CN103491983A - 与心血管成像相关的材料及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于斑块成像（如：心血管斑块）的结合物以及相关的药物组合物。本发明的其他方面包括用于给予和成像这类结合物和组合物以及利用该成像来表征斑块的方法。本发明的结合物区分斑块中的原弹性蛋白和弹性蛋白。原弹性蛋白的存在可以作为斑块易于破裂或蚀损的指示。这类信息能够评估疾病进展以及对治疗的反应。

Description

与心血管成像相关的材料及方法
技术领域
本发明涉及与斑块成像相关的材料和方法，并且更具体地，涉及使用能够对斑块成像的试剂对心血管斑块成像以评估斑块负荷和不稳定性、疾病进展和对治疗的反应。
背景技术
在西方国家，急性心肌梗塞（AMI）和中风依然是死亡和患病的主要原因。AMI主要由不稳定的/脆弱的动脉粥样硬化斑块的破裂或蚀损引起。生物学过程的复杂群与斑块进展和去稳定作用有关，包括内皮机能障碍、炎症、新血管形成、向外重新塑造以及细胞外基质解体。类似地，主动脉瘤的发展和破裂被看成是炎症和基质退化的结果。
由于期望能够分辨可能破裂/蚀损的斑块，对斑块负荷和不稳定性的评估、疾病进展和对治疗反应的评估已成为本领域的研究主题。使用冠状血管造影术的早期研究（限于冠状血管壁的间接可视化的技术）已经在疾病的程度、疾病进展和相关联的心血管死亡率之间建立联系。开发了血管内超声（IVUS）和光学相干性断层摄影术从而以高空间分辨率对血管壁成像，能够精确量化斑块负荷。然而，这些技术的侵入本性预先排除在大量病人群体中筛选和随后研究之外。已经将疾病负荷和进展建立为不利结果的独立的预测指标。已经显示FDG-PET与斑块巨噬细胞含量，以及与脆弱斑块的成像特征（包括在IVUS上的斑块透声（echolucency）、在MR上的斑块出血和富脂斑块，以及对巨噬细胞特异性的CT造影剂的摄取有关。
分子磁共振成像（MRI）是非侵入性技术，允许可视化体内的生物学标记物。因为与其他临床分子成像方式相比可实现显著地更高的空间分辨率，它非常适合用于评估相对薄的动脉血管壁。作为举例，WO2007/05491公开将酰肼结合物用作斑块成像的MRI试剂。然而，即使已在高弛豫造影剂的设计方面取得进步，但是与正电子发射断层扫描术、单光子发射计算机断层扫描术和光学成像相比，灵敏度依旧是分子MRI的主要限制因素。
动脉斑块中弹性蛋白和原弹性蛋白的存在已成为研究的主题。Krettek等人（1）描述与无疾病的动脉相比，人的粉瘤和腹部主动脉瘤中的原弹性蛋白增加。他们还指出巨噬细胞可能是原弹性蛋白的来源。Xu等人（2）描述原弹性蛋白表达与泡沫细胞病变的发展密切相关。Akima等人（3）描述富含脂质及破裂的斑块中弹性蛋白mRNA处于高水平而弹性蛋白处于低水平。
已经以不同方式接近原弹性蛋白和弹性蛋白的可视化；Kozel等人（4）利用标有染料的抗体来可视化细胞中的弹性蛋白，并且Starcher等人（5）描述针对在原弹性蛋白而不是弹性蛋白上的表位的抗体。WO2011/005322（6）描述了用于对富含弹性蛋白的组织成像的化合物。
已经使用其他的结合物来检测血管损伤。在美国5972890（7）中，建议肽标记的结合物用于结合至血管损伤的位置。美国4877599（8）描述在兔子中，使用针对结合至I-125的人弹性蛋白的抗体。
因此，在本领域内，对于提供斑块成像的进一步的方法依旧存在需求，尤其是对于评估斑块是否有破裂/蚀损的倾向。
发明内容
广义来说，本发明是基于以下发现：与稳定斑块相比较，处于破裂或侵蚀风险下的脆弱斑块具有增加的原弹性蛋白含量，并且能够特异性地结合至原弹性蛋白的成像剂能用于斑块成像，例如用于评估斑块负荷和不稳定性、疾病进展和/或对治疗的反应。可替换地或另外地，基于在此公开的结果（其显示与稳定的斑块相比较，在不稳定斑块中赖氨酰氧化酶活性降低），本发明包括使用赖氨酰氧化酶作为不稳定斑块的标记物。不希望受任何特定理论的约束，这些发现是连接的，因为赖氨酰氧化酶是负责交叉原弹性蛋白以产生成熟弹性蛋白的酶。因此，本发明提供一种方法，该方法利用新型原弹性蛋白特异性造影剂和/或用于检测赖氨酰氧化酶的存在、数量或活性的成像剂来改善不稳定有破裂倾向的斑块的检测，因此可以在此类高风险病人群体中更好地引导治疗。
在血管壁中，弹性蛋白扮演重要的结构角色，但也有生物学信号发送功能。几种病理学刺激可负责触发动脉粥样硬化的弹性蛋白生成（elastogenesis），导致在斑块发展过程中弹性蛋白含量的显著增加。不成熟弹性纤维可代表用于招募前炎性细胞的致动脉粥样化的刺激。斑块内弹性蛋白含量的成像定量改变可产生针对单独评估斑块负荷的补充信息，特别地，如应当指明的，基于其相对的弹性蛋白含量，人动脉粥样硬化斑块可以潜在地分化为纤维亚型和动脉粥样化亚型。
因此，在第一方面，本发明提供一种用于斑块成像的结合物，其包括原弹性蛋白特异性结合剂或赖氨酰氧化酶特异性结合剂，其中，结合剂连接至成像探针。
另一方面，本发明提供一种用于斑块成像方法的结合物，其包括原弹性蛋白特异性结合剂或赖氨酰氧化酶特异性结合剂，其中，结合剂连接至成像探针。
另一方面，本发明提供一种结合物在制备用于斑块成像的药物中的用途，其中，结合物包括原弹性蛋白特异性结合剂和成像探针。
本发明可涉及心血管斑块的成像。在一些情况下，根据本发明的任一方面，斑块可为心血管斑块。在一些情况下，根据本发明的任一方面，斑块可为动脉粥样硬化心血管斑块。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包括本发明的结合物。通常，该组合物用于静脉内给予病人。
在另一方面中，本发明提供对受试者的心血管斑块成像的方法，该方法包括：
（a）将组合物给予受试者，所述组合物包括用于心血管斑块成像的结合物，该结合物包含原弹性蛋白特异性结合剂和成像探针；
（b）允许成像剂结合至受试者的血管系统的斑块中存在的任何原弹性蛋白；
（c）检测成像探针以确定斑块的存在。
因此，本发明的方法可用于通过使用结合物对心血管斑块成像（例如：动脉粥样硬化斑块）来确定病人发展由斑块破裂或不稳定性引起的病症的可能性（例如急性心肌梗塞（AMI）、中风或主动脉瘤）。另外地或可替换地，本发明的方法可进一步包括利用通过结合物对诸如动脉粥样硬化斑块的心血管斑块进行成像用来（I）确定病人的治疗过程，和/或（II）将病人分配至给定疗法的病人类别，和/或（III）评估斑块负荷，（IV）监测疾病进展和/或（V）确定病人对疗法的反应。作为这些方法中任一种的部分，步骤（c）可包括对斑块中存在的原弹性蛋白定量。
