CN103525926A

CN103525926A - 一种基于基因表达谱的药物毒性个体易感性基因标志物的筛选方法

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Publication number: CN103525926A
Application number: CN201310464974.0A
Authority: CN
Inventors: 范骁辉; 陆晓燕
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2013-10-08
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-10-08
Also published as: CN103525926B

Abstract

本发明公开了一种基于基因表达谱的药物毒性个体易感性基因标志物的筛选方法，包括：根据个体对某药物毒性易感性的差异，挑选对药物毒性易感和耐受的个体分别组成易感亚集和耐受亚集；根据两个亚集给药前的基因表达谱，挑选给药前的差异表达基因；结合药物给药后两个亚集的基因表达谱，进一步筛选给药前的差异表达基因，筛选出能够指示所述某药物毒性的个体易感性的潜在基因标志物；对所述的潜在基因标志物进行验证，筛选得到能够指示所述某药物毒性的个体易感性的基因标志物。本发明基于基因表达谱研究药物毒性的个体易感性，方法可靠，可操作性强。

Description

一种基于基因表达谱的药物毒性个体易感性基因标志物的筛选方法

技术领域

本发明涉及药物基因组学中药物毒性个体易感性的研究，尤其涉及一种基于基因表达谱的药物毒性个体易感性基因标志物的筛选方法。

背景技术

药物基因组学是确定个体遗传差异对药物效应作用的新学科，已被广泛应用于合理用药及个体化给药研究，即通过研究遗传因素对药物反应的影响，确定药物作用的靶点，研究从表型到基因型的药物反应的个体多样性，用已知的基因组学理论指导临床合理用药和创新药物。

由于高通量DNA/RNA技术的普及化，探讨DNA、mRNA、siRNA、miRNA等各种生物分子在药物反应的个体多样性中的作用已逐渐成为研究热点。

已有的研究表明，给药前的基因表达差异是药物毒性反应的个体多样性的重要影响因素（Yun JW,Lee TR,Kim CW,et al.Predose blood geneexpression profiles might identify the individuals susceptible to carbontetrachloride-induced hepatotoxicity.Toxicol.Sci.2010,115(1):12-21.YunJW,Kim CW,Bae IH,et al.Expression levels of pituitary tumor transforming1and glutathione-S-transferase theta3are associated with the individualsusceptibility to D-galactosamine-induced hepatotoxicity.Toxicol.Appl.Pharmacol.2010,242(1):91-99.Yun JW,Kim CW,Bae IH,et al.Determination of the key innate genes related to individual variation in carbontetrachloride-induced hepatotoxicity using a pre-biopsy procedure.Toxicol.Appl.Pharmacol.2009,239(1):55-63.）。但是，纵观现有研究，均未考虑给药前的差异表达基因可能与药物作用无关，并且由于给药前的个体间差异表达的基因数目众多，在筛选潜在的药物毒性个体易感基因标志物时，如果仅根据给药前的基因表达差异，一一对差异基因进行验证，费时费力且成本昂贵，因此需要进一步筛选与药物作用相关的差异表达基因，探讨它们作为药物毒性个体易感性标志物的可能。

再者，药物毒性是药物从市场撤回、被限制使用或被拒批的最重要的原因，而药物毒性的个体差异已在多种药物体现，如噻吩并吡啶类药物，解热镇痛药物等（Ariyoshi N,Iga Y,Hirata K,et al.Enhanced susceptibility of HLA-mediated ticlopidine-induced idiosyncratic hepatotoxicity by CYP2B6polymorphism in Japanese.Drug Metab.Pharmacokinet.2010,25(3):298-306.Moyer AM,Fridley BL,Jenkins GD,t al.Acetaminophen-NAPQI hepatotoxicity:a cell line model system genome-wideassociation study.Toxicol Sci.2011,120(1):33-41.)。综上所述，亟需开发一种药物毒性个体易感性基因标志物的筛选方法，研究药物毒性相关的个体易感性，为合理用药提供指导。

发明内容

本发明提供了一种基于基因表达谱的药物毒性个体易感性基因标志物的筛选方法，简化了筛选过程，且方法可靠，可操作性强。

一种基于基因表达谱的药物毒性个体易感性基因标志物的筛选方法，包括：

（1）根据个体对某药物毒性易感性的差异，在样本群体中选择对所述某药物毒性易感的个体组成易感亚集，选择对所述某药物毒性耐受的个体组成耐受亚集；

（2）分别取易感亚集和耐受亚集内个体给药前的体液或组织，提取RNA后通过芯片分析获得所述易感亚集和耐受亚集的基因表达谱，然后比较两个亚集的基因表达谱，筛选出易感亚集和耐受亚集表达具有显著差异的基因，即为给药前的差异表达基因；

