CN103517987A - 改变型脂肪酶及其制造方法、以及使用该酶的反应 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种显示高于序列编号1所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性且将序列编号1的193位的谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基得到的改变型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的该改变型脂肪酶的突变体、及使用它们制造氨基甲酸酯化合物的方法。另外，提供一种使用公知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。

Description

改变型脂肪酶及其制造方法、以及使用该酶的反应
技术领域
本发明涉及一种新型的改变型脂肪酶及其制造方法以及使用该酶的各种反应。更详细而言，涉及一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的改变型脂肪酶。进而，涉及一种使用该改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。
另外，本发明涉及一种使用已知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。
背景技术
目前，将脂肪酶用作催化剂得到氨基甲酸酯化合物的方法（氨基甲酸酯化）例如已知有在脂肪酶的存在下通过3’,5’-二氨基核苷（脂肪族胺化合物）和碳酸二乙酯化合物的反应来合成氨基甲酸酯的方法（非专利文献1）。
但是，脂肪酶相对于底物的添加量多、反应时间长且产物的收率也低，使用脂肪酶的氨基甲酸酯化合物的制造方法难以说是满足产业化的制造方法。从这些方面考虑，寻求一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的脂肪酶。
另一方面，进行了改变脂肪酶的氨基酸序列来提高活性、稳定性的研究（非专利文献2和3）。但是，尚未得知通过改变氨基酸序列提高了氨基甲酸酯化活性的脂肪酶。
另外，专利文献1记载了通过改变脂肪酶（CALB）的氨基酸序列来增加丙烯酸酯活性，但记载了将104位的色氨酸单独取代为苯丙氨酸会造成活性的降低。
现有技术文献
专利文献
专利文献：WO2009/080676A1
非专利文献
非专利文献1：J.Org.Chem，2004年69卷p.1748-1751
非专利文献2：ChemBioChem2010年11卷p.789-795
非专利文献3：J.Amer.Chem.Soc.，2005年127卷p.13466-13467
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种具有优异的氨基甲酸酯化活性的改变型脂肪酶、以及使用该改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。
另外，本发明的目的在于，提供一种使用公知的改变型脂肪酶制造氨基甲酸酯化合物的方法。
用于解决课题的方法
本发明的发明者们的目的在于，通过选择CALB作为脂肪酶，制作CALB的突变体来提高氨基甲酸酯化活性从而降低制造氨基甲酸酯化合物所需的成本。而且，进行了潜心研究，结果成功制成具有高于野生型的氨基甲酸酯化活性的突变CALB。另外，本发明的发明者们还发现，公知的改变型CALB具有较高的氨基甲酸酯化活性。即本发明提供下面的发明。
（1）一种改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将序列编号1的193位谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示高于序列编号1所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性。即，具有Q193X（在此，X表示谷氨酰胺以外的任意的氨基酸）的序列编号1的单独改变型脂肪酶或其突变体。
（2）根据（1）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有Q193E或Q193D的序列编号1的单独改变型脂肪酶或其突变体。
（3）根据（1）或（2）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F的序列编号1的双重改变型脂肪酶或其突变体。
（4）根据（1）或（2）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+[L278K或L278R]的序列编号1的双重改变型脂肪酶或其突变体。
（5）根据（3）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F+[L278K或L278R]的序列编号1的三重改变型脂肪酶或其突变体。
（6）根据（5）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶进一步将283位的丙氨酸取代为缬氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193X、Q193E或Q193D]+W104F+[L278K或L278R]+A283V的序列编号1的四重改变型脂肪酶或其突变体。
（7）一种DNA，其编码（1）～（6）中任一项记载的改变型脂肪酶或其突变体。
（8）一种转化微生物，其含有（7）所述的DNA。
（9）一种改变型脂肪酶或其突变体的制造方法，其特征在于，在培养基中培养（8）所述的转化微生物，使改变型脂肪酶或其突变体在培养基中和/或微生物中积累。
（10）一种改变型脂肪酶或其突变体，其是将（1）～（6）中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（9）所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在载体中固定化得到的。
（11）（1）～（6）和（10）中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（9）所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在氨基甲酸酯化反应中的使用。
（12）根据（11）所述的使用，其中，氨基甲酸酯化反应是使碳酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。
（13）一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于，在（1）～（6）和（10）中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（9）所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体的存在下，使碳酸二烷基酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。
（14）根据（13）所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其中，碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。
（15）将序列编号1的104位的色氨酸取代为苯丙氨酸得到的改变型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性的该改变型脂肪酶的突变体在氨基甲酸酯化反应中的使用。
（16）根据（15）所述的使用，其中，氨基甲酸酯化反应是使碳酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。
（17）一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于，在将序列编号1的104位的色氨酸取代为苯丙氨酸的改变型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性的该改变型脂肪酶的突变体的存在下，使碳酸二烷基酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。
（18）根据（17）所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其中，碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。
（19）一种改变型脂肪酶或其突变体，显示高于序列编号1所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性，其中，该改变型脂肪酶是将序列编号1的278位的亮氨酸取代为其它的氨基酸残基得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位。即，具有L278X1（在此，X1表示亮氨酸以外的任意的氨基酸）的序列编号1的改变型脂肪酶或其突变体。
（20）如（19）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有L278K或L278R的序列编号1的改变型脂肪酶或其突变体。
（21）如（19）或（20）所述的改变型脂肪酶或其突变体，其中，该改变型脂肪酶是将193位的谷氨酰胺进一步取代为谷氨酸或天冬氨酸得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。即，具有[Q193E或Q193D]+[L278X1、L278K或L278R]的序列编号1的改变型脂肪酶或其突变体。
（22）一种DNA，其编码（19）～（21）中任一项记载的改变型脂肪酶或其的突变体。
（23）一种转化微生物，其含有（22）所述的DNA。
（24）一种改变型脂肪酶或其突变体的制造方法，其特征在于，在培养基中培养（23）所述的转化微生物，使改变型脂肪酶或其突变体在培养基中和/或微生物中积累。
（25）一种改变型脂肪酶或其突变体，其是将（19）～（21）中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（24）所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在载体中固定化得到的。
（26）（19）～（21）和（25）中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（24）所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在氨基甲酸酯化反应中的使用。
（27）根据（26）所述的使用，其中，氨基甲酸酯化反应是使碳酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。
（28）一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于，在（19）～（21）和（25）中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过（24）所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体的存在下，使碳酸二烷基酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。
（29）根据（28）所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其中，碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。
发明的效果
本发明的改变型脂肪酶或其突变体显示比野生型脂肪酶优异的氨基甲酸酯化活性。
附图说明
图1表示包含与SUC2的信号序列连结的成熟野生型CalB基因的表达载体pYES2CT（pYES2CT/SUC2sig/mCALB）；
图2表示载有pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的转化酵母的酯化合物分解活性。“-CALB”表示载有不具有CalB基因的pYES2CT/SUC2sig载体的转化酵母（对照）。“+CALB”表示载有具有CalB基因的pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的转化酵母；
图3表示使用W104F、Q193E、W104F/Q193E改变型脂肪酶由碳酸二甲酯（DMC）和正己胺合成氨基甲酸酯化合物的活性。（A）表示使用W104F/Q193E改变型脂肪的8hr后的反应液的GC色谱。IS表示内标。（B）表示己基氨基甲酸甲酯的收率（%）。w.t.，W104F、Q193E和W104F/Q193E分别表示野生型脂肪酶、W104F改变型脂肪酶、Q193E改变型脂肪酶和W104F/Q193E改变型脂肪酶；
图4表示使用W104F、Q193E、W104F/Q193E改变型脂肪酶由碳酸二甲酯（DMC）和1,3-二氨基甲基环己烷（1,3BAC）合成氨基甲酸酯化合物的活性；
图5表示使用W104F、Q193E、W104F/Q193E改变型脂肪酶由碳酸二甲酯（DMC）和1,12-二氨基十二烷（DMD）合成氨基甲酸酯化合物的活性；