现在将通过实施例来描述本发明的实施方式但不限于参考附图及示例。
在此使用的“和/或”应当理解为明确地公开了两个具体特征或组件中的每一个（具有或不具有另外的）。例如，“A和/或B”应当理解为明确地公开了（i）A、（ii）B和（iii）A和B中的每一种情况，就像每一种情况在此单独地给出一样。
除非上下文中另外指出，否则上述给出的特征的描述和定义并不限于本发明的任何具体方面或者实施方式，并等同地应用于所描述的所有方面和实施方式。
附图说明
图1.示出了由原弹性蛋白生成弹性蛋白的方案。
图2.通过IHC对稳定和不稳定兔斑块中的原弹性蛋白纤维定量，显示与稳定斑块相比不稳定斑块中的原弹性蛋白上调。
图3.对稳定和脆弱兔斑块中的总弹性蛋白（原弹性蛋白和成熟弹性蛋白）定量，显示与稳定斑块相比脆弱斑块具有增加的总弹性蛋白（原弹性蛋白+成熟弹性蛋白）含量。
图4.在脆弱斑块中LOX下调。
图5.示出肽序列VVGSPSAQDEASPLS结合原弹性蛋白上的六肽VGVAPG的示意图。
图6.具有钆标记的(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS的ApoE-/-小鼠模型的斑块的体内成像，显示在带有斑块的头臂动脉和主动脉弓中优先摄取结合物而在无斑块的颈动脉中没有摄取。
图7.具有钆标记的K-(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY的ApoE-/-小鼠模型的斑块的体内成像，显示在带有斑块的头臂动脉和主动脉弓中优先摄取结合物而在无斑块的颈动脉中没有摄取。
图8.免疫组织化学：原弹性蛋白染色（棕色）确定在病态的头臂动脉中的新内膜（白色箭头）和外膜（黑色箭头）中原弹性蛋白的存在，但是在无斑块和带有斑块的头臂动脉的中膜中没有至几乎没有原弹性蛋白。
图9.K-(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY的生物分布示出了肾清除率和在头臂动脉中优先摄取。
具体实施方式
原弹性蛋白特异性的或赖氨酰氧化酶特异性的结合剂
原弹性蛋白是基质蛋白，其被合成以形成血管壁的一部分。在表达不成熟的原弹性蛋白之后，它通过酶，赖氨酰氧化酶（LOX）共价交联至结构成熟的弹性蛋白（图1），这为血管壁提供拉伸强度。因此，本发明涉及能够区分（特别是在体内）从头合成的原弹性蛋白和成熟的交联的弹性蛋白的结合物，前者与斑块不稳定性和破裂的增加的风险相关，这导致AMI和/或中风和/或主动脉瘤。人原弹性蛋白、赖氨酰氧化酶、和弹性蛋白的序列可在序列数据库得到，连同在动物模型（如：兔子）中相应的多肽序列一起（也参见下面的序列部分）。来自其他物种的原弹性蛋白也可用于设计特异性结合肽或者用于筛选抗体类结合剂。设计能够特异性地结合至一个以上物种的原弹性蛋白的肽或者抗体可能是有利的，例如，使同一结合物能够用于对动物模型中和人类患者中的斑块成像。
在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽能够特异性地结合原弹性蛋白。在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽基本上不结合至弹性蛋白。在优选实施方式中，原弹性蛋白特异性结合剂能够特异性地在体内结合原弹性蛋白，而基本上在体内并不结合至弹性蛋白。
在一些情况下，根据本发明的任一方面，与其他血管内的成分或蛋白质相比较，原弹性蛋白特异性结合肽对于原弹性蛋白具有特异性。在优选实施方式中，与体内的其他血管内的成分或蛋白质相比较，原弹性蛋白特异性结合剂对于原弹性蛋白具有特异性。
一般地，原弹性蛋白特异性结合剂可以是能够特异性地结合至原弹性蛋白的多肽或肽，或者可以是能够特异性地结合至原弹性蛋白的抗体分子。在优选实施方式中，原弹性蛋白特异性结合剂可以是能够特异性地结合至体内原弹性蛋白的多肽或肽，或者可以是能够特异性地结合至体内原弹性蛋白的抗体分子。同样地，赖氨酰氧化酶特异性结合剂可以是能够特异性地结合至赖氨酰氧化酶的多肽或肽，或者可以是能够特异性地结合至赖氨酰氧化酶的抗体分子。
原弹性蛋白特异性结合肽的实例包含具有氨基酸序列VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPG或者YPDHVQYTHY的肽。在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽由序列VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPG或者YPDHVQYTHY组成。例如，在原弹性蛋白特异性结合剂并未显著程度地结合至成熟弹性蛋白（特别在体内）的情况下，考虑到避免交叉反应的需要，本领域技术人员能够利用已知的多肽的已知氨基酸序列容易地设计出可替代的肽序列以结合至原弹性蛋白和/或赖氨酰氧化酶。在这些实例中，在设计出肽之后，通过PeptideSynthetics（Peptide Protein Research Ltd）以化学方法合成使用的肽。
在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽包括来自氨基酸序列VVGSPSAQDEASPLS的至少4、6、8、10、12或14个氨基酸的序列。在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽的长度不多于50个，不多于30、20、18或16个氨基酸。在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽包括或者由氨基酸序列VVGSPSAQDEASPLS组成。
在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽包括来自氨基酸序列YPDHVQYTHY的至少4、6或8个氨基酸的序列。在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽的长度不多于50个，不多于30、20、18、16、14、12或10个氨基酸。在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽包括或者由氨基酸序列YPDHVQYTHY组成。
