CN107375934B - 含有果糖-1，6-二磷酸的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

含有果糖-1，6-二磷酸的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供含有果糖‑1,6‑二磷酸的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中FBP与代谢调控剂的比例的确定以各自的药效剂量为准，由于代谢调控剂各自剂量不同，因此FBP与代谢调控剂的比例要以具体的代谢调控剂的有效剂量而定。所述组合物通过破坏肿瘤代谢网络的活性，实现预防和治疗肿瘤，以这种组合物为活性成分制备的药物可产生较FBP及其它代谢调控剂单独使用时更强大的抗癌药效。本发明组合物可全面逆转肿瘤代谢特征、摧毁肿瘤代谢网络，突出表现为在促进营养物质进入三羧酸循环和氧化磷酸化的同时可阻断糖酵解和三羧酸循环中间产物流向生物合成，破环氧化还原系统，安全性高，从而进一步提高FBP的抗癌药效。

Description

含有果糖-1，6-二磷酸的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明属于制药领域，涉及含有果糖-1，6-二磷酸的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。具体地说，所述组合物由果糖-1，6-二磷酸与其它代谢调控剂和/或果糖-1，6-二磷酸的血药浓度稳定剂构成，其目的在于破坏肿瘤代谢网络，从而产生广谱抗癌活性。
背景技术
癌症已经成为人类的第一死因，且其发病率及死亡率还呈现逐年上升的趋势。早在1920年，德国生物化学家Otto Warburg就提出了肿瘤细胞“有氧糖酵解”的特点，即肿瘤细胞在有氧条件下仍然利用糖酵解的增强获取能量，产生大量生物合成前体物质，并提出肿瘤细胞是一种代谢性疾病。然而，目前临床上尚无针对该策略的抗肿瘤药物，其原因在于肿瘤细胞具有很强的代谢异质性及代谢可塑性，除了葡萄糖之外，肿瘤细胞也能利用谷氨酰胺作为能量来源物质，单一调控某一条能量代谢通路来对抗肿瘤细胞是远远不够的，因此，针对肿瘤细胞能量代谢特点进行系统调控才能从根本上治疗癌症。
果糖-1，6-二磷酸也称可1，6-二磷酸果糖(fructose-1,6-bisphosphate,FBP)为糖酵解过程的中间产物，目前已有FBP多种药物制剂在临床上用于治疗心脑血管疾病，它对于组织缺血及缺氧显示出较强的有益作用。发明人已于前期研究中发现FBP的抗肿瘤作用并公布了FBP在制备抗肿瘤药物中的应用(连晓媛，辛文秀，杨勇，张治针。一种1，6-二磷酸果糖在制备抗癌药物中的应用，中国发明专利:ZL201110066413.6,2012年)。
上世纪早期，诺贝尔奖获得者Otto Warburg就提出肿瘤是一种代谢性疾病，近十多年的国内外研究进一步证明肿瘤特征性代谢是癌细胞的核心特征，与肿瘤抗凋亡和治疗耐药密切相关。因此，针对肿瘤代谢有望研发出安全、有效、广谱的新型抗肿瘤药物。葡萄糖和谷氨酰胺是癌细胞两种最主要的营养物质，癌细胞可协调使用葡萄糖和谷氨酰胺，以最优化的方式从这两大物质中获得充足的合成生物大分子的前体物质、抗氧化物质和能量物质。葡萄糖通过糖酵解通路产生大量的酵解中间产物并通过磷酸戊糖旁路和丝氨酸介导的一碳单位代谢通路流向生物合成。此外，包括葡萄糖和谷氨酰胺在内的各种营养物质(碳水化合物、脂肪、蛋白质和氨基酸)，经过不同途径汇集到线粒体，而后按照肿瘤细胞所需的比例一部分流向氧化磷酸化以产生所需能量(ATP)和适当量的活性氧自由基(ROS)，另一部分流出三羧酸循环进入生物合成通路。在此过程中，线粒体膜上的三羧酸转运体(特别是柠檬酸转移体，CIC)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和充足的NAD+至关重要。CIC将大量三羧酸中间产物柠檬酸从线粒体转运到胞浆，而后柠檬酸降解为乙酰辅酶A和草酰乙酸，前者是脂肪合成的唯一原材料、是肿瘤细胞分裂增殖所必须物质，后者通过柠檬酸循环可将胞浆中的NADH氧化成NAD﹢以及NADP+还原为NADPH、也可直接在转氨酶的作用下转化为核酸必需前提物质和蛋白质前提物质天门冬氨酸。GDH使癌细胞可利用谷氨酰胺产生足够的能量和生物合成前体物质。而充足的NAD+是维持癌细胞高度活跃的糖酵解的关键物质，对葡萄糖在糖酵解阶段流向对生物合成和氧化还原平衡起关键作用的丝氨酸也不可或缺。然而，分别抑制糖酵解、谷氨酰胺的代谢利用、线粒体氧化磷酸化、GDH和NAD+合成不能产生显著的广谱抗癌作用或产生显著的毒副反应。可见，特异性靶向肿瘤代谢网络也就是多条关键代谢通路以全面阻断肿瘤生物合成通路是产生安全、有效和广谱抗肿瘤药效的关键。
发明内容
本发明提供一种由1,6-二磷酸果糖(FBP)与其它代谢调控剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用。所述组合物通过破坏肿瘤代谢网络的活性，实现预防和治疗肿瘤，以这种组合物为活性成分制备的药物可产生较FBP及其它代谢调控剂单独使用时更强大的抗癌药效。在所述药物中FBP与其它代谢调控剂的比例的确定以各自的药效剂量为准，由于其它代谢调控剂各自剂量不同，因此FBP与其它代谢调控剂的比例要以具体的代谢调控剂的有效剂量而定。
所述FBP的药用形式包括果糖-1,6-二磷酸原形和果糖-1，6-二磷酸及其前药或衍生物在药学上可接受的盐包括但不限于化合物所形成的铵、钠、钾、钙、镁、锰、铜、甲胺、二甲胺、三甲胺、丁酸、乙酸、二氯乙酸、盐酸、氢溴酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸或者马来酸的酸根所成的盐及水合物。优选地，以果糖-1,6-二磷酸三钠盐的8分子水合物为药用形式。
所述的其它代谢调控剂包括柠檬酸转运蛋白(CIC)抑制剂、谷氨酸脱氢酶(GDH)抑制剂和NAD+抑制剂，所述其它代谢调控剂既可以是现已知物质也可以是将来发现或定向合成的物质。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和甲萘醌(VK3)分别是已知的谷氨酸脱氢酶抑制剂和NAD+抑制剂,柠檬酸竞争性抑制物1,2,3-benzenetricarboxylate(1,2,3BTC)是CIC抑制剂。所述其它代谢调控剂分别或共同与1,6-二磷酸果糖组合对肿瘤细胞可产生协同致死的作用，这就支持了FBP可与所述的其中一种或多种其它抑制剂组合在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明发现FBP可快速抑制糖酵解并促进线粒体氧化磷酸化，而后影响到谷氨酰胺的代谢利用和抑制三羧酸循环中间产物流向生物合成，特别是FBP对肿瘤代谢网络中的关键酶谷氨酸脱氢酶(GDH也可简称GLDH)和关键成分NAD+水平的降低出现较晚，FBP对阻断三羧酸中间产物柠檬酸流出线粒体进入胞浆的作用也在FBP作用也出现较晚。可见，快速阻断线粒体中柠檬酸流向细胞浆、抑制GDH活性和降低NAD+水平可能协同FBP产生的快速抑制糖酵解和促进氧化磷酸化的作用，从而发挥更强的抗癌作用。的确，本申请发现FBP联合GDH抑制剂EGCG或NAD+合成抑制剂VK3或三者联合均可产生更加显著的离体和整体抗癌活性。
本发明针对肿瘤代谢特征性代谢网络，通过构建活性功能组合物，不仅克服了长期以来抑制单一代谢通路不能产生足够强大的抗癌药效的缺陷，而且进一步优化了FBP的抗癌药效，产生了突破性的抗癌效果：这种功能组合物具有更广谱和更加强大的抗癌药效，其敏感癌种包括各种实体瘤和血液癌症。
具体地说，FBP可快速抑制糖酵解并促进葡萄糖进入线粒体氧化磷酸化，而后抑制葡萄糖和谷氨酰胺流向生物合成，并破化肿瘤表观遗传学特征和广泛下调肿瘤代谢酶；用EGCG抑制GDH不仅可抑制癌细胞对谷氨酰胺的代谢利用，而且可阻断谷氨酰胺代谢关联的天门冬氨酸-苹果酸穿梭来源的NAD+再生；用VK3抑制NAD+合成可协同FBP和GDH抑制剂进一步加剧癌细胞内NAD+耗竭的速度和程度；在施加FBP的同时施加CIC抑制剂可弥补FBP抑制柠檬酸流出线粒体的滞后效应。因此，本发明构建的这种功能组合物可迅速靶向肿瘤代谢网络中多条关键通路包括葡萄糖代谢通路和谷氨酰胺代谢通路以及它们的交汇点，因此可快速关闭癌细胞增殖和生存必需的生物合成和生存代偿通路并迫使癌细胞使用自杀方式即线粒体氧化磷酸化消耗葡萄糖同时产生对癌细胞有毒的大量活性氧自由基(ROS)。
本专业领域内人员可以理解，在所述组合物的基础上，针对肿瘤细胞代谢网络或特点，进一步加入活性成分，特别是谷氨酰胺转运体抑制剂和/或谷氨酰胺酶(GLS1)抑制剂，进而增强对肿瘤代谢网络的攻击能力，也在本发明的保护范围之内。本专业领域人员还可理解，由于FBP可增加ROS的产生并将少内源性抗氧化物质的合成，随着作用时间的延长，FBP破坏癌细胞的氧化还原平衡，因此加入一种可快速消耗胞内还原物质的氧化剂如维生素C来加速胞内氧化还原平衡的破坏，也应在本专利的保护范围内。