图6表示使用W104F、Q193E、W104F/Q193E改变型脂肪酶由碳酸二甲酯（DMC）和苯二甲基二胺（XDA）合成氨基甲酸酯化合物的活性；
图7表示使用W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V改变型脂肪酶由碳酸二甲酯（DMC）和正己胺合成的氨基甲酸酯化合物的活性。
具体实施方式
本发明的脂肪酶表示来源于Candida antarctica（南极假丝酵母）的脂肪酶（CALB、Genebank ACCESSION No.P41365）。本发明的CALB优选指成熟CALB，将其氨基酸序列示于序列编号1。另外，本发明的CALB也可以包括保持其功能的片段。而且，本发明的改变型脂肪酶或其的突变体也可以包含保持其功能的片段。下面，将具有序列编号1的氨基酸序列的脂肪酶称为野生型脂肪酶。
本发明的改变型脂肪酶是指显示高于野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性且将序列编号1中的193位的谷氨酰胺取代为其它氨基酸残基（Q193X，X为除谷氨酰胺以外的任意的氨基酸）得到的改变型脂肪酶（下面，称为Q193X改变型脂肪酶）。另外，也可以包含将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸（W104F）得到的改变型脂肪酶（下面为W104F改变型脂肪酶（序列编号3））。
优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸（Q193E或Q193D）得到的单独改变型脂肪酶（下面，称为Q193E改变型脂肪酶（序列编号2）或Q193D改变型脂肪酶（序列编号19））。
更优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸，进而将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸得到的双重改变型脂肪酶（下面，称为Q193E/W104F改变型脂肪酶（序列编号4）或Q193D/W104F改变型脂肪酶（序列编号20））。
本发明的改变型脂肪酶是指显示高于野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性且将序列编号1中的278位的亮氨酸取代为其它的氨基酸残基（L278X1，X1为除亮氨酸以外的任意的氨基酸）得到的改变型脂肪酶（下面，称为L278X1改变型脂肪酶）。
优选为将上述278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸（L278R或L278K）得到的单独改变型脂肪酶（下面，称为L278R改变型脂肪酶（序列编号21）或L278K改变型脂肪酶（序列编号22））。
更优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸，进而将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸得到的双重改变型脂肪酶（下面，称为Q193E/L278K改变型脂肪酶（序列编号24）、Q193E/L278R改变型脂肪酶（序列编号23）、Q193D/L278K改变型脂肪酶（序列编号26）或Q193D/L278R改变型脂肪酶（序列编号25））。
更优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸、将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸、将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸得到的三重改变型脂肪酶（下面，称为Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号28）、Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶（序列编号27）、Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号30）或Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶（序列编号29））。
更优选为将上述193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸、将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸、将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸、将283位的丙氨酸取代为缬氨酸得到的四重改变型脂肪酶（下面，称为Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶（序列编号32）、Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶（序列编号31）、Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶（序列编号34）或Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶（序列编号33））。
本发明的改变型脂肪酶的特征在于具有在上述193位、104位、278位和/或283位进行了氨基酸取代的氨基酸序列，但也可以在上述193位、104位、278位和/或283位以外的位置进一步含有氨基酸突变。由此，本发明也提供如下的突变体，其在与具有上述193位、104位、278位和/或283位的氨基酸取代的改变型脂肪酶进行比较的情况下其功能相同但与具有上述193位、104位、278位和/或283位的氨基酸取代的改变型脂肪酶相比一部分氨基酸序列不同。
一部分氨基酸序列不同典型而言是指通过构成氨基酸序列的一个～多个氨基酸的缺失、取代、添加、插入，倒位或它们的组合在氨基酸序列上产生突变。
因此，本发明包括193改变型脂肪酶的突变体，其在193位的谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与193改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
另外，本发明包括W104F改变型脂肪酶的突变体，其在W104F取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与W104F改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
另外，本发明包括Q193E改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E改变型脂肪酶显示相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明包括Q193D改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
另外，本发明还包括Q193E/W104F改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E/W104F取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/W104F改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D/W104F取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/W104F改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/L278K改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E/L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/L278K改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/L278R改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E/L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/L278R改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/L278K改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D/L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/L278K改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/L278R改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D/L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/L278R改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E/W104F/L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E/W104F/L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶显示相同氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D/W104F/L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D/W104F/L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E/W104F/L278K/A283V取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶的突变体，其在Q193E/W104F/L278R/A283V取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D/W104F/L278K/A283V取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明还包括Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶的突变体，其在Q193D/W104F/L278R/A283V取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明包括278改变型脂肪酶的突变体，其在278位的亮氨酸取代为其它的氨基酸残基取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与278改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明包括L278R改变型脂肪酶的突变体，其在L278R取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与L278R改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
本发明包括L278K改变型脂肪酶的突变体，其在L278K取代的基础上，进一步含有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，显示与L278K改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
在与氨基甲酸酯化反应相关的特性不会大幅降低的限度内（优选实质上保持的限度）容许氨基酸序列不同。因此，只要满足该条件，则氨基酸序列不同的位置没有特别限定。另外，也可以在多个位置产生不同。在此，所谓多个例如为相当于低于总氨基酸的约30%的数目，优选为相当于低于约20%的数目，进一步优选为相当于低于约10%的数目，更进一步优选为相当于低于约5%的数目，最优选为相当于低于约1%的数目。
因此，一部分氨基酸序列不同的蛋白质可以为与上述改变型脂肪酶的氨基酸序列中任一序列具有例如约70%以上、优选约80%以上、进一步优选约90%以上、更进一步优选约95%以上、最优选约99%以上的氨基酸序列同一性的同源蛋白质。氨基酸序列同一性可以使用本领域从业人员众所周知的BLAST以初始设定值进行计算。BLAST在网址（例如，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastp＆BLAST_PROGRAMS=blastp＆PAGE_TYPE=BlastSearch＆SHOW_DEFAULTS=on＆BLAST_SPEC=blast2seq＆LINK_LOC=blasttab＆LAST_PAGE=blastn＆BLAST_INIT=blast2seq）中公开。