在本发明中，原弹性蛋白特异性结合剂可以是能够结合氨基酸序列VGVAPG的肽或抗体分子。在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合剂可以是包括氨基酸序列QDEA的肽。在一些情况下，根据本发明的任一方面，原弹性蛋白特异性结合肽的长度不多于50个，不多于30、20、18、16、14、12或10个氨基酸。不希望受任何特定理论的约束，原弹性蛋白特异性结合剂上的氨基酸残基QDEA被认为结合原弹性蛋白六肽VGVAPG（图5）。
在本发明中，原弹性蛋白特异性结合剂可以是能够特异性地结合至原弹性蛋白的肽或者抗体分子，并且优选并不显著地结合至血管系统的弹性蛋白和/或其他成分。在优选实施方式中，原弹性蛋白特异性结合剂可以是能够特异性地结合至原弹性蛋白，并且优选能够并不显著地结合至体内血管系统的弹性蛋白和/或其他成分的肽或者抗体分子。原弹性蛋白特异性结合剂（如：肽或者抗体分子）可以具有针对原弹性蛋白的解离常数为小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM或小于1nM。相反，优选原弹性蛋白特异性结合剂（如：抗原弹性蛋白抗体或者肽）可以具有针对弹性蛋白的解离常数为高于100μmol/L。例如，原弹性蛋白特异性结合剂（如：抗原弹性蛋白抗体或者肽）可以具有针对体内弹性蛋白（如：存在于或来自哺乳动物，如：人类，受试者的弹性蛋白）的解离常数为高于1、10、100或者200μmol/L。
在本发明中，当赖氨酰氧化酶特异性结合剂是能够特异性地结合至赖氨酰氧化酶而不是血管系统的其他成分的肽或者抗体分子时，该肽或者抗赖氨酰氧化酶抗体可以具有针对赖氨酰氧化酶的解离常数为小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM或小于1nM。
原弹性蛋白特异性肽或抗原弹性蛋白抗体分子的结合动力学和亲合力（表示为平衡解离常数Kd）可利用标准技术（如表面等离子体共振，例如使用BIAcore分析）来确定。
如在此描述的抗原弹性蛋白抗体分子或者抗赖氨酰氧化酶抗体分子可以是免疫球蛋白或者其片段，并且可以是自然的或者部分地或全部地合成生成的，例如重组体分子。抗原弹性蛋白抗体分子的一个实例可购自Calbiochem Cat No.324756。
抗原弹性蛋白抗体分子或抗赖氨酰氧化酶抗体分子可以包括包含抗体抗原结合位点的任何多肽或者蛋白质，包括Fab、Fab2、Fab3、双抗体、三抗体、四抗体、微抗体和单域抗体、以及任何同种型或亚类的全部抗体。已经描述了抗体分子及其构造和使用方法，例如在Holliger&Hudson,Nature Biotechnology23(9):1126-1136(2005)中。
在一些优选实施方式中，抗原弹性蛋白抗体分子或抗赖氨酰氧化酶抗体分子可以为全抗体。例如：IgG、IgA、IgE或IgM或者任一同种亚类（具体地，IgG1和IgG4）。抗原弹性蛋白抗体分子可以是单克隆抗体。
抗原弹性蛋白抗体分子或抗赖氨酰氧化酶抗体分子可以是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
在避免污染物（例如能够结合其他多肽和/或血清成分的抗体）的意义上，如在此描述的抗原弹性蛋白抗体分子或抗赖氨酰氧化酶抗体分子可以进行被分离。尽管也可采用多克隆抗体，但是出于一些目的，优选单克隆抗体。
可利用本领域中标准的技术来获得抗原弹性蛋白抗体分子或抗赖氨酰氧化酶抗体分子。生产抗体的方法包括通过蛋白质或其片段使哺乳动物（小鼠、大鼠、兔、马、山羊、绵羊或猴子）免疫。利用本领域中已知的各种技术中任一种可从免疫的动物中获得抗体，并优选利用抗体结合至感兴趣的抗原来进行筛选。例如，可使用蛋白质印迹技术或者免疫沉淀（Armitage等人，1992，Nature357:800-82）。从动物中分离抗体和/或生产抗体的细胞可能伴随处死该动物的步骤。
例如，参见WO92/01047，作为通过肽对哺乳动物免疫的替代或补充，可以从表达的免疫球蛋白可变域的重组体生产文库中获得对蛋白质具有特异性的抗体，例如，使用在它们的表面上显示功能性免疫球蛋白结合域的λ噬菌体或丝状噬菌体。该文库可以是幼稚的（首次用于实验的，naive），即由未使用任何蛋白质（或者片段）免疫过的生物体中获得的序列构建的；或者该文库可以是使用从已经暴露于感兴趣的抗原的生物体中获得的序列构建的。
在一些实施方式中，抗原弹性蛋白抗体分子或者抗赖氨酰氧化酶抗体分子可由任何适宜的方式生成（诸如上述方法），然后筛选针对原弹性蛋白（相对于弹性蛋白（和/或血管壁的其他成分））的差异结合。适当的筛选方法在本领域内众所周知，并且使本领域中的技术人员能够识别显示增加结合至原弹性蛋白（相对于非原弹性蛋白（如：弹性蛋白））的抗体，或者能够结合至赖氨酰氧化酶的抗体。
在生产和/或分离之后，例如利用上述结合实验或者在结合物生产中，可以检测抗原弹性蛋白抗体分子或者抗赖氨酰氧化酶抗体分子的生物学活性，从而可以确定其作为成像剂的性质。
尽管仅包括重链可变域（VH））的抗原结合域也是可能的（如：骆驼或鲨鱼抗体），抗体分子通常包括抗原结合域，该抗原结合域包含免疫球蛋白重链可变域（VH）和免疫球蛋白轻链可变域（VL）。
该术语还涵盖包括抗体结合域的任何多肽或者蛋白质。包括抗原结合域的抗体片段为例如，Fab、scFv、Fv、dAb、Fd和双抗体。可能采取单克隆及其他抗体并使用重组DNA技术的多种技术来产生其他抗体或嵌合分子，这保留初始抗体的特异性。这类技术可涉及将抗体的免疫球蛋白可变区或互补决定区（CDR）中的DNA编码引入至不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加上框架区。参见例如，EP0184187A、GB2,188,638A或EP0239400A。
原弹性蛋白特异性抗体和抗赖氨酰氧化酶抗体分子是本领域已知的，且能从诸如Calbiochem/Abcam的来源商购。可替换地，本领域技术人员能容易地生产和筛选如上所述抗体的候选物。
C：成像探针
