CN103497944A

CN103497944A - 一种蔗糖异构酶的制备方法

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Publication number: CN103497944A
Application number: CN201310142535.8A
Authority: CN
Inventors: 李宪臻
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-04-23
Filing date: 2013-04-23
Publication date: 2014-01-08

Abstract

本发明涉及一种细胞壁融合蔗糖异构酶的制备方法，其特点是采用超声波破碎技术，制备含有蔗糖异构酶活性的细胞壁融合酶作为催化剂，将蔗糖转化为异麦芽酮糖。包括以下步骤：1）将蔗糖异构酶生产菌在种子培养基中进行菌种活化；2）将活化菌种转种至发酵培养基中培养，进行蔗糖异构酶生产；3）超声波破碎蔗糖异构酶生产菌并收集破碎细胞，获得细胞壁融合蔗糖异构酶。采用本发明制备的蔗糖异构酶催化蔗糖转化时，蔗糖转化率为99.8wt%，转化产物中的异麦芽酮糖比例为88.39%，海藻酮糖为11.61%。

Description

一种蔗糖异构酶的制备方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种蔗糖异构酶的制备方法。

背景技术

异麦芽酮糖的化学名称叫α-D-吡喃葡萄糖苷-1,6-D-呋喃果糖，具有与蔗糖相似的甜味特性，无异味，甜度是蔗糖的50%。异麦芽酮糖不但具有非致龋齿性，而且还能够阻止产生不溶性葡聚糖以防龋齿形成。由于人体本身无法消化异麦芽酮糖，只有被肠道微生物缓慢分解后才能进入血液而被人体吸收，因此，食用后在血液中释放单糖的速度比蔗糖慢且不刺激胰岛素分泌，因而有益于糖尿病防治。大多数细菌和酵母都不能利用异麦芽酮糖，当异麦芽酮糖应用于发酵食品和饮料生产时，其抗微生物特性使产品的甜味易于保持。

异麦芽酮糖是以蔗糖为原料，经蔗糖异构酶（α-葡糖基转移酶，EC.5.4.99.11）催化反应，将蔗糖转化为异麦芽酮糖的，由蔗糖异构酶催化的蔗糖异构化反应如图1所示。在异构化过程中，蔗糖分子中的α-1,2-糖苷键在蔗糖异构酶活性中心内首先被水解断开并转位，随后葡萄糖单体再与果糖单体形成α-1,6-或α-1,1-糖苷键，并从酶分子中脱落而产生两种蔗糖异构体——异麦芽酮糖和海藻酮糖，同时，断开的α-1,2-糖苷键也可以与水分子反应形成葡萄糖和果糖。因此，在蔗糖异构化过程中，除了生成α-1,6-连接的异麦芽酮糖外，也形成α-1,1-连接的海藻酮糖，同时还会形成一部分非连接的葡萄糖和果糖。所以，产物中除了异麦芽酮糖外，还伴随有三种副产品即海藻酮糖、葡萄糖和果糖的形成，其中海藻酮糖与异麦芽酮糖具有类似的生理功能，是一种非致龃齿糖且糖尿病人可食用，因此海藻酮糖不影响异麦芽酮糖的特殊品质，生产过程中无需考虑分离剔除。但是，这些蔗糖异构酶的转化产物中还含有2～7％的葡萄糖和果糖等副产物，严重影响异麦芽酮糖产品的质量，在后提取过程中必须要分离除去。生产过程中必须采用离子交换树脂等复杂的分离纯化过程除去这些杂质，导致生产成本大幅提高和大量用水，是一个值得考虑的工业化问题。

为了解决上述问题，我们通过对蔗糖异构酶催化反应过程的比较分析，发现蔗糖异构酶的存在形态影响蔗糖异构化产物的比率。与其它存在形态的蔗糖异构酶比较，当采用细胞融合蔗糖异构酶时，所催化的蔗糖异构化产物中完全不形成葡萄糖和果糖，为避免上述异麦芽酮糖生产中的工业化问题提供了解决方案。

发明内容

本发明的目的是提供一种蔗糖异构酶的制备方法，采用本发明制备的蔗糖异构酶，蔗糖转化率为99.8％以上，转化产物中的异麦芽酮糖含量为88.39％，葡萄糖和果糖的含量低于检测限。

本发明中所述甘蔗克雷伯菌（Klebsiella sugarcanna），在2013年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M2013153，保藏单位地址为：武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编：430072。

本发明的具体操作步骤如下：

第一步：种子活化

取出4°C冰箱保藏的克雷伯菌CCTCC M2013153菌保存斜面，在无菌操作条件下，用接种环接种1～2环到含有25毫升种子培养基的三角瓶中，在30°C、150转/分钟条件下，于摇床内振荡培养10～12小时，待种子活化液在600nm波长处的吸光度值为0.8～1.0时，停止培养。

种子培养基配方组成为：1～2g蔗糖，0.2～0.4g酵母粉，0.1～0.3g蛋白胨，0.03～0.07g硫酸镁，0.05～0.15g磷酸二氢钠，0.05～0.15g硝酸钠，100mL水，pH6.8～7.2。