同时，本领域内人员可以理解，在所述含FBP的功能组合物的基础上，再加入FBP血药浓度稳定剂以提高FBP的血药浓度峰值及延长有效血药浓度的维持时间，从而进一步提高抗肿瘤药效，也应在本专利保护范围内。
以上研究发现支持了FBP与所述的其它代谢调控剂的一种或多种组合制成的复方制剂在预防和治疗肿瘤中的应用，在此基础上进一步加入FBP的血药浓度稳定剂可进一步提高所述药物的抗癌药效，所述FBP稳定剂包括临床使用的降糖药和FBPase1抑制剂。
申请人已公开了FBP的广谱抗癌活性(连晓媛，辛文秀，杨勇，张治针。一种1，6-二磷酸果糖在制备抗癌药物中的应用，中国发明专利:ZL201110066413.6,2012年)，本发明发现CIC抑制剂、EGCG(GDH抑制剂)和VK3(NAD+抑制剂)均能进一步显著提高FBP的抗癌活性。FBP与所述的其它代谢调控剂的一种或多种组合制成的复方制剂具有广谱抗癌活性，FBP稳定剂也可进一步提高FBP的抗癌药效。因此，本次公开的各种FBP组合物的敏感肿瘤包括FBP的敏感肿瘤(连晓媛，辛文秀，杨勇，张治针。一种1，6-二磷酸果糖在制备抗癌药物中的应用，中国发明专利:ZL201110066413.6,2012年)，具体有脑瘤、消化系统肿瘤、肾癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤、骨肉瘤和各种血液系统癌症。基于本专利提供的组合物针对的是各种肿瘤细胞的共性特征，因此专业人员可以理解其它在此未涉及的肿瘤也包括在本组合物的有效范围内。
本领域内人员可以理解，所述FBP、CIC抑制剂、GDH抑制剂(如EGCG)和NAD+抑制剂(如VK3)的药用形式包括它们的原形、它们及其各自的前药或衍生物在药学上可接受的盐包括但不限于化合物所形成的铵、钠、钾、钙、镁、锰、铜、甲胺、二甲胺、三甲胺、丁酸、乙酸、二氯乙酸、盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸、三氟乙酸、柠檬酸或者马来酸的酸根所成的盐及水合物，与药学上可接受的赋形剂或载体用于制备各种适合肿瘤治疗的普通药物制剂(包括经口服和注射给药的制剂)、栓剂、膜剂和应用新材料和新技术产生的各种新型制剂(包括控释双层片，控释纳米制剂、微囊、微球、肠溶制剂等)。优先地，以果糖-1，6-二磷酸三钠盐的8分子水合物优先的药用形式；EGCG为优先的GDH抑制剂。
本发明旨在提供一组针对肿瘤细胞代谢特征，以FBP与所述其它代谢调控剂(GDH抑制剂、CIC抑制剂和NAD+抑制剂)为活性成分的抗癌药物。这组药物包括FBP与所述的一种或多种其它代谢调控剂联合，制备出一系列的抗癌药物在治疗及预防肿瘤的药物的应用。
在此基础上加入一种FBP血药浓度稳定剂，构成的主药成分有：1)FBP与EGCG(或其它GDH抑制剂)或/和CIC抑制剂或/和VK3(或其它NAD+抑制剂)或/和GLS1抑制剂，所述主要成分的重量比例为：FBP：EGCG为1:0.001～1:1，优选1:0.01～1:0.5；FBP：CIC抑制剂1,2,3BTC为1:0.001～1:1，优选1:0.01～1:0.5；FBP：NAD+抑制剂VK3为1:0.00001～1:1,优选1:0.0001～1:0.1；FBP：GLS1抑制剂为1:0.001～1:1，优选1:0.01～1:0.1。2)在此基础上分别加入FBP稳定剂(或西格列丁或二甲双胍)，这组药物可根据肿瘤细胞的代谢特征进行选择性应用。稳定剂与FBP的重量比例为：FBP：二甲双胍为1:0.1～1:1，优选1:0.2～1:1；FBP：西格列汀为1:0.001～1:0.5，优选1:0.01～1:0.1；FBP与胰岛素(单位，IU)的比例为1：0.02～1：0.002，优选1:0.006～1:0.008。
本发明还提供另外一种组合使用方式，即各种降糖药的独立制剂作为FBP稳定剂与FBP和其它代谢调控剂制成的系列复合制剂在临床上联合用于预防和治疗各种肿瘤。
所述各种功能组分构成的药物组合物中，1,6-二磷酸果糖三钠盐的药用剂量为1-10000mg/kg体重/天，优选为50～1000mg/kg体重/天；EGCG的药用剂量为0.01～2000mg/kg体重/天，优选为10～500mg/kg体重/天；VK3的药用剂量为0.001～1000mg/kg体重/天，优选为0.01～100mg/kg体重/天；磷酸西格列汀的剂量为0.01～500mg/kg体重/天，优选为1～100mg/kg体重/天；二甲双胍的剂量为10～1000mg/kg体重/天，优选为50～300mg/kg体重/天。
为实现在同一药物制剂中，FBP稳定剂(西格列汀或二甲双胍)优先于1,6-二磷酸果糖释放，可制备相应的药物制剂，包括同时均匀释放的制剂和可实现先后释放的双层片或三层片。
本发明也适用于FBP、GDH抑制剂(如EGCG)和NAD抑制剂(如VK3)以及各种降糖药的各自独立制剂在临床上的联合使用，根据实际情况采取同时服用和先后服用。
所述药物组合物给药途径采取口服、舌下给药、直肠给药、静脉注射、肌肉注射、皮下注射以及结膜、鼻咽、口腔、直肠、尿道和膀胱给药。
上述药物组合物在制备抗肿瘤药物当中的应用，所述肿瘤包括但不限于脑瘤、消化系统肿瘤、肺癌、肾癌、黑素瘤、前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、骨肉瘤、血液系统癌症。
本专业领域内人员可以理解，所述药物组合物的联合作用机制在于可以针对肿瘤细胞代谢特点，在1，6-二磷酸果糖的作用基础上，进一步加强对肿瘤代谢网络的攻击能力和加剧氧化还原平衡的破坏，从而产生更加强大的抗肿瘤作用。因此，凡能进一步加强1,6-二磷酸果糖对肿瘤代谢网络攻击能力和氧化还原平衡系统破坏能力的物质或方法均在本专利保护范围之内。
所述“药用剂量”意为达到预防、有效控制或治疗疾病的目的，临床使用时医生遵循个体化治疗原则，依据患者疾病情况调整患病个体药物的剂量。因此，本发明中所提供的组合物剂量及比例应当理解不是对本发明中的药物组合物使用剂量及比例进行限制，而是对本发明的优选。
本发明中“患病个体”尤指人类。但应当理解为，在现有药理学理解范围内，人类药用剂量与范围可与动物，尤其是哺乳动物，例如大鼠、小鼠、狗等，进行换算得出相适应的药用剂量与范围。
本发明的药物组合物剂型包括但不限于普通片剂、双层片剂、多层片剂、缓释片剂、单室控释片剂、分散片、肠溶片、颗粒剂、丸剂、肠溶胶囊、定点释药片剂、普通胶囊剂、缓控释胶囊剂、含微丸或小片的胶囊、靶向制剂。
将所述FBP与EGCG或VK3药物组合物制备成为片剂。采用直接压片法、干、湿法制粒的方法制备，所选择的填充剂选自但不限于淀粉、乳糖、糊精、蔗糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、磷酸氢钙、甘露醇等；所选择的黏合剂与润湿剂选自但不限于蒸馏水、乙醇、聚维酮、淀粉浆、蔗糖浆、聚乙二醇、纤维素衍生物；所选择的崩解剂选自但不限于干淀粉、低取代羟丙基纤维素、海藻酸、羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮等。
将所述FBP与EGCG或VK3药物组合物制备成为颗粒剂。采用湿法制粒或干法制粒制备，所选择的填充剂选自但不限于淀粉、乳糖、糊精、蔗糖、预胶化淀粉、微晶纤维素、磷酸氢钙、甘露醇等；所选择的黏合剂与润湿剂选自但不限于蒸馏水、乙醇、聚维酮、淀粉浆、蔗糖浆、聚乙二醇、纤维素衍生物；所选择的崩解剂选自但不限于干淀粉、低取代羟丙基纤维素、海藻酸、羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮等。
本专业领域内人员可以理解，所述填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂是为了通过选择适宜的辅料、辅料配比及制备方法，将药物组合物可制备成适宜于临床应用的剂型，达到提高用药顺应性的目的或根据药物释放快慢、顺序调整的包括但不限于缓、控释制剂。因此，达到上述能够方便临床应用、减少服药次数、提高药物浓度等作用的制剂均应在本专利保护范围内。
本发明中要点及产生的有益效果在于：(1)现有针对肿瘤代谢的药物或方法主要是分别抑制糖酵解、抑制或促进线粒体氧、抑制谷氨酰胺代谢和抑制生物合成，不足于破坏肿瘤代谢网络，因此无法克服肿瘤代谢的异质性和可塑性产生的对治疗耐受。本发明提供的药物可全面逆转肿瘤代谢特征、摧毁肿瘤代谢网络，突出表现为在促进营养物质进入三羧酸循环和氧化磷酸化的同时可阻断糖酵解和三羧酸循环中间产物流向生物合成，破环氧化还原系统，可克服现有药物的缺陷并产生了突破性的抗癌药效的提高。(2)本发明提供的系列复方制剂以临床使用的常用非肿瘤药物为活性成分，安全性高，可快速完成转化研究，将为癌症治疗产生突破性进展。(3)因此，本发明首先揭示了FBP对肿瘤代谢网络的作用及其作用特点，并在此基础上加入其它代谢调控剂以增强对肿瘤代谢网络的攻击能力，从而进一步提高FBP的抗癌药效。