除原弹性蛋白特异性结合剂，本发明的结合物包括能够通过成像技术（如：MRI、PET或SPECT或者它们的组合）进行检测的成像探针。成像探针的类型的实例包括放射性核素、光学标签或者顺磁性标签。本发明还可涉及应用可连接至或与结合物结合的另外的标记的探针，以便例如，能够实现多模式成像。结合光学探针以及放射性核素和MRI造影剂的可能性提供了结合多种模式的机会以增强诊断和检测，例如：通过用PET或SPECT扫描全身可识别出在全身水平上疾病的位置。类似地，结合的PET和MR成像可提供高灵敏度（PET、SPET）、信号定量（PET）及解剖分辨率（MR）和微环境测量（MR对比度增强）的优点。
本发明的结合物的一个优选的类别是MRI试剂，该MRI试剂包括连接至能够络合至MRI激活原子（诸如钆）的基团的原弹性蛋白特异性结合剂。替代性MRI信号元件可包括氧化铁。另外的可能性是使用19F作为NMR或MRI标签和/或F18作为标签，例如，用于PET或CT成像。
在一个实施方式中，能够络合至MRI激活原子的基团包括DOTA。在一些实施方式中，能够络合至MRI激活原子的基团是DOTA赖氨酸。
根据本发明使用的放射性核素探针可根据探针预期的应用使用一定范围的不同的放射性核素。可形成本发明探针的一部分的放射性核素的实例包括锝、铼、铜、钴、镓、钇、镥、铟、锆、碳、碘、氟和砹同位素如：Tc-99m、Ga-67、In-111、I-123（SPECT）、Cu-64、Cu-60、Cu-61、Cu-62、Tc-94m、Ga-68、Co-55、F-18、C-11、I-124、Zr-89（PET）、Cu-67、Re-186、Re-188、Y-90、Lu-177、I-131（放射性核素治疗）。本发明可单独地或结合地采用放射性核素。总体而言，采用锝同位素用于成像目的，铼同位素用于治疗目的，以及铜及卤素同位素用于成像和治疗两种目的。
光学探针的实例包括荧光基团诸如荧光素、发光分子和复合物（络合物）诸如镧系元素复合物（络合物）。
接头及结合化学
在一些实施方式中，结合物可以包括连接原弹性蛋白特异性结合剂和成像探针的接头或官能团。接头可为短的肽序列或者可为化学接头。肽接头序列的使用将是长度在6至25个之间的氨基酸，更优选地长度在9至16个氨基酸之间是本领域已知的。一般地，连接包括用于连接至结合剂和成像探针的反应基团，如自由的半胱氨酸残基。
结合物
在一些实施方式中，结合物是以下之中的一种：
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS，
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)，
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)，
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS，
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS，
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)，
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)，
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY，
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY或
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY。
用途
在一个方面，本发明提供用于对受试者的心血管系统中的原弹性蛋白成像（尤其是斑块成像）的方法的结合物。总体上，该方法需要以下步骤：
（a）将组合物给予受试者，该组合物包括用于心血管斑块成像的结合物，该结合物包含原弹性蛋白特异性结合剂和成像探针；
（b）允许成像剂结合至受试者的血管系统的斑块中存在的任何原弹性蛋白；
（c）检测该成像探针以确定斑块的存在。
为了接触和结合斑块中的原弹性蛋白，一般地，将包含结合物的组合物静脉内给予受试者。在针对结合发生适当地延迟之后，利用如在此描述的成像技术，可检测成像探针。然后，可以使用检测步骤的结果对斑块中存在的原弹性蛋白定量，随后可用于评估斑块负荷和/或斑块破裂的可能性和/或监测疾病进展和/或对治疗的反应。其目的将是确定对受试者的预测，尤其是关于具有AMI、中风和/或主动脉瘤的风险，和/或帮助确定旨在改善受试者病症的治疗介入。
尽管使用结合物的成像的主要方法采用MRI，但是这可结合其他核医学成像技术使用，如：单光子发射断层摄影术（SPET）（检测从放射性核素发射的γ射线以产生样品或受试者中的放射性核素分布的三维图像的成像技术）和正电子发射断层摄影术（PET）（通过检测由引入样品或受试者中的发射正电子的放射性核素间接发射的γ射线的对数来提供三维图像的成像技术）。作为举例，可以利用99mTc进行SPET研究，并且利用94mTc进行PET研究。然而，本领域技术人员应当清楚本发明中可采用的其他适当的SPET和PET放射性核素。一般地，通过恰当地选择成像探针，本发明可用于正电子发射断层摄影术（PET）、单光子发射断层摄影术（SPET）、光学（OI）和/或磁共振成像（MRI）。
因此，本发明的结合物可用于多模式成像方法中，即：其中信息或图像从两种不同技术得到，通过检测能够使用两种不同技术检测的成像探针或者通过在生物学系统中纳米粒子定位的位点提供第二标签，最方便地通过连接或使第二标签与前面详细解释的结合物结合。多模式研究将被共同登记（共同记录，co-register）并可同时用两种模式成像或者可需要在两个步骤中进行，但是通常采用相同的样品使得使用两种技术获得的空间信息可以比较。多模式成像的实例包括PET/CT、SPET/CT、PET/MR和SPET/MR。