第二步：种子培养液制备

在无菌操作条件下，按3～5%接种量，将种子活化液转接到含有50毫升种子培养基的三角瓶中，在30°C、150转/分钟条件下，于摇床内振荡培养4～6小时，待种子培养液在600nm波长处的吸光度值为0.8～1.0时，停止培养。

种子培养基配方组成与第一步中的相同。

第三步：蔗糖异构酶生产

按3～5％接种量，将种子培养液转接于含有150～200mL发酵培养基的三角瓶中，在30°C、150转/分钟的条件下，于摇床中振荡培养10～12小时，每隔3小时取样，检测发酵液中的酶活力，当酶活力达到最大值并稳定后，停止培养。

发酵培养基组成配方为：3～5g蔗糖，0.1～0.3g酵母浸粉，0.1～0.2g蛋白胨，100mL水，pH6.8～7.2。

第三步：菌体收集

在4°C、10000×g条件下，将发酵培养液离心20～30分钟，弃去上清液，菌体用25～30%原体积的蒸馏水洗涤，同样条件下离心，反复洗涤2～3次，重新悬浮于25～30%原体积的20mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）中，制成菌悬液。

20mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）配制：将3.561g二水磷酸氢二钠溶于500mL去离子水中，并补水到终体积1000mL，制成20mM溶液；将2.101g一水柠檬酸溶于500mL去离子水中，并补水到终体积1000mL，制成10mM溶液；将磷酸氢二钠溶液与柠檬酸溶液按16.47:3.53的比例混合，制成20mM的磷酸-柠檬酸缓冲液。

第四步：蔗糖异构酶制备

将20～25mL菌悬液转移到50mL大塑料试管内，将大塑料试管置于冰水浴中，采用超声波破碎，然后将细胞破碎液于4°C、10000×g条件下，离心15～20分钟，收集破碎后的菌体，用20mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）洗涤3～4次。重新悬浮于等体积的20mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0），制成细胞壁融合蔗糖异构酶。

超声波破碎条件为：功率400W，1/2”探头接近底部0.5～1.0cm处，强度45～55%，破5秒停2秒，破碎时间20～30分钟。

本发明中的相关方法如下：

蔗糖异构酶活性检测方法：将0.1毫升蔗糖异构酶与0.4毫升溶解于20mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）的2wt％蔗糖溶液混合均匀，于30°C水浴中反应10分钟，立即加入1.5毫升3,5-二硝基水杨酸试剂终止酶反应，并于沸水浴中加热5分钟显色，在波长520nm处测定吸光度值，通过异麦芽酮糖标准曲线确定还原糖含量。一个蔗糖异构酶活力单位定义为：在上述反应条件下，每分钟催化蔗糖异构化形成1μmol异麦芽酮糖所需要的酶量。

3,5-二硝基水杨酸试剂配制方法：将6.9g结晶酚溶于15.2mL10%氢氧化钠中，并稀释至69mL，加入6.9g亚硫酸氢钠，制成甲液；将255g酒石酸钠溶于300mL10%氢氧化钠中，再加入880mL1%的3,5-二硝基水杨酸溶液，制成乙液；将甲乙液混合后，并贮于棕色试剂瓶中，室温下放置7～10天，即制成3,5-二硝基水杨酸试剂。

高效液相色谱（HPLC）法：采用Waters2690系统HPLC分离异麦芽酮糖产物，层析柱为Waters糖分析专用柱（4.6×250毫米），检测器为Waters2410折光指数检测器，样品用70％的乙氰水溶液洗脱，洗脱液流速为1mL/分钟。由活性碎片蔗糖异构酶催化蔗糖转化形成产物的HPLC层析谱如图2所示，根据峰面积可以计算糖含量及产物比例。

纯蔗糖异构酶和GST融合蔗糖异构酶制备方法：根据蔗糖异构酶的基因序列（AY040843）合成引物，以克雷伯菌CCTCC M2013153的基因组DNA为模板，采用PCR技术扩增蔗糖异构酶基因，并在GST表达系统（GST GeneFusion System,Pharmacia）中表达蔗糖异构酶，用GST试剂盒中的专用亲和层析柱分离纯化蔗糖异构酶和GST融合蔗糖异构酶。

附图说明

图1、蔗糖异构酶催化蔗糖异构化反应的示意图

图2、蔗糖异构酶催化蔗糖转化产物的HPLC分析图谱

具体实施方式

实施例1

从4°C冰箱保存的克雷伯菌CCTCC M2013153斜面上，挑取1环菌体，接种到装有25mL种子培养基的三角瓶中，活化培养12小时（30°C、150转/分），按3％接种量转入装有50mL新鲜种子养基的三角瓶中，在30°C摇床振荡（150转/分钟）培养4.5小时后，按5%接种量，将上述种子培养液接种到含有250mL发酵培养基的三角瓶中，在30°C、150转/分钟的摇床中振荡培养10小时。取上述发酵液，在4°C、10000g条件下离心分离25分钟，将细胞菌体用去离子水洗涤3次，悬浮于1/4原体积的20mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）中，冰水浴中超声波破碎30分钟，在4°C、10000g条件下离心分离15分钟并水洗3次，悬浮于原发酵液体积的20mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）中，制成细胞壁融合蔗糖异构酶液。