附图说明
图1是1,6-二磷酸果糖三钠盐抑制胶质瘤细胞的糖酵解。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐。
图2是1，6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯或甲萘醌对人胶质癌细胞的毒性。FBP：1，6-二磷酸果糖三钠盐；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；VK3：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP组、FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与对照组比***P<0.001；FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与FBP组、EGCG(或VK3)组比###P<0.001、&&&P<0.001。
图3是1，6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯或甲萘醌对人肝癌细胞的毒性。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；VK3：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP组、EGCG组、VK3组、FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与对照组比***P<0.001；FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与FBP组、EGCG(或VK3)组比###P<0.001、&&&P<0.001。
图4是1，6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯或甲萘醌对人肠癌细胞的毒性。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；VK3：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP组、EGCG组、FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与对照组比***P<0.001；FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与FBP组、EGCG(或VK3)组比###P<0.001、&&&P<0.001。
图5是1，6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯或甲萘醌对人白血病细胞的毒性。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；VK3：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP组、EGCG组、VK3、FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与对照组比***P<0.001；FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与FBP组、EGCG(或VK3)组比###P<0.001、&&&P<0.001。
图6是1，6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯或甲萘醌对人胃癌细胞的毒性。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；VK3：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP组、EGCG组、VK3、FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与对照组比***P<0.001；FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与FBP组、EGCG(或VK3)组比###P<0.001、&&&P<0.001。
图7是1，6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯或甲萘醌对人骨髓瘤细胞的毒性。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；VK3：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP组、VK3、FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与对照组比***P<0.001；FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与FBP组、EGCG(或VK3)组比###P<0.001、&&&P<0.001。
图8是1，6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯或甲萘醌对人宫颈癌或卵巢癌细胞的毒性。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；VK3：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP、EGCG、VK3、FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与对照组比***P<0.001；FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与FBP组、EGCG(或VK3)组比###P<0.001、&&&P<0.001。
图9是1，6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯或甲萘醌对黑色素瘤细胞的毒性。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；VK3：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP、EGCG、FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与对照组比***P<0.001；FBP+EGCG(或FBP+VK3)组与FBP组、EGCG(或VK3)组比###P<0.001、&&&P<0.001。
图10是1,6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯及甲萘醌对肿瘤细胞的毒性。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；E：表没食子儿茶素没食子酸酯；V：甲萘醌。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP+EGCG+VK3组与FBP组、FBP+EGCG组、FBP+VK3组比较***P<0.001、###P<0.001、&&&P<0.001。
图11是1,6-二磷酸果糖三钠盐联合2-脱氧-D-葡萄糖、二氯乙酸钠或二甲双胍对人肝癌细胞的生长抑制作用。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐，2-DG：2-脱氧-D-葡萄糖，DCA：二氯乙酸钠，Met：二甲双胍。
图12是1,6-二磷酸果糖三钠盐联合表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠肝瘤的生长抑制作用。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐，E：表没食子儿茶素没食子酸酯。注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。FBP、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001；EGCG组与对照组比*P<0.01；FBP+EGCG组EGCG组比&&&P<0.001、与FBP组比#P<0.01。