作为举例，根据本发明的方法，可使用以下示例性方案成像。为了对冠状动脉壁和大血管诸如大动脉中摄取的造影剂可视化，可使用导航门控的（navigator-gated）、心脏触发的、脂肪抑制的T1-加权的3D梯度回波反转恢复靶向的（fat-suppressed T1-weighted3D gradient echo inversionrecovery targeted）或者全心脏序列（3D IR TFE或者3D IR SSFP）。3D IRTFE序列的成像参数可包括视场=320x320mm，基质=256x256，平面内获得的分辨率=1.25x1.25mm，重建的切片厚度=1.5mm（已获得的：3mm），采集窗口=80至100ms，重复时间/回波时间=5.8ms/1.9ms，翻转角=30°，启动周期=5，以及切片数量=20，但对于全心脏和SSFP方案可以有所不同。使用Look Locker序列可将病人特异性的反转时间（TI）调整为血液的零血液信号。
材料和方法
原弹性蛋白特异性结合剂
选择三种不同的肽（VVGSPSAQDEASPLS，EGFEPG以及YPDHVQYTHY）用于原弹性蛋白结合剂并与DOTA-赖氨酸结合用于钆和PET/SPECT标记。
实验设计
在此描述了原理实验的证明用于体内和离体测试的小鼠和兔模型使用的结合物。
结合研究
将执行使用原弹性蛋白和TNF-α涂覆的培育皿的结合研究以证明试剂的特异性。此外，将执行血管样品的透射电子显微术用于弹性蛋白和巨噬细胞的可视化，同时将获得X射线谱以与带有斑块的血管壁样品中的钆分布共同定位。
组织学
在MRI之后，将动物立即处以安乐死（euthanize）。随后，切下头臂动脉和腹主动脉并切成3mm的段。将这些部分切成3μm的切片用于石蜡包埋部分以及切成6μm切片用于OCT包埋部分。随后，这些部分将用苏木精和曙红（H&E）染色用于细胞浸润，Miller’s elastica van Gieson（EVG）用于弹性蛋白和Masson（马森氏）三色染色，以及天狼星红（Picrosirius red）用于斑块形态和胶原沉积。此外，将用针对原弹性蛋白、TNF-α和LOX的特异性抗体进行免疫染色。将应用质谱分析（MS）以对在研究的血管样品中的Gd的摩尔浓度定量。
ApoE小鼠模型
在高脂肪饮食开始后4、8和12周在进行性动脉粥样硬化的小鼠模型中以及在血管紧张素-II（Ang-II）释放微泵植入后1、2、3和4周在Ang-II诱导的主动脉瘤形成的模型中进行MRI。在接受原弹性蛋白或TNF-α结合造影剂（CA）的每个时间点扫描10只鼠，从而导致分别共计60和80只小鼠。在每个时间点，动物将经历前和后对比MRI期，并随后被处死以利用组织学、免疫染色、电子能谱和质谱分析来确认。为了证明治疗效果，在用原弹性蛋白结合CA染色治疗12周之后将扫描10只小鼠。为证明LOX在原弹性蛋白合成中的作用，在LOX抑制剂治疗开始后12周将用原弹性蛋白CA扫描10只小鼠。
斑块破裂模型
将用高胆固醇饮食（特殊饮食服务（Special Diets Services））饲养新西兰白兔2周，然后让其经历腹主动脉的球囊损伤。随后，继续高脂肪饮食再持续6周，紧接着4周正常饮食。与AHA型II-VI损伤相比，使用这种方案的斑块已显示发展相似特征（排除钙化损伤的存在）。在使用组胺和Russel喹蛇毒（RVV）触发斑块破裂之前，通过原弹性蛋白结合MR造影剂来进行MRI。在诱发斑块破裂/蚀损后48h，重复MRI用来检测腔管内血栓的存在并且使用预触发物原弹性蛋白-Gd来关联血栓位置。将扫描总计16只兔，导致大约8只（50%）兔子具有而8只没有斑块破裂。在最后扫描之后立即处死动物以便利用组织学、免疫染色、质谱和电子能谱进行确认。
示例
对兔主动脉区段进行冷冻保护（30%蔗糖），包埋在组织冷冻介质中并且在-80℃下贮藏。以500μm间隔收集系列的10μm厚的横截面（跨越300μm长度）。这些部分用于Masson三色染色以检测总体斑块形态，VanGienson弹性蛋白染色以检测成熟的和不成熟的弹性蛋白纤维，以及免疫组织化学以检测原弹性蛋白纤维、LOX和巨噬细胞。使用Masson三色染色对碎裂的斑块分类，并且包括破裂的和蚀损的两种，如对人类斑块定义的。未碎裂斑块包括没有覆盖血栓的斑块。
通过抗生物素蛋白-生物素-过氧物酶方法执行免疫组织化学（VectorLaboratories,No.PK-6102）。使用针对原弹性蛋白（Calbiochem，#324756）、LOX（IMGENEX，#IMG-6442A）和巨噬细胞（Dako,clone RAM11,No.M0633）的抗兔多克隆抗体，并遵循以下步骤：1）在室温下，在10%福尔马林中将切片孵育20min以将组织切片附着在载玻片上；2）使用高压蒸锅在100℃下在基于柠檬酸盐的溶液（10mM柠檬酸，0.05%吐温20，pH6.0）（Vector Laboratories,Burlingame,California,No.H-3300）中将切片孵育20min以恢复表位；3）在室温下，用1%过氧化氢孵育10分钟以阻断内源性过氧物酶活性；4）10%马血清孵育60min以减少抗血清的非特异性结合；5）在室温下，一抗孵育2h。阴性对照切片仅用10%马血清孵育；6）在室温下，生化素化的马抗小鼠免疫球蛋白G（在1：200的稀释度下）孵育1hr；以及7）在室温下，以1：50稀释度下用抗生物素蛋白-生化素的辣根过氧物酶复合物（Vectastain Elite,Vector Laboratories,No.PK-6102）孵育1hr。在1：50的稀释度下通过用3，3-二氨基联苯胺（DAB底物色原，Vector Laboratories,No.SK-4100）孵育3至5min，使免疫反应性位置可视化。使用Tris缓冲盐水（pH7.4）稀释每种溶液并在每个步骤之间将切片洗涤三次。最后，将组织切片用苏木精复染色（1min）。
利用看起来结合至不成熟的（原）弹性蛋白的抗体和受控制的斑块破裂的兔模型，我们发现：
1.在动脉粥样硬化进行的过程中以及在脆弱斑块中，原弹性蛋白纤维的沉积增加。
2.在初始步骤中，原弹性蛋白纤维散布在整个内膜中，并且在晚期阶段，原弹性蛋白纤维密度增加且也出现在外膜中。
3.脆弱斑块中弹性蛋白含量增加可用于分子成像，以用于体内检测这类损伤。
4.在一些情况下，原弹性蛋白纤维看起来与CD68-阳性巨噬细胞共同定位，表明巨噬细胞可能是弹性蛋白的来源。
5.然而，也存在这样的情况，其中巨噬细胞不与弹性蛋白纤维共同定位，这表明可能存在具有不同位置官能度的多种巨噬细胞亚群。
使用原弹性蛋白特异性结合肽，进一步的实验研究了成像。
