIN1用限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切，纯化处理后将线性pTWIN1质粒片段和htt基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定，得到重组质粒pTWIN1-htt。
3.表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株的构建
采用电转化法将重组质粒pTWIN1-htt转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，得到重组菌DH5α-htt。
将重组菌DH5α-htt接种至LB液体培养基，置37℃摇床过夜培养。吸取过夜培养菌体以5％接种量接种LB液体培养基，37℃摇床培养至OD600＝0.5～0.7，然后置20℃摇床培养加入1mmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白4～6h，离心收集菌体。在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L pH＝8.3的溶液中进行超声破碎。通过离心(23000×g，30min，40℃)将细胞碎片和上清液分离开来。粗多肽纯度为60％。获得重组蛋白Htt1-90操作示意图如图1所示。
实施例2：重组蛋白Htt(1-90)的纯化
Htt1-90-intein-CBD融合蛋白中CBD成分可与几丁质树脂特异结合，从而便于去除杂蛋白，随后intein成分在一定条件下催化融合蛋白在htt1-90和intein之间发生断裂。
具体操作如下：将上清液上样于2ml几丁质重力柱。柱子先经过A液(Na-HEPES(pH8.0)20mmol/L，NaCl 500mmol/L，EDTA 1mmol/L)进行平衡，上清液上样后，再以A液洗脱。然后柱子在B液(Na-HEPES(pH8.0)20mmol/L，NaCl 500mmol/L，EDTA1mmol/L，DTT 50mmol/L)中40℃下浸泡16h。C液(Na-HEPES(pH8.0)20mmol/L，NaCl 500mmol/L)洗脱蛋白，每1ml收集。将每步收集到的样品进行SDS-PAGE分析，鉴定蛋白质的纯度是90％。
洗脱蛋白溶液中加入含有0.25mmol/L pH7.8MESNA的溶液，室温摇床切割3次，每次24h。收集切割液加1倍体积的HEPES Buffer慢速冲洗柱子，合并二次洗脱液，最后一次切割液加压吹干并回收树脂。将蛋白洗脱液移至超滤管，10000r/min离心15-30min，超滤至1.5ml时移液枪转移上层蛋白液，得到纯度为99％的重组多肽2g，-4℃冻存。
实施例3：SPPS方法获得位于S95位点磷酸化修饰的Htt(Cys-K92-K158)多肽本合成过程分为三个片段，首先合成Cys-S138-K158片段；再合成Cys-E110-L136片段；最后合成Cys-K92-I108片段；每个片段通过自然化学连接NCL或EPL方法连接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽。
固相肽的合成是在CS336X的多肽合成仪上进行的，Cys-S138-K158多肽的合成是基于Wang树脂。树脂的去保护和解聚在(TFA/DCM/H2O/TIPS 90/5/2.5/2.5)溶液中能够自发进行。然后通过10倍当量的冷乙醚对其沉淀，这些原始多肽通过反相HPLC进行纯化，使用waters 600泵和waters 2489紫外/可见光检测器，柱子采用GRACE-Vydac 218TP54C18柱。流动相A是0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B是0.1％三氟乙酸乙腈溶液，多肽的检测波长是214nm和234nm。多肽的质量通过MALDI-TOF-MS和ESI-MSF分析。最终得到18mg、纯度为99％的Cys-S138-K158多肽，产率为50％。
Cys-E110-L136多肽合成基于NBZ树脂，在多肽的C端产生一个NBZ衍生结构方便进行NCL反应。NBZ树脂最初的制备是通过氨基酸化的MBHA树脂和去保护的Fmoc与5倍当量的Di-Fmoc-3，4二氨基苯甲酸偶联得到的。多肽的延长通过Fmoc保护的氨基酸，当DIPEA浓度达到0.5mol/L时，Dbz与4-硝基苯基氯甲酸酯耦合时在分子内形成环状。最后通过键的断裂得到的多肽，合成的多肽N端采用赛唑烷保护，在methoxyamine HCl pH4.0条件下噻唑烷化学键断裂形成巯基。纯化步骤同上。最终得到16mg、纯度为99％的Cys-E110-L136多肽，产率为55％。