上述的同源蛋白质能够优选通过使不参与氨基甲酸酯化反应的氨基酸残基产生保守性氨基酸取代来得到。在此，保守性氨基酸取代是指将某氨基酸残基取代为具有同样性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链分类为如下几个家族（family）：碱性侧链（例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、非带电极性侧链（例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β分支侧链（例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）、芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）。保守性氨基酸取代优选为相同家族内的氨基酸残基间的取代。
因此，Q193X改变型脂肪酶突变体可以为与Q193X改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与193改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
另外，W104F改变型脂肪酶的突变体可以为与W104F改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与W104F改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
另外，Q193E改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
另外，Q193E/W104F改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/W104F改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/W104F改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/W104F改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/W104F改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/W104F改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/L278K改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/L278K改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/L278K改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/L278K改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/L278R改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/L278R改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/L278R改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/L278R改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/W104F/L2678K改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶的突变体可以为与Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
L278X1改变型脂肪酶的突变体可以为与L278X1改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与L278X1改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
L278R改变型脂肪酶的突变体可以为与L278R改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与L278R改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
L278K改变型脂肪酶的突变体可以为与L278K改变型脂肪酶具有约70%以上的氨基酸序列同一性且显示与L278K改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA是指具有编码改变型脂肪酶或其突变体的氨基酸序列的核酸序列的DNA，核酸序列可以基于本领域从业人员众所周知的遗传密码由氨基酸序列来确定。
由于一个以上的密码子能够编码相同的氨基酸（密码子的简并），所以，一个以上的核酸序列能够编码一个氨基酸序列。因此，只要是编码改变型脂肪酶或其突变体的核酸序列，则编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA没有限定。
编码Q193E改变型脂肪酶（序列编号2）或Q193D改变型脂肪酶（序列编号19）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如序列编号14或35的序列。编码W104F改变型脂肪酶（序列编号3）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如序列编号17的序列。
编码Q193E/W104F改变型脂肪酶（序列编号4）或Q193D/W104F改变型脂肪酶（序列编号20）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如序列编号18或36的序列。
编码Q193E/L278R改变型脂肪酶（序列编号23）、Q193E/L278K改变型脂肪酶（序列编号24）、Q193D/L278R改变型脂肪酶（序列编号25）或Q193D/L278K改变型脂肪酶（序列编号26）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如序列编号39、40、41或42的序列。
编码Q193E/W104F/L278R改变型脂肪酶（序列编号27）、Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号28）、Q193D/W104F/L278R改变型脂肪酶（序列编号29）或Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号30）的氨基酸序列的核酸序列，可以举出例如序列编号43、44、45或46的序列。
编码Q193E/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶（序列编号31）、Q193E/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶（序列编号32）、Q193D/W104F/L278R/A283V改变型脂肪酶（序列编号33）或Q193D/W104F/L278K/A283V改变型脂肪酶（序列编号34）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如序列编号47、48、49或50的序列。
编码L278R改变型脂肪酶（序列编号21）或L278K改变型脂肪酶（序列编号22）的氨基酸序列的核酸序列可以举出例如序列编号37或38的序列。
改变型脂肪酶的突变体可以为与改变型脂肪酶基因杂交且显示与改变型脂肪酶同等的氨基甲酸酯化活性的突变体。
所谓杂交优选指严格条件下的杂交。特别优选是指如下条件下的杂交：杂交缓冲液：2×SSC、10×Denhardt溶液（聚蔗糖(Ficoll)400+PEG+BSA；比率=1：1：1、0.1%SDS、5mM EDTA、50mMNa2HPO4、250μg/ml鲱鱼精DNA、50μg/ml tRNA、或25M磷酸钠缓冲液pH7.2；1mM EDTA；7%SDS），杂交温度：T=65～68℃，清洗缓冲液：0.1×SSC、0.1%SDS，清洗温度：T=65～68℃。
所谓含有编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA的转化微生物是指以将编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA导入微生物来生产改变型脂肪酶或其突变体的方式进行转化得到的微生物。编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA在微生物中既可以以质粒存在也可以整合在染色体中。
微生物没有限定，例如可以列举细菌、酵母、丝状菌等。可优选列举：大肠杆菌（Escherichia）、棒状杆菌（Corynebacterium）、芽孢杆菌（Bacillus）、乳酸菌（Lactobacillus(乳杆菌)、Bifidobacterium(双歧杆菌)）、酵母（Saccharomyces(糖酵母)、Pichia(毕赤氏酵母)、Schizosaccharomyces(裂殖糖酵母)、Kluyveromyces(克鲁维氏酵母)、Hansenula(汉逊氏酵母)、Yarrowia(亚罗酵母)）、丝状菌（Aspergillus(曲霉)）等。其中，更优选大肠杆菌（Escherichia co1i(大肠埃希氏菌)）、酵母（Saceharomyces、Pichia Schizosaccharemyces、Kluyveremyces、Hansenula、Yarrewia）、丝状菌（Aspergillus）。这些微生物可以从市场上获得。
转化到微生物中的编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA优选位于载体。载体可以列举：噬菌体、质粒等，优选质粒。质粒更优选具有用于表达的启动子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号序列、多克隆位点、复制起始点、选择标记等的表达用质粒。
作为源自大肠杆菌的质粒，例如可以列举：pBR322、pBR325、pUC18、pUC118。作为源自酵母的质粒，例如，可以列举：pSH19、pSH15、pYES2，作为源自丝状菌的质粒，例如，可以举出pAUR316。这些质粒可以从市场上获得。
转化到微生物中的编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA优选与能够在微生物中表达的启动子可操作地连结。
启动子只要在微生物中使所连结的改变型脂肪酶或其突变体表达就没有限定。在微生物为大肠杆菌的情况下，优选trp启动子、1ac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、T7启动子等，在微生物为酵母的情况下，优选PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、GAL1启动子等。在微生物为丝状菌的情况下，优选葡糖淀粉酶基因的启动子、α-淀粉酶基因的启动子、醇脱氢酶I基因的启动子、烯醇化酶基因的启动子等。
所谓与启动子可操作地连结是指在启动子的下游连结改变型脂肪酶或其突变体，以使其在启动子的控制下生产改变型脂肪酶或其突变体。
微生物的转化可以根据该技术领域中公知的方法进行。例如有电穿孔法或在制成感受态细胞的微生物中通过钙法导入DNA的方法等。
本发明的改变型脂肪酶或其突变体的制造优选通过在培养基中培养上述转化体并使上述改变型脂肪酶在培养基中和/或转化体中积累的方法来进行。
用于培养转化体的培养基只要为该微生物繁殖的培养基就没有特别限制，可以通过该技术领域中公知的方法进行培养。例如，在以葡萄糖、蔗糖等糖类为碳源且含有铵盐、硝酸盐等无机氮源、或者酵母提取物等有机氮源以及各种无机盐、维生素类等的培养液中，根据情况也可以含有诱导剂（IPTG等）、选择剂（氨苄青霉素、氯霉素、羧苄青霉素等抗生素等）等。培养条件（温度、时间、振荡、需氧或厌氧）只要为微生物繁殖的条件就没有特别限定。
在培养基中分泌改变型脂肪酶或其突变体的情况下，编码改变型脂肪酶或其突变体的DNA也可以与用于分泌的信号序列连结。信号序列可以使用例如碱性磷酸酶、转化酶等信号序列。另外，也可以与用于使纯化变得容易的标签序列，例如组氨酸标签序列、FLAG标签序列等连结。另外，也可以在标签序列、信号序列与改变型脂肪酶或其突变体之间连结切割序列，例如肽链内切酶的识别序列。
通过转化体生产的改变型脂肪酶或其突变体可以直接使用培养培养基和/或培养转化体，也可以进一步进行纯化。从培养培养基和/或培养转化体中的纯化可以根据现有的蛋白质的纯化方法使用例如色谱法（凝胶过滤色谱法、亲合色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法等）等来进行。
本发明的改变型脂肪酶或其突变体优选结合于不溶性载体而成的固定化改变型脂肪酶或其突变体。
为了进行载体结合法（物理吸附法、离子结合法、共价结合法、生化特异性结合法），载体例如可以列举：多糖（纤维素、琼脂糖等）、无机物质（多孔玻璃、金属氧化物等）、合成高分子（聚丙烯酰胺化合物、聚苯乙烯树脂、离子交换树脂等）。为了进行交联法，例如可以列举：OHC-(CH2)3-CHO（戊二醛）、O=N=C-(CH2)3-C=N=O。为了进行包埋法，例如可以列举：多糖（褐藻酸、卡拉胶等）、聚丙烯酰胺化合物、ENT、PU、尼龙。
改变型脂肪酶或其的突变体向载体的固定化可以根据用于蛋白质的现有的固定化方法进行。