研究了肽VVGSPSAQDEASPLS和YPDHVQYTHY的潜在切割位点。发现仅在消化系统中主要存在的酶切割肽VVGSPSAQDEASPLS和YPDHVQYTHY。在血液或者斑块中，未报道这些酶，因此在肽VVGSPSAQDEASPLS或者YPDHVQYTHY结合至血管壁/斑块特异性目标，原弹性蛋白之前，不可能对其切割。
执行蛋白BLAST以筛选同源性。在描述为与原弹性蛋白（分别地弹性蛋白结合蛋白（EBP）和微纤丝相关糖蛋白-1（MAGP-1））相互作用的蛋白质中而不是在其他蛋白质中仅发现氨基酸序列VVGSPSAQDEASPLS和YPDHVQYTHY。这些结果表明选择的肽对于感兴趣的蛋白质（原弹性蛋白）具有高度特异性。
用钆标记的(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS注射的ApoE-/-小鼠高脂肪饮食（HFD）饲养12周内的体内实验显示在带有斑块的头臂动脉（BCA）和主动脉弓中而不是在没有斑块的颈动脉中具有优先摄取的有利的生物分布（图6），并且，在造影剂（对比物）注射后，迅速的肾清除从而允许早在1小时成像。
用钆标记的K-(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY的HFD饲养的ApoE-/-小鼠的体内实验显示在带有斑块的头臂动脉和主动脉弓中具有摄取而在没有斑块的颈动脉中无摄取的有希望的结果（图7）。肽还显示在BCA中具有快速的肾清除和优先摄取的有利的生物分布（图9）。
免疫组织化学证实了病态BCA的新内膜和外膜中原弹性蛋白的存在，以及在带有斑块（病态的）和没有斑块（正常的）BCA血管壁的中膜中不存在原弹性蛋白（图8）。
在3T下结合弛豫被测量为20.88mM-1s-1。
在本说明书中提及的所有文献均通过引用整体并入本文中。
序列
1.原弹性蛋白特异性结合肽
VVGSPSAQDEASPLS
EGFEPG
YPDHVQYTHY
2.人类原弹性蛋白
1   magltaaapr pgvlllllsi lhpsrpggvp gaipggvpgg vfypgaglgalgggalgpgg
61  kplkpvpggl agaglgaglg afpavtfpga lvpggvadaa aaykaakagaglggvpgvgg
121 lgvsagavvp qpgagvkpgk vpgvglpgvy pggvlpgarf pgvgvlpgvptgagvkpkap
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241 kagyptgtgv gpqaaaaaaa kaaakfgaga agvlpgvgga gvpgvpgaipgiggi agvgt
30l paaaaaaaaa akaakygaaa glvpggpgfg pgvvgvpgag vpgvgvpgagipvvpgagip
361 gaavpgvvsp eaaakaaaka akygarpgvg vggiptygvg aggfpgfgvgvgg ipgvagv
421 pgvggvpgvg gvpgvgispe aqaaaaakaa kygaagagvl gglvpgpqaavpgvpgtggv
48l pgvgtpaaaa akaaakaaqf glvpgvgvap gvgvapgvgv apgvglapgvgvapgvgvap
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601 gvgagvpgfg agadegvrrs lspelregdp sssqhlpstp ssprvpgalaaakaakygaa
661 vpgvlgglga lggvgipggv vgagpaaaaa aakaaakaaq fglvgaaglgglgvgglgvp
721 gvgglggipp aaaakaakyg aaglggvlgg agqfplggva arpgfglspifpggaclgka
781 cgrkrk
3.小鼠原弹性蛋白
1   magltavvpq pgvllillin llhpaqpggv pgavpgglpg gvpggvyypgagigglgggg
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12l aykaaakaga glggvggvpg gvgvggvpgg vgvggvpggv gvggvpggvggiggigglgv
181 s tgavvpqvg agigaggkpg kvpgvglpgv ypggvlpgtg arfpgvgvlpgvptgtgvka
241 kapggggafs gipgvgpfgg qqpgvplgyp ikapklpggy glpytngklpygvagaggka
301 gyptgtgvgs qaaaaaakaa kygaggagvl pgvggggipg gagaipgiggiagagtpaaa
361 aaakaaakaa kygaagglvp ggpgvrlpga gipgvggipg vggipgvggpgiggpgivgg
421 pgavspaaaa kaaakaakyg arggvgipty gvgaggfpgy gvgagaglggaspaaaaaaa
481 kaakygagga galgglvpga vpgalpgavp avpgaggvpg agtpaaaaaaaaakaaakag
541 lgpgvggvpg gvgvggipgg vgvggvpggv gpggvtgiga gpgglggagspaaaksaaka
601 aakaqyraaa glgagvpgfg agagvpgfga gagvpgfgag agvpgfgagagvpgfgagav
661 pgslaaskaa kygaagglgg pgglggpggl ggpgglggag vpgrvagaappaaaaaaaka
721 aakaaqyglg gagglgaggl gagglgaggl gagglgaggl gagglgagglgagggvspaa
781 aakaakygaa glggvlgarp fpgggvaarp gfglspiypg ggagglgvggkppkpygga l
841 galgyqgggc fgkscgrkrk
4.人赖氨酰氧化酶
