CN103599115A - 一种组合物在制备抗癫痫药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和/或冰片组合物在制备抗癫痫药物中的应用，所述组合物由1,6-二磷酸果糖钠盐和果糖组合或由1,6-二磷酸果糖钠盐和冰片组合或由1,6-二磷酸果糖钠、果糖和冰片的组合。本发明组合物可提高1，6-二磷酸果糖在体内的稳定性，从而较长时间维持脑内高水平的1,6-二磷酸果糖，使1,6-二磷酸果糖钠盐可较长时间发挥抗癫痫药效。发明尤其采用咀嚼片、口崩片和分散片作为组合物的抗癫痫药物的剂型，均能在口腔粘膜直接吸收，避免肝脏首过效应，可进一步增加脑中1,6-二磷酸果糖水平，从而可进一步提高药物的抗癫痫药效。

Description

一种组合物在制备抗癫痫药物中的应用

技术领域

本发明属医药领域，涉及一种含1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和冰片的组合物在制备抗癫痫药物中的应用。在此组合物中，1,6-二磷酸果糖钠盐(或称果糖二磷酸钠)为主药，其药效活性部分为1,6-二磷酸果糖，果糖可提高主药1,6-二磷酸果糖在体内的稳定性从而维持较长时间的高水平血药浓度，随之可相应地提高脑内的1,6-二磷酸果糖水平，而可促进血脑屏障开放的冰片能促进血液中1,6-二磷酸果糖进入脑内，从而进一步提高脑内1，6-二磷酸果糖水平。可见，果糖和冰片能通过不同机制提高脑内1，6-二磷酸果糖水平，二者联合对促进主药1,6-二磷酸果糖进入脑内相得益彰，从而进一步增强主药1，6-二磷酸果糖钠的治疗癫痫的药效。

背景技术

癫痫是一种常见的反复发作的世界性疑难疾病。据世界卫生组织最新统计，全世界范围内大约有五千万人为癫痫病患者。常用的抗癫痫药物按照结构可分为六类：①乙内酰脲类，如苯妥英钠等；②巴比妥类，如苯巴比妥、扑米酮等；③亚芪胺类，如卡马西平等；④琥珀酰亚胺类，如乙琥胺等；⑤侧链脂肪酸类：丙戊酸钠等；⑥苯二氮卓类：地西泮、氯硝西泮等。现有的抗癫痫药物主要是通过抑制癫痫病灶的异常放电达到控制或抑制癫痫发作的目的。由于这种电活动抑制作用也影响正常神经细胞的电活动，所以现有的抗癫痫药物多有严重的不良反应和副作用,比如认识损害，情绪变化和神经内分泌紊乱等。癫痫是一种慢性疾病，通常需要长时期用药，这样毒副作用就更为突出了。特别的是，癫痫患者常常表现为智力水平的降低，现有抗癫痫药物的认知毒性对癫痫患者特别是青少年患者无疑是雪上加霜。因此，临床上需要疗效好、毒副作用小和作用机制独特的新型抗癫痫药物。 

1,6-二磷酸果糖是存在于体内的糖代谢中间产物，外源性的1,6-二磷酸果糖临床用于冠心病心绞痛、急性心肌梗死、心力衰竭和心律失常等的辅助治疗。中国专利(CN1309968A)基于一个急性癫痫模型公开了果糖二磷酸镁盐在制备治疗癫痫药物中的应用。由于专利CN1309968A使用的是一种急性癫痫动物模型并仅观测了给果糖二磷酸镁盐一次的抗癫痫药效，因此就无法知道多次给药后可能存在的药效变化。众所周知，癫痫是一种慢性疾病，通常需要长期给药治疗。本专利发现，在慢性癫痫模型中，多次给予1,6-二磷酸果糖钠盐后其抗癫痫药效逐渐减低，特别是高剂量组药效可以完全消失。可见，对于癫痫这样的慢性疾病来说，要发挥1,6-二磷酸果糖钠盐或其它盐类治疗癫痫的临床药用价值就必须克服这种随给药次数增加药效随之降低的严重缺陷。

发明内容

本发明的目的是提供一种1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和/或冰片组合物在制备抗癫痫药物中的应用。所述的抗癫痫是指防治癫痫发作和癫痫相关症状包括癫痫患者的学习记忆能力降低和精神行为障碍，以及与现有抗癫痫药物联合达到增强疗效降低毒副作用的目的。本发明的组合物由1,6-二磷酸果糖钠盐和果糖组合，或由1,6-二磷酸果糖钠盐和冰片组合，或由1,6-二磷酸果糖钠、果糖和冰片的组合，本发明的1,6-二磷酸果糖钠盐（8分子水）的用量选用10-500 mg/kg体重/天之间，优选用量20-300 mg/kg体重/天之间。果糖用量5-250 mg/kg 体重/天之间，优先用量10-150 mg/kg体重/天之间。冰片用量0.01-10 mg/kg体重/天之间，优先用量0.1-0.9 mg/kg体重/天。

在1,6-二磷酸果糖钠盐和果糖组合物中，1,6-二磷酸果糖钠盐与果糖比例为10: 1 至1: 1之间，优先2：1。

在1,6-二磷酸果糖钠盐和冰片组合物中，1,6-二磷酸果糖钠与冰片比率为：1：0.001 至1：0.09，优先1：0.01。

在1,6-二磷酸果糖钠、果糖和冰片的组合物中，三者比例为：1，6-二磷酸果糖钠盐：果糖：冰片=1：0.2-1：0.001-0.09， 优先比例为：1：0.5：0.01。