本发明中使用的微生物、重组DNA、突变体制作、PCR、表达、培养、纯化，固定化等实验技术对于本领域从业人员是众所周知的，详细记载于一般的教科书（例如，MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，second edition（Sambrook et al.，1989）ColdSpring Harbor Laboratory Press；（CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY（F.M.Ausubel et a1.，eds.，1987and annualupdates）；PCR PROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS ANDAPPLICATIONS（Innis et al.，1990.Academic Press，San Diego，CA）；PCR：THE POLYMERASE CHAIN REACTION（Mullis et al.，eds.，1994）；MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOY ANDBIOTECHNOLOGY，Second Edition（A.L.Demain，et al.，eds.1999）；及BIOTECHNOLOGY：A TEXTBOOK OF INDUSTRIALMICROBIOLOGY，（Thomas D.Brock）Second Edition（1989）SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，Mass等）中。
氨基甲酸酯化反应中的本发明的改变型脂肪酶或其突变体的使用是指通过本发明的改变型脂肪酶或其突变体进行氨基甲酸酯化反应。优选改变型脂肪酶或其突变体被固定化。
如下述反应式（A）所示，氨基甲酸酯化反应是指使胺化合物与碳酸酯化合物形成氨基甲酸酯键的反应。
反应式（A）：
Figure BDA0000406866610000181
（式中，R表示可以具有氢原子或取代基的烃基）。
胺化合物只要通过与碳酸酯化合物反应合成氨基甲酸酯化合物就没有特别限定，在本发明中，优选使用单胺化合物或二胺化合物。更优选使用脂肪族单胺化合物或脂肪族二胺化合物。脂肪族胺表示直链状烃的氢原子取代为氨基、-NH2得到的化合物。
单胺化合物优选使用通式（I）所示的化合物。
通式（I）：
R1-(CH2)n-NH2
（式中，R1为可以具有取代基的C1～20直链或支链烷基、可以具有取代基的C2～20直链或支链烯基、可以具有取代基的C2～20直链或支链炔基、可以具有取代基的C4～24环烷基烷基、可以具有取代基的C7～21芳烷基或可以具有取代基的C3～20环烷基，n为0或1）。
R1中的可以具有取代基的C1～20直链或支链烷基可以列举：甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、异丙基、异丁基或叔丁基等。优选C1～12直链或支链烷基，更优选甲基、乙基、正丙基、正丁基、正己基、正十二烷基、异丙基或叔丁基。
R1中的可以具有取代基的C2～20直链或支链烯基可以列举：烯丙基、1-丙烯基、1-丁烯基、1-戊烯基或异丙烯基等。优选C2～12直链或支链烯基，更优选烯丙基。
R1中的可以具有取代基C2～20直链或支链炔基，可以列举：乙炔基、炔丙基、丁炔基或1-甲基-2-丙炔基等。优选C2～12直链或支链炔基，更优选乙炔基或炔丙基。
R1中的可以具有取代基的C3～20环烷基为可以取代有C1～4直链烷基的单环或多环脂环式烃基，可以列举：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、双环[2.2.1]庚基、甲基环己基、二甲基环己基或乙基环己基等。优选C3～12环烷基，更优选环己基或双环[2.2.1]庚基。在此，C1～4的直链烷基可以列举：甲基、乙基、正丙基或正丁基等。
R1中的可以具有取代基的C4～24环烷基烷基为可以取代有上述所定义的C3～20环烷基的C1～4直链烷基，可以列举例如环己基甲基、环己基乙基、三甲基环己基甲基或降冰片基甲基等。优选取代有C3～10环烷基的C1～4直链烷基即C4～14环烷基烷基，更优选环己基甲基。
R1中的可以具有取代基的C7～21芳烷基可以举出取代有C6～20芳基的烷基。C6～20芳基为具有单环或多环的芳香环的基团，可以列举：苯基、萘基、联苯基或联三苯基（例如，对联三苯基-4-基、间联三苯基-3-基）等。另外，烷基的碳原子数为从芳烷基的碳原子数减去芳基的碳原子数而得到的数目。由此，C7～21芳烷基可以列举：苄基、苯乙基、萘基甲基或间联三苯基-3-基-甲基等，优选C7～13芳烷基，更优选苄基。另外，作为R1列举的基团包含各种异构体。
作为上述R1列举的基团可以具有进一步的取代基。作为R1中的进一步的取代基，例如可以列举：卤素原子（氟原子、氯原子、溴原子或碘原子）；甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基等C1～4的烷氧基；二甲基氨基、二乙基氨基或二丙基氨基等双取代有C1～6烷基的二烷基氨基；氰基；硝基；乙酰基；及R1为芳烷基时直接键合于苯环的氨基等。
如上所述，R1优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正己基、正十二烷基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氰基甲基、硝基甲基、氟乙基、三氟乙基、三氯乙基、氰基乙基、硝基乙基、甲氧基乙基、乙氧基乙基或叔丁氧基乙基等可以具有取代基的、C1～12直链或支链烷基、C3～12环烷基、C4～14环烷基烷基、苄基、氟苄基、氯苄基、溴苄基、碘苄基、甲氧基苄基、二甲氧基苄基、硝基苄基、二硝基苄基或氰基苄基；及氨基苄基等可以具有取代基的C7～13的芳烷基，特别优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正己基、正十二烷基、环己基、环己基甲基或苄基。
如上所述，通式（1）所示的单胺化合物特别优选为正己胺化合物、正十二烷基胺化合物、环己基甲基胺化合物或苄基胺化合物。
二胺化合物优选使用通式（II）所示的化合物。
通式（II）：
H2N-(CH2)m-R3-(CH2)p-NH2
（式中，R3为可以具有取代基的C1～20直链或支链亚烷基、可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基-C1～4直链亚烷基、可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C6～20亚芳基-C1～4直链亚烷基、可以具有取代基的C3～20环亚烷基或可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基，m和p互相独立，为0或1）。
R3中的可以具有取代基的C1～20直链或支链亚烷基，可以列举：亚甲基、亚乙基、正亚丙基、正亚丁基、正亚戊基、正亚己基、正亚庚基、正亚辛基、正亚壬基、正亚癸基或正亚十二烷基等直链亚烷基；或2-甲基亚丙基、2-甲基亚己基、四甲基亚乙基等支链亚烷基。优选C1～ 20直链亚烷基，更优选亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基或亚十二烷基。
R3中的可以具有取代基的C3～20环亚烷基为单环或多环的烃基，可以列举：可以取代有C1～4直链烷基的环亚丙基、环亚丁基、环亚戊基、环亚己基或双环[2.2.1]庚烷-2,6-二基。优选C3～12环亚烷基，更优选环亚己基或双环[2.2.1]庚烷-2,6-二基。
R3中的可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基-C1～4直链亚烷基中的C1～4直链亚烷基，可以列举：亚甲基、亚乙基、亚丙基或亚丁基。C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基-C1～4直链亚烷基可以列举：亚甲基-环亚戊基-亚甲基、亚乙基-环亚戊基-亚乙基或亚甲基-环亚己基-亚甲基等。优选C1～4直链亚烷基-C3～12环亚己基-C1～4直链亚烷基，更优选亚甲基-环亚己基-亚甲基。
R3中的可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基，优选取代有C1～4直链亚烷基-C1～4直链烷基的C3～12环亚烷基，更优选亚甲基-三甲基环亚己基。
R3中的可以具有取代基的C1～4直链亚烷基-C6～20亚芳基-C1～4直链亚烷基优选C1～4直链亚烷基-亚苯基-C1～4直链亚烷基，更优选亚二甲苯基。另外，这些基团包含各种异构体。
R3中的烃基可以具有进一步的取代基。作为R3中的进一步的取代基，可以举出与R1中的烃基的取代基相同的基团。另外，在R3为C1～4直链亚烷基-C6～20亚芳基-C1～4直链亚烷基的情况下，R3中的取代基可以举出直接键合于亚芳基的芳香族碳原子的伯氨基。
如上所述，R3优选为C1～20直链或支链亚烷基、C1～4直链亚烷基-C3～ 20环亚烷基-C1～4直链亚烷基、C1～4直链亚烷基-C6～20亚芳基-C1～4直链亚烷基、C3～20环亚烷基或C1～4直链亚烷基-C3～20环亚烷基；更优选为C1～12直链亚烷基、C1～4直链亚烷基-C3～12环亚烷基-C1～4直链亚烷基、C1～4直链亚烷基-亚苯基-C1～4直链亚烷基、C3～12环亚烷基或取代有C1～4直链亚烷基-C1～4直链烷基的C3～12环亚烷基；特别优选为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基、亚癸基、亚十二烷基、环亚己基、亚甲基-三甲基环亚己基、环亚己基二亚甲基或亚二甲苯基。
本发明的二胺化合物优选可以得到作为二异氰酸酯的原料的双氨基甲酸酯化合物的化合物。在本发明中，更优选选自1,6-六亚甲基二胺化合物、1,12-十二亚甲基二胺化合物、异佛尔酮二胺化合物、1,3-双(氨基甲基环己烷)、1,4-双(氨基甲基环己烷)、4,4’-亚甲基双(环己烷胺化合物)、2,5-双(氨基甲基)双环[2,2,1]庚烷、2,6-双(氨基甲基)双环[2,2,1]庚烷、1,3-双(氨基甲基)苯、1,4-双(氨基甲基)苯中的至少一种。
本发明的碳酸酯化合物优选使用通式（III）所示的化合物。
通式（III）:
Figure BDA0000406866610000221
（式中，R2表示可以具有取代基的烃基，R2可互相独立地形成环。）
在通式（III）中，R2的可以具有取代基的一价烃基可以举出与通式（1）中所定义的R1相同的基团。作为R2中的烃基，优选为甲基、乙基、正丙基、异丙基或正丁基等C1～20、优选C1～6直链或支链烷基，特别优选的基团为甲基或乙基。
上述R2中的烃基也可以具有进一步的取代基。作为进一步的取代基，例如可以列举：卤素原子（氟原子、氯原子、溴原子或碘原子）；甲氧基、乙氧基、丙氧基或丁氧基等C1～4烷氧基；二甲基氨基、二乙基氨基或二丙基氨基等双取代有C1～4的烷基的二烷基氨基；氰基或硝基。
如上所述，通式（III）所示的碳酸酯化合物优选为碳酸二甲酯化合物或碳酸二乙酯化合物。
本发明的反应可以使用有机溶剂或在无溶剂下进行。有机溶剂只要为能够溶解胺化合物和碳酸酯化合物且不会使改变型脂肪酶或其突变体失活的溶剂就没有特别限定，优选饱和环状烃、不饱和环状烃类、非环状醚类或它们的混合溶剂。
饱和环状烃类溶剂可以列举：环戊烷、环己烷、环庚烷或异丙基环己烷等C5～10非取代环烷烃类；氯代环戊烷或氯代环己烷等取代有卤素的C5～10环烷烃类等。优选为C5～10非取代环烷烃类，更优选为环己烷。
不饱和环状烃类溶剂可以列举：苯、甲苯、二甲苯或均三甲苯等芳香族烃类；环戊烯或环己烯等C5～10环烯烃类等。优选为芳香族系烃类，更优选为甲苯或二甲苯。
作为非环状醚，可以列举脂肪族醚类、例如二乙醚、叔丁基甲基醚或二异丙基醚等C2～8二烷基醚类；环戊基甲基醚或环戊基乙基醚等C5～18环烷基烷基醚类；苄基苯基醚、苄基甲基醚、烷基苯基醚、二苯基醚、二(对甲苯基)醚或二苄基醚等C7～18芳香族醚类等。优选为脂肪族醚类或者芳香族醚类，更优选为二异丙基醚或苯甲醚。这些有机溶剂可以单独使用或混合使用两种以上。
上述有机溶剂的使用量相对于1g单胺化合物或二胺化合物，优选为1～200mL，更优选为1～50mL，特别优选为1～20mL。
如下述反应式（B）和（C）所示那样，本发明的氨基甲酸酯化反应例如混合单胺化合物或二胺化合物、碳酸酯化合物、有机溶剂和改变型脂肪酶或其突变体（优选固定化改变型脂肪酶或其突变体），一边搅拌一边进行反应。或者利用在填充了固定化改变型脂肪酶或其突变体的柱中，使含有单胺化合物或二胺化合物以及碳酸酯化合物的有机溶剂通过的流通连续式等方法来进行。
在以流通连续式进行反应的情况下，反应溶液中的单胺化合物或二胺化合物的浓度优选设为相对于反应体系的总质量为10～50质量%。另外，反应液的通液线速度优选为0.5～400mm/分钟，进一步优选为1～200mm/分钟。该通液线速度（mm/分钟）是指由每分钟的送液量（mm3/分钟）（或称为送液速度（10-3mL/分钟））除以填充层剖面面积（mm2）而得到的商所表示的值。随着填充塔内压力因通液线速度提高而增大，液体通过变得困难，需要高耐压性的酶填充塔，除此以外，有时也会发生固定化酶因塔内压力的增加而破碎的情况，因此通液线速度优选设为400mm/分钟以下。另外，从生产率的方面考虑，通液线速度优选设为1mm/分钟以上。固定化酶的表达活性根据通液线速度发生变化，因此，通过选择最适的通液线速度确定反应条件，可以进行符合所期望的生产能力、制造成本的反应。反应容器中的反应溶液的流通时间可以设为30秒～6小时的范围。