（3）对所述的易感亚集和耐受亚集进行给药处理后，采集个体的体液或组织，提取RNA后通过芯片分析获得给药后易感亚集和耐受亚集的基因表达谱；

（4）根据给药前后，易感亚集和耐受亚集的基因表达变化，将所述的给药前的差异表达基因分为两类：

（ⅰ）(FC RA/R)*(FC SA/S)<0时，以︱FC RA/R︱*︱FC SA/S︱值的大小排序；

（ⅱ）(FC RA/R)*(FC SA/S)>0时，以(FC RA/R)/(FC SA/S)值或(FCSA/S)/(FC RA/R)值的大小排序；

其中，FC RA/R为给药前后耐受亚集单个基因的表达变化，FC SA/S为给药前后易感亚集单个基因的表达变化；

排序后，以（ⅰ）和（ⅱ）中数值较大的基因作为能够指示所述某药物毒性的个体易感性的潜在基因标志物；

（5）对所述的潜在基因标志物进行验证，筛选得到能够指示所述某药物毒性的个体易感性的基因标志物。

基于药物毒性易感个体和耐受个体给药前的基因表达差异，可确定可能的与某药物毒性个体易感性相关的给药前的差异表达基因（pre-DEGs），然后进一步结合给药后易感亚集和耐受亚基中这些基因的表达谱进行筛选。

本申请在进一步筛选时，将pre-DEGs分为两类：当(FC RA/R)*(FCSA/S)<0，以︱FC RA/R︱*︱FC SA/S︱值的大小排序，值越大，该基因作为药物毒性的个体易感性基因标志物的可能性越大。也就是说某些基因在给药前是易感组和耐受组中差异表达的基因，在药物作用后，这些基因在易感组和耐受组的变化趋势相反，如在易感组中上调（正值），但在耐受组中下调（负值），那么这些基因的变化趋势（FC）在两组中相乘小于零，反之亦然。对于这些基因，其给药后两组相乘绝对值越大，则其作为药物毒性的个体易感基因标志物的可能性越大。

当(FC RA/R)*(FC SA/S)>0，以(FC RA/R)/(FC SA/S)值或(FC SA/S)/(FC RA/R)值的大小排序即可，值越大作为药物毒性的个体易感性基因标志物的可能性越大。也就是说某些基因在给药前是易感组和耐受组中差异表达的基因，在药物作用后，这些基因在易感组和耐受组的变化趋势相同，在易感组和耐受组中均上调（正值）或者下调（负值），但是上调或者下调的倍数不一致，那么这些基因的变化趋势（FC）在两组中相乘大于零。对于这些基因，其给药后两组相除（RA/R除以SA/S或者SA/S除以RA/R）值越大，则其作为药物毒性的个体易感性基因标志物的可能性越大。

因此，通过上述的进一步筛选可大大缩小标志物选择范围，可选择更为可靠的与某药物毒性相关的个体易感性的潜在基因标志物，最后通过验证少数的潜在基因标志物，即可筛选得到能够指示所述某药物毒性的个体易感性的基因标志物。

所述的某药物为乙酰氨基酚，毒性为肝脏毒性。

所述的个体为鼠个体，具体为大鼠个体。给药处理时，乙酰氨基酚的给药量为1200mg/kg。

值得注意的是，在本发明中，所述的某药物并不仅限于乙酰氨基酚，可根据具体的测试药物而定，试验动物也并不仅限于鼠。

步骤（1）中，根据给予某药物后，不同个体血清中与药物毒性相关的生化指标的变化，判断个体对所述的某药物毒性为易感或耐受。通过生化指标的变化或组织病理学的检查来鉴定某药物引起的毒性为生物学和临床医学领域的常规手段，如血清中与肝脏毒性相关的生化指标有谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）及总胆红素（TBILI）等，通过检测这些指标的水平即可进行初步判断，进一步结合组织病理学的检查是临床诊断的金指标。

所述易感亚集内个体的数量占样本群体的1/6～1/8，所述耐受亚集内个体的数量占样本群体的1/6～1/8。不仅使后续的实验数据具有生物学上的统计意义，同时能够节约成本。