    特别需要指出的是，本发明公开的1,6-二磷酸果糖和果糖和/或冰片组合物在制备抗癫痫药物中的应用可以克服1,6-二磷酸果糖或其盐单独制成的抗癫痫药物的严重不足，大大提高其抗癫痫作用并改善癫痫动物的精神行为，从而可以提高1,6-二磷酸果糖及其盐在制备抗癫痫药物中的用途，可为临床提供一种新的抗癫痫药物。众所周知，癫痫是一种慢性疾病，治疗癫痫需要长期用药。显然，1,6-二磷酸果糖或其盐单独使用出现的随给药次数增加出现的抗癫痫药效降低的现象无疑会限制1,6-二磷酸果糖治疗癫痫的临床使用价值。本发明通过果糖与1,6-二磷酸果糖钠盐联合使用来提高1，6-二磷酸果糖在体内的稳定性，从而较长时间维持脑内高水平的1,6-二磷酸果糖，因此使1,6-二磷酸果糖钠盐可较长时间发挥抗癫痫药效。此外，本发明通过使用冰片可从促进1,6-二磷酸果糖进入脑内的角度进一步升高脑内1,6-二磷酸果糖水平，从而进一步加强1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫药效。

综上所述, 果糖和冰片可从不同角度增强1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫疗效。与1,6-二磷酸果糖钠盐单独使用相比, 1,6-二磷酸果糖钠盐与果糖和/或冰片联合使用可产生更加显著和更加稳定的抗癫痫药效。更重要的是, 果糖与1,6-二磷酸果糖钠盐联合使用可克服1,6-二磷酸果糖单独使用时随给药次数增加而产生的药效降低现象。

本领域技术人员应该理解果糖或冰片与1,6-二磷酸果糖或其药学上可接受的盐混合物制备抗癫痫制剂也属于本发明要求保护的范围。本领域技术人员能够理解，1,6-二磷酸果糖和其药学上可以接受的其它盐还包括这些化合物的水合物也属于本专利的保护范围。所述1,6-二磷酸果糖药学上可以接受的盐包括化合物带负电荷的部分，选用磷酸根，与正电荷的碱例如铵，或者碱土金属例如钠、钾、钙、镁、锰、铜、锶形成的一盐、二盐或者三盐。优先三钠盐。

所述抗癫痫药物，包含治疗有效量的1,6-二磷酸果糖、其前药或者其药学上可接受的盐，果糖和/或冰片以及药学上可以接受的赋形剂或者载体。

所述的治疗有效量，是指可对人和/或动物产生功能或者活性的且可被人和/或动物接受的量。所定义的药学上可接受的赋形剂或者载体，是指用于制备药物剂型的赋形剂或者载体，它们本身并不是必要的活性成分，且使用后没有毒性。

所述的治疗有效量的1,6-二磷酸果糖、其前药或者药学上可以接受的盐、果糖和/或冰片组合物可用于预防癫痫和治疗癫痫或者改善现有抗癫痫药物单一用药或者联合用药的疗效。本领域技术人员能够理解，在实际给药时的用量可高于或者低于上述剂量范围。针对某一对象(如哺乳动物或者人)的“治疗有效量”和具体治疗方案可受诸多因素的影响，包括给药对象的年龄、体重、一般情况、性别、饮食、给药时间、疾病进程以及收治医生的判断等。

本发明所述的药物可以是适合口服给药的剂型例如片剂或者胶囊，也可以是例如以无菌溶液、悬浮液或者乳液用于胃肠外注射(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)，也可以是例如以栓剂直肠给药。如没有特别说明，通常本发明所述的药物可以以常规方法使用本技术领域已知的常规赋形剂或者载体制备。

药学上可以接受的固体赋形剂或者载体包括：淀粉、玉米淀粉、乳糖、蔗糖、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二醇、碳酸钙、藻酸、微晶纤维素、明胶；药学上可以接受的液体载体包括例如无菌水、聚乙二醇、非离子表面活性剂(如羟丙基纤维素)和油例如玉米油、花生油、芝麻油、橄榄油或者液体石蜡；只要适合活性成分，即1,6-二磷酸果糖、其前药或者药学上可以接受的盐的特性和所需要的特定给药方式。在制备所述药物中通常使用的佐剂也可以被包括，例如调味剂、色素、防腐剂(如乙基或丙基-羟基苯甲酸酯)和抗氧化剂例如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

片剂可以不包衣或者包衣以改变它们的崩解和随后活性成分在胃肠道内的吸收或者增强它们的稳定性和/或外观，在所述后两种情况下可以使用本技术领域已知的常规包衣剂和方法。

用于口服的药物还可以是硬胶囊的形式，其中活性成分(1,6-二磷酸果糖、果糖和/或冰片)与惰性固体赋形剂例如碳酸钙、磷酸钙、微晶纤维或者高岭土，或是软胶囊的形式，其中活性成分(1,6-二磷酸果糖、果糖和/或冰片)与水或者油例如玉米油、花生油、芝麻油、橄榄油或者液体石蜡混合。

用于口服的药物还可以是咀嚼片的形式，由活性成分（1,6-二磷酸果糖、果糖和/或冰片）与惰性固体赋型剂组成，其中赋型剂包括释放剂(如淀粉、糊精、乳糖等)、粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、淀粉浆等)和润滑剂(如硬脂酸镁、二氧化硅、超微聚氧乙烯二醇等)，娇味剂（如糖、冰片、柠檬酸、甘草甜素等）。