反应式（B）：
Figure BDA0000406866610000241
（式中，R1、R2、m、n与上述的意义相同。）
反应式（C）：
Figure BDA0000406866610000242
（式中，R2、R3、m、n、p与上述的意义相同。）
本发明的反应中的温度只要为改变型脂肪酶或其的突变体不会失活的温度就没有特别限制，为了收率良好地得到所期望的氨基甲酸酯化合物，优选30℃～120℃，更优选60℃～90℃，特别优选65℃～90℃。另外，批式反应中的反应压力没有特别限制，优选在常压下或减压下进行。批式反应时的反应时间没有特别限定，优选0.5小时～120小时，更优选为0.5小时～72小时。
本发明的反应优选根据使用的各改变型脂肪酶或其突变体的特性在其不会失活的范围内进行。
在本发明中，反应通常为非均相体系，在催化剂可再利用且后处理简便的方面有利。即，反应结束时通过过滤除去催化剂，浓缩所得到的滤液，由此能够得到产物。另外，也可以通过对所得到的滤液进行晶析操作而得到产物。
用于本发明反应的制造装置没有特别限制，例如可以列举：反应容器、加热（冷却）装置等一般的制造装置。优选本发明的改变型脂肪酶或其突变体被固定化于载体、作为固定床内装于反应容器的装置。因此，本发明的反应优选为包括使单胺化合物或二胺化合物与碳酸酯化合物通过该反应容器的工序的反应。
而且，通过本发明的制造方法得到的通式（IV）所示的单氨基甲酸酯化合物或通式（V）所示的双氨基甲酸酯化合物也可以通过蒸馏、分液、提取、晶析、重结晶和柱层析法等一般的方法进一步纯化。
通式（IV）：
Figure BDA0000406866610000251
（式中，R1、R2、n与上述的意义相同。）
通式（V）：
Figure BDA0000406866610000252
（式中，R2、R3、m、p与上述的意义相同。）
通过本发明的制造方法得到的单氨基甲酸酯化合物、双氨基甲酸酯化合物使用本发明的改变型脂肪酶或其的突变体制造。因此，现有的氨基甲酸酯化合物制造方法中可能引起的在制品中混入金属盐或卤化物等杂质的可能性极低，可以得到化学上更安全的制品。
氨基甲酸酯化反应中的本发明的改变型脂肪酶或其突变体的使用是指通过本发明的改变型脂肪酶或其突变体进行氨基甲酸酯化反应。改变型脂肪酶或其的突变体优选被固定化。
下面，对本发明的实施例进行说明，但本发明并不受这些实施例任何限定。
[实施例1]
源自Candida antarctica的脂肪酶B（野生型、序列编号1）的通过酵母的表达
1）编码源自酵母转化酶（SUC2）的信号序列（序列编号6）的DNA片段的扩增
为了将源自SUC2的信号序列（序列编号6的核酸序列和序列编号7的氨基酸序列）克隆至酵母表达用载体，使用下面两种引物，即SUC2-F（序列编号8）：5’-gggaatattaagcttggtaccatgcttttgcaagctttccttttc-3’（无下划线的部分为与pYES2/CT载体相同的序列，下划线部分为编码SUC2信号序列的N末端侧的碱基序列）和SUC2-R（序列编号9：5’-tgctggatatctgcagaattctgcagatattttggctgcaaaac-3’（无下划线部分为与pYES2/CT载体相同的序列，下划线部分为编码SUC2信号序列的C末端侧的碱基序列），通过PCR进行DNA片段的扩增。以Saccharomycescerevisiae S288C（啤酒糖酵母S288C）株（Open Biosystems公司制）的染色体DNA作为模板，使用KOD Plus（东洋纺公司制）在94℃加热5分钟之后，进行94℃15秒、54℃30秒、68℃18秒的循环30次。引物等寡核苷酸可以由株式会社FASMAC获得。
2）pYES2/CT载体的利用限制酶的线性化
在GAL1启动子下游的位置用限制酶Kpn I（东洋纺公司制）切割（37℃、5小时）pYES2/CT载体（Invitrogen公司制）。切割后的DNA片段使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN公司制）进行纯化。将KPnI切割后的DNA片段进一步使用限制酶EcoR I（东洋纺公司制）进行切割（37℃、16小时），使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN公司制）纯化DNA片段。由此得到线性化的pYES2/CT载体。
3）编码源自SUC2的信号序列的DNA片段向载体的克隆
向1）中得到的PCR产物5μL中加入利用同源序列的克隆法即In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit w/Cloning Enhancer（Clontech公司制）中所附带的Cloning Enhancer2μL，在37℃处理15分钟后，在80℃进行15分钟的处理，得到Cloning Enhancer处理PCR产物。按照试剂盒中所附的方法使所得到的Cloning Enhancer处理PCR产物与2）中得到的线性化的pYES2/CT载体进行反应（在37℃反应15分钟之后，在50℃反应15分钟）。反应后，加入TE缓冲液40μL进行稀释，然后使用一部分液体（2.5μL）对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用WizardPlus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。对得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号6）。将得到的导入有源自SUC2的信号序列的载体称为pYES2/CT-SUC2sig。
4）编码源自Candida antarctica的脂肪酶B基因（序列编号5）的DNA片段的扩增
为了将编码源自Candida antarctica的脂肪酶B（CALB）基因（序列编号5）的DNA片段克隆至作为表达载体的pYES2/CT-suc2sig，使用以下两种引物：SUC2-mCALBf（序列编号10）：5’-gccaaaatatctgcactaccttccggttcggac-3’（无下划线部分为与编码SUC2信号序列的C末端侧的碱基序列相同的序列，下划线部分为编码成熟型CALB的N末端侧的碱基序列）和CalBterminal-r（序列编号11）：5’-cttaccttcgaagggccctctagactcgagtcagggggtgacgatg-3’（无下划线部分为与pYES2/CT-SUC2sig相同的序列，下划线部分为编码成熟型CALB的C末端侧的碱基序列），通过PCR进行DNA片段扩增。以克隆有CALB基因（购入在（株）Takara-bio通过定制合成序列编号5的序列的DNA、所克隆得到的质粒）的载体为模板，使用KOD Plus（东洋纺公司制）在94℃加热2分钟之后，进行94℃15秒、55℃30秒、68℃60秒的循环30次。
5）pYES2/CT-SUC2sig载体的利用限制酶的线性化
通过限制酶EcoR I（东洋纺公司制）切割（37℃、15小时）pYES2/CT－SUC2sig载体。切割后的DNA片段使用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN公司制）进行纯化。将EcoR I切割后的DNA片段进一步通过限制酶Xba I（东洋纺公司制）进行切割（37℃、16小时），使用QIAquickGel Extraction Kit（QIAGEN公司制）纯化DNA片段。由此得到线性化pYES2/CT-SUC2sig载体。
6）源自Candida antarctica的脂肪酶B基因向pYES2/CT-SUC2sig载体的克隆
向4）中得到的PCR产物5μL中加入In-Fusion Advantage PCRCloning Kit w/Cloning Enhancer（Clontech公司制）中所附带的CloningEnhancer2μL，在37℃处理15分钟后，在80℃处理15分钟，得到CloningEnhancer处理PCR产物。按照试剂盒中所附的方法使所得到的CloningEnhancer处理PCR产物与5）中得到的线性化pYES2/CT-SUC2sig载体进行反应（在37℃反应15分钟后，在50℃反应15分钟）。反应后，加入TE缓冲液40μL进行稀释，然后使用一部分液体（2.5μL）对ECOS E.coliDH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/L羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时后，使用Wizard Plus Minipreps DNA PurificationSystem（Promega公司制）提取质粒。对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号5）。将所得到的导入有源自SUC2的信号序列的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB（图1））。
7）利用pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的酵母的转化和野生型CALB表达
向酵母的转化使用S.cerevisiae Direct Transformation Kit Wako（和光纯药公司制），按照试剂盒说明书进行。将酵母S.cerevisiae BY4742株（由Open Biosystems，Inc.购买）以OD600=0.01的方式悬浮在YPD液体培养基（1%yeast extract(酵母提取物)，2%peptone(蛋白胨)，2%glucose(葡萄糖)）中，取1mL在30℃、180rpm培养27.5小时。制备转化液（在试剂盒所附带的Sc Tansformation Reagent20μ1中加入试剂盒所附带的Carrier DNA2μl和1μg质粒DNA而成），在42℃保温2小时。制备含有pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体和酵母培养液的混合液，进行转化。将转化液涂布于SC-Ura琼脂培养基（0.67%yeast nitrogen base(酵母氮源)（不含氨基酸）、2%葡萄糖、0.01%（腺嘌呤(adenine)、精氨酸(arginine)、半胱氨酸(cysteine)、亮氨酸(leucine)、赖氨酸(lysine)、苏氨酸(threonine)、色氨酸(tryptophan)）、0.005%（天冬氨酸(asparticacid)、组氨酸(histidine)、异亮氨酸(isoleucine)、甲硫氨酸(methionine)、苯丙氨酸(phenylalanine)、脯氨酸(proline)、丝氨酸(serine)、酪氨酸(tyrosine)、缬氨酸(valine)）、2%琼脂(agar)、pH5.6）后，在30℃培养3天，得到转化后的酵母菌落。
将载有pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的转化酵母接种于5mL的SC-Ura液体培养基，在30℃、200rpm培养16小时。将得到的预培养液加入到100mL的表达用YPD液体培养基（1%酵母提取物，4%蛋白胨，2%葡萄糖）中，使用500mL的坂口烧瓶（Sakaguchi flask）在20℃、130rpm的条件下培养3天。加入YG溶液（20%酵母提取物，40%半乳糖）2mL，直接在20℃、130rpm的条件下培养3天。离心分离培养液之后，回收上清液，通过下述所示的方法测定培养上清液中的酶活性（酯化合物分解活性）。
将560μL的底物溶液（50mM Tris-HC1，1%DMSO，2.1mM对硝基苯丁酸酯(p-nitrophenyl butyrate)，pH7.0）放入比色皿并在25℃预保温3分钟。接着加入培养上清液140μL并搅拌，利用分光光度计经时测定405nm的吸光度，算出反应的初始速度。其结果，在载有pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体的转化酵母中确认到高的酯化合物分解活性（图2）。
8）脂肪酶的纯化
在10mL的SC-Ura液体培养基中接种菌，在30℃、180rpm的条件下振荡培养一晩（16小时）。在2L的带挡板的烧瓶中准备的YPD培养基（1%酵母提取物，4%胰蛋白胨，2%葡萄糖）500mL加入预培养液10mL，在30℃、95rpm的条件下振荡培养8小时。添加20%酵母提取物25mL和40%半乳糖25mL，在20℃、95rpm的条件下振荡培养3天（约72小时），诱导表达。通过离心分离（8000g、10分钟）回收培养上清液之后，使培养上清液通过用20mM Tris-HC1缓冲液（pH7.5）平衡化的Butyl-TOYOPEARL650M（东曹制），使脂肪酶吸附于载体。用相同缓冲液清洗后，使用含有50%（v/v）EtOH的20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）洗脱脂肪酶。使洗脱液通过用20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）平衡化的SuperQ-650S（东曹制），回收直接通过后的溶液。
使用离心式超滤过滤器（Amicon（注册商标）Ultra-15CentrifugalFilter Devices、10000MWCO、Millipore制）将含有脂肪酶的溶液浓缩至1.0mL之后，加入20mM Tris-HCl缓冲液（pH7.5）10mL并混合，进一步浓缩至1.0mL。合计实施该操作三次，得到将溶剂置换为缓冲液的脂肪酶浓缩液。使脂肪酶浓缩液通过用20mM Tris-HC1缓冲液（pH7.5）平衡化的SuperQ-650S（东曹制），将直接通过后的溶液作为纯化脂肪酶溶液。