芯片分析前，需采集个体的组织或体液提取RNA，对组织或体液的具体种类并没有特殊的要求，基于采集的方便性考虑，所述的体液可以为血液或尿液。

所述的芯片具体可以为Affymetrix Rat2302.0Array。显然的，基因表达谱的获取并不仅限于该种芯片。

步骤（2）中，比较两个亚集的基因表达谱时，采用Welch t test对两个亚集的基因表达进行分析，选取p<0.05，且变化倍数FC≥2的基因作为给药前的差异表达基因。在采用Welch t test对两个亚集的基因表达进行分析前，对芯片数据进行提取和归一化处理，并剔除在所有芯片中强度都小于100的基因，可防止较低强度时个体差异对数据造成影响。

对芯片数据进行提取和归一化处理时，采用的软件为软件，所用算法为Mas5.0及中位数标准化（Median=1000）。

步骤（4）中，以（ⅰ）和（ⅱ）中数值较大的基因作为能够指示所述某药物毒性的个体易感性的潜在基因标志物，其中，潜在基因标志物的数目的选择并没有硬性的规定，可根据试验条件或目的灵活性的进行选择。

对所述的潜在基因标志物进行验证时可选择常规的方法，如实时定量荧光PCR反应等，具体的验证方法可以为：

选择新的样本群体，检测给药前潜在基因标志物的表达量，根据步骤（2）中该潜在基因标志物在所述易感亚集和耐受亚集间的差异，将新的样本群体中表达量较高的若干个个体作为预测的耐受（或易感）亚集，将表达量较低的若干个个体作为预测的易感（或耐受）亚集；

对所述预测的耐受亚集和预测的易感亚集进行给药处理，检测血清中与所述某药物毒性相关的生化指标或组织病理学的变化，若生化指标或组织病理学的变化与预测的耐受亚集或预测的易感亚集相对应，则该潜在基因标志物可作为指示所述某药物毒性的个体易感性的基因标志物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的方法通过考察给药前、后易感和耐受个体的基因表达谱，实现了对单个基因在易感和耐受两个亚集中给药前、后的变化监测，筛选出更为可靠的与药物毒性相关的潜在个体易感性的基因标志物，且在新的一批个体中对潜在个体易感性的基因标志物进行验证研究，证明差异表达基因作为药物毒性个体易感性标志物的潜在可能性。本发明的方法解决了先前研究中未考虑给药前差异表达基因可能与药物作用无关等问题，提供了实现进一步筛选的简单方法，通过进一步筛选，筛选出的潜在标志物更加可靠，且缩小了验证的基因范围，方法可操作性强，为药物基因组学在药物毒性个体易感性及合理用药中的应用提供方法学指导。

附图说明

图1a为药物对乙酰氨基酚作用大鼠24小时后血清ALT酶活性在易感和耐受两个亚集中的差异,与对照组相比，^*p<0.05,^**p<0.01，与易感亚集相比，^#p<0.05，^##p<0.01；

图1b为药物对乙酰氨基酚作用大鼠24小时后血清AST酶活性在易感和耐受两个亚集中的差异，与对照组相比，^*p<0.05,^**p<0.01，与易感亚集相比，^#p<0.05，^##p<0.01；

图1c为药物对乙酰氨基酚作用大鼠24小时后血清ALP酶活性在易感和耐受两个亚集中的差异，与对照组相比，^*p<0.05,^**p<0.01，与易感亚集相比，^#p<0.05，^##p<0.01；

图1d为药物对乙酰氨基酚作用大鼠24小时后血清TBILI含量在易感和耐受两个亚集中的差异，与对照组相比，^*p<0.05,^**p<0.01，与易感亚集相比，^#p<0.05，^##p<0.01；

图2为易感和耐受两个亚集大鼠在药物对乙酰氨基酚作用24小时后苏木精-伊红（HE）染色的肝组织病理学切片图；

图3a为药物乙酰氨基酚给药前血液中Incenp基因在新的32只大鼠个体中的表达水平；

图3b为药物乙酰氨基酚给药前血液中Rpgrip1基因在新的32只大鼠个体中的表达水平；

图3c为药物乙酰氨基酚给药前血液中Sbf1基因在新的32只大鼠个体中的表达水平；

图3d为药物乙酰氨基酚给药前血液中Mmp12基因在新的32只大鼠个体中的表达水平；

图4a为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Incenp基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清ALT酶活性，^*p<0.05,^**p<0.01；