用于口服的药物还可以是分散片的形式，由活性成分(1,6-二磷酸果糖、果糖和/或冰片)与惰性固体赋型剂组成，其中赋型剂包括微晶钎维素PH101、交联聚维酮 XL、滑石粉、羧甲基钎维素、硬脂酸镁、二氧化硅或调味剂(如果糖、冰片、柠檬酸、甘草甜素等)的混合物。

用于口服的药物还可以是口腔崩解片的形式，由活性成分(1,6-二磷酸果糖、果糖和/或冰片)与惰性固体赋型剂组成，其中赋型剂包括崩解剂(如低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠、聚维酮、羧甲基淀粉钠、交聚维酮中的一种或几种组合)、可溶性释放剂(如甘露糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇)、粘合剂(如聚维酮、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠)、润滑剂(如硬质酸镁、酰富马酸钠、硬脂酸、超微聚氧乙烯二醇、微粉硅胶)和娇味剂(如果糖、冰片、柠檬酸、甘草甜素等)。

特别的是，上述的咀嚼片可大大延长药物制剂中的药效成分在口腔停留时间，使药物成分特别是主药1,6-二磷酸果糖可通过口腔的毛细血管直接进入血液循环而进入脑中，这样就可以避免肠粘膜和肝脏的首过效应即对1,6-二磷酸果糖的降解，从而进一步提高1,6-二磷酸果糖进入脑内的量。

本发明研究发现一：在1,6-二磷酸果糖钠盐治疗大鼠自发性慢性癫痫时，随着给药天数的增加，抗癫痫效果逐渐降低甚至消失；其原因在于随着给药天数的递增，给1,6-二磷酸果糖钠盐后大鼠血液中和脑内1,6-二磷酸果糖水平升高逐渐减弱。具体表现在：1）一次性灌胃1,6-二磷酸果糖钠盐，随着剂量的增加，脑中1,6-二磷酸果糖水平也随之升高，这种脑中1,6-二磷酸果糖水平升高与在急性癫痫模型中一次性给予1,6-二磷酸果糖钠盐需要较高剂量（400-500mg/kg,ip）才有效是一致的。2）在多天给药的过程中，随着给1,6-二磷酸果糖钠盐（400mg/kg）天数的增加，脑中1,6-二磷酸果糖的水平与未给1,6-二磷酸果糖钠动物比较无明显差别。

本发明研究发现二：无论是一次性给药还是多次给药，在给予1,6-二磷酸果糖钠盐的同时给予果糖可升高血液和脑中1,6-二磷酸果糖水平，同时可加强1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫作用。特别是，对那些对单独给予1,6-二磷酸果糖钠盐多天后无效的慢性癫痫动物，在给予1,6-二磷酸果糖钠盐的同时给予果糖，则可恢复1,6-二磷酸果糖的抗癫痫药效，同时血液和脑中1,6-二磷酸果糖水平也得到提高。可见，果糖可提高1,6-二磷酸果糖在体内的稳定性，延长高水平的1,6-二磷酸果糖血药浓度和脑内水平，从而可加强1,6-二磷酸果糖的抗癫痫药效。以上研究证明，果糖与1,6-二磷酸果糖钠盐同时给药不仅可加强1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫药效，而且可克服随着重复给药次数的增加出现的药效降低的现象。

本发明研究发现三：癫痫的发病部位在大脑，治疗药物需要到达脑内才能发挥作用，但治疗药物进入大脑通常受到血脑屏障的阻碍，从而限制药物抗癫痫药效的发挥。冰片可作为血脑屏障开放剂通过增加药物进入脑内而增强药效。但是，冰片与1,6-二磷酸果糖钠盐联合治疗癫痫此前未见报道。本专利发现，冰片与1,6-二磷酸果糖钠盐联合使用可增强1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫效果。

本发明研究发现四：果糖、冰片与1,6-二磷酸果糖钠盐三者联合使用的效果要优于果糖或冰片与1,6-二磷酸果糖钠盐二者联合使用的效果。

综上所述，本发明发现了1,6-二磷酸果糖钠随着给药次数的增加出现抗癫痫药效减退的严重缺陷并揭示了其原因在于脑中1,6-二磷酸果糖水平逐渐减低；更重要的是，通过联合使用果糖克服了这种严重缺陷，而且与冰片联合使用可进一步增强1,6-二磷酸果糖钠的抗癫痫药效。

此外，本发明根据1,6-二磷酸果糖钠随着给药天数的递增，给1,6-二磷酸果糖钠盐后血液中和脑内1,6-二磷酸果糖水平升高逐渐减弱，从而导致药效降低的不足，从药物制剂的剂型角度进一步克服此不足。所以，本发明采用了咀嚼片、口崩片和分散片作为1,6-二磷酸果糖钠、果糖和冰片组合物的抗癫痫药物的剂型。这三种剂型均能在口腔粘膜直接吸收，避免肝脏首过效应，可进一步增加脑中1,6-二磷酸果糖水平，从而可进一步提高药物的抗癫痫药效。

附图说明

图1是慢性癫痫动物癫痫发作(A)对应的学习记忆能力(B)。

图2是治疗前和治疗期间各组动物每周的癫痫发作情况。Model，癫痫模型对照组；Valproate，已知药丙戊酸钠(300mg/kg/天, 灌胃给药)，FBP200(FBP200mg/kg/天, 灌胃给药)；FBP300(FBP300mg/kg/天, 灌胃给药)。