图13是降糖药升高1,6-二磷酸果糖三钠盐血药浓度峰值并稳定其血药浓度。FBP：1,6-二磷酸果糖；Met：二甲双胍；STG：西格列汀；Ins：胰岛素。注：采用最小显著性差异法分析实验数据。***P<0.001,*P<0.05对比于0小时(给药前)，#P<0.05对比于FBP单用组。
图14是降糖药提高1,6-二磷酸果糖三钠盐抗癌药效。FBP：1,6-二磷酸果糖；Met：二甲双胍；STG：西格列汀。注：采用最小显著性差异法分析实验数据。***P<0.001，**P<0.01对比于对照组(Con)；###P<0.001，#P<0.05对比于Met或STG组；&P<0.05对比于FBP组。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。但不应理解为本发明的范围仅限于以下实施例，应理解上述所实现的内容均属于本发明的范围，依照本发明内容进行的在任何本领域内的替换，均应属于本发明保护范围之内。
实施例1.1,6-二磷酸果糖抑制胶质瘤细胞的糖酵解
人胶质瘤细胞株(U87-MG,U-251,SHG-44)分别在含0.8mM和1.6mM的1，6-二磷酸果糖三钠盐、含1.6mM 2-脱氧葡萄糖的培养基中培养，12h、24h、36h分别测定培养基中细胞释放的糖酵解终产物乳酸的含量。实验结果显示：给药组乳酸水平均显著低于不加药对照组(CON)(给药组与对照组比***P<0.001)(表1a-c)。
人胶质瘤细胞株(U87-MG)在含0.8mM 1，6-二磷酸果糖三钠盐的培养基中培养1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h，用蛋白质印迹法分析各时间点细胞糖酵解通路关键代谢酶的水平变化，可见葡萄糖转运体1(GLUT1)、己糖激酶2(HK2)、丙酮酸激酶2(PKM2)和乳酸脱氢酶5(LDH5)均快速、持续下调(图1)。
实验结果表明：1,6-二磷酸果糖三钠盐可以抑制多种胶质瘤细胞的糖酵解活动并下调糖酵解通路中关键酶的蛋白水平。
表1a.1,6-二磷酸果糖处理后胶质瘤细胞U87-MG乳酸的相对水平(与对照组相比)
Figure BDA0001374893230000081
表1b.1,6-二磷酸果糖处理后胶质瘤细胞KNS-89乳酸的相对水平(与对照组相比)
Figure BDA0001374893230000082
表1c.1,6-二磷酸果糖处理后胶质瘤细胞SHG-44乳酸的相对水平(与对照组相比)
Figure BDA0001374893230000083
注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。给药组与对照组比*P<0.1显著差异，***P<0.001极显著差异。
FBP：1,6-二磷酸果糖；2-DG:2-脱氧-D-葡萄糖
实施例2.1,6-二磷酸果糖三钠盐促进胶质瘤细胞线粒体氧化磷酸化
大鼠胶质瘤细胞株(C6)，人胶质瘤细胞株(KNS-89,SHG-44)分别在含0.8mM或1.6mM果糖-1,6-二磷酸三钠盐的培养基中培养36h，可观察到各细胞株ATP/ADP比例(处理组与对照组比***P<0.001)、NADH/NAD+比例大幅升高(处理组与对照组比***P<0.001)，同时ATP水平显著升高(1,6-二磷酸果糖组与对照组比***P<0.001)(表2)。实验结果表明：1,6-二磷酸果糖促进胶质瘤细胞线粒体氧化磷酸化。
表2a.1,6-二磷酸果糖升高胶质瘤细胞ATP与ADP比例
Figure BDA0001374893230000091
表2b.1,6-二磷酸果糖升高胶质瘤细胞NADH与NAD+比例
Figure BDA0001374893230000092
注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。给药组与对照组比***P<0.001极显著差异。FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐
实施例3.1,6-二磷酸果糖三钠盐阻断糖酵解中间产物流向生物合成
人胶质瘤细胞株(U87MG)在含13C标记葡萄糖(U-13C-Glc)的培养基中培养并用1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐处理36h，采用液-质联用技术(LC-MS/MS)测定细胞内糖酵解通路、磷酸戊糖通路、“一碳单位”代谢通路和核酸从头合成通路的中间产物。实验结果显示：(1)处理组糖酵解中间产物1，6-二磷酸果糖(FBP)、3-磷酸甘油醛(GAP)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的水平较对照组显著升高(与对照组相比***P<0.001)，而糖酵解产物乳酸(Lac)的水平显著降低(与对照组相比***P<0.001)(表3a)；(2)处理组U-13C-Glc经丝氨酸生物合成通路生成的丝氨酸(Ser)(M+3)显著升高(对照组1±0.03，处理组1.57±0.04，对照组与处理组相比***P<0.001)，而丝氨酸经“一碳单位”代谢通路生成的甘氨酸(Gly)(M+2)显著降低(对照组1±0.07，处理组0.63±0.06，对照组与处理组相比***P<0.001)；(3)磷酸戊糖通路产物5-磷酸核糖(R5P)中13C标记的比例由对照组的68.96±5.03％降低为处理组的17.32±1.23％(对照组与处理组比***P<0.001)；(4)处理组游离的核酸生物合成中间产物三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸尿苷(UTP)、腺苷(A)、胞苷(C)、尿苷(U)、胸苷(T)中核糖带标记的比例较未处理组显著降低(与对照组相比*P<0.05；***P<0.001)(表3b)；同时，参与磷酸戊糖通路和丝氨酸代谢通路的相关酶G6PD、TKTL1、PHDGH、PSAT1、PSPH、SHMT1、MTDFH1、SHMT2、MTDFH2随处理时间延长而显著降低(图2)。
实验结果表明，1,6-二磷酸果糖三钠盐可使糖酵解中间产物在糖酵解通路中堆积，减少其通过磷酸戊糖通路，丝氨酸生物合成和“一碳单位”代谢，进而减少核酸的从头合成。
表3a.1,6-二磷酸果糖处理后糖酵解中间产物的相对水平(与对照组相比)
F6P FBP GAP PEP Lac
CON 1±0.01 1±0.05 1±0.18 1±0.06 1±0.01
FBP 2.06±0.04<sup>***</sup> 5.01±0.34<sup>***</sup> 4.27±0.07<sup>***</sup> 8.00±0.32<sup>***</sup> 1.06±0.02<sup>N.S.</sup>
表3b.1,6-二磷酸果糖处理后游离核苷及核苷酸中核糖的13C标记比例
F6P FBP GAP PEP Lac
CON 13.03±0.38 41.00±4.28 31.97±1.11 59.40±1.11 61.60±1.95
FBP 2.79±0.14<sup>***</sup> 34.99±1.63<sup>*</sup> 11.31±1.75<sup>***</sup> 13.71±0.54<sup>***</sup> 30.70±2.11<sup>***</sup>
注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。给药组与对照组比(N.S.无显著性差异；*P<0.05显著性差异；***P<0.001极显著性差异)。F6P：6-磷酸果糖；FBP：1,6-二磷酸果糖；GAP：3-磷酸甘油醛；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；Lac：乳酸；ATP：三磷酸腺苷；UTP：三磷酸尿苷；A：腺苷；C:胞苷；U:尿苷
实施例4.1,6-二磷酸果糖三钠盐阻断三羧酸循环中间产物流向生物合成
人胶质瘤细胞株(U87MG)在含13C标记的葡萄糖(U-13C-Glc)中培养并用1.6mM 1，6-二磷酸果糖三钠盐36h，采用液-质联用技术(LC-MS/MS)测定细胞内三羧酸循环中间产物、三羧酸循环中间产物衍生的氨基酸和核苷酸从头合成通路中间产物。实验结果显示：(1)处理组三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸(α-KG)和草酰乙酸(OAA)的水平较对照组显著升高(与对照组相比***P<0.001)(表4a)；(2)处理组三羧酸循环中间产物衍生的天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)较对照组显著降低(与对照组相比***P<0.001)(表4b)；(3)处理组游离核苷及核苷酸中嘌呤环和嘧啶环13C标记的比例显著降低(与对照组相比**P<0.005，***P<0.001)(表4c)。实验结果表明，1，6-二磷酸果糖三钠盐可阻断三羧酸循环中间产物转化为氨基酸，进而阻断其参与的核酸从头合成。