9）脂肪酶固定化酶的制备
在试管中准备作为载体的离子交换树脂的Lewatitt VPOC l600（LANXESS公司制）0.60g，加入3mL的乙醇并搅拌之后，使用移液器除去乙醇。加入蒸馏水3mL并搅拌之后，同样地除去水。进一步进行两次水洗，加入到1.5mg/mL的纯化脂肪酶溶液6mL（20mM Tris-HCI缓冲液、pH7.0）中，在10℃、180rpm的条件下搅拌19小时。分离溶液和载体之后，将回收的载体用3mL的蒸馏水清洗，然后进行减压干燥16小时，得到载体重量比担载酶量3wt%的固定化酶。
在固定化处理前后，通过BCA法（标准蛋白BSA）测定脂肪酶溶液中的蛋白质浓度，将因固定化处理减少的蛋白量作为向载体的固定化蛋白量，将除以所得到的固定化酶重量而得到的量作为酶担载量。
[实施例2]
Q193E改变型脂肪酶（序列编号2）的制作
1）Q193E突变的导入
为了构建Q193E改变型脂肪酶，对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制），按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
以下面两种引物CalB-Q193E-F（序列编号12）：5’-CCTGAGGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3’（下划线部分为相当于Q193E突变的序列）和CalB-Q193E-R（序列编号13）：5’-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3’为模板，使用pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体进行突变导入反应（在94℃加热2分钟钟后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号14）。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E。
2）酵母转化、Q193E改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1的7）～9）中记载的方法同样地进行。
[实施例3]
W104F改变型脂肪酶（序列编号3）的制作
1）W104F突变的导入
为了构建W104F改变型脂肪酶，对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制），按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
以下面两种引物CalB-W104F-F（序列编号15）：5’-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下划线部分为相当于W104F突变的序列）和CalB-W104F-R（序列编号16）：5’-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’为模板，使用pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。向反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基上，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号17）。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F。
2）酵母转化、W104F改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1的7）～9）中记载的方法同样地进行。
[实施例4]
W104F/Q193E改变型脂肪酶（序列编号4）的制作
1）W104F/Q193E突变的导入
为了构建W104F/Q193E改变型脂肪酶，对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制），按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
以下面两种引物CalB-W104F-F（序列编号15）和Ca1B-W104F-R（序列编号16）为模板，使用pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。向反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL）对ECOS E.coliDH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard Plus Minipreps DNAPurification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列（序列编号18）。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E。
2）酵母转化、W104F/Q193E改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1的7）～9）中记载的方法同样地进行。
[实施例5]
对使用改变型脂肪酶（W104F、Q193E、W104F/Q193E）由碳酸酯化合物和作为单胺化合物的正己胺合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
Figure BDA0000406866610000321
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的玻璃制容器中加入正己胺200mg（1.97mmol）、碳酸二甲酯0.536g（5.95mmol）、作为内标物质的四乙二醇二甲醚20.0mg，然后加入甲苯并定容至2.0m1，向得到的反应液中混合实施例1～4中制备的固定化脂肪酶（担载酶量3wt%）10.0mg，一边搅拌一边在70℃反应24小时。反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl甲醇并过滤，将1.0μl供于气相色谱分析（图3A）。反应收率由产物标准品和内标比的校准曲线对产物量进行定量来算出。
气相色谱分析条件
色谱柱：DB-530m×0.25mmID0.25μm
柱温：80℃（2min）→10℃/min→250℃（2min）
进样室（INJ）：200℃，检测器（DET）：FID在250℃
载气（Carrier Gas）：He，线速度30cm/sec
分流比（Sprit ratio）50：1，进样量：1.0μ
保留时间：四乙二醇二甲醚：12.3min，
正己胺：3.15mim
氨基甲酸正己酯：8.84min
结果
[表1]
Figure BDA0000406866610000331
如上述表1和图3B所示，Q193E改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比，氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约1.5倍（反应时间3、6、8h）。另一方面，W104F改变型脂肪酶与野生型脂肪酶活性基本相同。令人惊讶的是，与野生型脂肪酶相比，W104F/Q193E改变型脂肪酶的氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约2.0倍（反应时间3、6、8h）。
[实施例6]
对使用改变型脂肪酶（W104F、Q193E、W104F/Q193E）由碳酸酯化合物和作为二胺化合物合成的1,3-二氨基甲基环己烷（1,3-BAC）合成的氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
Figure BDA0000406866610000332
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的玻璃制容器中加入1,3-二氨基甲基环己烷（1,3-BAC）200mg（1.41mmol）、碳酸二甲酯760mg（8.43mmol）、作为内标物质的十四烷20.0mg，然后加入甲苯并定容至2.0ml，向得到的反应液中混合实施例1～4中制备的固定化脂肪酶（担载酶量3wt%）10.0mg，一边搅拌一边在70℃反应48小时。反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl的DMF并进行过滤，将1.0μl供于气相色谱分析。反应收率由产物标准品和内标比的校准曲线对产物量进行定量来算出。
气相色谱分析条件
色谱柱：DB-530m×0.25mmID0.25μm
柱温：80℃（2min）→10℃/min→250℃（2min）
INJ：200℃DET：FID在250℃
载气：He，线速度30cm/sec
分流比50：1，进样量：1.0μ
保留时间：十四烷：11.0min，
1,3BAC-单氨基甲酸酯（异构体混合物）：14.9min，
1,3BAC-二氨基甲酸酯（异构体混合物）：18.9、19.2min，
结果
[表2]
如上述表2和图4所示，与野生型脂肪酶相比，Q193E改变型脂肪酶的氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约1.5倍（反应时间24、48h）。另一方面，相对于本底物，W104F改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比，合成活性稍微降低。令人惊讶的是，与野生型脂肪酶相比，W104F/Q193E改变型脂肪酶的氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约2.0倍（反应时间24、48h）。
[实施例7]
对使用改变型脂肪酶（W104F、Q193E、W104F/Q193E）由碳酸酯化合物和作为二胺化合物的1,12-二氨基十二烷合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
Figure BDA0000406866610000351
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的玻璃制容器中加入1,12-二氨基十二烷200mg（1.0mmol）、碳酸二甲酯540mg（6.0mmol），然后加入甲苯并定容至2.0ml，向得到的反应液中混合实施例1～4中制备的固定化脂肪酶（担载酶量3wt%）10mg，一边搅拌一边在70℃反应44小时。反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl甲醇以停止反应。接着，通过离心浓缩器进行减压浓缩，然后加入甲醇1.0ml使其溶解，然后利用0.45μm过滤器过滤并供给HPLC分析。反应收率根据预先由产物标准品的峰面积制作的校准曲线，对产物量进行定量来算出。
HPLC分析条件
色谱柱（Column）：Inertsil ODS-3V4.6mm×250mm（GLScience Inc）
流动相（Mobile Phase）：MeOH/H2O（20mM KH2PO4pH7.0）=70/30
流速（Flow Rate）：1.0ml/min
检测器（Detecter）：RI
柱温（Column Temp）：40℃
进样体积（Injection Vol.）10μl
保留时间：DMD-二氨基甲酸酯：17.4min，
结果
[表3]
Figure BDA0000406866610000352
如上述表3和图5所示，与野生型脂肪酶相比，Q193E改变型脂肪酶的二氨基甲酸酯化合物的合成活性提高约2倍（反应时间20、44h）。另一方面，相对于本底物，W104F改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比，合成活性稍微降低。令人惊讶的是，与Q193E改变型脂肪酶相比，W104F/Q193E改变型脂肪酶的二氨基甲酸酯化合物的合成活性提高。
[实施例8]
对使用改变型脂肪酶（W104F、Q193E、W104F/Q193E）由碳酸酯化合物和作为二胺化合物的苯二甲基二胺（XDA）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
Figure BDA0000406866610000361
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的玻璃制容器中加入苯二甲基二胺化合物200mg（1.46mmol）、碳酸二甲酯0.79g（8.81mmol）、作为内标物质的十四烷20.0mg，然后加入甲苯并定容至2.0ml，向得到的反应液中混合实施例1～4中制备的固定化脂肪酶（担载酶量3wt%）10mg，一边搅拌一边在70℃反应24小时。反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl DMF并过滤，将1.0μl供于气相色谱分析。反应收率由产物标准品和内标比的校准曲线对产物量进行定量来算出。
气相色谱分析条件
色谱柱：DB-530m×0.25mmID0.25μm
柱温：80℃（2min）→10℃/min→250℃（2min）