图3显示停药后各组动物的癫痫发作情况。

图4是治疗前和经过4周治疗并停药后的第30天各组癫痫动物的学习记忆成绩。

图5是用水溶液溶解1,6-二磷酸果糖（FBP）测得的标准曲线。

图6是FBP溶解于全血中经过提取后测得的FBP水平标准曲线。

图7是一次性灌胃不同剂量的1,6-二磷酸果糖钠盐后2小时血液中1,6-二磷酸果糖（FBP）水平变化。

图8是一次性灌胃不同剂量的1,6-二磷酸果糖钠盐后2小时脑中1,6-二磷酸果糖（FBP）水平变化。

图9是多次灌胃不同剂量的1,6-二磷酸果糖钠盐后2小时脑中FBP水平变化。

图10是1,6-二磷酸果糖钠盐与果糖同时灌胃升高血液中FBP水平的作用。

图11是1,6-二磷酸果糖钠盐与果糖同时灌胃升高脑中FBP水平的作用。

图12A-B是治疗后各组癫痫发作次数变化。纵坐标数据是各组治疗后的每周每只大鼠癫痫发作次数分别减去各自治疗前一周的数据，此差值反应治疗后癫痫发作次数变化。

图13A-B是治疗后各组癫痫发作持续时间变化。纵坐标数据是各组治疗后的每周每只大鼠癫痫发作持续时间分别减去各自治疗前一周的数据，此差值反应治疗后癫痫发作持续时间变化。

图14A-B是治疗后各组癫痫发作总级别变化。纵坐标数据是各组治疗后的每周每只大鼠癫痫发作总级别分别减去各自治疗前一周的数据，此差值反应治疗后癫痫发作总级别变化。 

图15是治疗后各组癫痫发作次数变化。纵坐标数据是各组治疗后的每周每只大鼠癫痫发作次数分别减去各自治疗前一周的数据，此差值反应治疗后癫痫发作次数变化。 

图16是1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和冰片组合物对单用1,6-二磷酸果糖钠盐或1,6-二磷酸果糖钠盐加果糖或1,6-二磷酸果糖钠盐加冰片不敏感的慢性癫痫动物的抗癫痫作用。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步说明本发明，但不应理解为本发明仅限于这些说明。

具体实施例中出现的英文简称及其中文含义如下：

FBP：1,6-二磷酸果糖钠盐或1,6-二磷酸果糖；

Model：癫痫模型对照组；

Valproate：丙戊酸钠；

F：果糖。

（一）1、6-二磷酸果糖钠盐在慢性癫痫模型中的药效优势和局限

实施例1：1、6-二磷酸果糖钠盐在慢性癫痫模型中的药效优势和局限

1．自发性慢性癫痫模型的制备：

颞叶癫痫为临床成年人最常见的癫痫类型，而且常出现抗药性。毛果芸香碱诱导的大鼠颞叶癫痫模型可模拟人颞叶癫痫的症状、神经病理及组织形态变化特征，所以本模型国内外广泛用于抗癫痫药物的药效预测及抗癫痫机制研究。

成年雄性 Sprague Dawley大鼠(180-200g)腹腔注射毛果芸香碱(300mg/kg)诱导急性癫痫发作，按Racine标准判定癫痫发作的程度：1级:动须、咀嚼;2级:节律性点头;3级:一侧前肢阵挛;4级:站立伴双前肢阵挛;5级:4级+跌倒伴全身抽搐 （下同）。出现 3级癫痫和3级以上癫痫发作并维持2小时的动物定义为该动物有SE (status epilepticus)。2小时后，SE动物腹腔注射安定(10mg/kg)以提高动物存活率。而后动物饲养于正常环境等待自发性癫痫的发作。从SE的10天后起，每天从早上9点到下午5点观察动物的癫痫行为，每周连续观测5天(周1至周5)，记录连续5天内3级和3级以上的癫痫发作次数，如此观测一个月。而后，用Morris水迷宫测定动物的学习记忆能力，观测指标是动物在学习寻找逃生平台练习中的成绩(The scores of the morris training)：分数越高，成绩越好。水迷宫训练评分标准：第一天学会：4分；第二天学会：3分；第三天学会：2分；第四天学会：1分；4天结束之后没有学会：0分。将动物按癫痫发作严重程度分为以下5类动物：无癫痫发作对照动物(Control，无癫痫发作或偶尔诱发作)，轻度癫痫发作(1，连续5天内有2 天有癫痫发作)，轻中度癫痫发作(2，连续5天内有3 天有发作)，中度癫痫发作(3，连续5天内有4天有发作)，严重癫痫发作(4，连续5天内有5天有发作)。结果发现，大多数动物的癫痫发作随着时间的推移不断增加；癫痫动物(1-4类动物)的学习能力明显低于对照动物，而且癫痫发作越严重学习能力就越低(图1A，B)。

分组、给药及结果分析：

根据癫痫动物的癫痫发作和学习记忆成绩，将以上癫痫动物均匀分配到癫痫模型对照组(Model，n=6)，丙戊酸钠阳性药物对照组300 mg/kg/day(Valproate, n=6)，1,6-二磷酸果糖钠（购于张家港市华天药业有限公司的原料药，下同） 200 mg/kg/day组(FBP200，n=6)和1,6-二磷酸果糖钠300 mg/kg/day组(FBP300，n=6)。各给药组均采取灌胃给药方式，按设定剂量每天给药一次，连续给药4周，癫痫模型组给予同等体积的生理盐水；癫痫行为观测方法与给药前相同。分析比较各组动物在给药期间各周内与给药前一周内的癫痫发作总数差别、以及给药期间各组之间的差别，结果见图2。 停止治疗后，继续连续2周观测各组动物的癫痫发作情况，结果见图3。停止治疗后第30天测定各组动物的学习记忆成绩，结果见图4。