Cys-K92-I108合成与E110-L136多肽合成类似，多肽的固态合成基于NBZ树脂，在多肽的C端产生一个NBZ衍生结构方便进行NCL反应。S95位的丝氨酸过羟基先经磷酸化，磷酸基团通过苄基保护，氨基Fmoc保护，通过固肽合成得到K92-I108-pS95多肽。最后合成的多肽在N端赛唑烷保护和C端NBZ衍生结构，在methoxyamine HCl pH4.0条件下噻唑烷化学键断裂形成巯基，纯化步骤同上。最终得到13mg、纯度为99％的Cys-E110-L136多肽，产率为56％。S95位点磷酸化修饰的Htt(Cys-K92-K158)多肽合成示意图如图2所示。
实施例4：位于S95位点经磷酸化修饰的Htt(Cys-K92-K158)多肽的纯化
多肽的鉴定和纯化通过重新注入反相色谱，此时检测器是二极管阵列检测器，流动相同。流动相A是0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B是0.1％三氟乙酸乙腈溶液，多肽的检测波长是214nm和234nm。最终得到7.23mg的HttCys-K92-K158蛋白，产率为15.4％。
实施例5：Htt(Cys-K92-K158)多肽与重组蛋白Htt(1-90)经过偶联获得经磷酸化修饰目的蛋白Htt(1-158)
将重组蛋白Htt1-90和位于S95位点经磷酸化修饰的Htt(Cys-K92-K158)多肽放入缓冲液中，利用巯基和硫酯的特异性反应，再经过由S到N的转变完成肽键的合成。其合成示意图如图3。
实施例6：目的蛋白Htt(1-158)的纯化
NCL反应后的Htt1-158产物通过反相高效液相色谱纯化，纯化柱是COSMOSIL 5C4-AR-300(4.6mm*150mm 5μm)，线性梯度是10-90％，产物洗脱是在55％梯度下，得到产物5.2mg(0.5μmol，33％)，通过MALDI计算产物的分子量。通过超高效液相色谱UPLC评定产物的纯度。
实施例7：野生型和磷酸化修饰的Htt1-158蛋白的凝聚性能比较
样品制备方法：两个样品分别溶解在50μmol的10mmol/LTris 75mmol/L NaCl pH7.4的溶液中，然后100KDa透过膜，37℃去除聚集的培养物。
如图5为TEM对野生型和修饰型Htt1-158蛋白凝聚反应检测，图6为AFM对野生型和修饰型Htt1-158蛋白聚集检测。
结果分析：在第一个小时的培育后，在野生型样品中出现球状聚集体，此时修饰过的Htt1-158仍然只有小的单体；7天后，野生型的单体开始聚集成纤维结构，有明显的纤维状结构出现，但是经过修饰的Htt1-158，培养7天后和培养1h的相比，仍然没有纤维状结构；培养到14天的时候，Htt-WT出现较多的纤维结构，已经看不到单体的存在，经过修饰的Htt1-158开始出现纤维状结构，并且纤维尺寸和培养7天后的Htt-Wt长度相当。这些结果说明Htt-WT纤维聚集的速度远大于修饰过的Htt1-158，说明pS95磷酸化修饰Htt1-158能够明显抑制蛋白质的凝聚。
实施例8：野生型和磷酸化修饰的Htt1-158蛋白的培养结果比较
如图7所示：表示的是野生型和磷酸化修饰后的Htt蛋白的平均高度(左图)和长度(右图)分布情况。
从图7中可以看出：培养14天后的平均高度，野生型的Htt在3.5nm-6nm区间较多，而磷酸化的Htt在1.5nm-3nm之间较多；同时，野生型的长度大于磷酸化的长度，长度小于200nm磷酸化修饰后的Htt比野生型多。说明磷酸化修饰后的Htt明显降低了自身凝聚性。
图8表示的是HttWT和磷酸化修饰后的Htt1-158经过1h的培养，纤维物质的高度和直径数目比较情况。
从图8中可以看出：野生型Htt在1h时，高度没有明显区别，而野生型的Htt直径比磷酸化修饰的直径大，野生型Htt出现直径大约100nm，而磷酸化最大直径没有超过50nm，但是磷酸化修饰的Htt直径小于50nm的直径较多。
图9表示的是野生型Htt-WT和磷酸化修饰后的Htt1-158经过7D的培养，纤维物质的高度和直径数目比较情况。
从图9中可以看出：野生型和磷酸化修饰的Htt经过7天培养后，磷酸化修饰的Htt1-15高度和数目都比野生型大。野生型的Htt直径在50nm以下的数目较少，主要原因是已经形成大于直径150nm的纤维状物质，此时磷酸化的Htt开始出现直径比较大的颗粒型物质，数目较多。
综上所述，经磷酸化修饰的(1-158)能够明显抑制亨廷顿蛋白的凝聚，其抑制速率按照经显微镜纤维长度和直径大小的分析数据，大概在2-5倍左右。
Claims (5)