图4b为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Incenp基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清AST酶活性，^*p<0.05,^**p<0.01;

图4c为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Incenp基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清TBILI的水平，^*p<0.05,^**p<0.01;

图4d为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Rpgrip1基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清ALT酶活性，^*p<0.05,^**p<0.01；

图4e为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Rpgrip1基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清AST酶活性，^*p<0.05,^**p<0.01;

图4f为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Rpgrip1基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清TBILI的水平，^*p<0.05,^**p<0.01;

图4g为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Sbf1基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清ALT酶活性，^*p<0.05,^**p<0.01；

图4h为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Sbf1基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清AST酶活性。^*p<0.05,^**p<0.01;

图4i为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Sbf1基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清TBILI的水平，^*p<0.05,^**p<0.01;

图4j为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Mmp12基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清ALT酶活性，^*p<0.05,^**p<0.01；

图4k为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Mmp12基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清AST酶活性，^*p<0.05,^**p<0.01;

图4l为验证试验中根据药物乙酰氨基酚给药前血液中Mmp12基因的表达值预测的易感组（表达值最低8只）和耐受组（表达值最高8只）大鼠给药后血清TBILI的水平，^*p<0.05,^**p<0.01;

图5为验证试验中预测为易感和耐受两个亚集大鼠在药物对乙酰氨基酚作用24小时后苏木精-伊红（HE）染色的肝组织病理学切片图；

图6a为验证试验中根据给药后各项血清生化指标分别挑出对药物乙酰氨基酚致肝损伤易感和耐受的大鼠各5只，分析Incenp在每项血清指标所对应的易感和耐受两个亚集大鼠中的表达量，^*p<0.05,^**p<0.01；

图6b为验证试验中根据给药后各项血清生化指标分别挑出对药物乙酰氨基酚致肝损伤易感和耐受的大鼠各5只，分析Rpgrip1在每项血清指标所对应的易感和耐受两个亚集大鼠中的表达量，^*p<0.05,^**p<0.01；

图6c为验证试验中根据给药后各项血清生化指标分别挑出对药物乙酰氨基酚致肝损伤易感和耐受的大鼠各5只，分析Sbf1在每项血清指标所对应的易感和耐受两个亚集大鼠中的表达量，^*p<0.05,^**p<0.01；

图6d为验证试验中根据给药后各项血清生化指标分别挑出对药物乙酰氨基酚致肝损伤易感和耐受的大鼠各5只，分析Mmp12在每项血清指标所对应的易感和耐受两个亚集大鼠中的表达量，^*p<0.05,^**p<0.01。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释。

对乙酰氨基酚（APAP）肝脏毒性个体易感性研究实例

具体研究方法如下：

（1）易感和耐受亚集的筛选

Wistar大鼠180-200g42只，于给药前一周眼眶静脉丛采集1.5mL的血液于BD抗凝管中，用于抽提RNA进行后续的基因芯片分析；另采集1mL左右的血液于1.5mL EP管中，室温放置1.5h后，4℃，4000rpm，离心10min，取上层血清用于给药前生化指标的检测。

一周后，1200mg/kg APAP灌胃给药，其中给药组37只，溶剂对照组5只，24小时后，水合氯醛（5%，0.6mL/100g）麻醉大鼠，下腔静脉采血，收集1.5mL的血液于BD抗凝管中，用于抽提RNA进行后续的基因芯片分析；其余血液室温放置1.5h后，于4℃，4000rpm，离心10min，取上层血清用于给药后生化指标检测。同时，解剖大鼠，剪取一块肝组织，固定在10%的福尔马林溶液中，用于病理组织切片检查。

检测血清中与肝脏毒性相关的特定生化指标，如谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）及总胆红素（TBILI）等，以给药后ALT酶活性的高低为指标，对APAP受试大鼠进行排序，选择酶活性最高的5只作为易感亚集，而酶活性最低的5只作为耐受亚集。

如图1a-1d所示，给药前ALT、AST、ALP和TBILI指标在对照组、易感亚集和耐受亚集中均无显著差异；APAP给药后，与对照组相比，易感亚集的ALT、AST和TBILI生化指标显著上升，耐受亚集则无显著差异，且耐受亚集在ALT、AST和ALP生化指标上显著低于易感亚集。

如图2所示，易感亚集的大鼠HE染色的肝组织病理切片出现了大量的肝细胞坏死，并有炎性细胞浸润；而耐受亚集的大鼠的肝组织病理切片与对照组比较，除少量肝细胞水肿外，并无其他明显变化。可见，不同大鼠个体在相同给药浓度下，对APAP致肝损伤的易感性不同。