图2显示的是各实验组，治疗前1周和治疗期间第1周、第2周、第3周和第4周的各自从周一至周五5天中的癫痫发作总数。可见，癫痫模型对照组动物在治疗期间的4周里癫痫发作次数较治疗前有所增加，说明此慢性自发性癫痫模型癫痫发作稳定，如不给以药物治疗癫痫发作会不断加重。已知抗癫痫药物丙戊酸钠治疗到第3周癫痫发作次数减少，到第4周进一步减少到非常低的水平，此结果说明随着给药时间的延长丙戊酸钠的抗癫痫效果得到增强。1,6-二磷酸果糖钠(200 mg/kg/day，FBP200)在开始治疗的第1周癫痫发作数就开始降低，到第2周进一步降低到非常显著的水平，但是自第3周开始癫痫发作次数开始升高，到第4周回到治疗前的水平；1,6-二磷酸果糖钠(300 mg/kg/day, FBP300)在开始治疗的第1周癫痫发作数有下降趋势，而后的3周治疗期间癫痫发作次数未见任何降低现象, 反而在第3周的发作次数有高于治疗前的趋势。

从FBP的2种剂量的抗癫痫药效来看，FBP在200 mg/kg/day的剂量要优于较高剂量(300 mg/kg/day)(在后面的研究中我们找到其原因在于高剂量时脑内FBP水平反而低，详见实施例1,6-二磷酸果糖钠盐药代动力学研究)；随着给药次数的增加(或治疗时间的延长)FBP的药效逐步而显著地降低，而且高剂量组更加突出(原因见实施例1,6-二磷酸果糖钠盐药代动力学研究)。

与现有抗癫痫药物丙戊酸钠比较，FBP起效快，早期效果显著，但是随着治疗时间的延长效果逐渐不如丙戊酸钠；而丙戊酸钠则是随着治疗时间的延长，药效逐渐增强。

与模型组比较，从开始的第1周至结束治疗的第4周，FBP200组的癫痫发作次数均明显低于模型对照组，在FBP 300 mg/kg组除治疗的第2周外其它3周的治疗期间与模型组比较癫痫发作次数也有明显降低的趋势。

从图3可见，已知抗癫痫药物丙戊酸钠在停止治疗后的第1周和第2周的癫痫发作次数明显高于模型对照组，说明现有抗癫痫药物较普遍存在的停药后癫痫发作反弹现象。而FBP200 和FBP300 组均未见停止治疗后的癫痫发作反弹现象，这就清楚的显示了FBP作为新的抗癫痫活性物质较现有抗癫痫药物的显著优势。

图4 显示的是各组动物停止治疗后第30天的学习记忆的成绩，分数越高表示动物越聪明。治疗前各组之间的学习记忆成绩无明显差别，经过4周治疗并停药后的第30天，模型对照组(Model)的成绩有降低趋势，这可能与慢性癫痫持续发作有关。丙戊酸钠治疗组，停药后和给药前未见明显的差别，这一结果至少说明丙戊酸钠对癫痫动物的学习记忆能力的降低无改善作用。非常突出的是，FBP200组动物的学习成绩明显高于治疗前，说明经过4周的FBP治疗在停药后的第30天癫痫动物的学习记忆能力得到显著升高； FBP300组对学习记忆的改善作用未达到FBP200组，这一结果与抗癫痫发作效果一致，其原因见实施例1,6-二磷酸果糖钠盐药代动力学研究。

上述实验结果突出表现了1,6-二磷酸果糖钠盐(FBP)对毛果芸香碱诱导的大鼠颞叶癫痫动物的作用特色和局限性, 即：

1）较已有抗癫痫药物的显著优势：与现有抗癫痫药物丙戊酸比较，停止FBP治疗后不出现已有抗癫痫药物普遍存在的停药后癫痫发作反弹现象，FBP治疗后可显著改善癫痫动物的学习记忆能力。这些作用特点说明FBP不同于已有抗癫痫药物主要是控制癫痫发作而对癫痫疾病本身无治疗作用，而FBP可治疗癫痫疾病本身。癫痫患者常伴有认知能力的低下，从而严重危害特别是青少年患者，但是已有抗癫痫药物不仅对癫痫患者的认知能力低下无改善作用，相反常常可进一步危害癫痫患者的认知能力，这就凸显了FBP能改善癫痫患者认知能力的临床应用价值。

2）局限性：随着治疗时间的延长（或给药次数的增加），FBP的药效逐渐而显著地减弱。癫痫是一种慢性疾病，已有抗癫痫药物通常是通过长期给药来控制癫痫发作，可以想象要治好癫痫疾病也是需要较长期间的药物治疗。然而，随着给药次数的增加, FBP抗癫痫发作的药效逐渐减弱而无法有效控制癫痫发作，更无法使需要长时间治疗的慢性癫痫得到有效治疗，无疑这一局限将大大限制甚至使FBP较已有抗癫痫药物的优势无法在临床应用中得到实现。也就是说，要实现FBP治疗癫痫的医药用途，必须克服随着给药次数增加药效减弱的缺陷。