表4a.1,6-二磷酸果糖处理后部分三羧酸循环中间产物的相对水平(与对照组相比)
α-KG OAA
CON 1±0.01 1±0.14
FBP 1.61±0.01<sup>***</sup> 1.87±0.04<sup>***</sup>
表4b.1,6-二磷酸果糖处理后部分氨基酸的相对水平(与对照组相比)
Figure BDA0001374893230000101
Figure BDA0001374893230000111
表4c.1,6-二磷酸果糖处理后游离核苷及核苷酸中嘌呤环和嘧啶环的13C标记比例
ATP A G UTP U
CON 38.26±1.50 12.41±1.19 53.75±1.47 50.67±0.96 20.58±2.30
FBP 23.77±0.57<sup>***</sup> 7.70±1.50<sup>**</sup> 41.83±4.06<sup>**</sup> 18.19±0.87<sup>***</sup> 8.33±0.90<sup>***</sup>
注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。给药组与对照组比(**显著性差异；***P<0.001极显著性差异)
FBP：1,6-二磷酸果糖；α-KG：α-酮戊二酸；OAA：草酰乙酸；Asp天冬氨酸；Glu：谷氨酸；ATP：三磷酸腺苷；UTP：三磷酸尿苷；A：腺苷；C:胞苷；U:尿苷
实施例5.1,6-二磷酸果糖三钠盐阻断三羧酸中间产物流出线粒体
人胶质瘤细胞株(U87MG)在含1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐的培养基中培养36h后分离胞浆和线粒体，液-质联用技术(LC-MS/MS)分别测定胞浆和线粒体中三羧酸循环中间产物的水平。可见处理组三羧酸循环中间产物乙酰辅酶A(Ac-CoA)、柠檬酸(Cit)、α-酮戊二酸(α-KG)和草酰乙酸(OAA)在胞浆中的水平显著降低(与对照组相比**P<0.01；***P<0.001)，而在线粒体中的水平显著升高(与对照组相比***P<0.001)(表5)。实验结果表明，1，6-二磷酸果糖三钠盐可阻断三羧酸循环代谢中间产物流出线粒体。
表5.胞浆和线粒体中三羧酸循环中间产物的相对水平(与对照组相比)
Figure BDA0001374893230000112
注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。处理组与对照组比(*P<0.05显著性差异；***P<0.001极显著性差异)
FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；Ac-CoA：乙酰辅酶A；Cit：柠檬酸；α-KG：α-酮戊二酸；OAA：草酰乙酸；Cyto：胞浆；Mito：线粒体
实施例6.1,6-二磷酸果糖三钠盐破坏胶质瘤细胞氧化还原平衡
大鼠胶质瘤细胞株(C6)，人胶质瘤细胞株(KNS-89)在含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐的培养基中培养，随着处理时间的延长细胞内活性氧水平(ROS)逐步升高(表6a)，而线粒体膜电位(MMP)则逐步降低(表6b)。
大鼠胶质瘤细胞株(C6)，人胶质瘤细胞株(KNS-89,SHG-44)在含1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐的培养基中培养36h，液-质联用技术(LC-MS/MS)测定细胞中重要的抗氧化物质。实验结果表明：谷胱甘肽(GSH,GSSG)水平急剧降低(表6c)，同时NADPH/NADP+比例剧烈下降(表6d)。
实验结果表明：1,6-二磷酸果糖三钠盐增加活性氧的生成，抑制抗氧化成分谷胱甘肽的合成，阻碍NADP+向NADPH转化，从而从多个层面破坏胶质瘤细胞氧化还原平衡。
表6a.活性氧的相对水平(与对照组相比)
0h 12h 24h 48h 72h
C6 1±0.04 1.26±0.04<sup>***</sup> 1.89±0.03<sup>***</sup> / /
U-251 1±0.02 1.20±0.04 1.19±0.03 1.42±0.03<sup>***</sup> 1.82±0.03<sup>***</sup>
表6b.线粒体膜电位的相对水平(与对照组相比)
0h 12h 24h 48h 72h
U251 1±0.03 1.08±0.03 1.18±0.01 0.6±0.06<sup>***</sup> 0.40±0.07<sup>***</sup>
C6 1±0.08 0.8±0.14<sup>***</sup> 0.6±0.11<sup>***</sup> 0.1±0.09<sup>***</sup> 0.10±0.07<sup>***</sup>
表6c.GSH与GSSG的相对含量(与对照组相比)
Figure BDA0001374893230000121
表6d.NADPH与NADP+的相对比例(与对照组相比)
Figure BDA0001374893230000122
注：采用单因素方差分析的方法分析实验数据,用LSD方法检测各组之间显著性差异。(处理组与对照组比***P<0.001极显著性差异)。
FBP：1,6-二磷酸果糖三钠盐；GSH：还原型谷胱甘肽；GSSG：氧化型谷胱甘肽
讨论与小结(对实施例1-6)—FBP逆转肿瘤代谢特征
肿瘤细胞通过代谢重编程，特别是可产生大量的糖酵解中间产物和三羧酸循环中间产物并将这些中间产物用于生物合成，从而为肿瘤细胞的快速分裂增殖和生长提供前提条件。此外，来源于三羧酸循环中间产物的乙酰辅酶A、富马酸和琥珀酸支持着肿瘤表观遗传学特征，从而参与了促癌蛋白表达上调和抑癌蛋白表达下调的调节。FBP促进葡萄糖和谷氨酰胺进入三羧酸循环和氧化磷酸化并产生大量的ROS，还可阻断糖酵解和三羧酸循环中间产物流向生物合成导致生物合成前提物质和内源性抗氧化物质的匮乏，并阻断三羧酸中间产物流出线粒体并导致胞浆中乙酰辅酶A、富马酸和琥珀酸缺乏。可见,FBP可逆转肿瘤代谢特征，破坏氧化还原平衡系统，破坏肿瘤表观遗传学特征。
实施例7.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或甲萘醌(VK3)对人胶质癌细胞的毒性
培养24小时的人胶质瘤细胞株U87-MG或KNS-89分别在含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐、50或100μM EGCG、20μM VK3，或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及50/100μMEGCG或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及20μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG/VK3在人胶质瘤细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 0.8mM时，联合EGCG使得FBP对KNS-89、U87MG生长抑制率从42％和32％提高到了65％及50％(FBP组、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001，FBP+EGCG组与FBP组、EGCG组比###P<0.001、&&&P<0.001)；FBP 0.8mM时，联合VK3使得FBP对U87MG生长抑制率从35％提高到了60％(FBP组、FBP+VK3组与对照组比***P<0.001，FBP+VK3组与FBP组、VK3组比###P<0.001、&&&P<0.001)(图2)。实验结果表明：FBP联合EGCG或VK3可以对胶质瘤细胞产生协同致死作用。
实施例8.1，6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或甲萘醌(VK3)对人肝癌细胞的毒性