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121 arhwfqagys tsrareagas raenqtapge vpalsnlrpp srvdgmvgddpynpykysdd
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241 eenclastay radvrdydhr vllrfpqrvk nqgtsdflps rpryswewhschqhyhsmde
301 fshydlldan tqrrvaeghk asfcledtsc dygyhrrfac tahtqglspgcydtygadid
3 61 cqwiditdvk pgnyilkvsv npsylvpesd ytnnvvrcdi rytghhayasgctispy
5.小鼠赖氨酰氧化酶
1   mrfawavlll gplqlcpllr capqtprepp aapgawrqti qwenngqvfsllslgaqyqp
61  qrrrdpsata rrpdgdaasq prtpilllrd nrtastrart pspsgvaagrprpaarhwfq
121 agfspsgard gasrraanrt aspqppqlsn lrppshidrm vgddpynpykysddnpyyny
181 ydtyerprpg srnrpgygtg yfqyglpdlv pdpyyiqast yvqkmsmynlrcaaeencla
241 ssayradvrd ydhrvllrfp qrvknqgtsd flpsrprysw ewhschqhyhsmdefshydl
301 ldantqrrva eghkasfcle dtscdygyhr rfactahtqg lspgcydtyaadidcqwidi
361 tdvqpgnyil kvsvnpsylv pesdytnnvv rcdirytghh ayasgctispy
6.预测的兔赖氨酰氧化酶
1   mlcswtvlll gplqlcalvc gapqaagqqq ppreppaapg awrqriqwenngqvfsllsl
61  gaqyqpqrrr dagaaapgaq raagpqqrtp vlllrdnrta aasrprpagrhwfqagyasp
121 gardagasra gnrtaqgepp alsnlrppsh vdrmvgddpy npykysddnpyynyydtyer
181 prpgsryrpg ygtgyfqygl pdlvpdpyyi qastyvqkms mynlrcaaeenclassayra
241 dvrdydhrvl  lrfpqrvknq gtsdflpsrp ryswewhsch qhyhsmdefshydlldantq
301 rrvaeghkas  fcledtscdy gyhrrfacta htqglspgcy dtyaadidcqwiditdvqpg
361 nyilkvsvnp sylvpesdyt nnvvrcdiry tghhayasgc tisp
参考文献
1.Krettek et al ′Elastogenesis in human arterial disease：A rolefor macrophages in disordered elastin synthesis′ Arterioscl.Throm.Vas.23(2003)582-587
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6.WO201l/005322
7.US5972890A
8.US4877599A

Claims (41)

1.一种用于斑块成像的方法中的结合物，包括原弹性蛋白特异性结合剂和成像探针，其中，利用所述结合物对所述斑块成像用于确定病人发展由斑块破裂或不稳定性引起的病症的风险。
2.一种用于斑块成像的结合物，包括连接至成像探针的原弹性蛋白特异性结合剂，其中，利用所述结合物对所述斑块成像用于确定病人发展由斑块破裂或不稳定性引起的病症的风险。
3.一种结合物在制备用于斑块成像的药物中的用途，其中，所述结合物包括原弹性蛋白特异性结合剂和成像探针，其中，利用所述结合物对所述斑块成像用于确定病人发展由斑块破裂或不稳定引起的病症的风险。
4.根据前面权利要求中任一项所述的结合物和用途，其中，所述斑块是心血管斑块。
5.根据权利要求4所述的结合物及用途，其中，所述心血管斑块是动脉粥样硬化斑块。
6.根据权利要求4或5所述的结合物或用途，其中，所述病症是急性心肌梗塞（AMI）、中风或主动脉瘤。
7.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，利用所述结合物对所述斑块成像用于确定病人的治疗过程，用于将病人分配至用于给定疗法的病人类别，用于评估斑块负荷，用于监测疾病进展和/或用于确定病人对疗法的反应。
8.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，所述原弹性蛋白特异性结合剂能够特异性地结合原弹性蛋白。
9.根据权利要求7所述的结合物或用途，其中，所述原弹性蛋白特异性结合剂基本上不结合至弹性蛋白。
10.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，所述原弹性蛋白特异性结合剂能够在体内特异性地结合原弹性蛋白并且在体内基本上不结合至弹性蛋白。
11.根据权利要求4至6中任一项所述的结合物或用途，其中，与其他血管内的成分或蛋白质相比较，所述原弹性蛋白特异性结合剂对于原弹性蛋白具有特异性。
12.根据权利要求4至6中任一项所述的结合物或用途，其中，与体内其他血管内的成分或蛋白质相比较，所述原弹性蛋白特异性结合剂对于原弹性蛋白具有特异性。
13.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，所述原弹性蛋白特异性结合剂是能够结合至斑块中存在的原弹性蛋白的肽、抗体分子、蛋白质、适体或小分子配体。
14.根据权利要求13所述的结合物或用途，其中，所述原弹性蛋白特异性结合剂是肽或抗体分子。