为克服FBP的这种严重缺陷，我们首先是寻找产生给药次数增加药效降低的原因，而后是研究克服这一缺陷的措施，详细研究方案和结果见后面的实施例。

二)：以下进行1、6-二磷酸果糖钠盐药代动力学研究。

实施例2: 建立测定小鼠血液和脑组织中1,6-二磷酸果糖水平的方法

按文献报道方法[Xu K et al. Pharmacological research 2008; 57: 234-8]，外源性或内源性FBP含量测定能通过酶法测定烟碱胺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)来实现。反应原理如下：

简单地说，FBP在醛缩酶(aldolase, 45units mg^-1 diluted 1:27with distilled water)作用下分解成磷酸二羟丙酮(dihydroxycetone phosphate, DAP)和3-磷酸-D-甘油(d-glyceraldehyde 3-phosphate，GAP)，并消耗NADH。 DAP和GAP在磷酸丙糖异构酶(triosephosphate isomerase，TIM: 5290 units mg^-1 diluted 1:120with distilled water)作用下可以相互转换，在磷酸脱氢酶(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase，GDH：252units mg^-1 diluted 1:100with distilled water)催化下DAP消耗NADH转化成GAP。 并在酶法测定时加入TIM/GDH排除本身含有的DAP和GAP干扰。

全血血样的制备

取小鼠全血0.5 ml，加入1.0 ml高氯酸溶液(0.6 mol/l)，混匀。在3500 r/min, 4℃条件下离心10 min, 取上清用K₂CO₃溶液(5.0 mol/l)调PH至3.5，将处理好的溶液冰浴15 min后测定。

脑匀浆的制备

将小鼠小脑剥离，称量剩余部分重量，加入适当量的冰高氯酸溶液(0.6 mol/l), 快速进行匀浆，匀浆是时间为1-2 min。再将匀浆在3500 r/min, 4℃条件下离心10 min, 取上清, 用K₂CO₃溶液(5.0 mol/l)调节PH至3.5，将处理好的溶液冰浴15 min后测定。

酶法测定

在96孔板中依次加入75 

 三乙醇胺(tetraethyl ammonium buffer，TEA，0.4 mol/l， PH 7.6，EDTA 40 mmol/l)、50 

NADH、50 

 (或100 ) 样品、20 

 或0 

）三蒸水、10 

 TIM/GDH，振荡1 min后，在40℃下放置5 min，然后在340 nm处每三分钟测定一次吸收值，共测三次，其平均值即为初值(initial absorbance, AI)。 测定完后, 加入10 

 aldolase, 振荡1 min后, 同样在40℃下放置15 min, 然后在340 nm处每六分钟测定一次吸收值, 共测三次, 其平均值即为终值(final absorbance，AF)。FBP含量与(AI-AF)成正比。

水溶液标准曲线

将FBP配置成浓度分别为0、20、40、60、80、100ug/ml的水溶液，测定体系中FBP含量，参见图5：相关系数r= 0.9996，即水溶液体系中FBP含量与配置浓度正相关。

提取过程对血液中1,6-二磷酸果糖含量测定影响

由于血液成分比较复杂，对FBP的测定有一定的干扰，因此血液中FBP回收率的测定十分必要。 FBP用0.01M磷酸缓冲盐(phosphate buffer saline，PBS)溶解，分别测定经过提取和不经过提取的回收率。

用全血溶解外源性1,6-二磷酸果糖钠盐测得的1,6-二磷酸果糖水平测定标准曲线

小鼠全血中含有一定量的NADH，因而对测定结果有一定影响，应排除其干扰。取正常条件下生长的雄性小鼠全血0.5 ml，并加入一定量的FBP，使其浓度分别为0、50、100、200、300、400 

/ml的溶液，再按上述方法测定，图6为血液中测定的FBP含量与外源性加入的FBP剂量相关(相关系数r = 0.9995)。

实施例3：灌胃1,6-二磷酸果糖钠盐后，血液和脑组织中1,6-二磷酸果糖含量变化

2.1 一次给药

将正常雄性小鼠随机分组(5组)，每组7只，一次给药，其中包括对照组和给药组。给药组浓度分别为：200 mg/kg、300 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg。对照组动物给等量的生理盐水。灌胃给药2小时，用前面建立的方法测定血液和脑组织中FBP浓度。研究数据显示，给予200 mg/kg的FBP血液中FBP含量最高，为内源性FBP基础值的4倍，而剂量≥ 400mg/kg 时，血液中FBP仅约高于基础值(图7)，这种矛盾现象可能是因为高剂量FBP激活了体内FBP代谢或被利用的机制，同时可能2小时的时间点错过了高剂量组的浓度峰值。而脑中FBP水平随着剂量的升高而升高(图8)，这种结果与过去我们发现的一次性给FBP的抗癫痫药效随着剂量升高而加强是一致的。

多次给药

将正常雄性小鼠随机分组(6组)，每组7只，进行多次给药(包括一次和三次)，其中包括对照组和给药组。给药组浓度分别为200 mg/kg和400 mg/kg；对照组动物给等量的生理盐水。一次给药，在灌胃FBP后2小时取脑组织标本，用前面建立的方法测定脑组织中FBP浓度。三次给药，每天上午９点给FBP一次，连续三天，于最后一次给药2小时取脑组织标本测定FBP浓度。结果显示：当连续3次给药后，200 mg/kg和400 mg/kg两组脑内FBP浓度与给药剂量呈相反变化：给予200 mg/kg较给予400 mg/kg后脑内FBP含量显著升高(图9)。

