CN103529008A - 一种测定中药材中二氧化硫残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种测定中药材中二氧化硫残留量的方法，它包括如下操作步骤：（1）取待测中药材，制备供试品溶液；（2）取亚硫酸盐为对照品，制备对照品溶液；（3）分别取供试品溶液、对照品溶液，在缓冲液中，加入邻苯二甲醛溶液和铵盐溶液反应，待反应结束后，终止反应后，静置，再采用荧光衍生法测定中药材中二氧化硫残留量。本发明对中药二氧化硫残留量的测定方法，能够准确、快速测定中药材中二氧化硫的残留量，与药典方法准确度相当，但反应方法更为简便，实用性更好。

Description

一种测定中药材中二氧化硫残留量的方法

技术领域

本发明涉及一种测定中药材中二氧化硫残留量的方法。

背景技术

硫磺是一种古老的用于中药防虫的药物，不少中药材产地加工时都会硫熏，利用硫磺加热产生的二氧化硫达到漂白药材及杀菌防霉防虫的目的，由于硫磺熏蒸后中药材的性状及化学成分多有改变，且熏蒸后的中药材中残留的二氧化硫对人体有很大伤害，《中国药典》2005年版取消了药材的“硫磺熏蒸养护法”，并在《中国药典》2010年版附录中增加了基于蒸馏法的二氧化硫残留量测定法，由于该法要求专门的全玻璃蒸馏仪器，推广很慢，其他测定中药二氧化硫残留量的方法尚有盐酸副玫瑰苯胺法、高效液相色谱法、气相色谱法和离子色谱法等，但盐酸副玫瑰苯胺法操作过程中需使用有毒的四氯汞钠溶液，几种色谱法需要相应的设备及填充柱等，检测成本较高。

目前还未见将荧光衍生法用于中药材二氧化硫残留量的测定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定中药材中二氧化硫残留量的方法。

本发明提供了一种测定中药材中二氧化硫残留量的方法，它包括如下操作步骤：

（1）取待测中药材，制备供试品溶液；

（2）取亚硫酸盐为对照品，制备对照品溶液；

（3）分别取供试品溶液、对照品溶液，在缓冲液中，加入邻苯二甲醛溶液和铵盐溶液反应，待反应结束后，终止反应后，静置，再采用荧光衍生法测定中药材中二氧化硫残留量。

其中，步骤（1）中，供试品溶液的制备方法如下：

取待测中药材，粉碎后，加入无机碱溶液，提取，滤过，取滤液，稀释，即得。

进一步地，供试品溶液的制备方法如下：

取待测中药材，粉碎成细粉，加入中药材20～50倍v/w量的氢氧化钠溶液，振荡提取，滤过，取滤液稀释20～30倍，即得。

更进一步地，步骤（1）中，制备供试品溶液的方法如下：

取待测中药材，粉碎成细粉，加入中药材20-30倍v/w量的0.5%w/v氢氧化钠溶液，在40℃下，200r·min^-1振荡提取，滤过，取滤液稀释25倍，即得。

其中，步骤（2）中，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠。

其中，步骤（3）中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液pH值为6.37～6.47；邻苯二甲醛溶液的浓度为1mmoL·L^-1，用量为2～3mL；所述铵盐溶液为4～6mmoL·L^-1的乙酸铵溶液，用量为1.5～3mL；反应温度为45-60℃水浴，反应时间为3min以上；

所述荧光衍生法的条件如下：以试剂空白为参比，激发波长为321±5nm，发射波长为384±5nm。

进一步地，步骤（3）中，所述缓冲液为Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液系统，pH值为6.44；邻苯二甲醛溶液的浓度为1mmoL·L^-1，用量为2.5mL；乙酸铵溶液的浓度为5mmoL·L^-1，用量为1.5mL；反应温度为50℃水浴，反应时间为5min以上；

所述荧光衍生法的条件如下：以空白为参比，激发波长为321nm，发射波长为384nm。

更进一步地，步骤（3）中，反应时间为5～10min。

其中，步骤（3）中，静置的时间为30～50min；优选为40min。

优选地，它包括如下操作步骤：

（1）取待测中药材细粉1g，加入0.5%w/v氢氧化钠溶液25～30mL，40℃下，200r·min^-1振荡提取30min，滤过，取1.0mL滤液稀释至25mL，即得供试品溶液；