15.根据权利要求13或14所述的结合物或用途，其中，所述肽包括来自氨基酸序列VVGSPSAQDEASPLS的至少4个氨基酸的序列。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的结合物或用途，其中，所述肽包括氨基酸序列QDEA。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的结合物或用途，其中，所述原弹性蛋白特异性结合分子能够结合至氨基酸序列VGVAPG。
18.根据权利要求13或14所述的结合物或用途，其中，所述肽包括来自氨基酸序列YPDHVQYTHY的至少4个氨基酸的序列。
19.根据权利要求13或14所述的结合物或用途，其中，所述肽具有序列VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPG或YPDHVQYTHY。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的结合物或用途，其中，所述肽长度为不多于20个氨基酸。
21.根据权利要求13或14所述的结合物或用途，其中，所述肽由以下序列构成：VVGSPSAQDEASPLS、EGFEPG或YPDHVQYTHY。
22.根据权利要求8至21中任一项所述的结合物或用途，其中，与人弹性蛋白相比较，所述原弹性蛋白特异性结合剂对于人原弹性蛋白具有特异性。
23.根据权利要求8至21中任一项所述的结合物或用途，进一步地其中，与由斑块引起的病症的动物模型中的弹性蛋白相比较，所述原弹性蛋白特异性结合剂对于原弹性蛋白具有特异性。
24.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，利用所述结合物对所述斑块成像进一步用于确定所述斑块中存在的赖氨酰氧化酶（LOX）的量或活性。
25.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，所述成像探针用于MRI、SPECT或者PET成像。
26.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，所述成像探针是连接至能够络合钆的基团的MRI试剂。
27.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，所述成像探针是用于基于钆成像的DOTA-赖氨酸。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的结合物或用途，其中，所述成像探针是用于基于钆成像的DOTA-赖氨酸或者氧化铁。
29.根据权利要求1至24中任一项所述的结合物或用途，其中，所述成像探针包括放射性核素，所述放射性核素是氟、锝、铼、铜、钴、镓、钇、镥、铟、锆、碳、碘、氟或砹同位素。
30.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，所述成像探针包括具有荧光或者发光特性的光学标签。
31.根据前面权利要求中任一项所述的结合物或用途，其中，所述成像探针包括用作MRI造影剂的顺磁性探针。
32.根据权利要求13或14所述的结合物或用途，其中，所述结合物是以下中的一种：
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS，
(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)，
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS-K(DOTA-Gd)，
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS，
K(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS，
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)，
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY-K(DOTA-Gd)，
(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY，
K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY或者
K(DOTA-Gd)K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY。
33.根据权利要求13或14中所述的结合物或用途，其中，所述结合物是(DOTA-Gd)-VVGSPSAQDEASPLS或K(DOTA-Gd)-YPDHVQYTHY。
34.一种组合物，包括根据前面权利要求中任一项所述的结合物。
35.一种用于对受试者的心血管斑块成像的方法，所述方法包括：
（a）将组合物给予所述受试者，所述组合物包括根据权利要求34所述的用于心血管斑块成像的结合物，所述结合物包含原弹性蛋白特异性结合剂和成像探针；
（b）允许所述成像剂结合至所述受试者的血管系统中的斑块中存在的任何原弹性蛋白；
（c）检测所述成像探针以确定所述斑块的存在。
36.根据权利要求35所述的方法，进一步包括通过利用所述结合物对心血管斑块成像来确定病人发展由斑块破裂或者不稳定性引起的病症的风险。
37.根据权利要求35所述的方法，其中，所述病症是急性心肌梗塞（AMI）、中风或主动脉瘤。
38.根据权利要求35所述的方法，进一步包括，利用通过结合物对心血管斑块成像用于（I）确定病人的治疗过程，和/或（II）将病人分配至特定疗法的病人类别，和/或（III）评估斑块负荷，（IV）监测疾病进展和/或（V）确定病人对疗法的反应。
39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中，步骤(c)包括对斑块中存在的所述原弹性蛋白定量。
40.根据权利要求35至39中任一项所述的方法，其中，所述组合物用于静脉内给予所述受试者。
41.根据权利要求35至40中任一项所述的方法，其中，所述心血管斑块是动脉粥样硬化斑块。
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