培养24小时的人肝癌细胞Bel-7402、Huh7分别在含0.4、0.8或1.6mM 1，6-二磷酸果糖三钠盐，25、50μM EGCG，10、25μM VK3，或同时含0.4(或0.8)mM 1，6-二磷酸果糖三钠盐及25(或50)μM EGCG或同时含1.6mM 1，6-二磷酸果糖三钠盐及10(或25)μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(SulforhodamineB,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG/VK3在人肝癌细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 0.4/0.8mM时，联合EGCG使得FBP对Bel-7402、huh7生长抑制率从9％和10％提高到了80％及62％(FBP组、EGCG组、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001，FBP+EGCG组与FBP组、EGCG组比###P<0.001、&&&P<0.001)；FBP 1.6mM时，联合VK3使得FBP对Bel-7402、huh7生长抑制率从17％和40％提高到了76％和63％(FBP组、VK3组、FBP+VK3组与对照组比***P<0.001，FBP+VK3组与FBP组、VK3组比###P<0.001、&&&P<0.001)(图3)。实验结果表明：FBP联合EGCG或VK3可以对人肝癌细胞产生协同致死作用。
实施例9.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或甲萘醌(VK3)对人肠癌细胞的毒性
培养24小时的人肠癌细胞株HT29分别在含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐、25μMEGCG、10μM VK3或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及25μM EGCG或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及10μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG/VK3在人肠癌细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 0.8mM时，联合EGCG使得FBP对HT-29生长抑制率从37％提高到了68％(FBP组、EGCG组、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001，FBP+EGCG组与FBP组、EGCG组比###P<0.001、&&&P<0.001)；FBP 0.8mM时，联合VK3使得FBP对HT-29生长抑制率从45％提高到了75％(FBP组、FBP+VK3组与对照组比***P<0.001，FBP+VK3组与FBP组、VK3组比###P<0.001、&&&P<0.001)(图4)。实验结果表明：FBP联合EGCG或VK3可以对肠癌细胞产生协同致死作用。
实施例10.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或甲萘醌(VK3)对人白血病细胞的毒性
培养24小时的人白血病细胞Jurkat或K562分别在含0.8或1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐,5μM EGCG、5或2μM VK3或同时含1.6mM 1，6-二磷酸果糖三钠盐及5μM EGCG或同时含0.8(或1.6)mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及2(或5)μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG/VK3在人白血病细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 1.6mM时，联合EGCG使得FBP对Jurkat生长抑制率从44％提高到了72％(FBP组、EGCG组、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001，FBP+EGCG组与FBP组、EGCG组比###P<0.001、&&&P<0.001)；FBP 0.8/1.6mM时，联合VK3使得FBP对K562及Jurkat生长抑制率从35％和33％提高到了60％和68％(FBP组、VK3、FBP+VK3组与对照组比***P<0.001，FBP+VK3组与FBP组、VK3组比###P<0.001、&&&P<0.001)(图5)。实验结果表明：FBP联合EGCG或VK3可以对人白血病细胞产生协同致死作用。
实施例11.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或甲萘醌(VK3)对人胃癌细胞的毒性
培养24小时的人胃癌细胞株SGC-7901分别在含0.8或1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐、50μM EGCG、20μM VK3或同时含1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及50μM EGCG或同时含0.8mM1,6-二磷酸果糖三钠盐及20μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG/VK3在人胃癌细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 1.6mM时，联合EGCG使得FBP对SGC-7901生长抑制率从42％提高到了91％(FBP组、EGCG组、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001，FBP+EGCG组与FBP组、EGCG组比###P<0.001、&&&P<0.001)；FBP0.8mM时，联合VK3使得FBP对K562及SGC-7901生长抑制率从5％提高到了70％(FBP组、VK3、FBP+VK3组与对照组比***P<0.001，FBP+VK3组与FBP组、VK3组比###P<0.001、&&&P<0.001)(图6)。实验结果表明：FBP联合EGCG或VK3可以对胃癌细胞产生协同致死作用。
实施例12.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或甲萘醌(VK3)对人骨髓瘤细胞的毒性
培养24小时的人骨髓瘤细胞株U266分别在含0.4或0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐、10μM EGCG、5μM VK3或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及10μM EGCG或同时含0.4mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及5μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG/VK3在人骨髓瘤细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 0.8mM时，联合EGCG使得FBP对SGC-7901生长抑制率从51％提高到了75％(FBP组、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001，FBP+EGCG组与FBP组、EGCG组比###P<0.001、&&&P<0.001)；FBP 0.4mM时，联合VK3使得FBP对K562及SGC-7901生长抑制率从38％提高到了79％(FBP组、VK3、FBP+VK3组与对照组比***P<0.001，FBP+VK3组与FBP组、VK3组比###P<0.001、&&&P<0.001)(图7)。实验结果表明：FBP联合EGCG或VK3可以对骨髓瘤细胞产生协同致死作用。
实施例13.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或甲萘醌(VK3)对宫颈癌或卵巢癌细胞的毒性