（2）取亚硫酸盐为对照品，制备浓度为1×10^-3mmol·L^-1～18×10^-3mmol·L^-1对照品溶液；

（3）分别取供试品溶液、对照品溶液于10ml容量瓶中，先加入2.0mLpH=6.44的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液，再依次加入2.5mL1mmoL·L^-1邻苯二甲醛溶液及1.5mL5mmoL·L^-1乙酸铵溶液，混匀，用水定容，于50℃水浴中恒温5min，取出，立即放入冰水中冷却，终止反应，静置40min，以试剂空白为参比，在激发波长为321nm、发射波长为384nm时测定样品和对照品的相对荧光强度，计算待测中药材中的二氧化硫残留量。

其中，所述待测中药材为百合、葛根、党参、山药、白芍、薏苡仁、黄芪、麦冬、枸杞子、当归中的一种或两种以上的组合。

本发明对中药二氧化硫残留量的测定方法，能够准确、快速测定中药材中二氧化硫的残留量，反应方法更为简便，无需使用昂贵试验仪器或有毒试剂，检测成本更低，操作更安全，更适用于中药材二氧化硫残留量的快速测定。

附图说明

图1激发与发射光谱

图2pH对衍生物荧光强度的影响

图3缓冲液用量对荧光强度的影响

图4邻苯二甲醛溶液用量对荧光强度的影响

图5乙酸铵浓度对荧光强度的影响

图6乙酸铵用量对荧光强度的影响

图7加热温度对荧光强度的影响

图8反应时间对荧光强度的影响

图9静置时间对荧光强度的影响

图10NaOH溶液浓度对二氧化硫含量的影响

图11振荡速度对二氧化硫含量的影响

图12温度对二氧化硫含量的影响

图13提取时间对二氧化硫含量的影响

具体实施方式

实施例1本发明对中药材中二氧化硫的快速检测方法的建立

（1）取待测中药材细粉1g，加入0.5%w/v氢氧化钠溶液25mL，40℃下，200r·min^-1振荡提取30min，滤过，取1.0mL滤液稀释至25mL，即得供试品溶液；

（2）取亚硫酸盐为对照品，制备浓度为1、3、7、12、15、18×10^-3mmol·L^-1的对照品溶液；

（3）分别取适量供试品溶液、对照品溶液于10ml容量瓶中，先加入2.0mL pH=6.44的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液，再依次加入2.5mL1mmoL·L^-1邻苯二甲醛溶液及1.5mL5mmoL·L^-1乙酸铵溶液，混匀，用水定容，于50℃水浴中恒温5min，取出，立即放入冰水中冷却，终止反应，静置40min，以试剂空白为参比，在激发波长为321nm、发射波长为384nm时测定样品和对照品的相对荧光强度，计算待测中药材中的二氧化硫残留量。

实施例2本发明检测方法的优化

（一）荧光衍生反应方法的条件筛选

1实验部分

1.1仪器

RF-5301(PC)S荧光分光光度计(日本岛津公司)；电子分析天平BP211D(1/10万，德国Sartorius公司)，电子分析天平BP121S(1/1万，德国Sartorius公司)；pHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)；WHY-2水浴恒温振荡器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；恒温水浴锅W201B(北京国华医疗器械厂)。

1.2试剂

亚硫酸钠(成都科龙化工试剂厂，批号：20110906，纯度≥97%)；邻苯二甲醛(日本TCI公司，批号：120324，纯度≥98%)；其他试剂均为分析纯，实验用水为重蒸馏水；中药材样品购于荷花池中药材市场。

亚硫酸钠储备液：精密称取亚硫酸钠适量，加水溶解制成1mmoL·L^-1的亚硫酸钠储备液，避光冷藏，使用时用水稀释至所需浓度。

邻苯二甲醛溶液：1mmoL·L^-1。准确称取0.1341g邻苯二甲醛，无水乙醇溶解后定容至100mL棕色容量瓶中作为储备液，避光冷藏，使用时移取10.0mL定容至100mL配成1mmoL·L^-1的邻苯二甲醛工作液。

乙酸铵溶液：5mmoL·L^-1。准确称取7.7080g乙酸铵(AR)，用水溶解后定容至1000mL棕色容量瓶中作为储备液，避光冷藏，使用时移取5.0mL定容至100mL配成5mmoL·L^-1的乙酸铵工作液。

磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液：将浓度为0.3moL·L^-1的Na₂HPO₄和KH₂PO₄溶液按照不同体积比混合，配成一系列不同pH值的缓冲溶液。

1.3实验方法

准确移取2.0mL Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液(pH=6.44)，适量样品溶液（因为样品含硫量不同，所以具体的加入量可随含硫量变化，只要保证符合检测限即可）于10mL容量瓶中，依次加入2.5mL1mmoL·L^-1邻苯二甲醛溶液及1.5mL5mmoL·L^-1乙酸铵溶液，混匀，用水定容，于50℃水浴中恒温5min，取出，立即放入冰水中冷却，终止反应，静置40min，以试剂空白为参比，于1cm的石英比色皿中测定激发波长为321nm，发射波长为384nm时样品的相对荧光强度。

2方法与结果

2.1激发光谱和发射光谱

按实验方法配制溶液，然后在荧光分光光度计上分别扫描其激发光谱和发射光谱，由图1可知体系的最佳激发波长为321nm，发射波长为384nm。

2.2试验条件的选择

2.2.1缓冲液pH及其用量的影响

试验考察了不同pH Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液对体系荧光强度的影响，结果示于图2和图3，发现pH值在6.37～6.47时，衍生物的相对荧光强度大且稳定。当pH为6.44时，产物的相对荧光强度最大，故选择pH=6.44的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液作为测定的酸度条件，其加入量2.0mL较为适宜。

2.2.2邻苯二甲醛用量的影响

取适量的亚硫酸钠分别加入不同体积的1mmoL·L^-1邻苯二甲醛溶液，经衍生后测定产物的相对荧光强度，结果示于图4，表明随着邻苯二甲醛溶液用量的增大，产物的荧光强度先增大后降低，当其用量为2.5mL时，荧光强度最大，继续增加用量产物荧光强度反而降低，故本实验选择加入1mmoL·L^-1邻苯二甲醛溶液2.5mL。

2.2.3乙酸铵浓度及用量的影响

试验考察了不同浓度乙酸铵对衍生物荧光强度的影响，结果示于图5和图6，表明，随着乙酸铵浓度的增大，衍生物的荧光强度先增大后降低，当乙酸铵浓度为5mmoL·L^-1时，荧光强度达到最大，故本实验选择5mmoL·L^-1乙酸铵溶液，其加入量1.5mL较为适宜。

2.2.4反应温度和反应时间的影响

按实验方法，分别在不同温度和反应时间下进行衍生反应，然后测定产物的相对荧光强度，结果示于图7和图8，表明50℃水浴中反应5min最佳，然后立即冰水浴冷却，终止反应。

2.2.5静置时间的影响

按实验方法对对照品试样衍生化处理后，静置一定时间后测定其相对荧光强度，结果示于图9，表明，随静置时间延长产物相对荧光强度有所降低，当静置在30～50min范围内衍生物相对荧光强度趋于稳定，故本实验选择反应完成后静置40min测定产物的相对荧光强度。

综上，本发明的最佳衍生反应条件为：精密量取pH=6.44的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液2.0mL和适量样品于10mL量瓶中，然后分别依次精密加入1.0mmoL·L^-1邻苯二甲醛溶液2.5mL及5.0mmoL·L^-1乙酸铵溶液1.5mL，摇匀，水定容至刻度，于50℃水浴中衍生反应5min后，立即取出，放入冰水中冷却使反应终止，静置40min，在激发波长321nm、发射波长384nm处测定体系的相对荧光强度。

（二）样品处理（供试品溶液制备）方法的优化

目前中药材二氧化硫残留量测定过程中，样品的前处理多采用酸蒸馏，需特制的全玻璃蒸馏装置，且操作过程繁琐。若以水作溶剂仅能提取出游离态的亚硫酸盐，而可逆结合的亚硫酸盐在酸性条件下稳定，在pH>7时则分离成亚硫酸根