（2）给药前差异表达基因的筛选

对易感和耐受两个亚集的大鼠给药前全血样本进行高通量基因表达谱的分析。

血液采集后24h内采用Trizol试剂及厂商提供的标准操作流程进行样本的总RNA抽提；抽提所得的总RNA经Agilent Bioanalyzer2100电泳质检合格后采用RNeasy Mini Kit进行纯化；获得的样本RNA采用Affymetrix表达谱芯片配套试剂盒Gene Chip3’IVT Express Kit按照标准操作流程进行扩增、标记和纯化，获得带有生物素标记的cRNA；本实验所采用的芯片为Affymetrix Rat2302.0Array，每组生物学重复数量为5；按照Affymetrix表达谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒Hybridization，Wash and Stain Kit，在滚动杂交炉Hybridization Oven645中45℃滚动杂交16h，杂交完成后在洗涤工作站Fluidics Station450中按照Affymetrix提供的标准操作流程进行芯片的洗涤；芯片结果采用

Scanner3000进行扫描，用Command Console Software3.1读取原始数据；实验所得质控合格的芯片数据（CEL文件）采用

软件进行数据提取和归一化处理，所用算法为Mas5.0及中位数标准化（Median=1000）；剔除在所有芯片中强度都小于100的基因，防止在较低强度时个体差异对数据造成的影响；接着，采用Welch t test对两个亚集的基因表达进行分析，选取p<0.05，且变化倍数（FC）≥2的基因定义为给药前差异表达基因（pre-DEGs），结果显示：有158个基因在给药前易感和耐受大鼠上差异表达。

（3）结合给药后基因表达数据筛选pre-DEGs

对易感和耐受两个亚集的大鼠给药后全血样本，提取RNA后通过芯片获取基因表达谱，具体方法同（2），然后比较给药前后两个亚集的基因表达变化。

定义给药前后，耐受组单个基因的变化表示为FC RA/R，易感组单个基因的变化表示为FC SA/S。

具体筛选方法如下：将pre-DEGs分为两类：一类是(FC RA/R)*(FCSA/S)<0，以︱FC RA/R︱*︱FC SA/S︱值的大小排序，值越大，该基因作为APAP肝毒性的个体易感性基因标志物的可能性越大，选取值最高的5个基因作为待验证的能指示APAP肝毒性的个体易感性的潜在基因标志物；另一类是(FC RA/R)*(FC SA/S)>0，以(FC RA/R)/(FC SA/S)或(FCSA/S)/(FC RA/R)值的大小排序即可，值越大作为APAP肝毒性的个体易感性基因标志物的可能性越大，共选取值最高的5个基因作为待验证的能指示APAP肝毒性的个体易感性的潜在基因标志物。

选取的潜在基因标志物分别为：Myl7、Bmp2、Mmp12、Gprin1、Sox11、Rpgrip1、Incenp、Hrg、S100b及Sbf1。

（4）实时荧光定量PCR验证

采用新的一批大鼠（共37只，其中APAP给药组32只，溶剂对照组5只）对给药前的上述10个基因的表达量进行实时荧光定量PCR实验的分析。具体方法如下：

a.采用新的一批37只雄性Wistar大鼠，同样的方式获取给药前血液样本；恢复一周之后，大鼠灌胃给予APAP，剂量仍为1200mg/kg，24小时后进行给药后的血清肝脏毒性相关生化指标的检测（ALT、AST、ALP和TBILI）和肝脏组织病理切片的检查；

b.分别采用红细胞裂解液、Trizol试剂及RNeasy Mini Kit试剂盒对给药前血液样本进行总RNA的提取和纯化；

c.提取的RNA溶液用核酸定量分析仪对其质量进行检测，质量合格（A260/A280比值在1.8至2.0之间）的RNA溶液进行逆转录；

d.逆转录所有操作步骤在冰上进行。在PCR管中加入Oligo(dt)_12-18Primer2.5μL，总RNA4μg，dNTP mixture2.5μL，加DEPC水至30μL，随后将样本放入梯度PCR仪，65℃反应5min。反应完毕后，迅速将样本至于冰上，放置2min，3000rpm离心1min。离心后，在PCR管中加入5Xfirst-strand Buffer10μL，RnaseOUT^TM2.5μL，3000rpm离心1min，放入梯度PCR仪，42℃反应2min。最后加入Super Script^TM II RT2.5μL，混匀，将样本放入梯度PCR仪，42℃反应50min，70℃反应15min;

e.荧光定量PCR仪对挑选的候选基因标志物进行实时荧光定量PCR的验证。所有反应在冰上进行。反应体系为25μL，PCR反应八连管中加入SYBR(2x)12.5μL，上下游引物（引物序列见表1）各0.5μL，cDNA模板2μL，DEPC水9.5μL。PCR反应使用