培养24小时的人宫颈癌细胞株Hela或卵巢癌细胞株SK-OV-3分别在含0.4、0.8或3.2mM1,6-二磷酸果糖三钠盐、50μM EGCG、10μM VK3或同时含0.4mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及50μM EGCG或同时含0.8或3.2mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及20μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG/VK3在宫颈癌或卵巢癌细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 0.4mM时，联合EGCG使得FBP对SK-OV-3生长抑制率从13％提高到了73％(FBP组、EGCG组、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001，FBP+EGCG组与FBP组、EGCG组比###P<0.001、&&&P<0.001)；FBP 0.8/3.2mM时，联合VK3使得FBP对K562及SGC-7901生长抑制率从25％和33％提高到了80％和85％(FBP组、VK3、FBP+VK3组与对照组比***P<0.001，FBP+VK3组与FBP组、VK3组比###P<0.001、&&&P<0.001)(图8)。实验结果表明：FBP联合EGCG或VK3可以对宫颈癌及卵巢癌细胞产生协同致死作用。
实施例14.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)或甲萘醌(VK3)对黑色素瘤细胞的毒性
培养24小时的小鼠黑色素瘤细胞株B16分别在含0.4或0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐、50μM EGCG、5μM VK3或同时含0.8mM 1，6-二磷酸果糖三钠盐及50μM EGCG或同时含0.4mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及5μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG/VK3在黑色素瘤细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 0.8mM时，联合EGCG使得FBP对B16生长抑制率从32％提高到了62％(FBP组、EGCG组、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001，FBP+EGCG组与FBP组、EGCG组比###P<0.001、&&&P<0.001)；FBP 0.4mM时，联合VK3使得FBP对B16生长抑制率从10％提高到了83％(FBP组、FBP+VK3组与对照组比***P<0.001，FBP+VK3组与FBP组、VK3组比###P<0.001、&&&P<0.001)(图9)。实验结果表明：FBP联合EGCG或VK3可以对黑色素瘤细胞产生协同致死作用。
实施例15.1，6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)及甲萘醌(VK3)对肿瘤细胞的毒性
培养24小时的人肝癌细胞Bel-7402或人胶质瘤细胞U87-MG分别在含0.8或1.6mM1,6-二磷酸果糖三钠盐、25或50μM EGCG、5或25μM VK3或同时含1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及25μM EGCG或同时含1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及25μM VK3；或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及50μM EGCG或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及5μM VK3；或同时含1.6mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐、25μM EGCG及25μM VK3或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐、50μM EGCG及5μM VK3的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合EGCG及VK3在肝癌及胶质瘤细胞中表现出很强的协同致死作用，当FBP 1.6mM时，联合EGCG及VK3使得FBP对Bel-7402生长抑制率从17％提高到了83％；FBP 0.8mM时，联合EGCG及VK3使得FBP对U87MG生长抑制率从32％提高到了54％(FBP+EGCG+VK3组与FBP组、FBP+EGCG组、FBP+VK3组比较***P<0.001、###P<0.001、&&&P<0.001)(图10)。实验结果表明：FBP联合EGCG及VK3可以对肿瘤细胞产生更强的协同致死作用，其协同作用强于组合物中各药物单独用药或两两组合用药。
实施例16.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)、二氯乙酸钠(DCA)或二甲双胍(Met)对人肝癌细胞的毒性
培养24小时的人肝癌细胞Bel-7402或人胶质瘤细胞KNS-89分别在含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐、0.8mM 2-DG、0.8mM DCA或0.2mM Met,或同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及0.8mM 2-DG、同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及0.8mM DCA、同时含0.8mM 1,6-二磷酸果糖三钠盐及0.2mM Met的培养基中再培养72小时。同时设不加药处理组(也称对照组，Con)。用磺基罗丹明B(Sulforhodamine B,SRB)染色分析方法测定细胞活力。结果显示，FBP联合DCA及2-DG对Bel-7402及KNS-89产生了拮抗作用，联合Met无影响(图11)。实验结果表明：FBP联合2-DG、DCA或Met不会对人肝癌细胞产生协同致死作用，证明FBP与EGCG和VK3的联合用药并不是简单的抗肿瘤协同作用，而是基于FBP独特作用机制设计的抗肿瘤策略。
实施例17.1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)联合EGCG对小鼠肝瘤的生长抑制作用
按常规方法将小鼠肝癌细胞H22接种于成年雄性ICR小鼠右侧腋皮下，于接种24小时后，随机分为以下实验组：生理盐水对照组、1,6-二磷酸果糖三钠盐钠组(FBP)组(500mg/kg,i.g)、EGCG组(50mg/kg,i.g)、药物组合物组(FBP 500mg/kg+EGCG 50mg/kg，i.g),动物数每组7只。每天给药三次，连续7天，并观测实验过程中动物的情况，于末次给药24小时后处死动物，取肿瘤块称重，以每组动物的平均瘤重量作为疗效指标。结果表明：1,6-二磷酸果糖三钠盐钠对肿瘤生长的抑制率为45.39％，EGCG对肿瘤生长抑制率为32％，而FBP与EGCG联合使用后，发挥了协同致死抗肿瘤药效，整体抗肿瘤作用也大大提高，抑制率达到74.19％(FBP、FBP+EGCG组与对照组比***P<0.001；EGCG组与对照组比*P<0.01；FBP+EGCG组EGCG组比&&&P<0.001、与FBP组比#P<0.01)(见附图12)。
讨论与小结(对实施例7-17)
FBP与EGCG联合产生协同致死。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶茶多酚的主要组成成分，是已知的谷氨酸脱氢酶(GDH)抑制剂。因此，本发明对比研究了EGCG和FBP单独以及二者联合的抗癌药效。研究结果发现，在低剂量甚至是无效剂量的条件下，二者联合可产生显著的抗癌药效，证明二者联合可以对癌细胞产生协同致死作用，而且这种协同致死具有广谱性。
合成抑制剂甲萘醌(维生素K3，VK3)可加强FBP的抗癌活性。VK3属于维生素类药物，临床上用于维生素K缺乏所引起的出血性疾病，如新生儿出血、肠道吸收不良所致维生素K缺乏及低凝血酶原血症等。VK3是一种已知的NAD+合成抑制剂，因此本发明对比研究了VK3和FBP单独以及二者联合的抗癌药效。研究结果发现，在低剂量甚至是无效剂量的条件下，二者联合可产生显著的抗癌药效，证明二者联合可以对癌细胞产生协同致死作用，而且这种协同致死具有广谱性。
FBP与EGCG和VK3联合可进一步加强抗癌活性。根据肿瘤代谢网络的特点，预期联合FBP与EGCG和VK3可产生比它们三者之间任意两药联合更强大的抗癌药效。实验研究发现，将FBP联合EGCG及VK3能进一步提高抗肿瘤作用，相比于任意两药联合具有更强的抗癌药效和更宽泛的抗癌谱。