。因此，本发明以同一批次山药为研究对象，对样品的前处理方法进行研究。

以山药中二氧化硫含量为指标，考察提取方法、NaOH溶液浓度、振荡速度、温度、提取时间5个因素对二氧化硫提取率的影响。

1提取方法的确定

以山药中二氧化硫含量为考察指标，分别在30℃条件下以0.5%NaOH溶液采用浸渍、超声（400W）和振荡（150r·min^-1）3种方式提取10min，结果以振荡提取方法二氧化硫含量最高，故本研究采用振荡提取方法，结果见表1。

表1提取方法的选择

2NaOH溶液浓度的确定

取5份山药粉末，约1g，精密称定。料液比1:30，30℃、150r·min^-1振荡提取10min，分别考察了NaOH溶液浓度0.1%，0.3%，0.5%，0.8%，1%，结果随NaOH溶液浓度的增高，二氧化硫含量呈上升趋势，当NaOH溶液浓度达到0.5%时最大，其后随浓度增加而二氧化硫含量略有降低，见图10。

3振荡速度的确定

取山药粉末5份，约1g，精密称定。料液比1:30，以0.5%NaOH溶液30℃振荡提取10min，分别考察不同振荡速度50，100，150，200，250r·min^-1，结果随着振荡速度的增大，二氧化硫的含量先增大后降低，当振荡速度为200r·min^-1时二氧化硫含量最大，见图11，因此本实验选择振荡速度为200r·min^-1。

4提取温度的确定

取山药粉末5份，约1g，精密称定。料液比1:30，以0.5%NaOH溶液200r·min-1振荡提取10min，分别考察不同温度30，40，50，60，70℃，结果以40℃为宜，温度过高对山药中二氧化硫的提取效果反而不好，见图12。

5提取时间的确定

取山药粉末5份，约1g，精密称定。料液比1:30，以0.5%NaOH溶液40℃、200r·min^-1振荡提取，分别考察不同提取时间10，20，30，40，50，60min，结果在30min内，二氧化硫的含量基本不变，再增加提取时间，二氧化硫的含量反而逐渐降低，见图13。为了保证其二氧化硫被充分提取，本研究选择提取时间30min。

实施例3方法学考察

1供试品溶液制备

取山药细粉约1g，精密称定，精密加入0.5%氢氧化钠溶液25mL，摇匀，振荡提取(200r·min^-1，40℃)30min，滤过，取1.0mL稀释至25mL，即得。

2线性关系试验

分别精密吸取亚硫酸钠储备液0.1，0.3，0.7，1.2，1.5和1.8mL用水稀释至100mL，然后再分别移取上述不同浓度的稀释液1.0mL，按实验方法测定产物的相对荧光强度。以荧光强度为纵坐标，Na₂SO₃对照品的加入量(nmoL)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=46.247X－15.007，r²=0.9998，表明Na₂SO₃加入量在0.9997～17.99nmoL范围内线性关系良好。

3精密度试验

取同一批山药样品，按“1”项下方法，制备供试品溶液，平行测定6次，记录荧光强度，计算RSD为1.62%，表明仪器精密度良好。

4稳定性试验

取已制备好的同一份样品溶液，测定前避光冷藏，按上述实验方法分别在0、0.5、1、1.5、2、2.5h测定，记录荧光强度，结果2h内样品荧光强度的RSD为2.80%，表明样品溶液在避光冷藏的条件下2h内稳定。

5重复性试验

取同批次山药样品，按供试品溶液制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述实验方法测定其荧光强度，结果样品中SO₂含量平均为411.4μg·g^-1，RSD为1.9%，表明该方法重复性良好。

6加样回收试验

取已知SO₂含量的同批次山药样品6份，约0.5g，精密称定，精密加入亚硫酸钠对照品溶液适量，按供试品溶液的制备与测定同法操作，测定荧光强度，计算SO₂含量与回收率，得平均回收率为102.3%，RSD为4.6%，结果见表2。

表2加样回收试验(n=6)

7本发明方法的验证

山药为薯蓣科植物薯蓣Dioscorea opposita Thunb.的干燥根茎，系常用中药，长期以来其产地加工多用硫磺熏制。本研究以自购山药样品为研究对象，经硫磺熏蒸后测定其二氧化硫残留量。

（1）硫熏山药样品的制备

采用不锈钢材料自制熏箱，其容积约为0.5m³，内设一层网状隔板，在其顶部开一窗口。实验时，将250g山药饮片均匀铺于网状隔板上，称取50g药用硫磺置于搪瓷盘中并放入熏箱底部，点燃硫磺，关闭熏箱门，将山药分别熏蒸30、60、90、120和150min，即得。