这种FBP在脑中浓度随其剂量和给药次数的变化与FBP抗慢性癫痫药效完全一致。在大鼠慢性自发性癫痫模型，FBP 200 mg/kg的抗癫痫药效显著强于FBP 300 mg/kg的药效, FBP 400 mg/kg未见有药效。

实施例4：果糖与1,6-二磷酸果糖钠联合使用可增加血液中1,6-二磷酸果糖的峰值并延长其高水平维持时间，同时可升高脑中1,6-二磷酸果糖水平。

雄性成年SD大鼠随机分为1,6-二磷酸果糖钠(FBP)组、果糖(F)组和FBP+F组, 每组5-6只。 每组动物分别灌胃给予FBP(200mg/kg)、D-果糖(购于湖北远成药业有限公司的原料药，下同（100mg/kg）及同时给予FBP(200mg/kg)和果糖(100mg/kg)。在给药前2小时、给药后30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时和5小时，对各组动物从眼眶静脉取血0.5 ml, 每次取血后即刻腹腔注射1 ml 生理盐水以补充血容量。用前述方法测定血液中FBP的水平，并对各组FBP水平的差异进行统计学分析。结果见图10，给药后2小时各组动物血液中FBP水平显著升高, 3小时进一步升高并达到峰值；而后FBP水平下降，但4小时和5小时各组的FBP水平仍然高于给药前的水平。特别是在各个时间点，果糖与1，6-二磷酸果糖钠盐合用组的FBP水平均非常显著的高于FBP组和F组。 以上结果说明，单独给予1，6-二磷酸果糖钠盐或果糖均能显著升高血液中FBP水平，而果糖与1,6-二磷酸果糖钠盐合用可进一步升高血液中FBP水平，具体表现为峰值显著升高和保持高水平FBP的时间延长。

雄性成年SD大鼠随机分为1,6-二磷酸果糖钠(FBP组)、果糖(F)组和FBP+F组，每组5-6只。 每组动物分别灌胃给予FBP(200 mg/kg)、果糖(100 mg/kg)及同时给予FBP(200 mg/kg)和果糖(100 mg/kg)，每天给药一次，连续12天。在第12天给药后3小时取脑测定其FBP水平，并比较各组的差别。结果(图11)表明：1,6-二磷酸果糖钠盐组的脑内FBP水平显著高于单独给1，6-二磷酸钠盐或果糖组。

 三)：以下是1,6-二磷酸果糖钠盐与果糖和冰片合用提高1,6-二磷酸果糖钠盐的抗慢性癫痫的疗效

实施例5：果糖显著升高1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫药效

毛果芸香碱诱导的大鼠慢性自发性癫痫模型是国际公认的颞叶癫痫模型，广泛用癫痫病理机制和抗癫痫药物的药效及其机制研究。用常规方法用毛果芸香碱诱导成年雄性SD大鼠发生持续性癫痫大发作120分钟，而后终止癫痫发作并将动物饲养于正常条件下，待自发性癫痫的形成。于给毛果芸香碱后的第30天，观察动物的自发性癫痫行为，观测时间为周1至周6，每天从早上9点到下午7点(连续10小时)。按Racine标准判定癫痫发作的程度，将具有稳定的自发性癫痫发作的大鼠均匀分配到模型对照组、果糖(100 mg/kg/天, ig)组、1,6-二磷酸果糖钠盐(FBP, 200 mg/kg/天, ig)组和FBP(200 mg/kg/天, ig)+果糖(100 mg/kg/天, ig)组。每组动物数7-8只，并计算出给药前各组每只动物每周的癫痫发作数(3级和以上的癫痫发作)、癫痫发作持续时间(s)和癫痫发作总级别。按设定剂量，每天给药一次，连续5周；模型对照组给予同等体积的生理盐水。连续观测给药期间的第一周、第二周、第三周和第五周的动物癫痫行为，并分析比较各组的癫痫行为差别。具体指标为，治疗后的各周数据分别减去治疗前一周的数据，此差值可反映治疗后癫痫发作次数、发作持续时间和发作级别的变化。差值大于零说明癫痫发作加重，小于零说明癫痫发作减轻，数值越小表明抗癫痫效果越好。

图12A-B显示的是治疗后各组动物的癫痫发作次数(反应癫痫发作的频率)的变化。可见，模型对照组的癫痫发作次数明显增加；在治疗组中FBP+果糖组癫痫发作次数的降低最为明显，且在观测的所有4周里均有降低；而FBP治疗组的前3周发作次数减少，但第5周则未见有药效，提示其药效的消失；果糖组在给药后的1-3周似乎有一些作用，但第5周未见任何减少。

图13A-B显示的是治疗后各组动物癫痫发作持续时间的变化。可见，模型对照组癫痫发作持续时间明显增加；在治疗组中FBP+果糖组癫痫发作持续时间的降低最为明显，而且在观测的所有4周里均有降低；而FBP治疗组的前3周发作次数减少，但第5周则变为正值，提示其药效的减弱；果糖组效果不明显。

图14A-B显示的是治疗后各组动物的癫痫发作级别总数的变化。可见，模型对照组的癫痫发作级别总数明显增加；在治疗组中FBP+果糖组癫痫发作级别总数的降低最为明显，而且在观测的所有4周里均有降低；而FBP治疗组的前3周发作别总数减少，但第5周则变为正值，提示其药效的减弱；果糖组第一周和第二周虽为正值但较模型对照组小，第三周为负值，第五周与模型组无差异，提示果糖组前3周有一些作用。