代谢调控活性物质2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)、二氯乙酸钠(DCA)或二甲双胍(Met)不会显著增强FBP的抗癌药效。为了证明FBP、EGCG和VK3的联合对癌细胞产生的协同致死的特异性，也就是说FBP不是与任何通过影响肿瘤代谢或其它机制而具有抗癌活性的物质或药物联合均能产生更强的抗癌药效，本发明研究了FBP分别与糖酵解抑制剂2-脱氧-葡萄糖(2DG)、线粒体氧化磷酸化促进剂二氯乙酸(DCA)和线粒体氧化磷酸化抑制剂二甲双胍(Met)联合的抗癌活性。从作用机制上分析，预期FBP与这些物质联合不会产生协同致死的作用。的确，研究结果证明，有效剂量的2DG、DCA或Met与FBP联合未能产生类似FBP与EGCG或VK3联合的协同抗癌药效。这就证明，FBP与EGCG或/和VK3的联合是它们作用机制互补的结果，而不是各自抗癌药效的简单相加。
实施例18.降糖药升高1,6-二磷酸果糖三钠盐(FBP)血药浓度峰值、稳定其血药浓度并提高FBP抗癌药效
将6周龄ICR小鼠分为4组：生理盐水对照组、1,6-二磷酸果糖三钠盐组(500mg/kg,i.g)、1,6-二磷酸果糖钠联合二甲双胍(150mg/kg,i.g)组、1,6-二磷酸果糖三钠盐联合西格列汀(20mg/kg)组、1,6-二磷酸果糖三钠盐钠联合胰岛素(4U/kg)组，每组7只小鼠，所有组别均采用灌胃给药，二甲双胍、西格列汀及胰岛素提前于1,6-二磷酸果糖三钠盐0.5小时给药。于1，6-二磷酸果糖三钠盐给药后1.5及3小时，取各组别小鼠血液，分离血浆，酶法测定血液中1,6-二磷酸果糖浓度。如附图13所示，1，6-二磷酸果糖三钠盐组给药1.5小时后血液中FBP浓度从53.3μg/ml升高到77.5μg/ml，3小时后下降至70μg/ml(1,6-二磷酸果糖三钠盐组1.5小时与0小时比较*P<0.001)；而联合二甲双胍、胰岛素或西格列汀后，1.5小时后FBP血药浓度分别提高至97.5、97.5及106μg/ml，3小时后各组1,6-二磷酸果糖血药浓度分别为82.5、89.2及91.7μg/ml，均高于对照组(联合给药组1.5、3小时与0小时比较*P<0.001)，且相较于1,6-二磷酸果糖三钠盐单用组，联合给药组在达峰浓度及血药浓度维持时间上均大大提高(1.5小时联合给药组与1,6-二磷酸果糖三钠盐组比较#P<0.05，3小时联合西格列汀及胰岛素组与FBP组比较#P<0.05)。以上结果表明，FBP联合二甲双胍、胰岛素或西格列汀可以有效提高FBP峰浓度并稳定FBP在体内的血药浓度的维持时间，从而能够有效提高FBP体内抗肿瘤作用。
按常规方法将小鼠肝癌细胞H22接种于成年雄性ICR小鼠右侧腋皮下，于接种24小时后，随机分为以下实验组：生理盐水对照组、1,6-二磷酸果糖三钠盐组(FBP)组(500mg/kg,i.g)、二甲双胍(Met)组(150mg/kg,i.g)、药物组合物(F+M)组(FBP 500mg/kg+Met150mg/kg，i.g),或者生理盐水对照组、1,6-二磷酸果糖三钠盐组(FBP)组(500mg/kg,i.g)、西格列汀(STG)组(20mg/kg,i.g)、药物组合物(FBP+STG)组(FBP 500mg/kg+STG 20mg/kg，i.g)，动物数每组7只。每天给药三次，二甲双胍或西格列汀提前于1,6-二磷酸果糖三钠盐0.5小时给药，连续7天，并观测实验过程中动物的情况，于末次给药24小时后处死动物，取肿瘤块称重，以每组动物的平均瘤重量作为疗效指标。如图14所示：1,6-二磷酸果糖钠对肿瘤生长的抑制率为54.39％(1,6-二磷酸果糖组与对照组比较***P<0.001)，二甲双胍单独使用与对照组平均瘤重无显著性差异，西格列汀单独使用对肿瘤生长抑制率为46.12％(西格列汀组与对照组比较***P<0.001)，其细胞实验中并未显示出抗肿瘤作用，而整体实验中显示出一定的抗肿瘤作用，表明西格列汀可能通过刺激机体免疫而发挥抗肿瘤作用；FBP与二甲双胍或西格列汀联合使用后，其整体抗肿瘤作用大大提高，抑制率分别达到74.2％和75.3％(联合用药组与对照组比较***P<0.001；二甲双胍联合1,6-二磷酸果糖组与二甲双胍组比较###P<0.001、与1,6-二磷酸果糖组比较#P<0.05；西格列汀联合1,6-二磷酸果糖组与西格列汀组、1,6-二磷酸果糖组比较#P<0.05)。
讨论与小结——用抗糖尿病药物升高FBP的血药浓度峰值并维持其长时间的有效血药浓度，进一步提高FBP的抗癌药效
FBP作为糖代谢中间产物，外源性FBP进入体内后可能在肝脏、肾脏和肌肉内通过糖异生通路被用于合成葡萄糖而后合成糖原，从而被快速消耗，显然这种快速消耗不利于FBP抗癌血药浓度的维持，进而削弱甚至破坏FBP的抗癌药效。的确，本发明发现多次给以FBP可激活FBP通过糖原异生代谢通路的代谢活动包括FBP的糖异生第一个催化酶FBPase1，从而导致了随FBP给药时期的延长FBP的血药浓度下降；而现在临床使用的降糖药西格列汀和二甲双胍均具有抑制糖异生和糖原合成的作用，本发明发现：西格列汀和二甲双胍分别与FBP联合均能显著升高FBP的血药浓度峰值，并延长高水平的FBP血药浓度的时间。与此血药浓度变化一致，西格列汀、二甲双胍和胰岛素分别与FBP联合均能显著升高FBP的抗癌药效。以上研究结果支持了抑制FBP的糖异生通路维持FBP血药浓度对实现FBP的抗癌药用价值的意义。因此，本专业领域人员应当理解，除FBP与各种临床上使用的降糖药以外，FBP与FBPase1抑制剂联合在制备抗癌药物中的应用也在本专利的保护范围之内。
实施例19.FBP/EGCG或FBP/VK3药物组合物片剂的制备
采用直接压片法制备FBP/EGCG或FBP/VK3片剂，将乳糖141g过60目筛，与微晶纤维素205g过筛混合3次使均匀，再加入果糖-1,6-二磷酸三钠盐80g、EGCG 8g或VK3 3g，与混合好的辅料按等体积混合均匀后压片，即得。
实施例20.FBP/EGCG或FBP/VK3药物组合物颗粒剂的制备
采用湿法制粒制备FBP/EGCG或FBP/VK3颗粒剂，称取果糖-1,6-二磷酸三钠盐、甘露醇、糖粉、聚乙烯吡咯烷酮，混匀得A；取EGCG/VK3加入适量无水乙醇，加入A中，混匀后再加入聚乙烯吡咯烷酮-30％乙醇溶液中制成适宜软材；将软材过14目筛，制粒干燥后，即得。
实施例21.FBP-EGCG-STG双层片的制备
表7双层片处方：
Figure BDA0001374893230000191
分别将A层与B层按处方将活性成分、填充剂与粘合剂混合，采用湿法制粒机湿法制粒(I搅拌II剪切，5分钟)，在箱式干燥箱中60℃干燥并整粒；将A、B层干燥颗粒按照处方分别与崩解剂和润滑剂在混合机中混合约40分钟后，双层片压片机压制，即得FBP-EGCG-STG双层片。所得双层片外光完整、光洁，脆碎度均≤0.9％，片重无显著性差异，崩解时限均≤7分钟。所得双层片规格为0.5克/片。

Claims (4)

1.一种由1,6-二磷酸果糖与代谢调控剂及辅药构成的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的1,6-二磷酸果糖为果糖-1,6-二磷酸原形及其在药学上可接受的盐，所述的代谢调控剂为谷氨酸脱氢酶抑制剂和NAD+抑制剂，谷氨酸脱氢酶抑制剂选用表没食子儿茶素没食子酸酯，NAD+抑制剂选用甲萘醌，所述的辅药为1,6-二磷酸果糖稳定剂，1,6-二磷酸果糖稳定剂选用西格列汀。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的1,6-二磷酸果糖与代谢调控剂和1,6-二磷酸果糖稳定剂组合的重量比例为：1,6-二磷酸果糖：表没食子儿茶素没食子酸酯为1:0.01～1:0.5； 1,6-二磷酸果糖：甲萘醌为 1:0.0001～1:0.1； 1,6-二磷酸果糖：西格列汀为 1:0.01～1:0.1。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的1,6-二磷酸果糖为果糖-1,6-二磷酸三钠盐的8分子水合物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物由组合物与药学上可接受的赋形剂或载体制备，药物制剂形式为固体制剂或液体制剂。
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"Cancer cell metabolism, epigenetics and the potential influence of dietary components – A perspective";Gerhäuser C.，et al.;《Biomedical Research》;20121231;第23卷(第1期);摘要, 第2页图1 *
联合应用甲萘醌、维生素C和盐霉素治疗胶质瘤的体外研究;马驰;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20140915(第09期);第E072-95：7页 *

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