（2）样品二氧化硫残留量的测定

利用实施例2优化的提取法对未经硫磺熏蒸的及硫磺熏蒸不同时间的山药样品以进行前处理，并采用荧光衍生法测定其中的SO₂残留量，见表3。

表3硫熏山药样品测定结果

结果未经硫熏的山药阴性对照样品二氧化硫残留量为0，而硫熏山药样品均检出二氧化硫残留，且其二氧化硫残留量随硫熏时间的增加而增大。表明利用荧光衍生法测定中药材二氧化硫残留量具有可行性。

8样品测定

按照上述方法测定所购买部分中药材的SO₂含量，结果见表4。

表4样品测定结果(n=3)

综上，本发明对中药二氧化硫残留量的测定方法，能够准确、快速测定中药材中二氧化硫的残留量，反应方法更为简便，无需使用特殊仪器或有毒试剂，检测成本更低，操作更安全，更适用于中药材二氧化硫残留量的快速测定。

Claims (10)

1.一种测定中药材中二氧化硫残留量的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

（1）取待测中药材，制备供试品溶液；

（2）取亚硫酸盐为对照品，制备对照品溶液；

（3）分别取供试品溶液、对照品溶液，在缓冲液中，加入邻苯二甲醛溶液和铵盐溶液反应，待反应结束后，终止反应后，静置，再采用荧光衍生法测定中药材中二氧化硫残留量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，供试品溶液的制备方法如下：

取待测中药材，粉碎后，加入无机碱溶液，提取，滤过，取滤液，稀释，即得。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：供试品溶液的制备方法如下：

取待测中药材，粉碎成细粉，加入中药材20～50倍v/w量的氢氧化钠溶液，振荡提取，滤过，取滤液稀释20～30倍，即得；

优选地，制备供试品溶液的方法如下：

取待测中药材，粉碎成细粉，加入中药材20～30倍v/w量的0.5%w/v氢氧化钠溶液，在40℃下，200r·min^-1振荡提取，滤过，取滤液稀释25倍，即得。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述亚硫酸盐为亚硫酸钠。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液pH值为6.37～6.47；邻苯二甲醛溶液的浓度为1mmoL·L^-1，用量为2-3mL；所述铵盐溶液为4～6mmoL·L^-1的乙酸铵溶液，用量为1.5～3mL；反应温度为45-60℃水浴，反应时间为3min以上；

所述荧光衍生法的条件如下：以试剂空白为参比，激发波长为321±5nm，发射波长为384±5nm。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述缓冲液为Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液系统，pH值为6.44；邻苯二甲醛溶液的浓度为1mmoL·L^-1，用量为2.5mL；乙酸铵溶液的浓度为5mmoL·L^-1，用量为1.5mL；反应温度为50℃水浴，反应时间为5min以上；

所述荧光衍生法的条件如下：以空白为参比，激发波长为321nm，发射波长为384nm。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，反应时间为5-10min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，静置的时间为30～50min；优选为40min。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

（1）取待测中药材细粉1g，加入0.5%w/v氢氧化钠溶液25～30mL，40℃下，200r·min^-1振荡提取30min，滤过，取1.0mL滤液稀释至25mL，即得供试品溶液；

（2）取亚硫酸盐为对照品，制备浓度为1×10^-3mmol·L^-1～18×10^-3mmol·L^-1对照品溶液；

（3）分别取供试品溶液、对照品溶液于10ml容量瓶中，先加入2.0mLpH=6.44的Na₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲溶液，再依次加入2.5mL1mmoL·L^-1邻苯二甲醛溶液及1.5mL5mmoL·L^-1乙酸铵溶液，混匀，用水定容，于50℃水浴中恒温5min，取出，立即放入冰水中冷却，终止反应，静置40min，以试剂空白为参比，在激发波长为321nm、发射波长为384nm时测定样品和对照品的相对荧光强度，计算待测中药材中的二氧化硫残留量。

10.根据权利要求1～9任意一项所述的方法，其特征在于：所述待测中药材为百合、葛根、党参、山药、白芍、薏苡仁、黄芪、麦冬、枸杞子、当归中的一种或两种以上的组合。

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