破碎条件为：功率400W，1/2”探头接近底部0.5～1.0cm处，强度45～55%，破5秒停2秒。

种子培养基配方为：1.5g蔗糖，0.3g酵母粉，0.2g蛋白胨，0.05g硫酸镁，0.07g磷酸二氢钠，0.06g硝酸钠，100mL水，pH7.0。

发酵培养基配方为：4g蔗糖，0.2g酵母浸粉，0.15g蛋白胨，100mL水，pH7.0。

实施例2

按实例1所述方法，制备细胞壁融合蔗糖异构酶液，按酶液与蔗糖溶液比例为1:9比例，将蔗糖异构酶与20wt%蔗糖溶液混合，置于30°C水浴中保温6小时，将蔗糖转化为异麦芽酮糖。HPLC分析确认（图2），蔗糖转化液中含有88.39%的异麦芽酮糖和11.61%的海藻酮糖。

20wt%蔗糖溶液配制：称取20g蔗糖，溶入70mL的20mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）中，并补体积到100mL。

实施例3

将未超声波破碎的细胞悬浮液、细胞壁融合蔗糖异构酶液、纯化的蔗糖异构酶液和GST融合蔗糖异构酶液分别与浓度为20wt%的蔗糖溶液以1：10的比例混合，在30°C水浴中保温6小时后，停止反应，HPLC法分析蔗糖转化液中各种糖组分的比例。

表1不同存在形态的蔗糖异构酶催化蔗糖转化的产物组成（%）

酶存在形态	异麦芽酮糖	海藻酮糖	葡萄糖+果糖
				完整细胞	87.56	11.69	0.75
细胞壁融合蔗糖异构酶	88.39	11.61	0.0
				纯化的蔗糖异构酶	76.81	10.62	12.57
GST融合蔗糖异构酶	80.73	10.92	8.35

与细胞壁融合蔗糖异构酶的产物相比较，在纯酶的转化产物中，葡萄糖/果糖比例明显增加，已与其它同类酶的比例（12.5～13％）无明显区别。当在蔗糖异构酶的N-末端联接上一个GST融合蛋白时，可能是由于GST蛋白的空间障碍作用，蔗糖转化产物中的葡萄糖/果糖比例有所降低（8.35％）。由此可以看出，蔗糖异构酶以活性碎片形式存在时，催化蔗糖转化的产物纯度最高。

Claims

1. 一种蔗糖异构酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

第一步：蔗糖异构酶生产

将甘蔗克雷伯菌（Klebsiella sugarcanna）CCTCC M 2013153保存斜面接种到种子培养基中，在30°C、150转/分钟条件下，振荡培养至种子培养液的菌体浓度达到OD值0.8~1.0时，按3～5％接种量，接种到150～200 mL发酵培养基中，在30°C、150转/分钟条件下，振荡培养10～12小时，当发酵液中的酶活力达到最大值并稳定后，停止培养；

第二步：菌体收集

在4°C、10000 ′ g条件下，将发酵培养液离心20～30分钟，弃去上清液，菌体细胞用25～30%原体积的蒸馏水洗涤3～4次，悬浮于25～30%原体积的20 mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）中，制成菌悬液；

第三步：细胞融合蔗糖异构酶制备

将20~25 mL菌悬液转移到50 mL大塑料试管内并置于冰水浴中，采用超声波破碎后，于4°C、10000 ′ g条件下，离心15～20分钟，收集破碎后的菌体，用20 mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0）洗涤3～4次；悬浮于等体积的20 mM磷酸-柠檬酸缓冲溶液（pH7.0），制成细胞融合蔗糖异构酶。

2. 根据权利要求1所述的蔗糖异构酶制备方法，其特征在于所述的蔗糖异构酶是含有蔗糖异构酶活性的细胞融合酶。

3.根据权利要求1所述的蔗糖异构酶制备方法，其特征在于所述的蔗糖异构酶生产方法中所使用的种子培养基为：1～2g蔗糖，0.2～0.4g酵母粉，0.1～0.3g蛋白胨，0.03～0.07g硫酸镁，0.05～0.15g磷酸二氢钠，0.05～0.15g 硝酸钠，100mL水，pH6.8～7.2；发酵培养基为：3～5g蔗糖，0.1～0.3g酵母浸粉，0.1～0.2g蛋白胨，100mL水，pH6.8～7.2。

4.根据权利要求1所述的蔗糖异构酶制备方法，其特征在于所述的细胞融合蔗糖异构酶制备方法中所使用的超声波破碎条件为：功率400W，1/2”探头接近底部0.5～1.0 cm处，强度45～55%，破5秒停2秒，破碎时间20～30分钟。