1.一种亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、获取重组蛋白Htt的1-90片断：a、亨廷顿蛋白基因的获得：以质粒pcDNA3.1/myc-His为模板，设计合成含有EcoR I和Pst I限制酶切位点的上下游引物P1和P2，其中，P1：5-CCGGAATTCCTGCCGTGCC-3，P2：5-AAAACTGCAGACAGCCGGGC-3；b、重组表达质粒pTWIN1-htt的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α-htt的构建；d、重组蛋白的表达；(2)、重组蛋白Htt的1-90片断的纯化；(3)、SPPS方法获得磷酸化修饰的Htt多肽的Cys-K92-K158片断：(4)Htt多肽的Cys-K92-K158片断的纯化；(5)Htt多肽的Cys-K92-K158片断与重组蛋白Htt的1-90片断经过偶联获得经磷酸化修饰目的蛋白Htt的1-158片断；(6)经磷酸化修饰目的蛋白Htt的1-158片断的纯化；所述的步骤(3)中合成Htt多肽Cys-K92-K158片断的过程分为三个片段合成：a、首先合成Cys-S138-K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；c、最后合成Cys-K92-I108片段；d、每个片段通过自然化学连接NCL或EPL方法连接得到Htt多肽的Cys-K92-K158片断。
2.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法，其特征在于，所述步骤(1)中：a、亨廷顿蛋白基因的获得：以质粒pcDNA3.1/myc-His为模板，设计合成含有EcoR I和Pst I限制酶切位点的上下游引物P1和P2，PCR扩增htt基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收，纯化处理后与载体pMD18-T连接，转入大肠杆菌JM109中，通过氨苄青霉素抗性筛选，得到重组质粒pMD18T-htt，送至上海生工生物工程有限公司测序；将验证后的重组质粒用EcoR I和Pst I双酶切处理，酶切产物纯化处理后置4℃冰箱保存；b、重组表达质粒pTWIN1-htt的构建：将原核表达载体pTWIN1用限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切，纯化处理后将线性pTWIN1质粒片段和htt基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定，得到重组质粒pTWIN1-htt；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α-htt的构建：用电转化法将重组质粒pTWIN1-htt转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，得到重组菌DH5α-htt；将重组菌DH5α-htt接种至LB液体培养基，置37℃摇床过夜培养；吸取过夜培养菌体以5％接种量接种LB液体培养基，37℃摇床培养至OD600＝0.5～0.7，然后置20℃摇床培养加入1mmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白4～6h，离心收集菌体；在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L pH＝8.3的溶液中进行超声破碎；通过离心，离心条件为23000×g，30min，40℃，将细胞碎片和上清液分离开来，粗Htt多肽1-90片段纯度为60％。
3.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法，其特征在于，所述步骤(3)中磷酸化修饰位于亨廷顿外显子2或外显子3区域，即S95位点、T97位点、T107位点、S116位 点、S120位点、S138位点和S143位点中的至少一个位点。
4.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法，其特征在于，合成Cys-S138-K158片段所用的固相载体是wang树脂。
5.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的磷酸化修饰方法，其特征在于，合成Cys-E110-L136片段和Cys-K92-I108片段所用的固相载体是N-酰基-苯并咪唑酮树脂。
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| The role of post-translational modifications of huntingtin in the pathogenesis of Huntington’s disease;Yan WANG等;《Neurosci Bull》;20100401;第26卷(第2期);153-162 * |
| 一种亨廷顿舞蹈症体外药物筛选细胞模型的建立;王爱娥等;《中国生物工程杂志》;20061231;第26卷(第10期);18-23 * |
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