Premix Ex Taq^TM II试剂，按照使用说明上的标准流程完成，反应循环数为40，反应循环开始前预变性15min，温度为95℃，每个循环的温度参数设置为：95℃变性15sec、60℃退火30sec、72℃延伸15sec。40个循环完成后，插入熔解曲线，熔解曲线分析使用60至95℃所对应的数据，增量为0.5℃。根据标准曲线，确定每个基因的cDNA稀释浓度，每只大鼠的每个基因设置2个复孔，进行实时定量荧光PCR实验。内参基因选择18S rRNA，将经内参校正后的同一个基因的所有值除以该基因在32只大鼠中最小的相对表达量获得该基因在每只大鼠血液中的相对表达量。

实验所用基因引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如表1所示。

表1.引物序列

结果发现：在给药前不同大鼠个体中候选基因的表达量存在较大差异（10个基因中的4个如图3a-3d所示）。

为进一步验证Incenp、Rpgrip1、Sbf1、Mmp12这4个基因能否作为APAP致大鼠肝损伤的个体易感的基因标志物，根据给药前基因的相对表达量，分别选取4个基因相对表达量最低和最高的8只，根据筛选试验中该基因标志物在易感和耐受亚集间的差异，将表达量最低的8只大鼠预测为可能对APAP致大鼠肝损伤易感亚集，表达量最高的8只预测为可能对APAP致肝损伤耐受亚集，对预测的两个亚集大鼠给药后的各项血清生化指标用SPSS软件进行独立样本T检验。

结果表明，预测的易感和耐受亚集大鼠的给药后的各项血清生化指标的确存在差异（如图4a-4l所示，由于ALP在两个亚集间差异不显著，图未给出），特别是Incenp和Rpgrip1基因在ALT和AST生化指标上两个亚集间差异显著（^*p<0.05,^**p<0.01)；并且与肝脏组织病理切片相吻合，预测的易感组大鼠给药后肝脏组织病理切片显示，肝细胞有大量坏死，并有炎性细胞浸润，而预测的耐受组的大鼠肝脏只有少量肝细胞水肿（如图5）。

根据给药后各项血清生化指标分别挑出对APAP致肝损伤易感和耐受的大鼠各5只，分别分析Incenp、Rpgrip1、Sbf1、Mmp12这4个基因在每项血清指标所对应的易感和耐受两个亚集大鼠中的表达量；结果显示：在各项血清生化指标分别挑出的易感亚集和耐受亚集大鼠中这4个基因给药前表达量的平均值存在差异，且这4个基因在实时定量荧光PCR实验和基因芯片中的表达趋势一致，在易感亚集中这些基因的相对表达量均低于耐受亚集（如图6a-6d）。综上所述，在大鼠血液中Incenp、Rpgrip1、Sbf1、Mmp12基因表达量低的个体可能对APAP所导致肝损伤易感，这4个基因能作为APAP致大鼠肝损伤的个体易感的潜在基因标志物；根据大鼠暴露于药物前的基因表达差异来探讨不同个体对药物毒性的易感性是可行的。

Claims

1.一种基于基因表达谱的药物毒性个体易感性基因标志物的筛选方法，其特征在于，包括：

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的某药物为乙酰氨基酚，毒性为肝脏毒性。

3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的个体为鼠个体。

4.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（1）中，根据给予某药物后，不同个体血清中与某药物毒性相关的生化指标的变化，判断个体对所述的某药物毒性为易感或耐受。

5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述易感亚集内个体的数量占样本群体的1/6～1/8，所述耐受亚集内个体的数量占样本群体的1/6～1/8。

6.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤（2）中，比较两个亚集的基因表达谱时，采用Welch t test对两个亚集的基因表达进行分析，选取p<0.05，且变化倍数FC≥2的基因作为给药前的差异表达基因。

7.如权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，在采用Welch t test对两个亚集的基因表达进行分析前，对芯片数据进行提取和归一化处理，并剔除在所有芯片中强度都小于100的基因。