INJ：200℃DET：FID在250℃
载气：He，线速度30cm/sec
分流比50：1、进样量：1.0μ
保留时间：十四烷：11.0min，
XDA-单氨基甲酸酯：15.5min，
XDA-二氨基甲酸酯：19.6min，
结果
[表4]
Figure BDA0000406866610000371
如上述表4和图6所示，在以作为二胺化合物的苯二甲基二胺化合物为底物的情况下，与野生型相比，Q193E改变型脂肪酶和W104F改变型脂肪酶的二氨基甲酸酯化合物的合成活性提高3倍左右，进而，作为双重改变体的W104F/Q193E改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比，确认活性提高5倍以上。
[实施例9]
Q193D（序列编号19和35）、L278R（序列编号21和37）、L278K（序列编号22和38）和A283V（序列编号60和61）改变型脂肪酶的合成
1）改变的导入
为了构建各改变型脂肪酶，相对于实施例1中制作的pYES2CT/SUC2sig/mCALB载体（图1）进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制），按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下表5中记载的引物（下划线部分为相当于突变的序列）进行突变导入反应（在94℃加热2分钟后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
[表5]
Figure BDA0000406866610000372
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时培养之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNAPurification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有改变的载体分别称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193D、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278R、pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K及pYES2CT/SUC2sig/mCALB-A283V。
2）酵母转化、Q193D、L278R、L278K和A283V改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例10]
Q193E/L278R改变型脂肪酶（序列编号23和39）的合成
1）突变的导入
为了构建Q193E/L278R改变型脂肪酶，对于实施例2中制作的pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278Rf（序列编号53）：5’-CTCAGGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTC-3’（下划线部分为相当于L278R突变的序列）和CalB-L278r（序列编号54）：5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（NipponGene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278R。
2）酵母转化、Q193E/L278R改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例11]
Q193E/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号28和44）的合成
1）改变的导入
为了构建改变型脂肪酶，首先对于实施例9中制作的pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行L278K位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278Kf（序列编号55）：5’-CTCAAGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下划线部分为相当于L278K突变的序列）和CalB-L278r（序列编号56）：5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA PurificationSystem（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278K。
接着，为了导入W104F突变，对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278K载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-W104Ff（序列编号15）：5’-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下划线部分为相当于W104F突变的序列）和Ca1B-W104r（序列编号16）：5’-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA PurificationSystem（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278K。
2）酵母转化、W104F/Q193E/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例12]
Q193D/W104F/L278K改变型脂肪酶（序列编号30和46）的合成
1）改变的导入
为了构建改变型脂肪酶，首先对于实施例9中制作的pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K载体进行W104F位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即Ca1B-W104Ff（序列编号15）：5’-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下划线部分为相当于W104F突变的序列）和CalB-W104r（序列编号16）：5’-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA PurificationSystem（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-WF104F/L278K。
接着，为了导入Q193D突变，相对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/L278K载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-Q193Df（序列编号51）：5’-CCTGACGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3’（下划线部分为相当于Q193D突变的序列）和CalB-Q193r（序列编号52）：5’-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μl），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard（注册商标）Plus Minipreps DNA PurificationSystem（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193D/L278K。
2）酵母转化、W104F/Q193D/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例13]
Q193E/W104F/L278R/A283V突变型脂肪酶（序列编号31和47）的合成
1）改变的导入
为了构建各改变型脂肪酶，对于实施例4中制作的pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278R/A283Vf（序列编号59）：5’-CTCAGGGCGCCGGCGGCTGTAGCCATCGTG-3’（下划线部分分别为相当于L278R突变和A283V突变的序列）和CalB-L278r（序列编号54）：5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’，进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用Wizard Plus Minipreps DNA Purificatien System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278R/A283V。
2）酵母转化、W104F/Q193E/L278R/A283V改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例14]
使用实施例9～13中制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V），与实施例5同样地对由碳酸酯化合物（碳酸二甲酯）和单胺化合物（正己胺化合物）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
结果
[表6]
为了比较，野生型～W104F/Q193E记载了实施例5的表1的数据。
如上述表6和图7所述，W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改变型脂肪酶与Q193E改变型脂肪酶相比，反应3、6、8小时的收率明显较高，确认到反应速度进一步提高。
W104F/Q193E/L278R/A283V改变型脂肪酶的反应3小时的收率比野生型脂肪酶高约4倍。
[实施例15]
使用实施例9～13中制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V），与实施例6同样地对由碳酸酯化合物和作为二胺化合物的1,3-二氨基甲基环己烷（1,3-BAC）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。其中，实验条件在以下方面不同。
在实施例6中，使用含有2.0重量%水分的1,3-BAC，与此相对，在实施例14中，使用含有0.03重量%水分的1,3-BAC。另外，通过卡尔·费歇尔水分测定仪进行水分的测定。
结果
[表7]
Figure BDA0000406866610000441
如上述表7所示，W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改变型脂肪酶与Q193E改变型脂肪酶相比，收率明显较高，确认到反应速度进一步提高。特别是Q193E/L278R改变型脂肪酶的收率和反应速度提高显著。
[实施例16]
使用实施例9～13制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V），与实施例8同样地对由碳酸酯化合物和作为二胺化合物的苯二甲基二胺（XDA）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
结果
[表8]
Figure BDA0000406866610000451
为了比较，野生型～W104F/Q193E记载了实施例8的表4的数据。
如上述表8所示，W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R改变型脂肪酶与Q193E改变型脂肪酶相比，确认到活性提高。但是，W104F/Q193E/L278R/A283V和W104F/Q193E改变型脂肪酶最高。显示根据底物的不同，最适的改变型脂肪酶不同。
[实施例17]
使用实施例9～13中制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R/A283V、W104F/Q193D/L278K、W104F/Q193E/L278K、Q193E/L278R、L278R、L278K、Q193D、A283V），对由酯化合物和醇化合物进行酯交换的活性进行评价。
Figure BDA0000406866610000452
向具备搅拌装置、温度调节和上部冷却装置的内容积为约19ml的玻璃制容器中加入正丁醇200mg（2.69mmol）、乙酸乙烯酯0.463g（5.38mmol）、作为内标物质的四乙二醇二甲醚20.0mg，然后加入甲苯并定容至2.0ml，向得到反应液中混合实施例1和实施例9～13中制备的固定化脂肪酶（担载酶量3wt%）10.0mg，一边搅拌一边在30℃反应3小时。反应中，经时采集反应液50μl，加入150μl丙酮并过滤，将1.0μl供于气相色谱分析。反应收率由产物标准品和内标比的校准曲线对产物量进行定量来算出。
气相色谱分析条件
GC分析（GC-1700）
色谱柱：DB-170130m×0.25mm ID0.25μm
柱箱（Oven）：40℃（2min）→10℃/min→250℃（2min）
进样室：分流在250℃检测器：FID250℃
载气：He
线速度30cm/sec
分流比50：1