综合以上(图12-14)研究结果，说明果糖与1,6-二磷酸果糖钠盐联合使用可显著加强1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫活性，并可克服随着给药时间延长1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫药效降低的缺陷。这一结果支持了果糖与1,6-二磷酸果糖钠盐组合物在制备抗癫痫药物中的用途及临床价值。

实施例6：冰片显增强1，6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫药效

在实施例4的全部实验结束后，停止对所有动物的任何治疗，在正常条件下饲养2周，并观测所有动物的癫痫发作情况。按Racine标准判定癫痫发作的程度。癫痫发作观测时间为周1至周6，每天从早上9点到下午7点(连续10小时)。而后，将具有稳定癫痫发作的动物(不论来自实施例4的模型对照组、果糖组还是1,6-二磷酸果糖钠盐组)按照癫痫发作的级别均匀分配到本次实验的模型对照组、冰片（市售中药，下同）(10 mg/kg体重/天，ig)组和1,6-二磷酸果糖钠盐(FBP，200 mg/kg 体重/天)+冰片(10 mg/kg体重/天，ig)组，每组动物数5-6只。计数出各组每只动物在一周内的3级和3级以上的癫痫发作总数，此数值作为各组给药前的发作情况。按设定剂量，每天给药一次，连续3周；模型对照组给予同等体积的生理盐水。给药当天开始观测治疗后各组癫痫发作的情况，连续观测给药期间的第一周、第二周和第三周的动物癫痫行为，计算出各组治疗后每只动物在一周内的3级和3级以上的癫痫发作总数，并分析比较各组此总数治疗前与治疗后的差值。此差值大于零说明癫痫发作加重，小于零说明癫痫发作减轻，数值越小抗癫痫效果越好。

图15显示的是治疗后各组动物的癫痫发作次数(反应癫痫发作的频率)的变化。可见， 1,6-二磷酸果糖钠盐（FBP）+冰片组在给药期间的3周中癫痫发作次数变化为负值，说明癫痫发作次数少于治疗前； 1,6-二磷酸果糖钠盐（FBP）组前2周的癫痫发作次数变化为正值但小于模型对照组，第3周变化值为负值。以上结果显示，冰片与1,6-二磷酸果糖钠盐同时给药，可增强1,6-二磷酸果糖钠盐的抗癫痫效果。这就支持了冰片与1,6-二磷酸果糖钠盐组合物治疗抗癫痫药物的医药用途。

实施例7． 1,6-二磷酸果糖钠盐联合果糖和冰片抗癫痫效果更加显著

为了证实同时给予1，6-二磷酸果糖钠盐、果糖和冰片具有更好的抗癫痫效果，选用对单用1,6-二磷酸果糖钠盐（FBP）或1,6-二磷酸果糖钠盐加果糖或1,6-二磷酸果糖钠盐加冰片不敏感的慢性癫痫动物，共7只。在给药前连续6天观测癫痫发作并计算出平均每只动物每天3级和3级以上的癫痫发作总次数作为给药前的癫痫发作情况。而后，每只动物通过灌胃同时给予1,6-二磷酸果糖钠盐(200 mg/kg)、果糖(100 mg/kg)和冰片(5 mg/kg), 每天一次, 连续7天。在给药的当天开始观测给药治疗期间癫痫发作的变化。结果(见图16)显示：给药前连续6天动物癫痫发作稳定，在给药当天癫痫发作就有明显降低，第三天药效达到最高峰并一直维持在非常有效的状态。可见，1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和冰片三者联合给药对那些对具1,6-二磷酸果糖钠盐或1,6-二磷酸果糖钠盐加果糖或1,6-二磷酸果糖钠盐加冰片不敏感的慢性癫痫动物仍然有效，这就直接支持了1，6-二磷酸果糖钠盐、果糖和冰片组合物在制备抗癫痫药物中的医药用途。

Claims (4)

1.一种1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和/或冰片组合物在制备抗癫痫药物中的应用，其特征在于，组合物由1,6-二磷酸果糖钠盐和果糖组合，或由1,6-二磷酸果糖钠盐和冰片组合，或由1,6-二磷酸果糖钠、果糖和冰片的组合，当1,6-二磷酸果糖钠盐和果糖组合时，1,6-二磷酸果糖钠盐与果糖的比例为10: 1 至1: 1，当1,6-二磷酸果糖钠盐和冰片组合时，1,6-二磷酸果糖钠与冰片的比例为：1：0.001 至1：0.09，当1,6-二磷酸果糖钠、果糖和冰片组合时，1，6-二磷酸果糖钠盐：果糖：冰片的比例为：1：0.2-1：0.001-0.09。

2.根据权利要求1所述的一种1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和/或冰片组合物在制备抗癫痫药物中的应用，其特征在于，当1,6-二磷酸果糖钠盐和果糖组合时，1,6-二磷酸果糖钠盐与果糖的比例为2：1，当1,6-二磷酸果糖钠盐和冰片组合时，1,6-二磷酸果糖钠与冰片的比例为：1：0.01，当1,6-二磷酸果糖钠、果糖和冰片组合时，1，6-二磷酸果糖钠盐：果糖：冰片的比例为：1：0.5：0.01。

3.根据权利要求1或2所述的一种1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和/或冰片组合物在制备抗癫痫药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为固体制剂或液体制剂。

4.根据权利要求3所述的一种1,6-二磷酸果糖钠盐、果糖和/或冰片组合物在制备抗癫痫药物中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为咀嚼片、口崩片和分散片。

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