进样量：1.0μ
保留时间：四乙二醇二甲醚：17.3min
正丁基胺：3.2min
丙酸丁酯：5.6min
结果
[表9]
Figure BDA0000406866610000461
如上述表9所示，Q193E/L278R、L278R、L278K改变型脂肪酶较野生型脂肪酶，确认到明显的反应速度提高。
[实施例18]
W104F/L278K改变型脂肪酶的合成
1）突变的导入
为了构建W104F/L278K（序列编号62和63）改变型脂肪酶，对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus—Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-W104Ff（序列编号15）：5’-ACCTTTTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAG-3’（下划线部分为相当于W104F突变的序列）和CalB-W104Fr（序列编号16）：5’-GAGCACGGGAAGCTTGTTGTTG-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用WizardR Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/L278K。
2）酵母转化、W104F/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例19]
Q193E/L278K改变型脂肪酶的合成
1）突变的导入
为了构建Q193E/L278K（序列编号24和40）改变型脂肪酶，对于pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278Kf（序列编号55）：5’-CTCAAGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下划线部分为相当于L278K突变的序列）和CalB-L278r（序列编号56）：5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用WizardR Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193E/L278K。
2）酵母转化、Q193E/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例20]
Q193D/L278K改变型脂肪酶的合成
1）突变的导入
为了构建Q193D/L278K（序列编号26和42）改变型脂肪酶，对pYES2CT/SUC2sig/mCALB-L278K载体进行位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-Q193Df（序列编号51）：5’-CCTGACGTGTCCAACTCGCCACTCGACTCATCCTAC-3’（下划线部分为相当于Q193D突变的序列）和CalB-Q193r（序列编号52）：5’-CTGAACGATCTCGTCGGTCGC-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μL），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用WizardR Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-Q193D/L278K。
2）酵母转化、Q193D/L278K改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例21]
W104F/Q193E/L278R改变型脂肪酶的合成
1）突变的导入
为了构建W104F/Q193E/L278R（序列编号27和43）改变型脂肪酶，首先对pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E载体进行L278R位点突变导入。位点突变导入使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit（东洋纺公司制）按照所附的手册中记载的方法进行突变导入操作。
使用下面两种引物，即CalB-L278Rf（序列编号53）：5’-CTCAGGGCGCCGGCGGCTGCAGCCATCGTG-3’（下划线部分为相当于L278R突变的序列）和CalB-L278r（序列编号54）：5’-CGCAGCCGCGGCGACCTTTTGCTC-3’进行突变导入反应（在94℃加热2分钟之后，进行98℃10秒、68℃7分钟的循环10次）。
在反应液20μL中加入限制酶Dpn I0.8μL，在37℃反应4小时。使用通过该操作得到的一部分反应液（5μl），对ECOS E.coli DH5α感受态细胞（Nippon Gene公司制）50μL进行转化。将转化液全部量涂布于含有50μg/mL羧苄青霉素的LB琼脂培养基，在37℃培养16小时。从所得到的菌落中分离菌，在含有50μg/mL羧苄青霉素的LB液体培养基中培养16小时之后，使用WizardR Plus Minipreps DNA Purification System（Promega公司制）提取质粒。
对所得到的质粒分析碱基序列，确认为目标序列。将导入有突变的载体称为pYES2CT/SUC2sig/mCALB-W104F/Q193E/L278R。
2）酵母转化、W104F/Q193E/L278R改变型脂肪酶的表达、纯化和固定化酶的制备
与实施例1中记载的方法同样地进行。
[实施例22]
使用实施例18～21中制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R、W104F/L278K、Q193E/L278K、Q193D/L278K）与实施例5同样地对由碳酸酯化合物（碳酸二甲酯）和单胺化合物｛正己胺化合物）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。
结果
[表10]
Figure BDA0000406866610000501
为了比较，野生型～W104F/Q193E记载了实施例5的表1的数据，W104F/Q193E/L278R/A283V～A283V记载了实施例14的表6的数据。
如上述表10所示，W104F/Q193E/L278R改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比，反应3、6、8小时的收率明显较高，确认到反应速度进一步提高。
[实施例23]
对使用实施例18～21中制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R、W104F/L278K、Q193E/L278K、Q193D/L278K），与实施例15同样地由碳酸酯化合物和作为二胺化合物的1,3-二氨基甲基环己烷（1,3-BAC）合成氨基甲酸酯化合物的活性进行评价。与实施例14同样地使用含有0.03重量%水分的1,3-BAC。另外，通过卡尔·费歇尔水分测定仪进行水分的测定。
结果
[表11]
Figure BDA0000406866610000511
为了比较，野生型～A283V记载了实施例15的表7的数据。
如上述表11所示，W104F/Q193E/L278R改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比，收率明显较高，确认到反应速度提高。
[实施例24]
对使用实施例18～21制备的改变型脂肪酶（W104F/Q193E/L278R、W104F/L278K、Q193E/L278K、Q193D/L278K）与实施例17同样地对由酯化合物和醇化合物进行酯交换的活性进行评价。
结果
[表12]
Figure BDA0000406866610000521
为了比较，野生型～A283V记载了实施例17的表9的数据。
如上述表12所示，Q193D/L278K改变型脂肪酶与野生型脂肪酶相比，收率明显较高，确认到反应速度提高。
工业上的可利用性
本发明可以用于在工业上由碳酸酯化合物和胺化合物制造氨基甲酸酯化合物。
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Claims (18)

1.一种改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于：
该改变型脂肪酶是将序列编号1的193位的谷氨酰胺取代为其它的氨基酸残基得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示高于序列编号1所示的野生型脂肪酶的氨基甲酸酯化活性。
2.根据权利要求1所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于：
该改变型脂肪酶是将193位的谷氨酰胺取代为谷氨酸或天冬氨酸得到的，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
3.根据权利要求1或2所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于：
该改变型脂肪酶进一步将104位的色氨酸取代为苯丙氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
4.根据权利要求1或2所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于：
该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
5.根据权利要求3所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于：
该改变型脂肪酶进一步将278位的亮氨酸取代为精氨酸或赖氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
6.根据权利要求5所述的改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于：
该改变型脂肪酶进一步将283位的丙氨酸取代为缬氨酸，该改变型脂肪酶的突变体进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性。
7.一种DNA，其特征在于：
其编码权利要求1～6中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体。
8.一种转化微生物，其特征在于：
其包含权利要求7所述的DNA。
9.一种改变型脂肪酶或其突变体的制造方法，其特征在于：
在培养基中培养权利要求8所述的转化微生物，使改变型脂肪酶或其突变体在培养基中和/或微生物中积累。
10.一种改变型脂肪酶或其突变体，其特征在于：
其是将权利要求1～6中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过权利要求9所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在载体中固定化得到的。
11.权利要求1～6和10中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过权利要求9所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体在氨基甲酸酯化反应中的使用。
12.根据权利要求11所述的使用，其特征在于：
氨基甲酸酯化反应是使碳酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。
13.一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于：
在权利要求1～6和10中任一项所述的改变型脂肪酶或其突变体或者通过权利要求9所述的方法得到的改变型脂肪酶或其突变体的存在下，使碳酸二烷基酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。
14.根据权利要求13所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于：
碳酸二烷基酯化合物为碳酸二甲酯化合物。
15.将序列编号1的104位的色氨酸取代为苯丙氨酸得到的改变型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性的该改变型脂肪酶的突变体在氨基甲酸酯化反应中的使用。
16.根据权利要求15所述的使用，其特征在于：
氨基甲酸酯化反应是使碳酸酯化合物与胺化合物反应来制造氨基甲酸酯化合物的反应。
17.一种氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于：
在将序列编号1的104位的色氨酸取代为苯丙氨酸得到的改变型脂肪酶、或进一步具有一个或者多个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位且显示与该改变型脂肪酶相同的氨基甲酸酯化活性的该改变型脂肪酶的突变体的存在下，使碳酸二烷基酯化合物与胺化合物作为底物进行反应。
18.根据权利要求17所述的氨基甲酸酯化合物的制造方法，其特征在于：
碳酸酯化合物为碳酸二甲酯化合物。
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